Способ получения препарата рибонуклеопротеинового комплекса CRISPR-Cas и препарат для выявления гена антибиотикоустойчивости bla-TEM-1B в ультранизких концентрациях Российский патент 2024 года по МПК C12N15/11 C12N15/113 C12N9/22 C12P21/02 C12Q1/6876 C12Q1/6888 

Изобретение относится к области генной инженерии и биотехнологии, а именно к направляющим РНК, которые могут быть использованы в системах CRISPR-Cas12 в составе рибонуклеопротеиновых комплексов для выявления (обнаружения, детекции) гена антибиотикоустойчивости bla-ТЕМ-1В, а также к способам получения препаратов рибонуклеопротеинового комплекса CRISPR-Cas и к самим препаратам.

Изобретение позволяет in vitro выявлять единичные копии гена антибиотикоустойчивости bla-TEM-1В.

Направляющие РНК, описанные в настоящей заявке, могут быть использованы для детекции гена антибиотикоустойчивости bla-ТЕМ-1В после проведения специфической амплификации фрагмента гена антибиотикоустойчивости bla-ТЕМ-1В. Амплификация при этом может быть проведена различными способами, среди которых полимеразная цепная реакция (PCR); петлевая изотермическая амплификация (LAMP); геликаза-зависимая амплификация (HDA); рекомбиназа-опосредованная амплификация (RPA); амплификация со смещением цепи (SDA); амплификация, основанная на последовательности нуклеиновых кислот (NASBA); опосредованная транскрипцией амплификация (ТМА); амплификация, опосредованная никирующим ферментом (NEAR); круговая амплификация (RCA) и многие другие виды амплификации.

Направляющие РНК, описанные в настоящей заявке, могут быть использованы для разработки высокочувствительных и высокотехнологичных диагностических систем нового поколения на основе CRISPR технологий для совершенствования методов диагностики инфекционных заболеваний.

Для решения эпидемиологических задач по расшифровке вспышек инфекционных болезней, выявления и идентификации возбудителя, а также детекции специфических бактериальных генов необходимы разработка и внедрение в практику работы надзорных и мониторинговых служб современных технологий молекулярной эпидемиологии. Одной из таких технологий является использование элементов генетического редактирования системы CRISPR-Cas. Данная технология развивается достаточно эффективно в отношении создания средств лечения некоторых болезней, несмотря на ряд трудностей, связанных с возникновением непредвиденных мутаций. При углубленных исследованиях в области применения CRISPR-Cas системы, было выяснено, что она может быть использована для тонких диагностических процедур при выявлении возбудителя/ей инфекции у человека, а также их генотипирования.

В 2018 году было показано, что один из ферментов CRISPR системы - Cas12 после распознавания своей целевой ДНК-мишени начинает неспецифически гидролизовать одноцепочечную, а также двухцепочечную ДНК. Такое свойство Cas12 можно использовать в качестве индикатора присутствия определенной мишени, например, генома вируса или бактерии. Исследователи использовали это открытие для создания технологической платформы обнаружения нуклеиновых кислот, известной как DETECTR (DNA Endonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter - ДНК-нацеленная эндонуклеаза CRISPR транс репортер). Впервые DETECTR была использована для выявления и генотипирования вируса папилломы человека (HPV). Предложенная платформа объединяет нуклеазу Cas12a, ее направляющую РНК, специфичную к нуклеиновой кислоте HPV, флуоресцентную репортерную молекулу. Технология DETECTR используется для обнаружения целевой ДНК-мишени после предварительной амплификации [J.S. Chen, Е. Ma, L.B. Harrington, М. Da Costa, X. Tian, J.M. Palefsky, J.A. Doudna, CRISPR-Cas12a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity, Science 360(6387) (2018) 436-439].

He менее важным приложением системы CRISPR-Cas является идентификация бактериальных патогенов и детекция специфических бактериальных генов. Так, например, с помощью платформы SHERLOCK удалось корректно генотипировать ряд штаммов Escherichia coli и Pseudomonas aeruginosa при низкой перекрестной реактивности. Кроме того, платформа SHERLOCK использована для дифференциации клинических изолятов Klebsiella pneumoniae с двумя различными генами антибиотикоустойчивости, что открывает значительные перспективы к созданию мультиплексных систем для одновременной идентификации бактеральных патогенов и выявления у них генов антибиотикоустойчивости.

В связи с этим крайне актуальной является задача разработки новых эффективных методик выявления генов антибиотикоустойчивости у бактериальных патогенов, основанных на генетических технологиях, таких как CRISPR-Cas.

Из уровня техники известны научные статьи, описывающие обнаружение гена антибиотикоустойчивости bla-ТЕМ-1В в биологическом материале, содержащем 750 колониеобразующих единиц/мл Klebsiella pneumoniae [Perovic, О., Singh-Moodley, A., Dusé, A., Bamford, С, Elliott, G., Swe-Han, K.S., Kularatne, R., Lowman, W., Whitelaw, A., Nana, Т., Wadula, J., Lekalakala, R., Saif, A., Fortuin De-Smit, M., & Marais, E. (2014). National sentinel site surveillance for antimicrobial resistance in Klebsiella pneumoniae isolates in South Africa, 2010 - 2012. South African medical journal=Suid-Afrikaanse tydskrif vir geneeskunde, 104(8), 563-568. https://doi.org/10.7196/sami.7617]. Также известны и другие публикации, описывающие выявление гена антибиотикоустойчивости bla-ТЕМ методом ПЦР, однако чувствительность, описанных методов не указана [Monstein, Н.J., Ostholm-Balkhed, А., Nilsson, М.V., Nilsson, М., Dornbusch, K., & Nilsson, L. Е. (2007). Multiplex PCR amplification assay for the detection of blaSHV, blaTEM and blaCTX-M genes in Enterobacteriaceae. APMIS: acta pathologica, microbiologica, et immunologica Scandinavica, 115(12), 1400-1408. https://doi.org/10.1111/j.1600-0463.2007.00722.x; Dallenne, C., Da Costa, A., Decré, D., Favier, C., & Arlet, G. (2010). Development of a set of multiplex PCR assays for the detection of genes encoding important beta-lactamases in Enterobacteriaceae. The Journal of antimicrobial chemotherapy, 65(3), 490-495. https://doi.org/10.1093/jac/dkp498]. Кроме того, были найдены научные статьи, описывающие разработку и получение терапевтических направляющих РНК для элиминации патогенных микроорганизмов семейства Enterobacteriaceae, несущих ген антибиотикоустойчивости bla-TEM-1В, с помощью технологии CRISPR-Cas [Tagliaferri, Т.L., Guimarães, N.R., Pereira, M.P. M., Vilela, L.F.F., Horz, H.P., Dos Santos, S.G., & Mendes, Т.A.O. (2020). Exploring the Potential of CRISPR-Cas9 Under Challenging Conditions: Facing High-Copy Plasmids and Counteracting Beta-Lactam Resistance in Clinical Strains of Enterobacteriaceae. Frontiers in microbiology, 11, 578. https://doi.org/10.3389/fmicb.2020.00578].

