Способ прогнозирования невынашивания беременности в первом триместре путем оценки циклооксигеназы 2 и простагландина Е2 в периферической крови беременных при обострении цитомегаловирусной инфекции Российский патент 2023 года по МПК G01N33/68 G01N33/88 G01N33/569 G01N33/573 

Изобретение относится к области медицины, а именно к акушерству, а также к области научных исследований – патологической физиологии, и раскрывает способ прогнозирования невынашивания беременности в первом триместре путем исследования циклооксигеназы 2 (COX-2) и простагландина Е2 (PGE2) в периферической крови беременных при обострении цитомегаловирусной инфекции.

Невынашивание беременности в настоящее время остается одной из самых актуальных и сложных проблем современного акушерства, несмотря на многочисленные исследования в данной области [1, 2].

Известно, что ведущими звеньями патогенеза невынашивания беременности является избыточная сократительная активность миометрия и изменение микроциркуляции, приводящее к нарушению плацентации [3].

Этиология невынашивания разнообразна и зависит от многих причин. Самопроизвольный выкидыш или неразвивающаяся беременность часто вызваны не одним, а несколькими факторами, возникающими одновременно или последовательно [4, 5]. Наиболее частыми из них, по мнению большинства авторов, являются гормональные нарушения и хронические воспалительные процессы в эндометрии [6, 7]. Однако для механизма прерывания беременности, независимо от причины его вызвавшей, характерен ряд процессов с участием многих биологически активных веществ, в том числе простагландинов, обладающих выраженным вазопрессорным и миотоническим действием.

Простагландины имеют особое значение в репродуктивной системе, так как спектр их действия весьма широк [8]. Они стимулируют активность сперматозоидов, являются синергистами лютеинезирующего гормона, обеспечивая овуляцию, поддерживают жизнеспособность яйцеклетки, в родах вместе с окситоцином стимулируют сокращения миометрия матки, усиливают микроциркуляцию кровотока в матке и плаценте, расширяя сосуды в пуповине, тем самым обеспечивают плод кислородом. Известно, что при дефиците или избытке простагландинов возможны необратимые последствия для плода [9].

Простагландины играют фундаментальную роль в месте имплантации, регулируя два основных процесса во время инвазии эмбриона – децидуализацию и васкуляризацию [10]. Сообщалось, что простагландины участвуют в увеличении проницаемости сосудов, децидуализации стромы, росте и развитии бластоцист, рекрутировании лейкоцитов, транспорте эмбрионов, инвазии трофобласта и ремоделировании внеклеточного матрикса во время имплантации [11].

Простагландин E2 представляет собой гормон, выполняющий множество функций. В физиологических условиях PGE2 поддерживает лютеиновую функцию для развития эмбриона и ранней имплантации. Кроме того, он индуцирует экспрессию хемокинов, что позволяет трофэктодерме прикрепляться к децидуальной оболочке для имплантации [12]. На заключительном этапе беременности PGE2 способствует сокращению гладкой мускулатуры матки и наступлению родов [13]. Кроме этого, PGE2 известен как потенциатор воспаления и является основной фракцией простагландинов, продуцируемых плацентой. Он может регулировать баланс между ответами клеток Th1 и Th2, модулировать продукцию хемокинов и подавлять аллореактивность лимфоцитов децидуальных клеток на ранних сроках беременности [12, 14]. Помимо этого, PGE2 модулирует биохимическую и морфологическую дифференцировку трофобласта плаценты во время имплантации и плацентации [15].

По данным современных исследований, процессы имплантации и плацентации требуют развития сильной воспалительной реакции, которая создает условия для повреждения тканей эндометрия, трансформации эпителия матки, удаления продуктов обмена и формирования кровеносных сосудов, необходимых для адекватного функционирования фетоплацентарного кровообращения. Следовательно, первый триместр является провоспалительной фазой. Провоспалительная направленность иммунных реакций обусловливает активацию и повышение адгезивности эндотелия, что может приводить к нарушению лейкоцитарно-эндотелиальных взаимодействий [16].

