Способ отбора потенциальных пробиотиков, эффективных против Staphylococcus aureus Российский патент 2022 года по МПК C12N1/20 

Область техники

Настоящее изобретение относится к медицине, микробиологии, биотехнологии и предназначено для разработки таргетных препаратов-пробиотиков, направленных на лечение бактериальных инфекций, вызванных, в частности, золотистым стафилококков (Staphylococcus aureus).

Уровень техники

Золотистый стафилококк (Staphylococcus aureus) вносит значительный вклад в структуру инфекционных заболеваний человека, вызывая как локализованные процессы, например инфекции ЛОР-органов (риниты, синуситы), так и тяжелые генерализованные инвазивные инфекции, в частности внутрибольничные хирургические инфекции, пневмонии и сепсис [Khamash D.F., Voskertchian A., Milstone A.M. J Perinatol. 2018, 38: 105-109]. Так, известно [Kluytmans J., van Belkum A., Verbrugh H. Clin Microbiol Rev. 1997, 10: 505-520.], что примерно 20% популяции человека являются постоянными носителями S. aureus, у 60% людей S. aureus выделяется эпизодически и только 20% популяции являются свободными от данной бактерии. Известно также, что около 10 миллионов россиян переносят ежегодно инфекции слизистой носа и носовых пазух. Кроме того, считается, что колонизация S. aureus играет важную роль в развитии аллергических заболеваний, таких как пищевая аллергия, атопический дерматит и бронхиальная астма [Tan R.A., Corren J. Immunol Allergy Clin North Am. 2011, 31:481-491].

Тем не менее, существующие методы эрадикации золотистого стафилококка с использованием антисептиков и антибиотиков не позволяют эффективно контролировать носительство данного патогена, в связи с чем рассматриваются альтернативные способы, в частности пробиотикотерапия (пробиотики - это живые микроорганизмы, которые при введении в адекватных количествах благоприятное действие на организм хозяина) [Hill C., Guarner F., Reid G. et al. Nat Rev Gastroenterol Hepatol, 2014, 11:506-514]. Так, данные литературы, включая результаты метагеномных исследований свидетельствуют о том, что носительство S.aureus отрицательно коррелирует с присутствием в составе назальной микробиоты таких микроорганизмов как коринебактерии и Staphylococcus epidermidis [Khamash D.F., Voskertchian A., Milstone A.M. J Perinatol. 2018, 38:105-109], что говорит о возможности использования пробиотиков для создания эффекта бактериальной интерференции с целью эрадикации S. аureus.

Так, известно, что 2 штамма непатогенных коринебактерий, обитающих в назальной полости, способны подавлять S. aureus [Uehara Y., Nakama H., Agematsu K. et al. Journal of Hospital Infection. 2000, 44:127-133; Kiryukhina N.V., Melnikov V.G., Suvorov A.V. et al. Probiotics & Antimicro. Prot. 2013,5:233-238]. Кроме того, один из существующих препаратов-пробиотиков на основе лактобактерий также был предложен для лечении инфекций носовой полости, вызванных S. aureus [Примак Т.Д., Эрдынеева Б.С. Способ лечения стафилококкового бактерионосительства в носоглотке// Патент России № 2341273].

Способность пробиотических бактерий антагонизировать (подавлять) возбудителя за счет выработки органических кислот, бактериоцинов, других ингибиторов, считается одним из основных механизмов действия пробиотиков и в этой связи обычно является обязательным этапом схемы отбора бактерий с наибольшим пробиотическим потенциалом [Shokryazdan P., Faseleh Jahromi M., Liang J.B. et al. J Am Coll Nutr. 2017,36:666-676]. Большинство из существующих методов изучения бактериального антагонизма включают в себя обязательное выделение чистой культуры бактерии- потенциального пробиотика для последующего ее тестирования против какого-либо патогена с применением различных методик (прямого антагонизма, отсроченного антагонизма).

