ШТАММ PENICILLIUM CHRYSOGENUM ВКМ F-4876D ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ БИОПРЕПАРАТА ДЛЯ ЗАЩИТЫ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ РАСТЕНИЙ ОТ ФИТОПАТОГЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ, СПОСОБ ПРОИЗВОДСТВА ПРЕПАРАТА Российский патент 2022 года по МПК C12N1/14 

Изобретение относится к областям микробиологии, биотехнологии и сельскому хозяйству и представляет собой штамм микроорганизма P. chrysogenum ВКМ F-4876D, который может быть использован для производства биопрепарата против фитопатогенных микроорганизмов.

В настоящее время в условиях интенсивно развивающегося сельского хозяйства получение растениеводческой продукции невозможно представить без эффективной системы защиты растений от болезней, приводящих к значительным экономическим потерям. Основным инструментом борьбы и контроля за развитием заболеваний сельскохозяйственных растений является использование разнообразных по химическому строению химических фунгицидов. Однако, развивающаяся к ним резистентность фитопатогенных микроорганизмов, а также современный тренд развития сельскохозяйственного производства, направленного на экологизацию всех его этапов, диктует необходимость поиска новых высокоактивных и безопасных для окружающей среды способов борьбы с фитопатогенами. В связи с этим, в последние годы все больший интерес стал проявляться к биологическим способам защиты, созданным на основе микроорганизмов или их метаболитов. Такие биопрепараты, наиболее удачно вписываются в интегрированные системы защиты растений: они эффективны селективны и сравнительно безопасны для природы и человека.

Среди разнообразных микроорганизмов, применяемых для защиты растений, особое место занимают представители родов Penicillium, синтезирующие разнообразные биологически активные соединения (Ma H.-G., 2016), и обладающие широким спектром фунгицидного действия (Kozlovskii, V. P., 2013).

Поскольку полный отказ от химических соединений в условиях современного ведения сельского хозяйства невозможен, в качестве перспективного способа контроля фитопатогенных микроорганизмов могло бы стать комбинированное использование фунгицидов с биологически активными соединениями микробного или растительного происхождения, а также их искусственно синтезированных аналогов (L. Shcherbakova, 2019 г.). Получаемый в результате такого взаимодействия синергетический или аддитивный эффект позволяет без потери эффективности значительно снизить рабочие концентрации фунгицидных препаратов до уровней, при которых они были бы неэффективны при применении в одиночку. Известен способ защиты сельскохозяйственных растений, основанный на использовании композитного препарата, в котором в качестве действующего вещества используется комбинация химического фунгицида из класса триазолов или стробилуринов, а в качестве хемосенсибилизатора используют 2,3-диоксибензальдегид, 4-оксибензальдегид, тимол или фильтрат культуральной жидкости штамма гриба Fusarium sambucinum FS-94. Данный способ позволяет увеличить степень фунгицидного воздействия и его продолжительность, а также обеспечивает преодоление у фитопатогенов резистентности к фунгицидам при минимальных дозах последних (Патент РФ 2548191, 2013 г.).

Известен штамм гриба P. vermiculatum Dang. PK - 1 (ВИЗР № 3), на основе которого был разработан препарат против белой и серой гнили подсолнечника (патент СССР №1476891, 1987 г.). Недостатком штамма являлось то, что в процессе хранения и многократных пересевов происходило уменьшение антагонистической активности по отношению к возбудителям белой и серой гнилей подсолнечника, а также узкий спектр антагонистической активности.

Из штамма P. vermiculatum Dang. PK - 1 (ВИЗР № 3) путем селекции был получен другой штамм P. vermiculatum Dang РК-С, депонированный в коллекции чистых культур Всероссийского института защиты растений под номером ВИЗР-24 (Патент РФ 2322490, 2006 г.). На основании штамма P. vermiculatum Dang РК-С был создан препарат Вермикулен, представляющий собой живую культуру (споры и мицелиальная масса микроорганизма). Действие препарата основано на том, что штамм обладает следующим типом действия - конкуренцией, гиперпаразитизмом и антибиогенезом.

Известен штамм Penicillium sp. IBW F-104-06, являющийся продуцентом танзаваиновой кислоты (CN 105899668В, 2014 г.). Для указанного штамма, биопрепарата, полученного на основе штамма, а также экстракта культуральной жидкости продемонстрированы противогрибная активность в отношении широко круга фитопатогенных микроорганизмов.

Недостатком всех вышеперечисленных биопрепаратов, как в целом и всех других препаратов на основе живых микроорганизмов, является малый срок их хранения и чувствительность к условиям окружающей среды (УФ-излучение, температура, кислотность почвы и т.д.).

