Способ получения препарата рибонуклеопротеинового комплекса CRISPR-Cas и препарат для выявления гена антибиотикоустойчивости mecA Staphylococcus aureus в ультранизких концентрациях Российский патент 2022 года по МПК C12N15/11 C12N15/113 C12N9/22 C12Q1/6876 C12Q1/6888 

Изобретение относится к области генной инженерии и биотехнологии, а именно к направляющим РНК, которые могут быть использованы в системах CRISPR-Casl2 в составе рибонуклеопротеиновых комплексов для выявления (обнаружения, детекции) гена антибиотикоустойчивости mecA Staphylococcus aureus, а также к способам получения препаратов рибонуклеопротеинового комплекса CRISPR-Cas и к самим препаратам.

Изобретение позволяет in vitro выявлять единичные копии гена антибиотикоустойчивости mecA Staphylococcus aureus.

Направляющие РНК, описанные в настоящей заявке, могут быть использованы для детекции гена антибиотикоустойчивости mecA Staphylococcus aureus после проведения специфической амплификации фрагмента ДНК гена mecA. Амплификация при этом может быть проведена различными способами, среди которых полимеразная цепная реакция (PCR); петлевая изотермическая амплификация (LAMP); геликаза-зависимая амплификация (HDA); рекомбиназа-опосредованная амплификация (RPA); амплификация со смещением цепи (SDA); амплификация, основанная на последовательности нуклеиновых кислот (NASBA); опосредованная транскрипцией амплификация (ТМА); амплификация, опосредованная никирующим ферментом (NEAR); круговая амплификация (RCA) и многие другие виды амплификации.

Направляющие РНК, описанные в настоящей заявке, могут быть использованы для разработки высокочувствительных и высокотехнологичных диагностических систем нового поколения на основе CRISPR технологий для борьбы с распространением антибиотикоустойчивых бактериальных патогенов.

Для решения эпидемиологических задач по расшифровке вспышек инфекционных болезней, выявления и идентификации возбудителя, а также детекции специфических бактериальных генов необходимы разработка и внедрение в практику работы надзорных и мониторинговых служб современных технологий молекулярной эпидемиологии. Одной из таких технологий является использование элементов генетического редактирования системы CRISPR-Cas. Данная технология развивается достаточно эффективно в отношении создания средств лечения некоторых болезней, несмотря на ряд трудностей, связанных с возникновением непредвиденных мутаций. При углубленных исследованиях в области применения CRISPR-Cas системы, было выяснено, что она может быть использована для тонких диагностических процедур при выявлении возбудителя/ей инфекции у человека, а также их генотипирования.

В 2018 году было показано, что один из ферментов CRISPR системы - Casl2 после распознавания своей целевой ДНК-мишени начинает неспецифически гидролизовать одноцепочечную, а также двухцепочечную ДНК. Такое свойство Casl2 можно использовать в качестве индикатора присутствия определенной мишени, например, генома вируса или бактерии. Исследователи использовали это открытие для создания технологической платформы обнаружения нуклеиновых кислот, известной как DETECTR (DNA Endonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter - ДНК-нацеленная эндонуклеаза CRISPR транс репортер). Впервые DETECTR была использована для выявления и генотипирования вируса папилломы человека (HPV). Предложенная платформа объединяет нуклеазу Casl2a, ее направляющую РНК, специфичную к нуклеиновой кислоте HPV, флуоресцентную репортерную молекулу. Технология DETECTR используется для обнаружения целевой ДНК-мишени после предварительной амплификации [J.S. Chen, Е. Ma, L.B. Harrington, М. Da Costa, X. Tian, J.M. Palefsky, J.A. Doudna, CRISPR-Cas 12a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity, Science 360(6387) (2018) 436-439].

He менее важным приложением системы CRISPR-Cas является идентификация бактериальных патогенов и детекция специфических бактериальных генов. Так, например, с помощью платформы SHERLOCK удалось корректно генотипировать ряд штаммов Escherichia coli и Pseudomonas aeruginosa при низкой перекрестной реактивности. Кроме того, платформа SHERLOCK использована для дифференциации клинических изолятов Klebsiella pneumoniae с двумя различными генами антибиотикоустойчивости, что открывает значительные перспективы к созданию мультиплексных систем для одновременной идентификации бактеральных патогенов и выявления у них генов антибиотикоустойчивости.

В связи с этим крайне актуальной является задача разработки новых эффективных методик выявления генов антибиотикоустойчивости у бактериальных патогенов, основанных на генетических технологиях, таких как CRISPR-Cas.

