ХИМЕРНЫЙ ВИРУС РЕПРОДУКТИВНО-РЕСПИРАТОРНОГО СИНДРОМА СВИНЕЙ И ВАКЦИНА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ УКАЗАННОГО ВИРУСА Российский патент 2022 года по МПК C07K14/05 C12N7/00 A61K39/12 

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к химерному вирусу репродуктивно-респираторного синдрома свиней (PRRSV), который может быть использован в качестве вакцины, и химерный вирус по настоящему изобретению имеет низкую патогенность и высокую безопасность по сравнению с его исходным штаммом. Химерный PRRSV-вирус по настоящему изобретению может усиливать секрецию нейтрализующих антител, связанных с перекрестным иммунитетом, и обеспечить вакцину, которая сможет обеспечить эффективную защиту от репродуктивно-респираторного синдрома свиней.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Репродуктивно-респираторный синдром свиней (называемый далее PRRS) представляет собой инфекционное заболевание, наносящее наибольший ущерб свиноводству, наряду с цирковирусной инфекцией свиней и ящуром. PRRS приводит к стерильности у беременных свиней, репродуктивным расстройствам, таким как невынашивание, преждевременные роды или мертворождение, и к респираторным симптомам, таким как чихание, лихорадка и тому подобное, у молочных поросят и свиней в завершающей стадии откорма. Обычно тяжелые респираторные симптомы вызваны вторичными бактериальными или тому подобными инфекциями, развивающимися после инфицирования вирусом, но в случае хронической инфекции происходят уменьшение прибавки веса и повышение смертности без характерных клинических симптомов.

Это вирусное заболевание было впервые обнаружено в 1987 г. в Соединенных Штатах Америки, затем в Европе и в начале 90-х годов XX века было выявлено в Азии. До настоящего времени PRRS был эндемичен для стран с развитым свиноводством и распространился по всему миру, приводя к колоссальным экономическим потерям каждый год.

Возбудителем PRRS является вирус PRRS, принадлежащий к роду Arterivirus, семейству Arteriviridae и порядку Nidovirales. Вирус PRRS имеет геном из положительной смысловой одноцепочечной РНК и размер приблизительно 15,4 тысяч пар оснований (т.п.о.). В геноме вируса PRRS есть девять открытых рамок считывания (ORF) (Conzelmann et al., 1993; Meulenberg et al, 1993). Из них ORF1a и ORF1b, кодирующие неструктурные белки (NSP), составляют приблизительно 80% генома вируса (Bautista et al, 2002; Meulenberg et al., 1993; Snijder and Meulenberg, 1998, 2001). Известно, что из этих неструктурных белков NSP1-альфа, NSP1-бета и NSP2-NSP8 расположены в ORF1a, a NSP9-NSP12 - в ORF1b. ORF2-7, составляющие оставшиеся 20%, кодируют гликозилированные структурные белки GP2, GP3, GP4 и GP5, негликозилированный мембранный белок (М) и белок нуклеокапсида (N). Малые структурные белки GP2, GP3 и GP4 образуют гетеротримеры и действуют при проникновении вируса в клетку-хозяина, а большие структурные белки GP5 и М образуют гетеродимеры и действуют, повышая инфекционность вируса.

PRRS-вирус сильно мутирует ввиду его РНК-вирусной природы, поэтому между вирусами есть множество различий. PRRS-вирус разделяют главным образом на североамериканский тип и европейский тип. Существует тип I (Лелистадский вирус, LV), являющийся представителем европейского типа, и тип II, являющийся представителем североамериканского типа вирусного штамма (североамериканского штамма) АТСС VR2332 (последовательность генома VR2332 приведена в GenBank под регистрационным номером AY150564) (Murtaugh et al., Arch Virol. 1995; 140:1451-1460).

Известно, что степень различия генов североамериканского типа и европейского типа достигает 40%, поэтому перекрестная защита от обоих типов невозможна. Кроме того, часто не удается получить перекрестную защиту даже от мутантных штаммов, принадлежащих к одному и тому же типу (Meng, X.J. et al., 2000). Поэтому для каждого типа была изготовлена вакцина на основе стандартного мутантного штамма, но это не позволяет эффективно предупреждать PRRS из-за ее недостаточной способности обеспечивать перекрестную защиту. Для решения этой проблемы были предприняты различные попытки изготовить вакцину, эффективно обеспечивающую безопасность, иммуногенность и защиту.

В силу тяжести данного заболевания на протяжении приблизительно 20 лет, начиная с открытия вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней (PRRSV), являющегося возбудителем репродуктивно-респираторного синдрома свиней (PRRS), значительные усилия были вложены в разработку метода предупреждения инфекции, вызываемой данным вирусом, однако методы ее предупреждения и лечения до настоящего времени не разработаны. Для контроля над репродуктивно-респираторым синдромом свиней (PRRS) были разработаны различные вакцины, такие как инактивированные вакцины и ослабленные живые вакцины, но было обнаружено, что только ослабленные вакцины, обладающие инфекционной способностью, приводят к желаемому уровню защитного эффекта. Тем не менее, обеспечить защиту от разных вирусов репродуктивно-респираторного синдрома свиней (PRRSV) с использованием одной вакцины затруднительно ввиду отсутствия перекрестного иммунитета к разным типам вирусов из-за широкого разнообразия вирусов репродуктивно-респираторного синдрома свиней (PRRSV). Кроме того, существующие ослабленные вакцины могут быть получены только последовательным пассажем из 100-200 или более пассажей в клеточных линиях других видов животных, что приводит к продолжительному периоду разработки, и при этом трудно гарантировать эффективность и безопасность. Поэтому для каждого типа была изготовлена вакцина на основе стандартного мутантного штамма, но это не позволяет эффективно предупреждать PRRS из-за ее недостаточной способности обеспечивать перекрестную защиту.

Для решения этой проблемы были предприняты различные попытки изготовить вакцину, эффективно обеспечивающую безопасность, иммуногенность и защиту (заявка №10-2011-7004020; название изобретения: «Вакцина от высоко патогенного репродуктивно-респираторного синдрома свиней (HP-PRRS)»).

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Техническая задача

Настоящее изобретение относится к химерному вирусу репродуктивно-респираторного синдрома свиней (PRRSV), который имеет низкую патогенность и высокую безопасность и усиливает секрецию нейтрализующих антител, к вакцине, содержащей указанный вирус, и к способу ее получения.

В одном примере химерный вирус может содержать

(1) нуклеиновокислотную последовательность открытой рамки считывания 1а (ORF1a) и ORF1b, имеющую происхождение из мутантного штамма LMY ver2 с регистрационным номером KСТС 13394 ВР, или нуклеиновокислотную последовательность, на 70% или более гомологичную указанной нуклеиновокислотной последовательности, сохраняющую в то же время функциональную эквивалентность указанной последовательности, и

(2) нуклеиновокислотную последовательность областей ORF2-ORF7 выделенного штамма ВР2017-2, имеющего регистрационный номер KCTC 13393 ВР, или нуклеиновокислотную последовательность, на 70% или более гомологичную указанной нуклеиновокислотной последовательности, сохраняющую в то же время функциональную эквивалентность указанной последовательности.

Техническое решение

Настоящее изобретение относится к химерному вирусу репродуктивно-респираторного синдрома свиней (PRRSV), который может быть использован в качестве вакцины. Химерный PRRSV-вирус по настоящему изобретению является ослабленным и поэтому имеет низкую патогенность и высокую безопасность по сравнению с его исходным штаммом и усиливает секрецию нейтрализующих антител, связанных с перекрестным иммунитетом, значительно усиливая посредством этого иммунитет у свиней. Соответственно, он может быть использован в качестве эффективной вакцины для предупреждения и лечения PRRS-заболевания.

Далее настоящее изобретение будет описано более подробно.

При использовании здесь «ослабленный вирус» относится к нетоксичному вирусу, способному индуцировать иммунный ответ у целевого млекопитающего, не приводя к клиническим признакам PRRS-заболевания, и также относится к уменьшению клинических признаков у животных, инфицированных ослабленным вирусом или не получающих ослабленный вирус, или к уменьшению тяжести признаков по сравнению с «контрольными» животными, инфицированными неослабленным вирусом PRRS. В данном контексте термин «уменьшение/уменьшенный» означает уменьшение по меньшей мере на 10%, предпочтительно 25%, более предпочтительно 50% или, наиболее предпочтительно, 100% или более по сравнению с контролем, как определено выше.

При использовании здесь «вакцинная композиция» может представлять собой химерный вирус PRRS или любой его иммуногенный фрагмент или участок, предпочтительно ослабленный химерный вирус PRRS, например, химерный вирус PRRS по настоящему изобретению. Это приводит к «иммунному ответу», такому как клеточный и/или антитело-опосредованный иммунный ответ на PRRSV. Предпочтительно, чтобы вакцинная композиция была способна обеспечивать профилактический иммунитет от PRRSV-инфекции и связанных с ней клинических признаков.

При использовании здесь «иммунный ответ» означает любой клеточно- и/или антитело-опосредованный иммунный ответ на химерный вирус или вакцину при их введении животному, которому вводят химерный PRRSV-вирус по настоящему изобретению или вакцинную композицию, содержащую указанный вирус. Обычно «иммунный ответ» включает, без ограничения, один или более из следующих эффектов: появление или активацию антигенов, входящих в состав соответствующей композиции или вакцины, или антител, В-клеток, хелперных Т-клеток, ингибирующих Т-клеток, и/или цитотоксических Т-клеток, и/или у5 Т-клеток, специфично индуцированных против антигенов. Предпочтительно, чтобы хозяин демонстрировал терапевтический или профилактический иммунный ответ, улучшающий резистентность к новой инфекции и/или уменьшающий клиническую тяжесть заболевания по сравнению с контролем, не получающим иммуногенную композицию или вакцину. Это предупреждение будет продемонстрировано, в наиболее благоприятном случае, отсутствием симптомов, связанных с указанной выше инфекцией у хозяина, и, включая это, уменьшением частоты или тяжести.

При использовании здесь «свиньи», «свинья» и «поросята» могут быть использованы совместимым образом.

«Приведение в контакт с вакциной» или «введение вакцины» означает введение химерного PRRSV-вируса или вакцины, содержащей указанный химерный PRRSV-вирус, описанный здесь, до воздействия, приводящего к PRRS-заболеванию.

«Предупреждать» или «предупреждение» означает уменьшение частоты клинического проявления PRRS или тяжести или частоты симптомов в результате введения PRRSV-вируса или вакцинной композиции, содержащей указанный PRRSV-вирус, по настоящему изобретению. Уменьшение тяжести или частоты является результатом сравнения с животным или группой животных без введения химерного PRRSV-вируса или вакцинной композиции, содержащей указанный PRRSV-вирус, по настоящему изобретению. Предпочтительно, животное может представлять собой свинью.

Для удобства последовательности, указанные здесь, описаны, исходя из ДНК-нуклеотидов, и в случае полинуклеотидов РНК-типа это означает последовательность, где весь тимин (Т) нуклеотидной последовательности или его часть заменены на урацил (U).

Здесь «состоящий из последовательности» применительно к определенной нуклеотидной последовательности и/или аминокислоте включает все из содержащего указанную последовательность, по существу содержащего указанную последовательность и/или состоящего из указанной последовательности, и, по необходимости, они могут быть соответствующим образом заменены и использованы.

Согласно настоящему изобретению предложен ослабленный химерный вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней (PRRSV), представляющего собой вирусное заболевание, поражающее свиней.

Для решения указанной задачи, согласно настоящему изобретению, предложен полинуклеотид, содержащий структуру структурной формулы 1:

[структурная формула 1]

5'-[X]-[Y]-3'.

В указанной формуле [X] представляет собой нуклеиновокислотную последовательность генов областей ORF1a и ORF1b мутантного штамма LMY ver2, имеющего регистрационный номер 13394 ВР, или нуклеиновокислотную последовательность, на 70% или более гомологичную нуклеиновокислотной последовательности генов областей ORF1a и ORF1b, содержащую нуклеиновокислотную последовательность генов NSP1 (гена NSP1-альфа и гена NSP1-бета) мутантного штамма LMY ver2, имеющего регистрационный номер KСТС 13394 ВР, или нуклеиновокислотную последовательность, гомологичную на 70% или более в диапазоне, позволяющем сохранять функцию, равную функции указанной нуклеиновокислотной последовательности, например, содержащую

нуклеиновокислотную последовательность генов NSP1 мутантного штамма LMY ver2, или нуклеиновокислотную последовательность, гомологичную на 70% или более в диапазоне, позволяющем сохранять функцию, равную функции указанной нуклеиновокислотной последовательности, и [Y] представляет собой нуклеиновокислотную последовательность генов областей ORF2-ORF7 мутантного штамма ВР2017-2, имеющего регистрационный номер KСТС 13393 BP, или нуклеиновокислотную последовательность, гомологичную на 70% или более в диапазоне, позволяющем сохранять функцию, равную функции указанной нуклеиновокислотной последовательности. При использовании здесь «равная функция» может означать функцию, такую же, как желаемая функция, или качественно (активность) и/или количественно (уровень) сходную с ней. Например, аминокислотная последовательность белка, кодируемого рассматриваемым геном, может быть такой же, как аминокислотная последовательность белка, кодируемого геном дикого типа.

В одном примере [X] может содержать все виды точковых мутаций (молчащая мутация) в диапазоне, позволяющем сохранять аминокислотную последовательность белка NSP1, кодируемого геном NSP1, в нуклеиновокислотной последовательности гена NSP1, состоящей из нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 11, и, например, он может быть выбран и использован свободным образом в диапазоне, направленном на уменьшение СВР-показателя гена NSP1.

Например, [X] может представлять собой мутацию, где заменены одно или более, 25 или более, 66 или более, 80 или более или все из 91 основания, выбранные из группы, состоящей из положения 222, положения 225, положения 237, положения 240, положения 252, положения 306, положения 309, положения 312, положения 315, положения 324, положения 327, положения 330, положения 333, положения 336, положения 339, положения 342, положения 345, положения 357, положения 363, положения 366, положения 378, положения 379, положения 381, положения 393, положения 396, положения 543, положения 546, положения 549, положения 555, положения 558, положения 561, положения 573, положения 579, положения 582, положения 588, положения 612, положения 618, положения 621, положения 627, положения 633, положения 639, положения 654, положения 673, положения 675, положения 678, положения 681, положения 684, положения 705, положения 708, положения 729, положения 735, положения 738, положения 741, положения 744, положения 747, положения 771, положения 786, положения 789, положения 792, положения 810, положения 825, положения 828, положения 838, положения 840, положения 846, положения 849, положения 858, положения 867, положения 879, положения 882, положения 885, положения 891, положения 900, положения 903, положения 906, положения 924, положения 936, положения 939, положения 948, положения 954, положения 963, положения 966, положения 1026, положения 1029, положения 1038, положения 1047, положения 1053, положения 1066, положения 1068, положения 1086, положения и положения 1110 нуклеиновокислотной последовательности гена NSP1, состоящей из нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 11.

