СОЕДИНЕНИЯ, ПРЕДСТАВЛЯЮЩИЕ СОБОЙ КРАСИТЕЛИ, ПОЛУЧЕННЫЕ ИЗ ГЕНИПИНА ИЛИ МАТЕРИАЛОВ, СОДЕРЖАЩИХ ГЕНИПИН Российский патент 2019 года по МПК C09B61/00 C09B23/04 C09B69/10 C09B67/54 

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

1. Область техники

[0001] Настоящее изобретение относится к соединениям, представляющим собой красители, выделенным в результате взаимодействия сока Genipa americana, генипина или аналогов генипина, с амином, к композициям, содержащим указанные соединения, и к способам их получения и применения.

2. Уровень техники

[0002] Недоверие потребителей к использованию синтетических красителей, главным образом, вызванное их токсичностью, положило начало исследованию и разработке природных соединений, представляющих собой красители. Указанные соединения применяют уже многие века, но преимущества разработанных в последнее время технологий сделали применение указанных красителей целесообразным с точки зрения производства и коммерчески обоснованным и позволили конкурировать с синтетическими аналогами. См. "Market Brief in the European Union for selected natural ingredients derived from native species; Genipa americana", представленную на Конференции ООН по торговле и развитию (2005). Природные красители, такие как синие и черные красители на основе Genipa americana, используют в пищевой, косметической и текстильной промышленности по всему миру.

[0003] Существует описание способов получения синих красителей. Например, способ получения невосприимчивого к pH синего красителя, полученного из смеси необработанного неочищенного сока, выделенного из мякоти плодов Genipa americana, и глицина, был описан в патенте США №7927637 (Эчеверри (Echeverri) с соавторами), содержание которого включено в настоящую заявку во всей полноте посредством ссылки. Другие примеры получения синих красителей включают публикации заявок на патент Японии №№52053932 А2 и 52053934 А2, X. Окуяма (Н. Okuyama) с соавторами, в которых описан сине-фиолетовый краситель, полученный в результате спонтанного взаимодействия первичных аминов с генипином; и публикацию WO 2009/120579 (By (Wu) с соавторами), в которой описано смешивание сока Genipa americana с соком других плодов (например, арбуза) и аминокислотами. В указанных существующих способах в общем случае применяют получаемую неочищенную смесь без дополнительной очистки, что, вероятно, связано со сложностями, известными в области очистки таких смесей. См. Touyama R. et al., Studies on the Blue Pigments Produced from genipin and methylamine. I. Structures of the Brownish-Red Pigments, Intermediates Leading to the Blue Pigments, Chem Pharm. Bull 42, 66, 1994 (было установлено, что синий пигмент, полученный в результате взаимодействия генипина или его структурных аналогов с аминокислотами, "представляет собой трудноперерабатываемую смесь высокомолекулярных полимеров, о чем свидетельствует его хроматографическое поведение, не поддающийся анализу спектр ¹³С-ЯМР и измерения молекулярной массы"). Таким образом, описание молекулярной структуры синего пигментного материала является ограниченным, так как этот материал из-за его очень высокой полярности растворим практически только в воде, что приводит к сложностям при его мониторинге с помощью ТСХ. Сообщалось о полимере с молекулярной массой 9000 (см. Н. Jnouye, Y. et al., 26th Symposium on the Chemistry of Natural Product, Kyoto, Abstr. pp 577-584, 1983). Позднее By и Хорн (публикация заявки на патент США №2013/0115252) описали способ обогащения генипина, выделенного из Genipa americana, и способы применения материала, обогащенного генипином. Тем не менее, «экстракт, обогащенный генипином» согласно описанию содержит 30-97% (масс./масс.) генипина, оставшаяся часть композиции включает влагу, жир, небольшие количества кислот и азотсодержащих соединений, а остаток составляют углеводы (см. публикацию заявки на патент США №2013/0115252, стр. 3, левый столбец).

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0004] Настоящее изобретение способствует преодолению недостатка знаний о молекулярных структурах синего пигментного материала, полученного в результате взаимодействия генипина с аминокислотой. В настоящем описании предложены композиции красителей, содержащие по существу очищенные соединения, представляющие собой красители (например, полимеры), и способы выделения соединений, представляющих собой красители, и способы применения выделенных соединений, представляющих собой красители.

[0005] Определенные варианты реализации относятся к по существу очищенному соединению формулы 1А или формулы 1В, его геометрическому изомеру, таутомеру, соли или их комбинации:

.

[0006] Определенные варианты реализации относятся к по существу очищенному соединению формулы 2, 3А или 3В, его геометрическому изомеру, таутомеру, соли или их комбинации:

[0007] Определенные варианты реализации относятся к композиции красителя, содержащей полимер формулы 4:

,

его геометрический изомер, таутомер или соль,

где n представляет собой целое число от 2 до 200;

каждый А независимо выбран из группы, состоящей из фрагмента формулы 5А, формулы 5В, формулы 5С, его геометрического изомера, таутомера, соли и их комбинации:

,

причем:

R¹ представляет собой водород, метил, этил, пропил, изопропил, бутил, втор-бутил, изобутил или трет-бутил;

R² и R'² независимо представляют собой водород или C_1-10 алкил;

R³ представляет собой водород или СООН;

и Т¹ представляет собой водород или метальную группу; и Т² представляет собой водород или А-Т¹, где А и Т¹ определены выше; где указывает на место присоединения группы А в полимере формулы 4;

при этом композиция красителя по существу не содержит первое дополнительное соединение, выбранное из группы, состоящей из соединений формулы 6, формулы 7, формулы 8, их геометрических изомеров, таутомеров и солей:

[0008] В некоторых вариантах реализации композиция красителя содержит полимер формулы 4:

,

его геометрический изомер, таутомер или соль,

где n представляет собой целое число от 2 до 20;

каждый А независимо выбран из группы, состоящей из фрагмента формулы 5'А, формулы 5'В, формулы 5'С, его геометрического изомера, таутомера, соли и их комбинации:

,

причем:

R¹ представляет собой водород, метил, этил, пропил, изопропил, бутил, втор-бутил, изобутил или трет-бутил;

и Т¹ представляет собой водород или метальную группу; и Т² представляет собой водород или А-Т¹, где А и Т¹ определены выше;

при этом композиция красителя по существу не содержит первое дополнительное соединение, выбранное из группы, состоящей из соединений формулы 2', формулы 3'А, формулы 3'В, их геометрических изомеров, таутомеров и солей:

[0009] В некоторых вариантах реализации R¹ представляет собой метил. В некоторых вариантах реализации общая масса первого дополнительного соединения составляет менее 1% относительно массы полимера.

[0010] Определенные варианты реализации относятся к по существу очищенному соединению формулы 3'А (Me) или формулы 3'В (Me), его геометрическому изомеру, таутомеру, соли или их комбинации:

.

[0011] Определенные варианты реализации относятся к по существу очищенному полимеру формулы 4:

,

его геометрическому изомеру, таутомеру или соли,

где n представляет собой целое число от 2 до 20;

каждый А представляет собой фрагмент формулы 5'А (Me), его геометрический изомер, таутомер или соль:

,

причем Т¹ представляет собой водород или метальную группу; и Т² представляет собой водород или А-Т¹, где А и Т¹ определены выше.

[0012] Определенные варианты реализации относятся к очищенным соединениям, представляющим собой красители, и способам выделения соединений, представляющих собой красители, полученным в результате взаимодействия генипина с глицином. В некоторых вариантах реализации соединения, представляющие собой красители, получают в результате взаимодействия очищенного генипина (например, более 80%, 85%, 90%, 95% или 99% по массе) с глицином. В некоторых вариантах реализации соединения, представляющие собой красители, получают в результате взаимодействия глицина с соком, содержащим генипин. В некоторых вариантах реализации соединения, представляющие собой красители, получают в результате взаимодействия глицина с соком плодов, выделенным из Genipa americana. В некоторых вариантах реализации соединения, представляющие собой красители, получают в результате взаимодействия очищенного глицина с генипином, где генипин представляет собой очищенный генипин (например, более 80%, 85%, 90%, 95% или 99% по массе) или сок, содержащий генипин. В некоторых вариантах реализации соединения, представляющие собой красители, получают в результате взаимодействия генипина со смесью, содержащей глицин (например, с соком, содержащим глицин, или сухой смесью, содержащей глицин, такой как концентрат сока, содержащий глицин), где генипин представляет собой очищенный генипин (например, более 80%, 85%, 90%, 95% или 99% по массе) или сок, содержащий генипин. В некоторых вариантах реализации соединения, представляющие собой красители, получают в результате взаимодействия сока, содержащего глицин (например, плодового сока, такого как сок, полученный из арбуза, белого винограда, ананаса, личи, мускусной дыни, банана, апельсина, яблока, груши, лимона, маракуйи, красного винограда, черники, тамаринда, персика, папайи, асаи, сливы, гуавы, мандарина, борохо, купуасу, годжи или киви), с соком, содержащим генипин (например, с плодовым соком, таким как сок, выделенный из Genipa americana). В некоторых вариантах реализации соединения, представляющие собой красители, получают в результате взаимодействия сока, полученного из арбуза, с соком, полученным из Genipa americana.

[0013] Определенные варианты реализации относятся к способу выделения соединений, представляющих собой красители, включающему: экстракцию синей смеси, полученной в результате взаимодействия генипина и глицина со спиртовым растворителем с получением фракции, растворимой в спирте, и фракции, не растворимой в спирте; и очистку фракции, растворимой в спирте, или фракции, не растворимой в спирте. В некоторых вариантах реализации синяя смесь представляет собой сухой порошок (например, лиофилизированный порошок), полученный в результате взаимодействия генипина с глицином.

[0014] Определенные варианты реализации относятся к по существу очищенному соединению, представляющему собой краситель, содержащему очищенный полимер формулы 4, его геометрический изомер, таутомер или соль. В некоторых вариантах реализации по существу очищенное соединение, представляющее собой краситель, содержит димер формулы 2, 3'А (Me) или 3'В (Me). В некоторых вариантах реализации по существу очищенное соединение, представляющее собой краситель, например, полимер (например, соединение формулы 4, его геометрический изомер, таутомер или соль), не содержит углеводы, например, сахара. В некоторых вариантах реализации по существу очищенное соединение, представляющее собой краситель, содержит полимер (например, соединение формулы 4, его геометрический изомер, таутомер или соль), по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% свободный от углеводов, и по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% свободный от других примесей, например, мономеров, димеров, жирных кислот, жиров, белков и/или органических кислот.

[0015] В некоторых вариантах реализации способ придания синей окраски субстрату включает приведение субстрата в контакт с композицией красителя, описанной в настоящей заявке. В некоторых вариантах реализации субстрат представляет собой продукт питания, лекарственное средство или нутрицевтический продукт, косметический продукт или медицинское устройство. В некоторых вариантах реализации композиция красителя содержит очищенный полимер формулы 4, его геометрический изомер, таутомер или соль. В некоторых вариантах реализации композиция красителя содержит по существу чистый димер формулы 2, 3'А (Me) или 3'В (Me).