Известно, что нормальная микробиота назальной полости человека включает в себя до 500 и более видов бактерий, и лишь некоторые из них было изучены на их способность к подавлению S. aureus. Так, штаммы коринебактерий, примененные в указанных выше аналогах, не были изолированы путем целенаправленного скрининга на основании их способности подавлять S. aureus, а были получены или из существующих музейных коллекций (штамм «от здорового человека» из неуказанного сайта изоляции - Kiryukhina N.V. et al., 2013) или же, по всей видимости, как результат случайного экспериментального наблюдения (в оригинальной публикации не указана методика отбора - Uehara Y. et al., 2000). Судя по тому, что данные препараты не получили широкого распространения в клинике для лечения инфекций S. aureus, предложенные биологические агенты, по всей вероятности, не обладают достаточной эффективностью именно в связи с тем, что не были отобраны из широкого круга нормальных микроорганизмов назальной полости, а являются представителями всего лишь одной таксономической группы.

По нашему мнению, для отбора высокоэффективных препаратов-пробиотиков необходимо применять методику интегрального изучения антагонистичекой активности нормальной микробиоты людей против S. aureus. Ближайшим техническим решением к данному изобретению, принятым за прототип, является способ отбора пробиотиков для аквакультур (для выращивания рыб), способных подавлять рост Vibrio anguillarum [Hjelm М., Bergh ∅., Riaza А. System. Appl. Microbiol. 2004, 27:360-371]. Данный способ включает в себя высев материала, полученного от личинок рыб на неселективную питательную среду, предназначенную для выращивания морских микроорганизмов (Marine Agar) с последующим переносом выросших колоний методом реплик на поверхность питательного агара, содержащего индикаторный штамм указанного патогена. После инкубации, штаммы, способные подавлять патоген, отбирались на основании их способности вызывать зоны отсутствия роста вокруг колоний. К недостаткам данного способа можно отнести использование только одной неселективной питательной среды и только одних условий инкубации, что не позволяет обеспечить рост многих бактерий, представленных в назальной микробиоте человека.

Раскрытие сущности изобретения

Задачей изобретения является разработка способа отбора пробиотиков из числа представителей нормальной микробиоты человека антагонистически активных против Staphylococcus aureus.

Сущность изобретения заключается в том, что производится прямой отбор наиболее активных штаммов-антагонистов Staphylococcus aureus путем высева материала носовых ходов здоровых доноров на несколько различных питательных сред, поддерживающие рост широкого спектра нормальных бактерий назальной микробиоты человека. Среды инкубируются в различных условиях (температура, присутствие или отсутствие кислорода) с последующим тестированием выросших колоний на их способность подавлять индикаторный штамм Staphylococcus aureus методом реплик в комбинации с методом отсроченного антагонизма. При решении поставленной задачи достигаются следующие технические результаты: предложенный способ позволяет произвести ускоренный прямой отбор штаммов-потенциальных пробиотиков, принадлежащих к различным таксономическим группам бактерий, способных подавлять рост Staphylococcus aureus.

Осуществление изобретения.

Отбор штаммов-потенциальных пробиотиков из состава нормальной назальной микробиоты согласно их способности подавлять рост индикаторного штамма S.aureus проводили двумя альтернативными методами: (I) модифицированным методом реплик [Hjelm М., Bergh ∅., Riaza А. System. Appl. Microbiol. 2004, 27:360-371] и (II) модифицированным методом отсроченного антагонизма в агаре [Muriana P.M., Klaenhammer T.R. Appl Environ Microbiol. 1987, 53:553-560].

Материал собирали зонд-тампонами, смоченными в стерильном физиологическом растворе, из наружных носовых ходов у клинически здоровых лиц, не являющихся носителями золотистого стафилококка. Зонд-тампоны погружали в 2 мл физ. раствора и пробирки ресуспендировали на вортексе в течение 10 секунд. Проводили высевы 0,1 мл неразведенной и разведенной (1:10) суспензии на поверхность следующих горизонтально-залитых агаризованных сред:

1. Columbia Base Agar (Himedia, Индия) с добавлением 5% крови (Кровяной агар) для выделения широкого спектра анаэробных и аэробных микроорганизмов (аэробная и анаэробная инкубация);

