КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ПРЕДОТВРАЩЕНИЯ, УЛУЧШЕНИЯ ТЕЧЕНИЯ ИЛИ ЛЕЧЕНИЯ ОЖИРЕНИЯ ИЛИ ЖИРОВОЙ БОЛЕЗНИ ПЕЧЕНИ, СОДЕРЖАЩАЯ LEUCONOSTOC CITREUM WIKIM0104 Российский патент 2024 года по МПК C12N1/20 A61K35/744 A61P1/16 A61P3/04 

[ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ]

Настоящая заявка испрашивает приоритет на основании корейской патентной заявки №10-2019-0024254, поданной 28 февраля 2019 г., и полное содержание, раскрытое в описании и чертежах соответствующей заявки, включено в настоящую заявку. Настоящее изобретение относится к новому штамму, выделенному из Kimchi, и композиции для предотвращения, улучшения течения или лечения воспаления, ожирения или жировой болезни печени, содержащей указанный штамм.

[УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ]

Жировая болезнь печени представляет собой заболевание, при котором нормальный метаболизм жиров не достигается из-за чрезмерного потребления жиров, увеличения накопления и синтеза в печени и снижения выведения, что приводит к накоплению триглицеридов в гепатоцитах, и когда жир составляет более 5% от общей массы печени, это классифицируется как жировая болезнь печени.

Кроме того, в связи с недавним распространением характерной для западного мира высококалорийной диеты с высоким содержанием жиров, а также отсутствием физических упражнений из-за развития цивилизации, количество пациентов с жировой болезнью печени быстро растет, и возраст также увеличивается с подросткового до 60 и более лет. Когда жир непрерывно накапливается в печени, состояние прогрессирует до жирового гепатита, сопровождающегося воспалением, и может возникнуть цирроз печени вследствие некроза тканей печени и фиброза печени из-за хронического воспаления. При дальнейшем ухудшении симптомов существует возможность развития рака печени. Поэтому жировая болезнь печени является основной причиной гепатита, цирроза и рака печени.

Лекарственные средства, используемые в настоящее время на рынке, включают Xenical™ (Roche), который содержит орлистат в качестве основного ингредиента, и Reductil™ (Abbott), который содержит сибутрамин в качестве основного ингредиента, и тому подобные, однако они демонстрируют побочные эффекты, такие как диарея, боль в животе и бессонница и тому подобное, а также в качестве терапевтического агента для лечения жировой болезни печени в клинической практике применяют лекарственные средства на основе фибрата, представленные клофибратом, и тому подобное, однако сообщалось о побочных эффектах, таких как дисфункция печени.

С другой стороны, хотя различные молочнокислые бактерии в следующем патентном документе 1 демонстрируют эффект улучшения течения жировой болезни печени, существует насущная потребность в разработке терапевтического агента для лечения жировой болезни печени, который имеет основной эффект предотвращения или улучшения течения жировой болезни печени и не проявляет вышеупомянутых побочных эффектов.

Между тем в патентном документе 1 раскрыт эффект улучшения течения жировой болезни печени, демонстрируемый различными молочнокислыми бактериями, такими как Bifidobacterium sp. и Lactobacillus sp. и тому подобное, однако терапевтический агент, который оказывает основное терапевтическое действие на жировую болезнь печени и не проявляет вышеуказанных побочных эффектов, еще не разработан. Поэтому существует насущная потребность в разработке терапевтического средства, способного принципиально лечить жировую болезнь печени и не имеющего побочных эффектов.

(Патентный документ 1) Патентная заявка KR №10-1937365 (2018.08.08.)

[ОПИСАНИЕ]

[ТЕХНИЧЕСКАЯ ПРОБЛЕМА]

Настоящее изобретение относится к новой молочнокислой бактерии Leuconostoc citreum sp. с превосходной эффективностью в отношении предотвращения или улучшения течения жировой болезни печени.

[ТЕХНИЧЕСКОЕ РЕШЕНИЕ]

Соответственно, в результате того, что авторы настоящего изобретения попытались найти штамм молочнокислых бактерий, который демонстрирует эффект предотвращения или улучшения течения жировой болезни печени, в составе традиционных ферментированных пищевых продуктов, они выделили и идентифицировали новый штамм молочнокислых бактерий Weissella sp.[yl], Leuconostoc citreum WiKim0104, придя тем самым к настоящему изобретению.

В одном варианте реализации настоящего изобретения предложена композиция для предотвращения или улучшения течения воспаления, ожирения или жировой болезни печени, содержащая штамм Leuconostoc citreum WiKim0104, его культуру, его лизат или его экстракт в качестве активного ингредиента.

Жировая болезнь печени может представлять собой любое одно или более заболеваний, выбранных из группы, состоящей из простой жировой болезни печени, неалкогольного стеатогепатита, фиброза печени и цирроза печени.

Композиция может представлять собой пищевую композицию, заквасочную композицию молочнокислых бактерий для ферментации пищевых продуктов, композицию корма или кормовой добавки или фармацевтическую композицию.