В одном примере [X] может содержать, в нуклеиновокислотной последовательности гена NSP1, состоящей из нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 11, одну или более, 25 или более, 66 или более, 80 или более или все из 91 мутации, выбранные из группы, состоящей из мутации, где G в положении 222 заменен на С, мутации, где С в положении 225 заменен на А, мутации, где Т в положении 327 заменен на С, мутации, где А в положении 240 заменен на Т, мутации, где Т в положении 252 заменен на С, мутации, где А в положении 306 заменен на С, мутации, где Т в положении 309 заменен на С, мутации, где G в положении 312 заменен на А, мутации, где С в положении 315 заменен на А, мутации, где Т в положении 324 заменен на С, мутации, где С в положении 327 заменен на G, мутации, где G в положении 330 заменен на А, мутации, где С в положении 333 заменен на Т, мутации, где С в положении 336 заменен на G, мутации, где Т в положении 339 заменен на С, мутации, где А в положении 342 заменен на Т, мутации, где Т в положении 345 заменен на А, мутации, где А в положении 357 заменен на G, мутации, где Т в положении 363 заменен на А, мутации, где Т в положении 366 заменен на С, мутации, где С в положении 378 заменен на Т, мутации, где С в положении 379 заменен на А, мутации, где С в положении 381 заменен на G, мутации, где Т в положении 393 заменен на С, мутации, где Т в положении 396 заменен на А, мутации, где Т в положении 543 заменен на С, мутации, где Т в положении 546 заменен на С, мутации, где С в положении 549 заменен на А, мутации, где Т в положении 555 заменен на С, мутации, где Т в положении 558 заменен на С, мутации, где Т в положении 561 заменен на А, мутации, где С в положении 573 заменен на Т, мутации, где Т в положении 579 заменен на С, мутации, где G в положении 582 заменен на Т, мутации, где Т в положении 588 заменен на С, мутации, где Т в положении 612 заменен на С, мутации, где G в положении 618 заменен на С, мутации, где Т в положении 621 заменен на С, мутации, где А в положении 627 заменен на Т, мутации, где Т в положении 633 заменен на С, мутации, где Т в положении 639 заменен на G, мутации, где С в положении 654 заменен на Т, мутации, где С в положении 673 заменен на Т, мутации, где С в положении 675 заменен на А, мутации, где С в положении 678 заменен на Т, мутации, где С в положении 681 заменен на G, мутации, где С в положении 684 заменен на G, мутации, где G в положении 705 заменен на С, мутации, где С в положении 708 заменен на Т, мутации, где А в положении 729 заменен на С, мутации, где Т в положении 735 заменен на С, мутации, где G в положении 738 заменен на Т, мутации, где Т в положении 741 заменен на С, мутации, где Т в положении 744 заменен на С, мутации, где Т в положении 747 заменен на А, мутации, где Т в положении 771 заменен на С, мутации, где Т в положении 786 заменен на С, мутации, где С в положении 789 заменен на Т, мутации, где Т в положении 792 заменен на G, мутации, где С в положении 810 заменен на Т, мутации, где Т в положении 825 заменен на С, мутации, где С в положении 828 заменен на Т, мутации, где Т в положении 838 заменен на С, мутации, где G в положении 840 заменен на С, мутации, где С в положении 846 заменен на G, мутации, где G в положении 849 заменен на А, мутации, где А в положении 858 заменен на G, мутации, где Т в положении 867 заменен на С, мутации, где Т в положении 879 заменен на С, мутации, где С в положении 882 заменен на G, мутации, где С в положении 885 заменен на Т, мутации, где С в положении 891 заменен на Т, мутации, где Т в положении 900 заменен на С, мутации, где С в положении 903 заменен на А, мутации, где Т в положении 906 заменен на С, мутации, где G в положении 924 заменен на Т, мутации, где Т в положении 936 заменен на С, мутации, где Т в положении 939 заменен на С, мутации, где А в положении 948 заменен на С, мутации, где А в положении 954 заменен на С, мутации, где А в положении 963 заменен на Т, мутации, где Т в положении 966 заменен на С, мутации, где А в положении 1026 заменен на G, мутации, где G в положении 1029 заменен на С, мутации, где С в положении 1038 заменен на Т, мутации, где Т в положении 1047 заменен на С, мутации, где Т в положении 1053 заменен на С, мутации, где А в положении 1066 заменен на С, мутации, где А в положении 1068 заменен на С, мутации, где С в положении 1086 заменен на Т, и мутации, где Т в положении 1110 заменен на С.

Например, [X] может представлять собой нуклеиновокислотную последовательность гена NSP1 (SEQ ID NO: 12) и/или NSPl-бета (SEQ ID NO: 1; участок из 609 5'-концевых оснований SEQ ID NO: 12) мутантного штамма LMY ver2, имеющего регистрационный номер 13394 ВР, или нуклеиновокислотную последовательность, гомологичную на 70% или более, 75% или более, 80% или более, 85% или более, 90% или более, 95% или более, 96% или более, 97% или более, 98% или более, 99% или более или 99,5% или более в диапазоне, позволяющем сохранять функцию, равную функции указанной нуклеиновокислотной последовательности.

Кроме того, [Y] может представлять собой нуклеиновокислотную последовательность генов областей ORF2-ORF7 мутантного штамма ВР2017-2, имеющего регистрационный номер KСТС 13393 ВР, или нуклеиновокислотную последовательность, гомологичную на 70% или более, 75% или более, 80% или более, 85% или более, 90% или более, 95% или более, 96% или более, 97% или более, 98% или более, 99% или более или 99,5% или более в диапазоне, позволяющем сохранять функцию, равную функции указанной нуклеиновокислотной последовательности.

Согласно одному примеру настоящего изобретения, возможно также присутствие [А]n на 3'-конце [Y] структурной формулы 1. Указанное n представляет собой количество нуклеотидов, содержащих основание А, и может представлять собой целое число от 10 до 100. Предпочтительно, оно может представлять собой целое число от 10 до 80, от 10 до 70, от 10 до 60, от 10 до 50, от 10 до 40, от 10 до 30, от 15 до 80, от 15 до 70, от 15 до 60, от 15 до 50, от 15 до 40, от 15 до 30, от 20 до 30, от 20 до 26.

Полинуклеотид может представлять собой РНК, обратный транскриптом РНК (ДНК) или их комбинацию. Указанный полинуклеотид может функционировать как геном химерного PRRSV-вируса.

Соответственно, согласно другому примеру настоящего изобретения предложен химерный вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней (PRRSV), содержащий полинуклеотид, имеющий структуру структурной формулы 1. Геном химерного PRRSV-вируса может представлять собой ДНК или РНК, предпочтительно РНК.

[X] соответствует области гена NSP1, содержащей NSP1-бета мутантного штамма LMY ver2, имеющего регистрационный номер 13394 ВР, и может представлять собой генный фрагмент, полученный обработкой генома мутантного штамма LMY ver2 рестриктазами AscI и PacI, и, например, может содержать нуклеиновокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 и/или SEQ ID NO: 12 или нуклеиновокислотную последовательность, гомологичную на 70% или более, 75% или более, 80% или более, 85% или более, 90% или более, 95% или более, 96% или более, 97% или более, 98% или более, 99% или более или 99,5% или более в диапазоне, позволяющем сохранять функцию, равную функции указанной нуклеотидной последовательности.

[Y] соответствует областям ORF2-ORF7 мутантного штамма ВР2017-2, имеющего регистрационный номер KСТС 13393 ВР, и может представлять собой генный фрагмент, полученный обработкой генома мутантного штамма ВР2017-2 рестриктазами AscI и PacI, и, например, может содержать нуклеиновокислотную последовательность SEQ ID NO: 2 или нуклеиновокислотную последовательность, гомологичную на 70% или более, 75% или более, 80% или более, 85% или более, 90% или более, 95% или более, 96% или более, 97% или более, 98% или более, 99% или более или 99,5% или более в диапазоне, позволяющем сохранять функцию, равную функции указанной нуклеиновокислотной последовательности.

В одном примере структурная формула 1 может содержать нуклеиновокислотную последовательность SEQ ID NO: 4 или нуклеиновокислотную последовательность, гомологичную на 70% или более, 75% или более, 80% или более, 85% или более, 90% или более, 95% или более, 96% или более, 97% или более, 98% или более, 99% или более или 99,5% или более в диапазоне, позволяющем сохранять функцию, равную функции указанной нуклеиновокислотной последовательности. Например, она может представлять собой нуклеиновокислотную последовательность SEQ ID NO: 4.

В Таблице 1 ниже часть, выделенная полужирным шрифтом, в нуклеотидной последовательности гена NSP1 LMY ver2 представляет собой область NSP1-бета.

(В приведенной таблице полинуклеотид (РНК), предложенный здесь, может содержать нуклеиновокислотную последовательность, где в последовательности, показанной в SEQ ID NO: 1-4, Т заменены на U.)

Согласно настоящему изобретению, предложен химерный PRRSV-вирус, содержащий полинуклеотид структурной формулы 1 в качестве генома. Химерный PRRSV-вирус может включать вирусное потомство, культивированное в 1-80 пассажах, 1-70 пассажах, 1-60 пассажах, 1-50 пассажах, 1-40 пассажах, 1-30 пассажах, 1-20 пассажах или 1-10 пассажах.

[структурная формула 1]

5'-[X]-[Y]-3'.

В приведенной формуле [X] представляет собой нуклеиновокислотную последовательность гена NSP1 и/или NSP1-бета мутантного штамма LMY ver2, имеющего регистрационный номер 13394 ВР, или нуклеиновокислотную последовательность, на 70% или более гомологичную указанной нуклеиновокислотной последовательности, и [Y] представляет собой нуклеиновокислотную последовательность генов областей ORF2-ORF7 мутантного штамма ВР2017-2, имеющего регистрационный номер KCTC 13393 ВР, или нуклеиновокислотную последовательность, на 70% или более гомологичную указанной нуклеиновокислотной последовательности.

Например, [X] может представлять собой нуклеиновокислотную последовательность гена NSP1 и/или NSP1-бета мутантного штамма LMY ver2, имеющего регистрационный номер 13394 ВР, или нуклеиновокислотную последовательность, на 70% или более, 75% или более, 80% или более, 85% или более, 90% или более, 95% или более, 96% или более, 97% или более, 98% или более, 99% или более или 99,5% или более гомологичную указанной нуклеиновокислотной последовательности.

Кроме того, [Y] может представлять собой нуклеиновокислотную последовательность генов областей ORF2-ORF7 мутантного штамма ВР2017-2, имеющего регистрационный номер KСТС 13393 ВР, или нуклеиновокислотную последовательность, на 70% или более, 75% или более, 80% или более, 85% или более, 90% или более, 95% или более, 96% или более, 97% или более, 98% или более, 99% или более или 99,5% или более гомологичную указанной нуклеиновокислотной последовательности.

Согласно одному примеру настоящего изобретения, возможно также присутствие [А]n на 3'-конце [Y] структурной формулы 1. Указанное n представляет собой количество нуклеотидов, содержащих основание А, и может представлять собой целое число от 10 до 100, и, например, может представлять собой целое число от 10 до 80, от 10 до 70, от 10 до 60, от 10 до 50, от 10 до 40, от 10 до 30, от 15 до 80, от 15 до 70, от 15 до 60, от 15 до 50, от 15 до 40, от 15 до 30, от 20 до 30, от 20 до 26.

Полинуклеотид может представлять собой РНК, обратный транскриптом РНК (ДНК) или их комбинацию. Указанный полинуклеотид может функционировать как геном химерного PRRSV-вируса. Соответственно, согласно другому примеру настоящего изобретения, предложен химерный вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней (PRRSV), содержащий полинуклеотид, имеющий структуру структурной формулы 1. Геном химерного PRRSV-вируса может представлять собой ДНК или РНК, предпочтительно РНК.

[X] соответствует области гена NSP1, содержащей NSP1-бета мутантного штамма LMY ver2, имеющего регистрационный номер 13394 ВР, и может представлять собой генный фрагмент, полученный обработкой генома мутантного штамма LMY ver2 рестриктазами AscI и PacI, и, например, может содержать нуклеиновокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 или нуклеиновокислотную последовательность, гомологичную на 70% или более, 75% или более, 80% или более, 85% или более, 90% или более, 95% или более, 96% или более, 97% или более, 98% или более, 99% или более или 99,5% или более в диапазоне, позволяющем сохранять функцию, равную функции указанной нуклеотидной последовательности.

[Y] соответствует областям ORF2-ORF7 мутантного штамма ВР2017-2, имеющего регистрационный номер KСТС 13393 ВР, и может представлять собой генный фрагмент, полученный обработкой генома мутантного штамма ВР2017-2 рестриктазами AscI и PacI, и, например, может содержать нуклеиновокислотную последовательность SEQ ID NO:2 или нуклеиновокислотную последовательность, гомологичную на 70% или более, 75% или более, 80% или более, 85% или более, 90% или более, 95% или более, 96% или более, 97% или более, 98% или более, 99% или более или 99,5% или более в диапазоне, позволяющем сохранять функцию, равную функции указанной нуклеиновокислотной последовательности.

В одном примере структурная формула 1 может содержать нуклеиновокислотную последовательность SEQ ID NO: 4 или нуклеиновокислотную последовательность, гомологичную на 70% или более, 75% или более, 80% или более, 85% или более, 90% или более, 95% или более, 96% или более, 97% или более, 98% или более, 99% или более или 99,5% или более в диапазоне, позволяющем сохранять функцию, равную функции указанной нуклеиновокислотной последовательности. Например, она может представлять собой нуклеиновокислотную последовательность SEQ IN NO: 4.

Согласно одному конкретному примеру, предложен химерный PRRSV-вирус, содержащий нуклеиновокислотную последовательность, содержащую полинуклеотид SEQ ID NO: 4, в качестве генома, названный LMY+BP2017. Вирус LMY+BP2017 может представлять собой вирус, имеющий регистрационный номер KCTC 13394 ВР.