2. TS-агар (Himedia, Индия) для выделения нейссерий, коринебактерий и других факультативно-аэробных и аэробных бактерий (аэробная и анаэробная инкубация);

3. Коринебактагар (ФБУН ГНЦ ПМБ) для выделения коринебактерий (аэробная и микроаэрофильная инкубация);

4. BHI-агар для выделения широкого спектра аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов (аэробная инкубация);

5. MRS-агар (Himedia, Индия) для выделения лактобацилл (анаэробная инкубация);

6. LM17-агар (Himedia, Индия) для выделения лактококков (аэробная инкубация).

(I) Для использования в методе реплик чашки после посева инкубировали аэробно, микроаэрофильно (в анаэростатах АЭ-01в атмосфере 5-10% СО₂) или анаэробно (и использованием анаэростатов АЭ-01 и газпакетов Анаэрогаз (НИКИ МЛТ, Пенза). Аэробная и микроаэрофильная инкубации проводились 18-24 ч, анаэробная - 48 ч при 37°С. После инкубации, выросшие колонии переносили с помощью стерильных кругов фильтровальной бумаги на следующие среды:

1. Кровяной агар, 15 мл, залитый горизонтальным слоем той же среды (0,7% агара, 6 мл), содержащего 0,05 мл ночной культуры индикаторного штамма S. aureus в ГРМ-бульоне;

2. TS-агар (TSA), 15 мл, залитый горизонтальным слоем той же среды (0,7% агара, 6 мл), содержащего 0,05 мл ночной культуры индикаторного штамма;

3. Колонии, выросшие на коринебактагаре, переносили на TSA, 15 мл, залитый горизонтальным слоем той же среды (0,7% агара, 6 мл), содержащего 0,05 мл ночной культуры индикаторного штамма;

4. MRS-агар, 15 мл, залитый горизонтальным слоем смеси среды MRS (0,7% агара, 3 мл) и среды BHI (0,7% агара, 3 мл), содержащей 0,05 мл ночной культуры индикаторного штамма.

5. BHI-агар, залитый горизонтальным слоем той же среды (0,7% агара, 6 мл), содержащего 0,05 мл ночной культуры индикаторного штамма;

6. LM17-агар, залитый горизонтальным слоем смеси среды LM17 (0,7% агара, 3 мл) и среды BHI (0,7% агара, 3 мл), содержащей 0,05 мл ночной культуры индикаторного штамма.

После этого, чашки инкубировали аэробно, микроаэрофильно или анаэробно как указано выше.

(II) Для использования в методе отсроченного антагонизма посевы заливали строго горизонтально тонким слоем (6 мл) соответствующего полужидкого покровного агара (Кровяной агар, TSA, MRS, BHI, или LM17-агар, 0.7%) и инкубировали аэробно или анаэробно как указано выше, после чего чашки заливали дополнительным слоем покровного агара, содержащим 0,05 мл ночной бульонной культуры индикаторного штамма с дополнительной инкубировацией в течение 18 час.

После инкубации выявляли бактериальные колонии, подавляющие рост индикаторного штамма S. aureus по наличию зон задержки роста, переносили колонии на соответствующие питательные среды для дальнейшей характеризации.

Изобретение поясняется следующими примерами.

Пример 1. Отбор нормальных микроорганизмов-представителей назальной микробиоты человека, способных антагонизировать S. aureus модифицированным методом реплик в комбинации с методом отсроченного антагонизма с использованием материала от 6 здоровых лиц, у которых не было выявлено носительство золотистого стафилококка, позволило выявить 89 бактериальных изолятов, выраженно подавляющих рост указанного патогена. Из данных изолятов-антагонистов, 46 были идентифицированы с помощью метода MALDI-TOF как представители коагулаз-отрицательных видов стафилококков S. epidermidis, S. lugdunensis, Staphylococcus capitis и Staphylococcus haemolyticus, которые рассматриваются как нормальные представители назальной микробиоты, а также штаммы, относящиеся к видам Kocuria kristinae, Lactococcus garvieae и Lactococcus lactis (табл. 1)

