Способ оценки нарушения инвазии трофобласта путем исследования матриксной металлопротеиназы-9 в ворсинчатом хорионе при цитомегаловирусной инфекции Российский патент 2022 года по МПК G01N33/68 G01N33/569 G01N33/573 

Изобретение относится к медицине, в частности к акушерству, а также к научным исследованиям в области патологической физиологии и предназначено для оценки нарушения инвазии трофобласта у женщин с самопроизвольным выкидышем, ассоциированным с цитомегаловирусной инфекцией.

В настоящее время общепризнана ведущая роль нарушения инвазии трофобласта и последующей плацентации в индукции и манифестации поздних гестационных осложнений, повышающих перинатальную и младенческую смертность: синдрома задержки роста плода, преэклампсии, поздних преждевременных родов, отслойки плаценты [2].

Действительно, инвазия ворсинчатого трофобласта в ткань матки является ключевым процессом успешного эмбриогенеза и процессов плацентации. Деградация миоцитов вокруг спиральных артерий матки и замена эндотелиальных клеток эндоваскулярным трофобластом приводит в конечном итоге к расширению просвета сосудов, что необходимо для усиления межворсинчатого кровотока. Поверхностная инвазия трофобласта и неполное преобразование спиральных артерий приводит к развитию преэклампсии. При этом недостаточная степень инвазии трофобласта может привести либо к элиминации эмбриона уже в первые недели беременности, либо, в случае прогрессирования беременности, к ограничению ростовых возможностей плаценты в виде ее гипоплазии с последующим развитием акушерских осложнений [3].

Формирование плаценты является инвазивным процессом и неотъемлемо связано с преобразованием базальной мембраны и экстрацеллюлярного матрикса, в котором принимают участие целый ряд ферментов, в том числе система матриксных металлопротеиназ (ММР) [7].

ММР представляют собой тип цинк-зависимых эндопротеиназ, способных расщеплять почти все компоненты внеклеточного матрикса соединительных тканей. В настоящее время в литературе описано около 28 типов матриксных металлопротеиназ. Активность ММР в физиологических условиях регулируется рядом специфических ингибиторов, прежде всего тканевыми ингибиторами металлопротеиназ (ТIMP) [7]. ММР участвуют во многих физиологических процессах, таких как рост клеток, пролиферация, дифференцировка, миграция, апоптоз, эмбриональное развитие, морфогенез, репродукция и ремоделирование ткани, а также в различных патологических процессах: артритах, циррозе, злокачественном росте и сердечнососудистых заболеваниях. Во время беременности ММР и их ингибиторы играют главную роль в инвазии трофобласта в стенку матки. В свою очередь успешная инвазия трофобласта обеспечивает нормальное развитие тканей плаценты и эмбриона. На ранних стадиях беременности ММР подготавливают среду для последующего вторжения в плацентарное ложе. Экспрессия MMP-2 в первые 6-8 недель доминирует над экспрессией других ММР, играя главную роль в имплантации. В физиологических условиях TIMP-2 подавляет активность ММP-2 [17, 18, 21]. Нарушение регуляции секреции этих ферментов может препятствовать физиологической инвазии трофобласта [6, 15, 16].

В последнее время уделяется большое внимание изучению инвазивных процессов трофобласта и гестационной перестройке спиральных артерий матки при невынашивании беременности [5]. Невынашивание беременности до настоящего времени остается важнейшей проблемой общества. Ежегодно 15-20% всех желанных беременностей завершаются самопроизвольным абортом [1, 10]. При этом в структуре самопроизвольных абортов наблюдается достоверное увеличение доли неразвивающейся беременности на сроках 5-8 недель и уменьшение частоты поздних выкидышей [4]. Частота неразвивающейся беременности среди случаев самопроизвольных выкидышей на ранних сроках возросла с 10,0-20,0% до 45,0-88,6% за последние годы, в среднем составляет 18,9% [11].