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

[0016] На ФИГУРАХ 1А-В показаны химические формулы для обеих изомерных форм соединения №1.

[0017] На ФИГУРАХ 2А-В приведено другое изображение химических формул для обеих изомерных форм соединения №1.

[0018] На ФИГУРАХ 3А-В показаны химические формулы для обеих изомерных форм соединения №3.

[0019] На ФИГУРАХ 4А-В приведено другое изображение химических формул для обеих изомерных форм соединения №3.

[0020] На ФИГУРЕ 5 показаны спектры спектроскопии ядерного магнитного резонанса (ЯМР) соединения 1, выделенного после взаимодействия генипина с глицином.

[0021] На ФИГУРЕ 6 показаны спектры ЯМР спектроскопии соединения 3, выделенного после взаимодействия генипина с глицином.

[0022] На ФИГУРЕ 7 показаны спектры ЯМР фракций S31, S32, S33 и S34 (полученных из фракции S3), выделенных после взаимодействия генипина с глицином.

[0023] На ФИГУРЕ 8 приведено схематическое изображение структуры полимера, имеющего формулу 4.

[0024] На ФИГУРЕ 9 показан спектр ЯМР нерастворимой фракции, выделенной после взаимодействия генипина с глицином.

[0025] На ФИГУРЕ 10 показан спектр ¹Н-¹³С ЯМР в твердой фазе для полимера, выделенного после взаимодействия генипина с глицином.

[0026] На ФИГУРЕ 11 показан массовый спектр, полученный путем селективного фильтрования по молекулярным массам полимера, выделенного после взаимодействия генипина с глицином.

[0027] На ФИГУРЕ 12 показан ИК-профиль полимера, выделенного после взаимодействия генипина с глицином.

[0028] На ФИГУРАХ 13A-D показаны кривые высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) для четырех образцов (А, В, С и D), содержащих синий полимер, полученный в результате взаимодействия сока Genipa americana с глицином. А) розовая линия 240 нм, синяя линия 590 нм с пониженным поглощением; В) практически равное поглощение при 240 и 590 нм; С) повышенное поглощение при 590 нм; и D) пустой образец, содержащий носитель.

[0029] На ФИГУРАХ 14A-F показаны калибровочные кривые 1-6, соответственно, для стандартных растворов синего полимера сравнения.

[0030] На ФИГУРЕ 15 показаны спектры ВЭЖХ и поглощение в УФ спектре для образцов PF, FC и PC (см. пример 10 для определения PF, FC и PC).

[0031] На ФИГУРЕ 16 показаны цветовые параметры образцов PF, FC и PC.

[00321 На ФИГУРЕ 17 показаны спектры ВЭЖХ фракции полимера и водной фракции, элюированной из смолы XAD-7.

[0033] На ФИГУРЕ 18 показаны спектры поглощения в УФ спектре и видимой области продуктов взаимодействия сока Genipa americana с различными аминокислотами.

[0034] На ФИГУРАХ 19А-С показан анализ ВЭЖХ продуктов взаимодействия сока Genipa americana с различными аминокислотами, где изображения сгруппированы по аминокислотам. На фигурах 19А-С для каждой аминокислоты, (19А) глицин, лизин и валин, (19В) метионин и пролин, и (19С) тирозин и триптофан, показаны следующие параметры: спектры ВЭЖХ продуктов взаимодействия сока Genipa americana с аминокислотой при помощи способа согласно примеру 6; увеличенный вид области спектра ВЭЖХ, в которой выявлен полимер; и спектры в УФ и видимой области выбранного сигнала.

[0035] На ФИГУРЕ 20 показана стабильность (выраженная как период полураспада) продуктов взаимодействия различных аминокислот с соком Genipa americana в буферном растворе при pH 3,0 при УФ облучении с длиной волны 254 нм.

[0036] На ФИГУРЕ 21А показан спектр ВЭЖХ водного экстракта мезокарпия свежих плодов Genipa americana, который имеет пик со временем удерживания от 19 до 20 минут, практически соответствующий времени удерживания генипина (22-23 минуты), где длина волны максимального поглощения составляет 240 нм.

[0037] На ФИГУРЕ 21В показан спектр ВЭЖХ водного экстракта мезокарпия (кожуры) плодов Genipa americana, которые собирали в то же время, что и плоды, изображенные на фигуре 21А, но оставляли при комнатной температуре на три дня перед проведением экстракции. Спектр имеет пики с временами удерживания 19-20 минут и 22-23 минуты.

[0038] На ФИГУРЕ 22 показан спектр ¹Н ЯМР пурпурного продукта, полученного из водного экстракта мезокарпия (кожуры) плодов Genipa americana и глицина.

[0039] На ФИГУРЕ 23 показан спектр ¹Н ЯМР синего продукта, полученного при помощи способа взаимодействия предварительно нагретого водного экстракта мезокарпия (кожуры) плодов Genipa americana с глицином.

[0040] На ФИГУРЕ 24 показаны неспелые плоды Genipa americana (джагуа) и отмечены перикарпий (наружный слой кожуры), эндокарпий (мякоть) и мезокарпий (кожура).

[0041] На ФИГУРАХ 25А-В показаны спектры ¹Н ЯМР в CD₃OD (с подавленным сигналом воды) генипина (25А) и предшественника, содержащегося в мезокарпии (25В).

[0042] На ФИГУРАХ 26А-В показаны профили ВЭЖХ (240 нм) водного экстракта мезокарпия (26А) и фракции водного экстракта, полученного после отделения с использованием этилацетата в качестве растворителя (26В).

[0043] На ФИГУРЕ 27 показан профиль ВЭЖХ (240 нм) водного экстракта мезокарпия из плодов джагуа, выдерживаемых в комнатных условиях в течение нескольких дней после сбора.

[0044] На ФИГУРЕ 28 показан спектр ¹Н ЯМР водного экстракта мезокарпия, при этом увеличено изображение области, где можно ожидать пики альдегида.

[0045] На ФИГУРЕ 29 показан спектр ¹³С ЯМР предшественника генипина, содержащегося в мезокарпии джагуа.

[0046] На ФИГУРЕ 30 показаны химические структуры генипина (1) и генипозида (2).

[0047] На ФИГУРЕ 31 показаны хроматограммы, полученные в результате Me - Gly: одновременного взаимодействия сока Genipa americana с глицином и метионином; 1+2: взаимодействия метионина с соком Genipa americana и затем с глицином; и RN: взаимодействия сока Genipa americana только с глицином.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Определения

[0048] Согласно настоящему описанию термин «полимер» обозначает химическое соединение или смесь соединений, полученных в результате полимеризации и состоящих по существу из повторяющихся структурных звеньев.

[0049] Согласно настоящему описанию очищенный полимер может обозначать очищенное отдельное химическое соединение, имеющее определенную молекулярную структуру и заданное количество повторяющихся структурных звеньев. Очищенный полимер может также обозначать смесь полимерных соединений, полученных в реакции полимеризации, имеющих различную степень полимеризации (т.е. количество повторяющихся структурных звеньев может быть различным).

[0050] На схеме 1 показана типовая реакция полимеризации реагента 1 (например, генипина, R¹=Me) и реагента 2 (например, глицина, R³=СООН, R² и R'² представляют собой Н). Очищенный полимер, полученный в результате взаимодействия, описанного на схеме 1, может представлять собой выделенную полимерную композицию с определенной чистотой (например, содержащую более 75%, 80%, 85%, 90% или 95% полимера по массе), если рассматривать молекулы отдельного полимера (молекула отдельного полимера формулы 4 означает, что Т¹, Т², А и n в формуле являются фиксированными). Очищенный полимер, полученный в результате взаимодействия, описанного на схеме 1, также может представлять собой выделенную полимерную композицию с определенной чистотой (например, содержащую более 75%, 80%, 85%, 90% или 95% полимера по массе), если рассматривать смесь полимерных соединений, полученных в реакционной смеси, имеющих одинаковые повторяющиеся структурные звенья, но различную степень полимеризации (например, в формуле 4 полимерные соединения имеют одинаковые А, но различные n).

[0051] В определенных вариантах реализации полимер согласно настоящему изобретению характеризуется молекулярной формулой, например, формулой 4, геометрическим изомером, таутомером или солью соединения указанной молекулярной формулы. Согласно настоящему описанию термин «полимер формулы 4» или «полимеры формулы 4» обозначает полимер или полимеры, имеющие структуру согласно формуле 4 или геометрический изомер, таутомер или соль указанного соединения. В определенных вариантах реализации полимер согласно настоящему описанию характеризуется физическими данными (например, спектральными данными, молекулярно-массовым распределением). Способы определения параметров полимера известны в данной области техники. Например, полимер может быть охарактеризован при помощи спектроскопических способов (например, ИК, УФ/видимая область, ЯМР, МС и т.д.); и для получения значений среднечисловой молекулярной массы (M_n) и/или среднемассовой молекулярной массы (M_w) можно проводить анализ молекулярной массы полимера.

[0052] Термин «геометрические изомеры», используемый в настоящем описании, обозначает изомеры, имеющие идентичную структуру за исключением различной конфигурации относительно двойной(-ых) связи(-ей) (т.е. Е- или Z- изомер или цис-/транс-изомер). Для иллюстрации на схеме 2 показан пример пары двух геометрических изомеров, где различия между двумя изомерами заключаются исключительно в конфигурации относительно двойной связи.

[0053] Термин «таутомеры» или «таутомерные изомеры», используемый в настоящем описании обозначает соединения, которые могут превращаться друг в друга посредством таутомеризации. Таутомеризация известна в данной области техники и в общем случае относится к реакции, показанной на схеме 3A. В большинстве случаев группа G в реакции представляет собой водород.

[0054] Дополнительный пример таутомеров показан на схеме 3B. Следует понимать, что на схеме 3B показаны не все возможные таутомерные структуры.

[0055] Стрелки, используемые на схемах 2, 3A и 3B, предназначены для иллюстрации, и их не следует рассматривать как обозначающие фактическое равновесие между изомерами или таутомерами.

[0056] Следует понимать, что согласно настоящему описанию термин «соль» включает внутренние соли или внешние соли, если конкретно не указано иное. Примеры внешних солей включают соли, содержащие катион в качестве противоиона, такой как ион щелочного металла (например, Na⁺, K⁺ и т.д.), ион щелочноземельного металла (например, Mg²⁺, Са²⁺ и т.д.), ион аммония (например, NH₄⁺ или органический ион аммония и т.д.). Примеры внешних солей также включают соли, содержащие анион в качестве противоиона, такой как неорганический анион (например, Cl^-, SO₄^2-, Br^-, HSO₄^- и т.д.) или органический анион (например, анион карбоновой кислоты, такой как формиат, ацетат и т.д.).