Прототипом заявленного изобретения можно считать способ получения биопрепарата на основе биомассы штамма P. vermiculatum Dang. ВИЗР-24 (Патент РФ 2322490, 2006 г.). Недостатком указанного способа получения биопрепарата является достаточно длительный, в течение 30 дней, способ твердофазного культивирования штамма P. vermiculatum Dang. ВИЗР-24 на среде, состоящей из смеси лузги и семянок подсолнечника. Данный метод выращивания не является технологичным и не может быть использован для крупнотоннажного производства биопрепаратов. Кроме того, затруднена возможность полного контроля и регулирования процесса роста гриба. В дальнейшем, авторы усовершенствовали процесс приготовления препаративной формы путем проведения глубинного культивирования в жидкой питательной среде, а препаративную форму получили с использованием в качестве наполнителя к жидкой культуре биопрепарата вспученной вулканической лавы - перлита. В течение первого месяца хранения порошка в условиях переменной температуры титр практически не изменяется (3,3 × 10⁹ КОЕ/г). В дальнейшем, через 3 и 6 месяцев хранения, происходит снижение титра. Из чего следует, что действие препарата будет определяться, в первую очередь, условиями его хранения. (Л.В. Маслиенко, 2009 г.). В отличие от биопрепарата-прототипа, противогрибная активность сухой биомассы, полученной на основе штамма P. chrysogenum ВКМ F-4876D, обладает высокой стабильностью при хранении, что подтверждается примерами.

Техническая задача настоящего изобретения состояла в разработке биопрепарата на основе инактивированной биомассы штамма, принадлежащего к роду Penicillium, обладающего высокой фунгицидной активностью по отношению к широкому кругу фитопатогенных микроорганизмов - возбудителей следующих болезней сельскохозяйственных культур: фузариоза (Fusarium oxysporum, F. graminearum, F. culmorum, F. avenaseum, F. sporotrichioides, F. poae), альтернариоза (Alternaria alternata, Alternaria solani), белой (Sclerotinia. sclerotiorum) и серой (Botrytis cinerea) гнилей, фомоза (Phoma exigua, P. betae, P. glomerata), гельминтоспориоза (Bipolaris sorokiniana), церкоспороза (Cercospora beticola), ризоктониоза (Rhizoctonia solani), способа его производства, а также разработке способа защиты сельскохозяйственных растений путем комбинации нового биопрепарата и химических фунгицидов.

Поставленная задача была решена в четыре этапа:

1. Применением метода ненаправленного УФ-мутагенеза и последующей селекции исходного штамма P. chrysogenum ВКПМ F-1310 был получен штамм P. chrysogenum F-24-28, обладающий более высокой противогрибной активностью по отношению к широкому кругу фитопатогенных микроорганизмов. Штамм P. chrysogenum F-24-28 был депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов под номером ВКМ F-4876D.

2. Определены условия культивирования нового штамма в биореакторе объемом 15 л и получение сухой инактивированной биомассы P. chrysogenum ВКПМ F-4876D.

3. Подобрано оптимальное количество сухой биомассы штамма P. chrysogenum ВКПМ F-4876D для полного и продолжительного ингибирования роста фитопатогенных грибов в опытах in vitro.

4. Определено оптимальное количество сухой биомассы штамма P. chrysogenum ВКМ F-4876D и коммерчески используемых фунгицидов, принадлежащих классам стробилуринов, триазолов, фенилпирролов для подавления роста и развития фитопатогенных грибов.

Выбор штамма P. chrysogenum в качестве основы для создания высокоактивного биопрепарата обусловлен тем фактом, что микроскопические грибы рода Penicillium - это один из наиболее ценных источников разнообразных по структуре и спектру применения биологически активных веществ - алкалоидов, антибиотиков, гормонов и других соединений, способных ингибировать развитие широкого спектра фитопатогенных грибов. Механизм фунгицидного действия синтезируемых метаболитов грибами рода Penicillium может быть различным, и основан, например, на гиперполяризации плазматической мембраны, приводящей в итоге к нарушению клеточного гомеостаза и, в-первую очередь, осмотического баланса, активации ионных каналов с последующим увеличением количества активных форм кислорода в клетке и индукцией ее апоптоза. Препараты, созданные на основе микроорганизмов рода Penicillium, в той или иной степени способны оказывать на растение ростостимулирующее воздействие и индуцировать развитие его собственных защитных механизмов.

Техническим результатом данного изобретения является создание биопрепарата на основе инактивированной биомассы штамма P. chrysogenum ВКМ F-4876D, обладающего высокой фунгицидной активностью по отношению к широкому спектру фитопатогенных микроорганизмов, а также увеличивающего чувствительность фитопатогенов к химическим фунгицидам, что обеспечивает получение продолжительного противогрибного эффекта при минимальных концентрациях последних, и способа его получения.

Практическое применение.