Мутантный штамм LMY ver2, являющийся каркасом химерного вируса LMY+BP2017, может представлять собой мутантный штамм PRRSV, содержащий мутантный NSP1-бета, где заменено по меньшей мере одно основание неструктурного белка 1-го типа (NSP1) SEQ ID NO: 5 исходного штамма LMY (регистрационный номер в GenBank DQ473474.1.).

Нуклеотидная последовательность, подлежащая замене, в нуклеотидной последовательности гена, кодирующего NSP1 и/или NSPl-бета штамма LMY, может быть выбрана с использованием известной программы SAVE (Synthetic Attenuated Virus Engineering) и, предпочтительно, может быть выбрана с использованием программы SAVE, разработанной авторами настоящего изобретения. Конкретно, она может представлять собой деоптимизированную нуклеотидную последовательность, полученную анализом генетически высокостабильной области NSP1 в геноме исходного штамма LMY с использованием программы SAVE, разработанной авторами настоящего изобретения, с последующим выбором и заменой части или всей нуклеотидной последовательности, демонстрирующей относительно высокое предпочтение пар кодонов (Codon Pair Bias, СРВ). Деоптимизированная нуклеотидная последовательность может содержать, в гене, кодирующем белок NSP1 штамма LMY, состоящем из нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 11, одну или более, 25 или более, 66 или более, 80 или более или все из 91 мутации, выбранные из группы, состоящей из мутации, где G в положении 222 заменен на С, мутации, где С в положении 225 заменен на А, мутации, где Т в положении 327 заменен на С, мутации, где А в положении 240 заменен на Т, мутации, где Т в положении 252 заменен на С, мутации, где А в положении 306 заменен на С, мутации, где Т в положении 309 заменен на С, мутации, где G в положении 312 заменен на А, мутации, где С в положении 315 заменен на А, мутации, где Т в положении 324 заменен на С, мутации, где С в положении 327 заменен на G, мутации, где G в положении 330 заменен на А, мутации, где С в положении 333 заменен на Т, мутации, где С в положении 336 заменен на G, мутации, где Т в положении 339 заменен на С, мутации, где А в положении 342 заменен на Т, мутации, где Т в положении 345 заменен на А, мутации, где А в положении 357 заменен на G, мутации, где Т в положении 363 заменен на А, мутации, где Т в положении 366 заменен на С, мутации, где С в положении 378 заменен на Т, мутации, где С в положении 379 заменен на А, мутации, где С в положении 381 заменен на G, мутации, где Т в положении 393 заменен на С, мутации, где Т в положении 396 заменен на А, мутации, где Т в положении 543 заменен на С, мутации, где Т в положении 546 заменен на С, мутации, где С в положении 549 заменен на А, мутации, где Т в положении 555 заменен на С, мутации, где Т в положении 558 заменен на С, мутации, где Т в положении 561 заменен на А, мутации, где С в положении 573 заменен на Т, мутации, где Т в положении 579 заменен на С, мутации, где G в положении 582 заменен на Т, мутации, где Т в положении 588 заменен на С, мутации, где Т в положении 612 заменен на С, мутации, где G в положении 618 заменен на С, мутации, где Т в положении 621 заменен на С, мутации, где А в положении 627 заменен на Т, мутации, где Т в положении 633 заменен на С, мутации, где Т в положении 639 заменен на G, мутации, где С в положении 654 заменен на Т, мутации, где С в положении 673 заменен на Т, мутации, где С в положении 675 заменен на А, мутации, где С в положении 678 заменен на Т, мутации, где С в положении 681 заменен на G, мутации, где С в положении 684 заменен на G, мутации, где G в положении 705 заменен на С, мутации, где С в положении 708 заменен на Т, мутации, где А в положении 729 заменен на С, мутации, где Т в положении 735 заменен на С, мутации, где G в положении 738 заменен на Т, мутации, где Т в положении 741 заменен на С, мутации, где Т в положении 744 заменен на С, мутации, где Т в положении 747 заменен на А, мутации, где Т в положении 771 заменен на С, мутации, где Т в положении 786 заменен на С, мутации, где С в положении 789 заменен на Т, мутации, где Т в положении 792 заменен на G, мутации, где С в положении 810 заменен на Т, мутации, где Т в положении 825 заменен на С, мутации, где С в положении 828 заменен на Т, мутации, где Т в положении 838 заменен на С, мутации, где G в положении 840 заменен на С, мутации, где С в положении 846 заменен на G, мутации, где G в положении 849 заменен на А, мутации, где А в положении 858 заменен на G, мутации, где Т в положении 867 заменен на С, мутации, где Т в положении 879 заменен на С, мутации, где С в положении 882 заменен на G, мутации, где С в положении 885 заменен на Т, мутации, где С в положении 891 заменен на Т, мутации, где Т в положении 900 заменен на С, мутации, где С в положении 903 заменен на А, мутации, где Т в положении 906 заменен на С, мутации, где G в положении 924 заменен на Т, мутации, где Т в положении 936 заменен на С, мутации, где Т в положении 939 заменен на С, мутации, где А в положении 948 заменен на С, мутации, где А в положении 954 заменен на С, мутации, где А в положении 963 заменен на Т, мутации, где Т в положении 966 заменен на С, мутации, где А в положении 1026 заменен на G, мутации, где G в положении 1029 заменен на С, мутации, где С в положении 1038 заменен на Т, мутации, где Т в положении 1047 заменен на С, мутации, где Т в положении 1053 заменен на С, мутации, где А в положении 1066 заменен на С, мутации, где А в положении 1068 заменен на С, мутации, где С в положении 1086 заменен на Т, и мутации, где Т в положении 1110 заменен на С, без ограничения указанными вариантами.

При использовании программы SAVE можно провести количественную оценку СРВ, представляющего собой предпочтение, формирующееся при образовании пар кодонов в вирусных генах, с использованием компьютерного алгоритма, и, поскольку пролиферативные свойства вируса уменьшаются при уменьшении показателя СРВ (деоптимизации) и его ослаблении (Virus Attenuation by Genome-Scale Changes in Codon Pair Bias, Science, 2008, J. Robert Coleman et al), ослабленный мутантный штамм LMY ver2, используемый для получения химерного вируса по настоящему изобретению, может быть получен заменой части нуклеотидной последовательности с высоким показателем СРВ на нуклеотидную последовательность с низким показателем СРВ или, предпочтительно, проведением молчащих мутаций в соответствии с принципом деоптимизации пар кодонов. Мутантный штамм LMY ver2 может содержать ген, кодирующий белок NSP1-бета, состоящий из нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:6, или ген, кодирующий белок NSP1, состоящий из нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 12.

Кроме того, согласно настоящему изобретению, может быть предложена клетка, содержащая геном химерного PRRSV-вируса по настоящему изобретению. Клетка относится к клетке, трансфицированной геномом химерного вируса (ДНК, РНК или вектором, содержащим указанную ДНК или РНК) или химерным вирусом, содержащим указанный геном, для получения большого количества химерного вируса, и тип клетки не ограничен, если она соответствует поставленной задаче.

Согласно одному примеру настоящего изобретения, может быть предложена вакцинная композиция от вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней, содержащая химерный PRRSV-вирус или его субкультивированное потомство.

Субкультивированное потомство может включать вирусное потомство, субкультивированное в 1-80 пассажах, 1-70 пассажах, 1-60 пассажах, 1-50 пассажах, 1-40 пассажах, 1-30 пассажах, 1-20 пассажах или 1-10 пассажах.

Согласно одному примеру настоящего изобретения, вакцина может представлять собой живую вакцину или инактивированную вакцину, но, предпочтительно, она представляет собой живую вакцину. Конкретно, ослабленный химерный вирус PRRS, описанный здесь, может представлять собой модифицированную живую вакцину, содержащую один или более чем один из указанных выше вирусных штаммов в жизнеспособном состоянии в фармацевтически приемлемом носителе. Более того или альтернативно, для изготовления инактивированной вакцины может быть использован инактивированный вирус.

Вакцина может дополнительно содержать одно или более, выбранное из группы, состоящей из носителей, разбавителей, эксципиентов и адъювантов. Тип фармацевтически приемлемого носителя не ограничен, но может включать все и любые растворители, дисперсионные среды, покрытия, стабилизаторы, консерванты, антибиотики и противогрибковые агенты, изотонические агенты, агенты, замедляющие всасывание, и тому подобное.

С другой стороны, эффективная доза ослабленного химерного вируса по настоящему изобретению, присутствующая в вакцинной композиции, может представлять собой такое количество вируса, которое приводит или может привести к иммунному ответу у животного, которому вводят указанную эффективную дозу вируса. Эффективное количество может зависеть от компонентов вакцины и схемы введения. Доза вакцинной композиции может входить в диапазон от 2 до 6, предпочтительно от 3 до 4 цитопатических доз 50% (TCID₅₀), и может варьировать в зависимости от типа субъекта, без ограничения указанными вариантами.

Геном химерного вируса LMY-BP2017 по настоящему изобретению и вакцинная композиция, содержащая указанный геном, могут быть использованы для предупреждения эффектов PRRS-заболевания у свиней. Кроме того, для предупреждения эффектов PRRS-заболевания у свиней могут быть использованы субъединицы, содержащие иммуногенные фрагменты или участки химерного вируса PRRS. Ослабленный химерный вирус по настоящему изобретению или вакцинная композиция, содержащая указанный вирус, могут быть введены профилактически до контакта свиньи со штаммом вируса PRRS, вызывающего PRRS, и могут быть введены свинье одновременно с контактом свиньи с таким штаммом вируса, и могут быть введены терапевтически после контакта рассматриваемой свиньи с таким штаммом вируса.

Вакцинная композиция, предложенная согласно настоящему изобретению, может быть использована для предупреждения репродуктивно-респираторного синдрома свиней (PRRS), например, для предупреждения PRRS, вызванного североамериканским типом PRRSV. В одном примере североамериканский тип PRRSV может представлять собой штамм вируса II-го типа VR2332.

Ослабленный химерный PRRSV-вирус по настоящему изобретению или вакцинная композиция, содержащая указанный вирус, могут быть введены посредством перорального, парентерального, подкожного, внутримышечного, внутрикожного, сублингвального, трансдермального, ректального введения, введения через слизистую оболочку, ингаляционного введения, исходя из площади поверхности, трансбуккального введения или их комбинаций. Кроме того, ослабленный химерный вирус PRRS может быть введен в форме имплантата, способного к длительному высвобождению ослабленного вируса.

Ослабленный химерный PRRSV-вирус по настоящему изобретению или вакцинная композиция, содержащая указанный вирус, могут быть введены инъекцией, ингаляцией или трансплантацией, и инъекция особенно предпочтительна. В зависимости от желаемого периода и эффективности вакцинации или лечения, ослабленный химерный PRRSV-вирус или вакцинную композицию, содержащую указанный вирус, можно вводить один или несколько раз и периодически, например, на протяжении нескольких суток, нескольких недель или нескольких месяцев, в разных дозах каждый день. Инъекционное введение может быть проведено инъекцией в желаемом количестве, или подкожной инъекцией, или распылением в носовой полости, или, альтернативно, непрерывной инъекцией.

Согласно одному примеру настоящего изобретения, химерный PRRSV-вирус по настоящему изобретению может представлять собой вирус, имеющий показатель TCID₅₀, составляющий от 0,01 до 0,1 по сравнению с показателем TCID₅₀ исходного штамма, который представляет собой показатель TCID₅₀ вируса, измеренный приведением свиных альвеолярных макрофагов в контакт с химерным вирусом и его исходным штаммом (регистрационный номер в GenBank DQ473474.1.). Предпочтительно, измерение проводят после 2 суток и показатель TCID₅₀ может составлять от 0,05 до 0,1. Химерный PRRSV-вирус по настоящему изобретению имеет показатель TCID₅₀, меньше, чем у исходного штамма, меньшие пролиферативные свойства и является ослабленным.

Кроме того, предложен вирус, где мутантный штамм имеет содержание нейтрализующих антител, измеренное введением химерного PRRSV-вируса по настоящему изобретению и его исходного штамма (регистрационный номер в GenBank DQ473474.1.) свинье, от 2 до 8 относительно исходного штамма, предпочтительно от 2 до 4. Измерение предпочтительно проводят через 28 суток. Нейтрализующее антитело означает антитело, обладающее нейтрализующей способностью против VR2332, типичного штамма североамериканского типа PRRSV. Соответственно, при введении ослабленного химерного вируса по настоящему изобретению или вакцинной композиции, содержащей указанный вирус, свинье у свиньи происходит увеличение титра нейтрализующих антител и экспрессии иммунных факторов, благодаря чему эффект иммунизации от PRRS может быть существенно увеличен.

Согласно одному конкретному примеру, показатель СРВ химерного PRRSV-вируса LMY+BP2017 по настоящему изобретению, описанного выше, меньше, чем у исходного штамма LMY (регистрационный номер в GenBank DQ473474.1.), и может предпочтительно составлять от -0,39 до 0, более предпочтительно от -0,35 до -0.20, подходящим образом от -0,35 до -0,26, например, -0,2393184052058128. При показателе СРВ менее -0,39 получение вируса затруднительно, а когда он превышает 0, проблема состоит в том, что его можно получить, но пролиферативные свойства не будут уменьшены и, таким образом, он не будет ослабленным. Соответственно, предпочтительно, чтобы ослабленный химерный вирус LMY+BP2017 по настоящему изобретению имел показатель СРВ, указанный выше.

Кроме того, согласно настоящему изобретению предложен химерный вирус LMY+BP2017, имеющий показатели CpG, Up А, составляющие от 1,0 до 3,0 относительно исходного штамма (регистрационный номер в GenBank DQ473474.L). Изменение отношения CpG, UpA является необходимым результатом деоптимизации, и увеличение показателей CpG, UpA эукариотических генов приводит к клеточному стрессу, и поэтому происходит уменьшение пролиферативных свойств вируса и, таким образом, возможно ослабление вируса. Химерный вирус LMY+BP2017 по настоящему изобретению имеет более высокие показатели CpG, UpA, чем исходный штамм, и, предпочтительно, его показатели больше в 1,0-3,0 раза, и, например, ослабленный химерный вирус по настоящему изобретению может иметь CpG 1,1753 и UpA 1,03.

Согласно одному примеру настоящего изобретения, предложен способ получения химерного вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней, включающий обработку генома мутантного штамма LMY ver2, имеющего регистрационный номер 13394 ВР, рестриктазами AscI и PacI с получением полинуклеотидного фрагмента, обработку генома мутантного штамма ВР2017-2, имеющего регистрационный номер KСТС 13393 ВР, рестриктазами AscI и PacI с получением полинуклеотидного фрагмента и рекомбинацию полинуклеотидного фрагмента LMY ver2 и полинуклеотидного фрагмента ВР2017-2 с получением инфекционного клона.

