УСКОРИТЕЛЬ РОСТА КОРНЕВОЙ СИСТЕМЫ РАСТЕНИЙ (ВАРИАНТЫ) Российский патент 2023 года по МПК A01N63/00 C12N1/20 C12R1/00 

Область техники, к которой относится изобретение.

Группа изобретений относится к биотехнологии и сельскохозяйственной микробиологии и касается получения препаратов, содержащих смеси штаммов бактерий и грибов, на основе культуральных жидкостей для ускорения роста и оздоровления микробного сообщества корней, ускорения разложения органических остатков, повышения доступности минерального питания, повышения урожая сельскохозяйственных культур и качества получаемой продукции.

Основу изобретения составляют смеси культуральных жидкостей микроорганизмов, приготовленных в определенной пропорции, в частности используются бактерии Bacillus licheniformis, Bacillus pumilus, Bacillus subtilis, Bacillus mucilaginosus, Bacillus coagulans, Paenibacillus polymyxa, Pseudomonas chlororaphis, Pseudomonas putida, Arthrobacter globiformis и грибы Trichoderma harzianum и Trichoderma viride, обладающие фитопротекторными, целлюлолитическими и ростостимулирующими свойствами, способные снижать инфекционный фон в период вегетации и цветения растений, обеспечивающие оздоровление ризосферы и увеличивающие доступность минерального питания, обеспечивающего рост и развитие растений.

Уровень техники

Известны штаммы микроорганизмов, непосредственно стимулирующие рост и способствующие повышению продуктивности растений, такие как Pseudomonas putida ВКПМ В-4308 (Патент РФ №2051586), Pseudomonas lemoignei ВКМ В-6615 (Патент РФ №2121271), Streptomyces chrysomallus Р-21 (Патент РФ №2226214), Bacillus subtilis 8А (Патент РФ №2495119,), Serratia ficaria ВКПМ В-11403 (Патент РФ №2545398,), Bacillus pumilus А1.5 (Патент РФ №2551968), Bacillus atrophaeus ВКПМ В-11474 (Патент РФ №2570624), Bacillus cereus 875 TS (Патент РФ №2624032). Однако ни для одного из перечисленных штаммов не указаны возможные механизмы прямой стимуляции роста растений, не показаны эффекты, оказываемые данными штаммами на корневую систему, не достигается комплексный эффект мобилизации минерального питания и развития ризосферы.

Известен препарат штамма бактерии Azospirillum zeae OPN-14, депонированного во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под номером ВКПМ В-12542, в качестве биологического агента с ростостимулирующей активностью по отношению к растениям (Патент РФ №2678755). Известен механизм стимуляции роста Azospirillum zeae, обусловленный выделением фитогормоноподобных соединений, непосредственно оказывающих действие на рост растений. Однако данный эффект не позволяет качественно улучшить насыщение растения минеральными солями, так как не оказывает комплексного влияния на ризосферу.

Известен фосфатмобилизующий штамм почвенных бактерий Lelliottia nimipressuralis ССМ 32-3, продуцент фитогормонов, депонированный во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов ФГБУ ГосНИИгенетика под регистрационным номером ВКПМ В-12783 (Патент РФ №2676926). Механизм действия микроорганизма на рост растений обусловлен увеличением доступности фосфосодержащих соединений в почве для питания корней.

Известен эффективный штамм почвенных фосфатрастворяющих бактерий Pseudomonas chlororaphis ssp chlororaphis Vsk-26a3, обладающий способностью подавлять фитопатогенные грибы и бактерии. Штамм Pseudomonas chlororaphis ssp chlororaphis Vsk-26a3 высвобождает фосфаты из нерастворимого минерального сырья, имеет широкий спектр действия против фитопатогенных грибов (подавляет 15 видов) и бактерий, а также стимулирует рост растений и повышает их урожайность. Штамм депонирован в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ-Оболенск» под номером В-7427 (Патент РФ №2603281).

Известен штамм микроскопического гриба Trichoderma asperellum, депонированный во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов под номером F-1323, оказывающий комплексное действие для защиты сельскохозяйственных растений от болезней, вызываемых фитопатогенными грибами, стимуляции роста и повышения урожайности растений, а также биодеградации пожнивных остатков и улучшения фитосанитарного состояния почв (Патент РФ №2634415).