Указанная пищевая композиция может включать оздоровительный функциональный пищевой продукт, напиток, батончик или ферментированное масло.

В другом варианте реализации настоящего изобретения предлагается применение для предотвращения, улучшения течения или лечения воспаления, ожирения или жировой болезни печени штамма Leuconostoc citreum WiKim0104, его культуры, его лизата или его экстракта.

Жировая болезнь печени может представлять собой любое одно или более заболеваний, выбранных из группы, состоящей из простой жировой болезни печени, неалкогольного стеатогепатита, фиброза печени и цирроза печени.

Предложенный штамм может быть применен в виде пищевой композиции, композиции закваски молочнокислых бактерий для ферментации пищевых продуктов, композиции корма или кормовой добавки или фармацевтической композиции.

В одном варианте реализации настоящего изобретения предложен способ предотвращения, улучшения течения или лечения воспаления, ожирения или жировой болезни печени, включающий введение композиции, содержащей штамм Leuconostoc citreum WiKim 0104, его культуру, его лизат или его экстракт, субъекту, нуждающемуся в этом. Субъект может представлять собой животное, включая человека.

Предложен способ предотвращения, улучшения течения или лечения воспаления, ожирения или жировой болезни печени, в котором жировая болезнь печени включает любое одно или более заболеваний, выбранных из группы, состоящей из простой жировой болезни печени, неалкогольного стеатогепатита, фиброза печени и цирроза печени.

Настоящее изобретение относится к Leuconostoc citreum WiKim0104.

Leuconostoc citreum WiKim0104 согласно настоящему изобретению представляет собой новый штамм Leuconostoc citreum, полученный из Kimchi. Несмотря на то, что Leuconostoc citreum WiKim0104 выделен и идентифицирован из Kimchi согласно настоящему изобретению, способы получения не ограничиваются указанным способом.

Было показано, что штамм молочнокислых бактерий, выделенный в соответствии с примерами в настоящем изобретении, имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1, исходя из секвенирования 16S рДНК для идентификации и классификации микроорганизмов.

Таким образом, микроорганизм согласно настоящему изобретению, который имеет последовательность 16S рДНК SEQ ID NO: 1, назван Leuconostoc citreum WiKim0104 и депонирован в Корейском центре культур микроорганизмов 14 декабря 2018 года (идентификационный номер КССМ12420Р).

Leuconostoc citreum WiKim0104 согласно настоящему изобретению представляет собой грамположительную бактерию и факультативный анаэроб, который может расти как в аэробных, так и в анаэробных условиях, и не образует спор, не обладает подвижностью, а клетки имеют форму бацилл.

В следующих примерах было подтверждено, что штамм Leuconostoc citreum WiKim0104 согласно настоящему изобретению ингибировал экспрессию FAS (синтаза жирных кислот), SCD (ген, связанный с липогенезом), СОХ-2 (циклооксигеназа-2) и NF-K (ген, связанный с воспалением). Это подтвердило, что штамм Leuconostoc citreum WiKim0104 может предотвращать или улучшать течение жировой болезни печени, ингибируя формирование состояния жировой печени примерно на 30-35%. Следовательно, штамм Leuconostoc citreum WiKim0104 согласно настоящему изобретению может быть по-разному применен для профилактики, лечения или улучшения течения жировой болезни печени человека или животного.

Кроме того, как может быть подтверждено в следующих примерах, было подтверждено, что композиция, содержащая Leuconostoc citreum WiKim0104 в качестве активного ингредиента, ингибирует накопление жира в гепатоцитах (клетках HepG2) и воспаление, а также повышает эффективность снижения массы тела и показателей функции печени в крови и снижает экспрессию генов факторов, связанных с метаболизмом жиров, воспалением и фиброзом печени, в ткани печени. Следовательно, композиция может быть применена в качестве активного ингредиента композиции для предотвращения, лечения или улучшения течения воспаления, ожирения или жировой болезни печени, которая представляет собой одно или более из группы, состоящей из простой жировой болезни печени, неалкогольного стеатогепатита, фиброза печени и цирроза печени.

В настоящем изобретении предложена композиция для предотвращения, улучшения течения или лечения воспаления, ожирения или жировой болезни печени, содержащая Leuconostoc citreum WiKim0104, его культуру, его лизат или его экстракт в качестве активного ингредиента.

Leuconostoc citreum WiKim0104, содержащийся в композиции согласно настоящему изобретению, может присутствовать в виде живой клетки или убитой клетки, и он также может присутствовать в высушенной или лиофилизированной форме. Форма и способ получения молочнокислых бактерий, подходящих для включения в различные композиции, хорошо известны специалистам в данной области техники. Например, штамм Leuconostoc citreum WiKim0104 может быть приготовлен в форме культуры, полученной путем культивирования в известной жидкой среде или твердой среде, или ферментированного продукта, полученного путем культивирования штамма и дополнительного компонента вместе, или экстракта, полученного путем экстракции штамма органическим растворителем, или растворенного вещества (или лизата), полученного путем растворения клеточной мембраны штамма, или дробления, или гомогенизирующей обработки, или тому подобного, но не ограничиваясь этим.