Обострение цитомегаловирусной инфекции в период гестации ассоциировано с высокой концентрацией провоспалительных цитокинов, в том числе фактора некроза опухолей α [17], которые стимулируют продуцирование простагландинов и инициируют хемотаксис нейтрофилов, инфильтрацию и активацию, что приводит к синтезу и высвобождению металлопротеиназ. Помимо этого простагландины стимулируют сокращение матки, в то время как металлопротеазы вызывают созревание шейки матки и ухудшают хориоамниотические мембраны, вызывая их разрыв [18]. Простагландины, продуцируемые в амнионе, как правило, инактивируются простагландиндегидрогеназой, высвобождаемой хорионической тканью, тем самым предотвращая попадание простагландинов в миометрий и вызывая сокращения матки. Инфекция хориона ингибирует активность простагландиндегидрогеназы, тем самым позволяя простагландинам достигать миометрия и вызывать преждевременные сокращения [19-21].

Следует отметить тот факт, что проникновение инфекции в матку во время беременности сопровождается локальным повышением COX-2, и как следствие, продукции простагландинов [22]. В свою очередь, COX-2 и PGЕ2 контролируют процесс ангиогенеза путем повышения продукции эндотелиального фактора роста [23, 24], ангиопоэтина 1 и ангиопоэтина 2 [25]. Помимо этого, PGЕ2 опосредует действие половых стероидов на экспрессию эндотелиального фактора роста и ангиопоэтина, что приводит к увеличению проницаемости сосудов и ангиогенезу во время имплантации и децидуализации, соответственно [26].

Ангиогенез играет решающее значение для успешной плацентации и дальнейшего развития беременности. Дисфункция процесса ангиогенеза может рассматриваться как один из ключевых патофизиологических факторов, обусловливающих развитие заболеваний репродуктивной системы человека, в том числе невынашивания беременности.

Вышеперечисленные факторы как изолированно, так и в сочетании друг с другом могут вызывать нарушение эмбрионального развития и опосредуют запуск процессов отторжения. В связи с этим наиболее ценными являются способы прогнозирования ранних репродуктивных потерь до клинических проявлений и манифестации патологических состояний.

На основании описанных выше известных сведений, нами предложен способ прогнозирования невынашивания беременности в первом триместре путем оценки COX-2 и PGЕ2 в периферической крови беременных при обострении цитомегаловирусной инфекции.

В результате проведенного патентно-информационного поиска был найден способ раннего прогнозирования невынашивания беременности, основанный на определении экспрессии фермента, регулирующего синтез липидных медиаторов COX-2 и энзима, индуцирующего апоптоз – каспазы-3 [27].

Основным недостатком данного метода является его трудоемкость. Необходимо выделить РНК из эпителиальных клеток цервикального канала у женщин на ранних сроках беременности; провести обратную транскрипцию с получением ДНК; определить экспрессию COX-2 и каспазы-3 с помощью количественной полимеразной цепной реакции и провести расчет по уравнениям линейной дискриминантной функции.

Известен способ, предложенный нами ранее [28] оценки нарушения имплантации эмбриона при беременности, осложненной цитомегаловирусной инфекцией путем определения COX-2 в гомогенате ворсинчатого хориона.

Основным недостатком данного метода является то, что он позволяет определить причину развития угрозы раннего выкидыша после самопроизвольного прерывания беременности, ассоциированной с обострением цитомегаловирусной инфекцией.

За прототип мы взяли исследования зарубежных исследователей [24], которые изучали уровень экспрессии COX-2, простагландинов I2, D2, E2, F2α, уровень экспрессии мРНК рецептора, активируемого пролифератором пероксисом (PPARβ) и ретиноидного X-рецептора (RXRα), уровень экспрессии эндотелиального фактора роста в ворсинчатом хорионе при рецидивирующем самопроизвольном аборте.

