ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
[001] Настоящее изобретение относится к турбидиметрическому способу и тестовой системе для количественного определения членов семейства S100 связывающих кальций белков в физиологических жидкостях и фекалиях. Тестовый набор содержит антитела, буферы и набор из частей для использования в диагностике острых и хронических воспалительных заболеваний и состояний.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
[002] Термин кальпротектин относится к двум белкам гранулоцитов с относительными молекулярными массами 36500 Дальтон и изоэлектрическими точками при pH 6,3 и 6,5 (US 4833074; Fagerhol et al., Scand. J. Haematol. 24, 393–398 (1980). Fagerhol et al., Bull. Europ. Physiopath. Resp. 16 (suppl), 273–281 (1980). Альтернативные наименования включают связывающие кальций белки с низкой молекулярной массой S100A8 и S100A9, родственный миелоиду белок 8 (MRP8), родственный миелоиду белок 14 (MRP14), родственные ингибирующему миграцию фактору белки 8/14 (MRP8–MRP14), S100a/b, кальгранулин A/B, антиген кистозного фиброза (CFA), человеческий лейкоцитарный белок, комплекс лейкоцитарного белка L1, антиген 60BB и антиген 27E10. Кальпротектин является доказанным маркером активации нейтрофилов, поскольку его концентрация в физиологических жидкостях и матриксах является показательной для обновления лейкоцитов и их инфильтрации в ткани. Таким образом, он стал широко используемым биомаркером в клинической химии для инфекций, острых и хронических воспалительных нарушений и других заболеваний. Измерение кальпротектина можно использовать для установления отличий бактериальной инфекции от других причин, так же как для диагностики неинфекционного системного воспаления (Striz, I & Trebichavsky, Calprotectin – a pleiotropic molecule in acute and chronic inflammation, Physiological research/Academia Scientiarum Bohemoslovaca (2004) 53(3): 245–53; Nilsen T et al, A new turbidimetric immunoassay for serum calprotectin for fully automatized clinical analysers, Journal of Inflammation (2015) 12:45; Johne B et al, Functional and clinical aspects of the myelomonocyte protein calprotectin, Mol. Pathol. 1997;50:113–23; Nielsen T et al, Serum calprotectin levels in elderly males and females without bacterial or viral infections, Clin. Biochem 2014;47(12):1065–8). Кальпротектин, кроме того, предложен в качестве маркера сердечно–сосудистого заболевания (CVD) до начала симптомов CVD у бессимптомных субъектов (ср. EP 1 573 335 B1).
[003] Одновременное присутствие различных моно– и мультимеров S100, в дополнение к гетеродимеру, однако, осложняет иммунологическое определение кальпротектина в биологических образцах (крови, сыворотке, синовиальной жидкости и т.д.) и матриксах (фекалиях). Свойства связывания Ca2+ и Zn2+ белков S100A8/A9 дополнительно оказывают важное влияние на их конформацию и олигомеризацию. S100A8 и S100A9 имеют тенденцию формировать тетрамеры в присутствии ионов кальция или цинка, в то время как гетеродимер кажется преобладающей формой в отсутствие кальция (ср. Grabarek Z, Structural basis for diversity of the EF–hand calcium–binding proteins, J Mol Biol (2006), 359: 509–25). Смешивание очищенных S100A8 и S100A9 не образует автоматически кальпротектин со свойствами, как у гетеродимера, секретируемого гранулоцитами. Эксперименты с мутантными S100A8 и S100A9 позволяют предполагать, что гомо– и гетеро–олигомеризация S100A8 и S100A9 также является функционально и диагностически важной.
[004] Кальпротектин экспрессируется in vivo в ходе различных стадий миелоидной дифференцировки, в циркулирующих нейтрофилах и моноцитах, в то же время отсутствует в макрофагах и лимфоцитах нормальной ткани, и подвергается повышающей регуляции во многих типах злокачественных опухолей, включая злокачественные опухоли желудка, пищевода, ободочной кишки, поджелудочной железы, мочевого пузыря, яичника, щитовидной железы, молочной железы и кожи, при неродегеративных нарушениях, так же как при воспалительных и аутоиммунных заболеваниях и патологиях. Хронические воспалительные состояния, такие как псориаз, приводят к экспрессии в эпидермисе. Кальпротектин обнаружен в высоких концентрациях в локальных участках воспаления, так же как в сыворотке (крови) и фекалиях пациентов с воспалительными заболеваниями, ревматоидным артритом, кистозным фиброзом, воспалительным заболеванием кишечника, болезнью Крона, гигантоклеточным артериитом, синдромом Шегрена, системной красной волчанкой и прогрессивной системной склеродермией. Кальпротектин также вовлечен в формирование и накопление амилоидов в стареющей предстательной железе, известное как включения амилоидных телец.
[005] Различные роли приписывают кальпротектину. Он может индуцировать хемотаксис нейтрофилов и увеличивать бактерицидную активность посредством стимуляции фагоцитоза и/или дегрануляции нейтрофилов посредством зависимого от MAPK механизма (Simard J.C. et al, Induction of neutrophil degranulation by S100A9 via a MAPK–dependent mechanism, J Leukoc Biol. (2010) 87(5):905–14). Противомикробная, окислительная–утилизирующая и индуцирующая апоптоз активность, так же как провоспалительная активность (например, привлечение лейкоцитов) дополнительно приписаны кальпротектину, который, по–видимому, является усилителем воспаления при аутоиммунитете, так же как стимулятором врожденных иммуноцитов посредством их связывания с узнающими паттерн рецепторами, такими как Toll–подобный рецептор 4 (TLR4) и рецептор конечных продуктов гликирования (AGER). Другие виды активности включают стимуляцию продукции цитокинов и хемокинов, и регуляцию адгезии и миграции лейкоцитов. Связывание с TLR4 и AGER активирует пути передачи сигналов MAP–киназы и NF–kappa–B, что приводит к усилению провоспалительного каскада. Противомикробная активность против бактерий и грибов, по–видимому, возникает в результате связывания ионов Zn2+ и Mn2+, которые являются необходимыми для роста микроорганизмов. Активность транснитрозилазы также обнаружена для кальпротектина, и предположили, что комплекс транснитрозилазы iNOS–S100A8/A9 управляет избирательным зависимым от воспалительного стимула S–нитрозилированием мишеней, содержащих мотив [IL]–x–C–x–x–[DE]. Кальпротектин может, кроме того, действовать как алармин или молекула ассоциированного с опасностью молекулярного паттерна (DAMP).
[006] Правильное и точное измерение кальпротектина в биологических образцах и матриксах является необходимым, если результаты следует интерпретировать для диагностических целей и ухода за пациентом, в частности, для мониторирования лечения острых и хронических воспалительных нарушений с использованием биологических средств. В частности, результаты должны являться сопоставимыми, если необходимо использовать объединенные значения диагностических заключений и результаты клинических исследований. Метрологическую проблему, с учетом разнообразных состояний олигомеризации кальпротектина, можно разбить на прослеживаемость измеренных значений, неточность измерений и их коммутативность. Когда прослеживаемость недостижима, сопоставимость результатов необходимо реализовывать другими способами, поскольку измерения являются основной деятельностью клинических лабораторий. Целью является то, чтобы результаты для пациентов имели прослеживаемую связь с наивысшим возможным эталонным значением, для улучшения качества диагностических результатов.
[007] В общепринятых способах измерения кальпротектина используют поликлональные антитела, либо в свободной форме, либо связанными с твердой фазой (ср. WO2012/175616, WO2013/132347, WO2014/037588, US20170108507). Однако, параллельное определение посредством иммуноанализа (например, посредством твердофазного иммуноферментного анализа – ELISA) очищенного кальпротектина, добавленного в растворы образцов, с использованием УФ/видимого света, биурета, реактива Бредфорд или Кумасси синего, не дает окончательных ответов на стандартную проблему, поскольку кальпротектин может принимать форму димеров (S100A8/A9), тетрамеров (S100A8/A9)2 или даже олигомеров (T.Vogl et al, Poster: Towards a Reference Material for the Standardization of Calprotectin (S100A8/Ag; MRP8/14) Immunoassay, presented at FOCUS (Association for Clinical Biochemistry and Laboratory Medicine), May 3–5. 2017, Leeds, UK). Предложено использование мутантных белков S100A8 и S100A9, имеющих по меньшей мере одну мутацию в области высоко– или низкоаффинного связывания кальция, поскольку эти рекомбинантные белки больше не способны к олигомеризации (WO 2016/116881).
[008] Турбидиметрические иммуноанализы обеспечивают преимущества простых способов и автоматического анализатора. В турбидиметрическом иммуноанализе с усилением частицами латекса (PETIA) специфические для мишени антитела связаны с частицами («сенсибилизированные частицы») таким образом, что реакция антитело–антиген приводит к агглютинации частиц, которую можно измерять посредством спектрометрии (ср. EP 0 061 857; EP1 205 755 B1; и ссылки в этом документе). Одного типа реагента в форме частиц достаточно, когда антиген–мишень узнают два или более антитела, соединяя мостиком две или более латексных частицы (Methods in Enzymology (1981) 74, 106–139, Academic Press, New York; EP 1 739 430 B1; EP1 573 335 B1). Неспецифические реакции между реагентом в форме частиц и образцом также могут приводить к агглютинации и увеличенной мутности (ср. JP 11 023 573 A, JP 58 144 748 A, EP 1 205 755 B1). Безопасное и полное ингибирование неспецифических реакций, в частности, представляет проблему, если используют поликлональные антитела, связанные с реагентом в форме частиц, или если мишень выделяют из комплексного или неоднородного матрикса, подобного фекалиям (ср. EP 0 038 181 B1). Стандарт с использованием мутантного кальпротектина (mutS100A8/A9) является мало полезным при измерении присутствия эндогенного кальпротектина в человеческих матриксах и образцах, например, полученных от соответствующих пациентов, или посредством способа агглютинации. В настоящее время, кальпротектин определяют в биологических образцах с использованием турбидиметрического иммуноанализа с усилением частицами латекса (particle–enhanced turbidimetric immunoassay (PETIA)), где иммобилизованные поликлональные антитела связываются с множеством эпитопов на кальпротектине таким образом, чтобы любой тип белка S100 мог приводить к агглютинации, вне зависимости от того, находится ли он в состоянии олигомеризации, секретированном гранулоцитами, или нет. Это приводит к не подходящим для диагностики значениям порога отсечения, неточности измерения и подрывает коммутативность, в частности, поскольку поликлональная антисыворотка подвержена образованию неспецифической агглютинации.
