КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ОБЛЕГЧЕНИЯ, ПРЕДУПРЕЖДЕНИЯ ИЛИ ЛЕЧЕНИЯ ЗАБОЛЕВАНИЙ КОСТЕЙ ИЛИ МЕТАБОЛИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ, СОДЕРЖАЩАЯ НОВЫЙ ШТАММ LACTOBACILLUS SAKEI CVL-001 И ЕЕ КУЛЬТУРАЛЬНУЮ СРЕДУ Российский патент 2022 года по МПК C12N1/20 A61K35/747 A61P19/10 C12R1/225 

Область изобретения

Настоящее раскрытие было сделано при поддержке Министерства науки и ИКТ (Информационно-коммуникационные технологии), Республика Корея, в рамках проекта №2018R1A2B3004143, который проводился Национальным фондом по НИОКР (Научно-исследовательские и опытно-конструкторские работы) Chonnam в исследовательском проекте под названием «Исследование Nod2-опосредованной клеточной/тканеспецифичной системы защиты от патогенной инфекции» под управлением Национального исследовательского фонда Кореи для проекта под названием «Проект по поддержке основных исследователей», с 01 марта 2018 года по 28 февраля 2022 года.

Данная заявка заявляет приоритет и преимущества по корейской заявке на патент №№10-2019-0022670 и 10-2019-0022671, поданной 26 февраля 2019 года, и корейской заявке на патент №10-2020-0012763, поданной 03 февраля 2020 года в Офисе интеллектуальной собственности Республики Корея, содержания которых включены в данный документ во всей своей полноте посредством ссылки.

Настоящее раскрытие относится к штамму Lactobacillus sakei CVL-001 и способу его выделения, и, более конкретно, к штамму Lactobacillus sakei CVL-001, выделенному и идентифицированному из кимчи.

Кроме того, настоящее раскрытие относится к композиции, содержащей штамм Lactobacillus sakei CVL-001 или его культуральную жидкость, для облегчения, предупреждения или лечения заболеваний костей или метаболического заболевания и, более конкретно, к композиции, содержащей штамм Lactobacillus sakei CVL-001, депонированный под номером доступа KCTC13816BP, или его культуральную жидкость, для облегчения, предупреждения или лечения заболеваний костей или метаболических заболеваний.

Предшествующий уровень техники

Молочнокислые бактерии в большом количестве обнаружены в корейских традиционных ферментированных пищевых продуктах, таких как кимчи. При существовании в симбиозе друг с другом в пищеварительной системе человека молочнокислые бактерии отвечают за деградацию волокон и сложных белков, обеспечивая важные питательные вещества и поддерживая кишечную среду при кислотном рН с ингибированием пролиферации вредных бактерий, таких как Е. coli или Chlostridium sp., и с облегчением диареи и запора, и играют роль в синтезе витаминов и снижении уровней холестерина в крови. В частности, сильно связываясь с клетками слизистой оболочки и эпителиальными клетками кишечника, молочнокислые бактерии вносят большой вклад в регуляцию кишечника.

Кроме того, известно, что молочнокислые бактерии усиливают способность макрофагов распознавать и уничтожать вредные кишечные бактерии посредством стимуляции пролиферации макрофагов и демонстрируют иммуностимулирующее действие за счет стимуляции секреции иммуноопосредованных веществ (Gabriela peridgon et al. J of food Protection 53: 404-411, 1990: Katsumasa sato et al., Microbiol Immunol., 32(7): 689-698, 1998).

Микроорганизмы Lactobacillus spp., которые осуществляют гомо- или гетероферментативное молочнокислое брожение, обычно участвуют в ферментации молочных продуктов и овощей. Недавно проводилось активное исследование по разработке микроорганизмов Lactobacillus spp в качестве пробиотиков, пищевых добавок и т.д.

За последние годы широко исследуется важность кишечной микробиоты (ниже в данном документе называемой «GM» (от англ. gut microbiota)) как в отношении здоровья, так и заболевания. GM включает триллионы бактерий, которые в совокупности содержат в 150 раз больше генов, чем геном человека. GM приобретается при рождении и, хотя и являясь четко выраженной структурой, явно совместно эволюционировала с человеческим геномом и может считаться многоклеточным органом, который взаимодействует с и воздействует на своего хозяина множеством способов.

Состав GM модулируется целым рядом факторов окружающей среды, таких как рацион и лечение антибиотиками. Молекулы, продуцируемые кишечными бактериями, могут быть как полезными, так и вредными, и, как известно, воздействуют на эндокринные клетки в кишечнике, энтеральную нервную систему, проницаемость кишечника и иммунную систему. Предполагают, что нарушенный состав микроорганизмов вовлечен в целый ряд воспалительных состояний, в пределах и вне кишечника, включая болезнь Крона, язвенный колит, ревматоидный артрит, рассеянный склероз, диабет, пищевые аллергии, экзему и астму, а также ожирение и метаболический синдром.

Женщины в климактерический период переживают разные синдромы менопаузы. В частности, падение уровня эстрогена у женщин во время менопаузы вызывает повторное поглощение кальция из костей с уменьшением костной массы. Увеличенная потеря костной массы делает кость пористой, приводя к высокому риску остеопороза. По многим причинам женщинам нелегко в период менопаузы распознавать постменопаузные симптомы, поскольку для появления симптомов после начала менопаузы требуется продолжительный период времени. В соответствии с корейской национальной медицинской статистикой Министерства здравоохранения и социального обеспечения, сообщено, что распространенность остеопороза у людей в возрасте 30 лет или старше составляет 1% в случае мужчин и 9% в случае женщин, с 9-кратным преобладанием у женщин, по сравнению с мужчинами.

Перелом костей, вызываемый остеопорозом, является главной проблемой со здоровьем и приводит к огромной экономической нагрузке на системы здравоохранения. Пожизненный риск какого-либо остеопоротического перелома является высоким на Западе (примерно 50% в случае женщин и 20% в случае мужчин), и переломы связаны со значительной смертностью и заболеваемостью. Кортикальное вещество кости составляет приблизительно 80% кости в организме. Многие исследования показали, что кортикальное вещество кости является главным определяющим фактором прочности костей и, вследствие этого, склонности к переломам. Потеря костной массы в возрасте старше 65 лет главным образом обусловлена потерей в кортикальном веществе кости, а не в губчатых костях (Lancet, 2010, May 15; 375(9727):1729-36).

Скелет заново создается посредством остеобластов, формирующих кость (ОВ - от англ. osteoblast), и остеокластов, резорбирующих кость (OCL - от англ. osteoclast). Макрофагальный колониестимулирующий фактор (MCSF - от англ. Macrophage colony stimulating factor) увеличивает пролиферацию и выживаемость клеток - предшественников OCL, а также повышающую регуляцию экспрессии активатора рецептора ядерного фактора-κВ (RANK - от англ. receptor activator of nuclear factor-κВ) в OCL. Это обеспечивает связывание лиганда RANK (RANKL) и начало сигнального каскада, что приводит к образованию OCL. Эффект RANKL может быть ингибирован остеопротегерином (OPG - от англ. osteoprotegerin), который представляет собой рецептор-ловушку для RANKL.

Кроме того, метаболические заболевания, такие как ожирение, сахарный диабет и т.д., имеют тенденцию к росту вследствие генетических факторов и факторов окружающей среды, наряду с быстрым экономическим ростом и европеизированным режимом питания. В то время как продолжаются исследования веществ, предупреждающих и лечащих данные заболевания, требуется разработка разных функциональных продуктов питания.

Распространенность ожирения увеличивается по всему миру, одновременно возрастает заинтересованность в лечении ожирения из-за метаболических осложнений, вызываемых ожирением. Лекарственные средства против ожирения, используемые в настоящее время, обычно предназначены для подавления аппетита в результате индукции насыщения или для индукции потери массы тела в результате снижения поглощения жиров. Насыщение индуцируется посредством повышения концентрации норэпинефрина или серотонина в синапсисах нейромедиаторов или посредством стимуляции серотонинергических рецепторов или адренергических рецепторов.

Однако, лекарственные средства, разработанные для лечения ожирения, демонстрируют серьезные нежелательные эффекты, в сравнении с их фармакологическим действием. Таким образом, существует острая необходимость в разработке вещества, которое обладало бы новым механизмом действия, приводящим к превосходному действию, направленному против ожирения, с маленькими побочными эффектами.

Раскрытие изобретения

Техническая проблема

Посредством трудоемкого и всестороннего исследования авторам настоящего изобретения удалось выделить и идентифицировать штамм Lactobacillus sakei из образцов кимчи, собранных со всех частей Кореи, и они обнаружили, что данный штамм Lactobacillus sakei, выделенный из кимчи, и его культуральная жидкость оказывают эффекты ингибирования дифференцировки остеокластов, облегчения заболеваний на основе остеопороза, ингибирования дифференцировки адипоцитов и подавления набора массы тела.