До сих пор большинство наборов для обнаружения бета-лактамаз расширенного спектра, к которым в том числе относится бета-лактамаза, кодируемая геном bla-TEM-1В, основаны на методологии диффузионного теста в агаре и определении изоэлектрической точки, которая обычно считается достаточной для идентификации штаммов, продуцирующих бета-лактамазы расширенного спектра. Однако из-за появления большого количества различных бета-лактамаз bla-SHV, bla-TEM и bla-СТХ-М изоэлектрофокусирование, по-видимому, не является подходящим методом для установления фенотипа бета-лактамаз расширенного спектра. Кроме того, описанные методы требуют продолжительного времени, специализированного оборудования, а также квалифицированного персонала (микробиология).

Ближайшими аналогами заявляемого решения являются изобретения по патентам: RU 2743861 (дата приоритета 15.04.2020), RU 2734520 (дата приоритета 15.04.2020), RU 2745637 (дата приоритета 15.04.2020), направленные на получение направляющих РНК, предназначенных для разработки высокочувствительных и высокотехнологичных диагностических систем нового поколения для выявления гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 (металло-бета-лактамаза класс В VIM-2) Pseudomonas aeruginosa; RU 2782314 (дата приоритета 27.12.2021), RU 2782588 (дата приоритета 27.12.2021), RU 2782315 (дата приоритета 27.12.2021), раскрывающие техническую возможность получения направляющих РНК, предназначенных для разработки высокочувствительных и высокотехнологичных диагностических систем нового поколения для выявления гена антибиотикоустойчивости mecA Staphylococcus aureus на основе CRISPR технологий; RU 2791879 (дата приоритета 27.12.2021), RU 2791880 (дата приоритета 27.12.2021), RU 2782739 (дата приоритета 27.12.2021), раскрывающие возможность получения направляющих РНК, предназначенных для разработки высокочувствительных и высокотехнологичных диагностических систем нового поколения для выявления exoU, кодирующего экзотоксин системы секреции третьего типа, Pseudomonas aeruginosa на основе CRISPR технологий. Однако, для расширения спектра подобных диагностических систем и совершенствования методов диагностики инфекционных заболеваний, эпидемиологического надзора и контроля за распространением антибиотикоустойчивых микроорганизмов необходимо разрабатывать новые методы для выявления генов антибиотикоустойчивости патогенных микроорганизмов.

Исходя из вышеизложенного, возникает техническая проблема, заключающаяся в необходимости разработки и получения направляющих РНК для выявления единичных копий гена антибиотикоустойчивости bla-TEM-1B, in vitro.

Предложенная технология перспективна для разнообразных применений, включая количественное определение ДНК/РНК, быструю мультиплексную детекцию экспрессии, другие виды чувствительной детекции, например, выявление загрязнения образцов нуклеиновыми кислотами. Технология, основанная на CRISPR-Cas, является многофункциональной, устойчивой к ошибкам технологией детекции ДНК, пригодной для быстрой постановки диагнозов, включая инфекционные заболевания, и генотипирования инфекционных агентов и выявление генов антибиотикоустойчивости и генов, кодирующих экзотоксины, бактериальных патогенов.

Применение предложенной технологии делает возможным создание диагностических систем нового поколения, которые будут обладать следующими свойствами:

• высокая чувствительность;

• возможность проведения диагностики у постели больного;

• возможность проведения диагностики в полевых условиях без применения специализированного высокотехнологичного оборудования;

• скорость и простота анализа;

• сниженная стоимость анализа;

• отсутствие необходимости оснащения диагностической лаборатории дорогостоящим оборудованием;

• отсутствие необходимости проведения выделения нуклеиновых кислот возбудителя.

Изобретение относится к новым средствам направляющим РНК, которые могут быть использованы в системах CRISPR-Cas12 для ультрачувствительного выявления, идентификации, обнаружения или детекции гена антибиотикоустойчивости bla-TEM-1В в биологических образцах.

Технической задачей предложенного изобретения является разработка новых средств - направляющих РНК, которые могут быть использованы в системах CRISPR-Cas12 с белками Cas12, например, LbCpf1 из Lachnospiraceae, для ультрачувствительного выявления гена антибиотикоустойчивости bla-TEM-1В.

При осуществлении настоящего изобретения, согласно приведенной в формуле изобретения совокупности существенных признаков, достигается неожиданный технический результат - возможность ультрачувствительного выявления гена антибиотикоустойчивости bla-TEM-1В до единичных копий в одной реакции. Изобретение обеспечивает повышение эффективности выявления гена антибиотикоустойчивости bla-TEM-1В до 1,5 раз. Также предложенное изобретение позволяет увеличить выход продукта реакции, получив желаемую концентрацию финального препарата направляющей РНК, и обеспечивает формирование корректной конформации шпильки, содержащейся в направляющей РНК.

Технический результат достигается за счет:

• разработки молекул направляющих РНК, которые могут быть использованы в системах CRISPR-Cas12 для ультра чувствительного выявления гена антибиотикоустойчивости bla-TEM-1В, где указанные направляющие РНК выбраны из последовательностей SEQ ID NO:1-6, способны связываться с целевыми высоко консервативными участками гена антибиотикоустойчивости bla-TEM-1В, содержат РНК-шпильку, которая распознается РНК-направляемой ДНК-эндонуклеазой LbCpf1 из Lachnospiraceae, с обеспечением выявления единичных копий гена антибиотикоустойчивости bla-TEM-1В.

• применения РНК-направляемой ДНК-эндонуклеаз LbCpf1 из Lachnospiraceae, полученной согласно способу, разработанному авторами ранее (Патент RU №2707542, дата приоритетат 28.03.2019), для создания рибонуклеопротеиновых комплексов (РПК) системы CRISPR-Cas, пригодных для детекции гена антибиотикоустойчивости bla-TEM-1В в ультра низких концентрациях (единичные копии).

• разработки набора специфических олигонуклеотидов, выбранных из SEQ ID NO: 7, 8, для предварительной амплификации фрагмента гена антибиотикоустойчивости bla-TEM-1В.

• оптимизации условий проведения предварительной амплификации фрагмента гена антибиотикоустойчивости bla-TEM-1В.

• определения условий проведения ультрачувствительной детекции гена антибиотикоустойчивости bla-TEM-1В и установления последовательности стадий метода.