Новый препарат был испытан в условиях Краснодарского края. С целью защиты озимой пшеницы от таких заболеваний, как фузариоз, и гельминтоспориоз, исследовали эффективность биопрепарата на основе сухой биомассы штамма P. chrysogenum ВКМ F-4876D с нормой расхода 20 г/га или 20 г/т семян. Опыт проводили на делянках площадью 28 м², повторность четырехкратная. Сорт пшеницы «Батько». Обработка почвы - предпосевная культивация, удобрения не вносили. Кратность обработок - предпосевная обработка семян, двухкратная обработка вегетирующих растений. Протравливание семян осуществляли с помощью протравителя «Hege11», обработку вегетирующих растений проводили с помощью ручного пневматического опрыскивателя «Tecnoma». Уборку проводили ручным способом со всей опытной делянки.

По результатам испытания была установлена эффективность обработки семян озимой пшеницы препаратом на основе сухой биомассы штамма P. chrysogenum ВКМ F-4876D по сравнению с контролем. Против фузариозной семенной инфекции эффективность препарата составила 65,5%, гельминтоспориозной инфекции - 55,0%. Против корневых гнилей гельминтоспориозно - фузариозной этиологии в фазе кущения была получена 90% эффективность при протравливании семян по сравнении с контролем. Зарегистрировано увеличение урожайности на 8% по сравнению с контролем.

Сущность заявляемого изобретения иллюстрируется, но не ограничивается следующими примерами.

Пример 1. Получение высокоактивного штамма P. chrysogenum ВКМ F-4876D.

Суспензию спор (1,5-2,0)×10⁶ спор/мл облучают в открытой чашке Петри на расстоянии 40 см от лампы (время экспозиции варьировало от 0 до 25 минут). Далее, подвергшуюся облучению суспензию переносят на поверхность PDA среды и культивируют в течение 10 - 14 суток при температуре 24°С. Степень выживаемости колоний определяют по соотношению числа выросших колоний после облучения к числу колоний, выросших на контрольных чашках. По окончании культивирования из выросших на агаризованной среде колоний отбирают 5-7 морфологически измененных колоний и повторно пересевают на картофельно-глюкозный агар.

Далее проверяют антагонистическую активность полученных колоний методом встречных культур, выявляя, таким образом, наиболее активную колонию. Колонию с максимальной противогрибной активностью подвергают новому раунду мутагенеза и вновь определяют ее фунгицидную активность. В результате получен штамм P. chrysogenum F-24-28, обладающий высокой антагонистической активностью к возбудителям фузариоза, альтернариоза, фомоза, белой и серой гнилей, церкоспороза, ризоктониоза, гельминтоспориоза, антракноза.

Идентификация штамма.

Для генетической идентификации полученного штамма P. chrysogenum F-24-28 была определена частичная последовательность (616 нуклеотидов) амплификата гена, кодирующего консервативную область 18S рРНК с использованием праймерной системы (18S F566-18S R1200r).

GCGGTAATTCCAGCTCCAATAGCGTATATTAAAGTTGTTGCAGTTAAAAAGCTCGTAGTTGAACCTTGGGTCTGGCTGGCCGGTCCGCCTCACCGCGAGTACTGGTCCGGCTGGACCTTTCCTTCTGGGGAACCTCATGGCCTTCACTGGCTGTGGGGGGAACCAGGACTTTTACTGTGAAAAAATTAGAGTGTTCAAAGCAGGCCTTTGCTCGAATACATTAGCATGGAATAATAGAATAGGACGTGTGGTTCTATTTTGTTGGTTTCTAGGACCGCCGTAATGATTAATAGGGATAGTCGGGGGCGTCAGTATTCAGCTGTCAGAGGTGAAATTCTTGGATTTGCTGAAGACTAACTACTGCGAAAGCATTCGCCAAGGATGTTTTCATTAATCAGGGAACGAAAGTTAGGGGATCGAAGACGATCAGATACCGTCGTAGTCTTAACCATAAACTATGCCGACTAGGGATCGGACGGGATTCTATAATGACCCGTTCGGCACCTTACGAGAAATCAAAGTTTTTGGGTTCTGGGGGGAGTATGGTCGCAAGGCTGAAACTTAAAGAAATTGACGGAAGGGCACCACAAGGCGTGGAGCCTGCGGCTTAATTTGA

С использованием праймерной системы (ITS4-ITS5) для исследуемого образца также была определена последовательность (589 нуклеотидов), кодирующая межгенную область рибосомального оперона:

TAACAAGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTACCGAGTGAGGGCCCTCTGGGTCCAACCTCCCACCCGTGTTTATTTTACCTTGTTGCTTCGGCGGGCCCGCCTTAACTGGCCGCCGGGGGGCTCACGCCCCCGGGCCCGCGCCCGCCGAAGACACCCTCGAACTCTGTCTGAAGATTGAAGTCTGAGTGAAAATATAAATTATTTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATACGTAATGTGAATTGCAAATTCAGTGAATCATCGAGTCTTTGAACGCACATTGCGCCCCCTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTGCTGCCCTCAAGCCCGGCTTGTGTGTTGGGCCCCGTCCTCCGATTTCCGGGGGACGGGCCCGAAAGGCAGCGGCGGCACCGCGTCCGGTCCTCGAGCGTATGGGGCTTTGTCACCCGCTCTGTAGGCCCGGCCGGCGCTTGCCGATCAACCCAAATTTTTATCCAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAG

Последовательность гена 18S рРНК на 100% совпадает с аналогичной последовательностью типового штамма P. chrysogenum CBS 306.48 на всем протяжении, поддающемся достоверной расшифровке.