Известен консорциум молочнокислых, азотфиксирующих и фосфатмобилизующих бактерий, способствующий усилению минерального питания и позволяющий повысить урожайность на 25-35%, приживаемость растений на 20-40% и качество стандартного посадочного материала (Патент РФ №2127509). Консорциум применяется для предпосевной обработки семян, для прямого внесения в грунт перед посевом или высадкой растений, для обработки вегетирующей части растений или внесения в почву в период роста. Однако отсутствуют данные о способности консорциума снижать численность патогенных микроорганизмов, разлагать растительные остатки в почве и влиять непосредственно на рост корневой системы.

Известен консорциум микроорганизмов, состоящий из четырех штаммов почвенных бактерий-антагонистов Bacillus polymixa, Bacillus thuringiensis, Pantoea agglomerans и Pantoea chlororatis, обладающих фитопротекторными свойствами (Патент РФ №2149552). Консорциум применяется для защиты от серой гнили и мучнистой росы у томата и огурца, бактериального рака у клевера, сосудистого бактериоза у качанной капусты, угловатой пятнистости у огурца, фузариозного увядания у томата, гельминтоспороза у ячменя, корневых гнилей у хлопчатника. Показано защитное действие, оказываемое препаратом на корневую систему. Однако отсутствуют данные о способности консорциума непосредственно влиять на рост и развитие корневой системы.

Наиболее близким техническим решением является препарат для защиты растений от возбудителей болезней сельскохозяйственных культур, обладающий фитопротекторными, целлюлолитическими и ростостимулирующими свойствами, включающий культуральную жидкость штаммов микроорганизмов, отличающийся тем, что в качестве культуральной жидкости штаммов микроорганизмов он содержит культуральные жидкости штаммов бактерий Bacillus amyloliquefaciens ВКПМ В-11986, Bacillus amyloliquefaciens ВКПМ В-11987, Pseudomonas brassicacearum ВКПМ В-11984, Rahnella aquatilis ВКПМ В-11985, Serratia plymuthica ВКПМ В-12008 в соотношении 1:1:1:1:1 с титром каждого штамма бактерий не менее 1×10⁹КОЕ в 1 см³ , см патент РФ № 2595405.

Однако препарат на основе смеси данных штаммов бактерий с комплексной фитопротекторной, целлюлолитической и ростостимулирующей активностью, предназначен для снижения инфекционного фона в период вегетации растений, а также ускорения разложения соломы и пожнивных остатков, активации микробиоценоза почв и повышения урожайности сельскохозяйственных культур и качества производимой продукции. Предложенный препарат не предусмотрен для использования с целью воздействия на ускоренное развитие и защиту корневой системы растения от почвенных патогенов, активацию процессов мобилизации и увеличения доступности минерального питания.

Раскрытие изобретения.

Опирающееся на это оригинальное наблюдение настоящее изобретение, главным образом, имеет целью предложить ускоритель роста корневой системы растений на основе смеси штаммов микроорганизмов с комплексной активностью по стимуляции роста корневой системы, самого растения, включающей защиту от почвенных патогенов, ускоренное разложение отмирающих корней, увеличение доступности минерального питания, прямое стимулирование роста корней выделяемыми фитогормонами и стабилизацию ризосферного сообщества микроорганизмов, приводящих в итоге к повышению обильности цветения и урожайности сельскохозяйственных культур и качества производимой продукции.

Поставленная задача решается за счет использования консорциумов микроорганизмов следующего состава:

1. Ускоритель роста корневой системы для обработки молодых и взрослых растений в период вегетации и цветения, содержащий культуральную жидкость микроорганизмов Bacillus licheniformis с титром не менее 1,5×10⁷ КОЕ в см³, Bacillus pumilus с титром не менее 1,5×10⁷ КОЕ в см³, Bacillus subtilis с титром не менее 10⁷ КОЕ в см³, Paenibacillus polymyxa с титром не менее 2×10⁷ КОЕ в см³, применяемый в виде 0,2% раствора в чистой воде.

1. Ускоритель роста корневой системы, повышающий доступность минерального питания и повышающий защиту от почвенных патогенов, для обработки молодых и взрослых растений в период вегетации и цветения, содержащий культуральную жидкость микроорганизмов Bacillus mucilaginosus с титром не менее 2,5×10⁷ КОЕ в см³, Pseudomonas chlororaphis с титром не менее 10⁷ КОЕ в см³, Pseudomonas putida с титром не менее 1,5×10⁷ КОЕ в см³, Trichoderma harzianum с титром не менее 1,5×10⁷ КОЕ в см³, Trichoderma viride с титром не менее 2×10⁷ КОЕ в см³, применяемый в виде 0,2% раствора в чистой воде.