Направляющие РНК согласно настоящему изобретению соответствуют высоко консервативным фрагментам гена антибиотикоустойчивости bla-TEM-1В. Наиболее предпочтительны направляющие РНК, распознающиеся РНК-направляемой ДНК-эндонуклеазой LbCpf1 из Lachnospiraceae, характеризующиеся, имеющие или содержащие нуклеотидную последовательность, выбранную из:

• SEQ ID NO: 1;

• SEQ ID NO: 2;

• SEQ ID NO: 3;

• SEQ ID NO: 4;

• SEQ ID NO: 5;

• SEQ ID NO: 6;

• или идентичной любой из них по меньшей мере на 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%,

• или комплементарной любой из них,

• или гибридизующейся с любой из них в строгих условиях.

Специфические олигонуклеотиды для проведения предварительной амплификации фрагмента гена антибиотикоустойчивости bla-TEM-1В согласно настоящему изобретению соответствуют высоко консервативному участку гена антибиотикоустойчивости bla-TEM-1В. Наиболее предпочтительны олигонуклеотиды, характеризующиеся, имеющие или содержащие нуклеотидную последовательность, выбранную из:

• SEQ ID NO: 7;

• SEQ ID NO: 8;

• или идентичной любой из них по меньшей мере на 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%,

• или комплементарной любой из них,

• или гибридизующейся с любой из них в строгих условиях.

Согласно предложенному изобретению получают рибонуклеопротеиновые комплексы (РПК), состоящие из по меньшей мере одной направляющей РНК и РНК-направляемой ДНК-нуклеазы системы CRISPR-Cas LbCpf1 из Lachnospiraceae, пригодные для использования для выявления гена антибиотикоустойчивости bla-TEM-1В в ультранизких концентрациях (единичные копии).

Препараты РПК представляют собой растворы, содержащие направляющую РНК, выбранную из SEQ ID NO: 1-6, объединенную с белком системы CRISPR-Cas (LbCpf1 из Lachnospiraceae) или лиофильно высушенные РПК.

Полученные направляющие РНК могут быть использованы в составе набора для обнаружения гена антибиотикоустойчивости bla-TEM-1В с инструкцией по применению.

Набор может дополнительно включать компоненты для проведения предварительной амплификации высококонсервативного фрагмента гена антибиотикоустойчивости bla-TEM-1В, в том числе один или несколько специфических олигонуклеотидов, выбранных из SEQ ID NO: 7, 8. При этом по меньшей мере одна направляющая РНК в составе набора может находиться в комплексе с белком системы CRISPR-Cas (LbCpf1 из Lachnospiraceae) в одном контейнере или отдельно в разных контейнерах.

Способ получения препарата рибонуклеопротеинового комплекса CRISPR-Cas предусматривает:

(i) синтез направляющей РНК с SEQ ID NO: 1-6,

(ii) объединение Cas-белка семейства CRISPR-Cas LbCpf1 из Lachnospiraceae, в комплекс с по меньшей мере одной направляющей РНК, полученной на стадии (i), и при необходимости

(iii) лиофильную сушку рибонуклеопротеинового комплекса CRISPR-Cas, полученного на стадии (ii),

с получением, таким образом, препарата рибонуклеопротеинового комплекса CRISPR-Cas.

В предложенном способе синтез направляющих РНК может быть проведен методом in vitro транскрипции с последующим переосаждением продуктов реакции in vitro транскрипции из реакционной смеси добавлением хлорида натрия до конечной концентрации 400 mM и равного объема изопропилового спирта.

Также предложенный способ предусматривает непосредственно перед объединением с Cas-белком прогрев направляющей РНК при 90°С в течение 5 минут и позволяют медленно остыть до комнатной температуры, что обеспечивает формирование корректной конформации шпильки, содержащейся в направляющей РНК.

Предложен препарат рибонуклеопротеинового комплекса CRISPR-Cas для выявления гена антибиотикоустойчивости bla-TEM-1В, который может быть получен раскрытым в настоящей заявке способом. Препарат содержит Cas-белок семейства CRISPR-Cas LbCpf1 из Lachnospiraceae в комплексе с по меньшей мере одной направляющей РНК с SEQ ID NO: 1-6.

Препарат может быть представлен как в жидкой форме раствора указанного рибонуклеопротеинового комплекса CRISPR-Cas, так и в виде лиофилизата лиофильно высушенного порошка указанного рибонуклеопротеинового комплекса CRISPR-Cas.

Предложенная технология позволяет определить единичные копии гена антибиотикоустойчивости bla-TEM-1В в биологических образцах пациента, выбранных из жидкости и/или ткани, предположительно содержащих ген антибиотикоустойчивости bla-TEM-1В. Биологическим образцом может быть образец крови, сыворотки или плазмы крови, клеток крови, слюны, мокроты, лимфоидных тканей, тканей кроветворных органов и других биологических материалов от пациента, которые могут быть использованы для анализа на наличие гена антибиотикоустойчивости bla-TEM-1В.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1. Визуализация амплифицированного фрагмента гена антибиотикоустойчивости bla-TEM-1В (размером 618 п.о.) после предварительной амплификации с использованием олигонуклеотидов bla-TEM-1В 59 и bla-TEM-1В 65 при помощи электрофореза в агарозном геле, где буквами a-h обозначены:

а - Продукт, полученный в ходе амплификации 2,56×10⁶ копий модельной матрицы pGEM-T-bla-TEM-1В;

b - Продукт, полученный в ходе амплификации 2,56×10⁵ копий модельной матрицы pGEM-T-bla-TEM-1В;

с - Продукт, полученный в ходе амплификации 2,56×10⁴ копий модельной матрицы pGEM-T-bla-TEM-1В;

d - Продукт, полученный в ходе амплификации 2560 копий модельной матрицы pGEM-T-bla-TEM-1В;

е - Продукт, полученный в ходе амплификации 256 копий модельной матрицы pGEM-T-bla-TEM-1В;

f - Продукт, полученный в ходе амплификации 25,6 копии модельной матрицы pGEM-T-bla-TEM-1В;

g - Продукт, полученный в ходе амплификации 2,56 копии модельной матрицы pGEM-T-bla-TEM-1В;

h - отрицательный контроль, не содержащий модельной матрицы pGEM-T-bla-TEM-1В;

М - стандарты молекулярных масс: снизу вверх 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1200, 1500, 2000, 3000 пар нуклеотидов (GeneRuler 100 bp Plus, Thermo Fisher Scientific, США).

Фиг. 2. Профиль флуоресценции в реальном времени для предварительно амплифицированного фрагмента гена антибиотикоустойчивости bla-TEM-1В, обработанного рибонуклеопортеиновым комплексом, содержащим направляющую РНК crRNA bla-TEM-1В №56 и белок LbCpf1, на котором посредством графика визуализировано выявление фрагмента модельной матрицы pGEM-T-bla-TEM-1B с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов LbCpf1 из Lachnospiraceae, содержащих направляющую РНК crRNA bla-TEM-1В №56, где:

- по вертикали указаны значения нормализированного флуоресцентного сигнала, создаваемого красителем;

- по горизонтали указано время флуоресценции, в минутах;

- на кривых 1-8 показано количество копий нуклеиновой кислоты на реакцию, а именно:

1 - 2560000 копий/реакция;

2 - 256000 копий/реакция;

3 - 25600 копий/реакция;

4 - 2560 копий/реакция;

5 - 256 копий/реакция;

6 - 25,6 копий/реакция;

7 - 2,56 копий/реакция;

8 – К - (отрицательный контроль).

