Штамм микромицета Penicillium crustosum ИНА 01369 ВКПМ F-1843 - продуцент антибиотиков, обладающий антимикробной активностью к фитопатогенным грибам рода Fusarium Российский патент 2024 года по МПК C12N1/20 

Область техники

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано в сельском хозяйстве и растениеводстве для биологического контроля фитопатогенных микроорганизмов - возбудителей фузариозной гнили растений.

Уровень техники.

Растущий спрос пищевых потребностей человечества на экологически чистую пищевую продукцию требует постоянного совершенствования агропромышленного комплекса. Важными задачами являются повышение сельскохозяйственной продуктивности, быстрый и точный контроль качества производимой продукции. Кроме того, необходимо снижение количества используемых потенциально токсичных средств защиты сельскохозяйственных растений и животных от возможных инфекций, а также повышение эффективности хранения готовой пищевой продукции.

Одной из существенных проблем, ведущих к экономическим потерям при картофелеводстве, являются бактериальные инфекции, приводящие к гнилостным поражениям, как вегетирующих растений, так и урожая. В некоторых случаях потери урожая при хранении и дальнейшей транспортировке могут достигать 50% (Bhat et al., 2010).

В настоящее время доля обработанных биопестицидами посевов в России не превышает 2 %. По последним данным (06.07.2021) в Государственном каталоге пестицидов Российской Федерации насчитывается около 50 сертифицированных биопрепаратов защиты растений (Государственный каталог пестицидов РФ, 2021), в то время как в США их количество превышает 420 наименований (Biostimulants and Biopesticides 2021-2031: Technologies, Markets and Forecasts, 2021, https://www.idtechex.com/en/research-report/biostimulants-and-biopesticides-2021-2031-technologies-markets-and-forecasts/773, дата обращения 12.12.2021).

Многие штаммы Penicillium проявляют активность в отношении экономически важных фитопатогенных грибов, таких как Rhizoctonia solanacearum (Wattana-Amorn et al., 2016), Phytophtora oryzae (Law et al., 2017), рода Fusarium (Grigorcea, S., Nedbaliuc, B., Chiriac, E., Aluchi, N., & Grigorcea, D. (2021). Determination of the particularities of growth and development in different temperature conditions of micromicets Alternaria spp, Fusarium spp, and Botrytis spp . in dual culture with Penicillium spp. Determinarea particularitat, ilor de cres, tere ˘ , 1(11), 138-145. https://doi.org/10.36120/ 2587-3644.v11i1.138-145) и фитопатогенных бактерий (Sabuquillo, P., Cal, A. De, & Melgarejo, P. (2006). Biocontrol of tomato wilt by Penicillium oxalicum formulations in different crop conditions. Biological Control, 37(3), 256-265. https://doi.org/10.1016/j.biocontrol.2006. 02.009; Karpova, N. V., Yaderets, V. V., Glagoleva, E. V., Petrova, K. S., Ovchinnikov, A. I., & Dzhavakhiya, V. V. (2021). Antifungal activity of the dry biomass of Penicillium chrysogenum f-24-28 and is application in combination with azoxystrobin for efficient crop protection. Agriculture (Switzerland), 11(10). https://doi.org/10.3390/agriculture111 00935).

В России известен биопрепарат Вермикулен на основе штамма гриба-антагониста РК-1-3 Penicillium vermiculatum Dangeard, который включен в «Государственный каталог пестицидов и агрохимикатов, разрешенных к применению в РФ», как перспективный биофунгицид для протравливания семян подсолнечника (Л.В. Маслиенко. Вермикулен - перспективный микробиопрепарат полифункционального типа действия для защиты подсолнечника и других сельскохозяйственных культур от болезней масличной культуры. Научно-технический бюллетень Всероссийского научно-исследовательского института масличных культур. Вып. 2 (141), 2009). Препарат отнесен к малоопасным веществам четвертого класса, не фитотоксичен, не вызывает аллергии, не токсичен для пчел.

Известен биопрепарат полифункционального типа действия Фуникулозум на основе штамма Penicillium funiculosum, который используется для протравливания семян и защиты подсолнечника от корневой гнили, вызываемой фитопатогенными грибами (https://www.vetpress.ru/jour/article/viewFile/758/742 https://doi.org/10.32634/0869-8155-2019-326-2-115-118).

