ГИДРОГЕЛЬ, СОДЕРЖАЩИЙ В КАЧЕСТВЕ СУБСТРАТА ПРОИЗВОДНОЕ ГИАЛУРОНОВОЙ КИСЛОТЫ, МОДИФИЦИРОВАННОЕ ГАЛЛОЛЬНОЙ ГРУППОЙ, И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ Российский патент 2022 года по МПК C08B37/08 C08J3/75 C08L5/08 A61L27/20 A61L27/54 A61K47/36 

Область техники

Настоящее изобретение относится к гидрогелю на основе производного гиалуроновой кислоты, модифицированного галлольной группой, и его применению.

Уровень техники

Интерес к функциональным биоматериалам растет, так как рынки сбыта для медицинской, биотехнологической, косметической и прочих индустрий быстро расширяются. В частности, все более популярной становится разработка биосовместимых материалов с применением стабильных природных полимеров, а не химически синтезированных полимеров, которые могут оказаться токсичными или иметь побочные эффекты.

Гиалуроновую кислоту в качестве биосовместимого материала изучали в ходе различных исследований и разработок. Гиалуроновая кислота представляет собой полимер биологического происхождения, который при применении в живом организме имеет незначительные побочные эффекты и является гидрофильным вследствие химической структуры содержащегося сахара. Кроме того, благодаря содержанию большого количества влаги гиалуроновая кислота, как известно, выступает в роли физиологического буфера и смазки при трении суставов и влияет на упругость кожи. Также гиалуроновая кислота защищает от внешнего бактериального воздействия и при попадании в живой организм биоразлагается под воздействием гиалуронидазы. Гиалуроновая кислота играет важную роль для систем доставки лекарств, вызывая связывание гиалуроновой кислоты с различными лекарственными средствами. В частности, после одобрения Управления США по контролю за качеством продуктов питания и лекарственных средств (FDA) гиалуроновую кислоту стали широко применять в качестве медицинского биоматериала, материала скаффолда в тканевой инженерии и полимера для доставки лекарств. Более того, гиалуроновая кислота в изобилии присутствует в различных слоях кожи и выполняет сложные функции, такие как доставка влаги и поддержка тканей внеклеточного матрикса, выступает в роли наполнителя кожи и участвует в процессе регенерации тканей. Однако с возрастом количество гиалуроновой кислоты, коллагена, эластина и других матричных полимеров, присутствующих в коже, уменьшается. Например, регулярное воздействие ультрафиолетовых солнечных лучей приводит к тому, что клетки кожи не только сокращают выработку гиалуроновой кислоты, но и характеризуются повышенной скоростью ее разложения. Уменьшение содержания гиалуроновой кислоты приводит к морщинам, ямкам, потере влаги и/или другим нежелательным последствиям, которые способствуют старению кожи. Поэтому в качестве одного из способов улучшения состояния кожи широко используется композиция наполнителя, содержащая гиалуроновую кислоту в качестве основного компонента.

В нескольких публикациях традиционные технологии получения гиалуроновой кислоты приводятся в качестве примеров синтеза сшитых нерастворимых производных гиалуроновой кислоты с использованием соединений, имеющих в своем составе две функциональные группы, например, бисэпоксид, бисгалогенид, а также формальдегид. В частности, в патенте США №4,582,865 раскрыт пример применения дивинилсульфона для сшивания гиалуроновой кислоты; в патенте США №4,713,448 раскрыта реакция сшивания с применением формальдегида; а в патенте США №5,356,883 раскрыт пример синтеза геля на основе производного гиалуроновой кислоты, карбоксильная группа которого модифицирована О-ацилмочевиной или N-ацилмочевиной с применением различных карбодиимидов. Однако сшитые продукты на основе гиалуроновой кислоты, полученные способами, описанными в данных патентах, обладают более низкой стабильностью по сравнению с ферментом, вызывающим распад гиалуроновой кислоты, и высокое содержание непрореагировавших химических веществ, которые могут оказаться биотоксичными. Кроме того, контролировать сшивание или физические свойства таких продуктов в зависимости от их предполагаемого применения нелегко. Таким образом, существуют ограничения в применении таких продуктов в различных медицинских материалах. Следовательно, необходимо разработать методику, с помощью которой будет легко контролировать физические свойства гидрогеля гиалуроновой кислоты с сохранением его превосходной биосовместимости.

Соответственно, для решения данных проблем авторы настоящего изобретения делали все возможное для разработки технологии, способной улучшить функциональность гиалуроновой кислоты, являющейся биосовместимым материалом. В результате авторы настоящего изобретения разработали гидрогелевую платформу на основе гиалуроновой кислоты, модифицированной пирогаллольной группой, и создали настоящее изобретение на базе данной методики. Техническая задача

Таким образом, объектом настоящего изобретения является получение производного гиалуроновой кислоты путем модификации гиалуроновой кислоты пирогаллольной группой и способ его получения.

Другим объектом настоящего изобретения является способ получения гидрогеля на основе производного гиалуроновой кислоты, включающий стадию сшивания производных гиалуроновой кислоты.

Еще одним объектом настоящего изобретения является гидрогель на основе производного гиалуроновой кислоты, имеющий структуру, где производные гиалуроновой кислоты поперечно сшиты.

Еще одним объектом настоящего изобретения является получение носителя для доставки лекарственного средства или системы доставки лекарственных средств с применением гидрогеля на основе производного гиалуроновой кислоты.

Еще одним объектом настоящего изобретения является получение медицинского материала, например, скаффолда для тканевой инженерии, с применением гидрогеля на основе производного гиалуроновой кислоты.

Еще одним объектом настоящего изобретения является получение раневой повязки или противоспаечного барьера на основе производного гиалуроновой кислоты.

Еще одним объектом настоящего изобретения является получение наполнителя, содержащего гидрогель на основе производного гиалуроновой кислоты.

Еще одним объектом настоящего изобретения является разработка способа разглаживания морщин, включающего стадию введения наполнителя в/под кожу индивидуума.

Однако технические задачи, которые должны решаться с помощью настоящего изобретения, не ограничиваются вышеупомянутыми задачами, и другие не упомянутые задачи могут быть поняты специалистами в данной области техники из нижеследующего описания.

Решение технической задачи

Для достижения целей настоящего изобретения, как описано выше, в рамках настоящего изобретения предлагается способ получения гидрогеля гиалуроновой кислоты, включающий стадию сшивания производных гиалуроновой кислоты, каждое из которых модифицировано галлольной группой, при этом производные гиалуроновой кислоты модифицируются галлольной группой вследствие реакции между гиалуроновой кислотой и 5'-гидроксидопамином.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения производное гиалуроновой кислоты может быть представлено нижеследующей Формулой 1, где производное гиалуроновой кислоты может иметь молекулярную массу от 10000 Да до 2000000 Да и коэффициент замещения галлольной группой примерно от 0,1% до 50%

(В Формуле 1 выше, R₁ представляет собой гидроксильную группу или a n - целое число от 1 до 1000).

В другом варианте осуществления настоящего изобретения, на стадии сшивания, поперечное сшивание можно проводить путем добавления окислителя или регулятора кислотности, где в роли окислителя может выступать периодат натрия, пероксид водорода, пероксидаза хрена или тирозиназа, а регулятором кислотности - гидроксид натрия, гидроксид лития, гидроксид калия, гидроксид рубидия, гидроксид цезия, гидроксид магния, гидроксид кальция, гидроксид стронция или гидроксид бария.

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения на стадии сшивания, осуществляемой путем добавления окислителя, между производными гиалуроновой кислоты может образовываться сшивка, представленная нижеследующей Формулой 2

(В приведенной выше Формуле 2 НА' представляет собой гиалуроновую кислоту, в которой карбоксильная группа замещена амидной группой.)

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения на стадии сшивания, осуществляемой путем добавления регулятора кислотности, между производными гиалуроновой кислоты может образовываться сшивка, представленная нижеследующей Формулой 3

(В приведенной выше Формуле 3 НА' представляет собой гиалуроновую кислоту в которой карбоксильная группа замещена амидной группой.)

Кроме того, в рамках настоящего изобретения предлагается гидрогель гиалуроновой кислоты, полученный путем сшивания производных гиалуроновой кислоты, каждое из которых представлено в вышеуказанной Формуле 1, например, гидрогель гиалуроновой кислоты, где между производными гиалуроновой кислоты образуется сшивка, как показано выше в Формуле 2 или Формуле 3; а также носитель для доставки биологически активного вещества, включающий гидрогель гиалуроновой кислоты. С этой точки зрения в одном варианте осуществления настоящего изобретения носитель включает, помимо прочего, антитело, фрагмент антитела, белок, пептид, полипептид, низкомолекулярное химическое соединение, ДНК и/или РНК, миРНК, ген, а также стволовые клетки, включая стволовые клетки взрослого индивидуума, мезенхимальные стволовые клетки (МСК) или индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК). С этой точки зрения в другом варианте осуществления настоящего изобретения носитель для доставки биоактивного вещества обеспечивает замедленное высвобождение биоактивного вещества in vivo и ex vivo.

Кроме того, в рамках настоящего изобретения предлагается гидрогель гиалуроновой кислоты, полученный путем сшивания производных гиалуроновой кислоты, каждое из которых представлено вышеуказанной Формулой 1, например, гидрогель гиалуроновой кислоты, в котором сшивка, показанная выше в Формуле 2 или Формуле 3, образуется между производными гиалуроновой кислоты; а также скаффолд для тканевой инженерии, содержащий гидрогель гиалуроновой кислоты.

Кроме того, в рамках настоящего изобретения предлагается наполнитель, содержащий производное гиалуроновой кислоты, модифицированное галлольной группой, или гидрогель на основе производного гиалуроновой кислоты, полученный путем сшивания производных гиалуроновой кислоты.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения в соответствии с этой целью производное гиалуроновой кислоты может иметь молекулярную массу от 10000 до 2000000 Да; а производное гиалуроновой кислоты может иметь степень замещения пирогаллольной группой от 0,1% до 50%, предпочтительно от 1% до 30%, и более предпочтительно от 2% до 20%. В другом варианте осуществления настоящего изобретения производное гиалуроновой кислоты может содержаться в количестве от 0,1% (мас/об) до 15% (мас/об) относительно всей композиции наполнителя.

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения наполнитель может находиться в жидком состоянии ex vivo и гелеобразном in vivo без сшивающего агента. В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения наполнитель можно ввести путем инъекций в любой участок, выбранный из группы, состоящей из области слезной борозды, области межбровной складки, области края глаза, области лба, области переносицы, области носогубных складок, области марионеточных морщин и области складок на шее. В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения композиция наполнителя может дополнительно содержать любой фактор роста клеток, выбранный из группы, состоящей из фактора роста фибробластов (FGF), фактора роста эпителиальных клеток (EGF), фактора роста кератиноцитов (KGF), трансформирующего фактора роста альфа (TGF-α), трансформирующего фактора роста бета (TGF-β), гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (GCSF), инсулиноподобного фактора роста (IGF), фактора роста эндотелия сосудов (VEGF), фактора роста гепатоцитов (HGF), тромбоцитарного фактора роста ВВ (PDGF-BB), нейротрофического фактора головного мозга (BDNF) и нейротрофического фактора глиальных клеток (GDNF). В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения композиция наполнителя может дополнительно содержать любой компонент, выбранный из группы, состоящей из местного анестетика, антиоксиданта, витамина и их комбинаций.

Кроме того, в рамках настоящего изобретения предлагается способ получения наполнителя, включающий стадию введения пирогаллольной группы в костяк глюкуроновой кислоты в гиалуроновой кислоте для получения производного гиалуроновой кислоты; и стадию добавления производного гиалуроновой кислоты в водную среду и перемешивания.

Кроме того, в рамках настоящего изобретения предлагается способ разглаживания морщин, включающий стадию введения наполнителя в/под кожу индивидуума.

