Изобретение относится к области молекулярной биологии, вирусологии и биотехнологии, в частности к диагностике инфекционных заболеваний, а именно к тест-системе для выявления SARS-CoV-2 линии Омикрон, с определением субварианта BA.1методом одношаговой полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией.
26 ноября 2021 Всемирная организация здравоохранения обозначила новую линию вируса SARS-CoV-2 – Омикрон (Классификация варианта «омикрон» (B.1.1.529) как варианта вируса SARS-CoV-2, вызывающего обеспокоенность. Сайт Всемирной организации здравоохранения, URL: https://www.who.int/ru/news/item/26-11-2021-classification-of-omicron-(b.1.1.529)-sars-cov-2-variant-of-concern, дата обращения – 28.12.2021 г.). На сегодняшний день выделяют несколько субвариантов SARS-CoV-2 линии Омикрон – BA.1,BA.2,BA.2.12, BA.3,BA.4, BA.5, обладающие различиями в скорости распространения, патогенности и нейтрализации сыворотками переболевших. На сегодняшний день актуальной задачей является разработка тест-систем, пригодных для диагностики SARS-CoV-2 линии Омикрон с определением субвариантов этой линии, что позволит повысить эффективность вирусологического мониторинга.
Известна тест-система для обнаружения РНК вируса SARS-CoV-2 (Тест-система для обнаружения РНК вируса SARS-CoV-2 в биоматериале от животных, пищевых продуктах и объектах окружающей среды методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени: патент RU2756474, Российская Федерация, заявка RU2021114811, заявл. 24.05.2021, опубл. 30.09.2021), включающая -ПЦР смесь, содержащую олигонуклеотидные праймеры и флуоресцентно-меченный зонд для амплификации и детекции участка гена N вируса SARS-CoV-2: прямой GGACCCCAAAATCAGCGAAA, обратный CTGGTTACTGCCAGTTGAATC, флуоресцентный зонд ROXCACCCCGCATTACGTTTGGTGGAC. Причем осуществляют реакцию ПЦР в режиме реального времени, состоящей из следующих этапов: обратная транскрипция 42°С - 15 мин, денатурация при 95°С в течение 5 мин и термического циклирования при 95°С - 15 с, 55°С - 15 с; 72°С - 20 с - 40 циклов, образец считается положительным на наличие РНК вируса SARS-CoV-2, если значение Ct≤35, образец считается отрицательным на наличие РНК вируса SARS-CoV-2, если значение Ct отсутствует/не регистрируется, однако в случае, если значение Ct для проб находится в пределах от 35 до 40, результат обнаружения РНК вируса SARS-CoV-2 считается сомнительным и подлежит повторному исследованию, при этом, если при проведении повторного исследования регистрируемое значение Ct≤40, результат обнаружения РНК вируса SARS-CoV-2 считается положительным; если значение Ct не регистрируется, результат обнаружения РНК вируса SAPS-CoV-2 считается отрицательным.
Также известен набор для выявления вируса SARS-CoV методом ОТ-ПЦР в реальном времени (Набор для выявления вируса SARS-CoV методом ОТ-ПЦР в реальном времени: патент RU2744198, Российская Федерация, заявка RU2020118246, заявл. 25.05.2020, опубл. 03.03.2021), включающий в себя олигонуклеотидные праймеры, ограничивающие фрагмент гена РНК зависимой РНК полимеразы, и олигонуклеотид, меченный флуоресцентной меткой (флуоресцентный зонд), имеющие следующую структуру:
CoV2-f tcacaattc aga agtagg acc tg;
CoV2-r agcctccaaaggcaa tag tgc
CoV2-pr R6G - tcttgccgaataccataatgaatccaa – BHQ1
Также известен набор синтетических олигонуклеотидов (Набор для выявления коронавируса SARS-CoV-2: патент RU2765497, Российская Федерация, заявка RU2021102274, заявл. 02.02.2021, опубл. 31.01.2022), фланкирующих несколько выбранных участков на РНК коронавируса SARS-CoV2 (праймеры), а также синтетических олигонуклеотидов, несущих в себе флуоресцентную метку и тушитель флуоресценции одновременно (зонды). При узнавании праймерами и зондами соответствующего участка на кДНК, комплементарной РНК коронавируса SARS-CoV2, происходит их связывание с ним, с последующим расщеплением зонда ферментом ДНК-полимеразой. При расщеплении зонда происходит усиление флуоресценции, что говорит о наличии в пробирке молекул-мишеней. Изобретение позволяет выявлять РНК коронавируса SARS-CoV2 в биологических образцах человека и животных, а также в мазках и смывах, взятых из окружающей среды с применением метода ПЦР в реальном времени.
