СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ЛИМФОТРОПИНА ИЗ ПРОМЫШЛЕННОГО КРАСИТЕЛЯ "ДИСУЛЬФИНОВЫЙ ГОЛУБОЙ" Российский патент 2022 года по МПК A61K49/00 C09B67/54 

Изобретение относится к области органической и медицинской химии, молекулярной биологии, а именно к способу очистки от примесей дисульфопроизводного диаминотрифенилметанового красителя для последующего его использования в качестве контрастного агента при выявлении регионарного лимфогенного метастазирования злокачественных новообразований при опухолях различной локализации и визуализации лимфатических узлов.

Применение цветной лимфографии позволяет существенно снизить травматичность операций при злокачественных новообразованиях различных органов, поскольку при помощи этого метода происходит визуализация лимфатических узлов - вероятных коллекторов опухолевых клеток, что значительно повышает прецизионность хирургических манипуляций. Поэтому требования к красителям, используемым для цветной лимфографии, постоянно растут, и поиск новых красителей для цветной лимфографии является актуальной задачей.

Ранее для определения сторожевых лимфатических узлов использовалась композиция на основе трифенилметанового красителя - натриевой соли 4-{[(4-диэтиламино)фенил][4-(диэтилимино)-циклогекса-2,5диен-1-илиден]-метил}бензо-1,4-дисульфоната в фосфатном буфере. Данная композиция известна под торговым названием «Лимфазурин», производится только в США.

Установлено, что изомер трифенилметанового красителя «Лимфазурина» динатриевая соль 4-{[(4-диэтиламино) фенил] [4-(диэтилимино)-циклогекса-2,5диен-1-илиден]-метил}бензо-1,3-дисульфоната, известный под торговым названием «Дисульфиновый голубой» обладает значительно большей лимфотропностью чем «Лимфазурин», однако выход его является незначительным и сопровождается большим количеством побочных продуктов.

Известен способ получения синего красителя «Дисульфиновый голубой» (cas 129-17-9) (А.с. СССР №50850), который получали из толуола путем сульфирования в среде олеума до толуол-2,4-дисульфокислоты с последующим окислением метальной группы в бензальдегидную. Образующийся бензальдегид-2,4-дисульфокислота в кислой среде конденсировали с диэтиланилином до соответствующего триарилкарбинольного соединения, которое при окислении в кислой среде высаливалось с помощью хлорида натрия в виде соответствующей натриевой соли 4-{[(4-ди-этиламино)фенил][4-(диэтилимино)-циклогекса-2,5диен-1-или-ден]-метил}бензо-1,3-дисульфоната.

Недостатком данного способа является длительность получения конечного продукта (более 70 часов), поскольку конденсация бензальдегид-2,4-дисульфокислоты с диэтиланилином осуществляется при кипячении в кислой среде в течение 48 часов с относительно небольшим выходом конечного продукта (около 20%, считая на исходные реагенты), а также большое количество побочных продуктов реакции, затрудняющих очистку целевого продукта.

Известен способ получения триарилметановых красителей (А.с. 219725), которые получают из толуол-2,4-дисульфокислоты путем взаимодействия с диэтиланилином с образованием соответствующего триарилкарбинольного соединения с выходом 85% в присутствии гексахлорциклофосфазотриена.

Однако используемый в качестве реакционной среды гексахлорцикло-фосфазотриен получается с выходом не более 50%, и является неустойчивым соединением, что обусловливает низкую технологичность представленного способа.

Известно получение триарилкарбинола (US 2726252 А), в котором конденсацию диэтиланилина и динатриевой соли бензальдегид-2,4-дисульфокислоты, полученной традиционным способом из толуол-2,4-дисульфокислоты, проводят в кипящей ледяной уксусной кислоте в присутствии эквимолярного количества карбамида.

Недостатком данного способа является длительная процедура конденсации исходного дисульфобензальдегида и диэтиланилина и низкий общий выход продукта конденсации (20%), который сопоставим с таковым, получаемым при способе, описанном в А.с. СССР №50850.

Известен способ получения синего изосульфана (US 20120078007 А1), представляющего собой композицию (американский препарат «Lymphazurin»), состоящую из синего красителя - натриевой соли 4-{[(4-диэтиламино)фенил] [4-(диэтилимино)-циклогекса-2,5диен-1-илиден]-метил}бензо-1,4-дисульфоната в фосфатном буфере (флакон, содержащий 5 мл раствора препарата с концентрацией активного вещества 1 мг/мл, $600).