[0057] Согласно настоящему описанию соединения №1, 2 и 3 относятся к соединениям, выделенным после взаимодействия генипина с глицином, как описано в разделе Примеры.

[0058] Согласно настоящему описанию димер или димерное соединение обозначает соединение, состоящее по существу из двух мономеров. Примеры димеров включают соединения №1, №2, №3 и соединения формулы 1А, 1В, 2, 3A, 3B, 2', 3'А, 3'В, 3'А (Me), 3'В (Me), 6, 7 и 8.

[0059] Согласно настоящему описанию «по существу не содержит соединение» (например, первое дополнительное соединение, второе дополнительное соединение или их комбинацию) означает, что общая масса соединения составляет менее 5% относительно массы данного материала (например, полимера формулы 4, его геометрического изомера, таутомера или соли). В некоторых вариантах реализации «по существу не содержит соединение» означает, что общая масса соединения составляет менее 4,5%, менее 4%, менее 3%, менее 2%, менее 1%, менее 0,5%, менее 0,1% или менее 0,01% относительно массы данного материала (например, полимера формулы 4, его геометрического изомера, таутомера или соли). В некоторых вариантах реализации композиция (например, композиция красителя), «по существу не содержащая» соединение, означает что композиция не содержит соединение. В некоторых вариантах реализации «по существу не содержит соединение» означает, что общая масса соединения составляет 0,01-5%, 0,01-4,5%, 0,01-4%, 0,01-3%, 0,01-2%, 0,01-1%, 0,01-0,5% или 0,01-0,1% относительно массы данного материала (например, полимера формулы 4, его геометрического изомера, таутомера или соли).

[0060] Согласно настоящему описанию термин «по существу очищенное» или «по существу чистое» соединение (например, по существу очищенный полимер, по существу очищенный димер) обозначает соединение, имеющее чистоту более 80% (например, более 80%, 85%, 90%, 95% или 99% по массе (например, в пересчете на сухую массу, т.е. без учета летучих компонентов, таких как растворители (например, вода, CH₃CN, МеОН, EtOH и т.д.))). В некоторых вариантах реализации по существу чистый полимер формулы 4, его геометрический изомер, таутомер или соль содержит более 80%, 85%, 90%, 95% или 99% полимера, геометрического изомера, таутомера или соли в пересчете на сухую массу.

[0061] Термин «очищенный генипин», используемый в настоящем описании, относится к веществу, содержащему более 80%, 85%, 90%, 95% или 99% генипина по массе. Аналогично, термин «очищенный глицин», используемый в настоящем описании, относится к веществу, содержащему более 80%, 85%, 90%, 95% или 99% глицина по массе.

[0062] Чистоту красителей согласно настоящему изобретению можно измерять при помощи известных способов анализа (например, анализа высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ)). Таким образом, количественную оценку соединения (например, димера, полимера) в образце можно проводить при помощи способов ВЭЖХ, например, схожих со способами, описанными в разделе Примеры.

Композиции красителей, содержащие димер

[0063] В настоящем изобретении предложены соединения, представляющие собой красители, и их молекулярные структурные формулы и способы выделения соединений, представляющих собой красители, полученных в результате взаимодействия генипина, выделенного из Genipa americana, с глицином. В некоторых вариантах реализации соединения получают путем многократного хроматографического фракционирования материала, полученного в результате взаимодействия. В некоторых вариантах реализации молекулярные структурные формулы определяют путем спектроскопии ¹Н ядерного магнитного резонанса (¹Н ЯМР), J-модуляции (JMOD), Н-Н-корреляционной спектроскопии (COSY ¹Н-¹Н) и других средств анализа структуры молекул.

[0064] В некоторых вариантах реализации соединение, представляющее собой краситель, имеет формулу 3A (в настоящей заявке формула 3A соответствует соединению №3 в предпочтительной изомерной форме):

Формула 3A

[0065] В другом варианте реализации соединение, представляющее собой краситель, имеет изомерную формул формулы 3B (в настоящей заявке формула 3B соответствует соединению №3 в изомерной форме):

Формула 3B

[0066] Определенные варианты реализации относятся к способу выделения соединения формулы 3A, представляющего собой краситель:

Формула 3A

[0067] При этом способ включает:

A. Выделение генипина из сока Genipa americana;

B. Взаимодействие глицина с указанным генипином с получением материала, растворимого в метаноле;

C. Хроматографическое разделение растворимого в метаноле материала на фракции S1, S2, S3, S4.

D. Повторное хроматографическое разделение фракции S3 на фракции S31, S32, S33 и S34. Выделение путем обращенно-фазовой хроматографии соединения формулы I из фракции S33.

[0068] Менее предпочтительный вариант реализации относится к способу выделения соединения, имеющего изомерную форму формулы 3B:

Формула 3B

,

где способ включает:

A. Выделение генипина из сока Genipa americana;

B. Взаимодействие глицина с указанным генипином с получением материала, растворимого в метаноле;

C. Хроматографическое разделение материала, растворимого в метаноле, на фракции S1, S2, S3, S4.

D. Повторное хроматографическое разделение фракции S3 на фракции S31, S32, S33 и S34.

E. Выделение путем обращенно-фазовой хроматографии соединения формулы I из фракции S33.

[0069] На ФИГУРАХ 3A и 4А приведены изображения химической формулы предпочтительной изомерной формы соединения №3. Соединение №3 представляет собой вещество-краситель очень темно-синей окраски. На ФИГУРАХ 3B и 4В показана менее предпочтительная изомерная форма соединения №3. На ФИГУРЕ 6 показан профиль спектроскопии ядерного магнитного резонанса (ЯМР) соединения №3. Анализ профиля спектроскопии ядерного магнитного резонанса (ЯМР) соединения №3 показал:

[0070] ¹Н ЯМР (400 МГц, D₂O). δ 8,6, 8,0, 7,9, 6,7, 3,90, 1,8 ppm.

[0071] ¹³С ЯМР (100 МГц). δ 172,2, 166,3, 138,8, 135,6, 135,1, 133,3, 131,4, 127,1, 120,46, 118,9, 61,0, 53,3, 11,2 ppm.

m/z 505 [М+Н]

[0072] Дальнейший анализ соединения №3 показал, что:

[0073] Масс-спектр соединения 3 показывает m/z=505 [М+Н]⁺ согласно масс-спектрометрии, что указывает на изомер описанного ранее соединения. Тем не менее, спектры ¹Н и ¹³С ЯМР очень отличались от него. В протонных спектрах были детектированы следующие синглеты: δ 8,0, δ 7,9 и δ 6,7 (2Н каждый) и один дополнительный синглет при δ 8,6, интегрированный для 1Н. Другие сигналы представляли собой синглет на δ 4,7 (N-CH2) и две метальные группы при δ 3,9 (ОСН₃) и δ 1,8 (СН₃ винил). Согласно JMOD-исследованию, также наблюдались следующие атомы углерода: карбоксильная группа при δ 172,2, сложный метиловый эфир при δ 166,3, (СООН), пять четвертичных атомов углерода при δ 138,8, δ 135,1, δ 127,1, δ 120,4, δ 118,9, четыре метина при δ 135,6, δ 133,3, δ 131,4, δ 131,4, один метилен (N-СН₂) при δ 61,0 и две метальные группы при δ 53,3 (ОСН₃) и δ 11,2 (СН₃ винил). Структура каждого мономерного звена была установлена согласно НМВС-исследованию: сигналы при δ 7,9 и δ 8,0 были отнесены к протонам пиридильной группы, так как была обнаружена корреляция в широком диапазоне с N-метиленовой группой при δ 61,0; кроме того, последний протон показывает ³J взаимодействие с карбонилом сложного метилового эфира при δ 172,2. Кроме того, было показано другое важное взаимодействие между синглетом при δ 131,4 (С-7) и протонами метальной группы. Небольшое количество ароматических и винильных протонов указывает на присутствие симметричной димерной молекулы, такой, как показано на ФИГУРАХ 3A-3B. К этой молекуле могут быть отнесены две структуры в зависимости от относительной ориентации группы сложного метилового эфира (ФИГУРЫ 3A-3B), но структура В снова имеет низкую вероятность из-за стерических затруднений.

[0074] В другом варианте реализации способ выделения соединения №3, представляющего собой краситель, включает:

A. Выделение генипина из сока Genipa americana;

B. Взаимодействие глицина с указанным генипином с получением материала, растворимого в метаноле;

C. Хроматографическое разделение материала, растворимого в метаноле, на фракции S1, S2, S3 и S4.

D. Повторное хроматографическое разделение фракции S3 на фракции S31, S32, S33 и S34 (ФИГУРА 7). Выделение путем обращенно-фазовой хроматографии соединения формулы I из фракции S33.

[0075] В настоящей заявке термины S1, S2, S3, S4 и S31, S32, S33 и S34 представляют собой способ обозначения фракций, полученных на описанных стадиях указанного способа. Тем не менее, эти термины (S1, S2, S3, S4 и S31, S32, S33 и S34) охватывают любые фракции, полученные на аналогичных стадиях хроматографии, которые могут быть получены в результате взаимодействия генипина с глицином, при котором получают фракцию, аналогичную S3, и фракции, полученные из S3 (со спектром ЯМР, аналогичным представленному на ФИГУРЕ 7). На ФИГУРЕ 7 показаны спектры ЯМР спектроскопии фракций S31, S32, S33 и S34, полученных из фракции S3.

[0076] В некоторых вариантах реализации композиция красителя содержит по существу чистое соединение формулы 1А, 1В, 2, 3'А (Me) и 3'В (Me), выделенное после взаимодействия генипина с глицином.

[0077] В некоторых вариантах реализации способ выделения соединения №3, представляющего собой краситель, включает:

A. Выделение генипина из сока Genipa americana;

B. Взаимодействие глицина с указанным генипином с получением материала, растворимого в метаноле;

C. Хроматографическое разделение материала, растворимого в метаноле, на фракции S1, S2, S3, S4.

D. Повторное хроматографическое разделение фракции S3 на фракции S31, S32, S33 и S34 (ФИГУРА 7). Выделение путем обращенно-фазовой хроматографии соединения 3 из фракции S33.

[0078] Для задач настоящей заявки термины S1, S2, S3, S4 и S31, S32, S33, S34 и M2S1R, M2S2R, M2S3R, M2S4R и i1 и i2 представляют собой способ обозначения фракций, полученных на описанных стадиях указанного способа. Тем не менее, эти термины (S1, S2, S3, S4 и S31, S32, S33 и S34) охватывают любые фракции, полученные на аналогичных стадиях хроматографии, которые могут быть получены в результате взаимодействия генипина с глицином, при котором получают фракцию, аналогичную S3, и фракции, полученные из S3 (со спектром ЯМР спектроскопии, аналогичным представленному на ФИГУРЕ 7). На ФИГУРЕ 7 показаны спектры ЯМР спектроскопии фракций S31, S32, S33 и S34, полученных из фракции S3.