Целью настоящего раскрытия, таким образом, является предложение штамма Lactobacillus sakei CVL-001, депонированного под номером доступа KCTC13816BP.

Другой целью настоящего раскрытия является предложение культуральной жидкости штамма Lactobacillus sakei CVL-001, депонированного под номером доступа KCTC13816BP.

Еще одной целью настоящего раскрытия является предложение способа выделения штамма Lactobacillus sakei CVL-001, депонированного под номером доступа KCTC13816BP, причем способ включает стадию культивирования экстракта кимчи.

Еще одной целью настоящего раскрытия является предложение штамма Lactobacillus sakei CVL-001, депонированного под номером доступа KCTC13816BP, который обладает активностью облегчения, предупреждения или лечения заболевания костей или метаболического заболевания.

Еще одной целью настоящего раскрытия является предложение культуральной жидкости штамма Lactobacillus sakei CVL-001, депонированного под номером доступа KCTC13816BP, который обладает активностью облегчения, предупреждения или лечения заболевания костей или метаболического заболевания.

Еще одной целью настоящего раскрытия является предложение фармацевтической композиции для предупреждения или лечения заболевания костей или метаболического заболевания, содержащей культуральную жидкость штамма Lactobacillus sakei CVL-001, депонированного под номером доступа KCTC13816BP.

Еще одной целью настоящего раскрытия является предложение пищевой композиции для облегчения заболевания костей или метаболического заболевания, содержащей культуральную жидкость штамма Lactobacillus sakei CVL-001, депонированного под номером доступа KCTC13816BP.

Дополнительной целью настоящего раскрытия является применение штамма Lactobacillus sakei CVL-001, депонированного под номером доступа KCTC13816BP, в облегчении, предупреждении или лечении заболевания костей или метаболического заболевания.

Решение проблемы

Настоящее раскрытие относится к штамму Lactobacillus sakei CVL-001, способу его выделения, композиции, содержащей штамм Lactobacillus sakei CVL-001 или его культуральную жидкость, для облегчения, предупреждения или лечения заболевания костей или метаболического заболевания.

Авторы настоящего изобретения выделили штаммы из экстрактов кимчи, осуществляли отбор грамположительных, каталаза-негативных штаммов из них и идентифицировали отобранный штамм как Lactobacillus sakei CVL-001. Кроме того, идентифицировали, что штамм или его культуральная жидкость ингибируют дифференцировку остеокластов и оказывают терапевтическое действие на заболевание костей, с подавлением набора массы тела и уменьшением уровня глюкозы в крови, наблюдаемого у мышей с ожирением, вызванным рационом с высоким содержанием жира.

Ниже будет приведено подробное описание настоящего раскрытия.

Аспект настоящего раскрытия принадлежит к штамму Lactobacillus sakei CVL-001, депонированному под номером доступа KCTC13816BP.

Штамм может включать последовательность 16S рРНК (рибосомная рибонуклеиновая кислота), представленную SEQ ID NO: 1.

Еще один аспект настоящего раскрытия принадлежит к культуральной жидкости штамма Lactobacillus sakei CVL-001, депонированного под номером доступа KCTC13816BP.

Штамм может включать последовательность 16S рРНК, представленную SEQ ID NO: 1.

Еще один аспект настоящего раскрытия относится к способу выделения штамма Lactobacillus sakei CVL-001, депонированного под номером доступа KCTC13816BP, включающему стадию культивирования экстракта кимчи.

Экстракт кимчи может представлять собой сок из измельченной кимчи, полученный посредством измельчения кимчи и фильтрации измельченной кимчи. Например, экстракт кимчи может представлять собой разбавленный сок кимчи, полученный посредством добавления воды к соку из измельченной кимчи, но не ограничивается им.

Стадия культивирования может включать первую стадию культивирования для инкубации экстракта кимчи; и вторую стадию культивирования для культивирования штамма, выделенного на первой стадии культивирования.

Первая стадия культивирования может быть проведена в среде, содержащей 0,5-2% карбоната кальция или 0,004-0,006% бромкрезолового пурпурного, для выявления молочнокислых бактерий, например, в среде, содержащей карбонат кальция, но без ограничений ею.

Первую стадию культивирования можно проводить при температуре от 20 до 32°С в течение 36-60 часов, например, при 30°С в течение 48 часов, но, не ограничиваясь этим. Затем колонии с ореолом отбирали и подвергали второй стадии.

Вторая стадия культивирования может представлять собой стадию, на которой молочнокислые бактерии выбирают среди отобранных колоний и культивируют. Подробно, она может представлять собой стадию, на которой осуществляют отбор грамположительных, каталаза-негативных молочнокислых бактерий из выделанных штаммов.

Вторую стадию культивирования можно проводить при температуре от 20 до 32°С в течение 12-36 часов, например, при 30°С в течение 24 часов, но, не ограничиваясь этим.

Еще один аспект настоящего раскрытия относится к штамму Lactobacillus sakei CVL-001, депонированному под номером доступа KCTC13816BP, который обладает активностью облегчения, предупреждения или лечения заболевания костей. Штамм может быть выделен из кимчи, но, не ограничиваясь ей.

Еще один аспект настоящего раскрытия относится к культуральной жидкости штамма Lactobacillus sakei CVL-001, депонированного под номером доступа KCTC13816BP, которая обладает активностью облегчения, предупреждения или лечения заболевания костей.

Еще один аспект настоящего раскрытия относится к фармацевтической композиции, содержащей штамм Lactobacillus sakei CVL-001, депонированный под номером доступа KCTC13816BP, или его культуральную жидкость, для предупреждения или лечения заболевания костей.

Заболевание костей может быть выбрано из остеопороза, метастатического рака кости, остеомаляции, рахита, фиброзного остита, адинамической болезни кости, метаболического заболевания и периодонтита, например, остеопороза, но, не ограничиваясь ими.

Культуральная жидкость может представлять собой супернатант, полученный посредством культивирования штамма Lactobacillus sakei CVL-001 и удаления вышеуказанного, его концентрат, его фракцию или его лиофилизат.

Культуральная жидкость может быть получена в результате культивирования штамма Lactobacillus sakei CVL-001 в течение 12-30 часов, 12-24 часов, 18-30 часов или 18-24 часов, например, 22-26 часов, но, не ограничиваясь этим. При заданном пороговом значении 24 часа, ингибирующая активность в отношении дифференцировки остеокластов не повышается при культивировании зависимым от времени образом, когда время культивирования превышает пороговое значение.

Для культивирования штамма Lactobacillus sakei CVL-001 можно использовать среду Альфа-МЕМ.

Подробно, среда ВМЕ (от англ. Basal Media Eagle - базальная среда Игла), которую получают в результате исследования необходимых питательных веществ, неорганических солей и витаминов, необходимых для роста клеток, представляет собой основной состав для MEM и DMEM, обе из которых широко используются. MEM (от англ. Minimum Essential Media Eagle - минимальная основная среда Игла) имеет более высокую концентрацию аминокислот, чем ВМЕ, и содержит соли Эрла для буферизующего действия CO₂/NaHCO₃. В соответствии с типами клеток, можно использовать среду, дополнительно дополненную заменимыми аминокислотами, или среду, содержащую соли Хэнка, вместо солей Эрла. Дополненная аминокислотами, витаминами и т.д., среда Альфа-МЕМ (MEM, модификация Альфа) является полезной для трансформации ДНК в животных клетках.

Композиция может содержать культуральную жидкость в концентрации от 50 до 400, от 50 до 350, от 50 до 300, от 50 до 250, от 100 до 400, от 100 до 350, от 100 до 300, от 100 до 250, от 150 до 400, от 150 до 350, от 150 до 300, от 150 до 250, от 180 до 400, от 180 до 350 или от 180 до 300 мкл/мл, например, от 180 до 250 мкл/мл, но, не ограничиваясь ими.

Культуральная жидкость может иметь рН от 6,5 до 8,5, от 6,5 до 8,0, от 6,5 до 7,5, от 7,0 до 8,5 или от 7,0 до 8,0, например, рН 7,0-7,5, но не ограничивается им.

При росте молочнокислых бактерий, продуцируются метаболиты, такие как молочная кислота и т.д., делая культуральную жидкость кислотной, рН которой попадает в диапазон рН, неподходящий для культивирования клеток. Исходя из данной ситуации, рН 7,4 является наиболее подходящим для культивирования клеток.

Предупреждение и лечение заболевания костей может быть достигнуто посредством ингибирования дифференцировки остеокластов, но, не ограничиваясь им.