Кроме того, в рамках настоящего изобретения предлагается ранозаживляющий агент или противоспаечный барьер, содержащий производное гиалуроновой кислоты, модифицированное галлольной группой, или гидрогель на основе производного гиалуроновой кислоты, полученный путем поперечного сшивания производных гиалуроновой кислоты.

Полезный эффект изобретения

Способ получения гидрогеля гиалуроновой кислоты по настоящему изобретению основан на модифицировании производного гиалуроновой кислоты галлольной группой и включает стадию сшивания производных гиалуроновой кислоты в соответствующих условиях окисления или специфического рН. Настоящее изобретение позволяет эффективно контролировать физические свойства гидрогеля, такие как скорость сшивания, упругость и сила адгезии, в зависимости от способа сшивания, одновременно придавая гидрогелю превосходную биосовместимость. Таким образом, настоящее изобретение можно применять в различных областях, таких как медицина и косметология.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1 иллюстрирует процесс синтеза производного гиалуроновой кислоты по настоящему изобретению.

Фиг. 2 иллюстрирует результаты анализа структуры производного гиалуроновой кислоты по настоящему изобретению с помощью (а) инфракрасной спектроскопии с преобразованием Фурье (FT-IR) или (b) протонного магнитного резонанса (ПМР).

На Фиг. 3 схематично показаны виды гидрогелей гиалуроновой кислоты и изменения в сшивании в зависимости от способа поперечного сшивания.

Фиг. 4 иллюстрирует (а) результат анализа с помощью УФ-излучения изменений в химической структуре, которые происходят в процессе получения гидрогеля гиалуроновой кислоты при использовании NalO₄, и (b) механизм поперечного сшивания в зависимости от результата.

Фиг. 5 иллюстрирует (а) результат анализа с помощью УФ-излучения изменений в химической структуре, которые происходят в процессе получения гидрогеля гиалуроновой кислоты при использовании NaOH, и (b) механизм поперечного сшивания в зависимости от результата.

Фиг. 6 иллюстрирует результаты определения скорости образования гидрогелей гиалуроновой кислоты по настоящему изобретению. Фиг. 6 (а) иллюстрирует результаты визуального определения образования гидрогелей с течением времени, а Фиг. 6 (b) иллюстрирует результаты определения изменений модуля упругости гидрогелей стечением времени.

Фиг. 7 иллюстрирует результаты определения жесткости и упругости гидрогелей гиалуроновой кислоты по настоящему изобретению. Фиг. 7 (а) иллюстрирует результаты определения изменений модуля упругости гидрогелей при 0,1-1 Гц, а Фиг. 7 (b) иллюстрирует результаты сравнения модуля упругости и тангенса δ (G''/G') гидрогелей.

Фиг. 8 иллюстрирует результаты определения изменений в жесткости и упругости гидрогелей гиалуроновой кислоты, сшитых NalO₄, в зависимости от молекулярной массы и концентрации производных гиалуроновой кислоты. Фиг. 8 (а) иллюстрирует результаты определения изменений модуля упругости гидрогелей при 0,1-1 Гц, а Фиг. 8 (b) иллюстрирует результаты сравнения модуля упругости и тангенса δ (G''/G') гидрогелей.

Фиг. 9 иллюстрирует результаты определения силы адгезии гидрогелей гиалуроновой кислоты по настоящему изобретению. Фиг. 9 (а) иллюстрирует результат измерения с помощью реометра изменений силы, приложенной в зависимости от расстояния между пластинами, а Фиг. 9 (b) иллюстрирует результат количественной оценки и оценки силы адгезии.

Фиг. 10 иллюстрирует результаты определения степени набухания и разложения гидрогелей гиалуроновой кислоты по настоящему изобретению. Такие результаты были получены путем количественной оценки, а также оценки степени набухания и степени разложения гидрогелей гиалуроновой кислоты, полученных с применением производных гиалуроновой кислоты, которые были синтезированы путем добавления 0,5-кратного (а) или 1,0-кратного (b) 5'-гидроксидопамина относительно молярности гиалуроновой кислоты.

Фиг. 11 иллюстрирует результаты определения того, вызывают ли гидрогели гиалуроновой кислоты по настоящему изобретению цитотоксичность и воспалительную реакцию. Фигуры 11 (а) и (b) соответственно иллюстрируют окрашивание живых/мертвых клеток (масштабная линейка = 100 мкм) и (а) жизнеспособность (b) стволовых клеток жировой ткани человека (hADSC) в дни 1, 3 и 7 после инкапсулирования hADSC с целью оценки токсичности гидрогелей ГК-ПГ. Фиг. 11 (с) иллюстрирует результат иммуноферментного анализа, проведенного для количественного определения ФНО-α, полученного из макрофагов (RAW = 264,7) при совместном культивировании с гидрогелем ГК-ПГ, сшитым раствором NalO₄ или NaOH (n=4, ** р<0,01 по сравнению с группой ЛПС).

Фиг. 12 иллюстрирует результаты определения совместимости in vivo гидрогелей гиалуроновой кислоты по настоящему изобретению. Фиг. 12 (а) иллюстрирует формы гидрогелей ГК-ПГ (СЗ 8%), извлеченных из подкожной области мыши на 0-й, 7-й, 28-й и 84-й день после введения в подкожную область. Фиг. 12 (b) иллюстрирует профили биоразложения in vivo гидрогелей ГК-ПГ. Фиг. 12 (с) и (d) иллюстрируют окрашивание гематоксилином и эозином, соответственно, (с) окрашивание толуидиновым синим (d) гидрогелей, извлеченных вместе с прилегающей тканью на 28-й день после введения (масштабная линейка = 300 мкм).

Фиг. 13 иллюстрирует результаты определения in vivo степени разложения гидрогелей гиалуроновой кислоты по настоящему изобретению in vivo. Фиг. 13 (а) иллюстрирует результаты визуального определения изменений объема гидрогелей, а Фиг. 13 (b) иллюстрирует результаты определения массы оставшихся гидрогелей после того, как гидрогели были подкожно введены мышам.

Фиг. 14 иллюстрирует результаты определения возможности применения гидрогеля, полученного с использованием NalO₄, в качестве препарата для доставки лекарственных средств. Фиг. 14 (а) иллюстрирует результаты определения образования и наличия микрочастиц до или после лиофилизации, и (b) иллюстрирует результат идентификации высвобождаемого БСА, который был инкапсулирован в микрочастицы.

Фиг. 15 иллюстрирует результаты определения возможности применения гидрогеля, полученного с использованием NalO₄, в качестве препарата для доставки лекарственных средств. Фиг. 15 (а) иллюстрирует реакцию сшивания с использованием NalO₄, на Фиг. 15 (b) представлена фотография, сделанная с помощью микроскопа, на которой изображено образование микрочастиц ГК-ПГ (масштабная линейка = 50 мкм), а на Фиг. 15 (с) показано общее количество фактора роста сосудистого эндотелия (VEGF), полученного из балка гидрогеля ГК-ПГ. или микрочастиц ГК-ПГ (ФСБ, 37°С) (n=4).

Фиг. 16 иллюстрирует доставку VEGF и терапевтический эффект от применения гидрогеля, полученного с использованием NalO₄, на примере мыши с ишемией задних конечностей. На Фиг. 16 (а) представлены фото, показывающие результаты внутримышечного введения микрочастиц ГК-ПГ, содержащих VEGF, и наблюдений, сделанных в дни 0 (день введения препарата) и 28. Фиг. 16 (b) иллюстрирует численное представление результатов (n=4-5). На Фиг. 16 (с) представлены результаты окрашивания гематоксилином и эозином, а также трихромного окрашивания по Массону с использованием нормальной ткани мыши в качестве контроля (масштабная линейка = 100 мкм). Фиг. 16 (d) иллюстрирует результат количественного определения фиброзной области в конечности с ишемией (n=12, **р < 0,01 по сравнению с группой ФСБ, ##р < 0,01 по сравнению с группой ГК-ПГ, и @р < 0,05 по сравнению с группой VEGF), а на Фиг. 16 (е) представлены фото мышцы конечности с ишемией, которая была иммуноокрашена для определения наличия α-ГМА (артериол) и фактора фон Виллебранда (vWF) (капиллярных образований). Черные стрелочки показывают образование в пораженной ишемией ткани артериол (α-ГМА-положительных) и капилляров (vWF-положительных), соответственно (масштабная линейка = 100 мкм). На Фиг. 16 (f) показано количество α-ГМА положительно окрашенных просветов и vWF-положительных капилляров в ишемической мышце (n=18,20, *р < 0,05 и **р < 0,01 по сравнению с группой ФСБ, ## р < 0,01 по сравнению с группой ГК-ПГ и @р < 0,01 по сравнению с группой VEGF).

Фиг. 17 иллюстрирует получение адгезивного гидрогеля ГК-ПГ путем NaOH-опосредованного сшивания. Фиг. 17 (а) иллюстрирует образование гидрогеля производного гиалуроновой кислоты путем NaOH-опосредованного сшивания. Фиг. 17 (b) иллюстрирует результат сравнения силы адгезии гидрогеля на основе производного гиалуроновой кислоты, сшитого NaOH, и гидрогеля на основе производного гиалуроновой кислоты, сшитого NalO₄. Фиг. 17 (с) иллюстрирует результат сравнения средней силы отрыва между соответствующими гидрогелями ГК-ПГ (n=3, **р < 0,01 по сравнению с группой NalO₄).

Фиг. 18 (а) кратко иллюстрирует химию адгезии NaOH-индуцированного гидрогеля ГК-ПГ, а на Фиг. 18 (b) представлены фотографии, показывающие адгезию гидрогеля непосредственно к различным органам мыши (сердцу, почке и печени).

Фиг. 19 (а) иллюстрирует результат нанесения NaOH-индуцированного гидрогеля ГК-ПГ на поверхность печени мыши и окрашивания гидрогеля, приставшего к поверхности ткани печени, гематоксилином и эозином через 7 дней (масштабная линейка=500 мкм). Фиг. 19 (b) иллюстрирует результат трансплантации стволовых клеток жировой ткани человека (hADSC) в печень мыши с применением гидрогеля ГК-ПГ, сшитого NaOH, и последующего совместного иммуноокрашивания исходной ткани печени и hADSC в структуре гидрогеля по настоящему изобретению. Были обнаружены клетки, которые до трансплантации были помечены методом ДИЛ (слева). Иммуноокрашивание проводили для CD44, а ядра клеток были докрашены красителем DAPI (справа) (масштабная линейка = 500 мкм).

Фиг. 20 иллюстрирует процесс желатинизации раствора ГК-ПГ по настоящему изобретению путем окисления в организме, при этом Фиг. 20 (а) иллюстрирует введение раствора ГК-ПГ и его желатинизацию путем окисления в организме; а Фиг. 20 (b) иллюстрирует результат визуальной проверки состояния кожи мыши, в которой содержится гидрогель, образованный в организме.

Фиг. 21 иллюстрирует результаты введения раствора ГК-ПГ по настоящему изобретению в кожу и последующего определения, сохраняется ли в организме образующийся гидрогель; при этом Фиг. 21 (а) иллюстрирует результаты визуального определения образования гидрогеля в организме (недели 0, 10 и 24), а Фиг. 21 (b) иллюстрирует результат измерения изменений массы гидрогеля, образованного в организме, примерно за 6 месяцев.

Фиг. 22 иллюстрирует результаты определения условий образования гидрогеля ГК-ПГ из раствора ГК-ПГ по настоящему изобретению и его введения в организм, при этом Фиг. 22 (а) схематично иллюстрирует процесс образования гидрогеля ГК-ПГ, а Фиг. 22 (b) иллюстрирует результат сравнения размера иглы, которую вводили в организм с обычными наполнителями (Megafill, Perlane).

