ШТАММ BACILLUS LICHENIFORMIS ВКМ B-2713D, ОБЛАДАЮЩИЙ ВЫРАЖЕННЫМ АНТАГОНИЗМОМ ПО ОТНОШЕНИЮ К SALMONELLA TYPHI, STAPHYLOCCUS AUREUS, LISTERIA MONOCYTOGENES И РЕЗИСТЕНТНОСТЬЮ К СТРЕПТОМИЦИНУ И НАЛИДИКСОВОЙ КИСЛОТЕ Российский патент 2013 года по МПК C12N1/20 A61K35/74 C12R1/10 

Описание патента на изобретение RU2501849C1

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к пробиотическим бактериальным препаратам, которые могут найти применение в ветеринарии. Пробиотическими являются бактериальные препараты на основе штаммов микроорганизмов, обладающих антагонистической активностью к энтеропатогенным бактериям.

В классических исследованиях И.А.Мечникова эти свойства были изучены на примере молочнокислых бактерий. Затем круг продуцентов пробиотических препаратов был расширен.

Пробиотики на основе штаммов спорообразующих бактерий сравнительно недавно стали применяться в ветеринарии. Антагонистические свойства этих бактерий привлекают к себе внимание многих разработчиков.

Сложность лечения инфекционных заболеваний заключается в возникновении у патогенных микроорганизмов полирезистентности к антибиотикам. Кроме того, сами антибиотики часто оказывают побочное воздействие на организм животных и вызывают дисбактериоз кишечника, отягчающий течение основного заболевания. Это обусловливает необходимость поиска новых подходов к решению данной проблемы.

Препараты-пробиотики на основе бактерий рода Bacillus, подавляющие развитие патогенных микроорганизмов, находят широкое применение в сельском хозяйстве для подавления фитопатогенных бактерий и грибов, в медицине, ветеринарии для лечения различных заболеваний птиц и сельскохозяйственных животных [1].

В настоящее время препараты-пробиотики из бактерий рода Bacillus находят широкое применение в ветеринарии для лечения различных заболеваний птиц и сельскохозяйственных животных. Предложены многочисленные варианты пробиотиков из спорообразующих бактерий: бактиспорин [5], бациллоспорин [6], споролакт [7], споробактерин [8], субалин [9]. Основу вышеперечисленных препаратов-пробиотиков составляют разные штаммы бактерий рода Bacillus, обладающие антагонизмом в отношении патогенных бактерий.

Для повышения эффективности профилактики и лечения дисбактериозов предлагают бациллярные препараты из двух штаммов бактерий рода Bacillus - Bacillus subtilis и Bacillus licheniformis. Считается, что бактерии вида Bacillus subtilis - строгие аэробы, тогда как представители вида Bacillus licheniformis могут расти в микроаэрофильных условиях. Считается также, что эти свойства двух видов усиливают эффективность пробиотической терапии [2-4]. Подавляющее большинство представителей рода Bacillus безвредны для теплокровных животных, проявляют антагонистическую активность к широкому спектру патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, устойчивы к литическим ферментам, технологичны в производстве, стабильны при хранении, экологически безопасны.

Учитывая возможность применения антибиотиков в кормопроизводстве, весьма перспективно использование в составе пробиотических препаратов штаммов, обладающих как высокой антагонистической активностью против энтеропатогенов, так и полирезистентностью к антибиотикам.

В качестве прототипа можно рассматривать штамм Bacillus licheniformis ВКПМ - 2336, входящий в состав ветеринарного препарата Ирилис [11].

Задачей настоящего изобретения является получение штамма Bacillus licheniformis, обладающего антагонистической активностью к широкому спектру патогенных тест-организмов, а также резистентностью к наиболее широко применяемым антибиотикам.

Технический эффект, который может быть получен при использовании полученного штамма, заключается в повышении эффективности лечения за счет возможности сочетанного применения бактериального препарата с антибиотиками.