[0079] Определенные варианты реализации относятся к по существу очищенному соединению формулы 3'А (Me) или формулы 3'В (Me), его геометрическому изомеру, таутомер у, соли или их комбинации:

.

[0080] Определенные варианты реализации относятся к по существу очищенному соединению формулы 1А или формулы 1В, его геометрическому изомеру, таутомеру, соли или их комбинации:

.

Композиция, содержащая полимер

[0081] В определенных вариантах реализации очищенный полимер согласно настоящему изобретению, например, полимер формулы 4, его геометрический изомер, таутомер или соль, можно применять в качестве отдельного или основного красителя отдельно или в комбинации с другим красителем (например, с димером формулы 1А, 1В, 2, 3A, 3B, 2', 3'А, 3'В, 3'А (Me), 3'В (Me) или любой их комбинацией). В некоторых вариантах реализации очищенный полимер согласно настоящему изобретению, например, полимер формулы 4, его геометрический изомер, таутомер или соль, можно разбавлять путем смешивания полимера с разбавителем (например, с водой). В некоторых вариантах реализации очищенный полимер согласно настоящему изобретению, например, полимер формулы 4, его геометрический изомер, таутомер или соль, можно концентрировать путем удаления разбавителя (например, растворителя, такого как метанол, вода и т.д.) из композиции, содержащей полимер и разбавитель.

[0082] В некоторых вариантах реализации композиция красителя содержит полимер формулы 4:

,

его геометрический изомер, таутомер или соль,

где n представляет собой целое число от 2 до 200;

каждый А независимо выбран из группы, состоящей из фрагмента формулы 5А, формулы 5В, формулы 5С, его геометрического изомера, таутомера, соли и их комбинации:

,

причем:

R¹ представляет собой водород, метил, этил, пропил, изопропил, бутил, втор-бутил, изобутил или трет-бутил;

R² и R'² независимо представляют собой водород или C_1-10 алкил;

R³ представляет собой водород или СООН;

и Т¹ представляет собой водород или метальную группу; и Т² представляет собой водород или А-Т¹, где А и Т¹ определены выше;

при этом композиция красителя по существу не содержит первое дополнительное соединение, выбранное из группы, состоящей из соединений формулы 6, формулы 7, формулы 8, их геометрических изомеров, таутомеров и солей:

,

[0083] В некоторых вариантах реализации R³ представляет собой Н. В некоторых вариантах реализации R³ представляет собой СООН.

[0084] В некоторых вариантах реализации один из R² и R'² представляет собой водород. В некоторых вариантах реализации оба R² и R'² представляют собой водород. В некоторых вариантах реализации один из R² и R'² представляет собой водород; а другой из R² и R'² представляет собой незамещенную C_1-10 линейную алкильную цепь (например, метил, этил, пропил, бутил, пентил, гексил и т.д.) или C_1-10 линейную алкильную цепь, замещенную 1-3 метальными группами, такую как изопропил, изобутил, изопентил и т.д.

[0085] В некоторых вариантах реализации представляет собой остаток аминокислоты (R³ представляет собой СООН, и R² и/или R'² представляет(-ют) собой боковую(-ые) цепь(-и)). В некоторых вариантах реализации остаток аминокислоты представляет собой остаток глицина, аланина, валина, лейцина, изолейцина, серина, цистеина, треонина, метионина, пролина, фенилаланина, тирозина, триптофана, гистидина, лизина, аргинина, аспартата, глутамата, аспарагина, таурина, карнитина, орнитина, цитруллина или глутамина. В некоторых вариантах реализации остаток аминокислоты представляет собой остаток глицина.

[0086] В некоторых вариантах реализации R¹ может представлять собой водород, метил, этил, пропил, изопропил, бутил, втор-бутил, изобутил или трет-бутил, например, R¹ может представлять собой водород, метил или этил; или R¹ может представлять собой метил.

[0087] В некоторых вариантах реализации Т¹ может представлять собой водород или метил.

[0088] В некоторых вариантах реализации n равен 2-200, 2-150, 2-100, 2-50, 2-25, 2-20, 2-15, 2-10 или 2-5.

[0089] В некоторых вариантах реализации композиция красителя содержит полимер формулы 4:

,

его геометрический изомер, таутомер или соль,

где n представляет собой целое число от 2 до 20;

каждый А независимо выбран из группы, состоящей из фрагмента формулы 5'А, формулы 5'В, формулы 5'С, его геометрического изомера, таутомера, соли и их комбинации:

,

причем:

R¹ представляет собой водород, метил, этил, пропил, изопропил, бутил, втор-бутил, изобутил или трет-бутил;

и Т¹ представляет собой водород или метальную группу; и Т² представляет собой водород или А-Т¹, где А и Т¹ определены выше;

при этом композиция красителя по существу не содержит первое дополнительное соединение, выбранное из группы, состоящей из соединений формулы 2', формулы 3'А, формулы 3'В, его геометрический изомер, таутомер и соль:

.

[0090] В некоторых вариантах реализации R¹ представляет собой метил.

[0091] В некоторых вариантах реализации подходящие полимеры формулы 4, их геометрические изомеры, таутомеры или соли содержат различные повторяющиеся звенья (т.е. имеют различные «А» в формуле 4), различные терминальные группы (например, различные Т¹, Т² или обе указанные группы) и/или имеют различную длину цепи. В другом варианте реализации подходящие полимеры формулы 4, их геометрические изомеры, таутомеры или соли включают полимеры, имеющие характеристические спектры поглощения в УФ-видимой области (например, длину волны максимального поглощения (λ_max)), спектры ЯМР, ИК-спектры, среднюю молекулярную массу (например, среднечисловую молекулярную массу (M_n)) или их комбинацию. В другом варианте реализации подходящие полимеры формулы 4, их геометрические изомеры, таутомеры или соли включают полимеры, имеющие определенную степень чистоты.

Структура полимера

[0092] В некоторых вариантах реализации каждый А в полимере формулы 4 независимо представляет собой фрагмент формулы 5'А, формулы 5'В, формулы 5'С, его геометрический изомер, таутомер или соль. В некоторых вариантах реализации каждый А в полимере формулы 4 представляет собой фрагмент формулы 5'А, его геометрический изомер, таутомер или соль. В некоторых вариантах реализации каждый А в полимере формулы 4 представляет собой фрагмент формулы 5'В, его геометрический изомер, таутомер или соль. В некоторых вариантах реализации каждый А в полимере формулы 4 представляет собой фрагмент формулы 5'С, его геометрический изомер, таутомер или соль. В других вариантах реализации полимер формулы 4 может включать повторяющиеся звенья, имеющие формулу 5'А и формулу 5'В, формулу 5'А и формулу 5'С, формулу 5'В и формулу 5'С или формулу 5'А, формулу 5'В и формулу 5'С.

[0093] Полимеры формулы 4 с различными группами R¹ (например, представляющими собой водород, метил, этил, пропил, изопропил, бутил, втор-бутл, изобутил или трет-бутил) подходят в качестве соединений, представляющих собой синий краситель. В некоторых вариантах реализации R¹ может представлять собой водород, метил или этил. В некоторых вариантах реализации каждый А в полимере формулы 4 представляет собой фрагмент формулы 5'А, его геометрический изомер, таутомер или соль, и R¹ в формуле 5'А представляет собой водород. В некоторых вариантах реализации каждый А в полимере формулы 4 представляет собой фрагмент формулы 5'А, его геометрический изомер, таутомер или соль, и R¹ в формуле 5'А представляет собой метил. В некоторых вариантах реализации каждый А в полимере формулы 4 представляет собой фрагмент формулы 5'А, его геометрический изомер, таутомер или соль, и R¹ в формуле 5'А представляет собой этил. В некоторых вариантах реализации каждый А в полимере формулы 4 представляет собой фрагмент формулы 5'В, его геометрический изомер, таутомер или соль, и R¹ в формуле 5'В представляет собой водород. В некоторых вариантах реализации каждый А в полимере формулы 4 представляет собой фрагмент формулы 5'В, его геометрический изомер, таутомер или соль, и R¹ в формуле 5'В представляет собой метил. В некоторых вариантах реализации каждый А в полимере формулы 4 представляет собой фрагмент формулы 5'В, его геометрический изомер, таутомер или соль, и R¹ в формуле 5'В представляет собой этил. В некоторых вариантах реализации каждый А в полимере формулы 4 представляет собой фрагмент формулы 5'С, его геометрический изомер, таутомер или соль, и R¹ в формуле 5'С представляет собой водород. В некоторых вариантах реализации каждый А в полимере формулы 4 представляет собой фрагмент формулы 5'С, его геометрический изомер, таутомер или соль, и R¹ в формуле 5'С представляет собой метил. В некоторых вариантах реализации каждый А в полимере формулы 4 представляет собой фрагмент формулы 5'С, его геометрический изомер, таутомер или соль, и R¹ в формуле 5'С представляет собой этил.

[0094] В настоящем изобретении также предложены полимеры формулы 4 с различными терминальными группами. В некоторых вариантах реализации подходящая терминальная группа представляет собой любую группу, полученную в результате взаимодействия, приведенного на схеме 1. В некоторых вариантах реализации Т¹ представляет собой водород или метальную группу; и Т² представляет собой водород или А-Т¹, где А и Т¹ описаны в настоящей заявке.

[0095] В некоторых вариантах реализации очищенные полимеры формулы 4, их геометрические изомеры, таутомеры или соли с различной степенью полимеризации подходят для различных применений, предложенных в настоящем описании. В некоторых вариантах реализации n в формуле 4 представляет собой целое число от 2 до 20, от 2 до 18, от 2 до 16, от 2 до 14, от 2 до 12, от 2 до 10, от 2 до 8, от 2 до 6, от 2 до 4, от 4 до 20, от 4 до 18, от 4 до 16, от 4 до 14, от 4 до 12, от 4 до 10, от 4 до 8, от 4 до 6, от 6 до 20, от 6 до 18, от 6 до 16, от 6 до 14, от 6 до 12, от 6 до 10, от 6 до 8, от 8 до 20, от 8 до 18, от 8 до 16, от 8 до 14, от 8 до 12, от 8 до 10, от 10 до 20, от 10 до 18, от 10 до 16, от 10 до 14 или от 10 до 12. В некоторых вариантах реализации, где очищенный полимер представляет собой отдельное очищенное химическое соединение общей формулы 4, n в формуле 4 равен 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20.

Характеристики полимера

[0096] В определенных вариантах реализации полимеры, например, полимер формулы 4, его геометрический изомер, таутомер или соль, имеющие определенные характеристики, подходят для применения в композиции красителя.