В ходе изучения уровня техники были найдены научные статьи, описывающие разработку и получение терапевтических направляющих РНК для элиминации метициллин-устойчивых Staphylococcus aureus с помощью технологии CRISPR-Cas [Р. Gholizadeh, S. Kose, S. Dao, K. Ganbarov, et al., How CRISPR-Cas System Could Be Used to Combat Antimicrobial Resistance, Infect Drug Resist. 13 (2020) 1111-1121, https://doi.org/10.2147/IDR.S24727L M.A.B. Shabbir, M.Z. Shabbir, Q. Wu et al., CRISPR-cas system: biological function in microbes and its use to treat antimicrobial resistant pathogens, Ann Clin Microbiol Antimicrob 18 (2019) 21, https://doi.org/10.1186/sl2941-019-0317-x; K. Kiga, XE. Tan, R. Ibarra-Chavez et al., Development of CRISPR-Cas 13a-based antimicrobials capable of sequence-specific killing of target bacteria, Nat Commun 11 (2020) 2934, https://doi.org/10.1038/s41467-020-16731-6; Q. Liu, Y. Jiang, L. Shao et al., CRISPR/Cas9-based efficient genome editing in Staphylococcus aureus, Acta biochimica et biophysica Sinica 49(9) (2017) 764-770, https://doi.org/10.1093/abbs/gmx074; K. Wang, M. Nicholaou, Suppression of Antimicrobial Resistance in MRSA Using CRISPR-dCas9, American Society for Clinical Laboratory Science 30(4) (2017) 207-213, https://doi.Org/10.29074/ascls.30.4.207; D. Palacios Araya, K.L. Palmer, B. A. Duerkop, CRISPR-based antimicrobials to obstruct antibiotic-resistant and pathogenic bacteria, PLoS pathogens 17(7) (2021) el 009672, https://doi.org/10.1371/iournal.ppat.1009672; Z. Wu, L. Zhang, D. Qiao et al., Functional Analyses of Cassette Chromosome Recombinase C2 (CcrC2) and Its Use in Eliminating Methicillin Resistance by Combining CRISPR-Cas9, ACS synthetic biology 7(11) (2018) 2590-2599, https://doi.org/10.1021/acssvnbio.8b002611. Кроме того, были найдены научные статьи, описывающие применение системы направленного редактирования генома CRISPR-Cas для выявления гена антибиотикоустойчивости mecA у Staphylococcus aureus.

М.А. English и соавторы описали технологию для выявления нуклеиновых кислот на гидрогелевых носителях с помощью Casl2a, где в качестве мишени выступал ген антибиотикоустойчивости mecA у Staphylococcus aureus. Чувствительность описанного метода составляет 100 копий гена антибиотикоустойчивости mecA у Staphylococcus aureus на реакцию [М. A. English, L.R. Soenksen, R.V. Gayet, et al., Programmable CRISPR-responsive smart materials, Science (New York, N.Y.) 365(6455) (2019) 780-785, https://doi.org/10.1126/science.aaw51221.

В сентябре 2021 года A. Suea-Ngam и соавторы представили технологию E-Si-CRISPR. В основе E-Si-CRISPR электрохимический биосенсор CRISPR-Cas без амплификации, использующий металлизацию серебром, для обнаружения метициллин-устойчивого Staphylococcus aureus с помощью Casl2a. Чувствительность описанного метода составляет 100 копий гена антибиотикоустойчивости mecA у Staphylococcus aureus на реакцию [A. Suea-Ngam, P.D. Howes, A.J. DeMello, An amplification-free ultra-sensitive electrochemical CRISPR/Cas biosensor for drug-resistant bacteria detection, Chemical science, 12(38) (2021) 12733-12743, https://doi.org/10.1039/dlsc02197dl.

K. Guk и соавторы описали CRISPR-опосредованный метод ДНК-FISH (от англ., Fluorescence in situ hybridization - Флуоресцентная гибридизация in situ) для простого, быстрого и высокочувствительного обнаружения гена антибиотикоустойчивости mecA у Staphylococcus aureus с помощью белка dCas9. Чувствительность описанного метода составляет 10 КОЕ/мл [К. Guk, J.О. Keem, S.G. Hwang et al., A facile, rapid and sensitive detection of MRS A using a CRIS PR-mediated DNA FISH method, antibody-like dCas9/sgRNA complex, Biosensors & bioelectronics 95 (2017) 67-71, https://doi.Org/10.1016/i.bios.2017.04.0161.

Также были найдены патенты на изобретения, описывающие разработку и получение направляющих РНК для регулирования состава микробных популяций с помощью программируемых нуклеаз, в том числе CRISPR-Cas, а также для сенсибилизации и/или устранения целевых патогенных бактерий (US 20200282026, US 10760065, CN 106167808, WO 2019225246) и их генотипирования (CN 106167821). Кроме того, были обнаружены патенты, в которых программируемые нуклеазы, в том числе CRISPR-Cas, использовались для выявления и поиска целевых последовательностей нуклеиновых кислот (US 20150056629).

Из уровня техники известны решения, направленные на разработку и получение направляющих РНК для выявления нуклеиновых кислот возбудителя с помощью CRISPR-Cas (патенты CN 111378722, CN 111321234). Недостатками упомянутых изобретений является их чувствительность, которая не превышает 2 копий на реакцию.

Ближайшим аналогом изобретения является патент «Kit based on CRISPR and application thereof» (CN 112410343), в котором описывается набор для выявления clfA и тес А, содержащий специфические олигонуклеотиды, композицию сгРНК, белок Casl2a и одноцепочечный флуоресцентный ДНК-зонд 5'-6-FAM-TTTTTTTTTTTT- BHQ1-3'. Недостатками описанного анализа является его относительно небольшая чувствительность - композиция может обнаруживать только 1000-кратное разведение предварительно амплифицированной последовательности-мишени.

Исходя из этого, возникает техническая проблема, заключающаяся в необходимости разработки и получения направляющих РНК для выявления единичных копий гена антибиотикоустойчивости mecA Staphylococcus aureus in vitro, а также в разработке способов получения препаратов рибонуклеопротеинового комплекса CRISPR-Cas на их основе.

Предложенная технология перспективна для разнообразных применений, включая количественное определение ДНК/РНК, быструю мультиплексную детекцию экспрессии, другие виды чувствительной детекции, например, выявление загрязнения образцов нуклеиновыми кислотами. Технология основанная на CRISPR-Cas является многофункциональной, устойчивой к ошибкам технологией детекции ДНК, пригодной для быстрой постановки диагнозов, включая инфекционные заболевания, и генотипирования инфекционных агентов и выявление генов антибиотикоустойчивости бактериальных патогенов.

