Набор праймеров для видоспецифичного обнаружения коронавируса SARS-CoV-2 по фрагменту гена Е Российский патент 2023 года по МПК C12Q1/68 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к молекулярной биологии, вирусологии и медицине и обеспечивает видоспецифическое обнаружение коронавируса SARS-CoV-2 с помощью праймеров к фрагменту гена Е. Изобретение направлено на применение в условиях клинических лабораторий для ускоренной диагностики коронавируса нового типа.

Уровень техники

Пандемия, вызванная коронавирусом нового типа, охватившая множество стран по всему миру, началась в декабре 2019 года, когда в Ухане (Китай) была выявлена редкая форма неизвестной пневмонии (Zhu N, Zhang D, Wang W, Li X, Yang B, Song J, Zhao X, Huang B, Shi W, Lu R, Niu P, Zhan F, Ma X, Wang D, Xu W, Wu G, Gao GF, Tan W; China Novel Coronavirus Investigating and Research Team. A Novel Coronavirus from Patients with Pneumonia in China, 2019. N Engl J Med. 2020 Feb 20;382(8):727-733. doi: 10.1056/NEJMoa2001017. Epub 2020 Jan 24. PMID: 31978945; PMCID: PMC7092803) Всемирная организация здравоохранения объявила эту эпидемию чрезвычайной ситуацией в области общественного здравоохранения (ВОЗ) 30 января 2020 г. Далее, 11 февраля 2020 года, ВОЗ назвала это новое заболевание COVID-19 (www.who.int/dg/speeches/detail/who-director-general-s-opening-remarks-at-the-media-briefing-on-covid-19-11-march-2020), и в тот же день была объявлена глобальная пандемия.

Коронавирус нового типа, подобно другим РНК-содержащим вирусам, обладает высокой генетической пластичностью и образует множество новых серологически неоднородных подтипов в результате воздействия внешних факторов (пассажи в популяции хозяина, смена хозяина, воздействие иммунной системы и химиотерапии). Изменение паратопов в структурных белках (в случае коронавируса, это, в первую очередь, S- и N-белки) затрудняет идентификацию вируса иммунологическими методами (Тао, K., Tzou, P. L., Nouhin, J., Gupta, R. К., de Oliveira, Т., Kosakovsky Pond, S. L., Fera, D., & Shafer, R. W. (2021). The biological and clinical significance of emerging SARS-CoV-2 variants. Nature reviews. Genetics, 22(12), 757-773. https://doi.org/10.1038/s41576-021-00408-x). В то же время, белки, в меньшей степени входящие в прямой контакт с иммунной системой хозяина, мутируют в гораздо меньшей мере, но их ИФА-детекция затруднена именно по этой причине. Детекция консервативных генетических последовательностей возбудителя методом обратной транскрипции и последующей их амплификации (ОТ-ПЦР) в данном случае является методом выбора.

Для обнаружения коронавируса нового типа предложены различные методы (Sidiq, Z., Hanif, М., Dwivedi, К. К., & Chopra, К. К. (2020). Laboratory diagnosis of novel corona virus (2019-nCoV)-present and the future. The Indian journal of tuberculosis, 67(4S), S128-S131. https://doi.org/10.101 б/i.iitb.2020.09.023).

В статье (de Almeida, С.M., Motta, L. C, Folli, G. S., Marcarini, W. D., Costa, C. A., Vilela, A., Barauna, V. G., Martin, F. L., Singh, M. N., Campos, L., Costa, N. L., Vassallo, P. F., Chaves, A. R., Endringer, D. C, Mill, J. G., Filgueiras, P. R., & Romao, W. (2022). MALDI(+) FT-ICR Mass Spectrometry (MS) Combined with Machine Learning toward Saliva-Based Diagnostic Screening for COVID-19. Journal of proteome research, 27(8), 1868-1875. https://doi.org/10.1021/acs.jproteome.2c00148) описан метод идентификации коронавируса нового типа с помощью масс-спектрометрии (MALDI FT-ICR MS (matrix-assisted laser desorption/ionization Fourier-transform ion cyclotron resonance mass spectrometry).

Патент №202010522417.X (Китай) описывает применение MALDI для идентификации коронавируса нового типа (202010522417.Х, дата подачи 10.06.2020, дата публикации 27.10.2020, название «Kit for identifying new coronavirus by applying mass spectrum system and using method thereof))). Способ требует наличия сложного специализированного оборудования и высокую квалификацию персонала.

