ШТАММ BACILLUS LICHENIFORMIS ВКМ B-2713D, ОБЛАДАЮЩИЙ ВЫРАЖЕННЫМ АНТАГОНИЗМОМ ПО ОТНОШЕНИЮ К SALMONELLA TYPHI, STAPHYLOCCUS AUREUS, LISTERIA MONOCYTOGENES И РЕЗИСТЕНТНОСТЬЮ К СТРЕПТОМИЦИНУ И НАЛИДИКСОВОЙ КИСЛОТЕ Российский патент 2013 года по МПК C12N1/20 A61K35/74 C12R1/10 

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к пробиотическим бактериальным препаратам, которые могут найти применение в ветеринарии. Пробиотическими являются бактериальные препараты на основе штаммов микроорганизмов, обладающих антагонистической активностью к энтеропатогенным бактериям.

В классических исследованиях И.А.Мечникова эти свойства были изучены на примере молочнокислых бактерий. Затем круг продуцентов пробиотических препаратов был расширен.

Пробиотики на основе штаммов спорообразующих бактерий сравнительно недавно стали применяться в ветеринарии. Антагонистические свойства этих бактерий привлекают к себе внимание многих разработчиков.

Сложность лечения инфекционных заболеваний заключается в возникновении у патогенных микроорганизмов полирезистентности к антибиотикам. Кроме того, сами антибиотики часто оказывают побочное воздействие на организм животных и вызывают дисбактериоз кишечника, отягчающий течение основного заболевания. Это обусловливает необходимость поиска новых подходов к решению данной проблемы.

Препараты-пробиотики на основе бактерий рода Bacillus, подавляющие развитие патогенных микроорганизмов, находят широкое применение в сельском хозяйстве для подавления фитопатогенных бактерий и грибов, в медицине, ветеринарии для лечения различных заболеваний птиц и сельскохозяйственных животных [1].

В настоящее время препараты-пробиотики из бактерий рода Bacillus находят широкое применение в ветеринарии для лечения различных заболеваний птиц и сельскохозяйственных животных. Предложены многочисленные варианты пробиотиков из спорообразующих бактерий: бактиспорин [5], бациллоспорин [6], споролакт [7], споробактерин [8], субалин [9]. Основу вышеперечисленных препаратов-пробиотиков составляют разные штаммы бактерий рода Bacillus, обладающие антагонизмом в отношении патогенных бактерий.

Для повышения эффективности профилактики и лечения дисбактериозов предлагают бациллярные препараты из двух штаммов бактерий рода Bacillus - Bacillus subtilis и Bacillus licheniformis. Считается, что бактерии вида Bacillus subtilis - строгие аэробы, тогда как представители вида Bacillus licheniformis могут расти в микроаэрофильных условиях. Считается также, что эти свойства двух видов усиливают эффективность пробиотической терапии [2-4]. Подавляющее большинство представителей рода Bacillus безвредны для теплокровных животных, проявляют антагонистическую активность к широкому спектру патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, устойчивы к литическим ферментам, технологичны в производстве, стабильны при хранении, экологически безопасны.

Учитывая возможность применения антибиотиков в кормопроизводстве, весьма перспективно использование в составе пробиотических препаратов штаммов, обладающих как высокой антагонистической активностью против энтеропатогенов, так и полирезистентностью к антибиотикам.

В качестве прототипа можно рассматривать штамм Bacillus licheniformis ВКПМ - 2336, входящий в состав ветеринарного препарата Ирилис [11].

Задачей настоящего изобретения является получение штамма Bacillus licheniformis, обладающего антагонистической активностью к широкому спектру патогенных тест-организмов, а также резистентностью к наиболее широко применяемым антибиотикам.

Технический эффект, который может быть получен при использовании полученного штамма, заключается в повышении эффективности лечения за счет возможности сочетанного применения бактериального препарата с антибиотиками.

Для решения указанной проблемы предлагается штамм Bacillus licheniformis BKM B-2713D. Штамм депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов.

Идентификация штамма была осуществлена по «Определителю микроорганизмов» Берги (1997 г.).

Исходный почвенный изолят выделен в Кировской области. Почвенный изолят был подвергнут мутагенному воздействию нитрозогуанидина (доза от 40 до 100 мкг/мл) с последующим скринингом на селективных средах.

Культурально-морфологические и микроскопические особенности штамма: клетки палочковидные прямые, размер: 0,5-0,7×2,0-3,0 мкм, образует термоустойчивые эндоспоры, не более 1 в клетке-спорангии, спорообразование не подавляется экспозицией на воздухе, расположение центральное. Клетки неподвижны. На стандартных плотных питательных средах (МПА, LB, ГРМ-1) образует мелкие прозрачные выпуклые колонии. Колонии врастают в агар. Каталаза: положительный тест, факультативный анаэроб. Используемые источники углерода при аэробном росте: глюкоза, арабиноза, ксилоза, манит, декстроза, казеин, крахмал. Оптимум рН для роста 6,0-8,0, температура: от +4°С до +45°С.