Применение предложенной технологии делает возможным создание диагностических систем нового поколения, которые будут обладать следующими свойствами:

• высокая чувствительность;

• возможность проведения диагностики у постели больного;

• возможность проведения диагностики в полевых условиях без применения специализированного высокотехнологичного оборудования;

• скорость и простота анализа;

• сниженная стоимость анализа;

• отсутствие необходимости оснащения диагностической лаборатории дорогостоящим оборудованием;

• отсутствие необходимости проведения выделения нуклеиновых кислот возбудителя.

Изобретение относится к новым средствам - направляющим РНК, которые могут быть использованы в системах CRISPR-Cas 12 для ультрачувствительного выявления, идентификации, обнаружения или детекции гена антибиотикоустойчивости mecA Staphylococcus aureus в биологических образцах.

Технической задачей предложенного изобретения является разработка новых средств - направляющих РНК, которые могут быть использованы в системах CRISPR-Cas^ с белками Casl2, например, LbCpf1 из Lachnospiraceae, для ультрачувствительного выявления гена антибиотикоустойчивости mecA Staphylococcus aureus.

При осуществлении настоящего изобретения, согласно приведенной в формуле изобретения совокупности существенных признаков, достигается неожиданный технический результат - возможность ультрачувствительного выявления гена антибиотикоустойчивости mecA Staphylococcus aureus до единичных копий в одной реакции. Изобретение не имеет коммерчески доступных аналогов и обладает высокой эффективностью выявления гена антибиотикоустойчивости mecA Staphylococcus aureus. Также предложенное изобретение позволяет увеличить выход продукта реакции, получив желаемую концентрацию финального препарата направляющей РНК, и обеспечивает формирование корректной конформации шпильки, содержащейся в направляющей РНК.

Технический результат достигается за счет:

• разработки молекул направляющих РНК, которые могут быть использованы в системах CRISPR-Cas 12 для ультра чувствительного выявления гена антибиотикоустойчивости mecA Staphylococcus aureus, где указанные направляющие РНК выбраны из последовательностей SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2, способны связываться с целевыми высоко консервативными участками гена антибиотикоустойчивости mecA Staphylococcus aureus, содержат РНК-шпильку, которая распознается РНК-направляемой ДНК-эндонуклеазой LbCpf1 из Lachnospiraceae, с обеспечением выявления единичных копий гена антибиотикоустойчивости mecA Staphylococcus aureus.

• применения РНК-направляемой ДНК-эндонуклеаз LbCpf1 из Lachnospiraceae, полученной согласно способу, разработанному авторами ранее (Патент RU №2707542, дата приоритета 28.03.2019), для создания рибонуклеопротеиновых комплексов (РПК) системы CRISPR-Cas, пригодных для детекции гена антибиотикоустойчивости mecA Staphylococcus aureus в ультра низких концентрациях (единичные копии).

• разработки набора специфических олигонуклеотидов, выбранных из SEQ ID NO: 3-5, для предварительной амплификации фрагмента гена антибиотикоустойчивости mecA Staphylococcus aureus.

• оптимизации условий проведения предварительной амплификации фрагмента гена антибиотикоустойчивости mecA Staphylococcus aureus.

• определения условий проведения ультрачувствительной детекции гена антибиотикоустойчивости mecA Staphylococcus aureus и установления последовательности стадий метода.

Направляющие РНК согласно настоящему изобретению соответствуют высоко консервативным фрагментам гена антибиотикоустойчивости mecA Staphylococcus aureus. Наиболее предпочтительны направляющие РНК, распознающиеся РНК-направляемой ДНК-эндонуклеазой LbCpf1 из Lachnospiraceae, характеризующиеся, имеющие или содержащие нуклеотидную последовательность, выбранную из:

• SEQ ID NO: 1;

• SEQ ID NO: 2;

• или идентичной любой из них по меньшей мере на 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%,

• или комплементарной любой из них,

• или гибридизующейся с любой из них в строгих условиях.

Специфические олигонуклеотиды для проведения предварительной амплификации фрагмента гена антибиотикоустойчивости mecA Staphylococcus aureus согласно настоящему изобретению соответствуют высоко консервативному участку гена антибиотикоустойчивости mecA Staphylococcus aureus. Наиболее предпочтительны олигонуклеотиды, характеризующиеся, имеющие или содержащие нуклеотидную последовательность, выбранную из:

• SEQ ID NO: 3;

• SEQ ID NO: 4;

• SEQ ID NO: 5;

• или идентичной любой из них по меньшей мере на 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%,

• или комплементарной любой из них,

• или гибридизующейся с любой из них в строгих условиях.

Согласно предложенному изобретению получают рибонуклеопротеиновые комплексы (РПК), состоящие из по меньшей мере одной направляющей РНК и РНК-направляемой ДНК-нуклеазы системы CRISPR-Cas LbCpf1 из Lachnospiraceae, пригодные для использования для выявления гена антибиотикоустойчивости mecA Staphylococcus aureus в ультранизких концентрациях (единичные копии).

Препараты РПК представляют собой растворы, содержащие направляющую РНК, выбранную из SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2, объединенную с белком системы CRISPR-Cas (LbCpf1 из Lachnospiraceae) или лиофильно высушенные РПК.

Полученные направляющие РНК могут быть использованы в составе набора для обнаружения гена антибиотикоустойчивости mecA Staphylococcus aureus с инструкцией по применению.

Набор может дополнительно включать компоненты для проведения предварительной амплификации высококонсервативного фрагмента гена антибиотикоустойчивости mecA Staphylococcus aureus, в том числе один или несколько специфических олигонуклеотидов, выбранных из SEQ ID NO: 3-5. При этом по меньшей мере одна направляющая РНК в составе набора может находиться в комплексе с белком системы CRISPR-Cas (LbCpf1 из Lachnospiraceae) в одном контейнере или отдельно в разных контейнерах.