В одном конкретном примере композиция может представлять собой композицию, содержащую штамм Leuconostoc citreum WiKim0104, присутствующий в виде живой клетки или убитой клетки.

В настоящем изобретении жировая болезнь печени может включать простую жировую болезнь печени, неалкогольный стеатогепатит, фиброз печени и цирроз печени.

В настоящем изобретении жировая болезнь печени может включать как алкогольную жировую болезнь печени, так и неалкогольную жировую болезнь печени, и, например, может представлять собой неалкогольную жировую болезнь печени, индуцированную диетой с высоким содержанием жиров. Неалкогольная жировая болезнь печени (НАЖБП) может включать как первичную, так и вторичную неалкогольную жировую болезнь печени, и, например, она может представлять собой неалкогольную жировую болезнь печени, возникшую в результате первичной гиперлипидемии, диабета или ожирения.

В одном конкретном примере указанная композиция может представлять собой фармацевтическую композицию для предотвращения или лечения воспаления, ожирения или жировой болезни печени, содержащую культуру, лизат, ферментированный продукт или экстракт штамма Leuconostoc citreum WiKim0104.

Когда композицию согласно настоящему изобретению применяют в качестве фармацевтической композиции, фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению может быть получена с применением фармацевтически подходящего и физиологически приемлемого адъюванта, и в качестве адъюванта, вспомогательного вещества, разрыхляющего агента, подсластителя, связующего агента, покрывающего материала, раздувающего агента, смазывающего агента, глиданта или ароматизатора, или тому подобного.

Указанная фармацевтическая композиция может быть предпочтительно приготовлена для введения в виде фармацевтической композиции путем дополнительного включения одного или более фармацевтически приемлемых носителей наряду с активным ингредиентом, описанным выше.

Например, для приготовления в форме таблетки или капсулы указанный активный ингредиент может быть объединен с подходящим для перорального введения и нетоксичным фармацевтически приемлемым неактивным носителем, таким как этанол, глицерин, вода и тому подобное. Кроме того, при желании или необходимости в смесь также могут быть включены подходящий связующий агент, смазывающий агент, разрыхляющий агент и красящий агент. Подходящий связующий агент включает, но не ограничивается ими, натуральные сахара, такие как крахмал, желатин, глюкоза или бета-лактоза, натуральную и синтетическую камедь, такую как кукурузный подсластитель, гуммиарабик, трагакант или олеат натрия, стеарат натрия, стеарат магния, бензоат натрия, ацетат натрия, хлорид натрия и тому подобное. Разрыхляющий агент включает, но не ограничивается ими, крахмал, метил целлюлозу, агар, бентонит, ксантановую камедь и тому подобное. В композиции, которая должна быть приготовлена в виде жидкого раствора, в качестве приемлемого фармацевтического носителя, который подходит для стерильных и биосовместимых растворов, могут быть применены солевой раствор, стерильная вода, раствор Рингера, буферный солевой раствор, раствор альбумина для инъекций, раствор декстрозы, раствор мальтодекстрина, глицерин, этанол и один или более их смешанных компонентов, и при необходимости могут быть добавлены другие обычные добавки, такие как антиоксидант, буферный раствор, бактериостатический агент и тому подобное. Кроме того, она может быть приготовлена в виде инъекционного состава, такого как водный раствор, суспензия, эмульсия и тому подобное, в виде пилюли, капсулы, гранулы или таблетки путем дополнительного добавления разбавителя, диспергирующего агента, поверхностно-активного вещества, связующего агента и смазывающего агента.

Кроме того, она предпочтительно может быть приготовлена в соответствии с каждым заболеванием или компонентом с применением способа, описанного в Remington 's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA, с применением подходящего способа в соответствующей области техники.

В одном конкретном примере в настоящем изобретении предложена пищевая композиция для предотвращения или улучшения течения воспаления, ожирения или жировой болезни печени, содержащая Leuconostoc citreum WiKim0104, его культуру, его лизат, его ферментированный продукт или его экстракт в качестве активного ингредиента. Указанная пищевая композиция может включать форму оздоровительного функционального пищевого продукта или напитка, батончика или тому подобного.

В настоящем изобретении пищевая композиция, содержащая указанный штамм в качестве активного ингредиента, может включать напиток, такой как ферментированное масло, и тому подобное. Соответственно, в настоящем изобретении предложена закваска молочнокислых бактерий для ферментации, состоящая из Leuconostoc citreum WiKim0104 или его культуры.

Пищевая композиция согласно настоящему изобретению может быть применена в качестве функционального пищевого продукта или добавлена к различным видам пищевых продуктов, приготовленных тем же способом, что и фармацевтическая композиция. Пища, в которую добавлена композиция согласно настоящему изобретению, включает, например, напитки, витаминные комплексы, продукты питания с биологически активными пищевыми добавками и тому подобное.

