Прогнозирование эффективности применения лучевой терапии Российский патент 2022 года по МПК G01N33/574 G01N33/49 C12Q1/6886 

Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторной и молекулярной диагностике, онкологии и лучевой терапии, и предназначено для прогнозирования эффективности лучевой терапии у детей с диффузно растущими глиомами ствола мозга. Способ прогнозирования эффективности лучевой терапии у пациентов с детскими диффузными срединными глиомами (ДГСМ), включает исследование периферической крови, в качестве «жидкостной биопсии», где по циркулирующей в плазме крови опухолевой ДНК (цоДНК) оценивается концентрация мутантной формы BRAF(V600E) и ее изменение в процессе лечения. Повышение концентрации в жидкостной биопсии мутантной формы BRAF(V600E) в процессе лечения коррелирует с лучшим прогнозом.

Наиболее частым патологическим процессом в области ствола мозга у детей являются опухоли (ОСГМ). Удельный вес этой патологии среди всех новообразований ЦНС в детском и подростковом возрасте составляет от 10 до 15%, но, в то же время, она является причиной смерти около 40% всех детей, заболевших опухолями головного мозга [Ostrom Q.T. et al., 2014]. Пик заболевания приходится на 7-8 лет, частота заболеваний примерно одинакова для лиц обоего пола [Щербенко О.И. и соваторы, 2014]. В 80% случаев ОСГМ локализуются в области моста и растут инфильтративно [Кит О.И. и соваторы, 2017]. Значительно реже, в 15-20% случаев, ОСГМ растут преимущественно экзофитно, обозначаясь как задние экзофитные цервико-медуллярные глиомы и очаговые тектальные глиомы. Инфильтративно растущие ОСГМ являются наиболее тяжелой формой патологии. Радикальное хирургическое лечение этих опухолей сопровождается риском тяжелой инвалидизации и даже смерти больного, так как они расположены близко к ядрам черепно-мозговых нервов и проводящим путям, находящимся в области ствола. Возможность получение биопсийного материала также крайне ограничена, а ребиопсия во время прогрессирования практически не возможна [Pfaff Е. et al., 2019; Щербенко О.И. и соваторы, 2019; Panditharatna Е., et al., 2018]. В связи с этим крайне актуальным/важным является поиск не инвазивных методов, позволяющих получить клинически важную информацию о генетическом статусе опухоли, таких метод «жидкостной биопсии».

Основным методом лечения ОСГМ в настоящее время являются лучевая и химиолучевая терапия, но у большинства больных достигаемый эффект имеет временный характер: через различные интервалы времени опухоль возобновляет рост и двухлетний срок переживают только 10-15% больных [Guillamo J.S. et al., 2001; Veldhuijzen van Zanten D.S.E.M. et al., 2017]. В ситуации, когда после короткого периода относительного благополучия, достигнутого в результате лучевой терапии, наступает ухудшение состояния ребенка, перед врачом встает сложная проблема оказания реальной помощи больному. Поиск наиболее рациональных и эффективных вариантов оказания помощи таким детям определяет актуальность исследования. Достигнутые в последние годы успехи в использовании молекулярно-генетических характеристик опухоли для диагностики и прогнозирования течения эмбриональных опухолей мозга [Kumar R. et al., 2018] дают надежду для достижения прогресса и при глиальных опухолях. Становится реальной перспектива использования информации о молекулярных особенностях глиом для прогнозирования течения, индивидуализации тактики и создания таргетных препаратов.