Способ получения препарата рибонуклеопротеинового комплекса CRISPR-Cas предусматривает:

(i) синтез направляющей РНК с SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2,

(ii) объединение Cas-белка семейства CRISPR-Cas LbCpf1 из Lachnospiraceae, в комплекс с по меньшей мере одной направляющей РНК, полученной на стадии (i), и при необходимости (iii) лиофильную сушку рибонуклеопротеинового комплекса CRISPR-Cas, полученного на стадии (ii),

с получением, таким образом, препарата рибонуклеопротеинового комплекса CRISPR-Cas.

В предложенном способе синтез направляющих РНК может быть проведен методом in vitro транскрипции с последующим переосаждением продуктов реакции in vitro транскрипции из реакционной смеси добавлением хлорида натрия до конечной концентрации 400 mM и равного объема изопропилового спирта.

Также предложенный способ предусматривает непосредственно перед объединением с Cas-белком прогрев направляющей РНК при 90°С в течение 5 минут и позволяют медленно остыть до комнатной температуры, что обеспечивает формирование корректной конформации шпильки, содержащейся в направляющей РНК.

Предложен препарат рибонуклеопротеинового комплекса CRISPR-Cas для выявления гена антибиотикоустойчивости mecA Staphylococcus aureus, который может быть получен раскрытым в настоящей заявке способом. Препарат содержит Cas-белок семейства CRISPR-Cas LbCpf1 из Lachnospiraceae в комплексе с по меньшей мере одной направляющей РНК с SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2.

Препарат может быть представлен как в жидкой форме раствора указанного рибонуклеопротеинового комплекса CRISPR-Cas, так и в виде лиофилизата - лиофильно высушенного порошка указанного рибонуклеопротеинового комплекса CRISPR-Cas.

Предложенная технология позволяет определить единичные копии гена антибиотикоустойчивости mecA Staphylococcus aureus в биологических образцах пациента, выбранных из жидкости и/или ткани, предположительно содержащих Staphylococcus aureus. Биологическим образцом может быть образец крови, сыворотки или плазмы крови, клеток крови, слюны, мокроты, лимфоидных тканей, тканей кроветворных органов и других биологических материалов от пациента, которые могут быть использованы для анализа на наличие гена антибиотикоустойчивости mecA Staphylococcus aureus.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1. Визуализация амплифицированного фрагмента mecA-1280 гена антибиотикоустойчивости mecA Staphylococcus aureus (размером 169 п. о.) после предварительной амплификации с использованием олигонуклеотидов For 1280/1412 и Rev 1280 при помощи электрофореза в агарозном геле, где цифрами 1-9 обозначены:

1 - Продукт, полученный в ходе амплификации 20000 фг модельной матрицы pGEM-T-mecA-1280;

2 - Продукт, полученный в ходе амплификации 2000 фг модельной матрицы pGEM-T-mecA-1280;

3 Продукт, полученный в ходе амплификации 200 фг модельной матрицы pGEM-T-mecA-1280;

4 - Продукт, полученный в ходе амплификации 20 фг модельной матрицы pGEM-T-mecA-1280;

5 Продукт, полученный в ходе амплификации 2 фг модельной матрицы pGEM-T-mecA-1280;

6 - Продукт, полученный в ходе амплификации 0,2 фг модельной матрицы pGEM-T-mecA-1280;

7 Продукт, полученный в ходе амплификации 0,02 фг модельной матрицы pGEM-T-mecA-1280;

8 Продукт, полученный в ходе амплификации 0,002 фг модельной матрицы pGEM-T-mecA-1280;

9 - отрицательный контроль, не содержащий модельной матрицы pGEM-T-mecA-1280;

М - стандарты молекулярных масс: снизу вверх 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1200, 1500, 2000, 3000 пар нуклеотидов (GeneRuler 100 bp Plus, Thermo Fisher Scientific, США).

Фиг. 2. Визуализация амплифицированного фрагмента mecA-1412 гена антибиотикоустойчивости mecA Staphylococcus aureus (размером 314 п. о.) после предварительной амплификации с использованием олигонуклеотидов For 1280/1412 и Rev 1412 при помощи электрофореза в агарозном геле, где цифрами 1-9 обозначены:

1 - Продукт, полученный в ходе амплификации 20000 фг модельной матрицы pGEM-T-mecA-1412;

2 - Продукт, полученный в ходе амплификации 2000 фг модельной матрицы pGEM-T-mecA-1412;

3 Продукт, полученный в ходе амплификации 200 фг модельной матрицы pGEM-T-mecA-1412;

4 - Продукт, полученный в ходе амплификации 20 фг модельной матрицы pGEM-T-mecA-1412;

5 Продукт, полученный в ходе амплификации 2 фг модельной матрицы pGEM-T-mecA-1412;

6 - Продукт, полученный в ходе амплификации 0,2 фг модельной матрицы pGEM-T-mecA-1412;

7 - Продукт, полученный в ходе амплификации 0,02 фг модельной матрицы pGEM-T-mecA-1412;

8 Продукт, полученный в ходе амплификации 0,002 фг модельной матрицы pGEM-T-mecA-1412;

9 - отрицательный контроль, не содержащий модельной матрицы pGEM-T-mecA-1412;

М - стандарты молекулярных масс: снизу вверх 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1200, 1500, 2000, 3000 пар нуклеотидов (GeneRuler 100 bp Plus, Thermo Fisher Scientific, США).