Методы электронной микроскопии и полногеномного секвенирования (Zhu N, Zhang D, Wang W, Li X, Yang B, Song J, Zhao X, Huang B, Shi W, Lu R, Niu P, Zhan F, Ma X, Wang D, Xu W, Wu G, Gao GF, Tan W; China Novel Coronavirus Investigating and Research Team. A Novel Coronavirus from Patients with Pneumonia in China, 2019. N Engl J Med. 2020 Feb 20;382(8):727-733. doi: 10.1056/NEJMoa2001017. Epub 2020 Jan 24. PMID: 31978945; PMCID: PMC7092803) весьма сложны, требуют специального оборудования и специалистов высокой квалификации, и поэтому неприменимы для массового анализа в условиях клинической лаборатории.

Серологические методы активно разрабатывались с начала пандемии для быстрого выявления антигенов или антител к SARS-CoV-2. Эти тест-системы предназначены для выявления антител (IgM и IgG) против SARS-CoV-2 (Sidiq, Z., Hanif, M., Dwivedi, К. К., & Chopra, К. К. (2020). Laboratory diagnosis of novel corona virus (2019-nCoV)-present and the future. The Indian journal of tuberculosis, 67(4S), SI 28-S131.).

Патент «Kit for combined detection of 2019 novel coronavirus IgM and IgG antibodies and preparation method thereof» (№202010212667.3, дата подачи 24.03.2020, дата публикации 17.07.2020, Китай) описывает способ идентификации вирусспецифичных иммуноглобулинов классов М и G. Способ зависит от лаг-периода выработки антител и осуществляет косвенную детекцию вируса по обнаружению иммунного ответа организма.

Международная заявка PCT/CN2021/076965 описывает набор, состоящий из нитроцеллюлозных тест-полосок, специфичных к антителам против коронавируса нового типа.

Неспецифические ответы IgM и недели, необходимые для выработки специфических ответов IgG, ограничивают их использование в активном ведении пациентов, но могут сыграть определенную роль в диагностике поздней инфекции.

Молекулярно-биологические методы, основанные на обратной транскрипции с последующей амплификацией (ОТ-ПЦР) также получили широкое распространение.

Для идентификации мутантных вариантов предложен метод, основанный на обратной транскрипции - количественной амплификации (RT-qPCR) (Juul, S., Spiegelhauer, M. R., Petersen, M. N., Flugt, К. K., Hansen, N. V., Larsen, H., Jensen, P. В., Christensen, U. В., Petersen, R. K., & Friis-Hansen, L. (2022). Validation and advantages of using novel RT-qPCR melting curve analysis assays for the identification of SARS-CoV-2 variants. Scientific reports, 12(1), 13069. https://doi.org/10.1038/s41598-022-17339-01 Метод требует компьютерной обработки данных, анализа кривых амплификации и плохо подходит для массового скрининга образцов.

Патент 202011127088.5 «Triple real-time fluorescent RT-PCR primer, probe and detection method for detecting novel coronavirus» основан на ОТ-ПЦР с флуоресцентной детекцией. Изобретение направлено на детекцию высоковариабельного региона и не включает в себя контроль длины ампилифицируемого продукта, что может способствовать возникновению ложноположительных результатов и снижает надежность способа.

Патент 202010228610.2 «Novel 2019 coronavirus S protein gene isothermal chromogenic amplification primer group, screening kit and detection method» рассматривает детекцию гена, кодирующего S-белок, с помощью чипа либо специальной ванночки для реакционного раствора с хромогенной детекцией. Подход основан на обнаружении в образце крайне вариабельного локуса генома коронавируса нового типа и требует специального оборудования для осуществления способа.

Методы, основанные на детекции S- и N-белков, которые в настоящее время получили широкое распространение, неустойчивы к появлению новых субтипов, т.к. гены, кодирующие эти белки, весьма вариабельны, что привело к появлению таких опасных и высококонтагиозных вариантов вируса, как, например, альфа, дельта, омикрон (Thakur, V., & Ratho, R. К. (2022). OMICRON (В. 1.1.529): A new SARS-CoV-2 variant of concern mounting worldwide fear. Journal of medical virology, 94(5), 1821-1824. https://doi.org/l 0.1002/jmv.27541). Это требует поиска консервативных генетических мишеней.