2. Ускоритель роста корневой системы комбинированного действия для обработки молодых и взрослых растений в период вегетации и цветения, содержащий культуральную жидкость микроорганизмов Arthrobacter globiformis с титром не менее 6,6×10⁷ КОЕ в см³, Bacillus coagulans с титром не менее 1,2×10⁷ КОЕ в см³, Bacillus licheniformis с титром не менее 1×10⁷ КОЕ в см³, Bacillus mucilaginosus с титром не менее 1×10⁷ КОЕ в см³, Bacillus pumilus с титром не менее 3,3×10⁷ КОЕ в см³, Bacillus subtilis с титром не менее 1×10⁷ КОЕ в см³, Paenibacillus polymyxa с титром не менее 3,3×10⁷ КОЕ в см³, применяемый в виде 0,2% раствора в чистой воде.

Технический результат, получаемый при использовании данных препаратов, заключается в стимуляции роста корневой системы, приводящей к увеличению самого растения, обильности цветения, повышении урожайности сельскохозяйственных культур и качества получаемой продукции.

Культурально-морфологические признаки штаммов бактерий, входящих в заявляемый состав

Культуральные признаки при поверхностном культивировании бактерий на ΜΠΑ:

Arthrobacter globiformis образуют гладкие, круглые, выпуклые колонии с ровным краем.

Bacillus licheniformis образуют круглые колонии сероватого цвета, с неровным краем, 3-5 мм в диаметре, слизистые, приподнятые у молодой культуры и шероховатые, плоские у стареющей;

Bacillus pumilus образуют круглые колонии светло-серого цвета, с ровным краем, 3-5 мм в диаметре, слизистые, приподнятые у молодой культуры и шероховатые, плоские у стареющей;

Bacillus subtilis образуют круглые бесцветные колонии сухие, мелкоморщинистые, бархатистые, край колонии волнистый;

Bacillus mucilaginosus образуют колонии выпуклые, бесцветные, прозрачные, слизистые, с ровным краем, вязкой консистенции, диаметром 3-5 мм;

Bacillus coagulans образуют бесцветные колонии от мелких до средних или крупных со слегка волнистым краем. Различия в размере колоний на одной и той же чашке с агаром могут создать впечатление, что культура загрязнена;

Paenibacillus polymyxa формируют бесцветные, плоские или выпуклые, гладкие и слизистые колонии с пильчатым краем;

Pseudomonas chlororaphis образуют большие, непрозрачные, плоские колонии с неровными краями, окраска от бесцветной до оранжевой;

Pseudomonas putida формируют полупрозрачные, бесцветные, блестящие колонии округло-угловидной формы с гладкими цельными краями.

Культуральные признаки при поверхностном культивировании грибов на сусло-агаре:

Trichoderma harzianum быстро образует крупные зональные, опушенные колонии с хлопьевидным воздушным мицелием, оборотная сторона неокрашенная;

Trichoderma viride быстро образует крупные непигментированне опушенные колонии. Конидиальное спороношение в небольших подушечках сине-зелёного цвета

Морфологические признаки

Arthrobacter globiformis в процессе старения культуры морфология клеток изменяется от состояния грамотрицатеотных палочковидных клеток до грамположительных коккоидых.

Клетки Bacillus licheniformis представляют собой грамположительные спорообразующие палочки.

Клетки Bacillus pumilus представляют собой грамположительные палочки с эндоспорами и перитрихальными жгутиками.

Клетки Bacillus subtilis представляют собой грамположительные спорообразующие (споры расположены центрально) палочки размером 3 мкм на 0,4 мкм.

Клетки Bacillus mucilaginosus представляют собой крупные палочки правильной формы с округлыми концами, единичные, со слизистой оболочкой.

Клетки Bacillus coagulans представляют собой грамположительные, спорообразующие, подвижные палочки размером примерно 0,9 мкм на 3,0–5,0 мкм.

Клетки Paenibacillus polymyxa представляют собой грамположительные палочки размером 0,8 мкм на 2-5 мкм , формируют термостабильную овальную эндоспору, превышающую размер клетки (лимоновидной формы).

Клетки Pseudomonas chlororaphis представляют собой грамотрицательные палочки, не образующие спор с одним или несколькими полярными жгутиками.

Клетки Pseudomonas putida представляют собой грамотрицательные палочки, не образующие спор, обладают одним или несколькими жгутиками.

Конидиеносцы Trichoderma harzianum в очертании пирамидальные, с супротивными веточками в узлах, с мутовками 2-5 фляговидных фиалид размером 8 мкм на 4 мкм.

Конидиеносцы Trichoderma viride рыхлоразветвлённые, веточки парные, фиалиды также парные, узкофляговидные, 10 мкм на 3 мкм, конидии зелёные, шаровидные 4,5 мкм на 3,5 мкм, отчётливо бородавчатые.