Пищевая композиция согласно настоящему изобретению может содержать компонент, обычно добавляемый при приготовлении пищи, и, например, она содержит белок, углевод, жир, питательные вещества, приправы и ароматизаторы. Примером углевода, описанного выше, является обычный сахар, такой как моносахариды, например, глюкоза, фруктоза и так далее; дисахариды, например, мальтоза, сахароза, олигосахарид и так далее; и полисахариды, например, декстрин, циклодекстрин и так далее, и сахарный спирт, такой как ксилит, сорбит, эритрит и тому подобное. В качестве ароматизатора может быть использован натуральный ароматизатор [тауматин, экстракт стевии (например, ребаудиозид А, глицирризин и так далее)] и синтетический ароматизатор (сахарин, аспартам и так далее). Например, когда пищевую композицию согласно настоящему изобретению готовят в виде продуктов для питья и напитков, она может дополнительно содержать лимонную кислоту, жидкую фруктозу, сахар, глюкозу, уксусную кислоту, яблочную кислоту, фруктовый сок и различные виды растительных экстрактов и тому подобное.

Композиция согласно настоящему изобретению может быть использована в качестве кормовой добавки или корма.

При использовании в качестве кормовой добавки указанная композиция может быть приготовлена в виде сильного (20-90%) концентрата или в форме порошка или гранул. Указанная кормовая добавка может дополнительно содержать любую или одну или более из органических кислот, таких как лимонная кислота, фумаровая кислота, адипиновая кислота, молочная кислота, яблочная кислота и так далее, или фосфатов, таких как фосфат натрия, фосфат калия, кислый пирофосфат, полифосфат и так далее, или природных антиоксидантов, таких как полифенол, катехин, альфа-токоферол, экстракт розмарина, витамин С, экстракт зеленого чая, экстракт лакрицы, хитозан, дубильная кислота, фитиновая кислота и так далее. При использовании в качестве корма указанная композиция может быть приготовлена в виде обычной кормовой формы и может содержать обычный кормовой компонент.

Кормовая добавка и корм могут дополнительно содержать зерна, например, молотую или дробленую пшеницу, овес, ячмень, кукурузу и рис; корма с растительным белком, например, корма, содержащие рапс, фасоль и подсолнечник в качестве основного компонента; корма с животным белком, например, кровяную муку, мясную муку, костную муку и рыбную муку; сахара и молочные продукты, например, высушенные компоненты, состоящие из различных видов сухого молока и порошка сыворотки, и тому подобное, и, кроме того, могут дополнительно содержать пищевую добавку, усилитель пищеварения и всасывания, стимулятор роста и тому подобное.

Указанная кормовая добавка может быть введена животному отдельно или путем объединения с другими кормовыми добавками из числа съедобных носителей. Кроме того, указанная кормовая добавка может быть легко введена животному в виде подкормки, или путем непосредственного смешивания с кормом для животных, или в виде состава для перорального применения отдельно от корма. Когда указанную кормовую добавку вводят отдельно в корм для животных путем объединения с фармацевтически приемлемым съедобным носителем, хорошо известным в соответствующей области техники, она может быть приготовлена в виде состава с немедленным или замедленным высвобождением. Указанный съедобный носитель может быть твердым или жидким, например, он может представлять собой кукурузный крахмал, лактозу, сахарозу, бобовые хлопья, арахисовое масло, оливковое масло, кунжутное масло и пропиленгликоль. Когда применяют твердый носитель, указанная кормовая добавка может представлять собой таблетку, капсулу, порошок, троше или пастилку или подкормку в тонкодиспергируемой форме. Когда применяют жидкий носитель, указанная кормовая добавка может иметь форму мягкой желатиновой капсулы, или сиропа, или суспензии, эмульсии или раствора.

Кроме того, кормовая добавка и корм могут содержать адъювант, например, консервант, стабилизирующий агент, смачивающий агент или эмульгатор, ускоритель растворения или тому подобное. Указанная кормовая добавка может быть применена путем погружения, распыления или смешивания для добавления к корму для животных.

Корм или кормовая добавка согласно настоящему изобретению могут быть применены со многими рационами животных, включая рационы млекопитающих, домашней птицы и рыбы.

В настоящем изобретении животное включает млекопитающих, и настоящее изобретение может быть применено для млекопитающих, не только для свиньи, коровы, овцы, козы, экспериментального грызуна, но также и для экспериментального грызуна, домашнего животного (например, собаки, кошки) и тому подобного, и может быть применено для домашней птицы, курицы, индейки, утки, гуся, фазана и перепела и тому подобного, и может быть применено для рыбы, форели и тому подобного, но не ограничивается перечисленным.