Фиг. 3. Профиль флуоресценции в реальном времени для предварительно амплифицированного фрагмента гена антибиотикоустойчивости bla-TEM-1В, обработанного рибонуклеопортеиновым комплексом, содержащим направляющую РНК crRNA bla-TEM-1В №166 и белок LbCpf1, на котором посредством графика визуализировано выявление фрагмента модельной матрицы pGEM-T-bla-TEM-1B с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов LbCpf1 из Lachnospiraceae, содержащих направляющую РНК crRNA bla-ТЕМ-1В №166, где:

- по вертикали указаны значения нормализированного флуоресцентного сигнала, создаваемого красителем;

- по горизонтали указано время флуоресценции, в минутах;

- на кривых 9-16 показано количество копий нуклеиновой кислоты на реакцию, а именно:

9 - 2 560000 копий/реакция;

10 - 256000 копий/реакция;

11 - 25 600 копий/реакция;

12 - 2560 копий/реакция;

13 - 256 копий/реакция;

14 - 25,6 копий/реакция;

15 - 2,56 копий/реакция;

16 – К - (отрицательный контроль).

Фиг. 4. Профиль флуоресценции в реальном времени для предварительно амплифицированного фрагмента гена антибиотикоустойчивости bla-TEM-1В, обработанного рибонуклеопортеиновым комплексом, содержащим направляющую РНК crRNA bla-ТЕМ-1В №329 и белок LbCpf1, на котором посредством графика визуализировано выявление фрагмента модельной матрицы pGEM-T-bla-TEM-1B с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов LbCpf1 из Lachnospiraceae, содержащих направляющую РНК crRNA bla-TEM-1В №329, где:

- по вертикали указаны значения нормализированного флуоресцентного сигнала, создаваемого красителем;

- по горизонтали указано время флуоресценции, в минутах;

- на кривых 17-24 показано количество копий нуклеиновой кислоты на реакцию, а именно:

17 - 2560000 копий/реакция;

18 - 256000 копий/реакция;

19 - 25600 копий/реакция;

20 - 2560 копий/реакция;

21 - 256 копий/реакция;

22 - 25,6 копий/реакция;

23 - 2,56 копий/реакция;

24 - К - (отрицательный контроль).

Фиг. 5. Профиль флуоресценции в реальном времени для предварительно амплифицированного фрагмента гена антибиотикоустойчивости bla-TEM-1В, обработанного рибонуклеопортеиновым комплексом, содержащим направляющую РНК crRNA bla-TEM-1В №410 и белок LbCpf1, на котором посредством графика визуализировано выявление фрагмента модельной матрицы pGEM-T-bla-TEM-1B с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов LbCpf1 из Lachnospiraceae, содержащих направляющую РНК crRNA bla-TEM-1В №410, где:

- по вертикали указаны значения нормализированного флуоресцентного сигнала, создаваемого красителем;

- по горизонтали указано время флуоресценции, в минутах;

- на кривых 25-32 показано количество копий нуклеиновой кислоты на реакцию, а именно:

25 - 2560000 копий/реакция;

26 - 256000 копий/реакция;

27 - 25600 копий/реакция;

28 - 2560 копий/реакция;

29 - 256 копий/реакция;

30 - 25,6 копий/реакция;

31 - 2,56 копий/реакция;

32 – К - (отрицательный контроль).

Фиг. 6. Профиль флуоресценции в реальном времени для предварительно амплифицированного фрагмента гена антибиотикоустойчивости bla-TEM-1В, обработанного рибонуклеопортеиновым комплексом, содержащим направляющую РНК crRNA bla-TEM-1В №479 и белок LbCpf1, на котором посредством графика визуализировано выявление фрагмента модельной матрицы pGEM-T-bla-TEM-1B с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов LbCpf1 из Lachnospiraceae, содержащих направляющую РНК crRNA bla-TEM-1В №479, где:

- по вертикали указаны значения нормализированного флуоресцентного сигнала, создаваемого красителем;

- по горизонтали указано время флуоресценции, в минутах;

- на кривых 33-40 показано количество копий нуклеиновой кислоты на реакцию, а именно:

33 - 2560000 копий/реакция;

34 - 256000 копий/реакция;

35 - 25600 копий/реакция;

36 - 2560 копий/реакция;

37 - 256 копий/реакция;

38 - 25,6 копий/реакция;

39 - 2,56 копий/реакция;

40 – К - (отрицательный контроль).

Фиг. 7. Профиль флуоресценции в реальном времени для предварительно амплифицированного фрагмента гена антибиотикоустойчивости bla-TEM-1В, обработанного рибонуклеопортеиновым комплексом, содержащим направляющую РНК crRNA bla-ТЕМ-1В №536 и белок LbCpf1, на котором посредством графика визуализировано выявление фрагмента модельной матрицы pGEM-T-bla-TEM-1B с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов LbCpf1 из Lachnospiraceae, содержащих направляющую РНК crRNA bla-TEM-1В №536, где:

- по вертикали указаны значения нормализированного флуоресцентного сигнала, создаваемого красителем;

- по горизонтали указано время флуоресценции, в минутах;

- на кривых 41-48 показано количество копий нуклеиновой кислоты на реакцию, а именно:

41 - 2560000 копий/реакция;

42 - 256000 копий/реакция;

43 - 25600 копий/реакция;

44 - 2560 копий/реакция;

45 - 256 копий/реакция;

46 - 25,6 копий/реакция;

47 - 2,56 копий/реакция;

48 - К - (отрицательный контроль).