Полинуклеотидный фрагмент, полученный обработкой генома мутантного штамма LMY ver2 рестриктазами AscI и PacI, может содержать область, кодирующую NSP1-бета.

Полинуклеотидный фрагмент, полученный обработкой генома мутантного штамма ВР2017-2 рестриктазами AscI и PacI, может содержать области ORF2-ORF7.

При рекомбинации фрагментов может быть использована лигаза, и химерный вирус может быть получен введением полученного инфекционного клона в клетку.

Клетка обозначает клетку, трансфицированную с использованием ДНК или РНК химерного вируса или вектором, содержащим указанную ДНК или РНК, инфекционным клоном или химерным вирусом, для получения большого количества химерного вируса, и тип клетки не ограничен.

Кроме того, согласно одному примеру настоящего изобретения может быть предложена композиция для предупреждения или лечения вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней, содержащая указанную вакцинную композицию.

В предпочтительной форме композиция для предупреждения или лечения вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней по настоящему изобретению может содержать дополнительный компонент, известный специалистам в данной области, и может дополнительно содержать подходящие носители, эксципиенты и разбавители, обычно используемые для изготовления фармацевтической композиции.

Более того, она может быть использована как изготовленная в форме для перорального введения, такой как порошки, гранулы, таблетки, капсулы, суспензия, эмульсия, сироп, аэрозоли и тому подобное, препарата для наружного применения, суппозитория и стерильного раствора для инъекций. Предпочтительно использование подходящей композиции, известной в данной области, как раскрыто в соответствующем документе (Remington's Pharmaceutical Science, recently, Mack Publishing Company, Easton PA).

Носители, эксципиенты и разбавители, которые могут быть включены в фармацевтическую композицию по настоящему изобретению, включают лактозу, декстрозу, сахарозу, сорбит, маннит, ксилит, эритрит, мальтит, крахмал, аравийскую камедь, альгинат, желатин, фосфат кальция, силикат кальция, целлюлозу, метилцеллюлозу, микрокристаллическую целлюлозу, поливинилпирролидон, воду, метилгидроксибензоат, пропилгидроксибензоат, тальк, стеарат магния и минеральное масло. При изготовлении композиции она может быть изготовлена с использованием разбавителя или эксципиента, такого как наполнитель, разбавитель, связывающий агент, увлажняющий агент, разрыхлитель, поверхностно-активное вещество и тому подобное. Твердые композиции для перорального введения включают таблетки, пилюли, порошок, гранулы, капсулы и тому подобное, и эти твердые композиции изготавливают смешиванием по меньшей мере одного эксципиента, например, крахмала, карбоната кальция, сахарозы, лактозы, желатина и тому подобного, с композицией. Кроме того, в дополнение к простому эксципиенту, смазывающий агент, такой как стеарат магния и тальк. Жидкие композиции для перорального введения включают суспензию, жидкость для перорального введения, эмульсию, сироп и тому подобное, и, в дополнение к обычно используемым простым разбавителям, воде и жидкому парафину, могут содержать различные эксципиенты, например, увлажняющий агент, подсластитель, ароматизатор, консервант и тому подобное. Композиции для парентерального введения включают стерильный водный раствор, неводные растворители, суспензию, эмульсию, лиофилизированные композиции и суппозитории. В качестве неводного растворителя и суспензии могут быть использованы пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, растительное масло, такое как оливковое масло, сложный эфир, подходящий для инъекционного введения, такой как этилолеат, и тому подобное. В качестве основы суппозиториев могут быть использованы Витепсол, Макрогол, Tween 61, масло какао, лаурин (laurinum), глицерожелатин и тому подобное.

Предпочтительная доза композиции по настоящему изобретению варьирует в зависимости от состояния и массы тела субъекта, тяжести заболевания, лекарственной формы и пути и периода введения, но может быть подходящим образом выбрана специалистами в данной области. Например, для предпочтительного эффекта, композицию по настоящему изобретению можно вводить в количестве от 0,0001 до 1000 мг/кг (массы тела) в сутки. Введение композиции можно проводить один раз в сутки или разделять на несколько раз.

Композиция по настоящему изобретению может быть введена субъекту различными способами. Можно предполагать любые способы введения.

Согласно другому примеру настоящего изобретения, может быть предложен способ предупреждения или лечения репродуктивно-респираторного синдрома свиней, включающий введение свинье вакцинной композиции по настоящему изобретению.

Введение вакцинной композиции, содержащей геном химерного вируса по настоящему изобретению, свинье позволяет усилить иммунный ответ свиньи на антигены PRRSV и, благодаря усилению иммунного ответа свиньи на антигены PRRSV, может быть предложен способ предупреждения или лечения репродуктивно-респираторного синдрома свиней. Предпочтительно, он может происходить предупреждение.

Конкретно, способ может включать введение композиции подкожной инъекцией, внутривенной инъекцией, внутрикожной инъекцией, парентеральной инъекцией, внутримышечной инъекцией, безыгольной инъекцией, электропорацией, посредством пероральной доставки, интраназальной доставки, ороназальной доставки или любой их комбинацией.

Согласно настоящему изобретению, может быть предложен набор для осуществления любого из указанных выше способов. Данный набор может содержать контейнер, вакцинную композицию, предпочтительно содержащую ослабленный химерный вирус PRRS по настоящему изобретению, фармацевтически приемлемый носитель, адъювант и инструкции по введению иммуногенной композиции животному, нуждающемуся в этом, для уменьшения клинических признаков или эффектов PRRS-инфекции, предпочтительно частоты или тяжести PRRS. Набор может также содержать средства для проведения инъекции и/или других типы средств для введения. Кроме того, набор может содержать растворитель. Ослабленная вакцина может быть лиофилизирована и восстановлена растворителем с получением раствора для инъекции и/или ингаляции. Растворитель может представлять собой воду, физиологический раствор, буферный раствор или усиливающий растворитель. Набор может содержать отдельные контейнеры, содержащие ослабленный вирус, растворитель и/или фармацевтически приемлемый носитель. Инструкции могут представлять собой этикетки и/или распечатанные инструкции, прикрепленные к одному или более чем к одному контейнеру.

Полезные эффекты

Химерный PRRSV-вирус по настоящему изобретению может быть использован для эффективного предупреждения PRRS, существенно усиливая секрецию нейтрализующих антител при его введении свиньям, и может быть полезным образом использован в качестве вакцины для лечения PRRS.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

На ФИГ. 1 показана общая геномная структура вируса PRRS.

На ФИГ. 2 представлено схематическое изображение, на котором показана геномная структура химерного вируса LMY+BP2017, синтезированного вырезанием части клона вируса LMY ver2 и вируса ВР2017-2, соответственно, и их лигированием.

На ФИГ. 3 показано филогенетическое дерево PRRSV-вируса LMY ver2 и химерного вируса LMY+BP2017.

На ФИГ. 4 показаны различия пролиферативных свойств PRRSV-вируса LMY ver2 и химерного вируса LMY+BP2017 в свиных альвеолярных макрофагах (РАМ-клетках).

На ФИГ. 5 приведено сравнение различий секреции нейтрализующих антител после введения свиньям PRRSV LMY, химерного вируса LMY+BP2017 и фосфатно-солевого буферного раствора (PBS).

ВАРИАНТ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Далее настоящее изобретение будет описано подробно посредством примеров. Тем не менее, последующие примеры приведены лишь для пояснения настоящего изобретения, и настоящее изобретение не ограничено последующими примерами.

Поскольку РНК легко разрушается, после проведения всех действий посредством ее преобразования в ДНК клетки трансфицировали, синтезируя РНК из полученной ДНК.

Пример 1: Получение химерного вируса 1-1.

Конструирование химерного вируса

Был сконструирован химерный вирус PRRS, содержащий область неструктурного белка (неструктурный белок 1-го типа, NSP1; SEQ ID NO: 11) мутантного штамма штамма LMY и областей ORF2, ORF3, ORF4, ORF5, ORF6 и ORF7 ВР2017-2, выделенного в 2017 г.

1-2. Получение ослабленного мутантного штамма LMY

Мутантный штамм LMY ver2 был получен заменой 91 основания нуклеотидной последовательности гена области NSP1 с использованием штамма LMY (регистрационный номер в GenBank DQ473474.1.), представляющего собой PRRS-штамм, выделенный традиционным Агентством по карантину. В гене области NSP1 были заменены 25 оснований области NSP1-альфа и 66 оснований области NSP1-бета.

Конкретно, рекомбинантный штамм LMY ver2 был получен посредством молчащей мутации части нуклеотидной последовательности в соответствии с принципом деоптимизации пар кодонов (Таблица 3) с применением общеизвестной программы SAVE (Synthetic Attenuated Virus Engineering [конструирование синтетических ослабленных вирусов]) или программы SAVE (Synthetic Attenuated Virus Engineering), разработанной авторами настоящего изобретения. Сначала программу SAVE использовали для количественной оценки показателя СРВ (предпочтения пар кодонов), представляющего собой предпочтение, формирующееся при взаимодействии кодонов гена вируса LMY, когда происходит образование их пар, с применением компьютерного алгоритма. Показатель СРВ изменяется при замене некоторых нуклеотидных последовательностей генов вируса LMY на другие нуклеотидные последовательности и тесно связан с пролиферативными свойствами вируса. Пролиферативные свойства вируса уменьшаются и ослабевают при деоптимизации показателя СРВ посредством замен в нуклеотидной последовательности (Virus Attenuation by Genome-Scale Changes in Codon Pair Bias, Science, 2008, J. Robert Coleman et al.). Авторы настоящего изобретения выбрали область NSP1 (NSP1-альфа и NSP1-бета, SEQ ID NO: 11) с высокой генетической стабильностью в геноме исходного штамма LMY, проанализировали ее программой SAVE и выбрали 25 оснований в области NSP1-альфа и 66 в области NSP1-бета, в общей сложности 91 основание, из областей оснований с относительно высокими показателями СРВ для получения мутантного штамма вируса LMY. Мутантный штамм вируса LMY с мутацией 91 нуклеотида в последовательности NSP1 (SEQ ID NO: 12), полученный описанным методом, был назван LMY ver2, и его нуклеотидная последовательность показана в Таблице 3 ниже. LMY ver2 имеет регистрационный номер 13394 ВР.

(В Таблице 3 участки последовательностей гена NSP1 LMY ver2, выделенные подчеркнутым полужирным шрифтом, представляют собой участки с мутациями оснований гена NSP1 LMY или гена NSP1-бета LMY.)

Затем, для подтверждения степени ослабления мутантного штамма LMY ver2 измеряли показатель СРВ. Измеренный показатель СРВ NSP1 исходного штамма LMY составлял приблизительно 0,0139, и измеренный показатель СРВ NSP1-бета составлял приблизительно 0,016, но измеренный показатель СРВ мутантного штамма LMY ver2 по настоящему изобретению составлял приблизительно -0,2393 для NSP1 и приблизительно -0,33 для NSP1-бета. Исходя из этого был сделан вывод об уменьшении пролиферативных свойств мутантного штамма LMY ver2 по настоящему изобретению в сравнении с традиционным исходным штаммом и о том, что данный штамм является ослабленным.

Затем получали инфекционный клон LMY ver2.

Сначала проводили разделение полноразмерной генной последовательности штамма LMY (регистрационный номер в GenBank DQ473474.1.) на 7 фрагментов и их синтез, соответственно. Из этих 7 фрагментов фрагмент 1 представлял собой область NSP1, и эту область синтезировали как фрагмент ДНК (SEQ ID NO: 12) с заменой 91 основания в генной нуклеотидной последовательности области NSP1 штамма LMY. Синтезированный генный фрагмент последовательно разрезали рестриктазами, показанными в Таблице 5 ниже, и лигировали лигазой с получением одного инфекционного клона.

1-3. Конструирование химерного вирусного клона

Согласно схематическому изображению на ФИГ. 1, вирус PRRS содержит в общей сложности 8 ORF, а именно ORF1a, ORF1b и ORF2-7.

Из геномной области, содержащей полноразмерный структурный ген мутантного штамма LMY ver2, амплифицированный в Примере 1-1, области ORF2-ORF7 вырезали с использованием рестриктаз AscI и PacI. Затем геномную область штамма ВР2017, тот ее участок, который соответствует областям ORF2-ORF7 мутантного штамма LMY ver2, разрезали теми же рестриктазами AscI и PacI, и после этого участок ORF1a и ORF1b мутантного штамма LMY ver2 и участок, соответствующий областям ORF2-ORF7 штамма ВР2017, лигировали лигазой с получением рекомбинантного инфекционного клона, названного LMY+BP2017. Использованные рестриктазы показаны в Таблице 6 ниже.

Готовый инфекционный клон вводили в вектор с большим числом копий, в который были введены промотор CMV и ген устойчивости к ампициллину, затем трансфицировали им клетки ВНК (Корейский банк клеточных линий) с использованием липофектамина и в результате получали химерный вирус LMY+BP2017 по настоящему изобретению.

Химерный вирус LMY+BP2017 был депонирован в Микробном ресурсном центре Корейского исследовательского института биологических наук и биотехнологии (Microbial Resource Center of Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology) 24 октября 2018 г. с присвоением регистрационного номера KCTC13675 ВР.

Пример 2. Измерение показателей CpG и UpA химерного вируса LMY+BP2017

Для оценки пролиферативных свойств химерного вируса LMY+BP2017, полученного в Примере 1, измеряли отношения CpG и UpA гена NSP1 химерного вируса LMY+BP2017 и показатели CpG и UpA гена NSP1-бета исходного штамма LMY.

Изменение отношений CpG и UpA вирусного гена является неизбежным результатом деоптимизации, и увеличение показателей CpG и UpA данного гена приводит к клеточному стрессу и уменьшению пролиферативных свойств вируса. Отношения CpG и UpA гена NSP1-бета химерного вируса LMY+BP2017 и вируса LMY измеряли с использованием программы SSE (версии 1.2), и полученные результаты показаны в Таблице 7 ниже.

Как показано в Таблице 7, было подтверждено, что показатели CpG и UpA химерного вируса LMY+BP2017 увеличивались по сравнению с исходным штаммом LMY, и, исходя из этого, удалось подтвердить значительное уменьшение пролиферативных свойств химерного вируса LMY+BP2017 по сравнению с исходным штаммом LMY.