Штамм P. chrysogenum F-24-28 был депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов под номером ВКМ F-4876D.

Культурально-морфологические и физиологические признаки нового штамма P. chrysogenum ВКМ F-4876D.

Макроморфологические признаки на среде Чапек-Докс.

Колонии P. chrysogenum ВКМ F-4876D при культивировании в течение 10 дней при температуре 25°С достигают 30-35 мм, пепельно-зеленого цвета, темнеющие с возрастом, к 14 суткам роста колонии достигают 40-45 мм и состоят из тонкого базального войлочного сплетения мицелия, несущего плотные конидиальные структуры более менее бархатистые, четко радиальнобороздчатые, толщиной 1-2 мм, с белым растущим краем 1-2 мм ширины, вегетативный мицелий светло-желтого цвета с конидиеносной зоной мутного серо-зеленого цвета, выделяемый в среду пигмент и реверс колоний светло желтый. Капли эксудата золотисто-желтые. Склероции не образует.

Микроморфологические признаки на среде Чапек-Докс.

Конидиеносцы гладкие, бесцветные, главным образом отходят от субстрата, длина, в среднем, 150 - 350 мкм. Кисточки несимметричные, двухярусные, с мутовкой и 2-5 метуль на верхушке с одной или более веточками длинной 15 - 25 мкм. Длина метули, в среднем, 10-12 мкм. Стеригмы - 8-10 мкм, имеют бутылочную форму, собраны в компактную группу по 4-6 элементов. Конидии элептические, гладкие, в основном, 3,0-4,0 ×2,8-3,5 мкм, собраны в колонку, длина которой может достигать 200 мкм.

Физиологические признаки штамма P. chrysogenum ВКМ F-4876D.

Аэроб. Температурный оптимум роста 24-28°C. Оптимальный рН в пределах 5,0 - 6,0. Оптимальный рост гриба отмечен на средах, содержащих в качестве источника углерода глюкозу, фруктозу, сахарозу, глицерин, крахмале. В качестве источника азота можно использовать нитраты, аммонийные соли, пептон, аминокислоты.

Поддержание штамма гриба осуществляется на твердой агаризованной среде следующего состава (г/л): агар-агар - 20, глюкоза - 30, глицерин - 70, соевая мука - 10, мясной пептон - 10, NaNO₃ - 2, MgSO₄ x 7H₂O - 1, рН 6,3 - 6,5. Продолжительность выращивания не менее 4-5 суток при температуре 25°C. Штамм храниться при температуре 4°C, пересев 1 раз в месяц.

Для длительного хранения культуру замораживают при -(50-70^оС) в 50% глицерине, данные условия позволяют хранить культуру в течение 1 года без потери активности. Также штамм хранят в ампулах в лиофилизированном состоянии (защитная среда - обезжиренное молоко).

Таблица 1 - Влияние биопрепарата на основе сухой биомассы штамма P. chrysogenum ВКМ F-4876D на структуру урожая озимой пшеницы при подсевной обработке семян и двукратном опрыскивании по вегетации Вариант опыта Норма расхода Густота стояния растений шт/м² Продуктивная кустистость Масса зерна с 1 колоса Расчетная урожайность ц/га % к контролю биопрепарат 20 г/т семян
20 г/га 404 2,3 1,35 57,8 8,0 контроль
(без обработки) - 382 1,9 1,05 53,5 -

Пример 2. Получение сухой инактивированной биомассы штамма P. chrysogenum ВКМ F-4876D.

Для получения посевного материала готовят жидкую вегетативную среду следующего состава (г/л): сахароза - 100, соевая мука - 20, триптон - 10, NaNO₃ - 2, MgSO₄ x 7H₂O - 1, (pH среды до стерилизации 5,7 - 6,0). Полученную среду разливают в 1 л качалочные колбы Эрлейнмейера по 250 мл среды и стерилизуют при 120 °С в течение 30 мин.

Затем, после охлаждения, колбы засевают споровой суспензией гриба и помещают на качалочную установку «Innova 44» при 220 об/мин (эксцентриситет 5 см) и 24°С на 2 суток.

Для культивирования штамма P. chrysogenum ВКМ F-4876D в ферментационной установке объемом 15 л готовят питательную среду объемом не более 10 л. Приготовление и стерилизацию питательной среды осуществляют непосредственно в ферментере. Предварительно аппарат стерилизуют вместе с воздушными фильтрами при температуре (121 ± 2)°С в течение 1 часа. После стерилизации ферментера готовят питательную среду следующего состава (г/л): сахароза - 100, соевая мука - 30, триптон - 10, NaNO₃ - 2, MgSO₄ x 7H₂O - 1.