Фиг. 3. Значения флуоресценции в конечной точке (60 цикл анализа, 60 минут) для предварительно амплифицированных фрагментов модельной матрицы pGEM-T-mecA-1280, обработанных рибонуклеопортеиновыми комплексами, содержащими белок LbCpf1 и направляющую РНК crRNA mecA №1280.

Фиг. 4. Значения флуоресценции в конечной точке (60 цикл анализа, 60 минут) для предварительно амплифицированных фрагментов модельной матрицы pGEM-T-mecA-1412, обработанных рибонуклеопортеиновыми комплексами, содержащими белок LbCpf1 и направляющую РНК crRNA mecA №1412.

Фиг. 5. Значения флуоресценции в конечной точке (60 цикл анализа, 60 минут) для предварительно амплифицированных мишеней mecA-1280 и mecA-1412 Staphylococcus aureus, обработанных рибонуклеопортеиновыми комплексами, содержащим направляющие РНК crRNA mec А №1280 и crRNA тес А №1412.

Фиг. 6. Визуализация амплифицированного с клинических образцов фрагмента mecA-1280 гена антибиотикоустойчивости mecA Staphylococcus aureus (размером 169 п. о.) после предварительной амплификации с использованием олигонуклеотидов For 1280/1412 и Rev 1280 при помощи электрофореза в агарозном геле.

Фиг. 7. Визуализация амплифицированного с клинических образцов фрагмента mecA-1412 гена антибиотикоустойчивости mecA Staphylococcus aureus (размером 314 п. о.) после предварительной амплификации с использованием олигонуклеотидов For 1280/1412 и Rev 1412 при помощи электрофореза в агарозном геле.

Фиг. 8. Значения флуоресценции в конечной точке (60 цикл анализа, 60 минут) для предварительно амплифицированной с клинических образцов мишени mecA-1280 гена антибиотикоустойчивости mecA Staphylococcus aureus, обработанной рибонуклеопортеиновыми комплексами, содержащим направляющую РНК crRNA mecA №1280.

Фиг. 9. Значения флуоресценции в конечной точке (60 цикл анализа, 60 минут) для предварительно амплифицированной с клинических образцов мишени mecA-1412 гена антибиотикоустойчивости mecA Staphylococcus aureus, обработанной рибонуклеопортеиновыми комплексами, содержащим направляющую РНК crRNA mecA №1412.

Примеры осуществления изобретения

ПРИМЕР 1: ПОДБОР ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ-МИШЕНЕЙ В ГЕНЕ АНТИБИОТИКОУСТОЙЧИВОСТИ MECA STAPHYLOCOCCUS AUREUS ДЛЯ СОЗДАНИЯ НАПРАВЛЯЮЩИХ РНК

Для подбора последовательностей-мишеней в гене антибиотикоустойчивости mecA Staphylococcus aureus для создания направляющих РНК были использованы современные алгоритмы in silico анализа нуклеотидных последовательностей и программы, находящиеся в открытом доступе, включая Benchling (https://www.Pencilling.com/molecular-biology/). Был составлен перечень участков в гене антибиотикоустойчивости mecA Staphylococcus aureus с теоретически рассчитанной вероятностью их расщепления в высоко консервативных участках (Таблица 1). Направляющие РНК, специфически узнающие высоко консервативный участок гена антибиотикоустойчивости mecA Staphylococcus aureus, представлены уникальными последовательностями SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2.

ПРИМЕР 2: ПОДГОТОВКА МАТЕРИАЛА ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ ГЕНА АНТИБИОТИКОУСТОЙЧИВОСТИ MECA STAPHYLOCOCCUS AUREUS МЕТОДОМ ПРЕДВАРИТЕЛЬНОЙ АМПЛИФИКАЦИИ

Подготовку материала для обнаружения гена антибиотикоустойчивости mecA Staphylococcus aureus проводили методом предварительной амплификации. В качестве модельных матриц гена антибиотикоустойчивости mecA Staphylococcus aureus биологического образца использовали плазмидные ДНК:

1) pGEM-T-mecA-1280, содержащую в своем составе фрагмент гена антибиотикоустойчивости mecA Staphylococcus aureus с 1168 по 1336 п. о. (размером 169 п. о.), и

2) pGEM-T-mecA-1412, содержащую в своем составе фрагмент гена антибиотикоустойчивости mecA Staphylococcus aureus с 1168 по 1481 п. о. (размером 314 п. о.)

Предварительную амплификацию участков, соответствующих фрагментам гена антибиотикоустойчивости mecA Staphylococcus aureus, проводили с использованием специфических олигонуклеотидов с SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4 для получения фрагмента mecA-1280 и SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 5 для получения фрагмента mecA-1412, приведенных в Таблице 2.

ПЦР-продукты, кодирующие фрагменты mecA-1280 и mecA-1412 гена антибиотикоустойчивости mecA Staphylococcus aureus, получали в реакции амплификации с использованием ПЦР-смеси-2 blue (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) и специфических олигонуклеотидов For 1280/1412 и Rev 1280, For 1280/1412 и Rev 1412, соответственно (ГенТерра, Россия). Размер амплифицированного фрагмента mecA-1280 составлял 169 пары нуклеотидов, mecA-1412 314 пар нуклеотидов (Таблица 3).

Температурный профиль амплификации для получения ПЦР-продуктов фрагментов гена антибиотикоустойчивости mecA Staphylococcus aureus:

1. денатурация: 95°С в течение 3 минут;

2. 40 циклов амплификации: 95°С- 15 сек, 55°С - 45 сек, 72°С - 30 сек;

3. финальная элонгация: 72°С в течение 5 минут.