Известен способ защиты многолетних культур от инфекционных заболеваний (источник [1]: патент RU №2458503). Способ включает использование биологических средств в смеси из трех-шести биофунгицидов. В состав смеси входит биомасса гриба Penicillium vermiculatum. Используется смесь шести различных культур микроорганизмов: Бактофит (Bacillus subtilis штамм ИПМ-215 и продуцируемый антибиотик) - 2,5 л/га, Планриз (Pseudomonas fluorescens штамм АР-33) - 1,5 л/га, Триходермин (Trichoderma viride) - 1,5 л/га, Трихоцин (Trichoderma harzianum) - 100 г/га, Фитолавин (Streptomyces griseus или Streptomyces lavendulae штамм 696) - 1 л/га, Вермикулен (Penicillium vermiculatum) - 2,5 л/га). Или используют состав из трех культур микроорганизмов (Алирин-Б (Bacillus subtilis штамм В-10 ВИЗР) - 100 г/га, Триходермин (Trichoderma viride - 1,5 г/га, Фуникулозум (Penicillium funiculosum) - 2,5 л/га). Повышается эффективность борьбы с инфекционными заболеваниями на насаждениях многолетних культур, а также повышается адаптивный потенциал растений к экстремальным условиям зимнего периода и экологическая безопасности продукции.

Наиболее близким к заявляемому изобретению по спектру биологической активности, принятый за прототип, является штамм Penicillium chrysogenum ВКМ F-4876D для получения биопрепарата для защиты сельскохозяйственных растений от фитопатогенных микроорганизмов, способ производства препарата (источник [2]: патент RU №2780228). Штамм обладает высокой антагонистической активностью по отношению к широкому кругу фитопатогенных микроорганизмов - возбудителей фузариоза, альтернариоза, серой и белой гнили, фомоза, гельминтоспориоза. Полученная на основе штамма сухая биомасса, помимо высокой противогрибковой активности, обладает также способностью увеличивать чувствительность фитопатогенных микроорганизмов к широкому спектру коммерчески используемых фунгицидов, применяемых для защиты овощных и зерновых культур.

На сегодняшний момент неизвестно о каких - либо продуцентах биопестицидов на основе вида Penicillium crustosum, проявляющих активность в отношении грибов рода Fusarium. Все упоминания, касающиеся штаммов - антагонистов этого вида, носят исключительно теоретический характер, а разработки не доведены практического применения. Таким образом, заявляемое решение соответствует критерию патентоспособности - новизна.

Сущность изобретения.

Технической проблемой, на решение которой направлено заявляемое изобретение является выделение штамма микромицета Penicillium crustosum, который продуцирует антибиотики с высокой активностью к грибам рода Fusarium.

Техническая проблема решается тем, что выделен новый штамм микромицета Penicillium crustosum ИНА 01369 ВКПМ F - 1843 - продуцент антибиотиков, обладающий антимикробной активностью к грибам рода Fusarium.

Осуществление изобретения.

Штамм Penicillium crustosum ИНА 01369 под номером ВКПМ F - 1843 характеризуется следующими свойствами.

Штамм Penicillium crustosum ИНА 01369 ВКПМ F-1843 выделен в 2019 году из почвы птичьего базара на плакоре (90 м над уровнем моря) острова Нортбрук (Архангельская область, Приморский район, архипелаг Земля Франца Иосифа) и депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов и коллекции продуцентов антибиотиков имени Г.Ф. Гаузе. Штамм проявляет антагонистическую активность по отношению к широкому кругу фитопатогенных микроорганизмов - возбудителей фузариоза рода Fusarium, мягкой бактериальной гнили рода Pectobacterium. Полученные путем культивирования штамма и последующего выделения биологически активные вещества позволяют применять биопестицид на основе данного штамма в интегрированной системе защиты растений.

Штамм Penicillium crustosum ИНА 01369 ВКПМ F-1843 является моноспоровым клоном, полученным из исходного дикого изолята.