Для Е-гена (Envelope protein gene), выбранного в настоящем изобретении в качестве консервативной генетической мишени, кодирующего трансмембранные белок Е, описана очень маленькая частота мутаций, а именно 0,09% протестированных изолятов имели точечные мутации (Artesi, М., Bontems, S., Gobbels, P., Franckh, M., Maes, P., Boreux, R., Meex, C, Melin, P., Hayette, M. P., Bours, V., & Durkin, K. (2020). A Recurrent Mutation at Position 26340 of SARS-CoV-2 Is Associated with Failure of the E Gene Quantitative Reverse Transcription-PCR Utilized in a Commercial Dual-Target Diagnostic Assay. Journal of clinical microbiology, 55(10), eO 1598-20. https://doi.org/10.1128/JCM.01598-20). Это обстоятельство определяет надежность применения такой мишени для идентификации коронавируса нового типа, устойчивой к появлению новых серологических субтипов.

Раскрытие сущности изобретения

Изобретением предлагается набор праймеров (прямой и обратный) для видоспецифичной идентификации коронавируса по фрагменту Е-гена (Envelope protein gene), обладающих высокой специфичностью и устойчивых к генетической пластичности других участков генома вируса (в основном, это касается генов S- и N-белков, широко применяющихся для диагностики коронавируса нового типа).

SARS-CoV-2, коронавирус нового типа, подобно другим РНК-содержащим вирусам, обладает высокой генетической пластичностью и образует множество новых серологически неоднородных подтипов в результате воздействия внешних факторов (пассажи в популяции хозяина, смена хозяина, воздействие иммунной системы и химиотерапии) (Randhawa, G. S., Soltysiak, M., El Roz, H., de Souza, C, Hill, K. A., & Kari, L. (2020). Machine learning using intrinsic genomic signatures for rapid classification of novel pathogens: COVID-19 case study. PloS one, 15(4), e0232391. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0232391). Изменение паратопов в структурных белках (в случае коронавируса, это, в первую очередь, S- и N-белки (Coronaviridae Study Group of the International Committee on Taxonomy of Viruses (2020). The species Severe acute respiratory syndrome-related coronavirus: classifying 2019-nCoV and naming it SARS-CoV-2. Nature microbiology, 5(4), 536-544. https://doi.org/10.1038/s41564-020-0695-z) затрудняет идентификацию вируса иммунологическими методами. В то же время, белки, в меньшей степени входящие в прямой контакт с иммунной системой хозяина, мутируют в гораздо меньшей мере, но их ИФА-детекция затруднена именно по этой причине. Детекция консервативных генетических последовательностей возбудителя в данном случае является методом выбора.

Учитывая имеющиеся данные, для идентификации SARC-CoV-2 в предлагаемом изобретении выбран Е-ген, кодирующий трансмембранный белок Е, принимающий участие в фолдинге белка в комплексе Гольджи. Предполагается, что относительная консервативность белка Е связана с резким ослаблением вируса при возникновении мутаций, снижающих его сродство к пальмитолитическому белку (Lopez, L. A., Riffle, A. J., Pike, S. L., Gardner, D., & Hogue, В. G. (2008). Importance of conserved cysteine residues in the coronavirus envelope protein. Journal of virology, 82(6), 3000-3010. https://doi.org/10.1128/JVI.01914-07). Специфичность праймеров анализировали по алгоритму BLAST (NIH/США) с применением открытых баз данных, доступных во время разработки системы (2020 г. ). Способ направлен не на дифференциацию различных генетических линий SARC-CoV-2, а на надежную идентификацию на уровне вида (видоспецифичная идентификация). Мониторинг новых субтипов SARC-CoV-2 (более ста последовательностей по базе данных GenBank, относящихся к различным субвариантам) показал полное теоретическое совпадение последовательностей праймеров и выбранной генетической мишени.

Краткое описание фигур и таблиц

Фигура 1. Выравнивание последовательностей фрагмента Е-гена (Envelope protein gene) различных генетических линий SARC-CoV-2 (пример). Последовательности даны в формате ДНК (тимидин вместо уридина). Длина фрагмента, получаемого в процессе ОТ-ПЦР - 131 п. о. (пар оснований) Фигугр 2. Результат BLAST-анализа прямого праймера (SEQ ID NO: 1).

Фигура 3. Результат BLAST-анализа обратного праймера (SEQ ID NO: 2).

Фигура4. Результат электрофоретического разделения продуктов ОТ-ПЦР в 4% агарозном геле (окрашивание бромистым этидием) различных образцов коронавируса, относящихся к различным генетическим линиям: L - маркер длин продуктов GeneRuler 50 (Thermo Scientific, США, п. о. - пар оснований), 0* - штамм исходный «уханьский вариант», 1 - штамм «Dubrovka», 2 - штамм «Proletarskaya», 3 - штамм «Podolsk», 4 - штамм «Otradnoe», 5 - штамм «LIA», 6 - штамм «Altufjevo», NC -отрицательный контроль.