В ходе подготовки материала для обнаружения гена антибиотикоустойчивости mecA Staphylococcus aureus методом предварительной амплификации проводили титрование модельных матриц pGEM-T-mecA-1280 и pGEM-T-mecA-1412 путем приготовления серийных разведений (Таблица 4).

Для оценки эффективности предварительной амплификации полученные фрагменты гена антибиотикоустойчивости mecA Staphylococcus aureus визуализировали при помощи электрофореза в агарозном геле (Фиг. 1, 2).

Подготовленный описанным способом материал использовали для экспериментов по выявлению гена антибиотикоустойчивости mecA Staphylococcus aureus с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов LbCpf1 из Lachnospiraceae, содержащих направляющие РНК crRNA mecA №1280 и crRNA mecA №1412, без предварительной очистки.

ПРИМЕР 3: ПОЛУЧЕНИЕ НАПРАВЛЯЮЩИХ РНК И СОЗДАНИЕ РИБОНУКЛЕОПРОТЕИНОВЫХ КОМПЛЕКСОВ ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ ГЕНА АНТИБИОТИКОУСТОЙЧИВОСТИ MECA STAPHYLOCOCCUS AUREUS

Для получения направляющих РНК для обнаружения гена антибиотикоустойчивости mecA Staphylococcus aureus был разработан набор специфических олигонуклеотидов, приведенных в Таблице 5. Получение направляющих РНК проводили в несколько этапов:

1. получение ПЦР-продукта с использованием набора специфических олигонуклеотидов (Таблица 5), кодирующего направляющую РНК, способную связываться с целевым высоко консервативным участком гена антибиотикоустойчивости mecA Staphylococcus aureus, содержащую РНК-шпильку, которая распознается РНК-направляемой ДНК-эндонуклеазой LbCpf1 из Lachnospiraceae;

2. очистка ПЦР-продукта, кодирующего направляющую РНК, специфичную к фрагменту гена антибиотикоустойчивости mecA Staphylococcus aureus;

3. синтез направляющей РНК, специфичной к фрагменту гена антибиотикоустойчивости mecA Staphylococcus aureus;

4. очистка направляющей РНК, специфичной к фрагменту гена антибиотикоустойчивости mecA Staphylococcus aureus.

ПЦР-продукт, кодирующий направляющую РНК crRNA mecA №1280, получали в реакции амплификации с использованием ПЦР-смеси-2 blue (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) и специфических олигонуклеотидов Т7рг и crRNA 1280 (ГенТерра, Россия). Размер амплифицированного фрагмента, кодирующего crRNA mecA №1280, составлял 62 пары нуклеотидов.

ПЦР-продукт, кодирующий направляющую РНК crRNA mec А №1412, получали в реакции амплификации с использованием ПЦР-смеси-2 blue (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) и специфических олигонуклеотидов Т7рг и crRNA 1412 (ГенТерра, Россия). Размер амплифицированного фрагмента, кодирующего crRNA mecA №1412, составлял 62 пары нуклеотидов.

Температурный профиль амплификации для получения ПЦР-продуктов, кодирующих направляющие РНК:

1. денатурация: 95°С в течение 3 минут;

2. 35 циклов амплификации: 95°С- 15 сек, 55°С - 45 сек, 72°С - 30 сек;

3. финальная элонгация: 72°С в течение 5 минут.

ПЦР-продукты, кодирующие направляющие РНК, специфичные к фрагментам гена антибиотикоустойчивости mecA Staphylococcus aureus, визуализировали при помощи электрофореза в агарозном геле.

Очистку ПЦР-продуктов, кодирующих направляющие РНК, специфичные к фрагментам гена антибиотикоустойчивости mecA Staphylococcus aureus, проводили с использованием коммерчески доступного набора ISOLATE II PCR and Gel Kit (BioLine, США) согласно инструкции производителя. Очищенные ПЦР-продукты, кодирующие направляющие РНК, специфичные к фрагментам гена антибиотикоустойчивости mecA Staphylococcus aureus, использовали в качестве матрицы для синтеза направляющих РНК.

Синтез направляющих РНК, специфичных к фрагментам гена антибиотикоустойчивости mecA Staphylococcus aureus, осуществляли методом in vitro транскрипции с использованием коммерчески доступных наборов реагентов (HiScribe™ Т7 High Yield RNA Synthesis Kit, NEB, США) согласно инструкции производителя. Продукты реакции in vitro транскрипции переосаждали из реакционной смеси добавлением хлорида натрия до конечной концентрации 400 mM и равного объема изопропилового спирта. Такие модификации протокола производителя, внесенные авторами, позволяют увеличить выход продукта реакции и получить желаемую концентрацию финального препарата направляющей РНК.

Создание готового рибонуклеопротеинового комплекса, содержащего белок семейства CRISPR-Cas LbCpf1 из Lachnospiraceae, и направляющую РНК авторы проводили по стандартному протоколу с некоторыми модификациями [С.Anders, М. Jinek, In vitro enzymology of Cas9, Methods Enzymol. 546 (2014) 1-20, https://doi.org/10.1016/B978-0-12-801185-0.00001-51.

Непосредственно перед объединением с Cas-белком препарат направляющей РНК (в количестве 250 иг) прогревали при 90°С в течение 5 минут и позволяли медленно остыть до комнатной температуры (инкубация при комнатной температуре не менее 10 минут). Такое прогревание необходимо для формирования корректной конформации шпильки, содержащейся в направляющей РНК. Многие производители коммерческих препаратов Cas-белков пропускают данный этап при подготовке рибонуклеопротеинового комплекса.

Для формирования готового рибонуклеопротеинового комплекса 250 нг Cas-белка LbCpf1 из Lachnospiraceae и подготовленную направляющую РНК смешивали и инкубировали 15 минут при комнатной температуре. Полученный таким способом рибонуклеопротеиновый комплекс готов для выявления гена антибиотикоустойчивости mecA Staphylococcus aureus.