У 78-85% пациенток с угрозой невынашивания беременности персистируют цитомегаловирусы, что объясняется высокой их тератогенностью и способностью нарушать формирование плаценты и эмбриональных тканей [8, 9].

Показано, что при цитомегаловирусной инфекции на ранних сроках беременности изменяются уровни связанных с имплантацией ММР-2 и ММР-9 в ворсинках хориона, что указывает на нарушение инвазивной способности, приводящей к невынашиванию беременности [22].

Выше изложенные данные определяют необходимость разработки способов оценки нарушения инвазии трофобласта с целью определения факторов, приводящих к развитию первичной плацентарной недостаточности у женщин с цитомегаловирусной инфекцией в анамнезе.

Изучение экспрессии MMP для понимания процессов имплантации, ремоделирования и плацентации, а также с целью диагностики осложнений беременности широко представлено в материалах исследований зарубежных авторов. При этом показано, что повышенный уровень MMP-9 в амниотической жидкости связан с преждевременным разрывом плодных оболочек [23]. В случаях гестационного диабета было установлено повышение уровня MMP -9 в сыворотке, тканях матки и плаценты [20].

Известны работы, в которых для прогноза плацентарных нарушений, используются уровни MMP-9 и цинка в амниотической жидкости [19], экспрессии рецептора эпидермального фактора роста, MMP-3 и MMP-9 при самопроизвольном аборте [12]. Оценена ассоциация полиморфизма в генах MMP-2, MMP -3, MMP-9 с риском привычного невынашивания беременности [13], а также с рецидивирующим спонтанным абортом [14].

Вышеперечисленные факторы как изолировано, так и в сочетании друг с другом могут свидетельствовать о нарушении процессов формирования фетоплацентарного комплекса. В связи с этим, наибольшую диагностическую ценность имеют способы, позволяющие проводить оценку угрожающих состояний беременности, связанных с нарушением инвазии трофобласта, в том числе инфекционного генеза.

Аналогами данного изобретения являются приведенные выше способы, основными недостатками которых является трудоемкость [12] и неспецифичность [13, 14, 19].

За прототип мы взяли исследования зарубежных авторов [22], которые исследовали in vitro влияние цитомегаловирусной инфекции на инвазию трофобласта на ранних сроках беременности путем определения экспрессии белка c-erbB-2, MMP-2, MMP-9.

Основными недостатками данного метода является то, что для повышения точности прогнозирования исследуются три параметра: белок c-erbB-2, MMP-2, MMP-9, тогда как наши исследования показали, что достаточно исследовать один показатель - MMP-9.

Кроме того, данный способ предусматривает возможность оценки факторов риска нарушения инвазии трофобласта у женщин с самопроизвольным выкидышем, ассоциированным с цитомегаловирусной инфекцией.

Указанные факторы могут быть устранены в заявленном способе.

Техническим результатом, достигаемым при осуществлении изобретения, является оценка инвазии трофобласта у женщин с самопроизвольным выкидышем, ассоциированным с цитомегаловирусной инфекцией.

Заявляемый технический результат достигается тем, что у женщин с самопроизвольным выкидышем, ассоциированным с цитомегаловирусной инфекцией, определяют в гомогенате ворсинчатого хориона содержание MMP-9 и при значении MMP-9, равном 19,21 нг/мл и менее, делают заключение о нарушении инвазии трофобласта.

Новизна заявляемого способа заключается в том, что впервые предлагается проводить оценку нарушения инвазии трофобласта у женщин с самопроизвольным выкидышем, ассоциированным с цитомегаловирусной инфекцией, по уровню MMP-9 в гомогенате ворсинчатого хориона. Ранее совокупность указанных признаков в оценке нарушения инвазии трофобласта, определяющего развитие первичной плацентрной недостаточности и невынашивание беременности, ассоциированное с цитомегаловирусной инфекцией, не использовалась.