Таблица 1. Характеристика штаммов коронавируса SARS-CoV-2.

Осуществление изобретения

Целью изобретения является создание набора праймеров для для видоспецифичного обнаружения коронавируса SARS-CoV-2 по фрагменту гена Е. При этом в качестве исходного образца может быть использован клинический материал, лизат культуры, различные физиологические жидкости. Заявленный набор применяется для проведения обратной транскрипции на матрице РНК, выделенной из различных источников по стандартным методам, с последующей ПЦР.

Принципиальная схема идентификации коронавируса нового типа SARS-CoV-2 с помощью заявляемого набора праймеров (SEQ ID NO: 1. SEQ ID NO: 2)

Обработка образца перед проведением анализа осуществляется любым из имеющихся методов выделения РНК из биологических образцов, например - фенол-хлороформным методом (Molecular Cloning, Volume 3, 3rd edition, by Joseph Sambrook and David W. Russell. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, USA, 2001) или методом с использованием силикатных сорбентов (Cady N.C., Stelick S., Batt C.A. Nucleic acid purification using microfabricated silicon structures. Biosens Bioelectron. 2003 Oct 30;19(l):59-66), но не ограничивается ими. Лизаты образцов SARS-CoV-2 получают с помощью набора для выделения РНК (например, «Магно-Сорб», Россия), но не ограничиваются ими. Инактивацию вируса проверяют по наличию или отсутствию цитопатического эффекта на чувствительной культуре клеток Vero.

Подбор олигонуклеотидных праймеров выполняется на основе систематизации последовательностей, кодирующих белок Е. Систематизация и выбор консервативных локусов осуществляется на основе анализа литературных источников и последовательностей генов в базах данных (GenBank, Silva). Далее проводится множественное выравнивание (Multiplex Alignment) последовательностей отдельных локусов либо полноразмерного гена-мишени (Е-ген). Выравнивания проводятся с помощью специализированного программного обеспечения, например BioEdit Sequence Alignment Editor (версия 7.1.9) по алгоритму ClustalW. Далее, используя соответствующее программное обеспечение, например Oligo v. 6. 3 (Molecular Biology Insights Inc., США) или Fast PCR (http://www.biocenter.helsinki.fi/bi/ Programs/fastpcr.htm), расчитываются температуры отжига праймеров и, варьируя их длину, добиваются того, чтобы разброс температур отжига праймеров внутри набора не превышал 3-4°С. При подборе праймеров избегают таких последовательностей, которые способны формировать вторичные структуры типа шпильки с высокими температурами плавления. Специфичность подобранных праймеров проверятся путем поиска по базам данных нуклеотидных последовательностей (GenBank, Silva) с использованием программного обеспечения, поддерживающего алгоритм BLAST (например, www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST). Консервативность участка выбранного гена для сконструированных праймеров доказывается путем множественного анализа последовательностей с помощью алгоритма BLAST (например, www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST).

Продукты амплификации, полученные с помощью обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) с использованием данного набора праймеров, подвергаются разделению путем проведения электрофореза в агарозном геле. Далее, анализируются полученные изображения электрофореграмм. По расположению специфических полос для продуктов амплификации проводится интерпретация электрофореграммы и делается вывод о наличии в анализируемых образцах РНК коронавируса SARS-CoV-2 по продукту амплификации участка гена Е длиной 131 п. о. (пар оснований).

Далее изобретение будет проиллюстрировано примерами, которые предназначены для обеспечения лучшего понимания сущности заявленного изобретения, но не должны рассматриваться как ограничивающие данное изобретение.

Пример 1. Набор специфических олигонуклеотидных праймеров, специфичных к консервативному участку гена Е коронавируса нового типа SARS-CoV-2.

Праймеры для проведения полимеразной цепной реакции синтезируют на автоматическом синтезаторе 394 DNA/RNA synthesizer (Applied Biosystems, США).

Список праймеров и их последовательности представлены в Перечне последовательностей.

Пример 2. Выравнивание последовательностей праймеров с выбранным участком гена Е.

Для наглядности на Фигуре 1 показано расположение праймеров на последовательности гена Е. Нуклеотиды даны в форме ДНК (тимидин вместо уридина). Показана теоретическая специфичность к наиболее распространенным субвариантам (генетическим линиям) коронавируса нового типа SARS-CoV-2.