Проведенные в последние годы молекулярно-генетические исследования опухолей мозга позволили выявить ряд полезных для диагностики и планирования лечения маркеров при различных морфологических вариантах. Роль одного из важных молекулярных маркеров в нейроонкологии отводится гену BRAF. Протоонкоген BRAF - часть семейства сериновых/треониновых протеинкиназ, которые участвуют в MAPK/ERK сигнальном пути, регулируют клеточную дифференцировку, пролиферацию и миграцию [Roberts P.J. et al., 2007] и играют важнейшую роль в патогенезе различных видов рака. В нейроонкологии, наиболее диагностически ценными являются следующие мутации в гене BRAF: соматическая точечная мутация BRAF-V600E и соматическая fusion-мутация - генов KIAA1549-BRAF. Мутации BRAF-V600E чаще всего встречаются в плеоморфной ксантоастроцитоме, ганглиоглиоме, эпителиоидных глиобластомах и глиомах, диагностированных в более молодом возрасте. Мутация V600E присутствует у 15% диффузно инфильтративных педиатрических астроцитом II-IV степени злокачественности [Santiago-Dieppa D.R., et al, 2018]. Частота обнаружения мутации возрастает до 25% в педиатрических и взрослых ганглиоглиомах и достигает рекордного максимума - около 80% в плеоморфных ксантоастроцитомах [Veldhuijzen van Zanten S.E. et al., 2016]. Мутации BRAF-V600E, распространена в подмножестве глиом и может представлять собой потенциальный прогностический маркер. По данным мета- исследования [Нuу Gia Vuong et al., 2018], основанного на анализе 11 статей и 1308 пациентов с глиомой, было показано, что мутация V600E в гене BRAF связана с улучшением общей выживаемости (OS) у пациентов (HR=0,60; 95% CI=0,44-0,80). Результаты для выживаемости без прогрессирования (PFS), однако, не были статистически значимыми (HR=1.39; 95% CI=0.82-2.34). При разделение пациентов по группам, основанным на возрасте, наличие мутации V600E в гене BRAF ассоциировалось с улучшение выживаемости у детей и в группе молодых взрослых (до 35 лет), но не имело прогностического значения у пожилых пациентов. Кроме того, мутация V600E BRAF была связана только с благоприятным прогнозом при глиомах более низкой степени злокачественности. Проведенный мета-анализ свидетельствует о том, что мутация V600E в гене BRAF оказывает благоприятное прогностическое влияние на глиомы и ее прогностическая ценность может зависеть от возраста пациента и степени злокачественности опухоли.

В связи с этим нам представилось целесообразным при помощи метода «жидкостной биопсии» по циркулирующей в плазме крови опухолевой ДНК (цоДНК) изучить выявление и динамику концентрации в процессе лучевой терапии мутантной формы BRAF(V600E) при ДГСМ и других локализациях глиом мозга у детей.

Метод разработан в ФГБУ «Российский научный центр Рентгенорадиологии» Минздрава России и основана на оценке изменения уровня концентрации мутантной формы BRAF(V600E) в процессе лучевой терапии методом цифровой капельной ПЦР (ddPCR) в материале жидкостной биопсии.

Задачей изобретения является создание метода, позволяющего прогнозировать эффективность лучевой терапии у пациентов детского возраста с диффузными опухолями ствола головного мозга.

Для решения поставленной задачи в способе прогнозирования эффективности лучевой терапии у пациентов детского возраста с диффузными опухолями ствола головного мозга проводится забор периферической венозной крови в объеме не менее 2,5 мл четыре раза за период лечения. Образцы получают до начала курса лучевой терапии (ЛТ); на 3-5-й день; 14-18 день после начала ЛТ и после окончания ЛТ. Подготовка плазмы и выделение циркулирующей ДНК проводятся в максимально короткие сроки после получения образцов крови, не более 30 минут после забора крови. Скрининг мутации BRAF (V600E) проводится методом цифровой капельной ПЦР (Digital Droplet PCR, ddPCR). Анализ и обработка результатов осуществляется с использованием пакета прикладных программ Microsoft Excel 2013 (Microsoft Corporation, США) и Statistica 10.0 (StatSoft Inc., США). Оценивается динамика изменения концентрации мутантной формы BRAF(V600E) в процессе лучевой терапии, увеличение концентрации BRAF(V600E) в процессе лучевой терапии коррелирует с положительным прогнозом лечения.

Способ осуществляют следующим образом.

Были исследованы 146 образцов плазмы периферической крови, полученные от 60 пациентов, из них у 31 был установлен диагноз ДГСМ и у 29 другие глиальные опухоли головного мозга. Образцы получали до начала курса ЛТ; на 3-5-й; 14-18 день после начала ЛТ и после окончания ЛТ. По результатам проведенной лучевой терапии, пациенты были разделены на две группы: 1-я - наступление рецидива опухоли менее, чем через 6 месяцев после окончания курса ЛТ; 2 - стабилизация процесса, отсутствие рецидива, в течение 6 и более месяцев после окончания курса ЛТ.

Подготовки качественной плазмы проводилась сразу после получения образца крови, время от забора до подготовки составляло не более 30 минут. Подготовку плазмы и последующее выделение циркулирующей ДНК проводили согласно протоколу фирмы производителя, использовали наборы фирмы Sileks на основе частиц SileksMagNA-Direct (избирательное связывание нуклеиновых кислот).

Высокочувствительный скрининг мутации BRAF (V600E) проводили методом Digital Droplet PCR (ddPCR) с использованием наборов BRAF V600E Screening Kit (Bio-Rad, USA) и системы QX100™ Droplet Digital™ PCR System (Bio-Rad, США). Статистическую обработку результатов проводили с использованием пакета прикладных программ Microsoft Excel 2013 (Microsoft Corporation, США) и Statistica 10.0 (StatSoft Inc., США).