Фиг. 8. Значения флуоресценции в конечной точке (60 цикл анализа, 60 минут) для предварительно амплифицированного фрагмента гена антибиотикоустойчивости bla-TEM-1В, обработанного рибонуклеопортеиновыми комплексами, содержащим направляющие РНК crRNA bla-TEM-1В №56, crRNA bla-TEM-1B №166, crRNA bla-TEM-1B №329, crRNA bla-TEM-1B №410, crRNA bla-TEM-1B №479 и crRNA bla-TEM-1B №536, где посредством графика визуализировано выявление фрагмента модельной матрицы pGEM-T-bla-TEM-1B с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов LbCpf1 из Lachnospiraceae, при этом:

- по вертикали указаны значения нормализированного флуоресцентного сигнала, создаваемого красителем;

- по горизонтали указано количество копий модельной матрицы в реакции;

- столбцом визуализирована эффективность выявления единичных копий фрагмента модельной матрицы pGEM-T-bla-TEM-1B с использованием crRNA bla-TEM-1В №56;

- столбцом визуализирована эффективность выявления единичных копий фрагмента модельной матрицы pGEM-T-bla-TEM-1B с использованием crRNA bla-TEM-1В №166;

- столбцом визуализирована эффективность выявления единичных копий фрагмента модельной матрицы pGEM-T-bla-TEM-1B с использованием crRNA bla-TEM-1В №329;

- столбцом визуализирована эффективность выявления единичных копий фрагмента модельной матрицы pGEM-T-bla-TEM-1B с использованием crRNA bla-TEM-1В №410;

- столбцом визуализирована эффективность выявления единичных копий фрагмента модельной матрицы pGEM-T-bla-TEM-1B с использованием crRNA bla-TEM-1В №479;

- столбцом визуализирована эффективность выявления единичных копий фрагмента модельной матрицы pGEM-T-bla-TEM-1B с использованием crRNA bla-TEM-1 В №536.

Фиг. 9. Визуализация амплифицированного с клинических образцов фрагмента гена антибиотикоустойчивости bla-TEM-1В (размером 618 п. о.) после предварительной амплификации с использованием олигонуклеотидов bla-TEM-1В 59 и bla-TEM-1В 65 при помощи электрофореза в агарозном геле.

Фиг. 10. Значения флуоресценции в конечной точке (60 цикл анализа, 60 минут) для предварительно амплифицированного с клинических образцов фрагмента гена антибиотикоустойчивости bla-TEM-1В, обработанного рибонуклеопортеиновыми комплексами, содержащим направляющие РНК crRNA bla-TEM-1В №56, crRNA bla-ТЕМ-1B №166, crRNA bla-TEM-1B №410 и crRNA bla-TEM-1B №536, где посредством графика визуализировано выявление фрагмента гена антибиотикоустойчивости bla-TEM-1В с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов LbCpf1 из Lachnospiraceae на ограниченной панели клинических образцов, при этом:

- по вертикали указаны значения нормализированного флуоресцентного сигнала, создаваемого красителем;

- по горизонтали указаны идентификаторы образца;

- столбцом показана эффективность выявления фрагмента гена антибиотикоустойчивости bla-TEM-1В, содержащегося в составе препаратов, выделенных из клинических образцов, с использованием crRNA bla-TEM-1 В №56;

- столбцом показана эффективность выявления фрагмента гена антибиотикоустойчивости bla-TEM-1В, содержащегося в составе препаратов, выделенных из клинических образцов, с использованием crRNA bla-ТЕМ-1B №166;

- столбцом показана эффективность выявления фрагмента гена антибиотикоустойчивости bla-TEM-1В, содержащегося в составе препаратов, выделенных из клинических образцов, с использованием crRNA bla-TEM-1В №410;

- столбцом показана эффективность выявления фрагмента гена антибиотикоустойчивости bla-TEM-1В, содержащегося в составе препаратов, выделенных из клинических образцов, с использованием crRNA bla-TEM-1В №536.

Примеры осуществления изобретения

ПРИМЕР 1: ПОДБОР ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ-МИШЕНЕЙ В ГЕНЕ АНТИБИОТИКОУСТОЙЧИВОСТИ BLA-TEM-1В ДЛЯ СОЗДАНИЯ НАПРАВЛЯЮЩИХ РНК

Для подбора последовательностей-мишеней в гене антибиотикоустойчивости bla-TEM-1В для создания направляющих РНК были использованы современные алгоритмы in silico анализа нуклеотидных последовательностей и программы, находящиеся в открытом доступе, включая Benchling (https://www.benchling.com/molecular-biologY/). Был составлен перечень участков гена антибиотикоустойчивости bla-TEM-1В с теоретически рассчитанной вероятностью их расщепления в высоко консервативных участках (Таблица 1). Направляющие РНК, специфически узнающие высоко консервативные участки гена антибиотикоустойчивости bla-TEM-1В, представлены уникальными последовательностями SEQ ID NO: 1-6.

ПРИМЕР 2: ПОДГОТОВКА МАТЕРИАЛА ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ ГЕНА АНТИБИОТИКОУСТОЙЧИВОСТИ BLA-TEM-1В МЕТОДОМ ПРЕДВАРИТЕЛЬНОЙ АМПЛИФИКАЦИИ

Подготовку материала для обнаружения гена антибиотикоустойчивости bla-TEM-1В проводили методом предварительной амплификации. В качестве модельной матрицы, содержащей фрагмент гена антибиотикоустойчивости bla-TEM-1В, использовали плазмидную ДНК pGEM-T-bla-TEM-1B, содержащую в своем составе фрагмент гена антибиотикоустойчивости антибиотикоустойчивости bla-TEM-1В размером 618 п.о.

Предварительную амплификацию участка, соответствующего фрагменту гена антибиотикоустойчивости bla-TEM-1В, проводили с использованием специфических олигонуклеотидов с SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 8.

Продукт, кодирующий фрагмент гена антибиотикоустойчивости bla-TEM-1В, получали при проведении ПЦР с использованием специфических олигонуклеотидов bla-TEM-1В_59 и bla-TEM-1В_65 (ГенТерра, Россия) и ПЦР-смеси-2 blue (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия). Размер амплифицированного фрагмента составлял 618 пар нуклеотидов.

Температурный профиль амплификации для получения ПЦР-продуктов фрагментов гена антибиотикоустойчивости bla-TEM-1В:

1. денатурация: 95°С в течение 3 минут;

2. 40 циклов амплификации: 95°С - 15 сек, 55°С - 45 сек, 72°С - 30 сек;

3. финальная элонгация: 72°С в течение 5 минут.

В ходе подготовки материала для обнаружения гена антибиотикоустойчивости bla-TEM-1В методом предварительной амплификации проводили титрование модельной матрицы pGEM-T-bla-TEM-1B путем приготовления серийных разведений (Таблица 2).

Для оценки эффективности предварительной амплификации полученный фрагмент гена антибиотикоустойчивости bla-TEM-1В визуализировали при помощи электрофореза в агарозном геле (Фиг. 1).

Подготовленный описанным способом материал использовали для экспериментов по выявлению гена антибиотикоустойчивости bla-TEM-1В с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов LbCpf1 из Lachnospiraceae, содержащих направляющие РНК crRNA bla-TEM-1В №56, crRNA bla-TEM-1B №166, crRNA bla-TEM-1B №329, crRNA bla-TEM-1B №410, crRNA bla-TEM-1B №479 и crRNA bla-TEM-1B №536, без предварительной очистки.