Также известна тест-система для выявленияSARS-CoV-2, Influenzavirus A и Influenzavirus B (Тест-система для выявления SARS-CoV-2, Influenzavirus A, Influenzavirus B методом одношаговой полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией: патент RU 2761481, Российская Федерация, заявка 2021126293, заявл. 07.09.2021, опубл. 08.12.2021), включающая олигонуклеотидные праймеры и флуоресцентные зонды со следующей структурой: прямой праймер вируса гриппа В ATTCTTCAATgAAgAAggAAC; обратный праймер вируса гриппа В CTCCCAACACggTAgATA; флуоресцентный зонд вируса гриппа В (R6G)-TCCCATCATCATyCCAgg-(BHQ-1); прямой праймер вируса гриппа А CACCAAAyCATgArggAATA; обратный праймер вируса гриппа А gCTCATgTTgATTCCCAC; флуоресцентный зонд вируса гриппа А (ROX)-TgCAggTCCTrTAgAATCTrTCCACTC-(BHQ-2); прямой праймер SARS-CoV-2 AgAgCTATgAATTgCAgAC; обратный праймер SARS-CoV-2 gggAAATACAAAATTTggACA; флуоресцентный зонд SARS-CoV-2 (FAM)-AATTggCAAAgAAATTTgACACCTTCA-(BHQ-1).
На сегодняшний день не известны тест-системы, пригодные для эффективного выявления SARS-CoV-2 линии Омикрон.
Технической проблемой является необходимость разработки эффективной и точной тест-системы для выявления SARS-CoV-2 всех субвариантов линии Омикрон с возможностью дифференцировать субварианты.
Технический результат состоит в обеспечении возможности эффективной детекции РНК SARS-CoV-2 линии Омикрон с определением субварианта BA.1 методом одношаговой полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией.
Технический результат достигается тем, что тест-система на основе полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией для выявления SARS-CoV-2 линии Омикрон с определением субварианта BA.1включает олигонуклеотидные праймеры и флуоресцентный зонд со следующей структурой:
прямойпраймер2-SARS-CoV-2-ORF-1 – AGAGCTATGAATTGCAGAC
(SEQ ID NO: 1)
обратный праймер2-SARS-CoV-2-ORF-1 – GGGAAATACAAAATTTGGACA
(SEQ ID NO: 2)
флоуресцентный зонд 2-SARS-CoV-2-ORF-1 –
FAM-AATTGGCAAAGAAATTTGACACCTTCA-BHQ1(SEQ ID NO: 3)
прямой праймер N31-33del – GTTTGGTGGACCCTCAGATT(SEQ ID NO: 4)
обратный праймер N31-33del – CAAGACGCAGTATTATTGGGTAAAC(SEQ ID NO: 5)
флоуресцентный зонд N31-33del
HEX-AGTAACCAGAATGGTGGGGCGCG-BHQ1(SEQ ID NO: 6)
прямой праймер Ins214EPE – ATATTCTAAGCACACGCCTATT(SEQ ID NO: 7)
обратный праймер Ins214EPE – GGCAAATCTACCAATGGTTCTA(SEQ ID NO: 8)
флоуресцентный зонд Ins214EPE – ROX-TGCGTGAGCCAGAAGATCTCCCT-BHQ2(SEQ ID NO: 9)
Предложенная диагностическая система впервые позволяет детектировать все существующие на данный момент субварианты линии омикрон:
Впервые диагностическая система позволяет детектировать все существующие на данный момент субварианты линии омикрон: BA.1, BA.2,BA.2.12,BA.3, BA.4 bBA.5.Мультиплексная тест-система в сочетании (мультиплекс ОТ-ПЦР) с ранее заявленными олигонуклеотидами для детекции SARS-CoV-2 (патент RU2761481) и BA.1 (заявка RU2021140147), позволяет детектировать все известные на данный момент линии и варианты SARS-CoV-2 и определить принадлежность вируса к субвариантам BA.1 и не-BA.1 субвариантам линии Омикрон.