Фиг. 23 иллюстрирует результаты введения раствора ГК-ПГ по настоящему изобретению в кожу путем инъекций и последующего определения эффекта разглаживания морщин до и после инъекции; при этом Фиг. 23 (а) иллюстрирует результат дублирования и сравнения реплик морщинистой кожи, а Фиг. 23 (b) иллюстрирует результаты количественного определения площади, длины и глубины морщин и их сравнения.

Фиг. 24 иллюстрирует результаты сравнения с обычными наполнителями (Megafill, Perlane) с точки зрения способности удерживаться в организме; при этом Фиг. 24 (а) иллюстрирует результаты введения в кожу растворов ГК-ПГ по настоящему изобретению (200 кДа, 1 мДа), препаратов Megafill и Perlane путем инъекций, и последующего визуального определения образования в организме гидрогелей (дни 0, 14, 28, 56, 84, 168 и 252), а Фиг. 24 (b) иллюстрирует результат измерения изменений массы гидрогелей, образованных в организме, приблизительно за 9-месячный период.

Фиг. 25 иллюстрирует результаты сравнения с обычными наполнителями (Megafill, Perlane) с точки зрения способности удерживаться в организме; при этом Фиг. 25 (а) иллюстрирует результаты введения в кожу растворов ГК-ПГ по настоящему изобретению (200 кДа, 1 мДа), препаратов Megafill и Perlane путем инъекций, и последующего визуального определения образования в организме гидрогелей (дни 0, 14, 28, 56, 84 и 168), а Фиг. 25 (b) иллюстрирует результат измерения изменений объма гидрогелей, образованных в организме, приблизительно за 9-месячный период.

Фиг. 26 иллюстрирует результаты определения силы адгезии в организме гидрогеля, образованного в организме, при этом Фиг. 26 (а) иллюстрирует результат, полученный при определении силы адгезии препарата Perlane, а Фиг. 26 (b) иллюстрирует результаты измерения силы адгезии растворов ГК-ПГ (200 кДа, 1 мДа).

Фиг. 27 иллюстрирует результаты сравнения с обычными наполнителями (Megafill, Perlane) с точки зрения инъецируемости, и такие результаты были получены путем определения изменений силы экструзии при инъекции растворов ГК-ПГ по настоящему изобретению (200 кДа, 1 MDa), препаратов Megafill и Perlane с использованием инъекционных игл различных размеров (21G, 25G, 29G, 30G).

Фиг. 28 иллюстрирует результаты сравнения с обычными наполнителями (Megafill, Perlane) с точки зрения инъецируемости, при этом Фиг. 28 (а) иллюстрирует результат определения изменений силы экструзии при инъекции растворов ГК-ПГ по настоящему изобретению (200 кДа, 1 MDa), препаратов Megafill и Perlane с использованием инъекционной иглы 30G, а Фиг. 28 (b) иллюстрирует результат определения изменений силы экструзии при инъекции растворов ГК-ПГ по настоящему изобретению (200 кДа, 1 мДа), препаратов Megafill и продукта Perlane с использованием инъекционной иглы 29G.

Фиг. 29 иллюстрирует результаты сравнения с обычными наполнителями (Megafill, Perlane) с точки зрения инъецируемости, при этом Фиг. 29 (а) иллюстрирует результат сравнения сил сдвига при инъекции растворов ГК-ПГ по настоящему изобретению (200 кДа, 1 мДа), препаратов Megafill и Perlane с использованием игл для инъекций различных размеров (21G, 25G, 29G, 30G), а Фиг. 29 (b) иллюстрирует результат сравнения динамических сил трения скольжения при инъекции растворов ГК-ПГ по настоящему изобретению (200 кДа, 1 мДа), препаратов Megafill и Perlane с использованием игл для инъекций различных размеров (21G, 25G, 29G, 30G).

Фиг. 30 иллюстрирует результаты инъекций в кожу раствора ГК-ПГ по настоящему изобретению с инкапсулированным фактором роста эпителиальных клеток (20 нг/мл, 1 мкг/мл, 20 мкг/мл) и последующего определения эффекта разглаживания морщин до и после инъекции; при этом Фиг. 30 (а) иллюстрирует результаты дублирования и сравнения реплик морщинистой кожи, а Фиг. 30 (b) иллюстрирует результаты количественного определения площади, длины и глубины морщин и их сравнения.

Фиг. 31 иллюстрирует результаты инъекций в кожу растворов ГК-ПГ по настоящему изобретению с инкапсулированным фактором роста эпителиальных клеток (20 нг/мл, 1 мкг/мл, 20 мкг/мл), окрашивания гематоксилином и эозином ОКТ-замороженной части клеток и гистопатологического исследования.

Фиг. 32 иллюстрирует результаты сравнения эффекта регенерации кожной ткани во времени (1 месяц) между традиционным наполнителем (Perlane), раствором ГК-ПГ, в котором фактор роста эпителиальных клеток не был инкапсулирован, и раствором ГК-ПГ по настоящему изобретению с инкапсулированным фактором роста эпителиальных клеток (10 мкг/мл). Такие результаты были получены в ходе окрашивания гематоксилином и эозином ОКТ-замороженной части клеток и проведения гистопатологического исследования.

Фиг. 33 иллюстрирует результаты сравнения эффекта регенерации кожной ткани во времени (1 месяц) между традиционным наполнителем (Perlane), раствором ГК-ПГ, в котором фактор роста эпителиальных клеток не был инкапсулирован, и раствором ГК-ПГ по настоящему изобретению с инкапсулированным фактором роста эпителиальных клеток (10 мкг/мл). Такие результаты были получены в ходе трихромного окрашивания по Массону ОКТ-замороженной части клеток и проведения гистопатологического исследования.

Фиг. 34 иллюстрирует результаты нанесения раствора ГК-ПГ по настоящему изобретению на рану и последующего визуального определения, образуется ли гидрогель в месте раны, и, таким образом, пристает ли гидрогель к данному месту.

Фиг. 35 кратко иллюстрирует процесс преобразования раствора ГК-ПГ по настоящему изобретению в порошок.

Фиг. 36 иллюстрирует результаты инъекций в кожу раствора ГК-ПГ по настоящему изобретению, который повторно солюбилизировали из его лиофилизированной порошковой формы, и последующего визуального определения образования в организме гидрогеля.

Фиг. 37 иллюстрирует результаты определения стабильности при хранении раствора ГК-ПГ по настоящему изобретению, при этом данные результаты были получены в ходе определения, превращается ли раствор ГК-ПГ в гель в контейнере для хранения при условии хранения раствора ГК-ПГ при комнатной температуре (25°С) или в охлажденном состоянии (4°С).

Фиг. 38 иллюстрирует результаты определения стабильности раствора ГК-ПГ по настоящему изобретению при хранении. Газообразный азот вводили в контейнер для хранения, чтобы предотвратить контакт раствора ГК-ПГ с кислородом, после чего раствор ГК-ПГ хранили в охлажденном состоянии (4°С) в течение 3 дней; с другой стороны, раствор ГК-ПГ хранили в замороженном состоянии (-80°С) в течение 10 дней. Затем эти растворы вводили в кожу путем инъекций и визуально определяли образование в организме гидрогелей с тем, чтобы получить результаты.

Подробное описание изобретения

Далее настоящее изобретение будет описано подробно.

В рамках настоящего изобретения предлагается способ получения гидрогеля гиалуроновой кислоты, включающий стадию сшивания производных гиалуроновой кислоты, каждое из которых модифицировано галлольной группой, при этом производное гиалуроновой кислоты модифицировано галлольной группой в результате реакции между гиалуроновой кислотой и 5'-гидроксидопамином.

Термин «гиалуроновая кислота (ГК)», используемый в данном документе, относится к высокомолекулярному линейному полисахариду, который содержит в качестве повторяющегося звена дисахарид, в котором D-глюкуроновая кислота (GlcA) и N-ацетил-D-глюкозамин (GlcNAc) связаны через β-1,3-гликозидную связь, и который включает как гиалуроновую кислоту, так и ее соли. Что касается солей, то помимо прочего приведены примеры натриевой соли, калиевой соли, магниевой соли, кальциевой соли, алюминиевой соли и тому подобного.

Повторяющееся дисахаридное звено гиалуроновой кислоты может быть представлено нижеследующей Формулой 4 и может составлять от 1 до 1000, но не ограничивается этим.

Гиалуроновая кислота содержится в стекловидном теле глаза, синовиальной жидкости суставов, курином гребешке и т.п. и известна как биоматериал с высокой степенью биосовместимости. Несмотря на большую применимость гидрогеля гиалуроновой кислоты в отношении биоматериалов, ограниченные механические свойства из-за самого природного полимера затрудняют применение гидрогеля гиалуроновой кислоты в получении биоматериалов (например, носитель для доставки лекарств, скаффолд для тканевой инженерии). Таким образом, авторы настоящего изобретения ввели галлольную группу, обладающую высокой окислительной способностью, в гиалуроновую кислоту для получения производного гиалуроновой кислоты (Пример приготовления 1), и сшивали полученные производные гиалуроновой кислоты в условиях соответствующего окислительного или специфического рН (рН 8-9) до получения гидрогеля (Пример приготовления 2). Соответственно, настоящее изобретение имеет техническое значение в том смысле, что такие физические свойства, как скорость сшивания, упругость и сила адгезии гидрогеля, можно эффективно контролировать (Примеры 1 и 3).

Используемый в настоящем документе термин «производное гиалуроновой кислоты» или «конъюгат гиалуроновой кислоты и пирогаллола» можно интерпретировать как включающий как гиалуроновую кислоту, так и ее соль, в которой галлольная группа введена в костяк глюкуроновой кислоты в гиалуроновой кислоте или ее соли.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения производное гиалуроновой кислоты можно получить путем реакции между концом дисахаридного повторяющегося звена вышеуказанной Формулы 4, в частности, его карбоксильной группой и 5'-гидроксидопамином. Производное гиалуроновой кислоты, полученное в результате реакции, содержит по меньшей мере одно повторяющееся звено, представленное нижеследующей Формулой 5, и может быть представлено Формулой 1 ниже

(В Формуле 1 выше, R₁ представляет собой гидроксильную группу или a n - целое число от 1 до 1000.) Кроме того, производное гиалуроновой кислоты может иметь молекулярную массу от 10000 Да до 2000000 Да, а производное гиалуроновой кислоты может иметь степень замещения галольной группой от 0,1% до 50%, но степень замещения пирогаллольной группой не ограничивается данными показателями.

«Степень замещения» означает, что конкретная функциональная группа в гиалуроновой кислоте или ее соли заменена или модифицирована галлольной группой. Степень замещения галлольной группой определяется как количество повторяющихся звеньев, в которые введена галольная группа, из всех повторяющихся звеньев гиалуроновой кислоты, и может быть представлена, по определению, числовым значением в диапазоне от > 0 до ≤ 1, числовым значением в диапазоне от > 0% до ≤ 100%, или числовым значением в диапазоне от > 0 мол % до ≤ 100 мол %.

Термин «гидрогель» в контексте настоящего документа означает трехмерный гидрофильный полимер, сохраняющий достаточное количество влаги. В целях настоящего изобретения гидрогель обозначает гидрогель, образованный из производных гиалуроновой кислоты, каждое из которых модифицировано галлольной группой.