ПРИМЕР 3: ПОЛУЧЕНИЕ НАПРАВЛЯЮЩИХ РНК И СОЗДАНИЕ РИБОНУКЛЕОПРОТЕИНОВЫХ КОМПЛЕКСОВ ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ ГЕНА АНТИБИОТИКОУСТОЙЧИВОСТИ BLA-TEM-1В

Для получения направляющих РНК для обнаружения гена антибиотикоустойчивости bla-TEM-1В были разработаны специфические олигонуклеотиды, приведенные в Таблице 3. Получение направляющих РНК проводили в несколько этапов:

1. получение ПЦР-продукта с использованием набора специфических олигонуклеотидов (Таблица 3), кодирующего направляющую РНК, способную связываться с целевым высоко консервативным участком гена антибиотикоустойчивости bla-TEM-1В, содержащую РНК-шпильку, которая распознается РНК-направляемой ДНК-эндонуклеазой LbCpf1 из Lachnospiraceae;

2. очистка ПЦР-продукта, кодирующего направляющую РНК, специфичную к фрагменту гена антибиотикоустойчивости bla-TEM-1В;

3. синтез направляющей РНК, специфичной к фрагменту гена антибиотикоустойчивости bla-TEM-1В;

4. очистка направляющей РНК, специфичной к фрагменту гена антибиотикоустойчивости bla-TEM- 1В.

ПЦР-продукт, кодирующий направляющую РНК crRNA bla-TEM-1B №56, получали в реакции амплификации с использованием ПЦР-смеси-2 blue (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) и специфических олигонуклеотидов T7pr и crRNA bla-TEM-1В №56 (ГенТерра, Россия). Размер амплифицированного фрагмента, кодирующего crRNA bla-TEM-1В №56, составлял 62 пары нуклеотидов.

ПЦР-продукт, кодирующий направляющую РНК crRNA bla-TEM-1В №166, получали в реакции амплификации с использованием ПЦР-смеси-2 blue (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) и специфических олигонуклеотидов T7pr и crRNA bla-TEM-1В №166 (ГенТерра, Россия). Размер амплифицированного фрагмента, кодирующего crRNA bla-TEM-1В №166, составлял 62 пары нуклеотидов.

ПЦР-продукт, кодирующий направляющую РНК crRNA bla-TEM-1В №329, получали в реакции амплификации с использованием ПЦР-смеси-2 blue (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) и специфических олигонуклеотидов T7pr и crRNA bla-TEM-1В №329 (ГенТерра, Россия). Размер амплифицированного фрагмента, кодирующего crRNA bla-TEM-1В №329, составлял 62 пары нуклеотидов.

ПЦР-продукт, кодирующий направляющую РНК crRNA bla-ТЕМ-1В №410, получали в реакции амплификации с использованием ПЦР-смеси-2 blue (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) и специфических олигонуклеотидов T7pr и crRNA bla-TEM-1В №410 (ГенТерра, Россия). Размер амплифицированного фрагмента, кодирующего crRNA bla-TEM-1В №410, составлял 62 пары нуклеотидов.

ПЦР-продукт, кодирующий направляющую РНК crRNA bla-TEM-1В №479, получали в реакции амплификации с использованием ПЦР-смеси-2 blue (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) и специфических олигонуклеотидов T7pr и crRNA bla-TEM-1В №479 (ГенТерра, Россия). Размер амплифицированного фрагмента, кодирующего crRNA bla-TEM-1В №479, составлял 62 пары нуклеотидов.

ПЦР-продукт, кодирующий направляющую РНК crRNA bla-TEM-1В №536, получали в реакции амплификации с использованием ПЦР-смеси-2 blue (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) и специфических олигонуклеотидов T7pr и crRNA bla-TEM-1В №536 (ГенТерра, Россия). Размер амплифицированного фрагмента, кодирующего crRNA bla-TEM-1В №536, составлял 62 пары нуклеотидов.

Температурный профиль амплификации для получения ПЦР-продуктов, кодирующих направляющие РНК:

1. денатурация: 95°С в течение 3 минут;

2. 35 циклов амплификации: 95°С - 15 сек, 55°С - 45 сек, 72°С - 30 сек;

3. финальная элонгация: 72°С в течение 5 минут.

ПЦР-продукты, кодирующие направляющие РНК, специфичные к фрагменту гена антибиотикоустойчивости bla-TEM-1В, визуализировали при помощи электрофореза в агарозном геле.

Очистку ПЦР-продуктов, кодирующих направляющие РНК, специфичные к фрагменту гена антибиотикоустойчивости bla-TEM-1В, проводили с использованием коммерчески доступного набора ISOLATE II PCR and Gel Kit (BioLine, США) согласно инструкции производителя. Очищенные ПЦР-продукты, кодирующие направляющие РНК, специфичные к фрагменту гена антибиотикоустойчивости bla-TEM-1В, использовали в качестве матрицы для синтеза направляющих РНК.

Синтез направляющих РНК, специфичных к фрагменту гена антибиотикоустойчивости bla-TEM-1В, осуществляли методом in vitro транскрипции с использованием коммерчески доступных наборов реагентов (HiScribe™ Т7 High Yield RNA Synthesis Kit, NEB, США) согласно инструкции производителя. Продукты реакции in vitro транскрипции переосаждали из реакционной смеси добавлением хлорида натрия до конечной концентрации 400 mM и равного объема изопропилового спирта. Такие модификации протокола производителя, внесенные авторами, позволяют увеличить выход продукта реакции и получить желаемую концентрацию финального препарата направляющей РНК.

Создание готового рибонуклеопротеинового комплекса, содержащего белок семейства CRISPR-Cas12 LbCpf1 из Lachnospiraceae, и направляющую РНК авторы проводили по стандартному протоколу с некоторыми модификациями [С. Anders, М. Jinek, In vitro enzymology of Cas9, Methods Enzymol. 546 (2014) 1-20, https://doi.org/10.1016/B978-0-12-801185-0.00001-51.

Непосредственно перед объединением с Cas-белком препарат направляющей РНК (в количестве 250 нг) прогревали при 90°С в течение 5 минут и позволяли медленно остыть до комнатной температуры (инкубация при комнатной температуре не менее 10 минут). Такое прогревание необходимо для формирования корректной конформации шпильки, содержащейся в направляющей РНК. Многие производители коммерческих препаратов Cas-белков пропускают данный этап при подготовке рибонуклеопротеинового комплекса.

Для формирования готового рибонуклеопротеинового комплекса 250 нг Cas-белка LbCpf1 из Lachnospiraceae и подготовленную направляющую РНК смешивали и инкубировали 15 минут при комнатной температуре. Полученный таким способом рибонуклеопротеиновый комплекс готов для выявления гена антибиотикоустойчивости bla-TEM-1 В.