Пример 3. Идентификация химерного штамма LMY+BP2017 3-1. Идентификация химерного штамма LMY+BP2017

Для идентификации химерного штамма LMY+BP2017 секвенировали области NSP1 химерного штамма LMY+BP2017, синтезированного в Примере 1, и штамма LMY (регистрационный номер в GenBank DQ473474.1.).

Конкретно, ПЦР проводили с использованием набора праймеров, приведенных в Таблице 8, позволяющего выявлять 1-1654 нуклеотиды, включая область NSP1, вируса LMY и набор для одностадийной ОТ-ПЦР (Intron) и, конкретно, после начальной ОТ при 45°С на протяжении 30 минут и 95°С на протяжении 5 минут, реакцию проводили при 94°С на протяжении 30 секунд, при 61°С на протяжении 30 секунд и при 72°С на протяжении 2 минут, повторяя этот цикл 38 раз. Затем продукты, амплифицированные в результате ПЦР, секвенировали, завершая идентификацию каждого штамма.

3-2. Сравнение гомологии с другими штаммами и филогенетическое дерево

Для подтверждения генетических различий между рекомбинантным вирусным штаммом LMYver2 по настоящему изобретению, полученным в Примере 1, и известным штаммом вируса PRRS измеряли идентичность последовательностей каждого штамма в области NSP1 с использованием программы Bio Edit, и результаты сравнения гомологии показаны в Таблице 9.

Как показано в Таблице 9, из результатов сравнения гомологии видно, что химерный вирус LMY+BP имеет уникальную последовательность, отличающуюся от других PRRS-штаммов.

Исходя из результатов сравнения гомологии, анализировали филогенетическое дерево с использованием программы BioEdit, повторяя анализ («Bootstrap») 1000 раз. На основании этого было построено приблизительное филогенетическое дерево химерного вируса LMY+BP2017 и LMY, показанное на ФИГ. 3. Исходя из филогенетического дерева, представленного на ФИГ. 3, можно определить систематическое положение настоящего вируса.

3-3. Исследование клеточного пассажа

Было проведено подтверждение продолжительности сохранения модифицированной области при пассаже химерного вируса LMY+BP2017, полученного в Примере 1. Химерный вирус LMY+BP2017 по настоящему изобретению стабилизировали 30-кратным пассажем в клетках MARC-145, являющихся известной клеточной линией, восприимчивой к вирусу PRRS, и для подтверждения мутаций гена каждые 10 пассажей проводили секвенирование с применением того же метода, что в Примере 3-1.

В результате подтверждающего секвенирования было подтверждено, что область замен в гене настоящего вируса оставалась неизменной даже после стабилизации 30 пассажами. В Таблице 10 ниже показаны число мутаций оснований (изменения нуклеотидов), сайты мутаций и аминокислотные мутации (изменения аминокислот) после каждого числа пассажей.

Как подтверждено в Таблице 10, даже при проведении более чем 30 пассажей мутации генов NSP1a или NSP1b ORF1a оставались неизменными и были выявлены только мутации белка NSP2 или ORF2a. Таким образом, было подтверждено сохранение мутаций гена, кодирующего белок NSP1, у вируса, полученного в Примере 1, даже после 40 пассажей.

Пример 4: Сравнение пролиферативных свойств LMY и химерного LMY+BP

Для подтверждения пролиферативных свойств химерного вируса LMY+BP2017, полученного в Примере 1, количество вируса, полученного после приведения макрофагов (РАМ, Porcine Alveolar Macrophage [свиной альвеолярный макрофаг]) в контакт с химерным вирусом LMY+BP2017 и его исходным штаммом, подтверждали, измеряя TCID₅₀.

Конкретно, РАМ-клетки аликвотировали по 2×10⁶ клеток на лунку в 6-луночном планшете, содержавшем 2 мл среды RPMI (содержавшей 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 1% пенициллина и стрептомицина). Затем вносили LMY и химерный вирус LMY+BP2017 в разные лунки, соответственно, при отношении MOI 0,01, через 1 час после внесения весь супернатант удаляли и аликвотировали по 2 мл раствора поддерживающей среды RPMI (содержавшей 10% FBS, 1% пенициллина и стрептомицина). Через 2 суток после аликвотирования собирали супернатант из каждой лунки и измеряли TCID₅₀. Применительно к клеткам, использованным в последующем эксперименте, клетки MARC-145 сорбировали на лунки 96-луночного планшета по 2×10⁵ клеток на лунку аликвотированием со 100 мкл среды Игла, модифицированной по способу Дульбекко (DMEM) (10% (об./об.) FBS, 1% (масс./об.) пенициллина, стрептомицин) заранее, за день до измерения TCID₅₀.

Вносимый вирус подготавливали следующим образом. В крайнюю левую лунку ряда 96-луночного планшета аликвотировали 200 мкл супернатанта, собранного заранее, а в другие лунки аликвотировали по 180 мкл среды DMEM (FBS без добавления антибиотиков). Затем с использованием мультипипетки из каждой лунки, начиная слева, отбирали по 20 мкл и проводили десятикратное разведение, аликвотируя их в лунку справа. Разведение проводили последовательно, меняя наконечники, и последнюю 12-ю лунку оставляли как отрицательный контроль. Полученный разведенный раствор вируса вносили в планшет, на который были сорбированы клетки MARC-145. Затем весь культуральный раствор клеток MARC-145 удаляли, в каждую лунку аликвотировали по 200 мкл PBS и удаляли его, повторяя промывку 3 раза. После этого вносили полученный раствор вируса, аликвотируя по 100 мкл в каждую лунку, и через 2 часа после внесения весть внесенный раствор удаляли и аликвотировали по 100 мкл нового поддерживающего раствора (среда DMEM, 10% FBS, 1% пенициллина, стрептомицин).

На протяжении приблизительно 7 суток после аликвотирования в клетках подтверждали агрегацию и апоптоз, являющиеся разновидностями СРЕ (цитопатогенного эффекта), и, в завершение, рассчитывали коэффициент разведения, при котором СРЕ присутствовал в 4 лунках, представляющих собой половину из 8 растворов, в которые был внесен вирус, исходя из коэффициента разведения непосредственно перед лункой без СРЕ. Окончательное значение рассчитывали умножением на 10, исходя из 1 мл.

Химерный штамм LMY+BP2017 и исходный штамм LMY были приведены в контакт со свиными альвеолярными макрофагами (РАМ-клетками), и показатели TCID₅₀, измеренные за 1-2 суток, показаны в Таблице 11 ниже и на ФИГ. 4.

Как видно из Таблицы 11 и ФИГ. 4, согласно показателю ТСID₅₀, измеренному на 2 сутки внесения штамма, когда вирус начинает образовываться в больших количествах, химерный LMY+BP2017 продемонстрировал в 100 раз меньший показатель TCID₅₀, чем LMY. Исходя из этого, можно было видеть, что пролиферативные свойства химерного вируса LMY+BP2017 по настоящему изобретению в РАМ-клетках (свиных альвеолярных макрофагах), являющихся основными инфицированными клетками при PRRS, были как минимум в 10 раз меньше, чем у LMY, и удалось подтвердить, что химерный вирус LMY+BP2017 по настоящему изобретению был ослабленным, поскольку его пролиферативные свойства были меньше, чем у исходного штамма LMY.

Пример 4: Подтверждение паттерна секреции нейтрализующих антител

Для подтверждения паттерна секреции нейтрализующих антител после введения химерного вируса по настоящему изобретению 12 свиней в возрасте 3 недель разделяли на 3 группы, по четыре свиньи в каждой, и вводили им LMY (10⁵ TCID₅₀), химерный вирус LMY+BP2017 (10⁵ ТСID₅₀) и PBS, по 2 мл каждое. Через 4 недели у свиней из каждой группы получали венозную кровь, выделяли по 2 мл сыворотки и измеряли количество нейтрализующих антител в сыворотке.

Конкретно, анализ проводили общеизвестным методом. До начала анализа все образцы сыворотки инактивировали нагреванием до 56°С на протяжении 45 минут. Инактивированную сыворотку добавляли к среде RPMI 1640 (10% FCS, 20 мМ L-глутамина, смесь антибиотиков и противогрибковых агентов: 100 МЕ/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 50 мкг/мл гентамицина, 0,25 мкг/мл амфотерицина В) и затем проводили двукратное разведение. После этого отбирали по 100 мкл каждой разведенной сыворотки и смешивали со 100 мкл подготовленного заранее штамма VR2332, 200 ТСID₅₀/мл, инкубировали при 37°С на протяжении 1 часа и затем приводили в контакт с монослоем клеток Marc-145, культивированных за день до этого. Затем, после инкубации при 37°С на протяжении одного часа, все внесенные растворы удаляли и заменяли на 200 мкл культурального раствора RPMI. После этого цитопатический эффект (СРЕ) проверяли каждый день, проводя культивирование при 37°С, и в каждой лунке СРЕ подтверждали после 5 суток культивирования. В лунках без СРЕ рост вируса подтверждали, проводя окрашивание антителом SDOW 17. Титр нейтрализующих антител измеряли, рассчитывая реципрокное значение максимального коэффициента разведения без признаков роста вируса, и результаты измерений показаны в Таблице 11 ниже и на ФИГ. 5.

Как показано в Таблице 11 и на ФИГ. 5, удалось подтвердить, что химерный вирус LMY+BP2017 приводил к значимо высокой секреции нейтрализующих антител клетками по сравнению с исходным штаммом LMY.

--->

Перечень последовательностей

<110> BioPoA, Inc.

REPUBLIC OF KOREA(Animal and Plant Quarantine Agency)