[0097] В некоторых вариантах реализации полимер имеет длину волны максимального поглощения (λ_max) в диапазоне от примерно 580 до примерно 610 нм в УФ-видимой области спектра. В некоторых вариантах реализации полимер имеет длину волны максимального поглощения (λ_max), составляющую примерно 580, примерно 585, примерно 590, примерно 595, примерно 600, примерно 605 или примерно 610 нм. В некоторых вариантах реализации полимер имеет длину волны максимального поглощения (λ_max) менее чем примерно 580 нм (например, примерно 570, примерно 560 нм и т.д.). В некоторых вариантах реализации полимер имеет длину волны максимального поглощения (λ_max) более чем примерно 610 нм (например, примерно 620, примерно 630 нм и т.д.).

[0098] В некоторых вариантах реализации полимер характеризуется временем удерживания ВЭЖХ, составляющим примерно 10,3 минуты, например, при анализе при помощи способа, описанного в примере 6. В некоторых вариантах реализации полимер характеризуется повышенным поглощением при 590 нм по сравнению с поглощением при 240 нм. В некоторых вариантах реализации полимер характеризуется кривой ВЭЖХ, по существу идентичной спектру, приведенному на ФИГУРЕ 13С.

[0099] В определенных вариантах реализации полимеры формулы 4, их геометрические изомеры, таутомеры или соли, имеющие различную среднюю молекулярную массу, подходят для применения в композиции красителя. В некоторых вариантах реализации полимер имеет среднюю молекулярную массу в диапазоне от примерно 1000 до примерно 20000. В некоторых вариантах реализации полимер имеет среднюю молекулярную массу в диапазоне от примерно 3000 до примерно 15000 или от примерно 3000 до примерно 10000. В некоторых вариантах реализации полимер имеет среднюю молекулярную массу в диапазоне от примерно 4500 до примерно 7500. В некоторых вариантах реализации полимер имеет среднюю молекулярную массу, составляющую примерно 5000, примерно 5500, примерно 6000, примерно 6500 или примерно 7000. В некоторых вариантах реализации полимер имеет среднюю молекулярную массу, составляющую примерно 6000. В некоторых вариантах реализации средняя молекулярная масса представляет собой среднечисловую молекулярную массу (M_n). В некоторых вариантах реализации средняя молекулярная масса представляет собой среднемассовую молекулярную массу (M_w). В некоторых вариантах реализации средняя молекулярная масса представляет собой любую среднюю молекулярную массу, известную в данной области техники, такую как средневязкостная молекулярная масса (M_v), Z-средняя молекулярная масса (M_z) и т.д. Способы измерения и/или вычисления средней молекулярной массы (например, M_n, M_w, M_v или M_z) известны в данной области техники.

[0100] В определенных вариантах реализации полимеры, имеющие определенное ИК поглощение, особенно подходят для применения в композиции красителя. В некоторых вариантах реализации полимер характеризуется спектром ИК, имеющим следующие пики (±5 см^-1): 3393, 2949, 1726, 1630 и 1540 см^-1. В некоторых вариантах реализации полимер характеризуется спектром ИК, по существу идентичным спектру, показанному на ФИГУРЕ 12. В некоторых вариантах реализации полимер характеризуется спектром ИК, имеющим следующие пики (±5 см^-1): 3393, 2949, 1726, 1630 и 1540 см^-1, или спектром ИК, по существу идентичным спектру, показанному на ФИГУРЕ 12.

[0101] ¹Н ЯМР является другим спектроскопическим способом определения характеристик полимера. В некоторых вариантах реализации полимер имеет спектр ¹Н ЯМР такой, как показан на ФИГУРЕ 9. В некоторых вариантах реализации композиция красителя содержит полимер, где спектр ¹Н ЯМР полимера по существу идентичен спектру, приведенному на ФИГУРЕ 9. В некоторых вариантах реализации полимер имеет спектр ¹Н ЯМР, по существу идентичный спектру, приведенному на ФИГУРЕ 9, и/или спектр ИК, по существу идентичный спектру, приведенному на ФИГУРЕ 12.

[0102] Масс-спектрометрия является другим способом определения характеристик полимера. В некоторых вариантах реализации полимеры, содержащие фрагменты в анализе МС, имеющие отношение m/e, составляющее 701 и/или 475, применяют в композициях синего красителя. В некоторых вариантах реализации композиция красителя содержит полимер, характеризующийся наличием фрагмента в анализе МС с отношением (m/e), составляющим 701 или 475. В некоторых вариантах реализации полимер характеризуется наличием фрагментов в анализе МС, имеющих отношение (m/e), составляющее 701 и 405. В некоторых вариантах реализации фрагменты в анализе МС с отношениями (m/e) 701 и 405 соответствуют левому и правому фрагментам, изображенным на формуле 9, соответственно.

[0103] В некоторых вариантах реализации полимер характеризуется наличием фрагментов в анализе МС, имеющих отношение (m/e), составляющее 701 и 405, а также имеет спектр ¹Н ЯМР, по существу идентичный спектру, приведенному на ФИГУРЕ 9. В некоторых вариантах реализации полимер дополнительно характеризуется спектром ИК, по существу идентичным спектру, приведенному на ФИГУРЕ 12. В некоторых вариантах реализации полимер характеризуется массовым спектром, по существу идентичным спектру, показанному на ФИГУРЕ 11. В некоторых вариантах реализации композиция красителя по существу не содержит первое дополнительное соединение формулы 6, 7 или 8.

Чистота полимера

[0104] В определенных вариантах реализации подходящие полимеры включают, например, полимеры, описанные в настоящей заявке, имеющие определенную степень чистоты. В некоторых вариантах реализации композиция красителя содержит полимер формулы 4, где композиция красителя по существу не содержит первое дополнительное соединение, выбранное из группы, состоящей из соединений формулы 6, формулы 7, формулы 8, их геометрических изомеров, таутомеров и солей. В некоторых вариантах реализации композиция красителя по существу не содержит первое дополнительное соединение, выбранное из группы, состоящей из соединений формулы 2', формулы 3'А, формулы 3'В, их геометрических изомеров, таутомеров и солей. В некоторых вариантах реализации композиция красителя по существу не содержит первое дополнительное соединение, выбранное из группы, состоящей из соединений формулы 2, формулы 3'А (Me), формулы (3'В), их геометрических изомеров, таутомеров и солей:

.

[0105] В некоторых вариантах реализации общая масса первого дополнительного соединения составляет менее 4,5%, менее 4%, менее 3%, менее 2%, менее 1%, менее 0,5%, менее 0,1% или менее 0,01% относительно массы полимера. В некоторых вариантах реализации общая масса первого дополнительного соединения составляет менее 1% относительно массы полимера. В некоторых вариантах реализации общая масса первого дополнительного соединения составляет менее 0,1% относительно массы полимера. В других вариантах реализации общая масса первого дополнительного соединения составляет менее 0,01% относительно массы полимера. В некоторых вариантах реализации композиция красителя не содержит первое дополнительное соединение. В некоторых вариантах реализации общая масса первого дополнительного соединения составляет 0,01-5%, 0,01-4,5%, 0,01-4%, 0,01-3%, 0,01-2%, 0,01-1%, 0,01-0,5% или 0,01-0,1% относительно массы полимера.

[0106] В некоторых вариантах реализации композиция красителя содержит полимер формулы 4, где композиция красителя по существу не содержит второе дополнительное соединение, выбранное из группы, состоящей из соединений формулы 1А, формулы 1В, их геометрических изомеров, таутомеров и солей:

.

[0107] В некоторых вариантах реализации общая масса второго дополнительного соединения составляет менее 1% относительно массы полимера. В некоторых вариантах реализации общая масса второго дополнительного соединения составляет менее 0,1% относительно массы полимера. В других вариантах реализации общая масса второго дополнительного соединения составляет менее 0,01% относительно массы полимера. В некоторых вариантах реализации композиция красителя не содержит второе дополнительное соединение. В некоторых вариантах реализации общая масса второго дополнительного соединения составляет 0,01-5%, 0,01-4,5%, 0,01-4%, 0,01-3%, 0,01-2%, 0,01-1%, 0,01-0,5% или 0,01-0,1% относительно массы полимера.

[0108] В некоторых вариантах реализации композиция красителя, по существу не содержащая первое дополнительное соединение, также по существу не содержит второе дополнительное соединение. Подходящее содержание первого или второго дополнительного соединения в процентах по массе относительно массы полимера описано в настоящей заявке. В некоторых вариантах реализации суммарная масса первого и второго дополнительного соединения составляет менее 5% (например, менее 4,5%, менее 4%, менее 3%, менее 2%, менее 1%, менее 0,5%, менее 0,1%, менее 0,01%) относительно массы полимера. В некоторых вариантах реализации композиция красителя не содержит первое и второе дополнительное соединение. В некоторых вариантах реализации общая масса первого и второго дополнительного соединения составляет 0,01-5%, 0,01-4,5%, 0,01-4%, 0,01-3%, 0,01-2%, 0,01-1%, 0,01-0,5% или 0,01-0,1% относительно массы полимера.

[0109] В некоторых вариантах реализации композиция красителя содержит полимер формулы 4, по существу не содержащий соединения, отличные от полимера, имеющие длину волны максимального поглощения (λ_max) в диапазоне 580-610 нм. В некоторых вариантах реализации общая масса соединений, отличных от полимера, имеющих длину волны максимального поглощения (λ_max) в диапазоне 580-610 нм, составляет менее 5% (например, менее 4,5%, менее 4%, менее 3%, менее 2%, менее 1%, менее 0,5%, менее 0,1%, менее 0,01%) относительно массы полимера. В некоторых вариантах реализации композиция красителя не содержит соединения, отличные от полимера, имеющие длину волны максимального поглощения (λ_max) в диапазоне 580-610 нм. В некоторых вариантах реализации общая масса соединений, отличных от полимера, имеющих длину волны максимального поглощения (λ_max) в диапазоне 580-610 нм, составляет 0,01-5%, 0,01-4,5%, 0,01-4%, 0,01-3%, 0,01-2%, 0,01-1%, 0,01-0,5%) или 0,01-0,1% относительно массы полимера.

[0110] Определенные варианты реализации относятся к по существу очищенному полимеру формулы 4, его геометрическому изомеру, таутомеру или соли.

[0111] В некоторых вариантах реализации по существу очищенный полимер содержит:

,

геометрический изомер, таутомер или соль указанного полимера,

где n представляет собой целое число от 2 до 20;

каждый А представляет собой фрагмент формулы 5'А (Me), его геометрический изомер, таутомер или соль:

,

причем Т¹ представляет собой водород или метальную группу, и Т² представляет собой водород или А-Т¹, где А и Т¹ определены выше. В некоторых вариантах реализации по существу очищенный полимер характеризуется средней молекулярной массой, описанной в настоящей заявке (например, среднечисловой молекулярной массой (M_n), составляющей примерно 6000). В некоторых вариантах реализации по существу очищенный полимер характеризуется спектром ИК, описанным в настоящей заявке (например, спектром ИК, имеющим следующие пики (±5 см^-1): 3393, 2949, 1726, 1630 и 1540 см^-1). В некоторых вариантах реализации композиция красителя содержит полимер формулы 4, где композиция красителя не содержит или по существу не содержит углеводы, например, сахара. В некоторых вариантах реализации композиция красителя не содержит углеводы и имеет чистоту по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% свободна от других примесей, например, мономеров, димеров, жирных кислот, жиров, белков или органических кислот.