Все компоненты питательной среды через приемник поочередно подают в ферментер. Доводят объем очищенной водой до 9 л. Значение pH, при необходимости, доводят до (5,7 - 6,0). Среду в аппарате нагревают до 100-110°С путем подачи в рубашку ферментера пара давлением 0,28-0,3 МПа. Затем повышают температуру нагрева среды до (125±1)°С путем подачи острого пара внутрь аппаратов через барботер, пробоотборник и нижний слив. Продолжительность стерилизации составляет 1 ч. По завершении стерилизации подачу пара прекращают и питательную среду охлаждают до температуры (24±1)°С путем подачи воды в теплообменник. При охлаждении среды воздушное давление поддерживают на уровне 0,03-0,05 МПа путем подачи стерильного воздуха в аппарат. Стерилизацию и охлаждение питательной среды проводят при непрерывном перемешивании (100 об/мин).

В процессе ферментации были установлены следующие параметры культивирования:

Объем среды с учетом набора пароконденсата - 10 литров;

Температура - (24 ± 1)°С;

Аэрация - 0,1 л/л/мин;

Скорость перемешивания среды - 250 об/мин;

Значение рО₂ - 100% от насыщения;

Давление в ферментере - 0,03-0,05 Мпа;

рН среды - 6,8-7,0.

Перед засевом отбирают пробу среды для микробиологического и биохимического контроля. Засев ферментера с простерилизованной питательной средой, охлажденной до температуры (24 ± 1)°С, производят посевным материалом, полученным как описано выше. Количество посевного материала составляет 10% от объема среды в ферментере (1л). Посевной материал поступает в ферментер по посевной линии.

Выращивание штамма-продуцента в ферментере ведут в условиях, представленных в таблице 2.

Таблица 2 - Основные параметры культивирования штаммов
P. chrysogenum ВКМ F-4876D в 15 л ферментере Наименование параметра Значение показателей температура 24°С аэрация 5-10 л/мин рН Накопление биомассы сопровождается самопроизвольным снижением pH до 5,5 - 5,0 и дальнейшим подъемом на стадии биосинтеза до 6,5 - 7,5. перемешивание скорость перемешивания в течение процесса увеличивают до 500 - 600 об/мин для поддержания необходимого уровня растворенного кислорода; концентрация растворенного кислорода поддерживается на уровне 30% от насыщения до окончания процесса. продолжительность культивирования 72-96 часов контроль процесса Через 18-24 часа от начала процесса отбирают пробу для контроля чистоты культуры, стадии развития мицелия, количества мицелия по сырому весу, содержанию редуцирующих сахаров. Далее отбор проб проводят по мере необходимости, но не реже 1 раза в сутки.

При культивировании в биореакторе штамм P. chrysogenum ВКМ F-4876D растет в виде открытой мицелиальной и компактной шарообразной формы. Гифы разветвленные, закручивающиеся, состоящие из нерегулярных расширенных клеток.

Выращенную на 4 сутки биомассу гриба P. chrysogenum инактивируют в ферментере при температуре 85°С в течение 40 мин, затем инактивированную культуральную жидкость замораживают в камере сублиматора в течение 18 часов при температуре -50-80° С или в морозильной камере не менее 12 часов при температуре -70-80°С. Затем запускают процесс сушки согласно инструкции по сушке продукта на лиофильной сушилке. В результате получается продукт влажностью не более 5%.

Пример 3. Изучение противогрибной активности сухой биомассы нового штамма P. chrysogenum ВКМ F-4876D.

К 50 мл стерильного физиологического раствора добавляют 5 г сухой биомассы. Полученную суспензию подвергают процессу гидратации при перемешивании 220 об/мин на качалочной установке «Innova 44» в течение часа при температуре 24°С. Готовую суспензию стерильной пипеткой вносят в остывшую агаризованную среду после стерилизации до получения конечной концентрации, определяемой целями эксперимента.

Для получения агаровых дисков фитопатогенов споровую суспензию грибов (концентрация спор 1×10⁶) в количестве 0,1 мл вносят в стерильные чашки Петри с картофельно-глюкозной агаризованной средой и растирают стерильным шпателем. Чашки инкубируют в течение суток при температуре 24°С. Далее, стерильным сверлом вырезают в агаре диски диаметром 10 мм, которые затем помещают в центр чашек с агаром, содержащим сухую биомассу. Чашки инкубируют в аналогичных условиях в течение 7 суток.

Противогрибную активность вычисляют по формуле:

где Dо - диаметр колонии в опытном варианте, мм

Dк - диаметр колонии в контрольном варианте, мм

Контролем служили чашки Петри с патогеном, выращенные на картофельно-глюкозном агаре. Результаты представлены в таблице 3.