Процесс получения гидрогеля гиалуроновой кислоты можно осуществить путем реакции сшивания между производными гиалуроновой кислоты. Для проведения реакции сшивания может дополнительно потребоваться смешивание производных гиалуроновой кислоты с ФСБ и тому подобным до получения исходного раствора гидрогеля гиалуроновой кислоты. Такое сшивание можно выполнить путем химического сшивания под воздействием ультрафиолетовых лучей, физическим сшиванием или биологическим сшиванием с образованием гидрогеля. В рамках настоящего изобретения химическое сшивание, вызванное ультрафиолетовым излучением, включает фото-сшивание, сшивание с использованием реакционноспособного сшивателя или тому подобное. Биологическое сшивание включает сшивание путем связывания гепарина с фактором роста, сшивание путем связывания комплементарной ДНК или тому подобного и т.д. Физическое сшивание включает сшивание путем водородного связывания, сшивание посредством гидрофобного взаимодействия, сшивание с использованием электростатического взаимодействия или тому подобное. Предпочтительно сшивание можно проводить путем добавления окислителя или регулятора кислотности. Окислителем может быть периодат натрия, пероксид водорода, пероксидаза хрена или тирозиназа, а регулятором кислотности может выступать гидроксид натрия, гидроксид лития, гидроксид калия, гидроксид рубидия, гидроксид цезия, гидроксид магния, гидроксид кальция, гидроксид стронция или гидроксид бария. Однако и окислитель и регулятор кислотности этим перечнем не ограничиваются.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения, в случае, когда добавляют окислитель и проводят сшивание, сшивка, представленная нижеследующей Формулой 2, образуется между производными гиалуроновой кислоты. В Формуле 2 НА 'представляет собой гиалуроновую кислоту, в которой карбоксильная группа замещена амидной группой.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения, в случае, когда добавляют регулятор кислотности и проводят сшивание, сшивка, представленная нижеследующей Формулой 3, образуется между производными гиалуроновой кислоты. В Формуле 3 НА' представляет собой гиалуроновую кислоту, в которой карбоксильная группа замещена амидной группой.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения на стадии сшивания производных гиалуроновой кислоты, каждое из которых модифицировано галлольной группой, гидрогель гиалуроновой кислоты получали с использованием периодата натрия, который является окислителем, или гидроксида натрия, который является регулятором кислотности (см. Пример приготовления 2). В результате можно было определить, что наравне с отличной биосовместимостью гидрогели гиалуроновой кислоты, полученные по соответствующим способам сшивания, демонстрируют заметные отличия в таких физических свойствах, как скорость сшивания, жесткость, упругость, сила адгезии и степень разложения (см. Примеры 1-3).

В одном варианте осуществления настоящего изобретения предлагается композиция наполнителя, содержащая производное гиалуроновой кислоты или гидрогель гиалуроновой кислоты по настоящему изобретению. Композиция наполнителя по настоящему изобретению представлена в жидком или растворенном состоянии, где производные гиалуроновой кислоты, в каждое из которых была введена галлольная группа, смешаны в водной среде. В частности, в случае введения в организм путем инъекций, такой раствор, даже без сшивающего агента в своем составе, может образовывать гидрогель только путем окисления в организме без индивидуальных отклонений, наполняя и удерживая влагу в коже. В одном варианте осуществления настоящего изобретения водная среда представляет собой фосфатно-солевой буфер (ФСБ), и производное гиалуроновой кислоты может содержаться в количестве предпочтительно от 0,1% (мас/об) до 20,0% (мас/об) и более предпочтительно 0,3% (мас/об) до 10,0% (мас/об) относительно всей композиции наполнителя. Однако в зависимости от водной среды и соотношения содержания в композиции наполнителя могут иметь место различные модификации или изменения, которые хорошо известны в данной области.

Используемый в настоящем документе термин «наполнитель» обозначает инъекционный препарат, который наполняет кожную ткань, например, путем инъекций биосовместимого материала в/под кожу для разглаживания морщин и восстановления поверхности кожи. В настоящее время в качестве материалов для приготовления наполнителей, одобренных Управлением по контролю качества продуктов питания и лекарств США (FDA) или Управлением по контролю качества продуктов питания и лекарств Кореи (MFDS), упоминаются коллаген, гиалуроновая кислота, гидроксиапатит кальция, полимолочная кислота и т.п. Из них гиалуроновая кислота представляет собой материал, аналогичный компоненту человеческого тела, и может применяться без проверки на кожные реакции; также гиалуроновая кислота обладает свойством притягивать 214 молекул воды на 1 свою молекулу, тем самым эффективно удерживая влагу в коже. Таким образом, гиалуроновая кислота в настоящее время занимает около 90% рынка наполнителей. Благодаря применению производного гиалуроновой кислоты, в которое была введена галлольная группа с высокой окислительной способностью, композиция наполнителя по настоящему изобретению может образовывать гидрогель в организме только под воздействием окисления, без добавления сшивающего агента для усиления биосовместимости, при этом вышеупомянутый гидрогель, образующийся в организме, может сохранять свою форму в прозрачном состоянии в течение длительного периода времени (не менее 6 месяцев). Таким образом, композиция наполнителя имеет техническое значение в том смысле, что она демонстрирует превосходный эффект сокращения морщин в соответствии с характеристиками гиалуроновой кислоты, как описано выше, имеет большую силу адгезии и стабильность в организме по сравнению с обычными наполнителями, и может стабильно вводиться в целевой объект путем инъекций независимо от силы экструзии (Примеры 2 и 3).

Кроме того, композиция наполнителя по настоящему изобретению может быть представлена в виде порошка и, более конкретно, в виде лиофилизированного порошка, чтобы обеспечить простоту применения и стабильность при хранении. С другой стороны, вышеупомянутая композиция наполнителя требует предварительной обработки, где ее растворяют в водной среде, такой как ФСБ, и солюбилизируют перед введением в кожу. Однако композицию наполнителя, которую предварительно превратили в раствор, можно также наносить непосредственно на кожу, в зависимости от условий ее хранения и приготовления.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения для того, чтобы добиться эффекта регенерации кожи, композиция наполнителя по настоящему изобретению может дополнительно содержать фактор роста клеток или какой-либо витамин. Фактор клеточного роста в целом означает полипептид, который способствует клеточному делению, росту и дифференцированию, и может быть предпочтительно выбран из группы, состоящей из фактора роста фибробластов (FGF), фактора роста эпителиальных клеток (EGF), фактора роста кератиноцитов (KGF), трансформирующего фактора роста альфа (TGF-α), трансформирующего фактора роста бета (TGF-β), гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (GCSF), инсулиноподобного фактора роста (IGF), фактора роста эндотелия сосудов (VEGF), фактора роста гепатоцитов (HGF), тромбоцитарного фактора роста ВВ (PDGF-BB), нейротрофического фактора головного мозга (BDNF) и нейротрофического фактора глиальных клеток (GDNF). Фактор роста клеток может содержаться в количестве от 20 нг/мл до 20 мкг/мл, но не ограничивается этим.

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения композиция наполнителя по настоящему изобретению может дополнительно содержать местный анестетик для облегчения боли во время процесса инъекции. Местный анестетик может быть выбран из группы, состоящей из амбукаина, амоланона, амилокаина, беноксината, бензокаина, бетоксикаина, бифенамина, бупивакаина, бутакаина, бутамбена, бутаниликаина, бутетамина, бутоксикаина, картакаина, хлорпрокаина, кокэтилена, кокаина, циклометикаина, дибукаина, диметизохина, диметокаина, диферодона, дициклонина, экгонидина, экгонина, этил хлорида, этидокаина, бета-эйкаина, эупроцина, феналкомина, фомокаина, гексилкаина, гидрокситетракаина, изобутил р-аминобензоата, лейцинокаина мезилата, левоксадрола, лидокаина, мепивакаина, меприлкаина, метабутоксикаина, метил хлорида, миртекаина, наэпаина, октакаина, ортокаина, оксетазаина, паретоксикаина, фенакаина, фенола, пиперокаина, пиридокаина, полидоканола, прамоксина, прилокаина, прокаина, пропанокаина, пропаракаина, пропипокаина, пропоксикаина, псевдококаина, пиррокаина, ропивакаина, салицилового спирта, тетракаина, толикаина, тримекаина, золамина и их солей. Анестетик может содержаться в количестве предпочтительно от 0,1 до 5,0 мас. %, и более предпочтительно от 0,2 до 1,0 мас. % относительно массы всей композиции наполнителя, но количество не ограничивается перечисленным.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения композиция наполнителя по настоящему изобретению может дополнительно содержать антиоксидант для предотвращения окисления и разложения гидрогеля, образующегося в организме. Антиоксидант может быть выбран из группы, состоящей из полиола, маннитола и сорбитола. Антиоксидант может содержаться в количестве предпочтительно от 0,1 до 5,0 мас. % и более предпочтительно от 0,2 до 1,0 мас. % относительно массы всей композиции наполнителя, но количество не ограничивается перечисленным.

В одном своем аспекте настоящее изобретение относится к способу получения композиции наполнителя, включающему стадию введения галлольной группы в костяк глюкуроновой кислоты в гиалуроновой кислоте для получения производного гиалуроновой кислоты; а также стадию добавления производного гиалуроновой кислоты в водную среду и перемешивания.

В настоящем изобретении стадия добавления производного гиалуроновой кислоты в водную среду и перемешивания может выполняться предпочтительно в таких условиях, при которых контакт с кислородом и другими источниками окисления заблокирован (например, путем введения газообразного азота) при температуре примерно от 4°С до 28°С и/или при рН от 4 до 8, чтобы предотвратить гелеобразование перед инъекцией композиции наполнителя, которая находится в жидком состоянии.

В одном варианте осуществления водная среда представляет собой фосфатно-солевой буфер (ФСБ), а производное гиалуроновой кислоты может быть представлено вышеуказанной Формулой 1 и получено путем реакции между гиалуроновой кислотой и 5'-гидроксидопамином. Композиция наполнителя по настоящему изобретению может быть приготовлена путем добавления вышеупомянутого фактора роста клеток, местного анестетика, антиоксиданта, витамина и их комбинаций.

В другом аспекте настоящего изобретения предлагается способ разглаживания морщин, включающий стадию введения композиции наполнителя в/под кожу индивидуума. В настоящем изобретении целевым участком, на который наносится композиция наполнителя, может быть любой участок тела, такой как лицо, шея, уши, грудь, бедра, руки, предпочтительно любой участок с морщинами на коже, и может быть выбран из группы, состоящей из области слезной борозды, области межбровной складки, области края глаза, области лба, области переносицы, области носогубных складок, области марионеточных морщин и области складок на шее. Тем не менее, данный участок не ограничивается вышеперечисленным. Кроме того, в настоящем изобретении термин «индивидуум» обозначает субъекта, нуждающегося в разглаживании морщин на коже, и, более конкретно, включает всех людей, нечеловекообразных приматов и т.д.

В частности, композиция наполнителя по настоящему изобретению может быть легко введена в целевой участок инъекций независимо от силы экструзии. На этапе введения композицию наполнителя можно вводить в/под кожу с помощью игл или канюль разных размеров. В качестве способа инъекции наполнителя, можно, например, использовать метод последовательных проколов, при котором многократные инъекции производятся в небольшом количестве каждая; метод линейной инъекции, при котором иглу двигают вперед примерно на 10 мм и затем делают инъекции в небольшом количестве каждая с вытягиванием иглы назад; веерный метод, при котором иглу вводят один раз, а затем многократно выполняют линейные инъекции таким же образом, но слегка меняя углы без удаления введенной иглы; и тому подобное.

В еще одном аспекте настоящего изобретения предлагается гидрогель гиалуроновой кислоты, полученный путем сшивания производных гиалуроновой кислоты, каждое из которых представлено вышеуказанной Формулой 1, где сшивка, представленная вышеуказанной Формулой 2, образуется между производными гиалуроновой кислоты; а также носитель для доставки лекарств, система доставки лекарств или скаффолд для тканевой инженерии, содержащий гидрогель гиалуроновой кислоты.

Кроме того, в еще одном аспекте настоящего изобретения предлагается гидрогель гиалуроновой кислоты, полученный путем сшивания производных гиалуроновой кислоты, каждое из которых представлено вышеуказанной Формулой 1, где сшивка, представленная вышеуказанной Формулой 3, образуется между производными гиалуроновой кислоты; а также носитель для доставки лекарств, система доставки лекарств или скаффолд для тканевой инженерии, содержащий гидрогель гиалуроновой кислоты.