[009] Наблюдаемый разброс при сравнении способов между ELISA, основанным на моноклональных антителах, и PETIA, основанным на агглютинации с использованием поликлональных антител, так же как отсутствие коммутативности подходящих для диагностики значений порога отсечения, являются дополнительными причинами для опасений. В то время как моноклональные антитела легче стандартизовать, и они позволяют контроль качества по определенному стандарту на протяжении полного срока действия продукта, существует объединенная проблема получения реакции агглютинации, чувствительности измерения и специфичности для кальпротектина в форме, секретированной гранулоцитами. Уровень техники в данной области для определения кальпротектина в биологических образцах и матриксах, таким образом, представляет проблему.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0010] Решение этих проблем достигают способом in vitro, как описано в пункте формулы изобретения 1. Предпочтительные варианты осуществления способа определены в зависимых пунктах формулы изобретения 1–14. Другой аспект изобретения относится к набору, например, для использования в турбидиметрическом или нефелометрическом иммуноанализе, содержащему два компонента реакции, как определено в пункте формулы изобретения 15.
[0011] Соответственно, одной целью является предоставление способа in vitro измерения присутствия кальпротектина в биологическом образце от пациента, включающего стадии, содержащие стадии: a) сбора предопределенного количества указанного биологического образца; b) солюбилизации и экстракции указанного биологического образца в предопределенном количестве водного органического буфера, имеющего i) pH между 5,0 и 6,0, ii) осмоляльность по меньшей мере 150 мосмоль/кг H2O, iii) 0,01–0,1% процента по массе анионного поверхностно–активного вещества, iv) где молекулы органического буфера можно координировать с использованием ионов кальция и цинка, и iv) и, необязательно, гомогенизации и экстракции матрикса указанного биологического образца с последующим удалением любого материала в форме частиц для получения раствора образца с определенным присутствием солюбилизированного кальпротектина (S100A8/A9) в форме, секретированной гранулоцитами (с интактными лизосомальными компартментами); c) смешивания определенного количества раствора указанного образца со стадии (b) с некоторым количеством реагента для получения смеси, содержащей наночастицы, имеющие иммобилизованные моноклональные антитела или их фрагменты, специфически связывающие любой из S100A8 и S100A9 или кальпротектин (S100A8/A9), и реакции связанное с частицами антитело–антиген для кальпротектина (S100A8/A9); d) инкубации смеси со стадии c) в течение некоторого интервала времени; и e) получения оптических свойств смеси и определения сигнала, показательного для содержания кальпротектина (S100A8/A9), на основании оптических свойств смеси; f) установления связи указанного содержания с калиброванным контролем и оценки клинического состояния указанного пациента на основании измеренного присутствия кальпротектина (S100A8/A9) в указанном биологическом образце. Если кальпротектин определяют, как описано выше, количество может иметь метрологически прослеживаемую связь с измерением стандарта кальпротектина, выделенного из гранулоцитов с интактными лизосомальными компартментами. В первоначальных способах для определения кальпротектина использовали поликлональные моноспецифические антитела, поскольку структура, количество и концентрация связывающий кальций белков семейства S100 изменчивы.
[0012] Стадия получения оптических свойств включает определение значения оптической плотности, светопроницаемости, отражения, светорассеяния, флуоресценции или сцинцилляции. Турбидиметрические или нефелометрические измерения являются предпочтительными, и наиболее предпочтительным является турбидиметрический иммуноанализ с усилением частицами латекса (PETIA), где стадии b) и c) включают использование двух реагентов–компонентов.
[0013] Наночастицы, предпочтительно, имеют диаметры от 150 до 350 нм для увеличения чувствительности. Более предпочтительным является PETIA, где антитела являются связанными с двумя типами частиц, имеющих гомогенные диаметры в диапазоне i) от 150 до 200 нм и ii) от 250 до 350 нм, для увеличения диапазона измерений. Указанные наночастицы могут быть изготовлены из карбоксилированного полистирола или активированного хлорметилом полистирола.
[0014] Реакцию связанное с частицами антитело–антиген, предпочтительно, проводят в смеси, имеющей pH между 5,0 и 6,0, и содержащей анионное поверхностно–активное вещество или додецилсульфат натрия и координированные Ca2+ молекулы буфера.
[0015] Биологический образец может представлять собой фекалии или, более точно, экстракт фекалий, поскольку определение фекального кальпротектина стало неотъемлемым компонентом лабораторного исследования воспалительного заболевания кишечника. Мониторирование параметра воспаления в фекалиях и маркера нейтрофильной активности гранулоцитов, такого как кальпротектин, облегчает раннее распознавание вспышки рецидивирующего заболевания после установившейся ремиссии. Другими предпочтительными биологическими образцами являются кровь, сыворотка или плазма и моча, например, для диагностики и установления отличий преренального и интраренального заболевания почек, или других воспалительных заболеваний сердечно–сосудистой системы.
[0016] Композицию буфера предпочтительно составляют из по меньшей мере одной соли, выбранной из группы, содержащей соли поликарбоновых кислот, трикарбоновых кислот, аконитовых кислот, трикарбаллиловых кислот, дикарбоновых кислот, щавелевой кислоты, малоновой кислоты, янтарной кислоты, глутаровой кислоты, адипиновой кислоты, пимелиновой кислоты, альфа–, бета– и гамма–гидроксикарбоновых кислот, гидроксидикарбоновых кислот, яблочной кислоты, лимонной кислоты, винных кислот, малоновой кислоты, глюконовой кислоты, 5–кетоглюконовой кислоты, 2–кетоглюконовой кислоты, дигидроксималеиновой кислоты, малеиновой кислоты, фумаровой кислоты, нитрилотриуксусной кислоты, молочной кислоты и/или аскорбиновой кислоты. Буфер для секвестрирования кальция со стадии b) содержит, предпочтительно, по меньшей мере одну соль из цитрата, ацетата или малеата, обработанный протеазми сывороточный альбумин, и 0,01–0,1 процента по массе анионных поверхностно–активных веществ. Добавление или присутствие неспецифической антисыворотки IgM в компонентах реакции может являться необходимым для инициации и ускорения реакции агглютинации.
[0017] Другой целью является предоставление тестового набора для измерения присутствия кальпротектина в биологическом образце посредством турбидиметрического иммуноанализа с усилением частицами латекса, как описано. Тестовый набор может содержать
первый реагент–компонент, содержащий
– 20–1000 ммоль/л органического буфера с pH в диапазоне от 5,0 до 6,0;
– 50–300 ммоль/л соли натрия, калия или лития;
– 0,1–1,5% обработанного протеазми сывороточного альбумина;
– 0,01–0,1% (масс./об.) додецилсульфата натрия, и
необязательно, бета–альдозы, триозу, тетрозы, пентозы, гексозы, глюкан, декстран и/или сахар для достижения осмоляльности по меньшей мере 200 мосмоль/л; и
второй реагент–компонент, содержащий
– 0,01–0,5% (масс./об.) латексных частиц диаметром от 150 до 350 нм, несущих иммобилизованные моноклональные антитела, которые связывают любой из S100A8 и S100A9 или кальпротектин (S100A8/A9).
[0018] Буферные реагенты в указанных компонентах реакции для секвестрирования ионов кальция и цинка могут содержать по меньшей мере одну соль органической кислоты, выбранной из группы, состоящей из поликарбоновых кислот, трикарбоновых кислот, аконитовых кислот, трикарбаллиловых кислот, дикарбоновых кислот, щавелевой кислоты, малоновой кислоты, янтарной кислоты, глутаровой кислоты, адипиновой кислоты, пимелиновой кислоты, альфа–, бета– и гамма–гидроксикарбоновых кислот, гидроксидикарбоновых кислот, яблочной кислоты, лимонной кислоты, винных кислот, малоновой кислоты, глюконовой кислоты, 5–кетоглюконовой кислоты, 2–кетоглюконовой кислоты, дигидроксималеиновой кислоты, малеиновой кислоты, фумаровой кислоты, нитрилотриуксусной кислоты, молочной кислоты, аскорбиновой кислоты. Такие органические кислоты могут координироваться в воде с ионами кальция и цинка, в частности, при использовании в комбинации.
[0019] Без намерения быть связанными какой–либо теорией, кислый pH 5,0 и 6,0, и координация буферных реагентов ионами кальция, по–видимому, создает условия, специфические для кальпротектина, как он присутствует в нейтрофильных гранулоцитах, где белки S100A8 и S100A9 имеют pKI 6,3 и 6,5, и сильно связывают кальций посредством бидентата, унидентата и псевдомостиков. Присутствие небольшого количества анионного поверхностно–активного вещества, такого как додецилсульфат натрия, может являться необходимым для поддержания белков в растворе, в то же время без ингибирования реакции между связанными с частицами антителами и мишенью. Композиция буфера, в рамках изобретения, является, применительно к pH и осмоляльности, сходной с клеточной средой, в которой кальпротектин присутствует в гранулоцитах. Гранулоцит имеет внутренний pH между 5,0 и 6,0, и концентрацию ионов кальция в 100–1000 раз ниже, чем в окружающей среде.
[0020] Предпочтительный аспект описания относится к набору с двумя компонентами реакции, поддерживающими определение посредством турбидиметрии. Это может представлять собой турбидиметрический иммуноанализ с усилением частицами латекса (PETIA), включающий два реагента–компонента для поддержания стадий b) и c). Наиболее предпочтительный вариант осуществления относится к определению фекального кальпротектина вместе с устройством для переноса определенного количества фекалий в буфер для разведения и экстракциии кальпротектина из фекального матрикса, например, как описано в DE10 2012 109 457 B4, DE10 2008 057 866 B4 US5246669 A, JP–H10–300 642 A, DE10 2007 07 760 B3.
[0021] Дополнительные цели, признаки и преимущества очевидны из рассмотрения чертежей и следующего ниже описания репрезентативных примеров, которые приведены только для иллюстрации, а не ограничения, поскольку специалист в данной области может также учитывать их потенциальные модификации. Объем описания определен в формуле изобретения.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
[0022] На чертежах:–
Фигура 1 представляет собой диаграмму с калибровочной кривой турбидиметрического иммуноанализа с использованием моноклонального антитела мыши против кальпротектина (S100 A8/A9), ковалентно связанного с латексными частицами, имеющими диаметр 180 нм;
На фигуре 2 показана калибровочная кривая для турбидиметрического анализа с использованием моноклонального антитела мыши против кальпротектина и предел прозоны иммуноанализа;
Фигура 3 представляет собой график, показывающий корреляцию турбидиметрического иммуноанализа с использованием одного моноклонального антитела и общепринятого ELISA с использованием двух моноклональных антител в качестве связывающего и детектирующего антител для определения стандартного кальпротектина из гранулоцитов с интактными кислыми компартментами;
Фигура 4 представляет собой график, показывающий корреляцию турбидиметрического анализа с использованием двух моноклональных антител и общепринятого анализа ELISA для определения стандартного кальпротектина, выделенного из гранулоцитов с интактными лизосомальными мембранами.