Все указанные штаммы не являются зоопатогенными и фитопатогенными.

Культивирование

В качестве сред для размножения и поддержания чистых культур используется картофельный агар. Культивация производится при 25°С. Подрощенные культуры хранятся в пробирках со скошенным слоем под марлевой пробкой при 5С.

Для ферментации в качестве питательной среды используется картофельная среда. Время культивирования в аэрируемом 20 литровом ферментёре составляет 36-48 часов при температуре 25°С.

Ферментация проводится совместно: объединенные в указанных соотношениях культуральные жидкости микроорганизмов инокулируются в среду в виде смеси. В процессе культивации количественные соотношения микроорганизмов в консорциуме сохраняются. После культивации раствор расфасовывается и хранится при комнатной температуре.

Промышленная применимость.

Ускоритель роста корневой системы растений во всех трех вариантах (далее указано как препарат 1, препарат 2 и препарат 3) по результатам испытаний признан соответствующим требованиям ТУ 20.20.13.120-001 - регуляторы роста растений.

Определение действия линейки препаратов на рост растений проводилось на кафедре ботаники и микологии медико-биологического факультета Воронежского государственного университета. В ходе исследований эффективность всех составов была продемонстрирована на примерах.

Пример 1. Оценка влияния препаратов на прирост сухой и свежей массы побегов и на обильность цветения.

Черенки тестовых культур, быстро укоренившееся, были пересажаны в горшки объемом 0,5л. содержащие субстрат. Для каждого опыта было предусмотрено четыре растения.

Орошение было спроектировано таким образом, чтобы раствор равномерно поступал под растение. В дневное время проводили одно или два орошения (используя 0,07-0,08 л. раствора на растение для каждого орошения). Растения выращивали в фитокамере при температуре 25-26°С в дневное время (18 часов в течении первых четырех недель вегетативной стадии и 10 часов в течении следующих девяти недель, в так называемой фазе цветения) и при температуре 18-20°С в ночное время. Они освещались лампами, производящими 600 ватт на квадратный метр.

Испытуемые растения орошали 0,2% раствором биопрепаратов на деионизированной воде, соответствующих составам 1, 2, 3 (указаны выше), контрольные растения орошали деионизированной водой.

После выращивания оценивали сырую и сухую массу побегов. В результате наблюдали увеличение сырой массы побегов на 20%, 14% и 5% при применении препаратов 1, 2 и 3 соответственно. Кратное увеличение массы наблюдали и для сухих побегов.

Таблица 1. Влияние препаратов на сырую и сухую массу побегов.

Сырая масса побегов (грамм) Сырая масса побегов (%) Сухая масса побегов (грамм) Сухая масса побегов (%) Контроль 73,67 100 % 23,85 100 % Препарат 1 88,70 120,4 % 28,26 118,5 % Препарат 2 84,41 114,6 % 27,3 114,5 % Препарат 3 77,27 104,9 % 26,5 111,1 %

Так же оценивали площадь зеленых и красных листьев у каждого растения. Оценка площади красных листьев позволяла оценить интенсивность образования антоцианов, что косвенно позволяло оценить вклад исследуемых препаратов в эффективность цветения. В результате наблюдали увеличение доли красных листьев как внутри серии, так и относительно контроля. Так доля красных листьев увеличилась на 118%, 68% и 12% при применении препаратов 1, 2 и 3 соответсвенно.

Таблица 2. Влияние препаратов на увеличение доли красных листьев.

Общая площадь зеленых листьев (см^2) Общая площадь красных листьев (см^2) Доля красных листьев растения (%) Увеличение доли красных листьев относительно контроля (%) Контроль 2203,13 543,61 19,8 % 100 % Препарат 1 1792,4 1186,49 39,8 % 218,3 % Препарат 2 1916,95 914,33 32,3 % 168,2 % Препарат 3 1755,15 609,32 25,8 % 112,1 %

Таким образом, технический результат заявляемого изобретения - стимуляция роста и повышение продуктивности сельскохозяйственных растений. Он достигается тем, что для обработки растений используются консорциумы микроорганизмов, обладающие ярко выраженной ростостимулирующей активностью за счет фитогормонподобного действия на растения, оздоровления ризосферного сообщества, улучшения их минерального питания, благодаря мобилизации фосфорного питания, при этом способных длительное время сохранять жизнеспособность и биологическую активность при хранении в виде жидкой культуры.