Еще один аспект настоящего раскрытия относится к фармацевтической композиции, содержащей штамм Lactobacillus sakei CVL-001, депонированный под номером доступа KCTC13816BP, или его культуральную жидкость, для предупреждения или лечения метаболического заболевания.

Метаболическое заболевание может представлять собой по меньшей мере одно заболевание, выбранное из группы, состоящей из ожирения, сахарного диабета, гипертензии, гиперлипидемии, сердечнососудистого заболевания и гиперинсулинемии.

Фармацевтическая композиция может содержать штамм Lactobacillus sakei CVL-001 в концентрации от 5×10⁵ до 5×10¹² КОЕ (колониеобразующая единица)/мл, от 5×10⁶ до 5×10¹¹ КОЕ/мл или от 5×10⁷ до 5×10¹⁰ КОЕ/мл, например, от 5×10⁸ до 5×10⁹ КОЕ/мл, но, не ограничиваясь этим.

Культуральная жидкость может быть получена посредством культивирования штамма Lactobacillus sakei CVL-001 на протяжении 12-30 часов, 12-24 часов, 18-30 часов или 18-24 часов, например, 22-26 часов, но, не ограничиваясь этим. При заданном пороговом значении 24 часа, эффект подавления набора массы тела или уменьшения уровней глюкозы в крови не значимо увеличивается зависимым от времени образом, когда время культивирования превышает пороговое значение.

Культуральная жидкость может представлять собой супернатант культуры, полученный посредством культивирования штамма Lactobacillus sakei CVL-001 и удаления вышеуказанного, его концентрат, его фракцию или его лиофилизат.

Культуральная жидкость может иметь рН 6,5-8,5, 6,5-8,0, 6,5-7,5, 7,0-8,5 или 7,0-8,0, например, рН 7,0-7,5, но, не ограничиваясь этим.

При росте молочнокислых бактерий, продуцируются метаболиты, такие как молочная кислота и т.д., делая культуральную жидкость кислотной, рН которой попадает в диапазон рН, неподходящий для культивирования клеток. Исходя из данной ситуации, рН 7,4 является наиболее подходящим для культивирования клеток.

Фармацевтическая композиция по настоящему раскрытию может использоваться в виде фармацевтической композиции, содержащей фармацевтически эффективное количество культуральной жидкости штамма Lactobacillus sakei CVL-001 и/или фармацевтически приемлемый носитель.

В том виде, в котором он используется в данном документе, термин «фармацевтически эффективное количество» относится к количеству, которое обеспечивает в достаточной степени достижение эффективности или активности культуральной жидкости штамма Lactobacillus sakei CVL-001.

Фармацевтически приемлемый носитель, содержащийся в фармацевтической композиции по настоящему раскрытию, может представлять собой любой фармацевтически приемлемый носитель, который обычно используется в композициях. Примеры данного носителя включают лактозу, декстрозу, сахарозу, сорбит, маннит, крахмал, аравийскую камедь, фосфат кальция, альгинат, желатин, силикат кальция, микрокристаллическую целлюлозу, поливинилпирролидон, целлюлозу, воду, сироп, метилцеллюлозу, метилгидроксибензоат, пропилгидроксибензоат, тальк, стеарат магния, минеральное масло и тому подобное, но не ограничиваются ими. Помимо данных носителей фармацевтическая композиция по настоящему раскрытию может дополнительно содержать смазывающее вещество, увлажнитель, подсластитель, корригент, эмульгатор, суспендирующий агент, консервант и т.д.

Фармацевтическая композиция по настоящему раскрытию может быть введена млекопитающим, включая человека, разными способами. Все возможные способы введения могут быть рассмотрены, включая, например, пероральный, накожный, внутривенный, внутримышечный, подкожный и другие способы, с предпочтением в отношении перорального способа.

Подходящая доза фармацевтической композиции по настоящему раскрытию может варьировать в зависимости от способов приготовления фармацевтической композиции, способов введения, возраста пациента, массы тела, пола, тяжести заболеваний, рациона, времени введения, способа введения, скорости экскреции и чувствительности. Лечащие врачи со средними навыками могут легко определять и диагностировать уровень дозировки лекарственного средства, эффективный для желательного лечения или предупреждения целевых нарушений или заболеваний.

Фармацевтическая композиция по настоящему раскрытию может быть приготовлена в однодозовой форме и многодозовой форме в соответствии со способами, которые могут осуществляться специалистом в данной области, используя фармацевтически приемлемый носитель и/или наполнитель. В связи с этим, композиция может находиться в форме раствора в масляной или водной среде, суспензии или эмульсии, экстракта, порошка, гранулы, таблетки, капсулы или геля (например, гидрогеля), и может дополнительно содержать диспергирующее средство или стабилизатор.

Еще один аспект настоящего раскрытия относится к пищевой композиции, содержащей штамм Lactobacillus sakei CVL-001, депонированный под номером доступа KCTC13816BP, или его культуральную жидкость, для облегчения заболевания костей.

Заболевание костей может быть выбрано из остеопороза, метастатического рака кости, остеомаляции, рахита, фиброзного остита, адинамической болезни кости, метаболического заболевания и периодонтита, например, остеопороза, но, не ограничиваясь ими.

Культуральная жидкость может представлять собой супернатант, полученный посредством культивирования штамма Lactobacillus sakei CVL-001 и удаления вышеуказанного, его концентрат, его фракцию или его лиофилизат.

Культуральная жидкость может быть получена в результате культивирования штамма Lactobacillus sakei CVL-001 в течение 12-36 часов, 12-30 часов, 12-24 часов, 18-36 часов, 18-30 часов или 18-24 часов, например, 22-26 часов, но без ограничения этим.

Композиция может содержать культуральную жидкость в концентрации 20-400, 20-350, 20-300, 20-250, 50-400, 50-350, 50-300, 50-250, 100-400, 100-350, 100-300, 100-250, 150-400, 150-350, 150-300, 150-250, 180-400, 180-350 или 180-300 мкл/мл, например, 180-250 мкл/мл, но без ограничений ими.

Культуральная жидкость может иметь рН от 6,5 до 8,5, от 6,5 до 8,0, от 6,5 до 7,5, 7,0 до 8,5 или от 7,0 до 8,0, например, рН от 7,0 до 7,5, но не ограничивается этим.

Облегчение заболевания костей могло быть достигнуто посредством ингибирования дифференцировки остеокластов, но без ограничений им.

Еще один аспект настоящего раскрытия относится к оздоровительной функциональной пищевой композиции, содержащей штамм Lactobacillus sakei CVL-001, депонированный под номером доступа KCTC13816BP, или его культуральную жидкость, для облегчения метаболического заболевания.

Метаболическое заболевание может представлять собой по меньшей мере одно метаболическое заболевание, выбранное из группы, состоящей из ожирения, сахарного диабета, гипертензии, гиперлипидемии, сердечнососудистого заболевания и гиперинсулинемии.

Оздоровительная функциональная пищевая композиция может содержать штамм Lactobacillus sakei CVL-001 в концентрации от 5×10⁵ до 5×10¹² КОЕ/мл, от 5×10⁶ до 5×10¹¹ КОЕ/мл или от 5×10⁷ до 5×10¹⁰ КОЕ/мл, например, от 5×10⁸ до 5×10⁹ КОЕ/мл, но без ограничений этим.

Культуральная жидкость может быть получена посредством культивирования штамма Lactobacillus sakei CVL-001 в течение 12-36 часов, 12-30 часов, 12-24 часов, 18-36 часов, 18-30 часов или 18-24 часов, например, 22-26 часов, но без ограничений этим.

Культуральная жидкость может представлять собой супернатант культуры, полученный посредством культивирования штамма Lactobacillus sakei CVL-001 и удаления вышеуказанного, его концентрат, его фракцию или его лиофилизат.

Культуральная жидкость может иметь рН 6,5-8,5, 6,5-8,0, 6,5-7,5, 7,0-8.,5 или 7,0-8,0, например, рН 7,0-7,5, но не ограничивается этим.

При использовании в качестве пищевой добавки, пищевую композицию по настоящему раскрытию можно добавлять, как она есть, или можно использовать в комбинации с другой пищей или пищевым ингредиентом, и можно подходящим образом применять общепринятым образом. В получении пищевых продуктов или напитков пищевую композицию можно обычно добавлять в количестве 15 масс.% или меньше и предпочтительно в количестве 10 масс.% в расчете на массу сырого вещества.

Никаких конкретных ограничений не накладывается на типы пищевых продуктов, для которых можно применять пищевую композицию. Примеры добавляемых пищевых продуктов включают мясные продукты, сосиски, хлебобулочные изделия, шоколад, конфеты, закуски, кондитерские изделия, пиццу, рамен, другие типы лапши, жевательные резинки, молочные продукты, включая виды мороженого, разные типы супов, напитки, чаи, напитки, алкогольные напитки и комплексы витаминов и, в соответствии со здравым смыслом, все типы пищевых продуктов.