Фигура 5 представляет собой график, показывающий корреляцию измерения турбидиметрического анализа для определения кальпротектина по изобретению с использованием двух моноклональных антител и одного моноклонального антитела.
Фигура 6 представляет собой график, показывающий корреляцию измерения описанного анализа с использованием двух типов частиц различных размеров и общепринятого анализа ELISA для определения кальпротектина.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0023] В прошлом, было сложно определить специфический диагностический порог кальпротектина в фекалиях, и выраженные различия между анализами существуют между различными коммерческими анализами из–за различных способов экстракции и буферов (Sipponen T, Kolho KL. Faecal calprotectin in children with clinically quiescent inflammatory bowel disease. Scand J Gastroenterol. 2010, 45:872–877; Gisbert JP, Bermejo F, Perez–Calle JL, et al. Fecal calprotectin and lactoferrin for the prediction of inflammatory bowel disease relapse. Inflamm Bowel Dis. 2009, 15:1190–1198; Walkiewicz D, Werlin SL, Fish D, et al. Fecal calprotectin is useful in predicting disease relapse in pediatric inflammatory bowel disease. Inflamm Bowel Dis. 2008, 14: 669–673; D'Inca R, Dal Pont E, Di Leo V, et al. Can calprotectin predict relapse risk in inflammatory bowel disease? Am J Gastroenterol. 2008 103:2007–2014 Tibble JA, Sigthorsson G, Bridger S, et al. Surrogate markers of intestinal inflammation are predictive of relapse in patients with inflammatory bowel disease. Gastroenterology. 2000;119:15–22). Описанный способ обеспечивает то преимущество, что буферы для экстракции и измерения обеспечивают окружение, сходное с окружением, обнаруживаемым при разрушении гранулоцитов, но сохранении интактными лизосомальных мембран и кислых компартментов. Иными словами, окружение является физиологически сходным с окружением, в которое гранулоциты высвобождают свой физиологический кальпротектин.
[0024] Буфер, используемый на стадии b), может содержать по меньшей мере одну соль из цитрата, ацетата или малеата, обработанный протеазами сывороточный альбумин и 0,01–0,1 процента по массе одного или нескольких анионных поверхностно–активных веществ. Для улучшения и ускорения агглютинации, один или несколько из компонентов реакции могут дополнительно содержать средство, облегчающее агглютинацию, например, неспецифическое IgM, ревматоидный фактор (RF). Хотя RF может существовать в форме изотипов IgG, IgM, IgA и IgE, IgM–класс RF является предпочтительным для клинического измерения кальпротектина.
[0025] Второй реагент–компонент может содержать одно или несколько моноклональных антител против кальпротектина, иммобилизованных на наночастицах. По меньшей мере два различных моноклональных антитела являются предпочтительными из соображений общей безопасности. Если используют только одно моноклональное антитело, всегда существует риск нетипичной иммунной реакции и ложного результата диагностики, который можно уменьшать с использованием второго специфического моноклонального антитела против кальпротектина. Кроме того, реакция агглютинации является более надежной с двумя специфическими антителами, поскольку они имеют различные эпитопы и связывающие детерминанты.
[0026] Наночастицы могут иметь диаметры от 150 до 350 нм для улучшения чувствительности. Наночастицы с гомогенным диаметром являются предпочтительными. Для увеличения диапазона измерения, может являться предпочтительным использование моноклональных антител против кальпротектина, иммобилизованных на двух типах частиц, имеющих диаметры в диапазонах i) от 150 до 200 нм и ii) от 250 до 350 нм. Указанные частицы одного или нескольких размеров могут представлять собой частицы из карбоксилированного полистирола или активированного хлорметилом полистирола.
[0027] Другой аспект относится к набору из двух реагентов–компонентов для измерения кальпротектина в физиологической жидкости или образце посредством турбидиметрического иммуноанализа с усилением частицами латекса. Первый реагент–компонент может представлять собой буфер для экстракции, как описано выше, и/или содержащий 20–1000 ммоль/л соли из буферного реагента, как описано, с pH в диапазоне от 5,0 до 6,0; 50–300 ммоль/л ионов натрия, калия или лития; 0,1–1,5% обработанного протеазми сывороточного альбумина; 0,01–0,1% (масс./об.) анионного детергента, предпочтительно, додецилсульфата натрия, и необязательно, бета–альдозы, триозу, тетрозы, пентозы, гексозы, глюкан, декстран и/или сахар для достижения осмоляльности по меньшей мере 200 мосмоль/л. Второй реагент–компонент может содержать 0,01–0,5% (масс./об.) латексных частиц диаметром от 150 до 350 нм, несущих иммобилизованные моноклональные антитела против кальпротектина человека, которые связывают любой из S100A8 и S100A9 или кальпротектин (S100A8/A9) при pH между 5,0 и 6,0.
[0028] Способ измерения присутствия кальпротектина в биологическом образце от пациента, включающий стадии: (a) сбора предопределенного количества указанного биологического образца, который может представлять собой фекалии, сыворотку или синовиальную жидкость; b) солюбилизации и экстракции указанного биологического образца в предопределенном количестве органического буфера, имеющего i) pH между 5,0 и 6,0, ii) осмоляльность по меньшей мере 150 мосмоль/кг H2O, iii) где органическая кислота может координировать или секвестрировать ионы цинка и кальция, и iv) 0,01–0,1% процента по массе анионного поверхностно–активного вещества и, необязательно, гомогенизации и экстракции матрикса указанного биологического образца с последующим удалением любого материала в форме частиц для получения раствора образца, содержащего кальпротектин (S100A8/A9); c) смешивания определенного количества раствора указанного образца со стадии (b) с некоторым количеством содержащего частицы реагента для получения смеси, имеющей i) pH между 5,0 и 6,0, ii) осмоляльность по меньшей мере 150 мосмоль/кг H2O, iii) органические соли и кислоты, секвестрирующие ионы кальция и цинка, и iv) содержащей наночастицы, имеющие диаметры по меньшей мере 150–350 нм и иммобилизованные на них моноклональные антитела или их фрагменты, специфически связывающие любой из белков S100A8 и S100A9 или кальпротектин (S100A8/A9); d) инкубации смеси со стадии c) в течение первого интервала времени; и e) получения оптических свойств указанной смеси и определения сигнала, показательного для содержания кальпротектина (S100As/A9), на основании оптических свойств указанной смеси; f) установления связи указанного содержания с калиброванным контролем из кальпротектина в таком же буферном растворе и оценки клинического состояния указанного пациента на основании измеренного присутствия кальпротектина (S100A8/A9) в указанном биологическом образце.
[0029] Другой аспект относится к набору реагентов для иммунологической латексной турбидиметрии для автоматизированного анализа, так же как к применению этих реагентов. Указанный вариант осуществления может представлять собой систему из двух реагентов, состоящую из первого реагента–компонента, содержащего буфер для стабилизации димерной формы кальпротектина в указанном растворе образца со стадии b) и второго реагента–компонента, содержащего частицы, несущие иммобилизованные одно или несколько моноклональных антител против S100A8 и S100A9 или кальпротектина (S100A8/A9). Описанный способ может включать перенос или разведение экстракта биологического образца в первом реагенте–компоненте, необязательно, после удаления любого присутствующего твердого материала. Первый реагент–компонент может содержать обработанный протеазами бычий или человеческий сывороточный альбумин, предпочтительно, в количестве 0,1–1,5%, в органической буферной системе, имеющей pH в диапазоне от 5,0 до 6,0 и содержащей органические буферные реагенты, секвестрирующие ионы кальция и цинка.
[0030] Как упомянуто, используемые наночастицы могут представлять собой частицы из карбоксилированного полистирола с диаметрами в диапазоне от 150 до 350 нм, предпочтительно, от 150 до 200 нм. В наиболее предпочтительном варианте осуществления, указанные наночастицы из карбоксилированного полистирола имеют диаметры в диапазоне от 160 до 180 нм. В наиболее предпочтительном варианте осуществления, наночастицы имеют по существу одинаковый размер, предпочтительно, с диаметрами в диапазоне от 160 до 180 нм. Этот размер частиц позволяет улучшенное представление молекул антитела и минимизирует сложности определения в условиях избытка антигена. Поскольку такие наночастицы имеют большую поверхность взаимодействия с антигеном, необходимо меньше покрытых антителом частиц, и реакция антитело–антиген становится сравнимой с поверхностно опосредованной иммунной реакцией, которая, как правило, быстрее. Такие крупные частицы также являются предпочтительными для лучшей метрологически прослеживаемой связи измеренных значений с предшествующими измерениями кальпротектина с использованием иммуносорбентного анализа (например, ELISA) и для их коммутативности. Прослеживаемости, надежности и коммутативности нвозможно достигать, когда реакция антитело–антиген является 3D в жидкости и не является зависимой от поверхности. Следовательно, авторы настоящего изобретения считают, что использование более крупных частиц, чем обычно, улучшает метрологическую прослеживаемость результатов. Сопоставимость результатов должна быть реализована и представляет основную деятельность клинических лабораторий.
[0031] Являются предпочтительными наночастицы таких размеров, которые пригодны для специфической двумерной реакции между указанными моноклональными антителами и в основном гетеродимерным кальпротектином, и оптимизированы таким образом, что необходимо меньшее количество антител. Усиленная частицами иммунная реакция стимулируется, в то время как стерические эффекты, по–видимому, уменьшают вклад структуры кальпротектина. Увеличение размера частиц не является ассоциированным с высокой степенью спонтанного помутнения, если находится в данном диапазоне размеров частиц.
[0032] В предпочтительном варианте осуществления, указанные наночастицы могут быть двух различных размеров, имея диаметры i) от 250 до 350 нм и ii) от 160 до 250 нм. Комбинация иммуносенсибилизированных частиц различных размеров может дополнительно увеличивать точность, так же как диапазон измерений.