<120> Chimeric virus of porcine reproductive and respiratory syndrome

virus, and vaccine using same

<130> OPP20194438KR

<150> KR 10-2018-0171306

<151> 2018-12-27

<150> KR 10-2019-0145389

<151> 2019-11-13

<160> 12

<170> KoPatentIn 3.0

<210> 1

<211> 609

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> NSP1-бета LMY ver2

<400> 1

gctgctgtct acgatgttgg tcatggcgcc gtcatgtatg tggccgatga gagagtctcc 60

tgggcccctc gcggcgggga cgaagttaga ttcgaaacgg tcccacagga gcttaagtcg 120

gttgcgaacc aactctgcac gtcgttccca ccccaccacg tagtcgatat gtctaagttc 180

gcctttaccg cccccggttg cggcgtatct atgcgggtcg aacgtcaata cggctgtctc 240

cccgccgata cggtccccga aggcaactgc tggtggagct tgttcgattc gctcccactc 300

gaagtgcaag gcaaagagat tcgccacgct aaccaattcg ggtatcagac taagcatggc 360

gtatccggta agtacctaca gcggaggctg caaattaacg gtctccgcgc agtcgctgac 420

cctaacggac ctttcgtcgt acagtacttc tccgtcaagg agagttggat ccgccacttg 480

aaactagcgg aagaacctag ttaccccggg ttcgaggacc tcctccgcat aagggttgag 540

tctaacacgt caccattggc taacaaggac gaaaaaattt tccggtttgg cagtcataag 600

tggtacggc 609

<210> 2

<211> 3188

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ORF2-ORF7 BP2017-2

<400> 2

atgaaatggg gtccatgcaa agcctttttt acaaaattgg ccaacttttt gtggatgctt 60

tcacggagtt cttggtgtcc attgttgata tcattatatt tttggccatt ttgtttggct 120

tcaccatcgc cggttggctg gtggtctttt gcatcagatt ggtttgctcc gcgatactcc 180

gtacgcgccc tgccattcac tctgagcaat tacagaagat cttatgaggc ctttctttcc 240

cagtgccaag tggacattcc cacctgggga actaaacatc ctttggggat gctttggcac 300

cataaggtgt caaccctgat tgatgaaatg gtgtcgcgtc gaatgtaccg catcatggaa 360

aaagcagggc aggctgcctg gaaacaggtg gtgagcgagg ctacgctgtc tcgcattagt 420

agtttggatg tggtggctca ttttcagcat ctagccgcca ttgaagccga gacctgtaaa 480

tatttggcct cccggctgcc catgctacac aacctgcgca tgacaggttc aaatgtaacc 540

atagtgtata atagcacttt gaatcaggtg tttgctattt ttccaacccc tggttcccgg 600

ccaaagcttc atgattttca gcaatggtta atagctgtac attcctccat attttcctct 660

gttgcagctt cttgtactct ttttgttgtg ctgtggttgc gggttccaat actacgtact 720

gtttttggtt tccgctggtt aggggcaatt tttctttcga actcacagtg aattacacgg 780

tgtgtccacc ttgcctcacc cggcaagcag ccacagagat ctacgaaccc ggtaggtctc 840

tttggtgcag gatagggtat gaccgatgtg aggaggatga tcatgacgag ctagggttta 900

tggtaccgcc tggcctctcc agcgaaggcc acttgactag tgtttacgcc tggttggcgt 960

tcttgtcctt cagctacacg gcccagttcc atcccgagat attcgggata gggaatgtga 1020

gtcgagttta tgttgacatc aaacatcaac tcatctgcgc cgaacatgac gggcagaaca 1080

ccaccttgcc tcgtcatgac aacatttcag ccgtgtttca gacctattac caacatcaag 1140

tcgacggcgg caattggttt cacctagaat ggcttcgtcc cttcttttcc tcgtggttgg 1200

ttttaaatgt ctcttggttt ctcaggcgtt cgcctgcaaa ccatgtttca gttcgagtct 1260

tgcagatatt aagaccaaca ccaccgcagc ggcaagcttt gctgtcctcc aagacatcag 1320

ttgccttagg catcgcgact cggcctctga ggcgattcgc aaaatccctc agtgccgtac 1380

ggcgataggg acacccgtgt atgttaccat cacagccaat gtgacagatg agaattattt 1440

acattcttct gatctcctca tgctttcttc ttgccttttc tatgcttctg agatgagtga 1500

aaagggattt aaggtggtat ttggcaatgt gtcaggcatc gtggctgtgt gtgtcaattt 1560

taccagctac gtccaacatg tcaaggagtt tacccaacgc tccctggtgg tcgaccatgt 1620

gcggttgctc catttcatga cacctgagac catgaggtgg gcaactgttt tagcctgtct 1680

ttttgccatt ctgttggcaa tttgaatgtt taagtatgtt ggagaaatgc ttgaccgcgg 1740

gctgttgctc gcaattgctt tctttgtggt gtatcgtgcc gttctgtttt gctgtgctcg 1800

ccaacgccag caacgacagc agctcccatc tacagctgat ttacaacttg acgctatgtg 1860

agctgaatgg cacagattgg ctagctaaca aatttgattg ggcagtggag agttttgtca 1920

tctttcccgt tttgactcac attgtctcct atggtgccct cactaccagc catttccttg 1980

acacagtcgc tttagtcact gtgtctaccg ccgggtttgt tcacgggcgg tatgtcctaa 2040

gtagcatcta cgcggtctgt gccctggctg cgttgacttg cttcgtcatt aggtttgcaa 2100

agaattgcat gtcctggcgc tacgcgtgta ccagatatac caactttctt ctggacacta 2160

agggcggact ctatcgttgg cggtcgcctg tcatcataga gaaaaggggc aaagttgagg 2220

tcgaaggtca tctgatcgac ctcaaaagag ttgtgcttga tggttccgtg gcaaccccta 2280

taaccagagt ttcagcggaa caatggggtc gtccttagat gacttctgtc atgatagcac 2340

ggctccagaa aaggtgcttt tggcgttttc tattacctac acgccagtga tgatatatgc 2400

cctaaaggtg agtcgcggcc gactgctagg gcttctgcac cttttgatct tcctgaattg 2460

tgctttcacc ttcgggtaca tgactttcgc gcactttcag agtacaaata aggtcgcgct 2520

cactatggga gcagtagttg cactcctttg gggggtgtac tcagccatag aaacctggaa 2580

attcatcacc tccagatgcc gtttgtgctt gctaggccgc aagtacattc tggcccctgc 2640

ccaccacgtt gaaagtgccg caggctttca tccgattgcg gcaaatgata accacgcatt 2700

tgtcgtccgg cgtcccggct ccactacggt caacggcaca ttggtgcccg ggttaaaaag 2760

cctcgtgttg ggtggcagaa aagctgttaa acagggagtg gtaaaccttg tcaaatatgc 2820

caaataacaa cggcaagcag cagaagagaa agaaggggga tggccagcca gtcaatcagc 2880

tgtgccagat gctgggtaag atcatcgctc agcaaaacca gtccagaggc aagggaccgg 2940

gaaagaaaaa taagaagaaa aacccggaga agccccattt tcctctagcg actgaagatg 3000

atgtcagaca tcactttacc cctagtgagc ggcaattgtg tctgtcgtca atccagaccg 3060

cctttaatca aggcgctggg acttgcaccc tgtcagattc agggaggata agttacactg 3120

tggagtttag tttgcctacg catcatactg tgcgcctgat ccgcgtcaca gcatcaccct 3180

cagcatga 3188

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> [A]n

<400> 3

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaa 24

<210> 4

<211> 15443

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Последовательность химерного вируса LMY-BP2017