Напитки могут содержать разные ароматизаторы или природные углеводы в качестве дополнительных ингредиентов. Примеры природных углеводов включают моносахариды, такие как глюкоза и фруктоза, дисахариды, такие как мальтоза и сахароза, натуральные подсластители, такие как декстран и циклодекстран, и синтетические подсластители, такие как сахарин и аспартам. Количество природных углеводов может быть соответствующим образом определено специалистом в данной области.

Кроме того, композиция по настоящему раскрытию может содержать разные питательные вещества, витамины, электролиты, ароматизаторы, красители, пектиновую кислоту или ее соли, альгиновую кислоту или ее соли, органические кислоты, защитные коллоидные загустители, регуляторы рН, стабилизаторы, консерванты, глицерин, спирт, карбонизирующие агенты, используемые в газированных напитках, и т.д. Кроме того, пищевая композиция по настоящему раскрытию может содержать фруктовую мякоть для получения натуральных фруктовых соков, напитков на основе фруктового сока и овощных соков. Данные компоненты можно использовать отдельно или в сочетании. Содержания данных добавок в композиции могут быть соответствующим образом выбраны специалистом в данной области.

Преимущественные эффекты изобретения

Настоящее раскрытие относится к штамму Lactobacillus sakei CVL-001 и способу его выделения. Штамм может быть выделен из кимчи и, как таковой, может преимущественно использоваться в пробиотическом агенте или пищевой добавке.

Кроме того, настоящее раскрытие относится к композиции, содержащей штамм Lactobacillus sakei CVL-001 или его культуральную жидкость, для облегчения, предупреждения или лечения заболевания костей. Демонстрируя эффект ингибирования дифференцировки остеокластов, облегчения остеопоротических заболеваний и подавления адипогенной дифференцировки и набора массы тела, штамм Lactobacillus sakei, выделенный из кимчи, и его культуральная жидкость могут находить преимущественные применения в облегчении, предупреждении или лечении заболевания - остеопороза или ожирения.

Краткое описание графических материалов

Фиг. 1а представляет собой графическое изображение, показывающее ингибирующее действие культуральной жидкости штамма Lactobacillus sakei CVL-001 на дифференцировку остеокластов.

Фиг. 1b представляет собой график, показывающий ингибирующее действие культуральной жидкости штамма Lactobacillus sakei CVL-001 на дифференцировку остеокластов.

Фиг. 2 представляет собой фотографическое изображение, показывающее вестерн-блоты, которые объясняют ингибирующее действие культуральной жидкости штамма Lactobacillus sakei CVL-001 на фосфорилирование белков, индуцирующих дифференцировку остеокластов.

Фиг. 3 демонстрирует графики, которые объясняют ингибирующее действие культуральной жидкости штамма Lactobacillus sakei CVL-001 на экспрессию генов, индуцирующих дифференцировку остеокластов.

Фиг. 4 представляет собой график, показывающий возрастающее действие штамма Lactobacillus sakei CVL-001 и его культуральной жидкости на минеральную плотность костной ткани в мышиных моделях с индуцированным остеопорозом.

Фиг. 5 представляет собой график, показывающий ингибирующее действие культуральной жидкости штамма Lactobacillus sakei CVL-001 на дифференцировку адипоцитов.

Фиг. 6 представляет собой график, показывающий ингибирующее действие штамма Lactobacillus sakei CVL-001 на набор массы тела со временем в опытных группах, которых кормили рационом с высоким содержанием жиров.

Фиг. 7 представляет собой график, показывающий действие штамма Lactobacillus sakei CVL-001, заключающееся в уменьшении массы эпидидимальной жировой ткани в опытных группах, которых кормили рационом с высоким содержанием жиров.

Фиг. 8 представляет собой график, показывающий ингибирующее действие культуральной жидкости штамма Lactobacillus sakei CVL-001 на набор массы тела со временем в опытных группах, которых кормили рационом с высоким содержанием жиров.

Фиг. 9 представляет собой график, показывающий действие культуральной жидкости штамма Lactobacillus sakei CVL-001, заключающееся в уменьшении массы эпидидимальной жировой ткани в опытных группах, которых кормили рационом с высоким содержанием жиров.

Фиг. 10 представляет собой график, показывающий противодиабетическое действие культуральной жидкости штамма Lactobacillus sakei CVL-001 в опытных группах, которых кормили рационом с высоким содержанием жиров, как измерено посредством теста толерантности к глюкозе.

Фиг. 11 представляет собой график, показывающий противодиабетическое действие штамма Lactobacillus sakei CVL-001 в опытных группах, которых кормили рационом с высоким содержанием жиров, как измерено посредством теста толерантности к глюкозе.

Фиг. 12 представляет собой график, показывающий противодиабетическое действие культуральной жидкости штамма Lactobacillus sakei CVL-001 в опытных группах, которых кормили рационом с высоким содержанием жиров, как измерено посредством теста на толерантность к инсулину.

Фиг. 13 представляет собой график, показывающий противодиабетическое действие штамма Lactobacillus sakei CVL-001 в опытных группах, которых кормили рационом с высоким содержанием жиров, как измерено посредством теста на толерантность к инсулину.

Наилучший способ осуществления изобретения

Настоящее раскрытие относится к штамму Lactobacillus sakei CVL-001, депонированному под номером доступа KCTC13816BP, обладающему активностью облегчения, предупреждения или лечения заболевания костей.

Способ осуществления изобретения

Лучшее понимание настоящего раскрытия может быть получено посредством следующих примеров, которые изложены для иллюстрации, а не для того, чтобы рассматриваться как ограничивающие настоящее раскрытие.

Если не указано иное, «%», используемый для того, чтобы показать концентрации конкретных веществ, означает масс./масс.% в следующем случае: твердое вещество/твердое вещество, масс./об.% в следующем случае: твердое вещество/жидкость и об./об.% в следующем случае: жидкость/жидкость на всем протяжении описания изобретения.

Пример 1: Выделение штамма

Пекинскую капусту кимчи сразу после приготовления собирали со всех частей Кореи. При хранении при 6°С плюс/минус 0,5°С с недели 0 по неделю 5, собранную кимчи использовали в качестве образцов кимчи для выделения молочнокислых бактерий. Ручной блендер (Hanil Со, Корея) использовали для измельчения 500 г кимчи с последующей фильтрацией через стерильную марлю. Фильтрат подвергали серийному разведению стерильной водой от 10¹ до 10⁷ раз. Наконец, 10⁷-кратно разведенный сок кимчи распределяли по агару.

Разведенный сок кимчи распределяли по агару MRS (от англ. Man-Rogosa-Sharpe - Ман-Рогоза-Шарп) (Difco Co., Франция), содержащему 2% карбоната кальция (СаСО₃), и инкубировали при 30°С в течение 48 часов перед отбором колоний с ореолом. Отобранные колонии подвергали окрашиванию по Граму (набор для окрашивания по Граму, BD Co., США) и тестированию на каталазу (Biomerieux Co., Франция) для аккуратного отбора грамположительной колонии, негативной в отношении каталазы, в качестве молочнокислых бактерий.

Штаммы молочнокислых бактерий, выделенные таким образом, инокулировали в бульон MRS, инкубировали при 30°С в течение 24 часов, и к ним добавляли 25 об./об.% глицерина для получения глицериновых стоков, которые хранили при -70°С до применения.

Пример 2: Идентификация молочнокислых бактерий

Отобранную в конечном итоге молочнокислую бактерию Lactobacillus sakei CVL-001 идентифицировали посредством секвенирования 16S рРНК. После полного выделения штаммы, распределенные по чашкам с MRS, доставляли посредством службы доставки замороженных упаковок в SolGent (Daejeon, Корея), где штаммы анализировали посредством секвенирования 16S рРНК с набором универсальных праймеров 27F (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3') и 1492R (5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3').

Выделенный штамм Lactobacillus sakei CVL-001, как определяли, имеет 16S рРНК-кодирующую нуклеотидную последовательность, состоящую в общей сложности из 1439 п.н., показанную ниже, в Таблице 1.

В отношении нуклеотидной последовательности, полученной выше, поиск сходства последовательностей запускали посредством программного обеспечения Blast (www.ncbi.nlm.nhi.gov) для зарегистрированной базы данных (база данных GenBank). В результате штамм в конечном итоге идентифицировали как Lactobacillus sakei LZ217 из-за 99%-ного сходства между ними.