ПРИМЕР 4: ОБНАРУЖЕНИЕ ЕДИНИЧНЫХ КОПИЙ ГЕНА АНТИБИОТИКОУСТОЙЧИВОСТИ BLA-TEM-1В С ПОМОЩЬЮ

РИБОНУКЛЕОПРОТЕИНОВЫХ КОМПЛЕКСОВ CRTSPR/CAS НА ПРИМЕРЕ МОДЕЛЬНОЙ МАТРИЦЫ

Предварительно амплифицированный материал, полученный способом, описанным в Примере 2, использовали в качестве матрицы для обнаружения гена антибиотикоустойчивости bla-TEM-1В с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR-Cas, полученных способом, описанным в Примере 3.

Для обнаружения гена антибиотикоустойчивости bla-TEM-1В с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR-Cas готовили реакционную смесь, содержащую следующие компоненты:

• 10 х буфер (100 mM TrisHCl рН 8,0, 1 М NaCl);

• 50 mM MgCl2 (конечная концентрация в реакционной смеси 10 mM);

• 250 нг рибонуклеопротеинового комплекса (LbCpf1 из Lachnospiraceae и направляющие РНК crRNA bla-ТЕМ-1 В №56, crRNA bla-TEM-1 В №166, crRNA bla-TEM-1B №329, crRNA bla-TEM-1B №410, crRNA bla-TEM-1B №479 и crRNA bla-TEM-1B №536);

• 10 pmol флуоресцентный зонд (6FAM-TTATT-BHQ1);

• Мишень (предварительно амплифицированный фрагмент гена антибиотикоустойчивости bla-TEM-1В);

• вода mQ.

Реакционные смеси, содержащие все необходимые компоненты, помещали в амплификатор QuantStudio 5 (Thermo Fisher Scientific, США) и задавали следующие параметры реакции:

30-60 циклов:

1. 37°С - 35 сек,

2. 37°С - 25 сек, съемка флуоресценции.

В первую очередь были проведены эксперименты по обнаружению единичных копий гена антибиотикоустойчивости bla-TEM-1В с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR-Cas, сформированных на основе LbCpf1 из Lachnospiraceae, с использованием в качестве мишени модельной матрицы плазмидной ДНК pGEM-T-bla-ТЕМ-1В, содержащую в своем составе фрагмент гена антибиотикоустойчивости bla-TEM-1В размером 618 п.о.

Было показано, что рибонуклеопротеиновые комплексы CRISPR-Cas обладают способностью выявлять единичные копии гена антибиотикоустойчивости bla-TEM-1В. Типичные результаты анализа приведены на примерах профилей флуоресценции в реальном времени для предварительно амплифицированного фрагмента гена антибиотикоустойчивости bla-TEM-1В, обработанного рибонуклеопортеиновыми комплексами, содержащими направляющие РНК crRNAbla-TEM-1В №56, crRNA bla-ТЕМ-1B №166, crRNA bla-TEM-1B №329, crRNA bla-TEM-1B №410, crRNA bla-TEM-1B №479 и crRNA bla-TEM-1B №536 и белок LbCpf1, на Фиг. 2, Фиг. 3, Фиг. 4, Фиг. 5, Фиг. 6 и Фиг. 7, соответственно.

Отметим, что комплексы CRISPR-Cas12 выявляют ген bla-TEM-1В с различной эффективностью. Так, crRNA №536 и crRNA №410 выявляют 2,56 копий гена антибиотикоустойчивости bla-TEM-1В в реакции; crRNA №56 и crRNA №166 - 256 копий в реакции; a crRNA №329 и crRNA №479 - 2560 копий в реакции.

В среднем уже на 47-ом цикле анализа (47 минут) значение сигнала, полученного в ходе детекции единичных копий (2,56 копий/реакция) гена антибиотикоустойчивости bla-TEM-1В, превышало значение «шума» (неспецифической флуоресценции контрольного образца, не содержащего мишени) минимум в пять раз, а к 55-ому циклу (55 минут анализа) - в 10 и более раз. Также отметим, что в среднем уже на 35-ом цикле анализа (35 минут) значение сигнала, полученного в ходе детекции 256 копий гена антибиотикоустойчивости bla-TEM-1В в реакции, превышало значение «шума» (неспецифической флуоресценции контрольного образца, не содержащего мишени) минимум в пять раз, а к 42-ому циклу (42 минуты анализа) - в 10 и более раз. Кроме того, в среднем уже на 13-ом цикле анализа (13 минут) значение сигнала, полученного в ходе детекции 2560 копий гена антибиотикоустойчивости bla-TEM-1В в реакции, превышало значение «шума» (неспецифической флуоресценции контрольного образца, не содержащего мишени) минимум в пять раз, а к 21-ому циклу (21 минута анализа) в 10 и более раз.

В ходе работ была оценена эффективность выявления гена антибиотикоустойчивости bla-TEM-1В, содержащегося в составе модельной матрицы, с использованием различных направляющих РНК. Было показано, что рибонуклеопротеиновые комплексы CRISPR-Cas, сформированные на основе LbCpf1 из Lachnospiraceae и направляющих РНК, выявляют ген антибиотикоустойчивости bla-ТЕМ-1В с различной эффективностью, и их можно расположить в следующем порядке по уменьшению активности: crRNA №536 ≥ crRNA №410 > crRNA №56 ≥ crRNA №166 > crRNA №329 ≥ crRNA №479 (Фиг. 8).

ПРИМЕР 5: ОБНАРУЖЕНИЕ ГЕНА АНТИБИОТИКОУСТОЙЧИВОСТИ BLA-TEM-1В С ПОМОЩЬЮ РИБОНУКЛЕОПРОТЕИНОВЫХ КОМПЛЕКСОВ CRISPR/CAS НА ОГРАНИЧЕННОЙ ПАНЕЛИ КЛИНИЧЕСКИХ ОБРАЗЦОВ

Разработанные направляющие РНК были апробированы на ограниченной панели клинических образцов (10 шт. ), содержащих ген антибиотикоустойчивости bla-TEM-1В (ранее подтверждено методом секвенирования следующего поколения).

Для обнаружения гена антибиотикоустойчивости bla-TEM-1В с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR-Cas была проведена предварительная амплификация фрагмента гена антибиотикоустойчивости bla-TEM-1В. Для проведения предварительной амплификации из клинических образцов 10 пациентов с помощью коммерчески доступного набора «РИБО-преп» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) согласно инструкции производителя были выделены препараты ДНК.

Продукт, кодирующий фрагмент гена антибиотикоустойчивости bla-TEM-1В, получали с помощью ПЦР с использованием специфических олигонуклеотидов bla-TEM-1В_59 и bla-TEM-1В_65 (ГенТерра, Россия) и визуализировали при помощи электрофореза в агарозном геле (Фиг. 9).

Полученный таким способом материал использовали в качестве матрицы для обнаружения гена антибиотикоустойчивости bla-TEM-1В с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR-Cas, полученных способом, описанным в Примере 3.