Для решения указанной проблемы предлагается штамм Bacillus licheniformis BKM B-2713D. Штамм депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов.

Идентификация штамма была осуществлена по «Определителю микроорганизмов» Берги (1997 г.).

Исходный почвенный изолят выделен в Кировской области. Почвенный изолят был подвергнут мутагенному воздействию нитрозогуанидина (доза от 40 до 100 мкг/мл) с последующим скринингом на селективных средах.

Культурально-морфологические и микроскопические особенности штамма: клетки палочковидные прямые, размер: 0,5-0,7×2,0-3,0 мкм, образует термоустойчивые эндоспоры, не более 1 в клетке-спорангии, спорообразование не подавляется экспозицией на воздухе, расположение центральное. Клетки неподвижны. На стандартных плотных питательных средах (МПА, LB, ГРМ-1) образует мелкие прозрачные выпуклые колонии. Колонии врастают в агар. Каталаза: положительный тест, факультативный анаэроб. Используемые источники углерода при аэробном росте: глюкоза, арабиноза, ксилоза, манит, декстроза, казеин, крахмал. Оптимум рН для роста 6,0-8,0, температура: от +4°С до +45°С.

Резистентность к антибиотикам: стрептомицин - 20 мкг/мл, налидиксовая кислота - 20 мкг/мл.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Штамм характеризуется высокой антагонистической активностью в отношении патогенных и условно-патогенных микроорганизмов. Антагонистическую активность проверяли методом отсроченного антагонизма.

Для этого взвесь клеток, смытых с агаровой среды, высевали штрихом по диаметру чашки Петри с агаризованной средой Гаузе N 2. Посевы инкубировали в термостате при 37°С в течение 48 ч. Затем к выросшей культуре подсевали штрихом тест-микроорганизмы (500-миллионные суспензии суточных культур в физиологическом растворе). Учет результатов проводили через 18-20 часов инкубирования при 37°С по величине зон отсутствия роста тест-культур. Контролем роста тест-культур служило параллельное выращивание их на чашках с агаризованной средой Гаузе N 2 без исследуемой культуры. Результаты приведены в таблице.

Исследование антагонистических свойств культуры.

Задержка роста тест-культур, мм Е.coli S.typhimurium S.typhi Ps.aeruginosa St.aureus L.monocytogenes 0 0 7 0 12 14

Пример 2. Была изучена резистентность к следующим антибиотикам: канамицин, стрептомицин, гентамицин, триметоприм, налидиксовая кислота, цефазолин, ампициллин, бензилпенициллина натриевая соль. Проверку осуществляли при глубинном культивировании продуцента на глюкозо-пептонной среде с дрожжевым экстрактом при различных концентрациях антибиотиков. Было установлено, что штамм обладает резистентностью к антибиотикам: стрептомицин - 20 мкг/мл, налидиксовая кислота - 20 мкг/мл.

Пример 3.

Активности ферментов в культуральной жидкости определяли при глубинном культивировании продуцента на глюкозо-пептонной среде с дрожжевым экстрактом в течение двух суток. Были определены следующие значения ферментативной активности:

α - амилазная активность - 0,015 Ед/ мл среды при рН 6,0,

протеазная активность - 2,34 Ед/мл среды при рН 7,0.

Следует отметить высокую протеазную активность штамма Bacillus licheniformis BKM B-2713D.

Литература

1. Смирнов В.В., Резник С.Р., Вьюницкая В.О. Современные представления о механизмах лечебно-профилактического действия пробиотиков из бактерий рода Bacillus // Микробиол. журн. - 1993. - №4. - С.92-112.

2. Бакулина Л.Ф., Тимофеев И.В., Перминова Н.Г., Полушкина А.Ф., Печуркина Н.И. Пробиотики на основе спорообразующих микроорганизмов рода Bacillus и их использование в ветеринарии // Биотехнология. 2001, №2, с.48-56.