Изобретения относятся к сельскому хозяйству. Ускоритель роста корневой системы растений, содержащий культуральную жидкость микроорганизмов Bacillus licheniformis с титром не менее 1,5*10⁷ КОЕ в см³, Bacillus pumilus с титром не менее 1,5*10⁷ КОЕ в см³, Bacillus subtilis с титром не менее 10⁷ КОЕ в см³, Paenibacillus polymyxa с титром не менее 2*10⁷ КОЕ в см³, применяющийся в виде 0,2% раствора в деионизированной воде для обработки молодых и взрослых растений в период вегетации и цветения. Ускоритель роста корневой системы растений, содержащий культуральную жидкость микроорганизмов Bacillus mucilaginosus с титром не менее 2,5*10⁷ КОЕ в см³, Pseudomonas chlororaphis с титром не менее 10⁷ КОЕ в см³, Pseudomonas putida с титром не менее 1,5*10⁷ КОЕ в см³, Trichoderma harzianum с титром не менее 1,5*10⁷ КОЕ в см³, Trichoderma viride с титром не менее 2*10⁷ КОЕ в см³, применяющийся в виде 0,2% раствора в деионизированной воде, повышающий доступность минерального питания и повышающий защиту от почвенных патогенов, для обработки молодых и взрослых растений в период вегетации и цветения. Ускоритель роста корневой системы растений, содержащий культуральную жидкость микроорганизмов Arthrobacter globiformis с титром не менее 6,6*10⁷ КОЕ в см³, Bacillus coagulans с титром не менее 1,2*10⁷ КОЕ в см³, Bacillus licheniformis с титром не менее 1*10⁷ КОЕ в см³, Bacillus mucilaginosus с титром не менее 1*10⁷ КОЕ в см³, Bacillus pumilus с титром не менее 3,3*10⁷ КОЕ в см³, Bacillus subtilis с титром не менее 1*10⁷ КОЕ в см³, Paenibacillus polymyxa с титром не менее 3,3*10⁷ КОЕ в см³, применяющийся в виде 0,2% раствора в деионизированной воде, являющийся ускорителем комбинированного действия для обработки молодых и взрослых растений в период вегетации и цветения. Изобретения позволяют стимулировать рост корневой системы растения, осуществлять защиту от почвенных патогенов, ускорить разложение отмирающих корней, увеличить доступность минерального питания, повысить обильность цветения, урожайность сельскохозяйственных культур и качество производимой продукции. 3 н.п. ф-лы, 2 табл., 1 пр.

1. Ускоритель роста корневой системы растений, содержащий культуральную жидкость микроорганизмов:

Bacillus licheniformis с титром не менее 1,5*10⁷ КОЕ в см³,

Bacillus pumilus с титром не менее 1,5*10⁷ КОЕ в см³,

Bacillus subtilis с титром не менее 10⁷ КОЕ в см³,

Paenibacillus polymyxa с титром не менее 2*10⁷ КОЕ в см³,

применяемый в виде 0,2% раствора в деионизированной воде,

применяемый для обработки молодых и взрослых растений в период вегетации и цветения.

2. Ускоритель роста корневой системы растений, содержащий культуральную жидкость микроорганизмов:

Bacillus mucilaginosus с титром не менее 2,5*10⁷ КОЕ в см³,

Pseudomonas chlororaphis с титром не менее 10⁷ КОЕ в см³,

Pseudomonas putida с титром не менее 1,5*10⁷ КОЕ в см³,

Trichoderma harzianum с титром не менее 1,5*10⁷ КОЕ в см³,

Trichoderma viride с титром не менее 2*10⁷ КОЕ в см³,

применяемый в виде 0,2% раствора в деионизированной воде,

повышающий доступность минерального питания и повышающий защиту от почвенных патогенов, для обработки молодых и взрослых растений в период вегетации и цветения.

3. Ускоритель роста корневой системы растений, содержащий культуральную жидкость микроорганизмов:

Arthrobacter globiformis с титром не менее 6,6*10⁷ КОЕ в см³,

Bacillus coagulans с титром не менее 1,2*10⁷ КОЕ в см³,

Bacillus licheniformis с титром не менее 1*10⁷ КОЕ в см³,

Bacillus mucilaginosus с титром не менее 1*10⁷ КОЕ в см³,

Bacillus pumilus с титром не менее 3,3*10⁷ КОЕ в см³,

Bacillus subtilis с титром не менее 1*10⁷ КОЕ в см³,

Paenibacillus polymyxa с титром не менее 3,3*10⁷ КОЕ в см³,

применяемый в виде 0,2% раствора в деионизированной воде,

являющийся ускорителем комбинированного действия для обработки молодых и взрослых растений в период вегетации и цветения.