Культурально-морфологические особенности штамма: на среде Сабуро и сусло-агар формирует быстро растущий, стерильный мицелий светло-белого цвета, может иметь кремовый оттенок, а также образовывать корочкообразную форму. Конидиальное спороношение обильное, от лимонно-зелёного до изумрудного цвета, край ровный, реверс коричневого цвета. Pазмер колонии: достигает 34-38 мм в диаметре за 6 дней. Цвет обратной стороны колонии: не окрашен, может иметь кремовый оттенок, часто «потрескавшийся» в виде корочки. Экссудат от прозрачного до зелёного цвета. По мере старения обильно спороносит, мицелий приобретает более темные оттенки зелёного цвета с коричневым реверсом (фиг. 1Г).

Микроморфология.

Имеет длинные ветвящиеся септированные гифы с округлыми конидиями, конидиеносцы преимущественно трёхъярусные, иногда встречаются четырёхъярусные, 200-400 мкм длиной и около 3,5 мкм толщиной (фиг. 1А, Б). Конидии шаровидные в виде длинных цепочек, диаметр 3,5 мкм. Хламидоспоры, склероции отсутствуют (фиг. 1В).

Физиолого-биохимические признаки.

Штамм продуцирует активные вещества - антибиотики, обладающие фунгицидными действием в отношении грибов Fusarium oxysporum и Fusarium solani.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1.

Идентификация штамма.

Определение видовой принадлежности штамма Penicillium crustosum ИНА 01369 ВКПМ F-1843 молекулярно-генетическими методами проводят на основании данных сиквенсов участков ITS rDNA, включая 5.8S РНК. Используют праймеры ITS1f (5' CTTGGTCATTTAGAGGAAGTA) и NL4 (5' GGTCCGTGTTTCAAGACGG) и смеси для ПЦР ScreenMix (ЗАО “Евроген”, Москва).

Последовательность:

CATTACCGAGTGAGGGCCCTCTGGGTCCAACCTCCCACCCGTGTTTATTTTACCTTGTTGCTTCGGCGGGCCCGCCTTAACTGGCCGCCGGGGGGCTTACGCCCCCGGGCCCGCGCCCGCCGAAGACACCCTCGAACTCTGTCTGAAGATTGAAGTCTGAGTGAAAATATAAATTATTTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATACGTAATGTGAATTGCAAATTCAGTGAATCATCGAGTCTTTGAACGCACATTGCGCCCCCTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTGCTGCCCTCAAGCCCGGCTTGTGTGTTGGGCCCCGTCCCCCGATCTCCGGGGGACGGGCCCGAAAGGCAGCGGCGGCACCGCGTCCGGTCCTCGAGCGTATGGGGCTTTGTCACCCGCTCTGTAGGCCCGGCCGGCGCTTGCCGATCAACCCAAATTTTTATCCAGGTTGACCTCGGATCAG

100% Penicillium crustosum.

Ссылка на референсный геном NR_077153.1 по базе данных NCBI:

https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi#alnHdr_452056297

Наиболее близкие виды:

99.61% Penicillium fuscoglaucum NR_163669.1 по базе данных NCBI:

https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi#alnHdr_1678639076

99.61% Penicillium caseifulvum NR_163685.1 по базе данных NCBI:

https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi#1678639092

Пример 2.

Культивирование штамма Penicillium crustosum ИНА 01369 ВКПМ F-1843 в стационарных и глубинных условиях для получения биомассы мицелия и культуральной жидкости при различных температурах в разных условиях культивирования. (Фиг.2, фиг. 3)

В качестве посевного материала используют 5-ти суточную культуру Penicillium crustosum ИНА 01369 ВКПМ F - 1843, полученную на сусло-агаре. Штамм выращивают на среде Сабуро и среде с добавлением 3 % неохмеленного сусла с рН 7,2 в стационарных условиях в колбах на Эйленмейера на 500 мл в течение 14 суток при 15, 20 и 25°С.

Штамм Penicillium crustosum ИНА 01369 ВКПМ F-1843 хорошо растет и накапливает биомассу в диапазоне температур от 15 до 28°C (таблица 1). Наибольший прирост биомассы наблюдают при температуре 28°C, при глубинном способе культивирования - при 20°C, при этом при глубинном способе культивирования накопление биомассы штаммом в 3 - 4 раза выше, чем при поверхностном, в зависимости от температуры. (Фиг. 3)

Таблица 1.