Количество штамма Leuconostoc citreum WiKim0104, содержащегося в композиции согласно настоящему изобретению, может составлять от примерно 10⁶ до 10¹² КОЕ/г в расчете на 1 прием, и, например, может составлять от 10⁷ до 10¹¹ КОЕ/г, от 10⁸ до 10¹⁰ КОЕ/г. При введении штамма предпочтительно вводить его в виде живой клетки, и перед приемом он может быть введен в виде убитой или ослабленной формы. Кроме того, при получении с применением супернатанта культуры и тому подобного может быть дополнительно осуществлен процесс стерилизации посредством термической обработки. Количество штамма и суточный уровень потребления, необходимый для достижения минимального эффекта, могут варьироваться в зависимости от состояния организма или здоровья принимающего, но, как правило, могут составлять от примерно 10⁶ до 10¹² КОЕ/г, например, от 10⁷ до 10¹¹ КОЕ/г, от 10⁸ до 10¹⁰ КОЕ/г.

Другой вариант реализации настоящего изобретения может быть предложен в качестве применения штамма Leuconostoc citreum WiKim0104 для предотвращения, лечения или улучшения течения воспаления, ожирения или жировой болезни печени человека или животного.

В другом варианте реализации настоящего изобретения предложено применение штамма Leuconostoc citreum WiKim0104, его культуры, его лизата или его экстракта для предотвращения, улучшения течения или лечения воспаления, ожирения или жировой болезни печени.

В другом варианте реализации настоящего изобретения предложены штамм Leuconostoc citreum WiKim0104, его культура, его лизат или его экстракт для предотвращения, улучшения течения или лечения воспаления, ожирения или жировой болезни печени.

В одном варианте реализации настоящего изобретения предложен способ предотвращения, улучшения течения или лечения воспаления, ожирения или жировой болезни печени, включающий введение композиции, содержащей штамм Leuconostoc citreum WiKim0104, его культуру, его лизат или его экстракт, субъекту, нуждающемуся в этом. Субъект представляет собой животное, включая человека, и пример животного может быть включен в объем настоящего изобретения при условии, что вышеупомянутые животные потребляют корм. Жировая болезнь печени может включать любое одно или более заболеваний из группы, состоящей из простой жировой болезни печени, неалкогольного стеатогепатита, фиброза печени и цирроза печени.

Преимущества и признаки настоящего изобретения и способы их достижения станут очевидны из примеров, подробно описанных ниже. Однако настоящее изобретение не ограничивается примерами, раскрытыми ниже, но будет реализовано в различных формах, и примеры представлены исключительно для того, чтобы сделать описание настоящего изобретения полным и полностью проинформировать специалистов в области техники, к которой относится настоящее изобретение, объем изобретения и настоящее изобретение определяются исключительно объемом формулы изобретения.

[ПОЛЕЗНЫЕ ЭФФЕКТЫ]

Штамм Leuconostoc citreum WiKim0104 согласно настоящему изобретению представляет собой молочнокислую бактерию, выделенную из Kimchi, и демонстрирует ингибирующее действие на развитие жировой болезни печени путем ингибирования накопления внутриклеточного жира и снижения экспрессии генов, связанных с жировой болезнью печени, и, следовательно, он может по-разному применяться для предотвращения, улучшения течения и лечения воспаления, ожирения или жировой болезни печени. Кроме того, он может быть эффективно применен в качестве закваски.

[КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ]

Фиг. 1 представляет собой график определения уровня экспрессии в клетках HepG2 в зависимости от обработки штаммом WiKim0104 согласно настоящему изобретению. L-LAB1 представляет собой Leu. citreum WiKim0104, a L-LAB2 представляет собой Leu. Mesenteroides, а также L-LAB3 и L-LAB4 представляют собой выделенные в лаборатории штаммы Leu. citreum №2, №3, соответственно.

Фиг. 2а - 2с представляют собой графики, демонстрирующие массу тела и значения показателей функции печени (GPT, GOT) в крови в модели жировой болезни печени у мышей в зависимости от получения штамма WiKim0104 согласно настоящему изобретению. *Р<0,05, по сравнению с ND; #Р<0,05, по сравнению с HFD. L-LAB1 представляет собой Leu. citreum WiKim0104.

Фиг. 3а - 3с представляют собой графики определения уровня экспрессии генов, связанных с тканями печени, в модели жировой болезни печени у мышей в зависимости от получения штамма WiKim0104 согласно настоящему изобретению. *Р<0,05, по сравнению с ND; #Р<0,05, по сравнению с HFD. L-LAB1 представляет собой Leu. citreum WiKim0104.

На фиг. 4 показана SEQ ID NO: 1 согласно настоящей заявке.

[ОСУЩЕСТВЛЕНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ]

Далее настоящее изобретение будет подробно описано с помощью примеров. Следующие примеры предназначены исключительно для иллюстрации настоящего изобретения, но объем настоящего изобретения не ограничивается следующими примерами.