[0033] Кальпротектин экспрессируется гранулоцитами, подгруппой белых клеток крови, и перед своим высвобождением или секрецией хранится в цитоплазматических гранулах, вероятно, некотором виде компартментов эндоплазматического ретикулума и транс–сети Гольджи, но это еще продолжают исследовать. Однако, гранулоциты получили свое наименование по присутствию гранул в их цитоплазме. Гранулоциты называют также полиморфноядерными лейкоцитами в соответствии с различными формами их ядер. Термин полиморфноядерный лейкоцит обычно относится к «нейтрофильным гранулоцитам», которые составляют приблизительно 95% гранулоцитов. Другие гранулоциты подразделяют на эозинофильные и базофильные гранулоциты, и тучные клетки, имеющие меньшие количества. Гранулоциты образуются посредством гранулопоэза в костном мозге и остаются в кровотоке в течение приблизительно 6 часов, где они осуществляют свои биологические функции. Уровни ионов кальция в цитозоле клеток поддерживаются относительно постоянными, составляя внутри клетки в 100000 раз ниже, чем снаружи клетки. Хорошо известно, что увеличение количества ионов кальция внутри клетки может приводить к важным клеточным изменениям, так что уровни ионов кальция и внутриклеточного кальция называют вторичными мессенджерами. Является жизненно необходимым для функций гранулоцитов и их связывающих кальций белков, таких как кальпротектин, чтобы уровни внутриклеточных ионов кальция находились под строгим контролем. Строгий контроль окружения кальция, доступного для связывания кальпротектином, кажется, таким образом, критическим для его функций и структуры, и для воспроизводимого определения биологически эффективного кальпротектина в физиологических жидкостях (сыворотке, синовиальной жидкости и т.д.), так же как в биологических матриксах, таких как ткань и фекалии.
[0034] С другой стороны, использование фосфатов, например, триполифосфата натрия (STP), в составах детергентов может приводить к преципитации, если присутствует кальций. При низком pH, S100A8 и S100A9 являются сильно связывающими кальций веществами и имеют изоэлектрические точки при pH 6,3 и pH 6,5. Следовательно, эти белки уже связаны с ионом кальция, и любой дополнительный кальций, присутствующий в биологических образцах (сыворотке, фекалиях, синовиальной жидкости и т.д.), может мешать их количественному определению. Без намерения быть связанными теорией, кажется благоприятным ингибировать связывание дополнительного кальция и олигомеризацию посредством изменения pH ниже изоэлектрических точек, более точно, ниже pH 6,0, и такое мягкое секвестрирующее средство является необходимым, чтобы избегать преципитации кальция. Этого можно достигать с использованием цитратных, малеатных или яблочных буферов. Альтернативно, полимеры и сополимеры акрилата и малеата можно добавлять для ингибирования преципитации и индуцированной ионами кальция агглютинации. Образование комплексов с кальцием зависит от pH раствора. В случае лимонной кислоты, концентрация не включенного в комплексы кальция остается низкой и постоянной при pH выше 6,5, когда полная депротонизация трех карбоновых групп является эффективной. В случае яблочной и молочной кислот и при pH выше, чем константа депротонизации последней, концентрация свободного кальция является более важной и колеблющейся. Исследовали ряд поликарбоновых кислот, содержащих ацетальные функциональные группы, и сравнивали их поведение применительно к секвестрированию кальция. Секвестрирование кальция окисленными углеводами, как правило, меньше, чем соответствующими эфирами поликарбоксилатов.
[0035] Когда кальпротектин определяют в фекалиях, количество кальция для связывания кальпротектином зависит от уровней кальция в желудочно–кишечном (GI) тракте и сильно изменчиво между образцами. Большинство солей кальция, собственно говоря, природные источники кальция в пищевых добавках и пище, имеют зависимую от pH растворимость. Растворимость четырех преобладающих солей кальция (гидрата оксалата кальция, тетрагидрата цитрата кальция, фосфата кальция, глицерофосфата кальция) увеличивается в каждом случае с увеличением pH. Следовательно, низкий pH является предпочтительным для экстракции и измерения, поскольку любой свободный кальций может приводить к формированию нетипичных тетрамеров или олигомеров связывающих кальций белков с низкой молекулярной массой S100A8 и S100A9.
[0036] Второй реагент–компонент может представлять собой суспензию латексных частиц, несущих иммобилизованное антитело. Один вариант осуществления реагента для иммунологической латексной турбидиметрии может представлять собой первый реагент–компонент, содержащий от 0,1 до 1,5% обработанного протеазами человеческого сывороточного альбумина, 20–1000 ммоль/л цитратного буфера, pH 5,0, 50–300 ммоль/л хлорида натрия и 0,1% (масс./об.) додецилсульфата натрия. Второй реагент–компонент может содержать 20–1000 ммоль/л цитратного буфера, pH 5,0; 50–300 ммоль/л хлорида натрия и 0,01–0,5%(масс./об.) латексных частиц диаметром от 150 до 350 нм, несущих иммобилизованные моноклональные антитела, которые связывают любой из S100A8 и S100A9 или гетеродимер кальпротектина (S100A8/A9).
[0037] Такие реагенты–компоненты обеспечивают высокую чувствительность и специфичность для кальпротектина (S100A8/A9) и улучшенную диагностическую надежность в турбидиметрическом иммуноанализе с усилением частицами латекса, в котором используют моноклональные антитела против кальпротектина (MRP 8/14, S100A8/A9), например, коммерчески доступные из Immundiagnostik AG, Bensheim, DE (Art. K6927, K6936). Более точно, результаты диагностики с использованием такого гомогенного иммуноанализа являются сравнимыми, даже более точными, по сравнению с разработанными способами ELISA и иммунохроматографическими тестами на месте оказания медицинской помощи. Диагностическое значение порога отсечения 50 микрограмм/г фекалий можно устанавливать для присутствия воспаления. В турбидиметрическом иммуноанализе с усилением частицами латекса используют, по сравнению с предшествующим уровнем техники, стандартизованные моноклональные антитела против гетеродимера кальпротектина (S100A8/A9), иммобилизованные на крупных наночастицах, имеющих диаметры в диапазоне от 150 до 350 нм.
[0038] Поскольку кальпротектин встречается преимущественно в физиологических жидкостях и фекалиях в форме гетеродимера, агглютинация не должна разрушать эти комплексы. Кажется, что крупные наночастицы в диапазоне от 150 до 350 нм делают агглютинацию кинетически зависимой от поверхности («двумерной»), так что мутность становится однородной и имеющей метрологически прослеживаемую связь с концентрацией кальпротектина (S100A8/A9), как определено посредством стандартного ELISA. Таким образом, диагностические результаты и оценки являются коммутативными, что является необходимым для работы клинической лаборатории. Следовательно, установленные диагностические значения порога отсечения можно, таким образом, использовать.
[0039] Кратко, диагностические результаты являются сравнимыми и коммутативными с результатами разработанных ELISA с использованием моноклональных антител, в то время как турбидиметрический иммуноанализ является не только гомогенным анализом. Количество кальпротектина (S100A8/A9), присутствующего в образце, можно определять посредством определения агглютинации или непрозрачности/мутности образца по сравнению со стандартом. Анализ можно, таким образом, проводить в любом коммерческом автоматическом анализаторе, таком как Hitachi или Cobas®. Использование рекомбинантных антител и фрагментов является предпочтительным, с учетом необходимых количеств антител.
[0040] Стабилизации кальпротектина во время экстракции из фекалий и после можно достигать посредством Ca2+ в буферах для экстракции и реакции. Однако, биологические образцы (сыворотка, кровь, синовиальная жидкость или фекалии) содержат эндогенный кальций. Использование буфера, мягко хелатирующего ионы кальция, является предпочтительным. Фекальный кальпротектин (S100A8/A9) защищен против протеаз, только когда имеет связанные ионы кальция, в то время как избыток ионов кальция приводит к образованию тетрамеров и олигомеров. По–видимому, кислый буфер секвестрирующий кальций, может стабилизировать и поддерживать гетеродимер кальпротектина (S100A/A9). Стабилизирующий кислый буфер может иметь pH между 5,0 и 6,0, и вплоть до 0,5%, предпочтительно, 0,1%, ионного и анионного поверхностно–активного вещества. Ионное поверхностно–активное вещество может представляет собой SDS, и неионное поверхностно–активное вещество – Tween®20. pH между 5,0 и 6,0, и ионную силу выше 150 мОсм/л наблюдают также в гранулах гранулоцитов, так что условия для солюбилизации и измерения являются сходными со средой в секреторных гранулах.
[0041] В нижеследующем; некоторые термины, как используют в описании, дополнительно объяснены и определены:
[0042] Термин «образец из организма» или «физиологическая жидкость» описывает материал от человека или животного, включая кровь, сыворотку, плазму, фекалии, мочу, слюну, экскреты, жидкости организма и тканей. Образцы из организма представляют собой также экстракты материала и образцов для диагностического обследования или оценки и идентификации медицинского состояния. Образец может представлять собой жидкость или твердое вещество. В случае твердого или полутвердого матрикса (образца фекалий), образец необходимо подвергать экстракции. Можно использовать любой коммерческий набор для экстракции образцов фекалий, например, систему для получения образцов (SSPS), предварительно заполненную IDK Extract® (Immundiagnostik AG, Bensheim, DE), или ее можно проводить вручную с использованием первого компонента реакции, как описано в настоящем описании. Количество, необходимое для проведения турбидиметрического теста, лежит в диапазоне 5–20 мг экстракта фекалий. Образец может представлять собой мочу для исследования заболеваний кишечного тракта, печени, желчного пузыря, поджелудочной железы или почки. Образец может представлять собой кровь, плазму или сыворотку для исследования сердечно–сосудистых заболеваний.
[0043] Калибраторы представляют собой (серийные) растворы с известными концентрациями аналита (кальпротектина) и эквивалентностью, необходимые для точной производительности в лабораторной работе. Для интерпретации силы сигнала и, таким образом, для определения присутствия или концентрации аналита (кальпротектина) в образце, результат для пробы образца из организма сравнивают с результатами, полученными для серийного разведения калибратора.
[0044] Предел детекции определяют как низшее количество аналита, которое можно надежно детектировать в анализе, в котором суммарная ошибка находится в соответствии с требованиями точности. В соответствии с описанным способом, можно получать предел детекции ≤ 10 микрограмм кальпротектина/грамм фекалий, который разумно ниже порога отсечения (50 микрограмм кальпротектина/грамм фекалий) для диагностики воспаления по фекалиям.