Обнаружение гена антибиотикоустойчивости bla-TEM-1В с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR-Cas проводили способом, описанным в Примере 4.

В ходе проведенного анализа было показано, что рибонуклеопротеиновые комплексы CRISPR-Cas обладают способностью выявлять ген антибиотикоустойчивости bla-TEM-1В в препаратах ДНК, выделенных из клинических образцов. При этом в среднем уже на 20 цикле (20 минут) анализа значение сигнала превышало значение «шума» (неспецифической флуоресценции контрольного образца, не содержащего мишени) более чем в 5 раз, а к 29 циклу (29 минут) анализа - более чем в 10 раз (Таблица 4).

Типичные результаты анализа приведены на примерах значений флуоресценции в конечной точке (60 цикл анализа, 60 минут) для предварительно амплифицированного фрагмента гена антибиотикоустойчивости bla-TEM-1В (10 независимых клинических образцов), обработанных рибонуклеопортеиновыми комплексами, содержащими направляющие РНК crRNA bla-TEM-1В №56, crRNA bla-TEM-1B №166, crRNA bla-TEM-1B №410 и crRNA bla-TEM-1B №536 и белок LbCpf1, на Фиг. 10.

Эффективность выявления гена антибиотикоустойчивости bla-TEM-1В, содержащегося в составе препаратов ДНК, выделенных из клинических образцов, с использованием различных направляющих РНК в составе рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR-Cas, сформированных на основе LbCpf1 из Lachnospiraceae, оцененная по соотношению значений сигнала к значению «шума» при детекции, можно представить в следующем порядке по убыванию: crRNA bla-ТЕМ-1B №410 > crRNA bla-ТЕМ-1В №56 > crRNA bla-TEM-1B №536 > crRNA bla-TEM-1B №166 (Таблица 4).

Таким образом, разработанные направляющие РНК позволяют ультрачувствительно выявлять единичные копии гена антибиотикоустойчивости bla-TEM-1В, и способны обнаруживать его препаратах ДНК, выделенных из клинических образцов, после предварительной амплификации в составе рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR-Cas.

--->

<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing

1.2//EN" "ST26SequenceListing_V1_2.dtd">

<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_2" fileName="bla-TEM-1B "

softwareName="WIPO Sequence" softwareVersion="1.0.0"

productionDate="2023-12-01">

<ApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>b/n</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2023-12-01</FilingDate>

</ApplicationIdentification>

<ApplicantFileReference>1</ApplicantFileReference>

<ApplicantName languageCode="ru">ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии

Роспотребнадзора</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>FBUN CRIE</ApplicantNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">Способ получения препарата

рибонуклеопротеинового комплекса CRISPR-Cas и препарат для выявления

гена антибиотикоустойчивости bla-TEM-1B в ультранизких

концентрациях</InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>8</SequenceTotalQuantity>

<SequenceData sequenceIDNumber="1">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>40</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>RNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..40</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other RNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>bla-TEM-1B</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>aatttctactaagtgtagatcgccccgaagaacgttttcc</INSDSeq

_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="2">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>40</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>RNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..40</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other RNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>bla-TEM-1B</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>aatttctactaagtgtagatctgtgactggtgagtactca</INSDSeq

_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="3">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>40</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>RNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..40</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other RNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>bla-TEM-1B</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>aatttctactaagtgtagatttgcacaacatgggggatca</INSDSeq

_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="4">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>40</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>RNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..40</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other RNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>bla-TEM-1B</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>aatttctactaagtgtagatcgcaacgttgttgccattgc</INSDSeq

_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="5">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>40</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>RNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..40</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other RNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>bla-TEM-1B</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>aatttctactaagtgtagattccgcctccatccagtctat</INSDSeq

_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="6">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>40</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>RNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..40</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other RNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>bla-TEM-1B</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>aatttctactaagtgtagattcagcaataaaccagccagc</INSDSeq

_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="7">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>34</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>RNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..34</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other RNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>bla-TEM-1B</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>ctggatctcaacagcggtaagatccttgagagtt</INSDSeq_seque

nce>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="8">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>34</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>RNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..34</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other RNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>bla-TEM-1B</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>cttaccatctggccccagtgctgcaatgataccg</INSDSeq_seque

nce>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Изобретение относится к области биотехнологии. Описана группа изобретений, включающая способ получения препарата рибонуклеопротеинового комплекса CRISPR-Cas и препарат рибонуклеопротеинового комплекса CRISPR-Cas для выявления гена антибиотикоустойчивости bla-TEM-1B, полученный вышеуказанным способом. Способ содержит стадии синтеза направляющей РНК с SEQ ID NO: 1-6, объединения Cas-белка семейства CRISPR-Cas LbCpf1 из Lachnospiraceae в комплекс с по меньшей мере одной направляющей РНК и лиофильной сушки рибонуклеопротеинового комплекса CRISPR-Cas, с получением, таким образом, препарата рибонуклеопротеинового комплекса CRISPR-Cas. Изобретение расширяет арсенал средств для выявления гена антибиотикоустойчивости bla-TEM-1B. 2 н. и 4 з.п. ф-лы, 10 ил., 4 табл., 5 пр.

1. Способ получения препарата рибонуклеопротеинового комплекса CRISPR-Cas, отличающийся тем, что содержит стадии:

(i) синтеза направляющей РНК с SEQ ID NO: 1-6;

(ii) объединения Cas-белка семейства CRISPR-Cas LbCpf1 из Lachnospiraceae в комплекс с по меньшей мере одной направляющей РНК, полученной на стадии (i); и при необходимости

(iii) лиофильной сушки рибонуклеопротеинового комплекса CRISPR-Cas, полученного на стадии (ii);

с получением, таким образом, препарата рибонуклеопротеинового комплекса CRISPR-Cas.

2. Способ по п.1, где синтез направляющих РНК осуществляют методом in vitro транскрипции с последующим переосаждением продуктов реакции in vitro транскрипции из реакционной смеси добавлением хлорида натрия до конечной концентрации 400 mM и равного объема изопропилового спирта.

3. Способ по любому из пп.1, 2, где непосредственно перед объединением с Cas-белком направляющую РНК прогревают при 90°С в течение 5 минут и позволяют медленно остыть до комнатной температуры, что обеспечивает формирование корректной конформации шпильки, содержащейся в направляющей РНК.

4. Препарат рибонуклеопротеинового комплекса CRISPR-Cas для выявления гена антибиотикоустойчивости bla-TEM-1B, полученный способом по любому из пп.1-3, содержащий Cas-белок семейства CRISPR-Cas LbCpf1 из Lachnospiraceae в комплексе с по меньшей мере одной направляющей РНК с SEQ ID NO: 1-6.

5. Препарат по п.4, где препарат представляет собой раствор указанного рибонуклеопротеинового комплекса CRISPR-Cas.

6. Препарат по п.4, где указанный препарат лиофилизирован.