<400> 4

atgacgtata ggtgttggct ctatgccttg acatttgtat tgtcaggagc tgtgaccatt 60

ggcacagtcc aaaacttgct gcgcagaaac acccttctgc gacagcctcc ttcaggggag 120

cttggggtct atccctagca ccttgcttct ggagttgcac tgctttacgg tctctccacc 180

cctttaacca tgtctgggat acttgatcgg tgcacgtgta cccccaatgc cagggtgttt 240

atggcggagg gccaagttta ctgcacacga tgtctcagtg cacggtctct ccttcccctg 300

aatctccaag tttctgagct cggggtgctg ggcctattct acaggcccga agagccactc 360

cggtggacgt tgccacgtgc attccccact gttgagtgct cccccgccgg ggcctgctgg 420

ctttctgcaa tctttccaat tgcacgaatg accagtggaa acctaaactt ccaacaaaga 480

atggtacggg tcgcagctga gatctacaga gttggccagc tcacccctgc agttttgaag 540

gctctacaag tttatgagcg gggttgccgc tggtatccca ttgttggacc tgtccctgga 600

gtggccgttt tcgccaactc cctgcatgtg agtgatagac ctttcccggg agcaactcac 660

gtattaacca acctgccact cccgcagaga cccaagcctg aggacttttg ccccttcgag 720

tgtgctatgg ctgctgtcta cgatgttggt catggcgccg tcatgtatgt ggccgatgag 780

agagtctcct gggcccctcg cggcggggac gaagttagat tcgaaacggt cccacaggag 840

cttaagtcgg ttgcgaacca actctgcacg tcgttcccac cccaccacgt agtcgatatg 900

tctaagttcg cctttaccgc ccccggttgc ggcgtatcta tgcgggtcga acgtcaatac 960

ggctgtctcc ccgccgatac ggtccccgaa ggcaactgct ggtggagctt gttcgattcg 1020

ctcccactcg aagtgcaagg caaagagatt cgccacgcta accaattcgg gtatcagact 1080

aagcatggcg tatccggtaa gtacctacag cggaggctgc aaattaacgg tctccgcgca 1140

gtcgctgacc ctaacggacc tttcgtcgta cagtacttct ccgtcaagga gagttggatc 1200

cgccacttga aactagcgga agaacctagt taccccgggt tcgaggacct cctccgcata 1260

agggttgagt ctaacacgtc accattggct aacaaggacg aaaaaatttt ccggtttggc 1320

agtcataagt ggtacggcgc tggtaagaga gcaaggaaag cacgctctcg tgcgactaat 1380

acagtcgctg accgcgcttt gtccgttcgt gaaatctggc aggccaagga gcatgaggtt 1440

accggcgcca ataaggctga gcacctcaaa cactactccc cacctgccga agggaattgt 1500

ggttggcact gcatttccgc catcgtcaac cggatggtta attccaaatt tgaaaccacc 1560

cttcccgaaa gagtgagacc tccagatgac tgggctaccg acgaggatct tgcgaatgcc 1620

atccaaatcc tcagactccc tgcggcctta gacaggaacg gtgcttgtgc tagcgccaag 1680

tacgtactta agctggaagg tgagcattgg actgtcactg tgacccctgg gatgtcccct 1740

tctttgctcc ctcttgaatg tgttcagggc tgttgtgggc acaagggcgg tcttggttcc 1800

ccagacgcag tcgaggtctc cggatttgac cctgcctgcc ttgaccgtct ggctgaggtg 1860

atgcacctgc ctagcagtgc tatcccagcc gctctggccg aaatgtctgg tgattccgat 1920

cgttcggctt ctccggtcac caccgtgtgg actgtttcgc agttctttgc ccgtcacagc 1980

ggaggaaatc accctgacca agtgcgctta gggaaaatca tcagcctttg tcaggtgatt 2040

gaggactgct gctgttccca gaacaaaacc aaccgggtca ccccggagga ggttgcagca 2100

aagattgacc tgtacctccg cggtgcaaca aatcttgaag aatgcttggc caggctcgag 2160

aaagcgcgcc cgccacgggt aatcgacacc ttctttgatt gggacgttgt gctccctggg 2220

gttgaggcag caacccaaac gaccaagctg ccccaggtca accagtgtcg tgctctggtc 2280

cctgttgtga ctcaaaagtc cttggacaac aactcggtcc ccctgaccgc cttttcactg 2340

gctaactact actaccgcgc gcaaggtgac gaagtttgtc accgtgaaag acttaatgcc 2400

gtgctttcca agctggaaga ggttgtccga gaagagtacg ggctcatgcc taccgggcct 2460

ggcccacggc ccacattgcc acgcgggctc gacgaactca aagaccagat ggaggtggac 2520

ttgctgaaac tggctaacgc ccaggcgact tctgacatga tggcttgggc agtcgagcag 2580

gttgacctaa aaacttgggt caagaactac ccgcggtgga tgccaccacc tcctccgcca 2640

aaagttcggc ctcgaaaaac gaagcctgtc aagagcttgc cagagggaaa gcccgccccc 2700

gcccctcgca ggagggttgg gactggttgt ggcagcccga cttcattggg cgatgatgtt 2760

cttaacagtt gggaagattt ggctgttggc agcccctcgg gtctcccgac cccccctgag 2820

ccggcaacac cttcgagtga gccagtggtt gtgtcagcac cgcagtgcat cttcagaccg 2880

gcgacgccct tgagtgagcc gaccccaatt cccgcacccc gtgggactgc gtctcgacca 2940

gtgacacctt tgagcgagcc gatccctgtg cctgcaccgc ggcgtaaatt tcagcaggcg 3000

agaaagttga gttcggcggt ggtaattccg ccgtaccagg acgagcccct ggatttgtcc 3060

gcttcctcgc tgactgaata tgaagccctt cctctagcgc cgccgcaaag cgagggcgct 3120

ctaagagtgg aggggcatga agttgaggaa gccctgagtg aaatctcaga catgtcgggt 3180

ggcactaaac ctgcgcccgt atcatcaagc agctccttgt ccagcgtgag aatcacacgc 3240

ccaaaacact cagctcaagc catcatcgac tcggtcgggc cctgcagtgg gcatctccaa 3300

gaggtgaagg agatatgcct tagtgtcatg cgcgaggcat gtgatgcgac taagctcaat 3360

gaccccgcta cgcaggaatg gctctctcgc atgtgggatc gggtggacat gctgacttgg 3420

cgcaacacgt ctgcttacca gacgcttagc accttaggtg gctggtcaag gttcctccca 3480

aaattgatac ttgagacacc gccgccctac ccgtgtgagt ttgtgatgat gccttacacg 3540

cctgcacctt ccgtgggtgc ggagagcgac ctcaccattg gctcagttgc tactgaggat 3600

gttccacgca tccttgagaa catggagaat gtcggcgaga tgactaacca gggacccttg 3660

gccttctccg aggataaacc ggtggatgac caaccttccg aagacctccg gacatcgtcg 3720

caaggacctg acgggagcac atcagctccg tccgcagata cagctggcgc cggctcatcc 3780

accgatttgc cgtcttcagg cggcgtggat gcggacggag ggggaccgct tcgggcggta 3840

aaaagaaaaa ccgaacggct ctttgaccaa ctgagtcgtc aggtttttga cctcgtctcc 3900

catctcccta ttttcttctc acgcctcttc aaccctggcg gtggttactc tccgggtgat 3960

tggggttttg cagcttttac tctattgtgc ctctttttat gttacagtta cccagcattt 4020

ggcatcgttc ccctcttggg tgtattttct gggtcttctc ggcgcgtgcg aatgggggtt 4080

tttggctgct ggttggcttt tgctgttggt ctgttcaagc ctgtgtccga cccagtcggc 4140

gctgcttgtg agtttgactc gccagaatgc agaaacatcc ttcattcttt tgagcttctc 4200

aaaccttggg accctgttcg cagccttgtt gtgggccccg tcggtctcgg ttttgccatt 4260

cttggcaggc tactgggcgg ggcacgcagc atctggcact ttttgcttag gcttggcatt 4320

gttgcagact gtgtcttggc tggagcttat gtgctttctc aaggtaggtg caaaaagtgt 4380

tggggatctt gtataagaac cgctcctaat gaggtcgctt tcaacgtgtt tccttttacg 4440

cgtgcaacca ggtcgtcact tgttgacctt tgcgatcggt tttgtgcgcc gagaggcatg 4500

gaccccattt ttctcgccac tgggtggcgt ggatgctggg ccggtcggag ccccattgag 4560

caaccctctg aaaaacccat cgcgtttgcc caattggatg aaaagaagat tacggctagg 4620

actgtggtcg cccagcctta tgatcccaac caagccgtaa agtgcctgcg ggtattgcag 4680

gcgggagggg cgatggtggc tgaggcggtc ccaaaagtgg tcagggtttc cgctgttcca 4740

tttcgagccc ccttttttcc taccggagtg aaggttgacc ctgaatgtag agtagtggtt 4800

gaccctgaca ctttcactgc agctctccgg tctggttact ccaccacaaa cctcgtcctc 4860

ggtgtggggg actttgccca gctgaatgga ttaaaaatca ggcaaatttc taagccttca 4920

ggggggggcc cacatctcat ggctgccctg catgttgcct gctcgatgat tttgcacatg 4980

tttgctggga tttatgtgac tgcggtgggt tcttgcggca ccggcaccaa cgatccgtgg 5040

tgcgcaaacc catttgccgt ccctggctac ggacctggct ccctctgcac gtccagattg 5100

tgtatttccc agcacggcct taccctgccc ttgacagcac ttgtggcggg attcggcatc 5160

caggaaattg ccttagtcgc tttgatcttt gtttccatcg gaggcattgc tcataggttg 5220

agttgtaaag ctgacatgct gtgtgttttg cttgcaattg ccagctatgt ttgggtacct 5280

cttacctggt tactttgtgt ttttccttgc tggttgcgct ggttttcttt gcatcccctt 5340

accgtcctat ggttggtgtt tttcttgatt tctgtgaata tgccttcagg aatcttggcc 5400

atggtgttgt tagtttctct ttggcttctt ggtcgttata ctaatgtcgc cggtcttgtc 5460

actccctacg acattcatca ttacaccagt ggcccccgcg gtgttgccgc attggctact 5520

gcaccagatg gaacctactt agccgctgtt cgccgcgctg cgttgactgg ccgcaccatg 5580

ttgttcaccc cgtcccagct tgggtctctt cttgagggcg ctttcagaac tcgaaagccc 5640

tcactgaaca ccgtcaatgt ggtcgggtcc tccatgggct ctggcggggt gtttaccatt 5700

gacgggaaag tcaggtgcgt gactgccaca catgtcctta cgggtaactc agccagggtt 5760

tccggaaccg gcttcaatca aatgcttgac tttgacgtaa aaggggattt cgctatagcc 5820

gattgcccga attggcaagg ggctgccccc aaaacccaat tctgcgagga tggatggact 5880

ggccgtgcct attggctaac atcctctggc gtcgaacccg gcgtcattgg gaaaggattc 5940

gccttctgct tcaccgcgtg cggcgattcc gggtccccag tgatcaccga ggccggtgag 6000

cttgtcggtg ttcacacggg atcgaataaa caaggggggg gtattgtcac acgcccctca 6060

ggccagtttt gtaatgtggc acccatcaag ctgagcgaat taagtgaatt ctttgctggg 6120

cctaaggtcc cgctcggtga tgtgaaggtt ggcagccaca taatcaaaga cacaagcgag 6180

gtgccttcag atctttgtgc cttgcttgct gccaaacctg aactggaagg aggtctctcc 6240

accgtccaac ttctgtgtgt gtttttcctt ctgtggagaa tgatgggaca tgcctggacg 6300

cccttggttg ctgtgggttt ctttattttg aatgagattc tcccggccgt cctggtccgg 6360

agtattttct cctttggaat gtttgtgcta tcctggctca cgccatggtc tgcgcaagtt 6420

ctgatgatca ggctcctgac agcagctctt aacaggaata gatgttcact tgcctttttc 6480

agcctcggtg cagtgaccgg ttttgttgca gatcttgcgg ctactcaggg gcatccgttg 6540

caggcagtga tgaatttgag cacctatgca ttcctgcctc gggtaatggt tgtgacttca 6600

ccagtcccag tgatcgcgtg tggtgttgtg cacctactcg ccatcattct gtacctgttt 6660

aaataccgta gcctgcacca tatccttgtt ggcgatggag tgttctcttc ggccttcttc 6720

ctgcgatatt ttgccgaagg aaagttgagg gaaggggtgt cacaatcctg cggaatgaat 6780

catgagtctc tgactggtgc cctcgctatg agactcaatg acgaggactt ggatttcctc 6840

atgaaatgga ctgattttaa gtgcttcgtt tctgcgtcca acatgaggaa tgcagcgggt 6900

caatttatcg aggctgcata tgctaaagca cttagagttg aactggccca gttggtgcag 6960

gttgataagg ttcgaggtac tatggccaaa cttgaagctt ttgctgatac tgtggcacct 7020

caactctcgc ccggtgatat tgttgtcgct ctcggccaca cgcctgttgg cagtatcttc 7080

gacttaaagg ttggtagcac caagcatacc ctccaagcca ttgagaccag ggttcttgct 7140

gggtccaaaa tgaccgtggc gcgcgtcgtc gacccgaccc ccacgccccc acccgcgccc 7200

gtgcccatcc ccctcccacc gaaagttctg gagaatggcc ccaacgcttg gggggatgag 7260

gaccgtttga ataagaagaa aagacgcagg atggaagccc tcggcatcta tgttatgggc 7320

gggaaaaagt accagaaatt ttgggacaag aactccggtg atgtgtttta tgaggaggtc 7380

cataacaaca cagatgagtg ggagtgtctc acagttggcg accctgccga ctttgaccct 7440

gagaagggaa ccctgtgtgg acatgtcacc attgacaaca aggcttacca tgtttacacc 7500

tcctcatctg gtaagaagtt cttggttccc gtcaacccag agaacggaag agttcaatgg 7560

gaagctgcaa agctttccgt ggagcaggcc ctaggcatga tgaatgtcga cggcgaactg 7620

actgccaagg aactggagaa actgaaaaga ataattgaca aactccaggg cctgactaag 7680

gagcagtgtt taaactgcta gccgccagcg acttgacccg ctgtggtcgc ggcggcttgg 7740

ttgttactga gacagcggtg aaaatagtca aatttcacaa tcggactttc actctggggc 7800

ctgtgaattt aaaagtggcc agtgaggttg agctaaaaga tgcggttgag cacaaccaac 7860

acccggttgc gaggccgatc gatggtggag ttgtgctcct gcgttccgcg gttccctcgc 7920

ttatagacgt cttgatctcc ggtgctgaca catctcccaa gttacttgcc cttcacgggc 7980

cgggaaacac tgggatcgat ggcacgctct gggatttcga gtccgaagcc actaaagagg 8040

aagtcgcact cagtgcgcaa ataatacagg cttgtgacat taggcgtggc gacgctcctg 8100

aaattggtct cccttataag ctgtaccctg ttaggggcaa ccctgagcgg gtgaaaggag 8160

ttctgcagaa tacaaggttt ggagacatac cctacaaaac ccctagtgac accgggagcc 8220

cagtgcacgc ggctgcctgc cttacgccca acgccactcc tgtgactgat gggcgttccg 8280

tcttggctac aaccatgccc cccgggtttg agttatatgt accgaccata ccagcgtctg 8340

tccttgatta ccttgactct aggcctgact gccctaaaca gctgacagag cacggctgcg 8400

aagacgccgc actgaaagac ctctctaaat atgacttatc tacccaaggc tttgtcttac 8460

ctggggttct tcgccttgtg cggaaatacc tgtttgccca tgtaggtaaa tgtccacccg 8520

ttcatcggcc ttctatttac cccgctaaga attctatggc tggaataaat gggaacaggt 8580

tcccaaccaa agacatccag agcgttcctg aaatcgacgt tctgtgcgca caggctgtgc 8640

gggaaaactg gcaaactgtc accccttgta ctcttaagaa acagtattgc gggaagaaga 8700

agaccaggac catactcggc accaataact tcattgcact ggcccaccga gcagtgttga 8760

gtggtgtcac ccagggcttc atgaaaaagg cgttcaactc gcccatcgcc ctcggaaaga 8820

acaagttcaa ggagctacag actccggtcc tgggcaggtg ccttgaagct gacctcgcat 8880

cctgtgatcg atccacgcct gcaattgttc gctggtttgc tgccaacctt ctttatgaac 8940

ttgcctgtgc tgaagagtat ctaccgtcgt atgtgctgaa ctgctgccac gacttactag 9000

tcacgcagtc cggcgcagtg actaagagag gtggcctgtc gtctggcgac ccgatcacct 9060

ctgtgtctaa caccatttac agtttggtga tctatgcaca gcacatggtg cttagttact 9120

ttaaaagtgg tcacccccat ggccttctgt tcttacaaga ccagctaaag tttgaggaca 9180

tgctcaaggt tcaacccctg atcgtctatt cggacgatct cgtgctgtat gccgagtctc 9240

ccaccatgcc aaattatcac tggtgggttg agcatctgaa tttgatgctg gggtttcaga 9300

cggacccaaa aaaaacagca ataacagatt cgccatcatt tctgggctgt agaataatga 9360

atgggcgcca gctagtcccc aaccgtgaca ggatcctcgc ggccctcgcc tatcacatga 9420

aggcaagtaa tgtttctgaa tactatgcct cagcggctgc aatactcatg gacagctgtg 9480

cttgtttgga gtatgatcct gaatggtttg aagaacttgt agttggaata gcgcagtgcg 9540

cccgcaagga tggctacagc tttcccggca cgccgttctt catgtccatg tgggaaaaac 9600

tcaggtccaa ttatgagggg aagaagtcga gagtgtgcgg gtactgcggg gccccggccc 9660

cgtacgctac tgcctgtggc ctcgacgtct gcatctacca cacccacttc caccagcatt 9720

gtccagtcac aatctggtgt ggccatccag cgggttctgg ttcttgtagt gagtgcaaat 9780

cccctgtagg gaaaggcaca aaccctttag acgaggtgct ggaacaagtc ccgtataagc 9840

ccccacggac cgttatcatg catgtagagc agggtctcac cccccttgat ccaggtagat 9900

accaaactcg ccgcggatta gtttccgtta ggcgtggaat taggggaaat gaagttgaac 9960

taccagacgg tgattatgct agcaccgcct tgctccctac ctgcaaagag atcaacatgg 10020

tcgctgtcgc ttccaatgta ttgcgcagca ggttcatcat cggcccaccc ggtgcaggga 10080

aaacatactg gctccttcaa caggtccagg acggtgatgt tatttacaca ccaactcacc 10140

agaccatgct tgacatgatc agggctttgg ggacgtgccg gttcaacgtc ccggcaggca 10200

caacgctgca attccctgtc ccctcccgca ccggtccgtg ggttcgcatc ctggccggcg 10260

gttggtgtcc tggcaagaat tccttcctag atgaagcagc gtattgcaac caccttgatg 10320

ttttgaggct tcttagcaaa actaccctca cctgtctagg agacttcaag caactccacc 10380

cagtgggttt tgattctcat tgttatgttt ttgacatcat gcctcaaact caactgaaga 10440

ccatctggag gttcggacag aatatctgtg atgccatcca gccagattac agggacaagc 10500

tcatgtccat ggtcaacaca acccgtgtga cctacgtgga aagacctgtc aggtatgggc 10560

aggtcctcac cccctaccac agggaccgag aggacgacgc catcactatt gactccagtc 10620

aaggcgccac attcgatgtg gtcacattgc atttgcccac taaagattca ctcaacaggc 10680

aaagagccct tgttgccatc accagggcta gacacgctat ctttgtgtat gacccacaca 10740

ggcagctgca gagcttgttt gatcttcctg caaaaggcac acccgtcaac cttgcagtgc 10800

accgcgacgg gcagctgatc gtacttgata gaaataacaa agaatgcacg gttgctcagg 10860

ctctaggcaa cggggataaa ttcagggcca cagacaagcg tgttgcagat tcactccgcg 10920

ccatttgtgc tgatctagaa gggtcgagtt ctccgctccc caaggtcgca cacaacttgg 10980

ggttttattt ctcacctgac ttaacacaat ttgccaaact cccagtggaa cttgcacctc 11040

attggcccgt ggtgacaacc cagaacaatg aaaagtggcc agatcggctg gtcgccagcc 11100

ttcgccctat ccataaatac agccgcgcgt gcatcggtgc cggctatatg gtgggccctt 11160

cggtgtttct aggcactcct ggggtcgtat catactttct tacaaaattt gttaaaggcg 11220

aggctcaaat gcttccagaa acagtcttca gcaccggccg aattgaggtg gattgccggg 11280

aatatcttga cgatcgggag cgggaagttg ctgcatccct cccacacgcc tttattggcg 11340

acgtcaaagg caccaccgtt ggcggatgtc atcatgtcac ctccaggtac cttcctcgct 11400

tccttcccaa agagtcagtt gcggtagtcg gggtctcaag ccccgggaaa gccgcgaagg 11460

caatgtgcac actgacagat gtgtacctcc cagatcttga agcctatctc cacccggaga 11520

cccagtccag gtgctggaaa atgatgttgg acttcaaaga agttcgactg atggtctgga 11580

aagacaaaac ggcctatttc caacttgagg gtcgttattt cacctggtat cagctcgcta 11640

gttatgcctc gtacgtccgt gttcctgtca actccacggt gtacttggac ccctgcatgg 11700

gcccagccca ttgcaacaga cgagttgtcg ggtccactca gtggggagct gacctcgcaa 11760

tcacccccta tgattatggc gccaagatca ttttgtctag cgcatatcac ggtgaaatgc 11820

cccctgggta caagattctg gcgtgtgcgg agttctcatt ggatgacccg gtcagataca 11880

aacacacctg gggatttgag tcggatacag cgtacctgta cgagttcact ggaaatggtg 11940

aggattggga agattataat gatgcgtttc gtgcgcgcca gaaagggaaa atttataagg 12000

ccactgccac cagcttgaag ttttatttcc ctccgggccc tgtcgttgaa ccaactttgg 12060

gcctgaactg aaggcgcgcc atgaaatggg gtccatgcaa agcctttttt acaaaattgg 12120

ccaacttttt gtggatgctt tcacggagtt cttggtgtcc attgttgata tcattatatt 12180

tttggccatt ttgtttggct tcaccatcgc cggttggctg gtggtctttt gcatcagatt 12240

ggtttgctcc gcgatactcc gtacgcgccc tgccattcac tctgagcaat tacagaagat 12300

cttatgaggc ctttctttcc cagtgccaag tggacattcc cacctgggga actaaacatc 12360

ctttggggat gctttggcac cataaggtgt caaccctgat tgatgaaatg gtgtcgcgtc 12420

gaatgtaccg catcatggaa aaagcagggc aggctgcctg gaaacaggtg gtgagcgagg 12480

ctacgctgtc tcgcattagt agtttggatg tggtggctca ttttcagcat ctagccgcca 12540

ttgaagccga gacctgtaaa tatttggcct cccggctgcc catgctacac aacctgcgca 12600

tgacaggttc aaatgtaacc atagtgtata atagcacttt gaatcaggtg tttgctattt 12660

ttccaacccc tggttcccgg ccaaagcttc atgattttca gcaatggtta atagctgtac 12720

attcctccat attttcctct gttgcagctt cttgtactct ttttgttgtg ctgtggttgc 12780

gggttccaat actacgtact gtttttggtt tccgctggtt aggggcaatt tttctttcga 12840

actcacagtg aattacacgg tgtgtccacc ttgcctcacc cggcaagcag ccacagagat 12900

ctacgaaccc ggtaggtctc tttggtgcag gatagggtat gaccgatgtg aggaggatga 12960

tcatgacgag ctagggttta tggtaccgcc tggcctctcc agcgaaggcc acttgactag 13020

tgtttacgcc tggttggcgt tcttgtcctt cagctacacg gcccagttcc atcccgagat 13080

attcgggata gggaatgtga gtcgagttta tgttgacatc aaacatcaac tcatctgcgc 13140

cgaacatgac gggcagaaca ccaccttgcc tcgtcatgac aacatttcag ccgtgtttca 13200

gacctattac caacatcaag tcgacggcgg caattggttt cacctagaat ggcttcgtcc 13260

cttcttttcc tcgtggttgg ttttaaatgt ctcttggttt ctcaggcgtt cgcctgcaaa 13320

ccatgtttca gttcgagtct tgcagatatt aagaccaaca ccaccgcagc ggcaagcttt 13380

gctgtcctcc aagacatcag ttgccttagg catcgcgact cggcctctga ggcgattcgc 13440

aaaatccctc agtgccgtac ggcgataggg acacccgtgt atgttaccat cacagccaat 13500

gtgacagatg agaattattt acattcttct gatctcctca tgctttcttc ttgccttttc 13560

tatgcttctg agatgagtga aaagggattt aaggtggtat ttggcaatgt gtcaggcatc 13620

gtggctgtgt gtgtcaattt taccagctac gtccaacatg tcaaggagtt tacccaacgc 13680

tccctggtgg tcgaccatgt gcggttgctc catttcatga cacctgagac catgaggtgg 13740

gcaactgttt tagcctgtct ttttgccatt ctgttggcaa tttgaatgtt taagtatgtt 13800

ggagaaatgc ttgaccgcgg gctgttgctc gcaattgctt tctttgtggt gtatcgtgcc 13860

gttctgtttt gctgtgctcg ccaacgccag caacgacagc agctcccatc tacagctgat 13920

ttacaacttg acgctatgtg agctgaatgg cacagattgg ctagctaaca aatttgattg 13980

ggcagtggag agttttgtca tctttcccgt tttgactcac attgtctcct atggtgccct 14040

cactaccagc catttccttg acacagtcgc tttagtcact gtgtctaccg ccgggtttgt 14100

tcacgggcgg tatgtcctaa gtagcatcta cgcggtctgt gccctggctg cgttgacttg 14160

cttcgtcatt aggtttgcaa agaattgcat gtcctggcgc tacgcgtgta ccagatatac 14220

caactttctt ctggacacta agggcggact ctatcgttgg cggtcgcctg tcatcataga 14280

gaaaaggggc aaagttgagg tcgaaggtca tctgatcgac ctcaaaagag ttgtgcttga 14340

tggttccgtg gcaaccccta taaccagagt ttcagcggaa caatggggtc gtccttagat 14400

gacttctgtc atgatagcac ggctccagaa aaggtgcttt tggcgttttc tattacctac 14460

acgccagtga tgatatatgc cctaaaggtg agtcgcggcc gactgctagg gcttctgcac 14520

cttttgatct tcctgaattg tgctttcacc ttcgggtaca tgactttcgc gcactttcag 14580

agtacaaata aggtcgcgct cactatggga gcagtagttg cactcctttg gggggtgtac 14640

tcagccatag aaacctggaa attcatcacc tccagatgcc gtttgtgctt gctaggccgc 14700

aagtacattc tggcccctgc ccaccacgtt gaaagtgccg caggctttca tccgattgcg 14760

gcaaatgata accacgcatt tgtcgtccgg cgtcccggct ccactacggt caacggcaca 14820

ttggtgcccg ggttaaaaag cctcgtgttg ggtggcagaa aagctgttaa acagggagtg 14880

gtaaaccttg tcaaatatgc caaataacaa cggcaagcag cagaagagaa agaaggggga 14940

tggccagcca gtcaatcagc tgtgccagat gctgggtaag atcatcgctc agcaaaacca 15000

gtccagaggc aagggaccgg gaaagaaaaa taagaagaaa aacccggaga agccccattt 15060

tcctctagcg actgaagatg atgtcagaca tcactttacc cctagtgagc ggcaattgtg 15120

tctgtcgtca atccagaccg cctttaatca aggcgctggg acttgcaccc tgtcagattc 15180

agggaggata agttacactg tggagtttag tttgcctacg catcatactg tgcgcctgat 15240

ccgcgtcaca gcatcaccct cagcatgatg ggctggcatt cttgaggcat ctcagtgttt 15300

gaattggaag aatgtgtggt gaatggcact gattgacatt gtgcctctaa gtcacctatt 15360

caattagggc gaccgtgtgg gggtgagatt taattggcga gaaccatgcg gccgaaatta 15420

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaa 15443

<210> 5

<211> 609

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Последовательность NSP1-бета LMY