[0045] Турбидиметрия представляет собой измерение потери интенсивности пропускаемого света из–за эффекта рассеяния частицами, суспендированными в растворе. Свет известной длины волны (нм) пропускают через кювету, содержащую раствор с частицами, и собирают в фотоэлектрической ячейке. Измеренное значение (мЕд) дает количество поглощенного света. В настоящее время используют два типа турбидиметрических анализа, прямую и усиленную частицами латекса иммунотурбидиметрию (PETIA). При прямой иммунотурбидиметрии, антитела формируют иммунный комплекс путем непосредственного взаимодействия со своими соответствующими антигенами. Усиленный частицами иммунотурбидиметрический способ основан на покрытии наночастиц антителами, в настоящей заявке, двумя мышиными моноклональными антителами против кальпротектина. Усиленные частицами иммунотурбидиметрические анализы оказываются полезными, когда аналит присутствует в низкой концентрации, поскольку частицы усиливают сигнал и обеспечивают увеличенную чувствительность.
[0046] Как правило, используют наночастицы, средний диаметр которых, как правило, измеряется в нанометрах (нм). Размер (диаметры) наночастиц можно надежно определять посредством динамического светорассеяния (DLS), фотонно–корреляционной спектроскопии (PCS) или квазиупругого рассеяния света (QELS). Диаметры, в рамках изобретения, измеряют с использованием Malvern Zetasizer Nano (Malvern Panalaytical Ltd., Malvern, GB) или Horiba SZ–100, где гауссово отклонение от данного среднего меньше 10 нм. Поскольку поверхность наночастицы конъюгирована с биомолекулами (HAS) и, разумеется, иммуноглобулинами (Ig) и моноклональными антителами, диаметры необходимо точно определять и контролировать. Большое соотношение площади поверхности к объему биоконъюгата наночастицы–Ig обеспечивает преимущества для взаимодействия иммуноглобулинов с биомолекулами–мишенями. Получение несущих антитела наночастиц хорошо известно в данной области. Антитела могут абсорбироваться подходящим покрытием на частицах, или могут быть химически связаны с ними посредством образующего мостик средства. Антитела можно также связывать непосредственно с полимером на самой латексной частице. Указанные наночастицы можно хранить перед использованием в буфере, содержащем дигидрат трехосновного цитрата натрия, бычий сывороточный альбумин, Tween 20, сахарозу, азид натрия (буфер для хранения). При использовании буфера для хранения по изобретению, латексные иммуночастицы с моноклональными антителами против кальпротектина являются высоко стабильными в суспензии, т.е. без спонтанной агрегации, в течение периодов вплоть до 12 месяцев при 2–8°C до иммуноанализа, с сохранением в то же время стабильности антитела
[0047] Кальпротектин высвобождается гранулоцитами, и до высвобождения, хранится внутри клеточных гранул, более точно, вероятно, в компартментах транс–Гольджи, не являющихся лизосомами. Уровни ионов кальция в цитозоле и внутри этих кислых компартментов (pH 5,0–6,0) поддерживаются относительно постоянными, где концентрация ионов кальция составляет в 100000 раз ниже, чем снаружи клетки. Является жизненно необходимым для функций гранулоцитов, так же как других клеток, чтобы уровни внутриклеточных ионов кальция находились под строгим контролем. Строгий контроль ионов кальция, доступных для связывания кальпротектином, и pH, вероятно, является критическим, не только для его функций, но также для метрологическии прослеживаемого определения кальпротектина в образцах из организма. Следовательно, необходимо использовать моноклональные антитела против кальпротектина, которые связываются при низком pH. Таким образом, существует необходимость стабилизации растворимой формы кальпротектина во время экстракции из образца матрикса и в растворе для анализа, где происходит иммунореакция и последующая агглютинация. Этого можно достигать посредством добавления вплоть до 0,5%, предпочтительно, 0,1% ионного и неионного поверхностно–активного вещества. Предпочтительным анионным поверхностно–активным веществом является SDS, в то время как в предшествующей области техники, по–видимому, работали преимущественно с неионными поверхностно–активными веществами, такими как Tween®20. pH между 5,0 и 6,0 используют для экстракции, и такой pH наблюдают также в кислых компартментах и гранулах гранулоцитов.
[0048] Для уменьшения неспецифических иммунореакций, образец можно растворять в буферном растворе, содержащем антисыворотку против IgM. Присутствие антисыворотки против IgM может вносить вклад в коррекцию эффекта влияния IgM на иммуноанализ таким образом, чтобы единообразные результаты можно было получать независимо от происхождения образца. Антисыворотка против IgM может содержать эндогенный кальпротектин, так что каждая партия антисыворотки против IgM требует, в зависимости от обстоятельств, коррекции на связанное с IgM–сывороткой содержания кальпротектина.
[0049] Настоящее изобретение, кроме того, относится к тестовому набору для количественного определения кальпротектина. Набор может содержать гомогенные наночастицы, покрытые по меньшей мере одним моноклональным антителом против кальпротектина или фрагментами этого антитела, связывающими при pH между 5,0 и 6,0, где указанные наночастицы имеют диаметры в диапазоне от 160 до 180 нм. Для увеличения чувствительности и диапазона измерений, набор может содержать второй тип гомогенных наночастиц, имеющих другие гомогенные диаметры. Настоящее изобретение относится также к способу количественной детекции кальпротектина в фекалиях, включающему стадии a) экстракции определенного количества фекалий с использованием первого компонента реакции для солюбилизации кальпротектина и получения жидкого образца, гле первый компонент реакции имеет pH 5,0–6,0 и осмоляльность по меньшей мере 150 мОсм/л; b) приведения указанного жидкого образца в контакт с наночастицами, имеющими иммобилизованное по меньшей мере одно моноклональное антитело против кальпротектина (S100A8/A9), связывающее при pH 5,0–6,0; и c) оценки количества кальпротектина в образце посредством турбидиметрии, где диаметры указанных наночастиц лежат в диапазоне от 160 до 350 нм. В предпочтительном варианте осуществления, указанные наночастицы могут представлять собой частицы из карбоксилированного полистирола, и ради чувствительности и диапазона детекции, могут присутствовать два типа наночастиц с гомогенными размерами, гомогенные диаметры которых лежат в диапазоне i) от 150 до 250 нм и ii) от 250 до 350 нм. Латексные частицы могут представлять собой частицы из органических высокомолекулярных материалов, например, латексные частицы из полистирола, сополимера стирола и метакриловой кислоты, сополимера стирола и глицидил(мет)акрилата или сополимера стирола и стиролсульфата.
[0050] Такой тест и способ можно адаптировать для автоматических анализаторов в клинических лабораториях. Способ характеризуется уменьшенной неспецифической агглютинацией благодаря использованию моноклональных антител, которые не являются специфическими для лота и связываются только с одним отдельным эпитопом. В общепринятых турбидиметрических тестах используют птичьи поликлональные антитела (IgY курицы против гетеродимера MRP8/MRP14), которые имеют недостаток спонтанной агрегации в турбидиметрическом анализе. Кроме того, на предшествующем уровне техники используют реакционный буфер при физиологическом pH (3–(N–морфолино)пропансульфоновый (MOPS) буфер с pH 7,2), который не мешает агрегации белков S100A9 и S100A9 в гомо– и гетеромультимеры (Nilsen T et al, A new turbidimetric immunoassay for serum calprotectin for fully automized clinical analysers, J. Inflammation, 2015, 12: 45). То же самое можно наблюдать, когда кальпротектин разводят в буфере при физиологическом pH 8 R1: pH 7,2; R2, pH 8,1), как используют в Bühlmann fCal® turbo, где используют такие же птичьи поликлональные антитела. Однако, турбидиметрический способ и реакция определяют количество молекул (комплекса) – мишеней в растворе, а не количества белка (аминокислот), как это определяют для калибровки способом с использованием биурета. Следовательно, общепринятыми турбидиметрическими способами определения кальпротектина с использованием высокого pH и поликлональных антител можно получать метрологически не прослеживаемые результаты. Коммутативности результатов между общепринятыми способами можно достигать только посредством коэффициентов коррекции (задним числом), что недоступно в повседневной практике клинической лаборатории. Кроме того, возникает изменчивость лотов между различными партиями антител, и очистка с использованием различных лотов антигена кальпротектина в различных партиях является критической.
[0051] В одном варианте осуществления изобретения, наночастицы могут представлять собой латексные частицы. В предпочтительном варианте осуществления, латексные наночастицы представляют собой частицы из карбоксилированного полистирола с размером частиц от 150 до 250 нм (от 250 до 350 нм), поверхностной плотностью заряда от 40 до 60 мкКл/см2; поверхностной плотностью заряда: 150–250 мкEq/г, содержанием твердых веществ 10,0 (%); стабилизированные с использованием 0,05% азида натрия.
[0052] Турбидиметрический способ по изобретению не требует специально разработанного анализатора, поскольку имеет гибкую применимость к общепринятым фотометрическим анализаторам. В соответствии с настоящим изобретением, дополнительные затраты на покупку специально разработанного устройства или расходных материалов больше не являются необходимыми. Способ по настоящему изобретению облегчает полностью автоматизированную переработку, без отнимающего время разделения образца на части, таким образом, обеспечивает более высокую пропускаемость образцов и увеличение эффективности клинической лаборатории. На основании настоящего описания, точная количественная оценка, метрологическая прослеживаемость, коммутативность результатов и дифференциальная диагностика на основании значения порога отсечения (например, 50 микрограмм кальпротектина/грамм фекалий) являются осуществимыми. Это необходимо для терапевтического мониторирования пациентов. Автоматизация и стандартизация являются применимыми и предпочтительными вариантами осуществления, поскольку тестирование вручную включает высокий риск контаминации для пользователя и анализируемого образца.
[0053] Одной целью настоящего изобретения является предоставление усиленного частицами турбидиметрического иммуноанализа, основанного на моноклональных антителах млекопитающих против кальпротектина человека, который устраняет недостаток уменьшенной чувствительности анализа, которому, как правило, подвержены птичьи антитела. Другой целью является анализ для определения кальпротектина, который может являться применимым для любого стандартного химического анализатора, вне зависимости от производителя. Другой аспект относится к буферу для хранения латексных частиц с иммобилизованными антителами, устраняющему естественную тенденцию латексных частиц к спонтанной аггрегации и преципитации при хранении. Описанный реакционный буфер можно также использовать в качестве буфера для хранения.