Гидрогель гиалуроновой кислоты по настоящему изобретению можно применять в качестве искусственного внеклеточного матрикса, который является эффективным средством доставки лекарств и имеет техническое значение в том смысле, что его форма из нано- или микрочастиц может быть получена благодаря превосходной окислительной способности производного гиалуроновой кислоты, модифицированного галлольной группой. Препарат особенно не ограничен и может предпочтительно включать, помимо прочего, химическое вещество, небольшую молекулу, пептид, антитело, фрагмент антитела, нуклеиновую кислоту, включая ДНК, РНК или миРНК, белок, ген, вирус, бактерию, бактерицидный компонент, противогрибковый компонент, противоопухолевое средство, противовоспалительное средство, их смесь, и тому подобное.

Кроме того, гидрогель гиалуроновой кислоты по настоящему изобретению можно применять в качестве скаффолда для тканевой инженерии благодаря отличной упругости и силе адгезии. Тканевая инженерия означает, что клетки или стволовые клетки, выделенные из ткани пациента, культивируются в скаффолде до получения комплекса «клетка-скаффолд», а затем полученный комплекс «клетка-скаффолд» снова пересаживают в живой организм. Гидрогель гиалуроновой кислоты можно применять как скаффолд, аналогичный биологической ткани, с целью оптимизировать регенерацию биологических тканей и органов. Следовательно, гидрогель гиалуроновой кислоты можно использовать как генно-терапевтический или клеточно-терапевтический препарат.

Кроме того, гидрогель по настоящему изобретению также можно применять в качестве косметического средства и медицинского материала, например, как ранозаживляющее средство, материал для покрытия ран, противоспаечный барьер или зубной матрикс. Однако применение гидрогеля по настоящему изобретению не ограничивается этим.

Далее будут описаны предпочтительные примеры для облегчения понимания настоящего изобретения. Однако данные примеры приведены исключительно с целью облегчения понимания настоящего изобретения, объем настоящего изобретения данными примерами не ограничивается.

[Примеры приготовления]

Пример приготовления 1: Приготовление производного гиалуроновой кислоты, модифицированного галлольной группой

Как показано на Фиг. 1, было получено производное гиалуроновой кислоты, модифицированное галлольной группой в соответствии с настоящим изобретением. В частности, гиалуроновую кислоту (MW 200K, Lifecore Biomedical, LLC, Иллинойс, США) полностью растворили в воде (TDW) и 1 эквиваленте N-гидроксисукцинимида (NHS, Sigma-Aldrich, Inc., Сент-Луис, Миссури, США), и добавили 1,5 эквивалента 1-(3-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимида гидрохлорида (EDC, Thermo Scientific, Рокфорд, Иллинойс, США). Через 30 мин добавили 1 эквивалент 5'-гидроксидопамина (Sigma-Aldrich, Inc.) в виде фрагмента ПГ, и получившийся продукт оставили реагировать при рН 4-4,5 в течение 24 ч. Для получения конъюгатов ГК-ПГ использовали реагенты с двумя различными молярными отношениями (ГА : EDC : NHS : ПГ = 1:1,5:1:1 или 2:1,5:1:1). Затем EDC, NHS и 5'-гидроксидопамин удалили путем диализа на основе ФСБ и воды (Cellu/Sep (торговое наименование), диализная мембрана (отсечка на 6,8 кДа, Membrane Filtration Products Inc., Сегвин, Техас, США)) и растворитель выпаривали путем лиофилизации до получения производного гиалуроновой кислоты по настоящему изобретению. Чтобы идентифицировать синтез производного гиалуроновой кислоты, провели анализ с помощью инфракрасной спектроскопии с преобразованием Фурье (FT-IR) (Vertex 70, Bruker, Billerica, Массачусетс, США) и протонного магнитного резонанса (ПМР) (Bruker 400 МГц, Bruker). В результате, как показано на Фиг. 2 (а), по сильному пику при волновом числе от примерно 1580 см^-1 до 1700 см^-1 можно было идентифицировать новообразованную амидную связь, и, как показано на Фиг. 2 (b), в 5'-гидроксидопамине можно было идентифицировать ароматические соединения в виде бензольного кольца и -СН₂СН₂- по пикам около 6,5 ppm и 3 ppm, соответственно. При анализе приведенных выше результатов обнаружили, что 5'-гидроксидопамин вводится в производное гиалуроновой кислоты по настоящему изобретению благодаря амидной связи, образованной между карбоксильной группой гиалуроновой кислоты и аминогруппой 5'-гидроксидопамина. Чтобы рассчитать степень замещения галлольной группой относительно костяка ГК, конъюгат ГК-ПГ растворили в ФСБ (рН 5) при 1 мг/мл и измерили оптическую плотность раствора при 283 нм (спектрофотометр УФ и видимой областей спектра) (Cary 100 UV-vis, Varian Inc., Пало-Альто, Калифорния, США)). Процент карбоксигрупп, замещенных ПГ в ГК, рассчитывали по стандартной калибровочной кривой, полученной путем серийного разбавления раствора 5'-гидроксидопамина (начиная с концентрации 1 мг/мл).

Пример приготовления 2: Приготовление гидрогеля гиалуроновой кислоты

Производные гиалуроновой кислоты из Примера приготовления 1 сшивали до получения гидрогеля гиалуроновой кислоты, при этом в каждом методе сшивания использовали периодат натрия (NalO₄) в качестве окислителя или гидроксид натрия (NaOH) в качестве регулятора кислотности (рН 8-9). В частности, производные гиалуроновой кислоты растворяли в ФСБ (1% (мас/об), 2% (мас/об)) и затем сшивали, смешивая с 4,5 мг/мл NalO₄ или 0,08 М NaOH при объемном соотношении от 1,5:1 до 4:1 относительно раствора производного гиалуроновой кислоты. Как показано на Фиг. 3, в результате сшивания каждым из этих способов получали гидрогель гиалуроновой кислоты светло-коричневого или синего цвета.

Чтобы идентифицировать сшивание гидрогеля гиалуроновой кислоты, проводили анализ с помощью спектроскопии в ультрафиолетовой и видимой области. В случае использования NalO₄, как показано на Фиг. 4, можно было определить, что в процессе окисления диапазон длины волны от 350 до 400 нм изменяется со временем (Фиг. 4 (а)), что означает мгновенное образование и уменьшение числа радикалов, являющихся промежуточными продуктами; также было обнаружено, что в результате полимеризации радикалов образуется бифенол (Фиг. 4 (b)). Кроме того, в случае использования NaOH, как показано на Фиг. 5, можно было определить, что длина волны 600 нм изменяется со временем (Фиг. 5 (а)); на основе этого обнаружили, что в результате таутомеризации [5+2] в процессе окисления образуются комплекс с переносом заряда и бензотрополон (Фиг. 5 (b)).

[Примеры]

Пример 1. Изменения физических свойств гидрогеля гиалуроновой кислоты в зависимости от способа поперечного сшивания

В настоящем примере сравнивались изменения физических свойств гидрогелей гиалуроновой кислоты в зависимости от различий в способе сшивания по Примеру приготовления 2. С другой стороны, на стадии приготовления гидрогеля соотношение молярной концентрации гиалуроновой кислоты к 5'-гидроксидопамину (0,5Х (ГК : EDC : NHS : 5'-гидроксидопамин = 2:1,5:1:1), 1Х (ГК : EDC : NHS : 5'-гидроксидопамин = 1:1,5:1:1)) можно использовать для доведения степени замещения галлольной группой до 4-5% (0,5Х) или 8-9% (1Х) (не показано); также сравнивали изменения физических свойств гидрогелей в зависимости от степени замещения 5'-гидроксидопамина. В частности, образование гидрогеля и изменения модуля упругости во времени сравнивали в зависимости от способов сшивания; и, соответственно, сопоставляли и анализировали упругость, силу адгезии, степень набухания и разложения в зависимости от способа поперечного сшивания и степени замещения 5'-гидроксидопамина.

1-1. Сравнение скорости образования гидрогеля гиалуроновой кислоты

Как показано на Фиг. 6 (а), можно было определить, что в случае использования NalO₄ гидрогель светло-коричневого цвета мгновенно образуется путем немедленной реакции сшивания; с другой стороны, в случае использования NaOH гидрогель синего цвета образуется относительно медленно. Кроме того, измеряли изменения модулей накопления (С) и модулей потерь (G'') во времени и результаты данных измерений сравнивали с результатами гидрогеля (ГК-СА (NalO₄)), полученного путем сшивания производных гиалуроновой кислоты, в каждом из которых катехиновую группу вводили с использованием NalO₄. В результате, как показано на Фиг. 6 (b), все гидрогели стабильно образовывались в процессе окисления (G'>G''). В частности, в случае, когда момент времени, в который образуется гидрогель, определяли по моменту времени, в который кривая модуля накопления и кривая модуля потерь входили в контакт друг с другом, было обнаружено, что на сшивание NaOH требуется примерно 2-3 мин, а для сшивания ГК-СА (NalO₄) требуется около 30 сек; с другой стороны, в случае сшивания с использованием NalO₄ процесс сшивания происходит так быстро, что невозможно провести замеры.

Коэффициент вязкоупругости гиалуроновой кислоты анализировали путем измерения модуля накопления (G') и модуля потерь (G'') в режиме изменения частоты в диапазоне от 0,1 до 1 Гц. Упругость гиалуроновой кислоты рассчитывали путем деления коэффициента накопления на коэффициент потерь при 1 Гц (n=45). Кинетику гелеобразования ГК-ПГ измеряли с помощью реометра (MCR 102, Anton Paar, Вирджиния, США) в режиме временной развертки при контролируемой деформации и частоте 10% и 1 Гц соответственно. Два окислителя (NalO₄ и NaOH) добавили через 30 мин после первоначального измерения G1 и G''. Адгезивность гидрогеля измеряли путем регистрации напряжения при отрыве полностью сшитого гидрогеля между зондом и подложкой в реометре (MCR 102, Anton Paar) (n=3). Скорость вытягивания зонда составляла 5 мкм/с.

1-2. Сравнение упругости и силы адгезии

Как показано на Фиг. 7 (а), несмотря на различия в способе сшивания или степени замещения 5'-гидроксидопамина, во всех случаях измеренный модуль накопления (G') был выше на определенном уровне, чем модуль потерь (G''), что позволило определить, что гидрогели стабильно формируются. Кроме того, были рассчитаны модуль упругости, представляющий жесткость гидрогеля, и тангенс δ (G'/G''), представляющий степень упругости. В результате, как показано на Фиг. 7 (b) в случае использования NalO₄ была продемонстрирована лучшая жесткость гидрогеля, при этом все гидрогели обладали отличной силой упругости даже при низкой степени замещения; с другой стороны, при использовании NaOH более высокой силу упругости достигали по мере увеличения степени замещения. Кроме того, было обнаружено, что в случае того же способа сшивания эти превосходные физические свойства также улучшаются при увеличении скорости замещения 5'-гидроксидопамина (0,5Х<1Х). Кроме того, на основе вышеуказанных результатов определили различия в физических свойствах гидрогелей, сшитых NalO₄, в зависимости от молекулярной массы (40, 200, 500 кДа) и концентрации (1% (мас/об), 2% (мас/об)) производных гиалуроновой кислоты. В результате, как показано на Фиг. 8, во всех случаях измеренный модуль накопления (G') оказывался на определенном уровне выше, чем модуль потерь (G''), что позволило определить стабильное формирование гидрогелей (Фиг. 8 (а)); также было обнаружено, что по мере увеличения молекулярной массы и концентрации гиалуроновой кислоты гидрогель демонстрирует улучшение жесткости и силы упругости (Фиг. 8 (b)). Кроме того, для оценки силы адгезии гидрогелей каждый из гидрогелей нанесли между соответствующими пластинами реометра (Bohlin Advanced Rheometer, Malvern Instruments, Вустершир, Великобритания), и силу, приложенную к прибору, измеряли с одновременным увеличением расстояния между пластинами. Приведенные выше результаты сравнивали с результатами гидрогеля (ГК-СА (NalO₄)), полученного путем сшивания производных гиалуроновой кислоты, в каждое из которых была введена катехиновая группа с использованием NalO₄. В результате, как показано на Фиг. 9, гидрогель, образованный с использованием NaOH и ГК-СА (NalO₄), показал превосходную силу адгезии, тогда как в гидрогеле, образованном с использованием NalO₄, силы адгезии почти не наблюдалось.