Биомасса мицелия (г/л) продуцента при разных температурах и типах культивирования

Тип культивирования Температура, °C 15 20 28 Стационарное 24,787 24,615 25, 642 Глубинное 55,167 77,932 64,834

Пример 3.

Определение фунгицидной активности экстрактов из мицелия и культуральной жидкости штамма Penicillium crustosum ИНА 01369 F-1843 в отношении штаммов условно-патогенных и фитопатогенных мицелиальных грибов.

Биомассу мицелия и спор Penicillium crustosum ИНА 01369 ВКПМ F-1843 отделяют центрифугированием на центрифуге. Антибиотические вещества из отфильтрованной культуральной жидкости содержанием завляемого штамма экстрагируют этилацетатом при соотношении этилацетата и культуральной жидкости 3:1. Активные соединения секретируются штаммом в культуральную жидкость.

Полученный экстракт упаривают в вакууме на роторном испарителе «Rotavapor-RBǘchi» (Швейцария) досуха при 42°С, сухой остаток - препарат хранят при 4°С. Для определения антибиотической активности используют диско-диффузионный метод с помощью стерильных бумажных дисков (бумага фильтровальная Ф ГОСТ 12026-76, Россия), смоченных в тестируемых препаратах и высушенных в стерильных условиях.

Диски пропитывают экстрактом, растворенным в 60% водном растворе этанола, и сушат их на воздухе в стерильных условиях. Антимикробную активность определяют в исходной культуральной жидкости.

Для оценки противогрибковой активности берут коллекционную тест-культуру мицелиальных грибов: патогенных штаммов Aspergillus niger INA 00760, фитопатогеного штамма Fusarium solani ВKПM F 890.

Экстракты культуральной жидкости штамма обладают широким спектром фунгицидной активности в отношении условно-патогенных грибов. Экстракты ингибируют рост всех тест-культур мицелиальных грибов, но особенно эффективны против возбудителя корневой гнили Fusarium solani ВKПM F 890 (таблица 2).

Таблица 2.

Зоны подавления роста штаммом Penicillium crustosum ИНА 01369 F - 1843 тест-штаммов фитопатогенных грибов.

Тип культивирования Значение температуры Зоны ингибирования тест-штаммов экстрактами из культуральной жидкости*,
мм Зоны ингибирования тест-штаммов экстрактами из мицелия*, мм F. solani ВКПМ F 890 A.niger INA 00760 F. solani ВКПМ F 890 A. niger INA 00760 Поверхностное 15°C 14 8 20 0 20°C 15 15 22 0 28°C 12 0 12 17 Глубинное 15°C 0 0 0 0 20°C 0 0 0 0 28°C 0 0 0 0

Примечание. *- по 50 мкл на диск. *с - статическая зона. Экстракция этилацетатом. Диаметр диска = 7 мм.

Изобретение поясняется иллюстративными материалами.

Фиг. 1. - Морфология конидиеносцев (1 A,1 Б); конидий (1 В) и вид колонии на среде Сабуро (1 Г) штамма Penicillium crustosum ИНА 01369 ВКПМ F-1843.

Фиг.2. Рост штамма Penicillium crustosum ИНА 01369 при поверхностном культивировании при различных температурах: 2 А при 15°C; 2 Б при 20°C; 2 В при 28°C.

Фиг. 3. Рост штамма Penicillium crustosum ИНА 01369 при глубинном культивировании при различных температурах: 3 А при 15°C;3 Б при 20°C; 3 В при 28°C.

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой штамм микромицета Penicillium crustosum ИНА 01369 ВКПМ F-1843 - продуцент антибиотиков, обладающий антимикробной активностью к грибам рода Fusarium. Данный штамм может быть использован в сельском хозяйстве и растениеводстве для биологического контроля фитопатогенных микроорганизмов - возбудителей фузариозной гнили растений. 3 ил., 2 табл.

Штамм микромицета Penicillium crustosum ИНА 01369 ВКПМ F-1843, обладающий антимикробной активностью к фитопатогенным грибам рода Fusarium.