[0054] Подсчет лейкоцитов и/или измерение C–реактивного белка (CRP) в настоящее время используют для диагностики бактериальной инфекции, требующей лечения антибиотиком. По оценкам, приблизительно 40% таких случаев неправильно классифицируют как бактериальные инфекции и другие причины (XuS et al, Lipocalins as biochemical markers of disease, Biochim Biophys Acto 2000, 1482:298–307). Маркер активации нейтрофилов HNL/NGAL может позволять установление различий между острыми бактериальными и вирусными инфекциями, но он не является целесообразным маркером из–за своей очень низкой концентрации в образцах из организма. Анализ кальпротектина по настоящему изобретению отражает активацию гранулоцитов, и показано, что она повышена при воспалительных состояниях. Однако молекула кальпротектина человека описана как гетеродимер 24 кДа, содержащий субъединицы S100A8 (MRP8) и S100A9 (MRP14), но не существует консенсуса фактической структуры кальпротектина in vivo, в то время как измерение посредством турбидиметрии требует определенных стандарта и молекул. Кальпротектин можно, согласно авторам исследований, обнаружить в форме гетеродимера, гетеротримера или даже гетеротетрамера, когда присутствует кальций. Кальпротектин представляет собой связывающий кальций белок, обнаруженный в нейтрофильных гранулоцитах, который становится доступным в просвете кишечника посредством выделения лейкоцитов, активной секреции, повреждения клеток и гибели клеток. Во время воспаления кишечника, нейтрофильные гранулоциты мигрируют в слизистую оболочку кишечника и увеличивают уровни фекального кальпротектина.
[0055] Уровни фекального кальпротектина коррелируют с гистологической и эндоскопической оценкой активности заболевания при болезни Крона и язвенном колите. Выделение с фекалиями меченных индием–111 нейтрофильных гранулоцитов предложено в качестве «золотого стандарта» активности заболевания при воспалительном заболевании кишечника (IBD). Поскольку пациенты с активными воспалительными заболеваниями кишечника (IBD) могут иметь увеличение вплоть до 10 раз уровней фекального кальпротектина, необходимо коммутативное определение увеличенных концентраций кальпротектина в фекалиях. Фекальный кальпротектин используют также для установления различий между IBD и синдромом раздраженного кишечника. Благодаря его устойчивости к ферментативной деградации, но только, если кальций является связанным, кальпротектин можно экстрагировать и измерять в фекалиях. Кальпротектин может указывать также на другие воспалительные состояния желудочно–кишечного тракта, такие как колоректальный рак, гастроэнтерит и непереносимость пищевых продуктов, но его уровни меняются, в зависимости от возраста, и в разные сутки у одних и тех же индивидуумов. Сывороточный кальпротектин является полезным маркером воспаления для диагностики сепсиса и острого аппендицита. Однако не существует международного стандарта кальпротектина. Таким образом, разработанные внутри страны стандарты для калибровки используют для исключения неточных определений из–за изменчивости между партиями. Это приводит также к различиям уровней стандартов между производителями, в зависимости от выбранного способа.
[0056] Однако определение кальпротектина, как описано, обеспечивает метрологически прослеживаемые результаты. Один смежный аспект, таким образом представляет собой подтверждение производительности турбидиметрического анализа посредством кальпротектиновых калибраторов от 0 до 2000 мкг/мл образца, которое является необходимым для преодоления высокой изменчивости содержания кальпротектина среди различных биологических образцов. Большой диапазон исключает избыточные прогоны или проблемы избытка антигена, и может быть достигнут с использованием описанного способа.
[0057] На фигуре 1 показана калибровочная кривая для покрытых моноклональным антителом мыши латексных частиц. Значения оптической плотности (ось Y) соответствуют значениям кальпротектина в микрограммах кальпротектина/г фекалий (ось X). Результаты поддерживают единообразное поведение в диапазоне от 0 до 2000 мкг/г Производительность иммуноанализа теряет линейность, когда концентрации кальпротектина в образце превышают 2000 мкг/г фекалий, как показано на фигуре 2.
[0058] Иммуночастицы по изобретению покрыты моноклональными антителами мыши, полученными против кальпротектина MRP8/MRP14. В то время как птичьи антитела являются менее реакционноспособными по отношению к ревматоидному фактору или антителам человека против IgG мыши, или к человеческой системе комплемента (см. EP 1 573 335 B1) – хорошо известным причинам ошибочного измерения – поликлональные птичьи антитела являются менее специфическими, чем моноклональные антитела млекопитающих. Другой целью настоящего изобретения, таким образом, является предоставление турбидиметрического анализа кальпротектина на основе высоко специфических антител без недостатка неспецифической реакционной способности. Это достигнуто посредством системы анализа по настоящему изобретению.
[0059] Чувствительные способы измерения кальпротектина являются доступными. Однако доступные анализы ELISA ассоциированы с длительными периодами обработки теста и являются более трудоемкими, чем турбидиметрические анализы. Настоящее изобретение относится к системе анализа, где образцы можно перерабатывать при их поступлении в лабораторию, так чтобы любое медицинское состояние, ассоциированное с увеличенными уровнями кальпротектина, можно было диагностировать своевременно. Пригодность турбидиметрического способа тестировали на 36 образцах фекалий и устанавливали корреляцию со стандартным анализом ELISA в качестве эталона. На фигуре 3 показана корреляция между турбидиметрическим анализом с использованием одного размера покрытых моноклональным антителом частиц и анализом ELISA для определения кальпротектина. Для турбидиметрического анализа использовали приложение Hitachi 912, в соответствии с руководством производителя. Статистический анализ выявил коммутативные результаты, таким образом, подтверждая пригодность описанного способа для определения кальпротектина в фекалиях (регрессия P/B Y=0,914 * X – 21,403; мед. (95)=212,169; n=36; r=0,9018, t=0,7693). Следует отметить, что коэффициент корреляции r лежит в диапазоне от –1 (0) до 1. Значение 1 показывает, что взаимосвязь между X и Y точно описывается линейным уравнением. Значение 0 относится к нелинейной корреляции между переменными.
[0060] В следующем эксперименте, в котором латексные частицы одного размера покрывали двумя различными моноклональными антителами против кальпротектина, турбидиметрический способ тестировали с использованием 36 образцов фекалий, и устанавливали корреляцию результатов определения со стандартным анализом ELISA в качестве эталона. На фигуре 4 показана корреляция измерений турбидиметрического анализа с использованием одного и двух моноклональных антител, и соответствующего ELISA для кальпротектина. Статистический анализ этих анализов не выявил значимых различий между использованием одного (фиг. 3) или двух антител (фиг. 4). Небольшое увеличение чувствительности анализа с использованием двух антител, вероятно, связано с более высокой интенсивностью сигнала из–за увеличенной нагрузки антитела (регрессия P/B Y=1,063 * X – 22,849; мед. (95)=258,068; n=36; r=0,9023, t=0,7781).
[0061] Кроме того, латексные частицы одного размера покрывали a) двумя моноклональными антителами и b) одним отдельным моноклональным антителом (mAB No. 1062, 1067, 1068, 1089 от Immundiagnostik AG, Bensheim, DE). 39 образцов фекалий подвергали экстракции и инкубировали с латексными частицами в каждом из условий. Проводили турбидиметрический анализ по изобретению, в обоих условиях, с использованием приложения Hitachi 912. На фигуре 5 показан анализ корреляции турбидиметрического анализа (регрессия P/B Y=1,151 * X+0,0; мед. (95)=39,409; n=39; r=0,9989; t=0,9605). Дополнительные эксперименты, привели в результате к сходным статистическим значениям, как показано в таблице 1.
ТАБЛИЦА 1
[0062] Производительность турбидиметрического анализа с использованием иммуночастиц двух различных размеров (гетерогенных), покрытых одним моноклональным антителом, тестировали в 36 образцах фекалий и устанавливали корреляцию со стандартным анализом ELISA в качестве эталона. Для турбидиметрического анализа использовали приложение Hitachi 912, в соответствии с руководством производителя. На фигуре 6 показан анализ корреляции турбидиметрического анализа. Статистический анализ теста выявил коммутативные результаты, таким образом, подтверждая способ точного определения кальпротектина в фекалиях (регрессия P/B Y=1,102 * X – 24,963; мед. (95)=289,067, n=36; r=0,9012; t=0,7847).
[0063] Турбидиметрический способ тестировали далее и измерения кальпротектина проводили с использованием латексных частиц двух различных размеров (гетерогенных), и сравнивали со способом с использованием частиц одного размера (гомогеннных). Латексные частицы 250 нм и 175 нм покрывали одним моноклональным антителом против кальпротектина. Образцы с концентрациями кальпротектина в диапазоне от 0 до 2000 мкг/г использовали в качестве калибраторов для турбидиметрического анализа с использованием приложения Hitachi 912, в соответствии с инструкциями производителя. Как показано в таблице 2 (мЕд (mA): оптическая плотность в миллиединицах), производительность анализа с использованием латексных частиц двух различных размеров приводит к увеличенной чувствительности определения, по сравнению с частицами одного размера. Соответственно, комбинация по меньшей мере двух размеров частиц может приводить к улучшению диапазона детекции кальпротектина, по сравнению с использованием частиц одного размера.
[0064] Латексные наночастицы имеют тенденцию к самоагрегации. Описанный буфер для хранения может содержать дигидрат трехосновного цитрата натрия, при pH 5,0, бычий сывороточный альбумин, 1% SDS, сахарозу, азид натрия. Буфер для хранения по настоящему изобретению вносит вклад в увеличение стабильности при хранении латексных иммуночастиц в течение длительных периодов времени. Описание стабильности иммуночастиц означает, что спонтанная агрегация (помутнение) латексных частиц уменьшена таким образом, что второй компонент реакции можно хранить вплоть до 12 месяцев при 2–8°C до использования. Буфер для хранения обеспечивает стабильность частиц при 37°C в течение нескольких суток. Не только агрегация является уменьшенной, но также стабильность антитела может быть продлена, что приводит к значениям измерений, в значительной степени независимым от условий хранения.
ТАБЛИЦА 2
[0065] В таблице 3 показаны значения оптической плотности (мЕд), измеренные на сутки хранения 1 и 30 при 2–8°C с использованием иммуночастиц, покрытых двумя моноклональными антителами, в турбидиметрическом анализе по изобретению. Иммуночастицы i) хранили при 2–8°C в течение 30 суток и ii) хранили при 37°C в течение 3 суток и дополнительные 30 суток при 2–8°C. Принимая во внимание, что моноклональные антитела являются чувствительными к температуре, это позволяет предполагать, что буфер для хранения по настоящему изобретению вносит вклад в точное определение кальпротектина на различных уровнях, а именно, в агрегацию иммуночастиц и стабильность связанного с частицами антитела.