Таблица 3 - Противогрибная активность сухой биомассы нового штамма P. chrysogenum ВКМ F-4876D на 7 сутки культивирования Фитопатоген Количество сухой биомассы, г/л Противогрибная активность, % Rhizoctonia solani 2,5 - 7,0 41 - 85 Fusarium graminearum 2,5 - 7,0 42 - 82 F. culmorum 2,5 - 7,0 35 - 84 F. avenaseum 2,5 - 7,0 44 - 82 F. poae 2,5 - 7,0 38 - 78 F. solani 2,0 - 5,5 50 - 80 F. sporotrichioides 2,0 - 5,5 44 - 85 F. oxysporum 2,0 - 5,5 48 - 90 Cercospora beticola 1,0 - 5,5 44 - 75 Alternaria alternata 1,0 - 3,5 45 - 76 A. solani 1,0 - 3,5 45 - 80 Botrytis cinerea 0,5 - 2,5 42 - 81 Phoma exigua 0,5 - 2,5 45 -80 P. betae 0,5 - 2,5 48 - 90 P. glomerata 0,5 - 2,5 50 - 86 Sclerotinia sclerotiorum 0,5 - 1,5 52 - 90 Bipolaris sorokiniana 0,5 - 1,5 52 - 82

Пример 4. Изучение противогрибной активности комбинации сухой биомассы нового штамма P. chrysogenum ВКМ F-4876D и одного из фунгицидов.

В агаризованную среду, приготовленную аналогично примеру 1, вносят совместно с сухой биомассой один из выбранных фунгицидов - азоксистробин (1 - 25 мг/л), тебуконазол (1 - 10 мг/л), флудиоксоноил (1-10 мг/л).

Противогрибную активность оценивают по аналогичной формуле на 7 сутки роста фитопатогенов на чашках. Результаты представлены в таблице 4.

Таблица 4 - Противогрибная активность комбинации сухой биомассы P. chrysogenum ВКМ F-4876D и фунгицидов на 7 сутки роста Фитопатоген Количество сухой биомассы, г/л Противогрибная активность, % Концентрация фунгицида, мг/л азоксистробин тебуконазол флудиоксоноил 2,5 - 10 1 - 10 1 - 10 Rhizoctonia solani 3,5 72 - 100 60 - 100 65 - 100 Fusarium graminearum 3,5 68 - 100 65 - 100 66 - 100 F. culmorum 3,5 70 - 100 67 - 100 65 - 100 F. avenaseum 3,5 68 - 100 62 - 100 60 - 100 F. poae 3,5 65 - 100 64 - 100 65 - 100 F. solani 3,5 77 - 100 70 - 100 68 - 100 F. sporotrichioides 2 76 - 100 72 - 100 68 - 100 F. oxysporum 2 77 - 100 76 - 100 72 - 100 Cercospora beticola 2 70 - 100 72 - 100 68 - 100 Alternaria alternata 1 82 - 100 74 - 100 69 - 100 A. solani 1 81 - 100 70 - 100 75 - 100 Botrytis cinerea 1 84 - 100 75 - 100 76 - 100 Phoma exigua 1 78 - 100 70 - 100 74 - 100 P. betae 1 71 - 100 67- 100 70 - 100 P. glomerata 1 75 - 100 74 - 100 69 - 100 Bipolaris sorokiniana 1 80 - 100 72 - 100 76 - 100 Sclerotinia. sclerotiorum 0,5 83 - 100 76 - 100 77 - 100

Пример 5. Изучение стабильности сухой биомассы нового штамма P. chrysogenum ВКМ F-4876D.

Была изучена стабильность сухой биомассы нового штамма P. chrysogenum ВКМ F-4876D методом естественного хранения при температуре 22±2 °С во влагонепроницаемом бумажном пакете с полимерным покрытием через 3, 6, 9 и 12 месяцев хранения. Противогрибную активность определяют по отношению к трем тест-культурам - F. oxysporum, A. alternata, B. cinerea по методу, описанному в примере 3. Было установлено, что в течение указанного периода времени биомасса сохраняет высокую противогрибную активность по отношению к выбранным фитопатогенам. Результаты представлены в таблице 5.

Таблица 5 -Стабильность фунгицидной активности сухой биомассы нового штамма P. chrysogenum ВКМ F-4876D при хранении Культура Концентрация биомассы, г/л Продолжительность хранения, месяц 3 6 9 12 Противогрибная активность, % F. oxysporum 3,5 66 - 70 68 - 71 65 - 70 66 - 69 A. alternata 2,5 68 - 72 66 - 70 68 - 70 67 - 71 B. sorokiniana 1,5 70-75 72 - 74 72 - 75 70 - 74

Список литературы

1. Ma H.-G., Liu Q., Zhu G.-L., Liu H.-S., Zhu W.-M. Marine natural products sourced from marine-derived Penicillium fungi //J Asian Natural Products Research. - 2016. - V. 18. - P. 92-115

2. Kozlovskii, V. P. Zhelifonova, T. V. Antipova A. G. Fungi of the Genus Penicillium as Producers of Physiologically Active Compounds (Review) Applied Biochemistry and Microbiology, 2013, Vol. 49, No. 1, pp. 1-10.