Способ осуществляют следующим образом:

У женщин с цитомегаловирусной инфекцией, исследуют ворсинчатый хорион, полученный при выскабливании стенок полости матки после самопроизвольного аборта. Определение уровня MMP-9 проводят методом иммуноферментного анализа с использованием тест-систем «R&D Systems, Inc., Human MMP-9 (total) Immunoassay» (США). Учет реакции проводят на иммуноферментном анализаторе Stat Fax-2100 (США) согласно протоколам для постановки иммуноферментного анализа фирмы-производителя в гомогенате ворсинчатого хориона.

При значении MMP-9 19,21 нг/мл и менее делают заключение о нарушении инвазии трофобласта у женщин с самопроизвольным выкидышем, ассоциированным с цитомегаловирусной инфекцией.

Использование способа позволяет оценить нарушение инвазии трофобласта у женщин с самопроизвольным выкидышем и дает возможность установить причину первичной плацентарной недостаточности в патогенезе невынашивания беременности цитомегаловирусной этиологии при наименьшей трудозатратности и материальных расходах на приобретение реактивов путем исследования одного биологического образца - ворсинчатого хориона и использования одного метода исследования - иммуноферментного анализа.

Отличительными признаками данного способа являются: ранние сроки беременности до 12 недель, установлены диагностические величины MMP-9, при значении 19,21 нг/мл и менее делают заключение о нарушении инвазии трофобласта.

Проведен ROC-анализ для определения диагностической значимости оценки нарушения инвазии трофобласта: AUC=0,788; 95% доверительный интервал - 0,710-0,827; чувствительность - 92,6%, специфичность - 80,3%.

Таким образом, предложенный нами способ является эффективным для оценки нарушения инвазии трофобласта у женщин с самопроизвольным абортом, ассоциированным с цитомегаловирусной инфекцией, обладает высокой диагностической значимостью, чувствительностью и специфичностью.

Использование данного способа подтверждается примерами:

Пример 1. Пациентка О., 28 л., находилась на стационарном лечении в гинекологическом отделении Городской клинической больницы (г. Благовещенск). Поступила с болями внизу живота и кровянистыми выделениями из половых путей. Гинекологический анамнез осложнен: 1 медицинский аборт без осложнений.

Проведено исследование крови на ЦМВ, УЗИ органов малого таза.

По ИФА выявлены антитела IgM к ЦМВ, титр антител IgG - 1:1600, индекс авидности - 84%.

По УЗИ: в полости матки плодное яйцо с эмбрионом 6 недель 2 дня. Сердцебиение определяется. Гипертонус по задней стенки матки. Внутренний зев сомкнут. Ниже плодного яйца гематома небольших размеров (отслойка ворсинчатого хориона).

Диагноз: Беременность 6-7 недель. Угрожающий самопроизвольный выкидыш. Хроническая цитомегаловирусная инфекция, стадия обострения.

На третий день стационарного лечения усилились боли внизу живота и кровянистые выделения из половых путей. Выставлен диагноз самопроизвольный выкидыш в ходу при сроке 7 недель беременности. Проведено выскабливание стенок полости матки.

По заявленному способу в гомогенате ворсинчатого хориона определено содержание MMP-9, которое составило 17,23 нг/мл.

Заключение: Нарушение инвазии трофобласта.

Пример 2. Пациента М., 34 л., поступила в гинекологическое отделение Городской клинической больницы (г. Благовещенск) для проведения медицинского аборта. Гинекологический анамнез осложнен: 1 медицинский аборт без осложнений.

Проведено обследование крови на ЦМВ, УЗИ органов малого таза.

По ИФА титр антител IgG ЦМВ - 1:800, индекс авидности - 92%.

По УЗИ: в полости матки плодное яйцо с эмбрионом 7 недель 3 дня. Сердцебиение определяется. Внутренний зев сомкнут.

Диагноз: Беременность 7-8 недель. Хроническая цитомегаловирусная инфекция, латентная стадия.

При сроке 7 недель беременности проведен медицинский аборт.