При сравнении результатов исследования мутационного статуса по плазме крови 11 больных различными локализациями глиом методом ddPCR и их же гистологических препаратов, полученных в результате операции, методом NGS установлено полное совпадение как положительных, так и отрицательных данных. Это дало основание для использования метода ddPCR при оценке мутационного статуса опухоли по циркулирующей в плазме крови опухолевой ДНК.

В целях выявления возможности прогнозирования течения заболевания, по молекулярно-генетическим признакам нами было проведено исследование динамики содержания опухолевой ДНК в плазме крови больных ДГСМ в процессе лучевой терапии и после ее окончания. Для этого был проведен дискриминантный анализ, в котором в качестве переменных использованы данные о концентрации циркулирующих в плазме крови, как мутантных, так и молекул дикого типа опухолевой ДНК (цоДНК), а также ряд клинических данных. Было установлено, что соотношение концентрация ДНК гена BRAF с мутацией V600E у больных с более благоприятным течением опухоли увеличивается в начале курса радиотерапии и снижается к концу ее. У больных с ранним рецидивом опухоли к концу курса лечения концентрация этого мутантного гена, напротив, не изменяется или возрастает (рис. 1)

Рис. 1. Динамика содержания мутантных форм ДНК гена BRAF в процессе лучевой терапии в зависимости от наличия или отсутствия прогрессирования опухоли.

Полученные данные свидетельствуют, что с помощью метода «жидкостной биопсии» можно определить наличие в плазме крови цоДНК специфичных для глиальных опухолей молекулярно-генетических маркеров и проследить их динамику в процессе лучевой терапии с возможным использованием полученных данных в прогнозировании течения заболевания. Различия в динамике содержания маркеров в процессе лучевой терапии у больных глиомами и ДГСМ могут быть также объяснены большей гетерогенностью структуры ДГСМ. Среди которых присутствуют опухоли лучше поддающиеся ионизирующей радиации, в результате чего на первом этапе концентрация мутировавшей ДНК в плазме крови повышается, а по мере девитализации основной популяции клеток опухоли к концу курса лечения она снижается.

1. Относительная концентрация мутаций BRAF (V600E), в плазме крови больных диффузно растущими опухолями ствола мозга выше, чем при глиомах других локализаций.

2. Повышение концентрации в плазме крови мутантной формы BRAF(V600E) коррелирует с лучшим прогнозом.

3. Динамический контроль концентрации опухолевой ДНК содержащей мутацию BRAFV600E в плазме крови у детей с опухолями головного мозга в процессе лучевой терапии может быть использован для прогноза эффективности ЛТ. На основании анализа динамики уровней концентрации мутантной цоДНК в процессе лечения, возможно предсказание рецидива опухоли после лучевой терапии с достоверностью 96%.

Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторной и молекулярной диагностике, онкологии и лучевой терапии, и может быть использовано для прогнозирования эффективности лучевой терапии у детей с диффузной опухолью ствола головного мозга. Осуществляют забор плазмы периферической крови у пациента до лучевой терапии, на разных этапах курса лучевой терапии и после лучевой терапии. На каждом этапе забора крови при помощи цифровой капельной ПЦР (ddPCR) определяют концентрацию мутантной формы BRAF(V600E). Если концентрация мутантной формы BRAF(V600E) увеличивается в начале курса радиотерапии и снижается к ее концу, то прогнозируют эффективность лучевой терапии. Способ обеспечивает возможность прогнозирования эффективности лучевой терапии у детей с диффузной опухолью ствола головного мозга за счет определения динамики уровней концентрации мутантной формы BRAF(V600E) в процессе лечения. 2 з.п. ф-лы, 1 ил.

1. Способ прогнозирования эффективности лучевой терапии у детей с диффузной опухолью ствола головного мозга, включающий

(а) забор плазмы периферической крови у пациента до лучевой терапии, на разных этапах курса лучевой терапии и после лучевой терапии;

(б) определение при помощи цифровой капельной ПЦР (ddPCR) концентрации мутантной формы BRAF(V600E) на каждом этапе забора крови;

(в) обработка результатов измерения,

если концентрация мутантной формы BRAF(V600E) увеличивается в начале курса радиотерапии и снижается к концу ее, то прогнозируют эффективность лучевой терапии.

2. Способ прогнозирования эффективности лучевой терапии по п. 1, отличающийся тем, что лучевая терапия применяется при диффузно растущих средних глиомах (ДГСМ).

3. Способ прогнозирования эффективности лучевой терапии по п. 1, отличающийся тем, что образцы плазмы периферической крови получали до начала курса лучевой терапии; на 3-5-й; 14-18-й день после начала лучевой терапии и после окончания лучевой терапии.