Однако выход при синтезе конечного продукта - натриевой соли 4-{[(4-диэтиламино)фенил][4-(диэтилимино)-циклогекса-2,5диен-1-илиден]-метил}-бензо-1,4-дисульфоната низкий и составляет всего 8,5% в пересчете от исходного 2-хлор-бензальдегида, что является основной причиной высокой стоимости препарата «Lymphazurin». В экспериментах на животных препарат «Lymphazurin» обладает выраженными лимфотропными свойствами и эффективно прокрашивает лимфатические сосуды и лимфатические узлы в зоне регионарного лимфооттока по отношению к месту введения препарата. В США и других странах, в которых препарат разрешен для клинического применения, препарат «Lymphazurin» эффективно используется для интраоперационной визуализиции сторожевых лимфатических узлов методом непрямой цветной лимфографии у больных злокачественными новообразованиями. Данная процедура выполняется для идентификации и последующего исследования состояния регионарных лимфатических узлов первого уровня лимфооттока с целью уточнения стадии заболевания и индивидуально обоснованного выбора тактики дальнейшего лечения.

В настоящее время препарат «Lymphazurin» и его аналоги не производятся и не зарегистрированы в качестве лекарственных средств в Российской Федерации.

Известна фармацевтическая композиция для интраоперационной визуализации лимфатических узлов методом непрямой цветной лимфографии (RU 2687092 С2), содержащая в качестве лимфотропного красителя смесь синего трифенилметанового красителя - динатриевой соли 4-{[(4-диэтиламино)фенил][4-(диэтилимино)-циклогекса-2,5-диен-1-илиден]-метил}бензо-1,3-дисульфоната, дигидрофосфата натрия и дигидрофосфата калия при следующем соотношении указанных компонентов в мг на 1 мл: 5,0-20,0:6,6:2,7.

Однако основным препятствием для использования вышеназванного красителя как соединения для цветной лимфографии является наличие в нем значительного количества примесей неизвестной природы, присутствие которых не гарантирует безопасного применения препарата на основе этого красителя.

Самым близким (прототип) является способ очистки дисульфопроизводного диаминотрифенилметанового красителя (RU 2654862 С1), согласно которому сульфопроизводные трифенилметановых красителей можно выделять из растворов с помощью объемной полимерной матрицы из полидиметилсилоксана.

Однако у данного способа имеются существенные недостатки:

- время сорбции модельного соединения сульфопроизводного трифенилметановых красителей составляет от 12 до 24 часов, причем авторы не указывают время десорбции, которое должно быть не меньше времени сорбции выше названного соединения.

Следовательно, процесс очистки модельного соединения, с учетом времени сорбции и десорбции, будет составлять от 24 до 48 часов, то есть соответствовать времени очистки для классической колоночной хроматографии.

- десорбция сульфопроизводного трифенилметанового красителя осуществляется водными растворами хлоридов щелочных металлов. Авторы не указывают ни способа отделения неорганической части элюента от чистого сульфопроизводного трифенилметанового красителя, ни времени, затраченного на отделение красителя от неорганических солей. Следовательно, не указан еще один важный параметр процесса очистки красителя;

- используются практически идеальные условия с участием чистых красителей и не исследуется промышленный краситель, который поступает в продажу на рынок, и в котором, как правило, содержится значительное количество примесей.

Таким образом, в известном способе имеются значительные технические затруднения по отделению сульфопроизводных трифенилметанового красителя от неорганических солей, которые имеют значительные временные рамки и делают предлагаемый способ выделения красителя сопоставимым с обычной колоночной хроматографией.

В связи с практически полным отсутствием в РФ производства трифенилметановых красителей, остро встал вопрос о поиске иного способа получения лимфотропного красителя, пригодного для медицинского применения.

Техническим решением является разработка способа выделения динатриевой соли 4-[бис[4-(диэтиламино)](2,4-дисульфофенил]метилен]-N,N-диэтил-2,5-циклогексадиен-1-иминиума (Лимфотропина) из промышленного красителя «Дисульфиновый голубой», аналогичного по лимфотропным свойствам препарату «Lymphazurin».