Способ получения очищенного полимера

[0112] В определенных вариантах реализации полимеры согласно настоящему изобретению получают путем взаимодействия производного генипина (например, генипина) с амином (например, глицином), как предложено на схеме 1. В некоторых вариантах реализации очищенные полимеры получают путем очистки реакционной смеси, состоящей из производного генипина (например, генипина) и амина (например, глицина), как предложено на схеме 1.

[0113] В некоторых вариантах реализации полимер получают путем взаимодействия генипина с амином. В некоторых вариантах реализации полимер получают путем взаимодействия генипина с первичным алкиламином (например, с метиламином, этиламином, пропиламином или другими первичными C_1-10 аминами). В некоторых вариантах реализации полимер получают путем взаимодействия генипина со вторичным амином (например, с изопропиламином или другими вторичными C_1-10 аминами). В некоторых вариантах реализации полимер получают путем взаимодействия генипина с аминокислотой (например, с глицином, аланином, валином, лейцином, изолейцином, лизином, тирозином, метионином, пролином, фенилаланином и т.д.). В некоторых вариантах реализации полимер получают путем взаимодействия генипина с глицином.

[0114] В некоторых вариантах реализации генипин представляет собой очищенный генипин или сок, содержащий генипин. В некоторых вариантах реализации полимер согласно настоящему изобретению представляет собой продукт взаимодействия очищенного генипина (например, более 80%, 85%, 90%, 95% или 99% по массе) с глицином. В некоторых вариантах реализации полимер согласно настоящему изобретению представляет собой очищенный продукт взаимодействия глицина с соком, содержащим генипин. В некоторых вариантах реализации сок, содержащий генипин, представляет собой плодовый сок. В некоторых вариантах реализации плодовый сок выделен из Genipa americana.

[0115] В некоторых вариантах реализации глицин представляет собой очищенный глицин. В некоторых вариантах реализации глицин представляет собой смесь, содержащую глицин (например, сок, содержащий глицин, или сухую смесь, содержащую глицин, такую как концентрат сока, содержащий глицин). В некоторых вариантах реализации глицин представляет собой сок, содержащий глицин (например, плодовый сок, такой как сок, выделенный из арбуза, белого винограда, ананаса, личи, мускусной дыни, банана, апельсина, яблока, груши, лимона, маракуйи, красного винограда, черники, тамаринда, персика, папайи, асаи, сливы, гуавы, мандарина, борохо, купуасу, годжи или киви). В некоторых вариантах реализации глицин представляет собой сок, содержащий глицин, где сок получен из арбуза. В некоторых вариантах реализации глицин представляет собой сок, содержащий глицин, где сок получен из свежего арбуза.

[0116] В некоторых вариантах реализации полимер получают путем взаимодействия сока, полученного из арбуза, с генипином. В некоторых вариантах реализации полимер получают путем взаимодействия сока, полученного из арбуза, с соком, полученным из Genipa americana. В некоторых вариантах реализации полимер получают путем взаимодействия сока, полученного из арбуза, с очищенным генипином (например, более 80%, 85%, 90%, 95% или 99% по массе).

[0117] Определенные варианты реализации относятся к способу выделения полимеров из реакционной смеси, состоящей из генипина с амином. В некоторых вариантах реализации способ включает (а) экстракцию синей смеси, полученной в результате взаимодействия генипина с амином, с использованием растворителя (например, метанола) с получением растворимой фракции и нерастворимой фракции; и (b) очистку нерастворимой фракции. В некоторых вариантах реализации стадия очистки (b) включает обработку нерастворимой фракции путем очистки ВЭЖХ.

[0118] Определенные варианты реализации относятся к способу выделения полимеров из реакционной смеси, состоящей из генипина с амином. В некоторых вариантах реализации способ включает (а) экстракцию синей смеси, полученной в результате взаимодействия генипина с глицином, метанолом с получением фракции, растворимой в метаноле, и фракции, не растворимой в метаноле; и (b) очистку фракции, не растворимой в метаноле. В некоторых вариантах реализации синюю смесь получают в результате взаимодействия очищенного генипина (например, более 80%, 85%, 90%, 95% или 99% по массе) с глицином. В некоторых вариантах реализации синюю смесь получают в результате взаимодействия глицина с соком, выделенным из Genipa americana. В некоторых вариантах реализации синяя смесь представляет собой сухой порошок (например, лиофилизированный порошок), полученный в результате взаимодействия генипина с глицином. В некоторых вариантах реализации стадия очистки включает обработку нерастворимой фракции путем очистки ВЭЖХ. В некоторых вариантах реализации очистка ВЭЖХ представляет собой очистку путем обращенно-фазовой ВЭЖХ. В некоторых вариантах реализации стадия очистки (b) схожа со стадией очистки, предложенной в разделе Примеры. В некоторых вариантах реализации способ очистки обеспечивает очищенный полимер, описанный в настоящей заявке.

[0119] В некоторых вариантах реализации продукт, представляющий собой краситель, получают при помощи способов, описанных в настоящей заявке. В некоторых вариантах реализации продукт, представляющий собой краситель, получают путем (а) экстракции синей смеси, полученной в результате взаимодействия генипина с глицином, метанолом с получением фракции, растворимой в метаноле, и фракции, не растворимой в метаноле; и (b) очистки фракции, не растворимой в метаноле, с получением продукта, представляющего собой краситель. В некоторых вариантах реализации синяя смесь представляет собой сухой порошок (например, лиофилизированный порошок), полученный в результате взаимодействия генипина с глицином. В некоторых вариантах реализации продукт, представляющий собой краситель, по существу не содержит любые соединения формулы 6, 7 или 8, предложенные в настоящем описании. В некоторых вариантах реализации продукт, представляющий собой краситель, может быть охарактеризован (а) спектром ЯМР, по существу идентичным тому, что показан на ФИГУРЕ 9; (b) спектром ИК, имеющим следующие пики (±5 см^-1): 3393, 2949, 1726, 1630 и 1540 см^-1; (с) средней молекулярной массой (например, среднечисловой молекулярной массой (M_n)), составляющей примерно 6000; (d) спектром МС, содержащим фрагменты МС 701 и/или 475; или (е) любой комбинацией (a)-(d).

Композиция красителя, по существу не содержащая углеводы

[0120] Определенные варианты реализации относятся к композиции красителя, содержащей очищенный полимер (например, полимер формулы 4), где композиция красителя по существу не содержит углеводы (например, моносахариды, дисахариды, олигосахариды или полисахариды). В некоторых вариантах реализации углевод представляет собой сахар (например, моносахариды и дисахариды). В некоторых вариантах реализации композиция красителя, по существу не содержащая углеводы, также не содержит другие примеси (например, димер формулы 1А, 1В, 2, 3A или 3B). В некоторых вариантах реализации композиция красителя не содержит углеводы, например, композиция красителя не содержит углеводы, которые можно обнаруживать, например, при помощи способа, описанного в примере 7. Термины «углевод» и «сахар» используют в настоящей заявке взаимозаменяемо, если не указаны другие отличия.

[0121] В некоторых вариантах реализации композиция красителя, не содержащая или по существу не содержащая углеводы, включает композиции, содержащие дополнительные материалы, отличные от очищенного полимера, например, мономеры, димеры, жирные кислоты, жиры, белки или органические кислоты. В некоторых вариантах реализации композиция красителя, не содержащая или по существу не содержащая углеводы, дополнительно содержит дополнительное соединение (например, димер формулы 1А, 1В, 2, 3A или 3B, дополнительный краситель (например, окрашивающую добавку, одобренную FDA)). В некоторых вариантах реализации композиция красителя, не содержащая или по существу не содержащая углеводы, также не содержит или по существу не содержит, например, мономеры, димеры (например, димер формулы 1А, 1В, 2, 3A или 3B), дополнительный краситель (например, окрашивающую добавку, одобренную FDA), жирные кислоты, жиры, белки или органические кислоты. В некоторых вариантах реализации композицию красителя, не содержащую или по существу не содержащую углеводы, получают при помощи способа, включающего смешивание очищенного полимера, по существу не содержащего углеводы, с дополнительным соединением (например, с димером формулы 1А, 1В, 2, 3A или 3B, дополнительным красителем (например, окрашивающей добавкой, одобренной FDA)), по существу не содержащим углеводы.

[0122] В некоторых вариантах реализации очищенный полимер получают путем взаимодействия генипина с глицином. В некоторых вариантах реализации очищенный полимер получают путем взаимодействия очищенного генипина (например, более 80%, 85%, 90%, 95%) или 99% по массе) с глицином. В некоторых вариантах реализации очищенный генипин получают из Genipa americana, В некоторых вариантах реализации очищенный полимер получают путем взаимодействия сока, содержащего генипин, с глицином. В некоторых вариантах реализации очищенный полимер получают путем взаимодействия плодового сока (например, сока, выделенного из Genipa americana, сока, выделенного из Genipa americana, обогащенного генипином) с глицином. В некоторых вариантах реализации очищенный полимер получают путем взаимодействия генипина с соком (например, с плодовым соком, таким как сок арбуза и других плодов, описанных в настоящей заявке), содержащим глицин.

[0123] В некоторых вариантах реализации очищенный полимер характеризуется временем удерживания ВЭЖХ, составляющим примерно 10,3 минуты при анализе, например, при помощи способа, описанного в примере 6. В некоторых вариантах реализации очищенный полимер характеризуется повышенным поглощением при 590 нм по сравнению с поглощением при 240 нм. В некоторых вариантах реализации очищенный полимер характеризуется кривой ВЭЖХ, по существу идентичной спектру, приведенному на ФИГУРЕ 13С.

[0124] Определенные варианты реализации относятся к способу получения композиции красителя, по существу не содержащей углеводы. В некоторых вариантах реализации способ включает очистку неочищенной композиции красителя путем колоночной хроматографии (например, гельпроникающей колоночной хроматографии, обращенно-фазовой ВЭЖХ и т.д.); анализ фракций на наличие углеводов (например, путем тонкослойной хроматографии); и сбор фракций, по существу не содержащих углеводы. В некоторых вариантах реализации неочищенную композицию красителя получают путем взаимодействия генипина (например, очищенного генипина, сока, полученного из Genipa americana, сока, обогащенного генипином, сока, полученного из Genipa americana, обогащенного генипином) с глицином. В некоторых вариантах реализации при помощи способа получают композицию, имеющую кривую ВЭЖХ, по существу идентичную спектру, приведенному на ФИГУРЕ 13А, 13В или 13С. В некоторых вариантах реализации при помощи способа получают композицию красителя, имеющую кривую ВЭЖХ, по существу идентичную спектру, приведенному на ФИГУРЕ 13С.