ТАБЛИЦА 3
[0066] Если аналит превышает определенную концентрацию в образце, происходит насыщение антитела, с последующим уменьшением агрегации. Уменьшенная агрегация приводит к меньшей интенсивности сигналов. Этот эффект описан как «избыток антигена» и может приводить к неправильной интерпретации ложно низких значений и к неправильным диагностическим заключениям. Как описано, избыток антигена–мишени не обязательно мешает турбидиметрическому определению, поскольку наночастицы оптимально диспергированы и отделены друг от друга, также из–за их заряженных поверхностей, оставляя полную поверхность частицы свободной для связывания антигена. Увеличения связывающей емкости антитела достигают посредством описанного буфера для хранения частиц и тестовой реакции.
[0067] В предпочтительном варианте осуществления, способ по изобретению осуществляют с использованием покрытых антителами наночастиц с размерами в диапазоне от 150 до 350 нм. Предшествующий уровень техники дает информацию, что наночастицы для турбидиметрических иммуноанализов не могут иметь более 140 нм в диаметре, поскольку увеличение размера частиц может коррелировать с неспецифической агрегацией, в частности, латексных частиц. Эта информация, однако, должна относиться к частицам, несущим менее специфические или перекрестно–реагирующие поликлональные антитела. Настоящее изобретение, однако, относится к наночастицам, имеющим диаметры от 150 до 350 нм и к тому, что крупные частицы вносят вклад в точное определение. Достигнуто также усиление реакции между моноклональным антителом и антигеном–мишенью (кальпротектином), благодаря увеличенной площади взаимодействия и поскольку реакция является частично зависимой от поверхности. Важно, что увеличение размера не ассоциировано с высокой степенью спонтанного помутнения.
[0068] В данной области, однако, не существует надежных способов увеличения чувствительности измерения и ускорения диспергирования суспендированных латексных частиц без нарушения иммунологической реакции. Способ по изобретению решает эту проблему посредством использования композиции буфера (тестового буфера или первого компонента реакции), содержащей цитрат натрия, pH 5,0–6,0, 150 мМ NaCl, бычий сывороточный альбумин, SDS/Tween® 20, сахарозу, азид натрия. Способ по настоящему изобретению можно использовать в комбинации с коммерчески доступными буферами для экстракции фекалий (например, IDK Extract® Immundiagnostik AG, Bensheim, DE), если смешать их с первым компонентом реакции R1. Для сравнения, различные концентрации кальпротектиновых калибраторов от 0 до 2000 мкг/г по отдельности разводили в тестовом буфере, как описано, и в буфере IDK Extract®. Иммунотурбидиметрические анализы проводили с использованием двух различных моноклональных антител, связанных с латексными частицами. Как показано в таблице 4, поддающееся измерению увеличение чувствительности детекции можно достигать с использованием тестового буфера (mA: значения оптической плотности в миллиединицах), что указывает на «более доступные молекулы–мишени» и меньшее формирование мультимеров.
[0069] Для следующего сравнения, 20 образцов фекалий по отдельности подвергали экстракции с использованием тестового буфера по изобретению и коммерчески доступного буфера для экстракции от Bühlmann (Bühlmann fCal Turbo®), имеющего измеренный физиологический pH 7,2 (Bühlmann Laboratories AG, Basel, Switzerland). Турбидиметрический анализ проводили, как описано выше, с использованием приложения Hitachi 912, в соответствии с инструкциями производителя. Значения оптической плотности в любых условиях коррелировали друг с другом. Статистический анализ показал корреляцию между обоими условиями (регрессия P/B Y= 1,004 * X – 1,552; мед. (95)= 30,37; n= 20; r=0,9932; t=0,9524). Тестовый буфер по изобретению, таким образом, обеспечивал по меньшей мере настолько же хорошую экстракцию фекального кальпротектина, как коммерчески доступные буферы, но обеспечивал преимущество уменьшенной неспецифической агрегации иммуночастиц.
ТАБЛИЦА 4
[0070] Фекалии содержат около 75% воды, и оставшаяся твердая фракция содержит 84–93% органических твердых веществ. Эти органические твердые вещества состоят из: 25–54% бактериальной биомассы, 2–25% белка или азотсодержащего вещества, 25% углеводов или непереваренного растительного материала и 2–15% липидов. Эти пропорции значительно меняются в зависимости от диеты и массы тела. Остальные твердые вещества состоят из фосфатов кальция и железа, кишечных секретов, эпителиальных клеток и слизи. Компоненты образцов из организма, в частности, фекалий, могут представлять источник помех, влияющий на чувствительность иммуноанализов и PETIA. Такие помехи могут приводить, например, к отрицательным значениям оптической плотности. Посредством способа по настоящему изобретению, помехи из–за вышеописанных компонентов образцов фекалий уменьшены.
[0071] Иммуноглобулин M (IgM) представляет собой основное антитело, продуцируемое B–клетками. IgM является самым крупным антителом в системе кровообращения человека и первым антителом, появляющимся в ответ на первоначальное воздействие антигена. Присутствие антисыворотки IgM может вносить вклад в учет помех, связанных с матриксом образца. Однако антисыворотка IgM может содержать эндогенный кальпротектин. Рекомендован анализ каждой партии антисыворотки IgM. В таблице 5 показаны значения оптической плотности мЕд, полученные посредством турбидиметрических измерений кальпротектиновых калибраторов и образцов фекалий, разведенных в компонентах реакции, с добавлением или без добавления антисыворотки IgM. Отрицательные значения оптической плотности отбрасывали, и достигли общего увеличения чувствительности и надежности детекции.
ТАБЛИЦА 5
ПРИМЕРЫ
ПРИМЕР 1 Получение иммуночастиц против кальпротектина
[0072] Использовали латексные частицы от хорошо известных производителей, например, MERCK, Bangs Laboratories. Латекс представлял собой карбоксилированный полистирол или хлорметильный латекс. Латексные частицы имели следующие параметры: поверхностная плотность заряда 62 мкКл/см2; поверхностная плотность заряда 163 мкEq/г пол.; содержание твердых веществ 9,0%, стабилизированные с использованием 0,05% азида натрия. Иммуночастицы получали посредством ковалентного присоединения очищенных моноклональных антител мыши (mAB 1062, 1067, 1069, 1089 и связывания в первом компоненте реакции), нацеленных против очищенного кальпротектина человека из гранулоцитов с интактными лизосомальными мембранами. Частицы из карбоксилированного полистирола имели, предпочтительно, однородный размер (175 нм). Альтернативно, наночастицы двух различных размеров (160–175 нм и 250–275 нм) покрывали одним моноклональным антителом (см. фигуру 6). Также, латексные частицы одного размера 175 нм покрывали двумя различными моноклональными антителами.
[0073] Частицы сохраняли до использования в буфере для хранения, содержащем цитрат натрия, pH 5,0–6,0, 50 мМ малеатный буфер, pH 5,0, 150 мМ NaCl, бычий сывороточный альбумин, 150 мМ сахарозу, азид натрия, при 2–8°C.
ПРИМЕР 2 Экстракция образцов фекалий
[0074] образцы фекалий подвергали экстракции следующим образом. Каждые 15 мг фекалий разводили 1:100 в 1,5 мл буфера. Пустые пробирки для образцов заполняли 1,5 мл тестового буфера, 50 мМ малоеат pH 5,0, 150 мМ NaCl, азид натрия, 0,1% додецилсульфат натрия, бычий сывороточный альбумин, в присутствии или в отсутствие антисыворотки IgM. Для сравнения, образцы также подвергали экстракции с использованием готового к применению буфера для экстракции IDK Extract® (кат. No. K 6967) и буфера для экстракции Bühlmann fCal Turbotm при комнатной температуре. Образцы фекалий сбирали и хранили вплоть до 48 час при 2–8°C. В течение длительных периодов (вплоть до 12 месяцев) рекомендовано хранение при –20°C. В начале турбидиметрического анализа, замороженные образцы медленно размораживали, предпочтительно, при 2–8°C. В некоторых случаях, гетерогенные образцы гомогенизировали механически. Для сбора образцов использовали систему переработки образцов (SAS) фекалий IDK® Stool Sample Application System (SAS) (кат. No. K 6998SAS). Наконечник щупа SAS, имеющий зарубки, удерживающие фиксированное количество необработанного материала, вставляли в образец фекалий. Щуп помещали обратно в пробирку с буфером для экстракции. При помещении щупа обратно в пробирку, избыток материала смывали. Затем 15 мг образца фекалий, оставшегося в щупе, разводили в буфере для экстракции. Пробирки плотно закрывали и хорошо встряхивали, пока в зарубках не переставал оставаться образец фекалий. 10 минут было необходимо, чтобы позволить образование осадка. Убедившись, что осадок не диспергируется снова, экстрагированный образец разводили 1:25 в тестовом буфере. Например, 40 мкл экстрагированного образца фекалий добавляли к 960 мкл тестового буфера.
ПРИМЕР 3 Турбидиметрический иммуноанализ кальпротектина
[0075] Образцы, экстрагированные с использованием любого буфера для экстракции, как описано выше, использовали для турбидиметрического определения с использованием приложения Roche Hitachi 912, в соответствии с рекомендациями производителя. 10 мкл экстрагированного образца добавляли к 200 мкл тестового буфера и 50 мкл буфера для хранения, содержащего цитрат натрия pH 5,0, бычий сывороточный альбумин, Tween 20, сахарозу, азид натрия. Автоматический анализатор осторожно перемешивал иммуночастицы с экстрагированными образцами во время инкубации при 37 градусов Цельсия в течение 5 минут. Второй компонент реакции с частицами, несущими иммобилизованные моноклональные антитела, добавляли при осторожном перемешивании. Время агглютинации составляло 5 минут при 37 градусов Цельсия, в это время измеряли оптическую плотность. Измерения проводили в двух повторах. Значения оптической плотности представляли собой считывания, полученные при длине волны 570 нм.
[0076] Коммерчески доступный кальпротектин разводили в цитратном буфере pH=5,4 в диапазоне от 0 до 2000 мкг/г. (6 точек калибровки) для калибровки турбидиметрического анализа. Получили линейный диапазон от 30 до 2000 мкг/г.
[0077] Образцы фекалий с известными количествами кальпротектина использовали в качестве контрольных и тестируемых образцов. Образцы, содержащие кальпротектин, разводили 1:100 в реакционном буфере, получая диапазоны измерений от 0,1 до 20 мкг кальпротектина в 1 г фекалий. Принимая во внимание коэффициент разведения, фактический диапазон измерений составлял вплоть до 2000 мкг/г.
[0078] Диапазон эталонных значений для 1 г фекалий является эквивалентным 1 мл. Медианное значение у здоровых взрослых составляет приблизительно 25 мкг кальпротектина/г фекалий. Образцы с концентрацией кальпротектина ниже 50 мкг/г считали отрицательными. Образцы с концентрацией кальпротектина между 50 мкг/г фекалий и 100 мкг/г фекалий считали погранично положительными. Образцы с концентрацией кальпротектина выше 100 мкг/г фекалий считали положительными.