Техническое решение достигается тем, что к раствору органической части промышленного красителя «Дисульфиновый голубой» в полярном растворителе добавляют силикагель из расчета одна весовая часть красителя на три весовых части силикагеля, полученную суспензию упаривают досуха, а полученный силикагель с нанесенным на него красителем помещают в колонку с загруженным силикагелем из расчета: одна часть силикагеля на одну часть выше названного красителя, далее подают элюент в виде смеси этилацетата/спирта и осуществляют контроль за выделяемой динатриевой солью 4-[бис[4-(диэтиламино)](2,4-дисульфофенил]метилен]-N,N-диэтил-2,5-циклогекса-диен-1-иминиума (лифотропин) с помощью тонкослойной хроматографии (ТСХ).

Способ осуществляют следующим образом.

Весовое количество промышленного красителя диспергируют в полярном растворителе в течение 30-40 минут, а затем отфильтровывают нерастворимую часть. Согласно исследованиям, нерастворимым осадком является хлорид натрия, который используется в традиционной технологии получения «Дисульфинового голубого» для выделения красителя из реакционной массы. Растворимую часть в полярном растворителе упаривают в вакууме, а затем разделяют на хроматографической колонке. В результате получают чистую динатриевую соль 4-[бис[4-(диэтиламино)](2,4-дисульфофенил]метилен]-N,N-диэтил-2,5-циклогекса-диен-1-иминиума. Данное соединение при анализе в масс-спектрометре высокого разрешения дает молекулярный пик 546-545 ед, который соответствует выше названному трифенилметановому красителю.

С помощью тонкослойной хроматографии удалось не только отделить основное вещество - динатриевую соль 4-[бис[4-(диэтиламино)](2,4-дисульфофенил]метилен]-N,N-диэтил-2,5-циклогекса-диен-1-иминиума (лимфотропин) от примеси соединений, но и отработать оригинальную технологию его выделения в количестве, достаточном для медико-биологических и доклинических исследований, а также пригодную для дальнейшего масштабирования.

Данное исследование позволило установить, что промышленный синий краситель «Дисульфиновый голубой», поставляемый в РФ компанией «Merck», получают по традиционной технологии, описанной в монографии (Венкатараман «Органические Красители»). Примеси, характеристики которых мы привели выше, необходимо удалить в ходе получения композиции, используемой в цветной лимфографии.

В связи с доступностью промышленного синего красителя «Дисульфиновый голубой», задача по разработке технологии отделения вышеназванных примесей от основного вещества является актуальной и востребованной для получения пригодного для медицины красителя, особенно необходимого при операциях по удалению злокачественных опухолей.

На основании вышеизложенного, для выделения динатриевой соли 4-[бис[4-(диэтиламино)](2,4-дисульфофенил]метилен]-N,N-диэтил-2,5-циклогекса-диен-1-имини-ума (лимфотропина), основное внимание было обращено на совершенствование очистки вышеназванного соединения с помощью колоночной хроматографии.

Первоначально мы использовали традиционный подход к разделению органической смеси красителя «Дисульфиновый голубой». Однако колоночная хроматография оказалась довольно медленной и мало отличалась по времени от прототипа.

В процессе отработки метода выделения динатриевой соли 4-[бис[4-(диэтиламино)](2,4-дисульфофенил]метилен]-N,N-диэтил-2,5-циклогекса-диен-1-иминиума мы разработали процесс, существенно ускоряющий очистку вышеназванного вещества с использованием колоночной хроматографии.

Процесс состоит из следующих последовательных операций.

К раствору органической части промышленного красителя «Дисульфиновый голубой» в полярном растворителе добавляют силикагель из расчета одна весовая часть красителя на три весовых части силикагеля. Далее суспензию упаривают досуха, а полученный силикагель с нанесенным на него красителем помещают в колонку, в которую предварительно уже загружен силикагель из расчета одна часть силикагеля на одну часть красителя «Дисульфиновый голубой». Далее подают элюент - смесь этилацетата/спирта, а контроль за выделяемыми веществами осуществляют с помощью TCX.

Благодаря вышеописанному приему, который не является очевидным, время выделения динатриевой соли 4-[бис[4-(диэтиламино)](2,4-дисульфофенил]метилен]-N,N-диэтил-2,5-циклогекса-диен-1-иминиума сократилось с 12-48 часов до приемлемых 3,5-4,0 часов, что не зависело от загрузки колонки и ее диаметра. Выделенный лимфотропин является хроматографически чистым и может быть использован для приготовления диагностического препарата для цветной лимфографии.

Пример выполнения способа.