[0125] Определенные варианты реализации относятся к способу получения композиции красителя, не содержащей сахар. В некоторых вариантах реализации способ включает (а) смешивание сока Genipa americana с аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из глицина, валина, лизина, метионина, пролина, тирозина, триптофана и любой их комбинации; (b) удаление сахара из смеси, полученной на стадии (а); и (с) выделение композиции красителя из продукта, не содержащего сахар, полученного на стадии (b), где интенсивность окраски композиции красителя, полученной при помощи указанного способа, превышает, например, по меньшей мере в два раза, интенсивность окраски композиции красителя, полученной из смеси, полученной на стадии (а), из которой не удаляли сахар. В некоторых вариантах реализации интенсивность окраски композиции красителя измеряют по поглощению в УФ-видимой области при определенной длине волны (например, при λ_max композиции красителя, при длине волны в диапазоне 580-610 нм, при длине волны 590 нм и т.д.). В некоторых вариантах реализации содержание полимера представляет собой содержание в % (г/100 г образца), и его определяют путем ВЭЖХ, и интенсивность окраски определяют при помощи спектрофотометра (например, с коэффициентом поглощения 0,6). В некоторых вариантах реализации способ включает удаление сахара (например, из реакционной смеси, состоящей из сока Genipa americana и аминокислоты (например, глицина, валина, лизина, метионина, пролина, тирозина, триптофана или любой их комбинации)) при помощи брожения, колоночной хроматографии (например, гельпроникающей хроматографии, ВЭЖХ), фильтрования с применением обратного осмоса, ультрафильтрования, микрофильтрования, диализа (например, способов диализа с использованием градиента осмотического давления), разделения на смолах (например, разделения на смолах XAD4, XAD7 или XAD8) или любой их комбинации. В определенных вариантах реализации микробиологическая стабильность продуктов брожения увеличивается при удалении сахара, который, например, может упрощать выработку мезофильных микробных агентов, таких как грибки и дрожжи.

[0126] В некоторых вариантах реализации способ включает удаление сахара путем брожения. В некоторых вариантах реализации брожение проводят с применением дрожжей (например, природных дрожжей, генетически модифицированных дрожжей, таких как дрожжи с повышенной эффективностью разложения Сахаров) или бактерий (включая генетически модифицированные бактерии с повышенной эффективностью разложения Сахаров). В некоторых вариантах реализации дрожжи или бактерии являются иммобилизованными (например, прикреплены к твердой подложке; инкапсулированы в микрокапсулы).

[0127] В некоторых вариантах реализации способ получения композиции красителя включает (а) смешивание сока Genipa americana с аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из глицина, валина, лизина, метионина, пролина, тирозина, триптофана и любой их комбинации; (b) стерилизацию смеси, полученной на стадии (а); (с) инокуляцию стерилизованной смеси, полученной на стадии (b), дрожжами или бактериями; (d) инкубацию инокулированной смеси, полученной на стадии (с), в условиях ферментации с получением продукта брожения; и (е) выделение композиции красителя из продукта брожения, полученного на стадии (d), где интенсивность окраски композиции красителя, полученной при помощи указанного способа, превышает, например, по меньшей мере в два раза, интенсивность окраски композиции красителя, полученной из смеси, полученной на стадии (а), в которой не проводили брожение.

[0128] В некоторых вариантах реализации инкубацию на стадии (d) проводят в течение по меньшей мере 6 часов (например, 6-24, 6-18, 6-12, 6-9, 9-24, 9-18, 9-12, 12-24, 12-18 или более 24 часов). В некоторых вариантах реализации инкубацию на стадии (d) проводят в течение менее 6 часов (например, 6, 5, 4, 3, 2, 1, 0,5 часа). Определенные варианты реализации относятся к способу количественной оценки содержания полимера в образце, включающему использование способа ВЭЖХ с применением чистой формы полимера в качестве внешнего стандарта. В некоторых вариантах реализации полимер представляет собой синий полимер, полученный в результате взаимодействия генипина с глицином. В некоторых вариантах реализации чистая форма полимера, применяемая в качестве внешнего стандарта, по существу не содержит углеводы. В некоторых вариантах реализации чистая форма полимера, применяемая в качестве внешнего стандарта, характеризуется кривой ВЭЖХ, по существу идентичной спектру, приведенному на ФИГУРЕ 13С.

Способы получения композиций красителя

[0129] Определенные варианты реализации относятся к способу получения композиции красителя. В некоторых вариантах реализации способ получения композиции красителя включает (а) выделение сока из плода Genipa americana; (b) смешивание сока с первой аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из глицина (GLY), валина (VAL), лизина (LYS), пролина (PRO), метионина (МЕТ), тирозина (TYR) и триптофана (TRP), и второй аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из глицина (GLY), валина (VAL), лизина (LYS), пролина (PRO), метионина (МЕТ), тирозина (TYR) и триптофана (TRP); (с) выделение композиции красителя после стадии (b). Определенные варианты реализации относятся к композициям красителей, содержащим продукт взаимодействия сока из плодов Genipa americana с комбинацией аминокислот, например, с глицином и метионином. В определенных вариантах реализации свежие плоды применяют в течение одного или двух дней после сбора (например, 0-6, 0-12, 0-18, 0-24, 0-36 или 0-48 часов). В других вариантах реализации плоды используют после хранения в условиях заморозки в течение 1,5 недели (например, в течение примерно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 дней) или в течение 2 недель (например, в течение примерно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 или 14 дней). В другом варианте реализации плод является неспелым, например, плод является твердым и имеет однородную кожуру в отличие от спелого плода, который является мягким и имеет неоднородную кожуру. В некоторых вариантах реализации композиция красителя является синей, сине-зеленой, зеленой, фиолетовой, красной или черной.

[0130] В некоторых вариантах реализации способ получения композиции красителя включает (а) смешивание генипина или производного генипина с первой аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из глицина (GLY), валина (VAL), лизина (LYS), пролина (PRO), метионина (МЕТ), тирозина (TYR) или триптофана (TRP), и второй аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из глицина (GLY), валина (VAL), лизина (LYS), пролина (PRO), метионина (МЕТ), тирозина (TYR) или триптофана (TRP), и выделение композиции красителя из указанной смеси. Определенные варианты реализации относятся к композициям красителей, содержащим продукт взаимодействия генипина или производного генипина с комбинацией аминокислот, например, с глицином и метионином. В некоторых вариантах реализации композиция красителя является синей, сине-зеленой, зеленой, фиолетовой, красной или черной.

Композиции пурпурных красителей

[0131] Неспелые плоды Genipa americana являются источником генипина, иридоидного метаболита, который взаимодействует с аминами с образованием продуктов с синей окраской. Генипин присутствует в эндокарпии (мякоти) плодов Genipa americana (джагуа), а остальной плод отбрасывают. Материал мезокарпия (кожуры) джагуа отбрасывают, так как он содержит низкое количество генипина.

[0132] Определенные варианты реализации относятся к способу получения композиции пурпурного красителя. В некоторых вариантах реализации способ получения композиции пурпурного красителя включает (а) выделение мезокарпия из плодов Genipa americana; (b) получение экстракта сока из мезокарпия; (с) смешивание экстракта сока с глицином; (d) нагревание смеси сока с глицином, полученной на стадии (с); и (е) выделение композиции пурпурного красителя после стадии (d). В некоторых вариантах реализации нагревание на стадии (d) проводят в течение по меньшей мере 90 минут (например, в течение периода времени от 90 минут до примерно 3, 4, 5 или 6 часов или более 6 часов). Согласно настоящему описанию «мезокарпий» относится к кожуре плода, например, плода Genipa americana. В определенных вариантах реализации свежие плоды применяют в течение одного или двух дней после сбора (например, в течение примерно 0-6, 0-12, 0-18, 0-24, 0-36 или 0-48 часов). В других вариантах реализации плоды применяют после хранения в условиях заморозки в течение 1,5 недели (например, в течение примерно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 дней) или 2 недель (например, в течение примерно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 или 14 дней). В другом варианте реализации плод является неспелым, например, плод является твердым и имеет однородную кожуру в отличие от спелого плода, который является мягким и имеет неоднородную кожуру.

[0133] Определенные варианты реализации относятся к композициям красителей, содержащим продукт взаимодействия водного экстракта, содержащего производное генипина, с амином (например, с аминокислотой, такой как глицин, валин, пролин, лизин, триптофан, тирозин или метионин). В некоторых вариантах реализации водный экстракт, содержащий производное генипина, получают при помощи способа, включающего (а) выделение мезокарпия из плодов Genipa americana; и (b) экстракцию мезокарпия водой. В некоторых вариантах реализации композиция красителя представляет собой композицию пурпурного красителя, содержащую продукт, полученный из водного экстракта мезокарпия из плодов Genipa americana и глицина. В некоторых вариантах реализации водный экстракт содержит менее 20%, 15%, 10%, 5%, 3%, 2%, 1%, 0,5% или 0,1% генипина согласно данным AUC (площади под кривой в спектре ВЭЖХ). В некоторых вариантах реализации аминокислота представляет собой глицин. В некоторых вариантах реализации продукт получают путем смешивания водного экстракта мезокарпия из плодов Genipa americana с глицином и последующего нагревания смеси, где водный экстракт предварительно не нагревают. В некоторых вариантах реализации композиция красителя содержит предшественник генипина, содержащий (+)-генипозид или предшественник генипина, представляющий собой В-гликозид иридоида, который получают из мезокарпия (кожуры) из плодов Genipa americana.

[0134] Генипозид представляет собой гликозид генипина. Генипозид обладает кинетикой и химическими свойствами, отличающимися от генипина. Глюкоза является частью структуры генипозида.

[0135] Глюкоза присутствует в соке Genipa americana в составе мякоти (эндокарпия) в виде свободной глюкозы. Тем не менее, генипин присутствует в эндокарпии, что приводит к получению синего красителя в результате взаимодействия с глицином. Взаимодействие глицина с генипозидом, содержащимся в мезокарпии, приводит к получению пурпурного красителя.

[0136] Определенные варианты реализации относятся к способу получения композиции красителя, включающему (а) выделение мезокарпия плодов Genipa americana; (b) выделение генипозида из мезокарпия; (с) смешивание генипозида с аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из глицина (GLY), валина (VAL), лизина (LYS), пролина (PRO), метионина (МЕТ), тирозина (TYR), триптофана (TRP) или любой их комбинации; и (d) выделение композиции красителя после стадии (с). В некоторых вариантах реализации генипозид стабилизируют путем лиофилизирования или сверхбыстрого замораживания. В некоторых вариантах реализации композиция красителя является пурпурной.