Пример 1: Идентификация Leuconostoc citreum WiKim0104

Одиночную бактериальную колонию, полученную путем нанесения неразбавленного раствора экстракта Kimchi на среду MRS, собирали с помощью петли и культивировали в бульоне MRS. Экстракцию ДНК проводили с использованием QIAamp DNA Mini Kit (QIAgen, Германия). Экстрагирование ДНК подтверждали с использованием 1% агарозного геля, и для амплификации гена 16S рДНК проводили полимеразную цепную реакцию (ПЦР) с использованием экстрагированной геномной ДНК в качестве матрицы, и выполняли 30 циклов в условиях ПЦР, включающих денатурацию при 95°С в течение 1 минуты, отжиг при 45°С в течение 1 минуты и элонгацию при 72°С в течение 1 минуты и 30 секунд. Для полученных продуктов ПЦР последовательность анализировали путем запроса в Macrogen (Сеул, Корея). Идентификацию бактерий проводили с помощью индуктивного анализа поисковой системы Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) Национального центра биотехнологической информации (NCBI, www.ncbi.nlm.nih.gov) для последовательности 16S рДНК.

Было показано, что штамм, выделенный в соответствии с примером настоящего изобретения, имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1, исходя из анализа последовательности 16S рДНК для идентификации микроорганизмов.

Соответственно, микроорганизм согласно настоящему изобретению был назван Leuconostoc citreum WiKim0104 и депонирован в Корейском центре культур микроорганизмов 14 декабря 2018 года (КССМ12420Р).

Пример 2: Подтверждение эффективности ингибирования накопления жира и воспаления в гепатоцитах (клетках HepG2) штаммом Leuconostoc citreum WiKim0104

Экспериментальный метод in vitro был разработан с использованием системы Transwell для имитации оси кишечник-печень организма человека.

Молочнокислую бактерию Leuconostoc citreum WiKim0104 культивировали в среде MRS при 30°С в течение 24 часов. В конце культивирования для выделения микробных клеток культуру подготавливали путем центрифугирования при 6000 об/мин в течение 5 минут и промывания ФСБ для удаления всех оставшихся компонентов среды.

Для культивирования энтероцитов (клетки НТ-29) и гепатоцитов (клетки HepG2) использовали среду RPMI-1640, в которую добавляли пенициллин/стрептомицин и 10% фетальной бычьей сыворотки, и совместную культуру получали с использованием 6-луночного планшета системы Transwell. Перед совместным культивированием энтероциты разделяли на аликвоты в мембране Transwell, а гепатоциты разделяли на аликвоты в 6-луночном планшете, и их подготавливали путем культивирования в условиях 37°С, 5% СО₂, соответственно.

Когда энтероциты (клетки НТ-29) и гепатоциты (клетки HepG2) вырастали примерно на 80% в культуральной чашке, культуральный раствор заменяли средой без ФБС и культивировали в течение 16 часов. После культивирования полученные молочнокислые бактерии в количестве 1Х10⁷ КОЕ переносили к энтероцитам, а совместное культивирование молочнокислых бактерий и энтероцитов с гепатоцитами проводили путем сборки системы Transwell, и продукцию жира в гепатоцитах индуцировали обработкой 0,1 мМ пальмитиновой кислоты в течение 48 часов. После культивирования с 0,1 мМ пальмитиновой кислоты продолжительностью 48 часов для выяснения уровня экспрессии генов, связанных с метаболизмом жиров и воспалением, в гепатоцитах в зависимости от обработки штаммом Leuconostoc citreum WiKim0104 проводили количественную полимеразную цепную реакцию (кПЦР) в реальном времени. В результате, как показано на фиг. 1, можно было подтвердить, что экспрессия генов синтазы жирных кислот (FAS) и фермента биосинтеза ненасыщенных жирных кислот (стеароил-КоА-десатураза, SCD), а также факторов, связанных с воспалением, СОХ-2 (циклооксигеназа-2) и NF-κВ (ядерный фактор каппа-В), была значительно снижена в гепатоцитах (клетки HepG2), которые культивировали с 0,1 мМ пальмитиновой кислоты совместно с Leuconostoc citreum WiKim0104, по сравнению с гепатоцитами (контроль), которые обрабатывали 0,1 мМ пальмитиновой кислоты.

Пример 3: Подтверждение эффективности снижения массы тела и улучшения показателей функции печени в крови

Пятинедельных самцов мышей (C57BL/6J) адаптировали к кормовой диете (CD; Пурина, Корея) в среде помещения для разведения в условиях температуры 20±2°С, влажности 50±5% и свето-темнового цикла, составляющего 12 часов, в течение 1 недели. Экспериментальные животные получали нормальную диету (D12450B, Research Diets, Нью-Брансуик, Нью-Джерси) или диету с высоким содержанием жиров (D12451, Research Diets, Нью-Брансуик, Нью-Джерси), в которой 45% от общего количества калорий составляли жиры, и были адаптированы к указанной диете в течение 1 недели, после чего был проведен эксперимент. Экспериментальные группы состояли в общей сложности из 3 групп, которые представляли собой группу приема нормальной диеты (ND), группу приема диеты с высоким содержанием жиров (HFD), группу приема, получавшую ежедневное пероральное введение Leuconostoc citreum WiKim0104 в концентрации 2×10⁹ КОЕ/200 мкл совместно с диетой с высоким содержанием жиров (HFD+L-LAB1), и жировую болезнь печени индуцировали посредством диеты в течение 20 недель. Группе приема нормальной диеты (ND) и группе приема диеты с высоким содержанием жиров (HFD) перорально вводили равное количество фосфатно-солевого буфера (ФСБ) ежедневно. Через 20 недель после проведения эксперимента измеряли массу тела в каждой экспериментальной группе. Кроме того, для определения показателей функции печени (GOT в сыворотке, GPT в сыворотке) в крови экспериментальных групп животные не получали пищи в течение 16 часов до окончания эксперимента, кровь собирали из полой вены брюшной полости, сыворотку отделяли и использовали в эксперименте.