Несмотря на очевидные достоинства, способ-прототип обладает рядом несовершенств: 1) проводится оценка прогностического порогового уровня большого числа исследуемых параметров (простагландины: I2, D2, E2, F2α, их рецепторы: PPARβ RXRα), а также уровень экспрессии эндотелиального фактора роста, что делает процедуру дорогостоящей; 2) не ставит задачу ранней диагностики невынашивания беременности при наличии вирусной инфекции у матери; 3) позволяет определить причину раннего выкидыша после самопроизвольного прерывания беременности.

Указанные факторы могут быть устранены в заявленном способе.

Техническим результатом, достигаемым при осуществлении предлагаемого изобретения, является повышение точности прогнозирования невынашивания беременности в первом триместре при обострении цитомегаловирусной инфекции.

Заявляемый технический результат достигается тем, что у беременных женщин с обострением цитомегаловирусной инфекции методом иммуноферментного анализа определяют в лизате мононуклеарных клеток содержание COX-2 в нг/мл с использованием тест-систем «Assay Desings, COX-2» (США) и в сыворотке крови концентрацию PGE2 в пг/мл с использованием наборов «Cloud-Clone Corp.» (США).

Полученные значения используют для вычисления прогностического индекса (ПИ), по формуле, разработанной с использованием дискриминантного анализа:

ПИ= –44,28–5,395× COX-2+0,315×PGE2,

где ПИ – дискриминантная функция, граничное значение которой 99,364.

При ПИ равном или больше граничного значения прогнозируют угрозу невынашивания беременности в первом триместре при обострении цитомегаловирусной инфекции. При ПИ меньше граничного значения прогнозируют отсутствие угрозы невынашивания беременности в первом триместре при обострении цитомегаловирусной инфекции.

Новизна заявляемого способа заключается в определении значений COX-2 в лизате мононуклеарных клеток и PGE2 в сыворотке крови у беременных женщин в первом триместре при обострении цитомегаловирусной инфекции для расчета прогностического индекса ПИ, по отношению которого к граничному значению дискриминантной функции прогнозируют угрозу невынашивания беременности в первом триместре при обострении цитомегаловирусной инфекции.

Ранее совокупность указанных признаков в прогнозировании угрозы невынашивания беременности в первом триместре при обострении цитомегаловирусной инфекции не использовалась.

Способ содержит следующие приемы:

1) у беременных женщин с обострением цитомегаловирусной инфекции методом иммуноферментного анализа в лизате мононуклеарных клеток определяют содержание COX-2 в нг/мл с использованием тест-систем «Assay Desings, COX-2» (США), в сыворотке крови – концентрацию PGE2 в пг/мл с использованием наборов «Cloud-Clone Corp.» (США);

2) с помощью дискриминантного уравнения определяют прогностический индекс ПИ= –44,28–5,395×COX-2+0,315×PGE2, где ПИ – дискриминантная функция, граничное значение которой 99,364;

3) определяют прогноз угрозы невынашивания беременности в первом триместре при обострении цитомегаловирусной инфекции: при ПИ равном или больше граничного значения, прогнозируют угрозу невынашивания беременности в первом триместре, при ПИ меньше граничного значения – прогнозируют отсутствие угрозы невынашивания беременности в первом триместре.

Вероятность правильного прогноза составляет 100%.

Результаты апробации метода

Пример 1. Больная Д., 28 л., в сроке 6 недель беременности госпитализирована в стационар гинекологического отделения ГАУЗ Амурской области «Городская клиническая больница» (г. Благовещенск) с жалобами на тянущие боли внизу живота, слизисто-сукровичные выделения из половых путей. Гинекологический анамнез осложнен: первая беременность в 24 года закончилась операцией медицинского аборта, осложнившегося эндометритом.

Проведено обследование: Взята кровь из вены на TORCH-инфекции и определены показатели содержания COX-2, PGE2, проведено ультразвуковое исследование органов малого таза. Иммуноферментным методом анализа выявлены антитела IgM к цитомегаловирусу, титр антител IgG составил 1:1600, индекс авидности – 94%.