С учетом результатов, полученных выше, а именно, морфологических признаков, способности к сахарному обмену, и результатов секвенирования 16S рРНК, штамм Lactobacillus sakei CVL-001 с прекрасной продуктивностью маннита и жизнеспособностью (преобладание) в соке кимчи, идентифицировали как Lactobacillus sakei LZ217.

Выделенный штамм называли Lactobacillus sakei CVL-001 и депонировали в корейскую коллекцию типовых культур, расположенную в 823, Shinjung-dong, Jeongeup City, Jeollabuk-do, Корея.

Пример 3: Получение культуральной жидкости штамма Lactobacillus sakei CVL-001

Культуру для использования в применении к клеткам получали посредством культивирования Lactobacillus sakei CVL-001 в течение 24 часов в среде альфа-МЕМ, центрифугирования клеточной культуры и регулирования рН у отделенного супернатанта до 7,4.

Пример 4: Анализ ингибирующей активности культуральной жидкости штамма Lactobacillus sakei CVL-001 в отношении дифференцировки остеокластов

Макрофаги мыши высевали при плотности 2×10⁵ клеток/лунка в 12-луночные планшеты и инкубировали в течение 24 часов. После замены среды средой с добавлением фетальной телячьей сыворотки (далее в данном документе называемой «FBS» (от англ. fetal bovine serum)), 1% пенициллина-стрептомицина (далее в данном документе называемых «PS» (от англ. penicillin-streptomycin)) и макрофагального колониестимулирующего фактора (далее в данном документе называемого «М-CSF» (от англ. macrophage colony stimulating factor)), клетки инкубировали с культуральной жидкостью (50, 100 и 200 мкл/мл) в течение 2 часов. Затем, клетки обрабатывали 100 нг/мл RANKL (от англ. receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand - лиганд рецептора-активатора ядерного фактора каппа-В) в течение 24 часов и обеспечивали дифференцировку в течение 6 суток способом, описанным выше.

Затем, хромогенный субстрат для цитохимического фермента-маркера, устойчивой к тартрату кислой фосфатазы (далее в данном документе называемой «TRAP» (от англ. tartrate-resistant acid phosphatase)), добавляли для окрашивания ядер. Многоядерные клетки с тремя или более ядрами наблюдали и получали изображения.

Применимо к макрофагам, RANKL связывается с RANK, вызывая дифференцировку в TRAP-позитивные клетки. Стимуляция TRAP-позитивных клеток фактором воспаления, таким как RANKL, TNF-α (от англ. tumor necrosis factor alpha - фактор некроза опухоли альфа) и т.д. превращает слияние клеток в многоядерные TRAP-позитивные клетки.

Как показано на Фиг. 1а и 1b и в Таблице 2, обработка макрофага RANKL повышала уровень дифференцировки в остеокласты, и наблюдали, что культуральная жидкость значимо уменьшала число остеокластов дозозависимым образом. Из данного результата было понятно, что культуральная жидкость Lactobacillus sakei CVL-001 может ингибировать дифференцировку остеокластов.

Пример 5: Анализ ингибирующей активности культуральной жидкости штамма Lactobacillus sakei CVL-001 в отношении экспрессии белка, индуцирующего дифференцировку остеокластов

Проводили исследование механизма MAPK (от англ. mitogen-activated protein kinase - митоген активируемая протеинкиназа) - и NF-κВ-сигнализации, когда мышиные макрофаги обрабатывались RANKL и культуральной жидкостью. С этой целью мышиные макрофаги высевали при плотности 4×10⁵ клеток/лунка в 12-луночные планшеты и инкубировали в течение 24 часов. После замены среды средой, дополненной FBS, 1% PS и M-CSF, культуральную жидкость штамма Lactobacillus sakei CVL-001 (100 мкл/мл) инкубировали в течение 2 часов. Затем, клетки обрабатывали 100 нг/мл RANKL в течение 0, 5, 15 и 30 мин.

После удаления среды белки экстрагировали буфером, лизирующим белок, и количественно оценивали, и 30 мкг белков разделяли в геле SDS-PAGE (от англ. sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis - электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия). Белки переносили на мембрану, последовательно инкубировали с первичными и вторичными антителами (p-jnk (Cell Signaling Technology, №9251S), p-p38 (Cell Signaling Technology, 9211S), p-ERK (Santa Cruz, sc-7383), Ikbalpha (Cell Signaling Technology, 9242S), p-p65 (Cell Signaling Technology, 3031S)). Развитие окраски осуществляли, используя набор (BIO-RAD, набор растворов для выявления ECL) и измеряли посредством устройства (Chemidoc).

RANKL связывается с RANK, осуществляя повышающую регуляцию экспрессии MAPK и NF-κВ посредством TRAF6 и индуцируя активацию разных транскрипционных факторов, приводя к стимуляции дифференцировки остеокластов. Таким образом, проводили исследование для того, чтобы посмотреть, вмешивается ли культуральная жидкость Lactobacillus sakei в данные механизмы, ингибируя дифференцировку остеокластов. В связи с этим, анализировали фосфорилирование MAPK-белков ERK, JNK и р38 посредством вестерн-блоттинга.

В результате, повышенные уровни фосфорилирования JNK, Р38 и ERK наблюдались через 5 и 15 мин после инкубации с RANKL, тогда как MAPK-белки были дефосфорилированы в результате обработки культуральной жидкостью. Кроме того, ингибирование наблюдалось как в отношении деградации IκВ альфа, так и в отношении фосфорилирования р65.

Как понятно по данным Фиг. 2, культуральная жидкость Lactobacillus sakei ингибирует фосфорилирование JNK, Р38 и ERK, подавляя, таким образом, дифференцировку в остеокласты.

Пример 6: Анализ воздействия культуральной жидкости Lactobacillus sakei на экспрессию гена, индуцирующего дифференцировку остеокластов

После обработки культуральной жидкостью Lactobacillus sakei мышиные макрофаги анализировали в отношении экспрессии гена TRAP, DC-STAMP, Катепсина K и NFATc1, которые представляют собой гены, участвующие в остеокластогенезе, посредством ПЦР (полимеразная цепная реакция) в реальном времени. Макрофаги костномозгового происхождения (далее в данном документе называемые «BMDM» (от англ. bone marrow-derived macrophage)) высевали при плотности 1×10⁵ клеток/лунка в 12-луночные планшеты и инкубировали в течение 24 часов. Далее, клетки обрабатывали средой, не содержащей FBS, с добавлением только 1% PS в течение 1 часа и затем 100 мкл/мл культуральной жидкости Lactobacillus sakei в течение 2 часов с последующей инкубацией с RANKL на протяжении 24 часов. Данным образом, клетки подвергали дифференцировке в течение 3 суток перед выделением РНК из клеток с помощью раствора Тризола. На основе количественного определения РНК заранее приготовленную смесь RT (от англ. reverse transcription - обратная транскрипция) использовали для синтеза кДНК, которую затем амплифицировали посредством ПЦР в реальном времени с использованием праймеров.

Используемые праймеры конструировали для мышиных TRAP, DC-STAMP, Катепсина K и NFATc1, которых анализировали в количествах относительно контрольного гена GAPDH (от англ. Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase - глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа).

Макрофаги подвергаются дифференцировке в TRAP-позитивные, многоядерные остеокласты при обработке RANKL, который связывается с RANK. Кроме того, обработка RANKL активирует NFATc1, который представляет собой транскрипционный фактор, играющий важную роль в дифференцировке в остеокласты и осуществляет повышающую регуляцию экспрессии TRAP, Катепсина K и DC-STAMP, которые участвуют в остеокластогенезе.

Как может быт видно на Фиг. 3 и в Таблице 3, уровни экспрессии TRAP, DC-STAMP, Катепсина K и NFATc1, которые были повышены в результате обработки RANKL, снижались в результате обработки культуральной жидкостью Lactobacillus sakei. Эти данные подразумевают, что культуральная жидкость Lactobacillus sakei ингибирует активность транскрипционного фактора NFATc1, осуществляя понижающую регуляцию экспрессии TRAP, DC-STAMP и Катепсина K, которые представляют собой гены, участвующие в остеокластогенезе, подавляя, таким образом, дифференцировку остеокластов.

Пример 7: Конструирование животной модели остеопороза посредством овариэктомии у мышей

Самок мышей C57BL/6 (в возрасте 7 недель) размещали в пластмассовых клетках, в которых поддерживалась температура 22 плюс/минус 2°С и относительная влажность 50 плюс/минус 10% с фотопериодом 12 ч света и 12 ч темноты. Мышей акклиматизировали к одной и той же окружающей среде на протяжении примерно одной недели перед овариэктомией.