GOT и GPT в крови определяли с помощью автоматического биохимического измерительного устройства (FUJI DRI-CHEM 7000i, Fujifilm, Токио, Япония), и на фиг. 2а - фиг. 2с ГЛУТАМАТ-ОКСАЛОАЦЕТАТ-ТРАНСАМИНАЗА (GOT) и ГЛУТАМАТ-ПИРУВАТ-ТРАНСАМИНАЗА (GPT) в крови показаны в виде графиков.

В результате, как показано на фиг. 2а - фиг. 2с, можно было подтвердить, что значения массы тела и показателей функции печени в крови были значительно снижены, когда диета с высоким содержанием жиров и Leuconostoc citreum WiKim0104 были получены совместно (HFD+L-LAB1), по сравнению с таковыми у мышей, получавших диету с высоким содержанием жиров (HFD).

Пример 4: Подтверждение уровня экспрессии генов, связанных с метаболизмом жиров, воспалением и фиброзом печени, в ткани печени

Для выяснения уровня экспрессии генов, связанных с метаболизмом жиров, воспалением и фиброзом печени, в ткани печени в зависимости от приема штамма Leuconostoc citreum WiKim0104 проводили кПЦР (количественную цепную полимеразную реакцию в реальном времени) с использованием ткани печени, выделенной после окончания эксперимента.

В результате, как показано на фиг. 3а - фиг. 3с, можно было подтвердить, что экспрессия генов фактора, связанного с метаболизмом жиров, CD36 (кластер дифференцировки 36), фактора, связанного с воспалением, NF-κВ (ядерный фактор каппа-В), и фактора, связанного с фиброзом печени, Collal (коллаген типа I альфа 1), была снижена в соответствии с приемом штамма Leuconostoc citreum WiKim0104.

[ПРОМЫШЛЕННАЯ ПРИМЕНИМОСТЬ]

В настоящем изобретении предложен новый штамм. Кроме того, штамм согласно настоящему изобретению может быть применен в качестве пищевого продукта, корма или кормовой добавки, фармацевтической композиции для предотвращения, улучшения течения или лечения воспаления, ожирения или жировой болезни печени или тому подобного.

[Идентификационный номер]

Наименование органа по депонированию: Корейский центр культур микроорганизмов (за рубежом)

Идентификационный номер: КССМ12420Р

Дата регистрации: 2018.12.14.