Пример 3. BLAST-анализ.

Для доказательства специфичности праймеров к выбранному учатску гена Е, а также для доказательства консервативности данного участка, проводят BLAST-анализ для более ста последовательностей коронавируса нового поколения, представляющих собой различные субтипы (генетические линии). На Фигуре 2 показан результат BLAST-анализа прямого праймера (SEQ ID NO: 1), на Фигуре 3 показан результат BLAST-анализа обратного праймера (SEQ ID NO: 2). Показано полное соответствие всем проанализированным последовательностям, доступным в базе данных GenBank, не выявлено неполного несоответствия, т.е. все праймеры специфичны на 100% (столбец «Query cower» на Фигуре 2 и Фигуре 3).

Пример 4. Использованные штаммы коронавируса нового типа

При создании заявляемого набора праймеров и для проверки специфичности набора праймеров используют образцы коронавируса, указанные в Таблице 1. Представлены основные варианты высокопатогенных штаммов, вызывающие в настоящее время вспышки заболевания COVID-19 в России и в мире. Принадлежность штамма к той или иной генетической линии доказывают с помощью стандартного секвенирования по Сенгеру.

Пример 5. Обратная транскрипция - полимеразная цепная реакция (ОТ-ПЦР).

ОТ-ПЦР проводят по стандартной методике, предлагаемой производителем набора для ОТ-ПЦР. Например, с использованием обратной транскриптазы MMLV и других компонентов набора "PEBEPTA-L" (ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора, Россия, в соответствии с инструкцией) и Hot Start Taq-полимеразы ("Thermo Scientific", в соответсвии с инструкцией) в буфере, входящем в набор; либо с помощью набора OneStep RT-PCR Kit ("Qiagen", США, в соответствии с инструкцией). Готовят реакционную смесь, содержащую необходимые компоненты набора в соответствии с инструкцией, а также природные dNTP, каждый в концентрации 400 мкМ, и праймеры в концентрации 5 мкМ каждого (прямой и обратный). Реакцию проводят на ДНК-амплификаторе TGradient Thermocycler ("Biometra", США) или аналогичном. ОТ проводят в течение 30 мин при 42°С, после чего проводят ПЦР в следующих условиях: 95°С в течение 3 мин (начальная денатурация); 36 циклов по 20 с при 95°С, 30 с при 64°С и 40 с при 72°С; завершающая инкубация в течение 5 мин при 72°С.

Пример 6. Электрофоретическое разделение продуктов ОТ-ПЦР.

Для подтверждения видоспецифичности заявляемого набора праймеров проводят ОТ-ПЦР (обратная транскрипция с последующей полимеразной цепной реакцией) по стандартным общепринятым методикам (например, с помощью транскриптазы MMLV (ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора, Россия, в соответствии с инструкцией)) и Hot Start Taq-полимеразы (Thermo Scientific, США, в соответствии с инструкцией) в реакционной пробирке, затем проводят разделение продуктов ОТ-ПЦР в агарозном геле по стандартным общепринятым методикам (например, с помощью камеры для горизонтального электрофореза SE-1, «Хеликон», Россия и геля на основе агарозы RA Biotechology Grade (Amerso, США). Сравнивают длину получающихся продуктов амплификации со стандартом - набором двухцепочечных ДНК различной длины (например, GeneRuler 50bp, как показано на Фигуре 4). Наличие продукта при визуальной детекции длиной около 131 п. н. свидетельствует о выявлении РНК коронавируса в исследуемом образце. В таком случае делается вывод о наличии в образце коронавируса нового типа.

Изобретение относится к молекулярной биологии, вирусологии и медицине. Представлен набор праймеров (прямой и обратный) для видоспецифичной идентификации коронавируса по фрагменту Е-гена (Envelope protein gene), обладающих высокой специфичностью и устойчивых к генетической пластичности других участков генома вируса (в основном, это касается генов S- и N-белков, широко применяющихся для диагностики коронавируса нового типа). Для идентификации SARC-CoV-2 в предлагаемом изобретении выбран Е-ген, кодирующий трансмембранный белок Е, принимающий участие в фолдинге белка в комплексе Гольджи. Изобретение расширяет арсенал средств для выявления SARS-CoV-2. 4 ил., 1 табл., 6 пр.

Набор праймеров для видоспецифичного обнаружения коронавируса SARS-CoV-2 по фрагменту гена Е, представленных последовательностями SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2.