Мышам давали наркоз с использованием внутримышечной инъекции Zoletil и Lumpun, после которой область овариэктомии сбривали и стерилизовали. На коже проводили надрез 1 см. Затем, вдоль матки аккуратно выявляли яичник, чтобы не повредить другие органы, и сшивали с помощью шовного материала таким образом, чтобы резецировать противоположные яичники. После овариэктомии каждый из органов повторно позиционировали в пределах брюшной полости, и надрез сшивали посредством нити. С 10 суток терапевтическое вещество вводили в течение 8 недель.

Введение молочнокислых бактерий: после предварительной культивации и основной культивации Lactobacillus sakei разделяли на аликвоты 1×10⁷, 1×10⁸ и 1×10⁹ клеток/мл и вводили перорально.

Введение культуральной жидкости: после предварительной культивации и основной культивации Lactobacillus sakei делили на аликвоты 1×10⁷, 1×10⁸ и 1×10⁹ клеток/мл. Аликвоты клеток разводили в 10 раз и культивировали в среде MRS при 30°С в течение 24 часов. Клетки осаждали посредством центрифугирования, и супернатант культуральной жидкости собирали, и его рН доводили до 7,4 перед пероральным введением в дозе 200 мкл.

Опытные группы делили следующим образом:

Мыши C57BL/6; 80 голов

G1: имитация без овариэктомии, 10 голов, вводили среду MRS (контроль)

G2: имитация без овариэктомии, 10 голов, вводили культуральную жидкость

G3: имитация без овариэктомии, 10 голов, Lactobacillus sakei вводили в дозе 1×10⁹ клеток/мл

G4: опытная группа, которую подвергали овариэктомии (OVX), 10 голов, вводили среду MRS (контроль)

G5: опытная группа, которую подвергали овариэктомии (OVX), 10 голов, вводили культуральную жидкость (разведенную в 1/4)

G6: опытная группа, которую подвергали овариэктомии (OVX), 10 голов, вводили культуральную жидкость (разведенную в 1/2)

G7: опытная группа, которую подвергали овариэктомии (OVX), 10 голов, вводили культуральную жидкость (сток)

G8: опытная группа, которую подвергали овариэктомии (OVX), 10 голов, вводили Lactobacillus sakei в дозе 1×10⁷ клеток/мл

G9: опытная группа, которую подвергали овариэктомии (OVX), 10 голов, вводили Lactobacillus sakei в дозе 1×10⁸ клеток/мл

G10: опытная группа, которую подвергали овариэктомии (OVX), 10 голов, Lactobacillus sakei вводили в дозе 1×10⁹ клеток/мл.

Пример 8: Оценка минеральной плотности костной ткани у мышей с индуцированным остеопорозом в соответствии с введением Lactobacillus sakei и его культуральной жидкостью

Минеральные плотности костной ткани измеряли с использованием компьютерной микротомографии (micro-CT - от англ. microcomputed tomography), которая может обеспечить изображения с более высоким разрешением, чем простая рентгенография и компьютерная томография.

После завершения эксперимента мышиные ноги фиксировали формалином и анализировали в отношении минеральной плотности костной ткани в лабораторном животном центре медицинского инновационного фонда Daegu-Gyeongbuk.

Известно, что у мышей, подвергающихся овариэктомии, уменьшается минеральная плотность костной ткани вследствие неэффективности эстрогена и тому подобное, они широко используются для исследования заболеваний остеопороза.

Как может быть видно на Фиг. 4 и в Таблице 4, наблюдали, что у группы мышей после овариэктомии (G4) значимо уменьшалась минеральная плотность костной ткани, по сравнению с группами имитации. Между тем, штамм Lactobacillus sakei и его культуральная жидкость увеличивали минеральную плотность костной ткани дозозависимым образом. В частности, группы, которым вводили сток культуральной жидкости (G7) и высокую концентрацию бактерий (G10), восстанавливали минеральную плотность костной ткани до уровней вплоть до уровней в группах имитации, не подвергавшихся овариэктомии.

Пример 9: Анализ ингибирующего действия культуральной жидкости штамма Lactobacillus sakei CVL-001, выделенного из кимчи, на дифференцировку адипоцитов (in vitro)

9-1. Получение культуральной жидкости Lactobacillus sakei CVL-001

Lactobacillus sakei CVL-001 культивировали при плотности 1×10⁸ КОЕ/мл в среде DMEM в течение 24 часов с последующим центрифугированием. рН супернатанта, полученного таким образом, доводили до 7,4, обеспечивая получение культуральной жидкости Lactobacillus sakei CVL-001.

9-2. Дифференцировка адипоцитов с использованием линии недифференцированных преадипоцитов 3T3-L1

Преадипоциты 3T3-L1, приобретенные у АТСС (Американская коллекция типовых культур, США), поддерживали посредством пассажа в DMEM с добавлением 10% бычьей телячьей сывороткой (BCS - от англ. bovine calf serum) и 1% PS. Сутки, в которые клетки достигали 100% конфлюентности после засевания в планшеты, обозначали как сутки -2. Пока клетки культивировали в течение еще двух суток, клеточный цикл был приостановлен на уровне фазы G1 во всех клетках, культивируемых в планшетах.

В сутки 0 клеткам давали начать дифференцировку в присутствии IBMX (от англ. 3-isobutyl-1-methylxanthine - 3-изобутил-1-метилксантин), дексаметазона и инсулина (MDI). В сутки 2 среду заменяли средой, содержащей только инсулин. С суток 4 среду заменяли средой с добавлением 10% фетальной телячьей сыворотки (FBS) каждые двое суток до дифференцировки.

9-3. Анализ ингибирующей активности культуральной жидкости Lactobacillus sakei CVL-001 в отношении дифференцировки адипоцитов (окрашивание масляным красным О)

Дифференцировку адипоцитов индуцировали, когда бычью телячью сыворотку (BCS) в составе среды заменяли FBS. Клетки 3T3-L1 высевали при плотности 5×10⁵ клеток/лунка в 12-луночные планшеты, содержащие среду, дополненную 10% FBS и 1% PS. Через двое суток после достижения клетками 100% конфлюентности, а именно, в сутки 0, клетки обрабатывали культуральной жидкостью (12,5, 25,0 и 50,0%) в течение 2 часов и затем индуктором адипогенеза MDI.

Культуральную жидкость получали в результате культивирования L. sakei в концентрации 1×10⁸ КОЕ/мл в среде DMEM (высокое содержание глюкозы) + FBS (10%) + PS (1%) в течение 24 часов, и разведение культуральной жидкости проводили с помощью среды DMEM.

В сутки 2 клетки инкубировали с культуральной жидкостью (12,5, 25,0 и 50,0%) в течение 2 часов, в то время как среду заменяли с последующей обработкой инсулином. В сутки 4 клетки инкубировали с культуральной жидкостью (12,5, 25,0 и 50,0%) одновременно с заменой среды. Ту же процедуру повторяли каждые двое суток до дифференцировки.

Когда наблюдались дифференцированные адипоциты, среду заменяли 4% формалином для фиксации клеток в течение 10 мин. Для окрашивания адипоцитов клетки два раза промывали D.W. (от англ. distilled water - дистиллированная вода) и инкубировали со смесью 6:4 (краситель масляный красный О : D.W) в течение 30 мин. За промывкой D.W. следовало исследование под микроскопом. Затем масляный красный О экстрагировали 100% изопропанолом, и проводили количественный анализ посредством считывания поглощения при 510 нм.

Как понятно из данных Фиг. 5 и Таблицы 5, клетки 3T3-L1 подвергались адипогенной дифференцировке, когда к среде клеточной культуры добавляли MDI. В результате данного исследования воздействие на клетки 3T3-L1 MDI увеличивало адипогенную дифференцировку, тогда как наблюдалось, что культуральная жидкость значимо уменьшала число адипоцитов дозозависимым образом.

В целом, данные подразумевают, что культуральная жидкость Lactobacillus sakei CVL-001 может ингибировать адипогенную дифференцировку.

Пример 10: Конструирование животной мышиной модели ожирения для анализа эффекта уменьшения ожирения (in vivo)

10-1. Получение живых Lactobacillus sakei CVL-001

Получали живые бактерии, подлежащие применению. Кратко, бактерии культивировали в течение 24 часов при 30°С на чашках с агаром MRS, и единичную колонию, образованную таким образом, отбирали и предварительно культивировали в бульоне MRS. Предварительное культивирование проводили в 5 мл среды при 30°С в течение 24 часов при встряхивании при 150 об/мин. Затем 10-кратное разведение культуры наращивали в течение 3 часов в тех же условиях.