<400> 5

gctgctgtct acgatgttgg tcatggcgcc gtcatgtatg tggccgatga gagagtctcc 60

tgggcccctc gtggcgggga tgaagtaaga tttgaaactg tcccacagga gctcaagtcg 120

gttgcgaacc aactctgcac ctccttccca ccccaccacg tagtggacat gtctaagttc 180

gcctttacag cccctgggtg tggtgtttct atgcgggtcg aacgtcaata tggctgtctc 240

cccgctgaca ctgtccccga aggcaactgc tggtggagct tgtttgactc gctcccattg 300

gaagtccagg gcaaagaaat tcgccatgct aaccaatttg gctaccagac caagcatggt 360

gtctctggta agtacctaca gcggaggctg caaattaatg gtctccgagc agtagctgac 420

ccaaatggac ctttcgtcgt acagtacttc tccgtcaagg agagttggat ccgccacttg 480

aaactagcgg aagaacccag ttaccctggg tttgaggacc tcctcagaat aagggttgag 540

tctaacacgt caccattggc taacaaggat gaaaaaattt tccggtttgg cagtcataag 600

tggtacggc 609

<210> 6

<211> 609

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Последовательность NSP1-бета LMY ver2

<400> 6

gccgccgtat acgacgtcgg acatggcgcc gttatgtacg ttgccgacga gagagtctcc 60

tgggcccctc gcggcggcga cgaagttaga ttcgaaacgg tcccacagga gcttaagtcg 120

gttgcgaacc aattatgtac gtcgttccca ccccaccacg tagtcgatat gtctaagttc 180

gcctttaccg cccccggttg cggcgtatct atgcgggtcg aacgtcaata cggctgtctc 240

cccgccgata cggtccccga aggcaactgt tggtggagct tgttcgattc gctcccactc 300

gaagtgcaag gcaaagagat tcgccacgct aaccaattcg ggtatcagac taagcatggc 360

gtatccggta agtacctaca gcgtaggctg caaatcaacg gtctccgcgc agtcgctgac 420

cctaacggac ctttcgtcgt acagtacttc tccgtcaagg agagttggat ccgccacttg 480

aaactggccg aagaacctag ttaccccggg ttcgaggacc tcctccgcat aagggttgag 540

tctaatacgt caccattggc taacaaggac gaaaaaattt tccggtttgg cagtcataag 600

tggtacggc 609

<210> 7

<211> 8

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Сайт распознавания рестриктазы AscI

<400> 7

ggcgcgcc 8

<210> 8

<211> 8

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Сайт распознавания рестриктазы PacI

<400> 8

ttaattaa 8

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Прямой ПЦР-праймер для амплификации ДНК LMY

<400> 9

atgacgtata ggtgttggct cta 23

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Обратный ПЦР-праймер для амплификации ДНК LMY

<400> 10

ctgaggattt ggatggcatt 20

<210> 11

<211> 1149

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Ген NSP1 LMY

<400> 11

atgtctggga tacttgatcg gtgcacgtgt acccccaatg ccagggtgtt tatggcggag 60

ggccaagttt actgcacacg atgtctcagt gcacggtctc tccttcccct gaatctccaa 120

gtttctgagc tcggggtgct gggcctattc tacaggcccg aagagccact ccggtggacg 180

ttgccacgtg cattccccac tgttgagtgc tcccccgccg gggcctgctg gctttctgca 240

atctttccaa ttgcacgaat gaccagtgga aacctaaact tccaacaaag aatggtacgg 300

gtcgcagctg agatctacag agttggccag ctcacccctg cagttttgaa ggctctacaa 360

gtttatgagc ggggttgccg ctggtatccc attgttggac ctgtccctgg agtggccgtt 420

ttcgccaact ccctgcatgt gagtgataga cctttcccgg gagcaactca cgtattaacc 480

aacctgccac tcccgcagag acccaagcct gaggactttt gccccttcga gtgtgctatg 540

gctgctgtct acgatgttgg tcatggcgcc gtcatgtatg tggccgatga gagagtctcc 600

tgggcccctc gtggcgggga tgaagtaaga tttgaaactg tcccacagga gctcaagtcg 660

gttgcgaacc aactctgcac ctccttccca ccccaccacg tagtggacat gtctaagttc 720

gcctttacag cccctgggtg tggtgtttct atgcgggtcg aacgtcaata tggctgtctc 780

cccgctgaca ctgtccccga aggcaactgc tggtggagct tgtttgactc gctcccattg 840

gaagtccagg gcaaagaaat tcgccatgct aaccaatttg gctaccagac caagcatggt 900

gtctctggta agtacctaca gcggaggctg caaattaatg gtctccgagc agtagctgac 960

ccaaatggac ctttcgtcgt acagtacttc tccgtcaagg agagttggat ccgccacttg 1020

aaactagcgg aagaacccag ttaccctggg tttgaggacc tcctcagaat aagggttgag 1080

tctaacacgt caccattggc taacaaggat gaaaaaattt tccggtttgg cagtcataag 1140

tggtacggc 1149

<210> 12

<211> 1149

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Ген NSP1 LMY ver2

<400> 12

atgtctggga tacttgatcg gtgcacgtgt acccccaatg ccagggtgtt tatggcggag 60

ggccaagttt actgcacacg atgtctcagt gcacggtctc tccttcccct gaatctccaa 120

gtttctgagc tcggggtgct gggcctattc tacaggcccg aagagccact ccggtggacg 180

ttgccacgtg cattccccac tgttgagtgc tcccccgccg gcgcatgctg gctttccgct 240

atctttccaa tcgcacgaat gaccagtgga aacctaaact tccaacaaag aatggtacgg 300

gtcgccgccg aaatatacag agtcgggcaa cttacgcccg ctgtattgaa ggctctgcaa 360

gtatacgagc ggggttgtag gtggtatccc atcgtaggac ctgtccctgg agtggccgtt 420

ttcgccaact ccctgcatgt gagtgataga cctttcccgg gagcaactca cgtattaacc 480

aacctgccac tcccgcagag acccaagcct gaggactttt gccccttcga gtgtgctatg 540

gccgccgtat acgacgtcgg acatggcgcc gttatgtacg ttgccgacga gagagtctcc 600

tgggcccctc gcggcggcga cgaagttaga ttcgaaacgg tcccacagga gcttaagtcg 660

gttgcgaacc aattatgtac gtcgttccca ccccaccacg tagtcgatat gtctaagttc 720

gcctttaccg cccccggttg cggcgtatct atgcgggtcg aacgtcaata cggctgtctc 780

cccgccgata cggtccccga aggcaactgt tggtggagct tgttcgattc gctcccactc 840

gaagtgcaag gcaaagagat tcgccacgct aaccaattcg ggtatcagac taagcatggc 900

gtatccggta agtacctaca gcgtaggctg caaatcaacg gtctccgcgc agtcgctgac 960

cctaacggac ctttcgtcgt acagtacttc tccgtcaagg agagttggat ccgccacttg 1020

aaactggccg aagaacctag ttaccccggg ttcgaggacc tcctccgcat aagggttgag 1080

tctaatacgt caccattggc taacaaggac gaaaaaattt tccggtttgg cagtcataag 1140

tggtacggc 1149

<---

Настоящее изобретение относится к биотехнологии, а именно к химерному вирусу репродуктивно-респираторного синдрома свиней (PRRS). Предложен химерный вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней (PRRSV), обеспечивающий иммунитет против PRRSV-инфекции. Вирус содержит полинуклеотид, состоящий из структурной формулы, где полинуклеотид представляет собой геном химерного вируса: 5'-[X]-[Y]-3', где [X] представляет собой генный фрагмент, полученный путем обработки генома мутантного штамма LMY ver2, имеющего регистрационный номер 13394 ВР, рестриктазами AscI и PacI, [Y] представляет собой генный фрагмент, полученный путем обработки генома мутантного штамма ВР2017-2, имеющего регистрационный номер 13393 ВР, рестриктазами AscI и PacI. Предложена вакцинная композиция от вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней. Химерный PRRSV-вирус по настоящему изобретению является более ослабленным, чем его исходный штамм, и поэтому стимулирует секрецию нейтрализующих антител, имея в то же время низкую патогенность и высокую стабильность, благодаря чему он может быть использован в качестве вакцины в эффективном предупреждении и лечении PRRS-заболеваний. 2 н. и 11 з.п. ф-лы, 5 ил., 12 табл., 4 пр.

1. Химерный вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней (PRRSV), обеспечивающий иммунитет против PRRSV-инфекции, содержащий полинуклеотид, состоящий из структуры структурной формулы 1, где полинуклеотид представляет собой геном химерного вируса:

[структурная формула 1]

5'-[X]-[Y]-3',

где [X] представляет собой генный фрагмент, полученный путем обработки генома мутантного штамма LMY ver2, имеющего регистрационный номер 13394 ВР, рестриктазами AscI и PacI,

[Y] представляет собой генный фрагмент, полученный путем обработки генома мутантного штамма ВР2017-2, имеющего регистрационный номер 13393 ВР, рестриктазами AscI и PacI.

2. Химерный PRRSV-вирус по п. 1, где полинуклеотид дополнительно содержит [А]n на 3'-конце [Y] структурной формулы 1,

где n представляет собой количество нуклеотидов с основанием аденином (А) и целое число от 1 до 100.

3. Химерный PRRSV-вирус по п. 1, где полинуклеотид представляет собой ДНК или РНК.

4. Химерный PRRSV-вирус по п. 1, где [X] содержит ген NSP1 мутантного штамма, где заменено основание в одном или более чем одном положении, выбранном из группы, состоящей из положения 222, положения 225, положения 237, положения 240, положения 252, положения 306, положения 309, положения 312, положения 315, положения 324, положения 327, положения 330, положения 333, положения 336, положения 339, положения 342, положения 345, положения 357, положения 363, положения 366, положения 378, положения 379, положения 381, положения 393, положения 396, положения 543, положения 546, положения 549, положения 555, положения 558, положения 561, положения 573, положения 579, положения 582, положения 588, положения 612, положения 618, положения 621, положения 627, положения 633, положения 639, положения 654, положения 673, положения 675, положения 678, положения 681, положения 684, положения 705, положения 708, положения 729, положения 735, положения 738, положения 741, положения 744, положения 747, положения 771, положения 786, положения 789, положения 792, положения 810, положения 825, положения 828, положения 838, положения 840, положения 846, положения 849, положения 858, положения 867, положения 879, положения 882, положения 885, положения 891, положения 900, положения 903, положения 906, положения 924, положения 936, положения 939, положения 948, положения 954, положения 963, положения 966, положения 1026, положения 1029, положения 1038, положения 1047, положения 1053, положения 1066, положения 1068, положения 1086, положения и положения 1110 нуклеиновокислотной последовательности гена NSP1, состоящей из нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:11.

5. Химерный PRRSV-вирус по п. 4, где ген NSP1 мутантного штамма представлен нуклеиновокислотной последовательностью SEQ ID NO:12.

6. Химерный PRRSV-вирус по п. 1, где [Y] представлен нуклеиновокислотной последовательностью SEQ ID NO:2.

7. Химерный PRRSV-вирус по п. 1, где структурная формула 1 представлена нуклеиновокислотной последовательностью SEQ ID NO:4.

8. Химерный PRRSV-вирус по п. 1, имеющий регистрационный номер KCTC 13675 ВР.

9. Вакцинная композиция от вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней, содержащая эффективное количество химерного PRRSV-вируса по п. 1.

10. Вакцинная композиция по п. 9, где вакцина представляет собой живую вакцину.

11. Вакцинная композиция по п. 9, дополнительно содержащая одно или более, выбранное из группы, состоящей из носителей, разбавителей, эксципиентов и адъювантов.

12. Вакцинная композиция по п. 9, где показатель цитопатических доз 50% (TCID₅₀) химерного вируса, измеренный после приведения свиных легочных макрофагов в контакт с вакцинной композицией и ее исходным штаммом (регистрационный номер в GenBank DQ473474.1.), представляет собой показатель TCID₅₀, составляющий от 0,01 до 0,1 по сравнению с показателем TCID₅₀ исходного штамма.

13. Вакцинная композиция по п. 9, где показатель нейтрализующих антител химерного вируса, измеренный после приведения свиных легочных макрофагов в контакт с вакцинной композицией и ее исходным штаммом (регистрационный номер в GenBank DQ473474.1.), составляет от 2 до 8 по сравнению с показателем нейтрализующих антител исходного штамма.