По данным ультразвукового исследования в полости матки плодное яйцо с эмбрионом 5 недель 6 дней. Сердцебиение эмбриона регистрируется. Выявлен гипертонус матки. Внутренний зев сомкнут. Ниже плодного яйца гематома небольших размеров (отслойка ворсинчатого хориона).

Диагноз: беременность 7-8 недель. Угрожающий самопроизвольный выкидыш. Реактивация хронической цитомегаловирусной инфекции, стадия обострения.

По заявленному способу при лабораторном исследовании крови получены следующие показатели: содержание COX-2 в лизате мононуклеарных клеток – 23,0 нг/мл, концентрация PGE2 в сыворотке крови – 850,10 пг/мл. Прогностический индекс, рассчитанный по формуле, составил 99,42, что свидетельствовало о высоком риске прерывания беременности, в связи с чем пациентка отнесена в группу риска по реализации невынашивания беременности в первом триместре.

Проводилась сохраняющая терапия, однако на второй день нахождения в стационаре усилились боли внизу живота и кровянистые выделения из половых путей. Выставлен диагноз самопроизвольный выкидыш в ходу при сроке 7 недель беременности. Способ подтвердил высокие тестовые характеристики.

Пример 2. Больная А., 24 л., находилась на приеме у перинатолога в женской консультации №2 Городской клинической больницы (г. Благовещенск). Гинекологический анамнез осложнен: 1 медицинский аборт без осложнений. Проведен анализ крови на TORCH-инфекции, содержание COX-2, PGE2, ультразвуковое исследование органов малого таза.

По ИФА титр антител IgG – 1:1600, индекс авидности – 92%. Диагноз: Беременность 8 недель. Хроническая цитомегаловирусная инфекция, стадия обострения.

По данным ультразвукового исследования: в полости матки имеется эмбрион, соответствующий 8 недельной беременности. Сердцебиение эмбриона регистрируется. Внутренний зев сомкнут.

Диагноз: Беременность 8 недель. Хроническая цитомегаловирусная инфекция, стадия обострения.

По заявленному способу при лабораторном исследовании крови получены следующие показатели: содержание COX-2 в лизате мононуклеарных клеток – 12,75 нг/мл, концентрация PGE2 в сыворотке крови – 42,0 пг/мл. Прогностический индекс, рассчитанный по формуле, составил (-99,84). Указанный прогностический индекс в соответствии с предложенным способом позволяет прогнозировать отсутствие риска угрозы невынашивания беременности.

Приведенные примеры наглядно показывают точность прогнозирования невынашивания беременности в первом триместре при обострении цитомегаловирусной инфекции.

Способ прошел клиническую апробацию. С его помощью проведено прогнозирование угрозы прерывания беременности у 40 беременных женщин с обострением цитомегаловирусной инфекции. Правильный прогноз определялся в 100% случаев, что подтверждает высокую эффективность заявляемого способа.

Таким образом, избыточная продукция COX-2, PGE2 может являться одной из причин невынашивания беременности, так как данные соединения являются важными факторами эмбрионального развития.

Используемые источники

1. Нигаметзянова Г. Р. Неразвивающаяся беременность // Лечение и профилактика. 2017. № 2(22). С. 47-55.

2. Петров Ю.А, Арндт И.Г., Бахтина А.С. Иммунологические аспекты невынашивания беременности // Главный врач Юга России. 2021. № 1(76). С. 38-41.

3. Сухих Г.Т., Ванько Л.В. Иммунные факторы в этиологии и патогенезе осложнений беременности // Акушерство и гинекология. 2012. №1. С. 128-136.

4. Ткаченко Л.В., Костенко Т.И., Углова Н.Д., Шкляр А.Л. Невынашивание беременности // Вестник Волгоградского государственного медицинского университета. 2015. № 1(53). С. 3-9.

5. Батрак Н.В., Малышкина А.И. Факторы риска привычного невынашивания беременности // Вестник Ивановской медицинской академии. 2016. Т. 21, № 4. С. 37-41.

6. Колесниченко А.А., Петров Ю.А. Хронический эндометрит и невынашивание беременности // Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований. 2019. № 10-2. С. 313-317.