№ п/п Вид бактерий Количество изолятов (% от общего числа 1. Staphylococcus epidermidis 22 (49%) 2. Staphylococcus lugdunensis 13 (29%) 3. Staphylococcus capitis 4 (13%) 4. Staphylococcus haemolyticus 3 (2%) 5. Kocuria kristinae 1 (2%) 6. Lactococcus garvieae 1 (2%) 7. Lactococcus lactis 1 (2%)

Пример 2. Чистые культуры репрезентативных представителей отобранных бактерий-антагонистов были дополнительно протестированы с использованием количественного метода отсроченного антагонизма в агаре для определения диаметра зон подавления роста индикаторного штамма S. aureus, что позволило определить штаммы, наиболее активно ингибирующие золотистый стафилококк (табл. 2)

Таблица 2 - Ингибиция индикаторного штамма S.aureus полученными бактериальными изолятами в тесте количественного отсроченного антагонизма № п/п Штамм Диаметр зоны задержки роста (Среднее±SD^*, мм) 1. Staphylococcus epidermidis ant3 7,5±1,4 2. Staphylococcus epidermidis ant5 8,2±1,9 3. Staphylococcus epidermidis C41 9,0±2,1 4. Staphylococcus lugdunensis Lant3 3,9±1,1 5. Staphylococcus capitis ant1 5,8±1,5 6. Staphylococcus haemolyticus E10 6,4±1,7 7. Kocuria kristinae LM4 5,9±2,1 8. Lactococcus lactis C44 11,1±2,3 9. Lactococcus garvieae LM1 5,5±1,5 * SD - среднеквадратичное отклонение

Отобранные наиболее активные штаммы-ингибиторы могут быть использованы в дальнейшей работе, направленной на разработку препаратов-пробиотиков, целенаправленно активных против S.aureus.

Список литературы

1. Khamash D.F., Voskertchian A., Milstone A.M. Manipulating the microbiome: evolution of a strategy to prevent S. aureus disease in children. J Perinatol. 2018. Vol. 38. P. 105-109.

2. Kluytmans J., van Belkum A., Verbrugh H. Nasal carriage of Staphylococcus aureus: epidemiology, underlying mechanisms, and associated risks. Clin Microbiol Rev. 1997. Vol.10, № 3. Р.505-520.

3. Tan R.A., Corren J. The relationship of rhinitis and asthma, sinusitis, food allergy, and eczema. Immunol Allergy Clin North Am. 2011. Vol. 31. P. 481-91.

4. Hill C., Guarner F., Reid G. et al. Expert consensus document. The International Scientific Association for Probiotics and Prebiotics consensus statement on the scope and appropriate use of the term probiotic. Nat Rev Gastroenterol Hepatol, 2014. Vol. 11. Р.506-514.

5. Khamash D.F., Voskertchian A., Milstone A.M. Manipulating the microbiome: evolution of a strategy to prevent S. aureus disease in children. J Perinatol. 2018. Vol. 38. P.105-109.

6. Uehara Y., Nakama H., Agematsu K. et al. Bacterial interference among nasal inhabitants: eradication of Staphylococcus aureus from nasal cavities by artificial implantation of Corynebacterium sp. Journal of Hospital Infection. 2000. Vol. 44. № 2. P.127-133.

7. Kiryukhina N.V., Melnikov V.G., Suvorov A.V. et al. Use of Corynebacterium pseudodiphtheriticum for elimination of Staphylococcus aureus from the nasal cavity in volunteers exposed to abnormal microclimate and altered gaseous environment. Probiotics & Antimicro. Prot. 2013. Vol. 5. P.233-238. DOI 10.1007/s12602-013-9147-x.

8. Shokryazdan P, Faseleh Jahromi M, Liang JB, Ho YW. Probiotics: From Isolation to Application. J Am Coll Nutr. 2017 Nov-Dec;36(8):666-676. doi: 10.1080/07315724.2017.1337529. Epub 2017 Sep 22.