ПРИМЕР 4 Анализ ELISA кальпротектина
[0079] ELISA IDK® кальпротектина (MRP8/14) выбран для сравнения с турбидиметрическим способом определения по изобретению. В анализе используют способ двухсайтового сэндвича с двумя избранными моноклональными антителами, которые связываются с кальпротектином человека. Калибратор, контрольные образцы и разведенные образцы от пациентов добавляют в лунки микропланшета, покрытого моноклональным антителом против кальпротектина человека. В ходе первой стадии инкубации, иммобилизованные молекулы антитела связывают кальпротектин в образцах. Затем меченный пероксидазой конъюгат добавляют в каждую лунку, и формируется комплекс. Тетраметилбензидин (TMB) используют в качестве субстрата для пероксидазы. Наконец, кислый стоп–раствор добавляют для остановки реакции. Окраска изменяется от синего до желтого в присутствии кальпротектина.
[0080] Интенсивность окраски была прямо пропорциональной концентрации кальпротектина в образце. Образцы оценивали количественно применительно к их оптической плотности. Общую калибровочную кривую с использованием кальпротектинового калибратора строили в каждом тесте. Выполняли два повтора. Оптическую плотность измеряли немедленно с использованием считывателя для ELISA при 450 нм против 620 нм (или 690 нм) в качестве контроля. Альтернативно, оптическую плотность измеряли при 405 нм против 620 нм в качестве контроля, когда экстинкция наивысшего стандарта превышала диапазон фотометра. Следует отметить, что интенсивность изменения окраски является чувствительной к температуре. Способы соответствовали протоколам ELISA IDK® кальпротектина (MRP8/14) от Immundiagnostik AG, Bensheim, Germany).
[0081] Сравнительные результаты оценивали с использованием программного обеспечения Analyse–it для Excel (Analyse–It Software, Ltd, Leeds UK). Подбор соответствия с помощью регрессии по Пассингу–Баблоку использовали для анализа коммутативности турбидиметрических анализов (и ELISA).
[0082] В общем, настоящее изобретение относится к иммунотурбидиметрическому анализу кальпротектина, в частности, для определения кальпротектина в фекальном матриксе или в сыворотке и других жидкостях и образцах из организма, основанному на моноклональных антителах млекопитающих, специфических для кальпротектина в форме, в которой он присутствует в кислых гранулах нейтрофильных гранулоцитов. Такие моноклональные антитела образуются против субъединиц кальпротектина при низком pH, а также связывают эти субъединицы при данном pH. Специфическая калибровка аналита кальпротектина является необходимой, поскольку этот аналит может подвергаться (само)агрегации и формировать комплексные мультимеры в присутствии кальция, что мешает турбидиметрическому измерению. Метрологическая прослеживаемость и коммутативность результатов необходима в работе клинической лаборатории. Авторы настоящего изобретения обнаружили, что описанные моноклональные антитела мыши связывают кальпротектин преимущественно в форме гетеродимера (S100A8/A9), и что формирование мультимеров можно ингибировать посредством органического буфера, координирующего ионы кальция. Рекомендовано присутствие поверхностно–активного вещества, и наиболее предпочтительным является добавление анионного поверхностно–активного вещества, поскольку субъединицы кальпротектина имеют pI 6,1 и 6,3, и иммунотурбидиметрическую реакцию проводят при pH ниже 6,0, предпочтительно, при pH между 5,0 и 6,0. Компоненты реакции должны иметь осмоляльность выше 150 мОсм/кг для дальнейшей агглютинации. Доказана метрологически прослеживаемая связь и коммутативность результатов с другими общепринятыми иммуноанализами с использованием моноклональных и поликлональных антител (но с использованием общепринятых буферов при физиологическом pH).
Группа изобретений относится к турбидиметрическому иммуноанализу. Раскрыт способ измерения in vitro присутствия кальпротектина в биологическом образце от пациента с помощью турбидиметрического иммуноанализа с усилением частицами латекса, включающий стадии сбора предопределенного количества указанного биологического образца; экстракции указанного биологического образца в предопределенном количестве водного органического буфера, и гомогенизации матрикса указанного биологического образца с последующим удалением любого материала в форме частиц для получения раствора образца с присутствием солюбилизированного гетеродимерного кальпротектина; смешивания определенного количества полученного раствора с некоторым количеством реагента, содержащего наночастицы, имеющие иммобилизованные два или более моноклональных антител или их фрагментов, специфически связывающих кальпротектин для получения реакции связанное с частицами антитело–антиген для кальпротектина, который присутствует как гетеродимер S100A8 и S100A9; инкубации смеси; получения оптических свойств смеси и определения сигнала, показательного для содержания кальпротектина, на основании оптических свойств смеси; установления связи указанного содержания с калиброванным контролем и оценки клинического состояния указанного пациента на основании измеренного присутствия кальпротектина в указанном биологическом образце. Также раскрыт тестовый набор для осуществления описанного выше способа. Группа изобретений обеспечивает преимущество, что используемые реагенты создают окружение, которое является физиологически сходным с окружением, в которое гранулоциты высвобождают свой физиологический кальпротектин. 2 н. и 10 з.п. ф-лы, 6 ил., 5 табл., 4 пр.
1. Способ измерения in vitro присутствия кальпротектина в биологическом образце от пациента с помощью турбидиметрического иммуноанализа с усилением частицами латекса, включающий стадии:
a) сбора предопределенного количества указанного биологического образца;
b) экстракции указанного биологического образца в предопределенном количестве водного органического буфера, имеющего i) pH между 5,0 и 6,0, ii) осмоляльность по меньшей мере 150 мосмоль/кг H2O, iii) 0,01–0,1% процента по массе анионного поверхностно–активного вещества, iv) где органический буфер является координирующим и секвестрирующим ионы кальция и цинка, и гомогенизации матрикса указанного биологического образца с последующим удалением любого материала в форме частиц для получения раствора образца с присутствием солюбилизированного гетеродимерного кальпротектина;
c) смешивания определенного количества раствора указанного образца со стадии (b) с некоторым количеством реагента, содержащего наночастицы, имеющие иммобилизованные два или более моноклональных антител или их фрагментов, специфически связывающих кальпротектин для получения реакции связанное с частицами антитело–антиген для кальпротектина, который присутствует как гетеродимер S100A8 и S100A9;
d) инкубации смеси со стадии c) в течение некоторого интервала времени; и
e) получения оптических свойств смеси и определения сигнала, показательного для содержания кальпротектина, на основании оптических свойств смеси;
f) установления связи указанного содержания с калиброванным контролем и оценки клинического состояния указанного пациента на основании измеренного присутствия кальпротектина в указанном биологическом образце.
2. Способ по п.1, где стадия e) получения оптических свойств включает определение значения оптической плотности, светопроницаемости, отражения, светорассеяния, флуоресценции или сцинцилляции.
3. Способ по п.1, включающий применение наночастиц, имеющих диаметры от 150 до 350 нм, для увеличения чувствительности.
4. Способ по п.3, где антитела являются связанными с двумя типами частиц, имеющих диаметры в диапазоне i) от 150 до 200 нм и ii) от 250 до 350 нм, для увеличения диапазона измерений.
5. Способ по любому из пп.1–4, где указанные частицы представляют собой частицы из карбоксилированного полистирола или активированного хлорметилом полистирола.
6. Способ по любому из пп.1–5, где биологический образец представляет собой фекалии или экстракт фекалий.
7. Способ по любому из пп.1–6, где композиция буфера составлена из по меньшей мере одной соли, выбранной из группы, содержащей соли поликарбоновых кислот, трикарбоновых кислот, аконитовых кислот, трикарбаллиловых кислот, дикарбоновых кислот, щавелевой кислоты, малоновой кислоты, янтарной кислоты, глутаровой кислоты, адипиновой кислоты, пимелиновой кислоты, альфа–, бета– и гамма–гидроксикарбоновых кислот, гидроксидикарбоновых кислот, яблочной кислоты, лимонной кислоты, винных кислот, малоновой кислоты, глюконовой кислоты, 5–кетоглюконовой кислоты, 2–кетоглюконовой кислоты, дигидроксималеиновой кислоты, малеиновой кислоты, фумаровой кислоты, нитрилотриуксусной кислоты, молочной кислоты и/или аскорбиновой кислоты.
8. Способ по любому из пп.1–7, где реакцию связанное с частицами антитело–антиген проводят в смеси, имеющей pH между 5,0 и 6,0 и содержащей анионное поверхностно–активное вещество или додецилсульфат натрия и координированные посредством Ca2+ молекулы буфера.
9. Способ по п.8, где буфер для секвестрирования кальция со стадии b) содержит по меньшей мере одну соль из цитрата, ацетата или малеата, обработанный протеазами сывороточный альбумин и 0,01–0,1 процента по массе анионных поверхностно–активных веществ.
10. Способ по любому из пп.1–9, включающий добавление или присутствие неспецифической антисыворотки IgM.
11. Способ по любому из пп.1–6 и 8–10, где указанный биологический образец представляет собой кровь, сыворотку или плазму.
12. Тестовый набор для осуществления способа по п.1 измерения присутствия гетеродимерного кальпротектина в биологическом образце посредством турбидиметрического иммуноанализа с усилением частицами латекса, содержащий первый водный реагент–компонент, содержащий
– 20–1000 ммоль/л органического буфера с pH в диапазоне от 5,0 до 6,0, который координирует и секвестрирует ионы кальция и цинка;
– 50–300 ммоль/л соли натрия, калия или лития;
– 0,1–1,5% обработанного протеазами сывороточного альбумина;
– 0,01–0,1% масс./об. додецилсульфата натрия, и
бета–альдозы, триозу, тетрозы, пентозы, гексозы, глюкан, декстран и/или сахар для достижения осмоляльности по меньшей мере 200 мосмоль/л; и
второй реагент–компонент, содержащий 0,01–0,5% масс./об. латексных частиц диаметром от 150 до 350 нм, несущих два или более иммобилизованных моноклональных антител или их фрагменты, которые связывают гетеродимерный кальпротектин.
| US 20060134705 A1, 22.06.2006 | |||
| US 20120322163 A1, 20.12.2012 | |||
| EA 201391634 A1, 29.01.2016 | |||
| NILSEN T | |||
| et al | |||
| A novel turbidimetric immunoassay for fecal calprotectin optimized for routine chemistry analyzers // J | |||
| Clin | |||
| Lab | |||
| Anal., 2016, V.31, pp.1-6. |