3. Shcherbakova L.A. Fungicide resistance of plant pathogenic fungi and their chemosensitization as a tool to increase anti-disease effects of triazoles and strobilurines (review).// Sel’skokhozyaistvennaya Biologiya [Agricultural Biology]. 2019. V. 54. № 5. P. 875-891.

4. Патент РФ 2548191, 2013 г.

5. Маслиенко Л.В. Вермикулен - перспективный микробиопрепарат полифункционального типа действия для защиты подсолнечника и других сельскохозяйственных культур от болезней. Научно-технический бюллетень Всероссийского научно-исследовательского института масличных культур. Вып. 2 (141), 2009 г.

6. Патент СССР № 1476891, 1987 г.

7. Патент РФ 2322490, 2006 г.

8. Патент CN 105899668В, 2014 г.

#1:

GCGGTAATTCCAGCTCCAATAGCGTATATTAAAGTTGTTGCAGTTAAAAAGCTCGTAGTTGAACCTTGGGTCTGGCTGGCCGGTCCGCCTCACCGCGAGTACTGGTCCGGCTGGACCTTTCCTTCTGGGGAACCTCATGGCCTTCACTGGCTGTGGGGGGAACCAGGACTTTTACTGTGAAAAAATTAGAGTGTTCAAAGCAGGCCTTTGCTCGAATACATTAGCATGGAATAATAGAATAGGACGTGTGGTTCTATTTTGTTGGTTTCTAGGACCGCCGTAATGATTAATAGGGATAGTCGGGGGCGTCAGTATTCAGCTGTCAGAGGTGAAATTCTTGGATTTGCTGAAGACTAACTACTGCGAAAGCATTCGCCAAGGATGTTTTCATTAATCAGGGAACGAAAGTTAGGGGATCGAAGACGATCAGATACCGTCGTAGTCTTAACCATAAACTATGCCGACTAGGGATCGGACGGGATTCTATAATGACCCGTTCGGCACCTTACGAGAAATCAAAGTTTTTGGGTTCTGGGGGGAGTATGGTCGCAAGGCTGAAACTTAAAGAAATTGACGGAAGGGCACCACAAGGCGTGGAGCCTGCGGCTTAATTTGA

#2:

TAACAAGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTACCGAGTGAGGGCCCTCTGGGTCCAACCTCCCACCCGTGTTTATTTTACCTTGTTGCTTCGGCGGGCCCGCCTTAACTGGCCGCCGGGGGGCTCACGCCCCCGGGCCCGCGCCCGCCGAAGACACCCTCGAACTCTGTCTGAAGATTGAAGTCTGAGTGAAAATATAAATTATTTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATACGTAATGTGAATTGCAAATTCAGTGAATCATCGAGTCTTTGAACGCACATTGCGCCCCCTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTGCTGCCCTCAAGCCCGGCTTGTGTGTTGGGCCCCGTCCTCCGATTTCCGGGGGACGGGCCCGAAAGGCAGCGGCGGCACCGCGTCCGGTCCTCGAGCGTATGGGGCTTTGTCACCCGCTCTGTAGGCCCGGCCGGCGCTTGCCGATCAACCCAAATTTTTATCCAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAG

Пример 1. Получение высокоактивного штамма P. chrysogenum ВКМ F-4876D.

Суспензию спор (1,5-2,0)×10⁶ спор/мл облучают в открытой чашке Петри на расстоянии 40 см от лампы (время экспозиции варьировало от 0 до 25 минут). Далее, подвергшуюся облучению суспензию переносят на поверхность PDA среды и культивируют в течение 10 - 14 суток при температуре 24^оС. Степень выживаемости колоний определяют по соотношению числа выросших колоний после облучения к числу колоний, выросших на контрольных чашках. По окончании культивирования из выросших на агаризованной среде колоний отбирают 5-7 морфологически измененных колоний и повторно пересевают на картофельно-глюкозный агар.

Далее проверяют антагонистическую активность полученных колоний методом встречных культур, выявляя, таким образом, наиболее активную колонию. Колонию с максимальной противогрибной активностью подвергают новому раунду мутагенеза и вновь определяют ее фунгицидную активность. В результате получен штамм P. chrysogenum F-24-28, обладающий высокой антагонистической активностью к возбудителям фузариоза, альтернариоза, фомоза, белой и серой гнилей, церкоспороза, ризоктониоза, гельминтоспориоза, антракноза.

Идентификация штамма.