По заявленному способу в гомогенате хориона определено содержание MMP-9 - 22,34 нг/мл.

Заключение: Физиологическое течение беременности. Угроза нарушения инвазии трофобласта отсутствует.

Таким образом, достаточный уровень экспрессии MMP-9 может быть предиктором успешной инвазии трофобласта и имплантации, тогда как сниженная экспрессия данного фермента может свидетельствовать о развитии первичной плацентарной недостаточности.

Предложенное изобретение позволяет эффективно выявлять причину невынашивания беременности у женщин с цитомегаловирусной инфекцией с целью профилактики репродуктивных потерь.

Список использованной литературы

1. Акушерство: Национальное руководство / под. ред. Э.К. Айламазяна, В.И. Кулакова, В.Е. Радзинского, Г.М. Савельевой. М.: ГЭОТАР-Медиа, 2009. 763.

2. Булатова Ю.С., Тетруашвили Н.К., Высоких М.Ю. Провоспалительные факторы митохондриального происхождения в патогенезе привычных выкидышей и ранних преждевременных родов // Акушерство и гинекология. 2017. №8. С. 5-9.

3. Воднева Д.Н., Шмаков Р.Г., Щеголев А.И. Роль маркеров инвазии трофобласта в развитии преэклампсии и опухолевой прогрессии //Акушерство и гинекология. 2013. №11. С. 9-12.

4. Гарина И.С., Радынова С.Б., Тюрина Н.А. Медицинская и социальная характеристика пациенток, прервавших беременность на поздних сроках путем медикаментозного аборта // Огарёв-Online. 2014. №12 (26). С. 8.

5. Гриневич В.Н. Морфологические особенности гестационной перестройки спиральных артерий в первом триместре беременности при незрелости плаценты // Фундаментальные исследования. 2011. №5. С. 37-42.

6. Гриневич Т.Н., Аврукевич М.А., Бернадцкая А.А., Гринь А.А. Связь матриксных металлопротеиназ с ранними эмбриональными потерями у женщин с привычным невынашиванием беременности // Актуальные проблемы медицины: сб. материалов итоговой научно-практической конференции. Гродно, 2021. С. 209-211.

7. Гришко Т.В., Ермола Ю.А. Морфогенез цитотрофобластической инвазии в течение осложненной преэклампсией беременности // Научно-методический электронный журнал «Концепт». 2017. Т. 42. С. 133-136.

8. Петров Ю.А., Блесманович А.Е., Алехина А.Г. Риски для беременной и плода при цитомегаловирусной инфекции // Главный врач Юга России. 2019. Т.36, №1. С. 91-96.

9. Петрова К.К. Клинико-функциональные и гормональные причины раннего невынашивания беременности при цитомегаловирусной инфекции //Здоровье. Медицинская экология. Наука. 2017. №4(71). С. 111-113.

Радзинский В.Е., Димитрова В.И., Майскова И.Ю. Неразвивающаяся беременность. М.: ГЭОТАР-Медиа, 2009. С. 23.

11. Радымова С.Б., Поршина О.В., Тувина М.О., Салах А.М. Исследование патогенетических аспектов неразвивающейся беременности у жительниц республики Мордовия // Медико-фармацевтический журнал. 2020. Т. 22, №6. С. 12-15.

12. Balci M, Özdemir G. Differential Expression of EGFR-1, MMP-3, and MMP-9 in Spontaneous Abortions, Induced Abortions, and Tubal Pregnancies // Turk Patoloji Derg. 2019; 35(1): 1-8. English. doi: 10.5146/tjpath.2018.01432.

13. Association of MMP-2, MMP-3, and MMP-9 Polymorphisms with Susceptibility to Recurrent Pregnancy Loss / A. Behforouz et al. // Fetal Pediatr Pathol. 2021; 40(5): 378-386. doi: 10.1080/15513815.2019.1710879.