Резистентность к антибиотикам: стрептомицин - 20 мкг/мл, налидиксовая кислота - 20 мкг/мл.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Штамм характеризуется высокой антагонистической активностью в отношении патогенных и условно-патогенных микроорганизмов. Антагонистическую активность проверяли методом отсроченного антагонизма.

Для этого взвесь клеток, смытых с агаровой среды, высевали штрихом по диаметру чашки Петри с агаризованной средой Гаузе N 2. Посевы инкубировали в термостате при 37°С в течение 48 ч. Затем к выросшей культуре подсевали штрихом тест-микроорганизмы (500-миллионные суспензии суточных культур в физиологическом растворе). Учет результатов проводили через 18-20 часов инкубирования при 37°С по величине зон отсутствия роста тест-культур. Контролем роста тест-культур служило параллельное выращивание их на чашках с агаризованной средой Гаузе N 2 без исследуемой культуры. Результаты приведены в таблице.

Исследование антагонистических свойств культуры.

Задержка роста тест-культур, мм Е.coli S.typhimurium S.typhi Ps.aeruginosa St.aureus L.monocytogenes 0 0 7 0 12 14

Пример 2. Была изучена резистентность к следующим антибиотикам: канамицин, стрептомицин, гентамицин, триметоприм, налидиксовая кислота, цефазолин, ампициллин, бензилпенициллина натриевая соль. Проверку осуществляли при глубинном культивировании продуцента на глюкозо-пептонной среде с дрожжевым экстрактом при различных концентрациях антибиотиков. Было установлено, что штамм обладает резистентностью к антибиотикам: стрептомицин - 20 мкг/мл, налидиксовая кислота - 20 мкг/мл.

Пример 3.

Активности ферментов в культуральной жидкости определяли при глубинном культивировании продуцента на глюкозо-пептонной среде с дрожжевым экстрактом в течение двух суток. Были определены следующие значения ферментативной активности:

α - амилазная активность - 0,015 Ед/ мл среды при рН 6,0,

протеазная активность - 2,34 Ед/мл среды при рН 7,0.

Следует отметить высокую протеазную активность штамма Bacillus licheniformis BKM B-2713D.

Литература

1. Смирнов В.В., Резник С.Р., Вьюницкая В.О. Современные представления о механизмах лечебно-профилактического действия пробиотиков из бактерий рода Bacillus // Микробиол. журн. - 1993. - №4. - С.92-112.

2. Бакулина Л.Ф., Тимофеев И.В., Перминова Н.Г., Полушкина А.Ф., Печуркина Н.И. Пробиотики на основе спорообразующих микроорганизмов рода Bacillus и их использование в ветеринарии // Биотехнология. 2001, №2, с.48-56.

3. Hong, H.A., Due L.H., Cutting S.M. The use of bacterial spore formers as probiotics // FEMS Microbiol. Rev. - 2005. - Vol.29, № 4. - P.813-835.

4. Probiotics Microbes: The Scientific Basis / R.J.Collier, et al. // A Report from American Academy of Microbiology.- Washington, 2006. - 28 p.

5. Патент РФ 2130316. Лечебно-профилактический биопрепарат бактиспорин. А61K 35/74, БИ №14, 1999, приор. 23.01.97.

6. Патент СССР 1710575. Штамм бактерий Bacillus sp - компонент лечебно-профилактического препарата против дисбактериозов и аллергий, C12N 1/20, БИ №5, 1992.

7. Патент РФ 2035186. Профилактический биопрепарат споролакт. А61K 35/66, БИ №14, 1995.

8. Алешкин, А.В., Афанасьев, С.С., Давыдкин, В.Ю., Манько, Т.Н., Давыдкин, И.Ю. Бактерийный препарат нового поколения «Споробактерин» // Мед. картотека. - 2003. - №4.

9. Патент РФ №2035185. Профилактический биопрепарат Субалин. - 1995. Приор. 31.01.1992.

10. Патент РФ 2115725. Штамм Bacillus subtilis, резистентный к рифампицину, ампициллину и стрептомицину, обладающий антибактеральной активностью по отношению к патогенным видам микроорганизмов. Приор. 23.07.1997.

11. Гатауллин А.Г. Биологические свойства штаммов Bacillus subtilis, перспективных для создания новых пробиотиков // Дисс. канд. биол. наук, Москва, 2005 г.

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано в ветеринарии. Штамм Bacillus licheniformis BKM B-2713D обладает выраженным антагонизмом по отношению к Salmonella typhi, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes. Штамм обладает резистентностью к антибиотикам при концентрации стрептомицина 20 мкг/мл, при концентрации налидиксовой кислоты 20 мкг/мл. Штамм обладает α-амилазной активностью 0,015 Ед/мл среды при рН 6,0, протеазной активностью 2,34 Ед/мл среды при рН 7,0. 1 табл., 3 пр.

Штамм Bacillus licheniformis BKM B-2713D, обладающий выраженным антагонизмом по отношению к Salmonella typhi, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes и резистентностью к антибиотикам стрептомицину и налидиксовой кислоте.