1-3. Сравнение степени набухания и разложения

Как показано на Фиг. 10, в зависимости от способа сшивания и степени замещения 5'-гидроксидопамина степень набухания и разложения отличались незначительно. Степень набухания оценивали путем измерения массы оставшегося гидрогеля в определенные временные точки (дни 0, 1, 2, 3, 5, 7, 14 и 28). В частности, ГК-ПГ инкубировали при 37°С в ФСБ, и степень набухания рассчитывали по следующей формуле: (Wt - Wi) / Wi × 100, где Wt - масса гидрогеля в каждой временной точке, a Wi - масса гидрогеля в исходной временной точке (n=4-5). Чтобы исследовать профиль разложения, гидрогель ГК-ПГ, набухавший в течение 3 дней, обработали гиалуронидазой (5 ед/мл, Sigma) и измеряли массу оставшейся гиалуроновой кислоты в соответствующие временные точки (n = от 4 до 7, 0, 2, 5, 12, 24, 48 и 72 ч). В случае использования NalO₄, а не NaOH, наблюдалась низкая степень набухания, и разложение происходило быстрее. В случае того же способа сшивания, когда степень замещения 5'-гидроксидопамина увеличивается, такая степень набухания и разложения имеет тенденцию к снижению. Эти результаты в совокупности показывают, что даже при применении производных гиалуроновой кислоты, имеющих одинаковую структуру, гидрогели сшиваются по-разному, в зависимости от способа сшивания (Пример приготовления 2), что приводит к изменениям физических свойств, таких как жесткость, упругость, сила адгезии, набухание и разложение. Кроме того, наоборот, было обнаружено, что даже при применении одного и того же способа сшивания вышеуказанные физические свойства также изменяются в зависимости от структуры производного гиалуроновой кислоты.

Пример 2. Анализ на цитотоксичность и биосовместимость

В настоящем примере оценивали цитотоксичность и биосовместимость гидрогеля гиалуроновой кислоты из Примера приготовления 2. Во-первых, чтобы определить, является ли гидрогель токсичным и вызывает ли воспалительную реакцию в культуре Зй-клеток, в гидрогеле культивировали стволовые клетки жировой ткани человека (hADSC) (1,0×10⁶ клеток на 100 мкл гидрогеля), и использовали набор LIVE/DEAD viability/cytotoxicity kit (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния, США) для окрашивания живых/мертвых клеток в соответствующие временные точки (дни 1, 3 и 7) согласно инструкциям производителя. За окрашенными клетками наблюдали в конфокальный микроскоп (LSM 880, Carl Zeiss, Оберкохен, Германия), а жизнеспособность определяли количественно, путем подсчета живых и мертвых клеток на флуоресцентном изображении (n=4-5). Клетки hADSC получили из Американской коллекции типовых культур (АТСС, Манассас, Вирджиния, США) и культивировали в базальной среде мезенхимальных стволовых клеток (АТСС) с добавлением низкоконцентрированной сыворотки роста (АТСС) и 1% раствора пенициллина/стрептомицина (Invitrogen).

Кроме того, в гидрогеле совместно культивировали иммунные клетки (Raw = 264,7) при помощи системы Transwell (проницаемые подложки с порами 3,0 мкм, Corning, Нью-Йорк, штат Нью-Йорк, США), после чего путем иммуноферментного анализа (ELISA) изучали некоторое количество фактора некроза опухоли (TNF-α), секретируемого в ответ на воспалительную реакцию. Клетки с числом Raw 264,7 инкубировали в течение ночи, а затем высевали на 96-луночный планшет (2,0×10⁴ клеток на лунку). Затем 50 мкл гидрогеля загружали через верхнюю часть Transwell для ввода и проводили дополнительную инкубацию в течение 24 ч. Количество TNF-α в среде, собранной в ходе совместного культивирования, определяли количественно с использованием набора для иммуноферментного анализа (ELISA) для TNF-α (R&D Systems, Миннеаполис, Миннесота, США).

Чтобы оценить биосовместимость гидрогеля ГК-ПГ in vivo, 100 мкл гидрогеля ГК-ПГ (конечная концентрация 2% [мас/об]), образованного с использованием NalCM или NaOH, подкожно вводили мышам ICR. Перед введением мышам (5-недельные самцы, OrientBio, Seongnam, Корея) сделали анестезию кетамином (100 мг/кг, Yuhan, Сеул, Корея) и ксилазином (20 мг/кг, Bayer Korea, Ансан, Корея). Для анализа тканей извлекали гиалуроновую кислоту с прилегающими тканями в заранее определенные временные точки (дни 0, 7, 14, 28 и 84). Извлеченную гиалуроновую кислоту помещали в 4% раствор параформальдегида (Sigma) на 2 дня, заключив ее в реагент ОСТ (Leica Biosystems, Вецлар, Гессе, Германия), и затем рзрезали на кусочки толщиной 6 мкм. Отрезанные образцы из эксперимента in vivo окрашивали гематоксилином и эозином, чтобы оценить, как сохранился гидрогель. Окрашивание толуидиновым синим проводили, чтобы изучить иммунный ответ на трансплантацию гидрогеля ГК-ПГ. Разложение гидрогеля ГК-ПГ in vivo оценивали путем измерения остаточной массы извлеченного гидрогеля в каждой временной точке (n=3-5).

В результате, как показано на Фиг. 11 и 12, ни один из двух типов гидрогеля в зависимости от способа сшивания не проявлял признаков цитотоксичности до 7 дней после культивирования (Фиг. 11 (а) и 11 (b)). TNF-α, который увеличился из-за ЛПС, был обнаружен только в небольшом количестве, когда проводили обработку двумя вышеупомянутыми формами гидрогеля, и это не сильно отличалось от контроля (NT - без тестирования), при котором обработку не проводили (Фиг. 11 (с)). Кроме того, как показано на Фиг. 12, даже в случае, когда гидрогель вводили мышам, специфических признаков воспаления не наблюдалось, и можно было определить, что его структура хорошо сохраняется без пролиферации воспалительных клеток, таких как макрофаги, вблизи от введенного гидрогеля (Фиг. 12 (с) и 12 (d)).

Пример 3. Анализ степени разложения in vivo

В настоящем примере гидрогели гиалуроновой кислоты, полученные разными способами сшивания (NalO₄/NaOH) и имеющие разное молярное соотношение (0,5Х, 1Х) прореагировавшего 5'-гидроксидопамина, подкожно вводили мышам. В день трансплантации и через 1, 4 и 12 недель после трансплантации мышей умерщвляли и собирали соответствующие гидрогели. По этим гидрогелям визуально определяли степень набухания и рассчитывали остаточное количество in vivo, анализируя таким образом степень разложения in vivo и т.п.

В результате, как показано на Фиг. 13, можно было определить, что гидрогель, полученный путем сшивания с использованием NalO₄, имеет меньшую степень набухания, также было обнаружено, что такой гидрогель быстрее разлагается in vivo. Кроме того, в случае того же способа сшивания, когда степень замещения 5'-гидроксидопамина (галлольная группа) увеличивается, степень разложения имеет тенденцию к снижению.

Результаты Примеров 2 и 3 позволяют предположить, что гидрогель гиалуроновой кислоты по настоящему изобретению можно применять, например, в биоматериалах, таких как носитель для доставки лекарств и скаффолд для тканевой инженерии. В частности, учитывая физические свойства из Примера 1 и т.п., гидрогель, полученный с использованием NalO₄, который демонстрирует высокие скорость сшивания и степень разложения in vivo, можно применять в качестве носителя для доставки лекарственных средств в форме мелких частиц, а гидрогель, полученный с использованием NaOH, который демонстрирует превосходную силу адгезии и медленное разложение in vivo, можно применять в качестве скаффолда для тканевой инженерии и тому подобного.

Пример 4. Применение в качестве системы доставки лекарств путем образования микрочастиц

4-1. Замедленное высвобождение белка с применением микрочастиц гидрогеля ГК-ПГ

В данном примере в качестве варианта получения гидрогеля с использованием NalO₄, приготовили препарат для доставки лекарственного средства в форме микрочастиц, имеющих диаметр в нано- или микроединицах, и определили его эффективность. Сначала использовали эмульсионный метод «масло-вода», чтобы вызвать образование эмульсии раствора производного гиалуроновой кислоты (ГК-ПГ) из Примера приготовления 2, и к раствору добавили окислитель (NalO₄). Затем определяли образование и наличие микрочастиц до и после лиофилизации. Кроме того, раствор ГК-ПГ смешивали с белком (бычий сывороточный альбумин, БСА) и полученной смеси придавали эмульсионную форму. Затем добавляли окислитель (NalO₄) и проводили сшивание, тем самым получая микрочастицы с инкапсулированным БСА. Степень высвобождения белка из микрочастиц определяли в течение 14 дней. В результате, как показано на Фиг. 14, микрочастицы, содержащие в качестве компонента гидрогель гиалуроновой кислоты, были получены путем вышеупомянутого процесса приготовления и оставались неизменными даже после лиофилизации (Фиг. 14 (а)). Кроме того, можно было идентифицировать, что инкапсулированные белки практически не высвобождаются в балке гидрогеля ГК-ПГ, тогда как в частицах ГК-ПГ белки высвобождаются с постоянной скоростью (Фиг. 14 (b)). Таким образом, гидрогель, полученный с использованием NalO₄, в форме микрочастиц можно применять в качестве препарата для доставки лекарственного средства.

4-2. Замедленное высвобождение антитела с применением микрочастиц гидрогеля ГК-ПГ

Во-первых, в качестве способа устойчивой и контролируемой доставки факторов роста для терапевтического применения, микрочастицы гидрогеля ГК-ПГ получали эмульсионным методом «масло-вода» с ультрабыстрым гелеобразованием при NalO₄-опосредованном сшивании (Фиг. 15 (а)). Микрочастицы ГК-ПГ можно получить простым добавлением раствора ГК-ПГ к эмульсии «вода-в-масле». Быстрое химическое сшивание эмульсии ГК-ПГ с использованием NalO₄ в масляной фазе привело к образованию большого количества субмикронных частиц ГК в течение нескольких минут. Полученные микрочастицы ГК-ПГ имели сферическую форму со средним диаметром 8,8 мкм (±3,9 мкм) (Фиг. 15 (b)). Интересно, что факторы роста эндотелия сосудов (VEGF), инкапсулированные в микрочастицах ГК-ПГ, медленно высвобождались в течение 60 дней, тогда как VEGF практически не высвобождались из гидрогеля из балка ГК-ПГ (Фиг. 15 (с)). В предыдущем исследовании, проведенном авторами настоящего изобретения, авторы настоящего изобретения обнаружили, что факторы роста, инкапсулированные в катехин-модифицированный альгинатный гидрогель, почти не высвобождаются в процессе гелеобразования из-за сильной связи белков с окисленным катехином. Подобно катехиновой группе, ПГ-группа также может вызывать сильное связывание факторов роста с гидрогелем. Однако, по-видимому, из-за существенно увеличившейся площади поверхности факторов роста для высвобождения ГК-ПГ в виде мелких частиц может высвобождать VEGF.