7. Чистякова Д.С. Гормональная недостаточность яичников и привычное невынашивание беременности // Журнал акушерства и женских болезней. 2008. Т. 57, № 2. С. 100-104.

8. Ишутина Н.А., Андриевская И.А. Простагландины и их роль в ранние периоды эмбрионального развития (обзор литературы) // Бюллетень физиологии и патологии дыхания. 2021. Вып. 80. С. 129-137. DOI: 10.36604/1998-5029-2021-80-129-137

9. Павлов С.А., Кутаев Е.М., Олейников Н.А. Роль простагландиновых соединений в репродуктивной системе животных // Актуальные проблемы биотехнологии и ветеринарной медицины: материалы междунар. научно-практ. конф. молодых ученых, Иркутск, 14-15 декабря 2017. Иркутск: Иркутский государственный аграрный университет им. А.А. Ежевского, 2017. С. 142-152.

10. Interaction between lysophosphatidic acid, prostaglandins and the endocannabinoid system during the window of implantation in the rat uterus / M.S. Sordelli et al. // PLoS One. 2012. Vol. 7(9): e46059. doi: 10.1371/journal.pone.0046059

11. Salleh N. Diverse roles of prostaglandins in blastocyst implantation // Scientific World Journal. 2014; 2014: 968141. doi: 10.1155/2014/968141.

12. Niringiyumukiza J.D., Cai H., Xiang W. Prostaglandin E2 involvement in mammalian female fertility: ovulation, fertilization, embryo development and early implantation // Reprod. Biol. Endocrinol. 2018. Vol. 16(1): 43. doi: 10.1186/s12958-018-0359-5

13. Prostaglandin-E2 deficiency during late pregnancy and the associated increase in interleukin-1β derived from periaortic lymph nodes lead to abortion / Q. Guo et al. // Mol. Hum. Reprod. 2019. Vol. 25(12). P. 825-837. doi: 10.1093/molehr/gaz058

14. Prostaglandin E2 receptor 3 signaling is induced in placentas with unexplained recurrent pregnancy losses / Y. Ye et al. // Endocr. Connect. 2018. Vol. 7(5). P. 749-761. doi: 10.1530/EC-18-0106

15. Comparative Study of PPARγ Targets in Human Extravillous and Villous Cytotrophoblasts / F. Liu et al. // PPAR Res. 2020; 2020:9210748. doi: 10.1155/2020/9210748

16. Рамазанова Э., Бапаева Г., Ахмедьянова Г., Хожамуратова А., Алишева А. Иммунологические аспекты неразвивающейся беременности в первом триместре гестации // Вестник КазГМУ. 2017. №4. С. 15-18.

17. Ишутина Н.А., Дорофиенко Н. Н., Андриевская И. А. Малоновый диальдегид и фактор некроза опухолей альфа при цитомегаловирусной инфекции в период беременности // Бюллетень физиологии и патологии дыхания. 2015. № 55. С. 78-81.

18. Improving survival of extremely preterm infants born between 22 and 25 weeks of gestation / K.L. Kyser et al. // Obstet Gynecol. 2012. Vol. 119(4). P. 795-800. doi: 10.1097/AOG.0b013e31824b1a03

19. Кривчик Г.В. Диагностика и прогнозирование внутриутробной инфекции: современные возможности и перспективы // Акушерство и гинекология. 2008. №2. С. 10-13.

20. Howson C.P., Kinney M.V., Lawn J.E.. March of dimes, PMNCH, save the children, WHO. Born too soon,‖ The Global Action Report on Preterm Birth, WHO., Geneva, Switzerland, 2012.

21. Tucker J., McGuire W. Epidemiology of preterm birth // BMJ. 2004. Vol. 329(7467). P. 675-678. doi: 10.1136/bmj.329.7467.675

22. Mitreski A., Radeka G. Prostacyclin and hormone levels in patients with symptoms of miscarriage and infection // Med. Pregl. 2002. Vol. 55(9-10). P. 371-379. English, Croatian. doi: 10.2298/mpns0210371m.