ПРИМЕР 4: ОБНАРУЖЕНИЕ ЕДИНИЧНЫХ КОПИЙ ГЕНА АНТИБИОТИКОУСТОЙЧИВОСТИ MECA STAPHYLOCOCCUS AUREUS С ПОМОЩЬЮ РИБОНУКЛЕОПРОТЕИНОВЫХ КОМПЛЕКСОВ CRISPR/CAS НА ПРИМЕРЕ МОДЕЛЬНОЙ МАТРИЦЫ

Предварительно амплифицированный материал, полученный способом, описанным в Примере 2, использовали в качестве матрицы для обнаружения гена антибиотикоустойчивости mecA Staphylococcus aureus с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR-Cas, полученных способом, описанным в Примере 3.

Для обнаружения гена антибиотикоустойчивости mecA Staphylococcus aureus с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR-Cas готовили реакционную смесь, содержащую следующие компоненты:

• 10× буфер (100 mM TrisHCl рН 8,0, 1 М NaCl);

• 50 mM MgCl2 (конечная концентрация в реакционной смеси 10 mM);

• 250 нг рибонуклеопротеинового комплекса (LbCpf1 из Lachnospiraceae и направляющие РНК crRNA mecA №1280, crRNA mecA №1412);

• 10 pmol флуоресцентный зонд (6FAM-TTATT-BHQ1);

• Мишень (предварительно амплифицированные фрагменты гена антибиотикоустойчивости mecA Staphylococcus aureus);

• вода mQ.

Реакционные смеси, содержащие все необходимые компоненты, помещали в амплификатор QuantStudio 5 (Thermo Fisher Scientific, США) и задавали следующие параметры реакции:

30-60 циклов:

37°С-35 сек,

37°С - 25 сек, съемка флуоресценции.

В первую очередь были проведены эксперименты по обнаружению единичных копий гена антибиотикоустойчивости mecA Staphylococcus aureus с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR-Cas, сформированных на основе LbCpf1 из Lachnospiraceae, с использованием в качестве мишени модельных матриц плазмидной ДНК pGEM-T-mecA-1280, содержащей в своем составе фрагмент гена антибиотикоустойчивости mecA Staphylococcus aureus с 1168 по 1336 п. о. размером 169 п. о., и плазмидной ДНК pGEM-T-mecA-1412, содержащей в своем составе фрагмент гена антибиотикоустойчивости mecA Staphylococcus aureus с 1168 по 1481 п. о. размером 314 п. о.

Было показано, что рибонуклеопротеиновые комплексы CRISPR-Cas обладают способностью выявлять единичные копий гена антибиотикоустойчивости mecA Staphylococcus aureus. Типичные результаты анализа приведены на примерах значений флуоресценции в конечной точке для предварительно амплифицированных мишеней тес А-1280 и mecA-1412 гена антибиотикоустойчивости mec A Staphylococcus aureus, обработанных рибонуклеопортеиновыми комплексами, содержащими направляющие РНК crRNA mecA №1280, crRNA mecA №1412 и белок LbCpf1, на Фиг. 3 и Фиг. 4, соответственно. Отметим, что в среднем уже на 39-ом цикле анализа (39 минут) значение сигнала, полученного в ходе детекции единичных копий (1,7 копий/реакция) гена антибиотикоустойчивости mecA Staphylococcus aureus, превышало значение «шума» (неспецифической флуоресценции контрольного образца, не содержащего мишени) минимум вдвое, а к 45-ому циклу (45 минут анализа) - в 3 и более раз.

В ходе работ была оценена эффективность выявления единичных копий гена антибиотикоустойчивости mecA Staphylococcus aureus, содержащегося в составе модельных матриц, с использованием различных направляющих РНК. Было показано, что рибонуклеопротеиновые комплексы CRISPR-Cas, сформированные на основе LbCpf1 из Lachnospiraceae и направляющих РНК, выявляют единичные копии гена антибиотикоустойчивости mecA Staphylococcus aureus с похожей эффективностью: crRNA mec А №1280 ~ crRNA mec А №1412 (Фиг. 5).

ПРИМЕР 5: ОБНАРУЖЕНИЕ ГЕНА АНТИБИОТИКОУСТОЙЧИВОСТИ МЕСА STAPHYLOCOCCUS AUREUS С ПОМОЩЬЮ РИБОНУКЛЕОПРОТЕИНОВЫХ КОМПЛЕКСОВ CRISPR/CAS НА ОГРАНИЧЕННОЙ ПАНЕЛИ КЛИНИЧЕСКИХ ОБРАЗЦОВ

Разработанные направляющие РНК были апробированы на ограниченной панели клинических образцов (16 шт. ), содержащих Staphylococcus aureus, несущую ген антибиотикоустойчивости mecA (ранее подтверждено методом секвенирования следующего поколения).

Для обнаружения единичных копий гена антибиотикоустойчивости mecA Staphylococcus aureus с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR-Cas была проведена предварительная амплификация фрагментов этого гена. Для проведения предварительной амплификации из 16 биологических образцов, полученных от пациентов, с помощью коммерчески доступного набора DNeasy Blood & Tissue Kit (QIAGEN, США) были выделены ДНК согласно инструкции производителя.

ПЦР-продукты, кодирующие фрагменты гена антибиотикоустойчивости mecA Staphylococcus aureus, получали в реакции амплификации с использованием ПЦР-смеси-2 blue (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) как описано в Примере 2, применяя описанный температурный профиль и продолжительность реакции амплификации. Полученные продукты визуализировали при помощи электрофореза в агарозном геле (Фиг. 6, 7).