3. Hong, H.A., Due L.H., Cutting S.M. The use of bacterial spore formers as probiotics // FEMS Microbiol. Rev. - 2005. - Vol.29, № 4. - P.813-835.

4. Probiotics Microbes: The Scientific Basis / R.J.Collier, et al. // A Report from American Academy of Microbiology.- Washington, 2006. - 28 p.

5. Патент РФ 2130316. Лечебно-профилактический биопрепарат бактиспорин. А61K 35/74, БИ №14, 1999, приор. 23.01.97.

6. Патент СССР 1710575. Штамм бактерий Bacillus sp - компонент лечебно-профилактического препарата против дисбактериозов и аллергий, C12N 1/20, БИ №5, 1992.

7. Патент РФ 2035186. Профилактический биопрепарат споролакт. А61K 35/66, БИ №14, 1995.

8. Алешкин, А.В., Афанасьев, С.С., Давыдкин, В.Ю., Манько, Т.Н., Давыдкин, И.Ю. Бактерийный препарат нового поколения «Споробактерин» // Мед. картотека. - 2003. - №4.

9. Патент РФ №2035185. Профилактический биопрепарат Субалин. - 1995. Приор. 31.01.1992.

10. Патент РФ 2115725. Штамм Bacillus subtilis, резистентный к рифампицину, ампициллину и стрептомицину, обладающий антибактеральной активностью по отношению к патогенным видам микроорганизмов. Приор. 23.07.1997.

11. Гатауллин А.Г. Биологические свойства штаммов Bacillus subtilis, перспективных для создания новых пробиотиков // Дисс. канд. биол. наук, Москва, 2005 г.