Определение всех вариантов линии Омикрон основано на детекции мутации ERS31del. На основании аннотаций аминокислотных замен и инделов более 5,5 миллионов образцов по 1513 линиям Pango из базы данных GISAID, доступных на 2021-12-03, рассчитаны относительные частоты замен по каждой линии с использованием языка Python v3.9.2, библиотек Pandas v1.3.5 и Numpy v1.3.5. Делеция ERS31del, детектируемая в данном анализе встречается только в линии Омикрон SARS-CoV-2 и является специфичным маркером этой линии.
Таблица 1. Описание разработанных олигонуклеотидов.
Для оптимизации работы тест-системы была проведена серия экспериментов по подбору рабочей концентрации праймеров и поставлен эксперимент с градиентом температуры отжига праймеров для подбора оптимального значения в условиях мультиплексной реакции. По результатам экспериментов оптимальная концентрация праймеров и зондов составила: 100 nM праймеров, 50 nMзонда. Увеличение количества олигонуклеотидов может привести к снижению специфичности реакции. Программа термоциклирования: обратная транскрипция 45°С - 15 мин, денатурация при 95°С в течение 5 мин и термическое циклирование при 95°С - 15 с, 62°С - 30 с - 40 циклов
Аналитическая чувствительность: предел детекции составляет 1000 генных копий в мл. Эффективность реакции: 105%.
Также заявляемое изобретение поясняется изображениями, где на фиг. 1 приведены результаты мультиплексного анализа, а на фиг. 2 приведен график, иллюстрирующий оптимальную эффективность ОТ-ПЦР для детекции РНК линии Омикрон– он основан на изменении Cqпри серийных десятикратных разведениях.
В случае использования тест-системы для детекции мутации ERS31del без добавления других олигонуклеотидов в реакцию, детекцию увеличения флюоресценции в ходе ПЦР по каналу HEX нужно расценивать как положительный результат – наличие SARS-CoV-2 линии омикрон в образце.
В случае мультиплексной ПЦР в сочетании с ранее разработанными олигонуклеотидами для выявления SARS-CoV-2 (патент №2761481), для выявления субварианта BA.1 линии Омикрон (заявка № 2021140147). Интерпретация результатов представлена в таблице 2.
Таблица 2. Интерпретация результатов мультиплексной ПЦР
Результаты проверки аналитической специфичности теста с использованием заявляемой тест-системы представлены в таблице 3.
Таблица 3. Результаты проверки аналитической специфичности теста:
Специфичность ОТ-ПЦР была оценена на образцах (мазки носоглотки от пациентов) SARS-CoV-2 других линий, а также на клинических образцах, положительных на другие респираторные вирусы из коллекции НИИ гриппа им. Смородинцева (грипп А и В, РСВ, сезонные коронавирусы, риновирусы) без ложно-положительных результатов.