Микрочастицы ГК-ПГ с содержанием VEGF (Peprotech, Рокки Хилл, Нью-Джерси, США) применяли для облегчения терапевтического ангиогенеза при заболеваниях периферических сосудов. Внутримышечная инъекция VEGF, содержащихся в микрочастицах ГК-ПГ (VEGF-насыщающая доза: 6 мкг на мышь), на мышах с ишемической болезнью конечностей продемонстрировала значительно улучшенный терапевтический эффект, достигнутый путем резекции и перевязки бедренной артерии. Мышей (balb/c, самки 6-недельного возраста) получили от OrientBio Inc. После 4 недель инъекций в группе, получавшей VEGF-содержащие микрочастицы ГК-ПГ, ампутации конечностей или некроза тканей не наблюдалось. С другой стороны, только у 20% группы, получавшей ФСБ или только ГК-ПГ без VEGF, наблюдалось улучшение в ишемических конечностях (Фиг. 16 (а)). Однократное болюсное введение VEGF в той же дозе (6 мкг на мышь) показало небольшое улучшение в состоянии ишемических конечностей; однако у 50% мышей с ишемией конечностей по-прежнему наблюдалась потеря ноги или некроз тканей (Фиг. 16 (b)). Кроме того, гистологический анализ, проведенный путем окрашивания гематоксилином и эозином и трихромным окрашиванием по Массону, показал на модели с мышами с ишемической болезнью в группе ГК-ПГ/VEGF минимальное повреждение мышц и образование фиброза (Фиг. 16 (с) и 16 (d)). Кроме того, иммуногистохимический анализ с использованием α-гладкомышечного актина (α-ГМА) и фактора фон Виллебранда (vWF) для окрашивания артериол и окрашивания капилляров, соответственно, показал, что число артериол и капилляров значительно увеличилось в группе ГК-ПГ/VEGF по сравнению с контролями (ФСБ, ГК-ПГ и VEGF) (Фиг. 16 (е) и 16 (f)). Эти результаты показывают значительное улучшение ангиогенеза. NaOH-опосредованное сшивание применяли для приготовления адгезивного гидрогелевого скаффолда для неинвазивной и безинъекционной трансплантации клеток (Фиг. 17 (а)). В результате предыдущих исследований установили, что катехин-модифицированные полимеры демонстрируют высокую силу адгезии к ткани благодаря высокой аффинности связывания с различными нуклеофилами окисленного катехина в белках.

Пример 5. Определение гелеобразования композиции наполнителя гиалуроновой кислоты при окислении в организме и его влияние на разглаживание/сокращение морщин

5-1. Образование и сохранение в организме гидрогелей благодаря окислительным процессам, протекающим в организме

Раствор ГК-ПГ, полученный в Примере приготовления 1, вводили мышам подкожно путем инъекций. Затем определили, может ли гелеобразование инъецированного раствора ГК-ПГ происходить в организме без добавления сшивающего агента. Также измеряли изменения массы образовавшегося гидрогеля ГК-ПГ в условиях организма в течение примерно 6 месяцев, чтобы определить, может ли сохраняться образующийся в организме гидрогель ГК-ПГ в течение длительного периода времени.

В результате, как показано на Фиг. 20 и 21 было обнаружено, что раствор ГК-ПГ, который вводили подкожно в жидком состоянии, превращается в организме в гидрогель ГК-ПГ в течение 5 минут, и что образованный гидрогель ГК-ПГ хорошо сохраняется в организме в прозрачном состоянии в течение 6 месяцев без каких-либо существенных изменений в массе. Кроме того, как показано на Фиг. 22, в случае, когда раствор ГК-ПГ подвергается воздействию окислительных процессов в организме, среди галлольных групп легко образуются хиноны, обладающие ярко выраженной способностью самоокисляться, так что гиалуроновая кислота полимеризуется и образуется гидрогель ГК-ПГ. Соответственно, было обнаружено, что в отличие от наполнителей (Megafill, Perlane), которые состоят из препаратов в полимеризованной форме, состав наполнителя по настоящему изобретению можно применять и в форме раствора, что обеспечит более легкое введение в кожу и позволит включить множество дополнительных ингредиентов. То есть раствор ГК-ПГ по настоящему изобретению образовывал гидрогель в организме без добавления сшивающего агента и мог стабильно сохраняться в организме. Исходя из этого, можно было сделать вывод о возможности применения раствора ГК-ПГ в качестве композиции наполнителя.

5-2. Определение эффекта разглаживания/сокращения морщин

На основании результатов в Примере 5-1 был выявлен эффект от раствора ГК-ПГ на сокращение морщин. В частности, лысым мышам давали кальцитриол в дозировке по 0,2 мкг/сут каждой по 5 раз в неделю в течение 6 недель, чтобы вызвать появление морщин на коже. Затем раствор ГК-ПГ вводили подкожно, а в морщинистую кожу до и после инъекции вводили повторно. Площадь, длину и глубину морщин измеряли с помощью прибора для анализа морщин и сравнивали. В результате, как показано на Фиг. 23, площадь, длина и глубина морщин перед инъекцией раствора ГК-ПГ составляли около 6 мм², около 36 мм и около 90 мкм соответственно, тогда как после инъекции раствора ГК-ПГ составляли около 2 мм², около 19 мм и около 68 мкм соответственно. Исходя из этого, можно было определить, что площадь, длина и глубина морщин заметно уменьшились. Эти результаты показывают, что раствор ГК-ПГ по настоящему изобретению можно применять в качестве композиции наполнителя для сокращения морщин на коже.

5-3. Сравнение с существующими наполнителями

(1) Сравнение силы адгезии и удерживания в организме

Чтобы более конкретно определить возможность применения раствора ГК-ПГ в качестве наполнителя, для гидрогелей ГК-ПГ на основе производных гиалуроновой кислоты с разной молекулярной массой (200 кДа, 1 мДа) и доступных в продаже традиционных наполнителей (Megafill, Perlane), показатели их сохранения и разложения в организме измеряли в течение примерно 9 месяцев и сравнивали. Кроме того, в случае гидрогелей, полученных с применением раствора ГК-ПГ по настоящему изобретению, и препарата Perlane сравнивали силу адгезии или их способность закрепляться в организме. В результате, как показано на Фиг. 24 и 25, по препаратам Megafill и Perlane можно было определить, что масса и объем гидрогеля в организме имеют тенденцию к снижению примерно через месяц после дня введения, тогда как в случае с гидрогелями ГК-ПГ их форма сохраняется в течение 9 месяцев без существенных изменений в массе и объеме. Было обнаружено, что гидрогели ГК-ПГ обладают отличной способностью сохраняться в организме. Также у гидрогелей определяли силу адгезии в организме. В результате, как показано на Фиг. 26, можно было определить, что препарат Perlane демонстрирует феномен, при котором образующийся гидрогель не пристает к коже, а опирается на конкретный участок, тогда как гидрогель, продуцируемый раствором ГК-ПГ, хорошо сохраняется в организме благодаря силе адгезии и фиксации к месту инъекции. Такая превосходная сила адгезии внутри организма является результатом реакции между функциональной группой, например, аминогруппой и тиоловой группой, существующей на коже, и производным гиалуроновой кислоты по настоящему изобретению (Фиг. 22 (а)). То есть раствор ГК-ПГ по настоящему изобретению проявляет лучшую стабильность и адгезивность в организме, чем существующие наполнители.

(2) Сравнение способности проходить через иглу при введении препарата (испытание на проходимость через иглу)

Чтобы конкретно определить превосходную проходимость раствора ГК-ПГ через иглу, в случае гидрогелей ГК-ПГ на основе производных гиалуроновой кислоты с различными молекулярными массами (200 кДа, 1 мДа) и доступных в продаже традиционных наполнителей (Megafill, Perlane) не только измеряли изменения в силе экструзии в зависимости от размеров иглы для инъекции (21G, 25G, 29G, 30G) с помощью универсальной испытательной машины (УСМ), но и количественно определяли и сравнивали силу сдвига, которая представляет собой силу, необходимую для первоначального сдвига шприца, и динамическую силу трения скольжения, которая является силой, необходимой для поддержания подвижности шприца. В результате, как показано на Фиг. 27 и 28, препарат Megafill не вышел из инъекционной иглы малого размера из-за большого размера частиц, и экструзия стала возможна только при размере иглы 21G или меньше. Даже в случае с Perlane сила экструзии нерегулярно демонстрировалась при 29G и 30G из-за размера частиц. С другой стороны, в случае растворов ГК-ПГ (200 кДа, 1 мДа) по настоящему изобретению можно было определить, что эффективная экструзия достигается даже при небольшом усилии в иглах всех размеров, включая 29G и 30G. Кроме того, сравнивали силы сдвига и силы динамического трения скольжения. В результате, как показано на Фиг. 29, по сравнению с препаратом Megafill, для которого измерения были невозможны из-за плохой экструзии, и препаратом Perlane, продемонстрировавшим высокий показатель силы, растворы ГК-ПГ по настоящему изобретению (200К, 1М) продемонстрировали удивительно низкий показатель силы. Таким образом, было обнаружено, что раствор ГК-ПГ по настоящему изобретению можно легко вводить независимо от силы экструзии, то есть размера иглы для инъекции. Эти результаты показывают, что растворы ГК-ПГ по настоящему изобретению можно вводить путем инъекций непосредственно в целевой участок и более стабильно.

5-4. Функциональная композиция наполнителя с содержанием фактора роста клеток

Чтобы идентифицировать применение в качестве функционального наполнителя, в кожу лысых мышей, у которых морщины были вызваны способом из Примера 5-2, вводили путем инъекций раствор ГК-ПГ с инкапсулированным фактором роста эпителиальных клеток (EGF; 20 нг/мл, 1 мкг/мл, 20 мкг/мл); морщинистую кожу до и после инъекций копировали; а площадь, длину и глубину морщин измеряли с применением прибора для анализа морщин и сравнивали. Через один месяц после инъекций раствора ГК-ПГ с инкапсулированным EGF собирали кожную ткань и делали замороженные срезы ОКТ. Затем путем окрашивания гематоксилином и эозином (Н & Е) ОКТ-замороженных срезов проводили гистопатологическое исследование. Также через месяц после инъекций лысым мышам раствора ГК-ПГ с инкапсулированным EGF (10 мкг/мл), раствора ГК-ПГ и существующим препаратом Perlane наблюдавшиеся различия в регенерации кожной ткани сравнивали с помощью окрашивания гематоксилином и эозином, а также трихромного окрашивания по Массону таким же образом, как описано выше.

В результате, как показано на Фиг. 30, можно было определить, что в случае инъекций раствора ГК-ПГ с инкапсулированным EGF независимо от размера имеющихся морщин, площадь, длина и глубина морщин заметно уменьшаются по сравнению с состоянием до инъекций. Кроме того, как показано на Фиг. 31, волокна коллагена в слое дермы были разрушены, чтобы показать очень низкую плотность и неправильное расположение; с другой стороны, при увеличении концентрации инкапсулированных факторов роста эпителиальных клеток, волокна коллагена имеют тенденцию к правильному расположению. Исходя из этого, была возможность выявить значительный эффект регенерации кожи и разглаживания морщин. Кроме того, как показано на Фиг. 32 и 33, в случае инъекций раствора ГК-ПГ с инкапсулированным EGF можно было определить, что слой эпидермиса, утолщенный из-за принудительно вызванных морщин, заметно утончается по сравнению с другими сравнительными группами (без наполнителя, Perlane, ГК-ПГ), и что плотность коллагена в дермальном слое значительно увеличивается. Эти результаты показывают, что фактор роста клеток добавляют к раствору ГК-ПГ по настоящему изобретению для сокращения улучшения морщин на коже, и, что таким образом, полученный продукт может применяться в качестве функционального наполнителя.