23. Wang Y., Zhao A., Lin Q. Role of cyclooxygenase-2 signaling pathway dysfunction in unexplained recurrent spontaneous abortion // Chinese medical journal. 2010. Vol. 123(12). P. 1543-1547.

24. Wang X., Klein R. D. Prostaglandin E2 induces vascular endothelial growth factor secretion in prostate cancer cells through EP2 receptor - mediated cAMP pathway // Molecular Carcinogenesis. 2007. Vol. 46(11). P. 912-923. doi: 10.1002/mc.20320.

25. Sales K.J., Jabbour H.N. Cyclooxygenase enzymes and prostaglandins in pathology of the endometrium // Reproduction. 2003. Vol. 126(5). P. 559-567. doi: 10.1530/rep.0.1260559

26. Cyclooxygenase-2 differentially directs uterine angiogenesis during implantation in mice / H. Matsumoto et al. // J. Biol. Chem. 2002. Vol. 277(32). P. 29260-29267. doi: 10.1074/jbc.M203996200

27. Способ раннего прогнозирования невынашивания беременности: пат. № 2592204 С1 RU / О.П. Лебедева и др.; патентообладатель ФГАУ ВО «Белгородский государственный национальный исследовательский институт»; заяв. 29.12.2014; опубл. 20.07.2016, Бюл. №20.

28. Способ оценки нарушения имплантации эмбриона при беременности, осложненной цитомегаловирусной инфекцией путем определения циклооксигеназы-2 в гомогенате ворсинчатого хориона: пат. №2685554 / И.А. Андриевская, Н.А. Ишутина; патентообладатель ФГБНУ «Дальневосточный научный центр физиологии и патологии дыхания»; заяв. 07.05.2018; опуб. 22.04.2019, Бюл. №12.

Изобретение относится к медицине, а именно к акушерству, и может быть использовано для прогнозирования невынашивания беременности в первом триместре при обострении цитомегаловирусной инфекции. У женщин методом иммуноферментного анализа определяют в лизате мононуклеарных клеток содержание циклооксигеназы 2 в нг/мл (COX-2). В сыворотке крови определяют концентрацию простагландина Е2 в пг/мл (PGЕ2). Затем прогнозируют угрозу невынашивания беременности путем сравнения прогностического индекса ПИ, рассчитанного с помощью дискриминантной функции: ПИ= –44,28–5,395×COX-2+0,315×PGE2, с граничным значением, равным 99,364. При ПИ, равном или больше граничного значения, прогнозируют наличие угрозы невынашивания беременности в первом триместре при обострении цитомегаловирусной инфекции. При ПИ меньше граничного значения прогнозируют отсутствие угрозы невынашивания беременности в первом триместре при обострении цитомегаловирусной инфекции. Способ обеспечивает возможность повышения точности прогнозирования невынашивания беременности в первом триместре при обострении цитомегаловирусной инфекции за счет исследования циклооксигеназы 2 (COX-2) и простагландина Е2 (PGE2) в периферической крови беременных при обострении цитомегаловирусной инфекции. 2 пр.

Способ прогнозирования невынашивания беременности в первом триместре при обострении цитомегаловирусной инфекции, отличающийся тем, что у женщин методом иммуноферментного анализа определяют в лизате мононуклеарных клеток содержание циклооксигеназы 2 в нг/мл (COX-2), в сыворотке крови определяют концентрацию простагландина Е2 в пг/мл (PGЕ2), затем прогнозируют угрозу невынашивания беременности путем сравнения прогностического индекса ПИ, рассчитанного с помощью дискриминантной функции: ПИ= –44,28–5,395×COX-2+0,315×PGE2, с граничным значением, равным 99,364; при ПИ, равном или больше граничного значения, прогнозируют наличие угрозы невынашивания беременности в первом триместре при обострении цитомегаловирусной инфекции, при ПИ меньше граничного значения прогнозируют отсутствие угрозы невынашивания беременности в первом триместре при обострении цитомегаловирусной инфекции.