Для сохранения равновесия между количеством клеток, полученные в конечном итоге культуры разводили в PBS (от англ. phosphate buffered saline - фосфатно-солевой буферный раствор) до достижения оптической плотности при 600 нм (OD600) 0,6, как измерено посредством спектрофотометра. Значение O.D. соответствует существованию молочнокислых бактерий в концентрации 0,89×10⁹ КОЕ/мл. С введением 200 мкл каждой мыши (1×10⁸ КОЕ/мышь, 1×10⁹ КОЕ/мышь) внутрь, среды живых бактерий получали посредством центрифугирования при 3000 об/мин в течение 15 мин.

10-2. Получение культуральной жидкости Lactobacillus sakei CVL-001

Среду MRS, в которой было завершено размножение Lactobacillus sakei, разводили в 10 раз, инкубировали при 30°С в течение 24 часов при встряхивании при 150 об/мин. После центрифугирования при 3000 об/мин в течение 15 мин, супернатант отделяли, и его рН доводили до 7,4. Проводили фильтрацию через 0,45 мкм мембранный бумажный фильтр перед хранением при 4°С.

10-3. Анализ активности штамма Lactobacillus sakei CVL-001 и культуральной жидкости, направленной против ожирения (in vivo)

Самцам мышей C57BL/6 в возрасте 7 недель вводили живые бактерии (однократная суточная доза 200 мкл/субъект), культуральную жидкость (однократная суточная доза 200 мкл/субъект) и рацион с высоким содержанием жиров. Далее, мышей взвешивали каждые две недели. На неделе 11 у мышей измеряли уровни сахара в крови. На неделе 14 на мышах проводили вскрытие, после которого производили забор образцов крови, и взвешивали органы.

Информация о группах, используемых для анализа данного штамма, выглядела следующим образом:

G1: контрольная группа (кормили нормальным рационом), перорально вводили PBS (фосфатно-солевой буферный раствор) (n=6)

G2: Контрольная группа, перорально вводили 10⁹ L. sakei (n=6)

G3: Группа высокого содержания жиров (кормили рационом с высоким содержанием жиров), перорально вводили PBS (n=8)

G4: Группа высокого содержания жиров, перорально вводили 10⁸ L. sakei (n=8)

G5: Группа высокого содержания жиров, перорально вводили 10⁹ L. sakei (n=8)

Информация о группах, используемых для анализа культуральной жидкости, выглядела следующим образом:

G1: Контрольная группа (кормили нормальным рационом), перорально вводили MRS (n=6)

G2: Контрольная группа, перорально вводили культуральную жидкость (сток) (n=6)

G3: Группа высокого содержания жиров (кормили рационом с высоким содержанием жиров), перорально вводили MRS (n=8)

G4: Группа высокого содержания жиров, перорально вводили культуральную жидкость (разведенную в 1/2) (n=8)

G5: Группа высокого содержания жиров, перорально вводили культуральную жидкость (сток) (n=8).

Пример 11: Анализ действия штамма Lactobacillus sakei CVL-001, выделенного из кимчи, и его культуральной жидкости (in vivo)

11-1. Изменение в массе тела под действием штамма Lactobacillus sakei CVL-001 или его культуральной жидкости (in vivo)

Пероральное введение рациона с высоким содержанием жиров, включающего 60% жиров, как известно, дополнительно увеличивает массу мышей, по сравнению с пероральным введением нормального рациона. Таким образом, животные модели ожирения, вызванного рационом с высоким содержанием жиров, широко используются для исследований заболеваний, связанных с ожирением.

Как может быть видно на Фиг. 6, значимый набор массы тела наблюдали в группе, которую кормили рационом с высоким содержанием жиров (G3), по сравнению с группой, которую кормили нормальным рационом (G1). В частности, наблюдали, что группы (G4 и G5), которых кормили штаммом Lactobacillus sakei CVL-001, в дозе 10⁸ и 10⁹ клеток, соответственно, вместе с рационом с высоким содержанием жиров, значимо уменьшались по массе, в сравнении с G3.

Как показано на Фиг. 7 и в Таблице 6, у G3, которую кормили высоким содержанием жиров, значимо увеличивалась масса эпидидимального жира, по сравнению с G1, в то время как значимое уменьшение массы эпидидимального жира наблюдали в G5, которую кормили штаммом в дозе 10⁹ клеток вместе с рационом с высоким содержанием жиров. Как показано на Фиг. 8, наблюдали, что у группы, которую кормили рационом с высоким содержанием жиров (G3), значимо увеличивалась масса тела, по сравнению с группой, которую кормили нормальным рационом (G1). В частности, значимое уменьшение массы тела выявляли в группе (G5), которую кормили стоком культуральной жидкости Lactobacillus sakei CVL-001 вместе с рационом с высоким содержанием жиров, по сравнению с G3. Набор массы тела, вызываемый рационом с высоким содержанием жиров, не подавлялся введением культуральной жидкости, разведенной в 1/2 (G4).

Как понятно из данных Фиг. 9 и Таблицы 7, масса эпидидимального жира также значимо увеличивалась в группе G3, которую кормили рационом с высоким содержанием жиров, и значимо уменьшалась в G5, которую кормили стоком культуральной жидкости вместе с рационом с высоким содержанием жиров, по сравнением с группой G1, которую кормили нормальным рационом.

11-2. Анализ уровня сахара в крови, проводимый натощак, у мышей, у которых вызвано ожирение, после введения штамма Lactobacillus sakei CVL-001 и культуральной жидкости

После голодания на протяжении 12 часов с 9 часов вечера перед днем эксперимента до 9 часов утра в день эксперимента, мышей подвергали анализу уровня сахара в крови. Как измеряли, у животных мышиных моделей, которых кормили рационом с высоким содержанием жиров, сохранялись высокие уровни сахара в крови натощак. Анализы для опытных групп проводили в тех же условиях, как в Примере 10-3, и группы, которым вводили штамм и культуральную жидкость, перечислены в Таблицах 8 и 9, соответственно.

Как может быть видно в Таблице 8, группа G3, которую кормили рационом с высоким содержанием жиров, поддерживала значимо высокий уровень глюкозы в крови натощак, по сравнению с группой G1, которую кормили нормальным рационом, в данном эксперименте. В частности, уровни глюкозы в крови в G4 и G5, которым вводили штамм Lactobacillus sakei CVL-001 в разных дозах вместе с рационом с высоким содержанием жиров, были ниже, чем уровни глюкозы в крови G3, и похожи на уровни глюкозы в крови группы G1, которую кормили нормальным рационом.

Как может быть видно в Таблице 9, значимо высокий уровень глюкозы в крови натощак сохранялся в группе G3, которую кормили рационом с высоким содержанием жиров, по сравнению с группой G1, которую кормили нормальным рационом, в данном эксперименте. В частности, уровень глюкозы в крови в G5, которую кормили стоком культуральной жидкости Lactobacillus sakei CVL-001, вместе с рационом с высоким содержанием жиров, как наблюдалось, был низким, по сравнению с уровнем глюкозы в крови группы G3, которой вводили сток культуральной жидкости, и похож на уровень глюкозы в крови группы G1, которую кормили нормальным рационом.

11-3. Тест толерантности к глюкозе у мышей, у которых вызвано ожирение, после введения штамма Lactobacillus sakei CVL-001 и культуральной жидкости

Тесты для опытных групп проводили в тех же условиях, как в Примере 10-3, и мышей подвергали тесту толерантности к глюкозе после голодания в течение 12 часов с 9 часов вечере перед днем эксперимента до 9 часов утра в день эксперимента. Раствор PBS, содержащий 10% глюкозу, стерилизованный посредством фильтрации через 0,2 мкм), внутрибрюшинно вводили (стерильной иглой 27G) в дозе 2 мг (глюкоза/г. объем (мкл) = масса тела (г) × 20) каждой мыши. Мышей снова размещали в клетки и измеряли уровень глюкозы в крови с временными интервалами 0, 30, 60, 90 и 120 мин. Для анализа глюкозы кровь брали из хвостов. Измерения приведены в Таблицах 10 и 11 и на Фиг. 10 и 11.

Как показано в Таблице 10 и на Фиг. 10, наблюдали, что группа (G3), которую кормили рационом с высоким содержанием жиров, поддерживала значимо высокий уровень сахара в крови, по сравнению с группой, которую кормили нормальным рационом (G1). В частности, значимое уменьшение уровня глюкозы в крови выявляли в группе (G5), которой вводили сток культуральной жидкости Lactobacillus sakei CVL-001, вместе с рационом с высоким содержанием жиров, по сравнению с G3, начиная с 30 мин после введения. Повышение уровня глюкозы в крови, вызванное рационом с высоким содержанием жиров, не подавлялось введением культуральной жидкости, разведенной в 1/2 (G4).