9. Hjelm М., Bergh ∅., Riaza А. Selection and Identification of Autochthonous Potential Probiotic Bacteria from Turbot Larvae (Scophthalmus maximus) Rearing Units. System. Appl. Microbiol. 2004. Vol. 27. P. 360-371.

10. Muriana P.M., Klaenhammer T.R. Conjugal Transfer of Plasmid-Encoded Determinants for Bacteriocin Production and Immunity in Lactobacillus acidophilus 88. Appl Environ Microbiol. 1987. Vol.53. № 3. P.553-560.

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ отбора потенциальных пробиотиков, эффективных против Staphylococcus aureus, включает в себя использование модицифированных метода реплик и метода отсроченного антагонизма, а именно высев материала, полученного стерильными зонд-тампонами из носовых ходов здоровых доноров на несколько различных питательных сред, например на кровяной агар, BHI агар, TS агар, коринебактагар, MRS агар, LM17 агар с культивированием при различных условиях (температура, аэробные, микроаэрофильные и анаэробные условия), с последующим переносом выросших колоний с помощью стерильной фильтровальной бумаги на свежие чашки Петри с теми же средами, залитыми слоем полужидкого (0,7%) агара, содержащим культуру индикаторного Staphylococcus aureus и поддерживающим рост штаммов - потенциальных пробиотиков, или же, при использовании метода отсроченного антагонизма, чашки Петри с указанными средами засеваются материалом от доноров, покрываются полужидким агаром, инкубируются в соответствующих условиях, после чего перегружаются слоем полужидкого агара, содержащим индикаторную культуру Staphylococcus aureus с последующей повторной инкубацией и отбором штаммов - потенциальных пробиотиков по их способности подавлять рост Staphylococcus aureus вокруг их колоний. Данный метод позволяет проводить ускоренный отбор штаммов - потенциальных пробиотиков из числа микроорганизмов, присутствующих в нормальной микробиоте людей. 2 н.п. ф-лы, 2 табл., 2 пр.

1. Способ отбора потенциальных пробиотиков, эффективных против Staphylococcus aureus, с использованием модифицированного метода реплик, включающий культивирование материала, полученного стерильными зонд-тампонами от здоровых доноров на нескольких различных селективных и неселективных питательных средах, в аэробных и микроаэрофильных условиях в течение 18-24 ч при 37°С, в анаэробных условиях 48 ч при 37°С, в частности кровяной агар - аэробная и анаэробная инкубация; коринебактагар – аэробная и микроаэрофильная инкубация; TS агар - аэробно и анаэробно; BHI агар – аэробно; MRS агар – анаэробно; LM17 агар – аэробно, с последующим репликативным переносом с помощью стерильной фильтровальной бумаги на свежие чашки Петри с теми же средами, залитыми тонким слоем полужидкого (0,7%) агара, содержащим ночную культуру индикаторного Staphylococcus aureus и поддерживающим рост штаммов - потенциальных пробиотиков, повторное инкубирование в течение 18 ч и отбор штаммов - потенциальных пробиотиков по их способности подавлять рост Staphylococcus aureus вокруг их колоний.

2. Способ отбора потенциальных пробиотиков, эффективных против Staphylococcus aureus, с использованием модифицированного метода отсроченного антагонизма, включающий культивирование материала, полученного стерильными зонд-тампонами от здоровых доноров на нескольких различных селективных и неселективных питательных средах, покрытых после засева указанным материалом от доноров полужидким агаром, в аэробных и микроаэрофильных условиях в течение 18-24 ч при 37°С, в анаэробных условиях 48 ч при 37°С, в частности кровяной агар – аэробная и анаэробная инкубация; коринебактагар – аэробная и микроаэрофильная инкубация; TS агар – аэробно и анаэробно; BHI агар – аэробно; MRS агар – анаэробно; LM17 агар – аэробно, после чего заливают слоем полужидкого агара, содержащим ночную индикаторную культуру Staphylococcus aureus, повторно инкубируют в течение 18 ч и отбирают штаммы - потенциальные пробиотики по их способности подавлять рост Staphylococcus aureus вокруг их колоний.