Похожие патенты RU2501849C1

название год авторы номер документа
ШТАММ Bacillus licheniformis, ОБЛАДАЮЩИЙ ВЫРАЖЕННЫМ АНТАГОНИЗМОМ ПО ОТНОШЕНИЮ К Salmonella typhi, Staphyloccus aureus, Listeria monocytogenes И РЕЗИСТЕНТНОСТЬЮ К СТРЕПТОМИЦИНУ И НАЛИДИКСОВОЙ КИСЛОТЕ 2012
  • Иваненко Алексей Александрович
  • Самойленко Владимир Александрович
  • Пунтус Ирина Филипповна
  • Филонов Андрей Евгеньевич
RU2501851C1
ШТАММ Bacillus subtilis subsp. Subtilis ВКМ В-2711D, ОБЛАДАЮЩИЙ ВЫРАЖЕННЫМ АНТАГОНИЗМОМ ПО ОТНОШЕНИЮ К Escherichia coli, Salmonella typhi, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes И РЕЗИСТЕНТНОСТЬЮ К СТРЕПТОМИЦИНУ И ТЕТРАЦИКЛИНУ 2012
  • Иваненко Алексей Александрович
  • Самойленко Владимир Александрович
  • Пунтус Ирина Филипповна
  • Филонов Андрей Евгеньевич
RU2509149C1
ШТАММ Bacillus amyloliquefaciens ВКМ В-2714D, ОБЛАДАЮЩИЙ ВЫРАЖЕННЫМ АНТАГОНИЗМОМ ПО ОТНОШЕНИЮ К Salmonella typhi, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes И РЕЗИСТЕНТНОСТЬЮ К ТЕТРАЦИКЛИНУ И ТРИМЕТОПРИМУ 2012
  • Иваненко Алексей Александрович
  • Самойленко Владимир Александрович
  • Пунтус Ирина Филипповна
  • Филонов Андрей Евгеньевич
RU2509148C1
Штамм бактерий Bacillus mojavensis RCAM05965, обладающий антагонистической активностью по отношению к Candida albicans, Serratia marcescens, Escherichia coli и перспективный для производства пробиотика для человека и/или животных 2023
  • Малкова Ангелина Владимировна
  • Иркитова Алена Николаевна
  • Евдокимов Иван Юрьевич
  • Ширманов Максим Вячеславович
  • Дудник Дина Евгеньевна
  • Каргашилова Екатерина Николаевна
RU2804275C1
ШТАММ BACILLUS SUBTILIS РАС, РЕЗИСТЕНТНЫЙ К РИФАМПИЦИНУ, АМПИЦИЛЛИНУ И СТРЕПТОМИЦИНУ, ОБЛАДАЮЩИЙ АНТИБАКТЕРИАЛЬНОЙ АКТИВНОСТЬЮ ПО ОТНОШЕНИЮ К ПАТОГЕННЫМ ВИДАМ МИКРООРГАНИЗМОВ 1997
  • Буланцев А.Л.
  • Тихонов Н.Г.
  • Липницкий А.В.
RU2115725C1
БИОПРЕПАРАТ БАЛИС ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ ИНФЕКЦИОННЫХ БОЛЕЗНЕЙ 2010
  • Далин Михаил Викторович
  • Лазовская Алла Леоновна
  • Воробьева Зоя Глебовна
  • Кравцов Эдуард Георгиевич
  • Васильева Елена Александровна
  • Анохина Ирина Викторовна
  • Яшина Наталия Вячеславовна
  • Мефёд Кирилл Михайлович
  • Кульчицкая Марина Александровна
  • Слинина Клавдия Николаевна
RU2454238C1
ШТАММ BACILLUS SUBTILIS ТРАХС, РЕЗИСТЕНТНЫЙ К ТЕТРАЦИКЛИНУ, РИФАМПИЦИНУ, АМПИЦИЛЛИНУ, ХЛОРАМФЕНИКОЛУ, СТРЕПТОМИЦИНУ, ОБЛАДАЮЩИЙ АНТИБАКТЕРИАЛЬНОЙ АКТИВНОСТЬЮ ПО ОТНОШЕНИЮ К ПАТОГЕННЫМ ВИДАМ МИКРООРГАНИЗМОВ 1997
  • Буланцев А.Л.
  • Тихонов Н.Г.
  • Липницкий А.В.
RU2118364C1
КОМБИНИРОВАННЫЙ ПРОБИОТИЧЕСКИЙ ПРЕПАРАТ НА ОСНОВЕ СПОРООБРАЗУЮЩИХ БАКТЕРИЙ РОДА BACILLUS (ВАРИАНТЫ) ДЛЯ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ В ЖИВОТНОВОДСТВЕ, СПОСОБ ЕГО ПРОИЗВОДСТВА (ВАРИАНТЫ) И ШТАММ BACILLUS SUBTILIS (NATTO), ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ В КАЧЕСТВЕ ДОБАВКИ К ПРЕПАРАТУ 2017
  • Джавахия Вахтанг Витальевич
  • Глаголева Елена Викторовна
  • Воинова Татьяна Михайловна
  • Карташов Максим Игоревич
  • Овчинников Александр Игоревич
RU2675934C2
ШТАММ BACILLUS SUBTILIS ТРАС, РЕЗИСТЕНТНЫЙ К ТЕТРАЦИКЛИНУ, РИФАМПИЦИНУ, АМПИЦИЛЛИНУ, СТРЕПТОМИЦИНУ, ОБЛАДАЮЩИЙ АНТИБАКТЕРИАЛЬНОЙ АКТИВНОСТЬЮ ПО ОТНОШЕНИЮ К ПАТОГЕННЫМ ВИДАМ МИКРООРГАНИЗМОВ 1997
  • Буланцев А.Л.
  • Тихонов Н.Г.
  • Липницкий А.В.
RU2122026C1
ШТАММ БАКТЕРИЙ BACILLUS SUBTILIS, ОБЛАДАЮЩИЙ ШИРОКИМ СПЕКТРОМ АНТАГОНИСТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ И УСТОЙЧИВОСТЬЮ К АНТИБИОТИКАМ 1999
  • Байгузина Ф.А.
  • Кузнецова Т.Н.
  • Баданова С.Ч.
RU2169767C1