14. Association of MMP2 and MMP9 gene polymorphisms with the recurrent spontaneous abortion: A meta-analysis / Y. Yan et al. // Gene. 2021; 30(767): 145173. doi: 10.1016/j.gene.2020.145173.

15. Expression and activity of matrix metalloproteinase 2 and 9 in human trophoblasts / K. Isaka et al. // Placenta. 2003; 24: 53-64. doi: 10.1053/plac.2002.0867.

16. Comparative study of the immunohistochemical expression of metalloproteinases 2, 7 and 9 between clearly invasive carcinomas and "in situ" trophoblast invasion / I. Ioannidis et al. // Neoplasma.2010; 57: 20-8. doi: 10.4149/neo_2010_01_020.

17. Moore C.S., Crocker S.J. An alternate perspective on the roles of TIMPs and MMPs in pathology // Am J Pathol. 2012; 180: 12-16. doi: 10.1016/j.ajpath.2011.09.008.

18. Circulating matrix metalloproteinase MMP-9 and MMP-2/TIMP-2 complex are associated with spontaneous early pregnancy failure / R. Nissi et al. // Reprod Biol Endocrinol. 2013; 15(11): 2. doi: 10.1186/1477-7827-11-2.

19. Ozdamar O, Gün I, Müngen E, Atay V. The assessment of the relationship between amniotic fluid matrix metalloproteinase-9 and zinc levels with adverse obstetric outcomes // Arch Gynecol Obstet. 2014; 290(1): 59-64. doi: 10.1007/s00404-014-3179-7.

20. Metalloproteinase 2 activity and modulation in uterus from neonatal streptozotocin-induced diabetic rats during embryo implantation / C. Pustovrh et al. // Reprod Fertil Dev. 2002; 14(7-8): 479-485. doi: 10.1071/rd02001.

21. Staun-Ram E, Goldman S, Gabarin D, Shalev E. Expression and importance of matrix metalloproteinase 2 and 9 (MMP-2 and -9) in human trophoblast invasion // Reprod Biol Endocrinol. 2004; 2: 59. doi: 10.1186/1477-7827-2-59.

22. In vitro study on human cytomegalovirus affecting early pregnancy villous EVT's invasion function / L. Tao et al. // Virol J. 2011; 11(8):114. doi: 10.1186/1743-422X-8-114.

23. Vadillo-Ortega F, Hernandez A, Gonzalez-Avila G, Bermejo L, Iwata K, Strauss JF 3rd. Increased matrix metalloproteinase activity and reduced tissue inhibitor of metalloproteinases-1 levels in amniotic fluids from pregnancies complicated by premature rupture of membranes // Am. J. Obstet. Gynecol. 1996; 174(4): 1371-1376. doi: 10.1016/s0002-9378(96)70687-7.

Изобретение относится к медицине, а именно к акушерству, и может быть использовано для оценки нарушения инвазии трофобласта у женщин с самопроизвольным выкидышем, ассоциированным с цитомегаловирусной инфекцией, путем исследования гомогената ворсинчатого хориона иммуноферментным методом. В гомогенате ворсинчатого хориона определяют содержание матриксной металлопротеиназы-9 (MMP-9). При значении MMP-9, равном или менее 19,21 нг/мл, делают заключение о нарушении инвазии трофобласта. Способ обеспечивает возможность оценки инвазии трофобласта у женщин с самопроизвольным выкидышем, ассоциированным с цитомегаловирусной инфекцией, за счет определения в гомогенате ворсинчатого хориона содержания MMP-9. 2 пр.

Способ оценки нарушения инвазии трофобласта у женщин с самопроизвольным выкидышем, ассоциированным с цитомегаловирусной инфекцией, путем исследования гомогената ворсинчатого хориона иммуноферментным методом, отличающийся тем, что в гомогенате ворсинчатого хориона определяют содержание матриксной металлопротеиназы-9 (MMP-9) и при значении MMP-9, равном или менее 19,21 нг/мл, делают заключение о нарушении инвазии трофобласта.