--->

Перечень последовательностей

<110> Korea Food Research Institute

<120> Композиция для предотвращения, улучшения течения или лечения

ожирения или жировой болезни печени, содержащая Leuconostoc

citreum WiKim0104

<130> PCT20-008

<160> 1

<170> KoPatentIn 3.0

<210> 1

<211> 1430

<212> ДНК

<213> Неизвестно

<220>

<223> Leuconostoc citreum WiKim0104

<400> 1

gatgaacgct ggcggcgtgc ctaatacatg caagtcgaac gcgcagcgag aggtgcttgc

60

acctttcaag cgagtggcga acgggtgagt aacacgtgga taacctgcct caaggctggg

120

gataacattt ggaaacagat gctaataccg aataaaactt agtatcgcat gatatcaagt

180

taaaaggcgc tacggcgtca cctagagatg gatccgcggt gcattagtta gttggtgggg

240

taaaggctta ccaagacgat gatgcatagc cgagttgaga gactgatcgg ccacattggg

300

actgagacac ggcccaaact cctacgggag gctgcagtag ggaatcttcc acaatgggcg

360

caagcctgat ggagcaacgc cgcgtgtgtg atgaaggctt tcgggtcgta aagcactgtt

420

gtatgggaag aaatgctaaa atagggaatg attttagttt gacggtacca taccagaaag

480

ggacggctaa atacgtgcca gcagccgcgg taatacgtat gtcccgagcg ttatccggat

540

ttattgggcg taaagcgagc gcagacggtt gattaagtct gatgtgaaag cccggagctc

600

aactccggaa tggcattgga aactggttaa cttgagtgtt gtagaggtaa gtggaactcc

660

atgtgtagcg gtggaatgcg tagatatatg gaagaacacc agtggcgaag gcggcttact

720

ggacaacaac tgacgttgag gctcgaaagt gtgggtagca aacaggatta gataccctgg

780

tagtccacac cgtaaacgat gaatactagg tgttaggagg tttccgcctc ttagtgccga

840

agctaacgca ttaagtattc cgcctgggga gtacgaccgc aaggttgaaa ctcaaaggaa

900

ttgacgggga cccgcacaag cggtggagca tgtggtttaa ttcgaagcaa cgcgaagaac

960

cttaccaggt cttgacatcc tttgaagctt ttagagatag aagtgttctc ttcggagaca

1020

aagtgacagg tggtgcatgg tcgtcgtcag ctcgtgtcgt gagatgttgg gttaagtccc

1080

gcaacgagcg caacccttat tgttagttgc cagcattcag ttgggcactc tagcgagact

1140

gccggtgaca aaccggagga aggcggggac gacgtcagat catcatgccc cttatgacct

1200

gggctacaca cgtgctacaa tggcgtatac aacgagttgc caacctgcga aggtgagcta

1260

atctcttaaa gtacgtctca gttcggactg cagtctgcaa ctcgactgca cgaagtcgga

1320

atcgctagta atcgcggatc agcacgccgc ggtgaatacg ttcccgggtc ttgtacacac

1380

cgcccgtcac accatgggag tttgtaatgc ccaaagccgg tggcctaacc

1430

<---

Изобретение относится к штамму Leuconostoc citreum WiKim0104 и его применению. Предложен штамм Leuconostoc citreum WiKim0104 с идентификационным номером KCCM12420P, предназначенный для предотвращения, облегчения течения или лечения заболевания, связанного с накоплением жира в гепатоцитах, выбранного из воспаления, ожирения или жировой болезни печени. Также предложено применение указанного штамма или его культуры для предотвращения, облегчения течения или лечения заболевания, связанного с накоплением жира в гепатоцитах, выбранного из воспаления, ожирения или жировой болезни печени. Также предложены композиция, содержащая указанный штамм или его культуру, и способ предотвращения, облегчения течения или лечения заболевания, связанного с накоплением жира в гепатоцитах, выбранного из воспаления, ожирения или жировой болезни печени, включающий введение указанной композиции субъекту, нуждающемуся в этом. Изобретение обеспечивает ингибирующее действие в отношении развития жировой болезни печени путем ингибирования накопления жира в клетках печени и снижения экспрессии генов, связанных с жировой болезнью печени. 4 н. и 8 з.п. ф-лы, 4 ил., 4 пр.

1. Штамм Leuconostoc citreum WiKim0104 с идентификационным номером KCCM12420P для предотвращения, облегчения течения или лечения заболевания, связанного с накоплением жира в гепатоцитах, выбранного из воспаления, ожирения или жировой болезни печени.

2. Композиция для предотвращения или облегчения течения заболевания, связанного с накоплением жира в гепатоцитах, выбранного из воспаления, ожирения или жировой болезни печени, содержащая эффективное количество штамма Leuconostoc citreum WiKim0104 с идентификационным номером KCCM12420P или его культуру в качестве активного ингредиента и один или более фармацевтически приемлемых носителей.

3. Композиция по п. 2, где жировая болезнь печени включает любое одно или более заболеваний, выбранных из группы, состоящей из простой жировой болезни печени, неалкогольного стеатогепатита, фиброза печени и цирроза печени.

4. Композиция по п. 2, где указанная композиция представляет собой пищевую композицию, композицию закваски молочнокислых бактерий для ферментации пищевых продуктов, композицию корма или кормовой добавки или фармацевтическую композицию.

5. Композиция по п. 4, где пищевая композиция представляет собой оздоровительный функциональный пищевой продукт, напиток, батончик или ферментированное масло.

6. Применение штамма Leuconostoc citreum WiKim0104 с идентификационным номером KCCM12420P или его культуры для предотвращения, облегчения течения или лечения заболевания, связанного с накоплением жира в гепатоцитах, выбранного из воспаления, ожирения или жировой болезни печени.

7. Применение по п. 6, где жировая болезнь печени включает любое одно или более заболеваний, выбранных из группы, состоящей из простой жировой болезни печени, неалкогольного стеатогепатита, фиброза печени и цирроза печени.

8. Применение по п. 6, осуществляемое в виде применения пищевой композиции, композиции закваски молочнокислых бактерий для ферментации пищевых продуктов, композиции корма или кормовой добавки или фармацевтической композиции.

9. Применение по п. 8, где пищевая композиция представляет собой оздоровительный функциональный пищевой продукт, напиток, батончик или ферментированное масло.

10. Способ предотвращения, облегчения течения или лечения заболевания, связанного с накоплением жира в гепатоцитах, выбранного из воспаления, ожирения или жировой болезни печени, включающий введение композиции, содержащей штамм Leuconostoc citreum WiKim0104 с идентификационным номером KCCM12420P или его культуру, субъекту, нуждающемуся в этом.

11. Способ по п. 10, где субъект представляет собой животное, включая человека.

12. Способ по п. 10, где жировая болезнь печени включает любое одно или более заболеваний, выбранных из группы, состоящей из простой жировой болезни печени, неалкогольного стеатогепатита, фиброза печени и цирроза печени.