Для генетической идентификации полученного штамма P. chrysogenum F-24-28 была определена частичная последовательность (616 нуклеотидов) амплификата гена, кодирующего консервативную область 18S рРНК с использованием праймерной системы (18S F566-18S R1200r) - #1.

С использованием праймерной системы (ITS4-ITS5) для исследуемого образца также была определена последовательность (589 нуклеотидов), кодирующая межгенную область рибосомального оперона - #2.

Последовательность гена 18S рРНК на 100% совпадает с аналогичной последовательностью типового штамма P. chrysogenum CBS 306.48 на всем протяжении, поддающемся достоверной расшифровке.

Штамм P. chrysogenum F-24-28 был депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов под номером ВКМ F-4876D.

Культурально-морфологические и физиологические признаки нового штамма P. chrysogenum ВКМ F-4876D.

Макроморфологические признаки на среде Чапек-Докс.

Колонии P. chrysogenum ВКМ F-4876D при культивировании в течение 10 дней при температуре 25°С достигают 30-35 мм, пепельно-зеленого цвета, темнеющие с возрастом, к 14 суткам роста колонии достигают 40-45 мм и состоят из тонкого базального войлочного сплетения мицелия, несущего плотные конидиальные структуры более менее бархатистые, четко радиальнобороздчатые, толщиной 1-2 мм, с белым растущим краем 1-2 мм ширины, вегетативный мицелий светло-желтого цвета с конидиеносной зоной мутного серо-зеленого цвета, выделяемый в среду пигмент и реверс колоний светло желтый. Капли эксудата золотисто-желтые. Склероции не образует.

Микроморфологические признаки на среде Чапек-Докс.

Конидиеносцы гладкие, бесцветные, главным образом отходят от субстрата, длина, в среднем, 150 - 350 мкм. Кисточки несимметричные, двухярусные, с мутовкой и 2-5 метуль на верхушке с одной или более веточками длинной 15 - 25 мкм. Длина метули, в среднем, 10-12 мкм. Стеригмы - 8-10 мкм, имеют бутылочную форму, собраны в компактную группу по 4-6 элементов. Конидии элептические, гладкие, в основном, 3,0-4,0 ×2,8-3,5 мкм, собраны в колонку, длина которой может достигать 200 мкм.

Физиологические признаки штамма P. chrysogenum ВКМ F-4876D.

Аэроб. Температурный оптимум роста 24-28 °C. Оптимальный рН в пределах 5,0 - 6,0. Оптимальный рост гриба отмечен на средах, содержащих в качестве источника углерода глюкозу, фруктозу, сахарозу, глицерин, крахмале. В качестве источника азота можно использовать нитраты, аммонийные соли, пептон, аминокислоты.

Поддержание штамма гриба осуществляется на твердой агаризованной среде следующего состава (г/л): агар-агар - 20, глюкоза - 30, глицерин - 70, соевая мука - 10, мясной пептон - 10, NaNO₃ - 2, MgSO₄ x 7H₂O - 1, рН 6,3 - 6,5. Продолжительность выращивания не менее 4-5 суток при температуре 25°C. Штамм храниться при температуре 4°C, пересев 1 раз в месяц.

Для длительного хранения культуру замораживают при -(50-70°С) в 50% глицерине, данные условия позволяют хранить культуру в течение 1 года без потери активности. Также штамм хранят в ампулах в лиофилизированном состоянии (защитная среда - обезжиренное молоко).

Изобретение относится к области биотехнологии. Штамм Penicillium chrysogenum ВКМ F-4876D получен селекционным путем из штамма P. chrysogenum ВКМ F-1310 и депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов. Штамм обладает высокой антагонистической активностью по отношению к широкому кругу фитопатогенных микроорганизмов - возбудителей фузариоза, альтернариоза, серой и белой гнилей, фомоза, гельминтоспориоза. Полученная на основе штамма сухая биомасса помимо высокой противогрибной активности обладает также способностью увеличивать чувствительность фитопатогенных микроорганизмов к широкому спектру коммерчески используемых фунгицидов, применяемых для защиты овощных и зерновых культур. Полученные результаты позволяют применять биопрепарат на основе данного штамма в интегрированной системе защиты растений. 2 н.п. ф-лы, 5 табл., 5 пр.

1. Штамм Penicillium chrysogenum ВКМ F-4876D, обладающий высокой антагонистической активностью по отношению к широкому кругу фитопатогенных микроорганизмов – возбудителей фузариоза, альтернариоза, фомоза, церкоспороза, белой и серой гнилей, фомоза, гельминтоспориоза, ризоктониоза.

2. Способ получения препарата, включающий культивирование штамма P. chrysogenum ВКМ F-4876D в биореакторах в жидкой питательной среде, содержащей сахарозу, соевую муку, триптон, нитрат натрия и сульфат магния, инактивирование культуральной жидкости путем нагревания при температуре 85°С в течение 40 минут, лиофильную сушку и приготовление целевого продукта в виде сухого порошка.