К 20 г образца промышленного красителя «Дисульфиновый голубой»добавляют 100 мл метанола, перемешивают, фильтруют. Время фильтрации смеси 1,5-2 мин. К органическому раствору темно-синего цвета добавляют 60 г силикагеля и упаривают суспензию на роторном испарителе до сухого остатка. Полученный синий порошок силикагеля и красителя помещают в колонку диаметром 50 мм с предварительно подготовленным слоем силикагеля (20 г). Через колонку пропускают элюент: смесь этилацетата и этанола, контроль за выходом лимфотропина контролируют с помощью ТСХ. Элюент с продуктом упаривают на роторном испарителе. Время очистки продукта I составляет 4 часа. Процесс легко масштабируется. Вместо колонки можно использовать стеклянный фильтр Шотта большого диаметра.

Анализ. Вычислено С27 Н31N2Na2S2O6. Формула С27Н3IN2Na2S2O6. Получено: N 4,70%, 4,71%; S 10,81%, 10,79%.

Таким образом, разработанный способ выделения сульфопроизводного трифенилметанового красителя превосходит прототип по времени в 3-4 раза и не требует сложных манипуляций по созданию полимерной матрицы.

Предложенный способ является простым в исполнении, легко масштабируемым, при этом получают хроматографически чистую динатриевую соль 4-[бис[4-(диэтиламино)](2,4-дисульфофенил]метилен]-N,N-диэтил-2,5-циклогекса-диен-1-иминиума, которая может быть использована для приготовления диагностического препарата лимфотропин для цветной лимфографии.

Пилотные медико-биологические исследования лимфотропина у животных показали его пригодность для выявления регионарного лимфогенного метастазирования злокачественных новообразований различной локализации в результате окрашивания и визуализации лимфатических узлов. Применение цветной лимфографии с помощью лимфотропина позволит значительно увеличить прецизионность хирургических вмешательств при опухолях различной локализации, оптимизировать объем операций, повысить их эффективность и улучшить качество жизни больных.

Изобретение относится к области органической и медицинской химии. Предложен способ выделения динатриевой соли 4-[бис[4-(диэтиламино)](2,4-дисульфофенил)метилен]-N,N-диэтил-2,5-циклогексадиен-1-иминиума (лимфотропина), характеризующийся тем, что к раствору органической части промышленного красителя «Дисульфиновый голубой» в полярном растворителе, полученному диспергированием исходного красителя в метаноле с последующей фильтрацией, добавляют силикагель из расчета одна весовая часть красителя на три весовых части силикагеля, полученную суспензию упаривают досуха, а полученный силикагель с нанесенным на него красителем помещают в колонку с загруженным силикагелем из расчета: одна часть силикагеля на одну часть вышеназванного красителя, далее подают элюент в виде смеси этилацетата/спирта и осуществляют контроль за выделяемой динатриевой солью 4-[бис[4-(диэтиламино)](2,4-дисульфофенил)метилен]-N,N-диэтил-2,5-циклогексадиен-1-иминиума (лимфотропин) с помощью тонкослойной хроматографии (ТСХ). Технический результат - предложенный способ очистки от примесей дисульфопроизводного диаминотрифенилметанового красителя для последующего его использования в качестве контрастного агента при выявлении регионарного лимфогенного метастазирования злокачественных новообразований при опухолях различной локализации и визуализации лимфатических узлов является простым в исполнении, легко масштабируемым, при этом получают хроматографически чистую динатриевую соль 4-[бис[4-(диэтиламино)](2,4-дисульфофенил]метилен]-N,N-диэтил-2,5-циклогексадиен-1-иминиума, которая может быть использована для приготовления диагностического препарата лимфотропин для цветной лимфографии. 1 пр.

Способ выделения динатриевой соли 4-[бис[4-(диэтиламино)](2,4-дисульфофенил)метилен]-N,N-диэтил-2,5-циклогексадиен-1-иминиума (лимфотропина), характеризующийся тем, что к раствору органической части промышленного красителя «Дисульфиновый голубой» в полярном растворителе, полученному диспергированием исходного красителя в метаноле с последующей фильтрацией, добавляют силикагель из расчета: одна весовая часть красителя на три весовых части силикагеля, полученную суспензию упаривают досуха, а полученный силикагель с нанесенным на него красителем помещают в колонку с загруженным силикагелем из расчета: одна часть силикагеля на одну часть вышеназванного красителя, далее подают элюент в виде смеси этилацетата/спирта и осуществляют контроль за выделяемой динатриевой солью 4-[бис[4-(диэтиламино)](2,4-дисульфофенил)метилен]-N,N-диэтил-2,5-циклогексадиен-1-иминиума (лимфотропин) с помощью тонкослойной хроматографии (ТСХ).