Как может быть видно в Таблице 11 и на Фиг. 11, значимый высокий уровень глюкозы в крови наблюдали в группе (G3), которую кормили рационом с высоким содержанием жиров, по сравнению с группой, которую кормили нормальным рационом (G1). В частности, наблюдали, что у групп (G4 и G5), которых кормили штаммом Lactobacillus sakei CVL-001 в дозе 10⁸ и 10⁹ клеток, соответственно, вместе с рационом с высоким содержанием жиров, значимо уменьшался уровень глюкозы в крови, по сравнению с G3.

11-4. Тест на толерантность к инсулину у мышей, у которых было вызвано ожирение, после введения штамма Lactobacillus sakei CVL-001 и культуральной жидкости

Тесты для опытных групп проводили в тех же условиях, как в Примере 10-3, и мышей подвергали тестированию толерантности к инсулину после голодания в течение 4 часов с 9 часов утра до 1 часа дня в день эксперимента. Каждой мыши внутрибрюшинно вводили 2 мг/ил инсулина (в D.W. с рН, доведенным до 3 посредством разбавленной HCl) (стерильной иглой 27G) в дозе 1 U (0,03846 мг/кг. Объем (мкл) = масса тела (г) × 20). Мышей снова размещали в клетки, и измеряли у них уровень глюкозы в крови с временными интервалами 0, 30, 60, 90 и 120 мин. Для анализа глюкозы осуществляли забор крови из хвостов.

Как показано в Таблице 12 и на Фиг. 12, наблюдали, что группа (G3), которую кормили рационом с высоким содержанием жиров, сохраняла значимо высокий уровень сахара в крови, по сравнению с группой, которую кормили нормальным рационом (G1). В частности, значимое уменьшение уровня глюкозы в крови выявляли в группе (G5), которой вводили сток культуральной жидкости Lactobacillus sakei CVL-001 вместе с рационом с высоким содержанием жиров, по сравнению с G3, через 90 и 120 мин после введения. Группа (G4), которой вводили культуральную жидкость, разведенную в 1/2, демонстрировала значимо уменьшенный уровень сахара в крови, по сравнению с G3, через 120 мин после введения.

Как может быть видно в Таблице 13 и на Фиг. 13, значимый высокий уровень глюкозы в крови наблюдали в группе (G3), которую кормили рационом с высоким содержанием жиров, по сравнению с группой, которую кормили нормальным рационом (G1). В частности, наблюдали, что у групп (G4 и G5), которых кормили штаммом Lactobacillus sakei CVL-001 в дозе 10⁸ и 10⁹ клеток, соответственно, вместе с рационом с высоким содержанием жиров, значимо уменьшался уровень глюкозы в крови, по сравнению с G3, на протяжении всего времени, за исключением 0 мин после введения.

Промышленная применимость

Настоящее раскрытие относится к штамму Lactobacillus sakei (Lactobacillus sakei) CVL-001 и способу его выделения, и, более конкретно, к штамму Lactobacillus sakei CVL-001, выделенному и идентифицированному из кимчи.

Кроме того, настоящее раскрытие относится к композиции, содержащей штамм Lactobacillus sakei CVL-001 или его культуральную жидкость, для облегчения, предупреждения или лечения заболевания костей, и, более конкретно, к композиции, содержащей штамм Lactobacillus sakei CVL-001, депонированный под номером доступа KCTC13816BP, или его культуральную жидкость, для облегчения, предупреждения или лечения заболевания костей.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Industry-University Cooperation Foundation Chonnam University

<120> КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ОБЛЕГЧЕНИЯ, ПРЕДУПРЕЖДЕНИЯ ИЛИ ЛЕЧЕНИЯ ЗАБОЛЕВАНИЙ КОСТЕЙ

ИЛИ МЕТАБОЛИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ, СОДЕРЖАЩАЯ НОВЫЙ ШТАММ LACTOBACILLUS

SAKEI CVL-001 И ЕЕ КУЛЬТУРАЛЬНУЮ СРЕДУ

<130> PP200015RU

<150> KR 10-2019-0022670

<151> 2019-02-26

<150> KR 10-2019-0022671

<151> 2019-02-26

<150> KR 10-2020-0012763

<151> 2020-02-03

<160> 3

<170> KoPatentIn 3.0

<210> 1

<211> 1439

<212> ДНК

<213> Неизвестен

<220>

<223> 16S рРНК Lactobacillus sakei CVL-001

<400> 1

gcagtcgaac gcactctcgt ttagattgaa ggagcttgct cctgattgat aaacatttga 60

gtgagtggcg gacgggtgag taacacgtgg gtaacctgcc ctaaagtggg ggataacatt 120

tggaaacaga tgctaatacc gcataaaacc taacaccgca tggtgtaggg ttgaaagatg 180

gtttcggcta tcactttagg atggacccgc ggtgcattag ttagttggtg aggtaaaggc 240

tcaccaagac cgtgatgcat agccgacctg agagggtaat cggccacact gggactgaga 300

cacggcccag actcctacgg gaggcagcag tagggaatct tccacaatgg acgaaagtct 360

gatggagcaa cgccgcgtga gtgaagaagg ttttcggatc gtaaaactct gttgttggag 420

aagaatgtat ctgatagtaa ctgatcaggt agtgacggta tccaaccaga aagccacggc 480

taactacgtg ccagcagccg cggtaatacg taggtggcaa gcgttgtccg gatttattgg 540

gcgtaaagcg agcgcaggcg gtttcttaag tctgatgtga aagccttcgg ctcaaccgaa 600

gaagtgcatc ggaaactggg aaacttgagt gcagaagagg acagtggaac tccatgtgta 660

gcggtgaaat gcgtagatat atggaagaac accagtggcg aaggcggctg tctggtctgt 720

aactgacgct gaggctcgaa agcatgggta gcaaacagga ttagataccc tggtagtcca 780

tgccgtaaac gatgagtgct aggtgttgga gggtttccgc ccttcagtgc cgcagctaac 840

gcattaagca ctccgcctgg ggagtacgac cgcaaggttg aaactcaaag gaattgacgg 900

gggcccgcac aagcggtgga gcatgtggtt taattcgaag caacgcgaag aaccttacca 960

ggtcttgaca tcctttgacc actctagaga tagagctttc ccttcgggga caaagtgaca 1020

ggtggtgcat ggttgtcgtc agctcgtgtc gtgagatgtt gggttaagtc ccgcaacgag 1080

cgcaaccctt attactagtt gccagcattt agttgggcac tctagtgaga ctgccggtga 1140

caaaccggag gaaggtgggg acgacgtcaa atcatcatgc cccttatgac ctgggctaca 1200

cacgtgctac aatggatggt acaacgagtt gcgagaccgc gaggtttagc taatctctta 1260

aaaccattct cagttcggat tgtaggctgc aactcgccta catgaagccg gaatcgctag 1320

taatcgcgga tcagcatgcc gcggtgaata cgttcccggg ccttgtacac accgcccgtc 1380

acaccatgag agtttgtaac acccaaagcc ggtgaggtaa cccttcgggg agccagccg 1439

<210> 2

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Прямой праймер 16S рРНК Lactobacillus sakei

<400> 2

agagtttgat cctggctcag 20

<210> 3

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Обратный праймер 16S рРНК Lactobacillus sakei

<400> 3

ggttaccttg ttacgactt 19

<---

Изобретение относится к штамму Lactobacillus sakei CVL-001 и его применению. Предложен штамм Lactobacillus sakei CVL-001, депонированный под номером доступа KCTC13816BP, предназначенный для восстановления минеральной плотности костей у млекопитающего или ингибирования дифференцировки остеокластов. Предложена также фармацевтическая композиция для восстановления минеральной плотности костей у млекопитающего или ингибирования дифференцировки остеокластов, содержащая эффективное количество указанного штамма и фармацевтически приемлемый носитель. Изобретение обеспечивает восстановление минеральной плотности костей у млекопитающего или ингибирования дифференцировки остеокластов и может эффективно применяться для предупреждения или лечения остеопороза. 2 н. и 2 з.п. ф-лы, 13 ил., 13 табл., 11 пр.

1. Штамм Lactobacillus sakei CVL-001, депонированный под номером доступа KCTC13816BP, для восстановления минеральной плотности костей у млекопитающего или ингибирования дифференцировки остеокластов.

2. Штамм Lactobacillus sakei CVL-001 по п. 1, где штамм включает последовательность 16S рРНК, представленную SEQ ID NO: 1.

3. Фармацевтическая композиция для восстановления минеральной плотности костей у млекопитающего или ингибирования дифференцировки остеокластов, содержащая эффективное количество штамма Lactobacillus sakei CVL-001, депонированного под номером доступа KCTC13816BP, и фармацевтически приемлемый носитель.

4. Фармацевтическая композиция по п. 3, представляющая собой суспензию и содержащая штамм Lactobacillus sakei CVL-001 в концентрации от 5×10⁵ до 5×10¹² КОЕ/мл.