Пример 6. Применение в составе раневых повязок, ранозаживляющих средств и противоспаечных барьеров

Чтобы идентифицировать применение в качестве пропитки для раневых повязок, раствор ГК-ПГ наносили на модель животного с нанесенной раной (на коже мышей на спине делали надрез 1 см × 1 см) и затем сшивали, используя активный кислород из окружающей среды. Затем идентифицировали образование гидрогеля в месте раны и, таким образом, адгезию раствора ГК-ПГ к месту раны. В результате, как показано на Фиг. 34, можно было определить, что гидрогелевая пленка образуется в течение 10 минут после нанесения раствора ГК-ПГ на участок раны, из которой раствор ГК-ПГ выделяется и пристает к участку с раной. Эти результаты показывают, что раствор ГК-ПГ можно применять в качестве нового типа материала для раневых повязок, который обладает превосходной окислительной способностью и может быть равномерно нанесен на рану без каких-либо дополнений.

Пример 7. Порошкообразная форма и анализ стабильности при хранении

7-1. Порошкообразная форма

Чтобы определить возможность разработки композиции наполнителя в форме порошка, как показано на Фиг. 35, раствор ГК-ПГ из Примера получения 1 лиофилизировали для приготовления композиции наполнителя в форме порошка. После этого композицию наполнителя в форме порошка растворили в ФСБ (рН 7) для повторной солюбилизации, подкожно вводили мышам и наблюдали, образовался ли гидрогель. В результате, как показано на Фиг. 36, можно было определить, что композиция наполнителя по настоящему изобретению, которую повторно солюбилизировали в лиофилизированном порошковом состоянии, сшивается в организме благодаря окислительной способности с образованием гидрогеля, как и раньше. Эти результаты показывают, что композиция наполнителя по настоящему изобретению в форме порошка может оказаться для пользователей простой в применении и удобной в хранении.

7-2. Анализ стабильности при хранении

Для того чтобы определить специфическую стабильность композиции наполнителя при хранении сначала было определили, образует ли раствор ГК-ПГ из Примера получения 1 гель в контейнере для хранения при хранении при комнатной температуре (25°С) или в охлажденном состоянии (4°С). Кроме того, в контейнер для хранения вводили газообразный азот, чтобы заблокировать контакт между раствором ГК-ПГ и кислородом, а затем хранили в охлажденном состоянии (4°С) в течение 3 дней; с другой стороны, раствор ГК-ПГ хранился в замороженном (-80°С) состоянии в течение 10 дней. Затем эти растворы вводили мышам подкожно и наблюдали за образованием гидрогелей. В результате, как показано на Фиг. 37, из-за высокой окислительной способности гелеобразование композиции наполнителя по настоящему изобретению происходило в течение одного дня при комнатной температуре и в течение трех дней в охлажденном состоянии. С другой стороны, как показано на Фиг. 38, можно было определить, что в условиях блокировки кислорода, в случае нахождения в охлажденном состоянии, гелеобразование не происходит даже после истечения 3 дней; в случае, когда раствор ГК-ПГ хранят в замороженном состоянии и затем размораживают через 10 дней, раствор ГК-ПГ сохраняет свойства раствора, и даже в случае, когда этот раствор ГК-ПГ вводят в кожу мышам, такой раствор ГК-ПГ сшивается благодаря окислительной способности организма с образованием гидрогеля, как и раньше. Эти результаты показывают, что композиция наполнителя по настоящему изобретению может храниться в течение более длительного периода времени в условиях, когда кислород блокируется, или в замороженном состоянии.

Специалистам в данной области техники, к которому относится настоящее изобретение, будет понятно, что вышеприведенное описание настоящего изобретения предназначено для применения в иллюстративных целях, и что различные изменения и модификации могут быть легко внесены без отклонения от технического смысла или существенных признаков настоящего изобретения. Следовательно, следует понимать, что вышеописанные примеры являются не ограничивающими, а иллюстративными во всех аспектах.

Изобретение относится к области биотехнологии. Описана группа изобретений, включающая способ получения гидрогеля гиалуроновой кислоты (варианты), гидрогель гиалуроновой кислоты, применение гидрогеля гиалуроновой кислоты в качестве скаффолда для тканевой инженерии, в качестве носителя для доставки лекарственного средства in vivo или ex vivo, композицию филлера для улучшения состояния кожи, включающего морщины, композицию противоспаечного барьера, композицию для раневой повязки, композицию для доставки лекарственного средства с замедленным высвобождением in vivo или ex vivo, производное гиалуроновой кислоты, способ разглаживания морщин, применение производного гиалуроновой кислоты в качестве скаффолда для тканевой инженерии, в качестве носителя для доставки лекарственного средства in vivo или ex vivo, композиции, включающие производное гиалуроновой кислоты: композиция филлера для улучшения состояния кожи, включающего морщины, композиция противоспаечного барьера, композиция для раневой повязки, композиция для доставки лекарственного средства с замедленным высвобождением in vivo или ex vivo. Изобретение расширяет арсенал средств на основе гиалуроновой кислоты, имеющих улучшенную биосовместимость. 17 н. и 13 з.п. ф-лы, 38 ил., 7 пр.

1. Способ получения гидрогеля гиалуроновой кислоты, включающий:

- проведение реакции между по меньшей мере одним повторяющимся звеном гиалуроновой кислоты, имеющим структуру, представленную нижеследующей Формулой 4, и 5'-гидроксидопамином с получением производных гиалуроновой кислоты, содержащих по меньшей мере одно повторяющееся звено, имеющее структуру, представленную нижеследующей Формулой 5, которое модифицировано пирогаллольной группой

[Формула 4],

[Формула 5]; и

- сшивание указанных производных гиалуроновой кислоты путем проведения реакции между пирогаллольными группами.

2. Способ по п. 1, где на стадии сшивания сшивание осуществляют путем добавления окислителя или регулятора кислотности.

3. Способ по п. 2, где окислителем является любой агент, выбранный из группы, состоящей из периодата натрия, пероксида водорода, пероксидазы хрена и тирозиназы; и

где регулятор кислотности представляет собой любой агент, выбранный из группы, состоящей из гидроксида натрия, гидроксида лития, гидроксида калия, гидроксида рубидия, гидроксида цезия, гидроксида магния, гидроксида кальция, гидроксида стронция и гидроксида бария.

4. Способ получения гидрогеля гиалуроновой кислоты, включающий сшивание производных гиалуроновой кислоты, модифицированных пирогаллольными группами:

путем добавления окислителя, обеспечивающего образование сшивки, представленной следующей Формулой 2

[Формула 2],

или

путем добавления регулятора кислотности, обеспечивающего образование сшивки, представленной следующей Формулой 3

,

[Формула 3],

причем в Формулах 2 и 3 выше HA' представляет собой гиалуроновую кислоту, в которой карбоксильная группа замещена амидной группой.

5. Гидрогель гиалуроновой кислоты, полученный путем сшивания производных гиалуроновой кислоты, содержащих по меньшей мере одно повторяющееся звено, имеющее структуру, представленную нижеследующей Формулой 5

[Формула 5],

где образуется сшивка, представленная Формулой 2 или Формулой 3

,

[Формула 2]

[Формула 3],

причем в Формулах 2 и 3 выше HA' представляет собой гиалуроновую кислоту, в которой карбоксильная группа замещена амидной группой.

6. Гидрогель гиалуроновой кислоты по п. 5, где средневесовая молекулярная масса (Mw) производного гиалуроновой кислоты составляет от 10000 до 10000000 Да.

7. Гидрогель гиалуроновой кислоты по п. 5 или 6, где производное гиалуроновой кислоты имеет коэффициент замещения галлольной группой от 0,1% до 50%.

8. Применение гидрогеля гиалуроновой кислоты по п. 5 или 6 в качестве скаффолда для тканевой инженерии.

9. Применение гидрогеля гиалуроновой кислоты по п. 5 или 6 в качестве носителя для доставки лекарственного средства in vivo или ex vivo.

10. Применение по п. 9, где лекарственное средство представляет собой антитело, фрагмент антитела, нуклеиновую кислоту, включая ДНК, РНК или миРНК, пептид, ген, белок, стволовую клетку или химическое соединение.

11. Композиция филлера для улучшения состояния кожи, включающего морщины, содержащая гидрогель гиалуроновой кислоты по п. 5 или 6 и фосфатно-солевой буфер (ФСБ).

12. Композиция противоспаечного барьера, содержащая гидрогель гиалуроновой кислоты по пп. 5, 6 и фосфатно-солевой буфер (ФСБ).

13. Композиция для раневой повязки, содержащая гидрогель гиалуроновой кислоты по пп. 5, 6 и фосфатно-солевой буфер (ФСБ).

14. Композиция для доставки лекарственного средства с замедленным высвобождением in vivo или ex vivo, содержащая гидрогель гиалуроновой кислоты по пп. 5, 6 и фосфатно-солевой буфер (ФСБ).

15. Производное гиалуроновой кислоты, содержащее по меньшей мере одно повторяющееся звено, имеющее структуру, представленную нижеследующей Формулой 5, и которое модифицировано пирогаллольной группой

[Формула 5].

16. Производное гиалуроновой кислоты по п. 15, где средневесовая молекулярная масса (Mw) производного гиалуроновой кислоты составляет от 10000 до 10000000 Да.

17. Производное гиалуроновой кислоты по п. 15 или 16, где производное гиалуроновой кислоты имеет степень замещения галлольной группой от 0,1% до 50%.

18. Композиция филлера для улучшения состояния кожи, включающего морщины, содержащая производное гиалуроновой кислоты по п. 15 или 16, и фосфатно-солевой буфер (ФСБ).

19. Композиция филлера по п. 18, где производное гиалуроновой кислоты содержится в количестве от 0,1% (мас./об.) до 15% (мас./об.) из расчета на общее количество композиции филлера.

20. Композиция филлера по п. 18, где композиция представлена в жидком состоянии in vitro и превращается в гель in vivo без сшивающего агента.

21. Композиция филлера по п. 18, дополнительно содержащая любой фактор роста клеток, выбранный из группы, состоящей из фактора роста фибробластов (FGF), фактора роста эпителиальных клеток (EGF), фактора роста кератиноцитов (KGF), трансформирующего фактора роста альфа (TGF-α), трансформирующего фактора роста бета (TGF-β), гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (GCSF), инсулиноподобного фактора роста (IGF), фактора роста эндотелия сосудов (VEGF), фактора роста гепатоцитов (HGF), тромбоцитарного фактора роста BB (PDGF-BB), нейротрофического фактора головного мозга (BDNF) и нейротрофического фактора глиальных клеток (GDNF).

22. Композиция филлера по п. 18, дополнительно содержащая любой компонент, выбранный из группы, состоящей из местного анестетика, антиоксиданта, витамина и их комбинаций.

23. Способ разглаживания морщин, включающий стадию введения композиции филлера по п. 18 в/под кожу индивидуума.

24. Способ по п. 23, в котором композицию вводят путем инъекций в любой участок, выбранный из группы, состоящей из области слезной борозды, области межбровной складки, области края глаза, области лба, области переносицы, области носогубных складок, области марионеточных морщин и области складок на шее.

25. Применение производного гиалуроновой кислоты по п. 15 или 16 в качестве скаффолда для тканевой инженерии.

26. Применение производного гиалуроновой кислоты по п. 15 или 16 в качестве носителя для доставки лекарственного средства in vivo или ex vivo.

27. Применение по п. 26, где лекарственное средство представляет собой антитело, фрагмент антитела, нуклеиновую кислоту, включая ДНК, РНК или миРНК, пептид, ген, белок, стволовую клетку или химическое соединение.

28. Композиция противоспаечного барьера, содержащая производное гиалуроновой кислоты по пп. 15, 16 и фосфатно-солевой буфер (ФСБ).

29. Композиция для раневой повязки, содержащая производное гиалуроновой кислоты по пп. 15, 16 и фосфатно-солевой буфер (ФСБ).

30. Композиция для доставки лекарственного средства с замедленным высвобождением in vivo или ex vivo, содержащая фосфатно-солевой буфер (ФСБ) и производное гиалуроновой кислоты, содержащее по меньшей мере одно повторяющееся звено, модифицированное пирогаллольной группой, имеющее структуру, представленную Формулой 5

[Формула 5].