Реферат патента 2013 года ШТАММ BACILLUS LICHENIFORMIS ВКМ B-2713D, ОБЛАДАЮЩИЙ ВЫРАЖЕННЫМ АНТАГОНИЗМОМ ПО ОТНОШЕНИЮ К SALMONELLA TYPHI, STAPHYLOCCUS AUREUS, LISTERIA MONOCYTOGENES И РЕЗИСТЕНТНОСТЬЮ К СТРЕПТОМИЦИНУ И НАЛИДИКСОВОЙ КИСЛОТЕ

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано в ветеринарии. Штамм Bacillus licheniformis BKM B-2713D обладает выраженным антагонизмом по отношению к Salmonella typhi, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes. Штамм обладает резистентностью к антибиотикам при концентрации стрептомицина 20 мкг/мл, при концентрации налидиксовой кислоты 20 мкг/мл. Штамм обладает α-амилазной активностью 0,015 Ед/мл среды при рН 6,0, протеазной активностью 2,34 Ед/мл среды при рН 7,0. 1 табл., 3 пр.

Формула изобретения RU 2 501 849 C1

Штамм Bacillus licheniformis BKM B-2713D, обладающий выраженным антагонизмом по отношению к Salmonella typhi, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes и резистентностью к антибиотикам стрептомицину и налидиксовой кислоте.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2013 года RU2501849C1

Препарат биоспорин для профилактики и лечения желудочно-кишечных заболеваний человека 1989
  • Смирнов Валерий Вениаминович
  • Резник Семен Рафаилович
  • Сорокулова Ирина Борисовна
  • Вьюницкая Валентина Алексеевна
  • Слабоспицкая Алла Тимофеевна
  • Берилло Эльвира Андреевна
  • Скорикова Ирина Григорьевна
  • Чаплинский Владимир Яковлевич
  • Тофан Анатолий Васильевич
SU1722502A1
БИОПРЕПАРАТ "ИРИЛИС" НА ОСНОВЕ БАКТЕРИЙ РОДА BACILLUS ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ ИНФЕКЦИОННЫХ БОЛЕЗНЕЙ И ДИСБИОЗА РАЗЛИЧНОЙ ЭТИОЛОГИИ И ШТАММЫ БАКТЕРИЙ BACILLUS SUBTILIS И BACILLUS LICHENIFORMIS, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ ДЛЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ БИОПРЕПАРАТА 2003
  • Сорокулова Ирина Борисовна
  • Осипова И.Г.
  • Васильева Е.А.
  • Калинин С.П.
  • Терешкина Н.В.
  • Харитонова Е.Ю.
  • Саркисов С.Э.
RU2264454C2
БИОПРЕПАРАТ БАЛИС ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ ИНФЕКЦИОННЫХ БОЛЕЗНЕЙ 2010
  • Далин Михаил Викторович
  • Лазовская Алла Леоновна
  • Воробьева Зоя Глебовна
  • Кравцов Эдуард Георгиевич
  • Васильева Елена Александровна
  • Анохина Ирина Викторовна
  • Яшина Наталия Вячеславовна
  • Мефёд Кирилл Михайлович
  • Кульчицкая Марина Александровна
  • Слинина Клавдия Николаевна
RU2454238C1
HONG H.A
et al
The use of bacterial spore formers as probiotics // FEMS Microbiology Reviews, 29 (2005), 813-835
Способ обработки целлюлозных материалов, с целью тонкого измельчения или переведения в коллоидальный раствор 1923
  • Петров Г.С.
SU2005A1

RU 2 501 849 C1

Авторы

Иваненко Алексей Александрович

Самойленко Владимир Александрович

Пунтус Ирина Филипповна

Филонов Андрей Евгеньевич

Даты

2013-12-20Публикация

2012-08-31Подача