Полученный таким способом материал использовали в качестве матрицы для обнаружения единичных копий гена антибиотикоустойчивости mecA Staphylococcus aureus с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR-Cas, полученных способом, описанным в Примере 3.

Обнаружение копий гена антибиотикоустойчивости mecA Staphylococcus aureus с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR-Cas проводили способом, описанным в Примере 4.

В ходе проведенного анализа было показано, что рибонуклеопротеиновые комплексы CRISPR-Cas обладают способностью выявлять ген антибиотикоустойчивости mecA Staphylococcus aureus в препаратах ДНК, выделенных из клинических образцов. При этом в среднем уже на 28 цикле (28 минут) анализа значение сигнала превышало значение «шума» (неспецифической флуоресценции контрольного образца, не содержащего мишени) более чем в 5 раз, а к 47 циклу (47 минут) анализа - более чем в 10 раз (Таблица 6).

Типичные результаты анализа приведены на примерах значений флуоресценции в конечной точке (60 цикл анализа, 60 минут) для предварительно амплифицированных мишеней mecA-1280 и mecA-1412 гена антибиотикоустойчивости mecA Staphylococcus aureus (16 независимых клинических образцов), обработанных рибонуклеопортеиновыми комплексами, содержащими направляющие РНК crRNA mec А №1280, crRNA mecA №1412 и белок LbCpf1, на Фиг. 8 и Фиг. 9, соответственно.

Эффективность выявления гена антибиотикоустойчивости mecA Staphylococcus aureus, содержащегося в составе препаратов ДНК, выделенных из клинических образцов, с использованием различных направляющих РНК в составе рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR-Cas, сформированных на основе LbCpf1 из Lachnospiraceae, оцененная по соотношению значений сигнала к значению «шума» при детекции, можно представить в следующем порядке по убыванию: crRNA mec А №1412>crRNA mec А №1280 (Таблица 6).

Таким образом, разработанные направляющие РНК позволяют ультрачувствительно выявлять единичные копии гена антибиотикоустойчивости mecA Staphylococcus aureus, и способны обнаруживать его препаратах ДНК, выделенных из клинических образцов, после предварительной амплификации в составе рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR-Cas.

--->

Перечень последовательностей

<110> ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора

<120>

<160> NUMBER OF SEQ ID NO: NOS: 5

<210> SEQ ID NO: NO 1

<211> 40

<212> RNA

<213> artificial

<400> SEQUENCE 1 (crRNA mecA №1280):

aau uuc uac uaa gug uag auu gcc aac cuu uac cau cga u 40

<210> SEQ ID NO: NO 2

<211> 40

<212> RNA

<213> artificial

<400> SEQUENCE 2 (crRNA mecA №1412):

aau uuc uac uaa gug uag auu uac ugc cua auu cga gug c 40 2

<210> SEQ ID NO: NO 3

<211> 20

<212> DNA

<213> artificial

<400> SEQUENCE 3 (For 1280/1412):

cct ctg ctc aac aag ttc ca 20

<210> SEQ ID NO: NO 4

<211> 22

<212> DNA

<213> artificial

<400> SEQUENCE 4 (Rev 1280):

atc ttg taa cgt tgt aac cac c 22

<210> SEQ ID NO: NO 5

<211> 23

<212> DNA

<213> artificial

<400> SEQUENCE 5 (Rev 1412):

ctt ggt ata tct tca cca aca cc 23

<---

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к получению препарата рибонуклеопротеинового комплекса CRISPR/CAS, а также к препарату рибонуклеопротеинового комплекса CRISPR-Cas для выявления гена антибиотикоустойчивости mecA Staphylococcus aureus, полученному вышеуказанным способом. Изобретение обеспечивает выявление единичных копий гена антибиотикоустойчивости mecA Staphylococcus aureus in vitro. 2 н. и 4 з.п. ф-лы, 9 ил., 6 табл., 5 пр.

1. Способ получения препарата рибонуклеопротеинового комплекса CRISPR-Cas, отличающийся тем, что содержит стадии:

(i) синтеза направляющей РНК с SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2;

(ii) объединения Cas-белка семейства CRISPR-Cas LbCpf1 из Lachnospiraceae в комплекс с по меньшей мере одной направляющей РНК, полученной на стадии (i); и при необходимости

(iii) лиофильной сушки рибонуклеопротеинового комплекса CRISPR-Cas, полученного на стадии (ii);

с получением, таким образом, препарата рибонуклеопротеинового комплекса CRISPR-Cas.

2. Способ по п.1, где синтез направляющих РНК осуществляют методом in vitro транскрипции с последующим переосаждением продуктов реакции in vitro транскрипции из реакционной смеси добавлением хлорида натрия до конечной концентрации 400 мМ и равного объема изопропилового спирта.

3. Способ по любому из пп.1, 2, где непосредственно перед объединением с Cas-белком направляющую РНК прогревают при 90°С в течение 5 минут и позволяют медленно остыть до комнатной температуры, что обеспечивает формирование корректной конформации шпильки, содержащейся в направляющей РНК.

4. Препарат рибонуклеопротеинового комплекса CRISPR-Cas для выявления гена антибиотикоустойчивости mecA Staphylococcus aureus, полученный способом по любому из пп.1-3, содержащий Cas-белок семейства CRISPR-Cas LbCpf1 из Lachnospiraceae в комплексе с по меньшей мере одной направляющей РНК с SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2.

5. Препарат по п.4, где препарат представляет собой раствор указанного рибонуклеопротеинового комплекса CRISPR-Cas.

6. Препарат по п.4, где указанный препарат лиофилизирован.