название | год | авторы | номер документа |
---|---|---|---|
Тест-система для выявления SARS-CoV-2 линии Омикрон методом одношаговой полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией | 2021 |
|
RU2772362C1 |
Тест-система для выявления SARS-CoV-2, Influenza virus A, Influenza virus B методом одношаговой полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией | 2021 |
|
RU2761481C1 |
Олигонуклеотиды для определения мутации S:Ins214EPE SARS-CoV-2 | 2022 |
|
RU2795017C1 |
Набор реагентов для выявления РНК вируса SARS-CoV-2 методом прямой полимеразной цепной реакции в режиме реального времени | 2022 |
|
RU2795939C2 |
Олигонуклеотиды для определения мутации S:delVYY143-145 SARS-CoV-2 | 2022 |
|
RU2795016C1 |
Олигонуклеотиды для определения мутации S:N501Y SARS-CoV-2 | 2022 |
|
RU2791958C1 |
Набор праймеров для видоспецифичного обнаружения коронавируса SARS-CoV-2 по фрагменту гена Е | 2022 |
|
RU2797000C1 |
Тест-система и способ для выявления РНК коронавируса SARS-COV-2, вируса-возбудителя коронавирусного заболевания 2019 COVID-19, методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (Варианты) | 2020 |
|
RU2731390C1 |
Набор олигодезоксирибонуклетидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда для идентификации РНК коронавирусов человека SARS и 2019-nCoV методом ОТ-ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени | 2020 |
|
RU2733665C1 |
Набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченых зондов для идентификации РНК коронавируса человека SARS-CoV-2 методом изотермической ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени | 2021 |
|
RU2778855C1 |
Изобретение относится к области молекулярной биологии, вирусологии и биотехнологии. Описана тест-система на основе полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией для выявления SARS-CoV-2 линии Омикрон с определением субварианта BA.1, включающая олигонуклеотидные праймеры и флуоресцентный зонд. Изобретение обеспечивает эффективную детекцию РНК SARS-CoV-2 линии Омикрон с определением субварианта BA.1 методом одношаговой полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией. 2 з.п. ф-лы, 2 ил., 3 табл.
1. Тест-система на основе полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией для выявления SARS-CoV-2 всех субвариантов линии Омикрон с определением субварианта BA.1, включающая олигонуклеотидные праймеры и флуоресцентный зонд со следующей структурой:
прямой праймер 2-SARS-CoV-2-ORF-1 – AGAGCTATGAATTGCAGAC
обратный праймер 2-SARS-CoV-2-ORF-1 – GGGAAATACAAAATTTGGACA
флоуресцентный зонд 2-SARS-CoV-2-ORF-1 –
FAM-AATTGGCAAAGAAATTTGACACCTTCA-BHQ1
прямой праймер N31-33del – GTTTGGTGGACCCTCAGATT
обратный праймер N31-33del – CAAGACGCAGTATTATTGGGTAAAC
флоуресцентный зонд N31-33del
HEX-AGTAACCAGAATGGTGGGGCGCG-BHQ1
прямой праймер Ins214EPE – ATATTCTAAGCACACGCCTATT
обратный праймер Ins214EPE – GGCAAATCTACCAATGGTTCTA
флоуресцентный зонд Ins214EPE – ROX-TGCGTGAGCCAGAAGATCTCCCT-BHQ2
2. Тест-система по п. 1, отличающаяся тем, что оптимальная концентрация праймеров и зондов составляет 100 nM для праймеров, 50 nM для зондов.
3. Тест-система по п. 1, отличающаяся тем, что оптимальная программа термоциклирования соответствует следующим параметрам: обратная транскрипция 45°С - 15 мин, денатурация при 95°С в течение 5 мин и термическое циклирование при 95°С - 15 с, 62°С - 30 с - 40 циклов.
YASHAVANTH SHAAN LAKSHMANAPPA, SONNY R | |||
ELIZALDI и др., SARS-CoV-2 induces robust germinal center CD4 T follicular helper cell responses in rhesus macaques, Nature Communications volume, 22.01.2021, N541, стр.1-14, найдено в интернет 08.08.2022 https://www.nature.com/articles/s41467-020-20642-x.pdf | |||
Тест-система для обнаружения РНК вируса SARS-CoV-2 в биоматериале от животных, пищевых продуктах и объектах окружающей среды методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени | 2021 |
|
RU2756474C1 |
Тест-система и способ для выявления РНК коронавируса SARS-COV-2, вируса-возбудителя коронавирусного заболевания 2019 COVID-19, методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (Варианты) | 2020 |
|
RU2731390C1 |
Авторы
Даты
2022-08-30—Публикация
2022-05-20—Подача