Композиции зеленых и черных красителей

[0137] Определенные варианты реализации относятся к способу получения композиции зеленого или черного красителя. Взаимодействие сока Genipa americana с различными аминокислотами приводит к получению продуктов различной окраски, например, синей (GLY и LYS), сине-зеленой (VAL, МЕТ и TYR), зеленой (TRP) и черной (PRO). Некоторые варианты реализации относятся к способу получения композиции черного красителя, включающему (а) получение экстракта сока из плодов Genipa americana; (с) смешивание экстракта сока с пролином; и (е) выделение композиции черного красителя, полученной на стадии (с). Некоторые варианты реализации относятся к способу получения композиции зеленого красителя, включающему (а) получение экстракта сока из плодов Genipa americana; (с) смешивание экстракта сока с триптофаном; и (е) выделение композиции зеленого красителя, полученной на стадии (с).

Применение композиций красителей, содержащих полимер и/или димер

[0138] Определенные варианты реализации относятся к применению очищенного полимера (например, полимера формулы 4, его геометрического изомера, таутомера или соли или полимера (например, полимера, полученного в результате взаимодействия генипина с глицином), по существу не содержащего углеводы) или очищенного димера (например, по существу чистого соединения №1, 2, 3 или по существу чистого соединения формулы 1А, 1В, 2, 3'А (Me), 3'В (Me) или их комбинации) для придания синей окраски субстрату (например, продукту питания, косметическому средству, лекарственному средству или нутрицевтическому продукту, текстильному продукту или устройству, такому как медицинское устройство).

[0139] В некоторых вариантах реализации способ придания синей окраски субстрату (например, продукту питания, косметическому средству, лекарственному средству или нутрицевтическому продукту, текстильному продукту или устройству, такому как медицинское устройство) включает приведение в контакт субстрата с композицией красителя, содержащей очищенный полимер (например, полимер формулы 4, его геометрический изомер, таутомер или соль, или полимер (например, полимер, полученный в результате взаимодействия генипина с глицином), по существу не содержащий углеводы) или очищенный димер (например, по существу чистое соединение №1,2, 3 или по существу чистое соединение формулы 1А, 1В, 2, 3'А (Me), 3'В (Me)), композицией красителя, описанной в настоящей заявке или с любой их комбинацией. В некоторых вариантах реализации композиция красителя содержит полимер формулы 4, его геометрический изомер, таутомер или соль. В некоторых вариантах реализации композиция красителя содержит димер. В некоторых вариантах реализации димер представляет собой по существу очищенное соединение формулы 1А, 1B, 2, 3'А (Me) или 3'В (Me). В некоторых вариантах реализации композицию красителя получают при помощи способа смешивания соединения формулы 1А, 1В, 2, 3'А (Me) или 3'В (Me) с любым из полимеров, предложенных в настоящем описании. В некоторых вариантах реализации композицию красителя получают путем смешивания полимера или димера, предложенного в настоящем описании, с окрашивающей добавкой (например, окрашивающей добавкой, одобренной FDA). В некоторых вариантах реализации субстрат представляет собой продукт питания. В некоторых вариантах реализации субстрат представляет собой медицинское устройство. В некоторых вариантах реализации субстрат представляет собой лекарственный продукт. В некоторых вариантах реализации субстрат представляет собой нутрицевтический продукт. В некоторых вариантах реализации субстрат представляет собой косметический продукт.

[0140] Определенные варианты реализации относятся к пищевому продукту, содержащему продукт питания и композицию красителя, предложенную в настоящем описании (например, композицию красителя, содержащую очищенный полимер, предложенный в настоящем описании, или композицию красителя, содержащую очищенный димер, предложенный в настоящем описании). Продукт питания может представлять собой твердый продукт питания или жидкий продукт питания. В некоторых вариантах реализации продукт питания представляет собой молочный продукт, хлебобулочное изделие, безалкогольный напиток, кондитерское изделие (например, конфету или зерновой батончик и т.д.) или напиток. В некоторых вариантах реализации продукт питания представляет собой напиток. В некоторых вариантах реализации продукт питания представляет собой газированный напиток. В некоторых вариантах реализации предназначен для употребления человеком. В некоторых вариантах реализации продукт питания представляет собой продукт питания для животных, такой как корм для домашних животных (например, корм для кошек, корм для собак или т.д.) или корм для сельскохозяйственных животных (например, корм для коров). В некоторых вариантах реализации продукт питания представляет собой питательное вещество для растений, такое как удобрение. В некоторых вариантах реализации продукт питания представляет собой однопорционный продукт питания, такой как однопорционный йогурт, пудинг, суп и т.д.

[0141] Определенные варианты реализации относятся к лекарственному продукту, содержащему лекарственное средство (например, лекарственное средство, одобренное FDA) и композицию красителя, предложенную в настоящем описании (например, композицию красителя, содержащую очищенный полимер, предложенный в настоящем описании, или композицию красителя, содержащую очищенный димер, предложенный в настоящем описании). В некоторых вариантах реализации лекарственное средство выполнено в виде жидкой лекарственной формы. В некоторых вариантах реализации лекарственное средство выполнено в виде твердой лекарственной формы. В некоторых вариантах реализации лекарственное средство выполнено в виде лекарственной формы, выбранной из группы, состоящей из таблеток, желатиновых капсул, шариков, гранул, пилюль, драже, пастилок, мазей, капсул, порошков, жидкостей, гелей, сиропов, взвесей и суспензий. В некоторых вариантах реализации лекарственное средство выполнено в виде сиропа.

[0142] Определенные варианты реализации относятся к нутрицевтическому продукту (например, к витаминам, витаминным добавкам или диетическим смесям и наборам), содержащему нутрицевтическое средство и композицию красителя, предложенную в настоящем описании (например, композицию красителя, содержащую очищенный полимер, предложенный в настоящем описании, или композицию красителя, содержащую очищенный димер, предложенный в настоящем описании). В некоторых вариантах реализации нутрицевтическое средство выполнено в виде жидкой лекарственной формы. В некоторых вариантах реализации нутрицевтическое средство выполнено в виде твердой лекарственной формы. В некоторых вариантах реализации нутрицевтическое средство выполнено в виде лекарственной формы, выбранной из группы, состоящей из таблеток, желатиновых капсул, шариков, гранул, пилюль, драже, пастилок, мазей, капсул, порошков, жидкостей, гелей, сиропов, взвесей и суспензий. В некоторых вариантах реализации нутрицевтическое средство выполнено в виде таблетки или желатиновой капсулы.

[0143] Определенные варианты реализации относятся к косметическому продукту, содержащему косметическое средство и композицию красителя, предложенную в настоящем описании (например, композицию красителя, содержащую очищенный полимер, предложенный в настоящем описании, или композицию красителя, содержащую очищенный димер, предложенный в настоящем описании). В некоторых вариантах реализации косметическое средство представляет собой средство для ванн, такое как гель для душа, гель для ванн или мыло. В некоторых вариантах реализации косметическое средство может представлять собой продукт для макияжа век и лица, полировки ногтей, губную помаду или татуировку. В некоторых вариантах реализации косметическое средство может представлять собой продукт для ухода за полостью рта (например, жидкость для полоскания рта, зубной гель или зубную пасту). В некоторых вариантах реализации косметическое средство может представлять собой продукт для ухода за кожей (например, кондиционер для ухода за кожей, гель (например, гель для рук), лосьон и крем или маску). В некоторых вариантах реализации косметическое средство может представлять собой продукт для бритья (например, крем для бритья). В некоторых вариантах реализации косметическое средство может представлять собой продукт для ухода за волосами (например, продукты для окрашивания волос).

[0144] Определенные варианты реализации относятся к медицинскому устройству, окрашенному с применением композиции красителя, предложенной в настоящем описании (например, композиции красителя, содержащей очищенный полимер, предложенный в настоящем описании, или композиции красителя, содержащей очищенный димер, предложенный в настоящем описании). В некоторых вариантах реализации медицинское устройство представляет собой хирургическое устройство (например, хирургические нити, ножницы, перчатки и т.д.).

[0145] Определенные варианты реализации относятся к текстильному продукту, окрашенному с применением композиции красителя, предложенной в настоящем описании.

[0146] В определенных вариантах реализации количество композиции красителя, вводимой в состав пищевого продукта, косметического продукта, лекарственного продукта, медицинского устройства или текстильного продукта, зависит от желаемой конечной окраски. В некоторых вариантах реализации пищевой продукт, косметический продукт, лекарственный продукт, медицинское устройство или текстильный продукт содержит композицию красителя, предложенную в настоящем описании, отдельно или совместно с другим красителем в количестве, которое является эффективным для придания пищевому продукту, косметическому продукту, лекарственному продукту или медицинскому устройству цвета, выбранного из группы, состоящей из светло-синего, синего Военно-воздушных сил США, Air Superiority Blue, голубого Элис, лазури, детского голубого, голубого Франции, синего, сине-серого, цвета воды пляжа Бопди, голубого Брандейского университета, голубого Кембриджского университета, голубого университета Северной Каролины, небесного (celeste), небесно-голубого (cerulean), кобальта синего, голубого Колумбийского университета, васильково-синего, светло-голубого (Cyan), темно-синего, глубокого небесно-голубого, джинсово-синего, голубого Доджерс, синего университета Дьюка, египетского синего, электрического синего, голубого Итонского колледжа, сизого (Glaucous blue), электрического индиго, индиго, международного синего Кляйна, ириса, светло-синего, синего Мажореля, голубого майя, умеренного синего, полуночного синего, флотского синего, нефотографического синего (Non-Photo Blue), Оксфордского синего, палатината голубого, барвинка, персидского синего, фталоцианинового синего, зеленовато-голубого (Powder Blue), берлинской лазури, королевского синего, синего сапфира, стального голубого, чиркового, голубого Тиффани, настоящего синего, голубого Тафтса, бирюзового, синего Калифорнийского университета Лос-Анджелеса, ультрамарина, фиолетово-синего, синего Йельского университета и кобальтовой сини. Эффективность композиции красителя можно определять путем сравнения (например, визуального сравнения) желаемой окраски (например, светло-синей) с продуктом или устройством, окрашенным количеством композиции красителя.

[0147] Несмотря на то, что в описании приведены предпочтительные варианты реализации настоящего изобретения, можно проводить дополнительные изменения формы и расположения элементов, не отходя от идей и основных принципов, охваченных формулой изобретения.

ПРИМЕРЫ

Пример 1. Выделение генипина из сока Genipa americana

[0148] Твердое вещество (900 грамм), лиофилизированное (высушенное путем сублимации) из 10 литров зеленого сока Genipa americana, экстрагировали в аппарате Сокслета дихлорметаном; полученный растворитель выпаривали при пониженном давлении с получением коричневого остатка (240 г); аликвоту массой 1 г отделяли путем эксклюзионной хроматографии по размеру с использованием в качестве подвижной фазы смеси гексан/метанол/дихлорметан (2:2:1), в результате чего были получены четыре конечных фракции; генипин был идентифицирован в одной из фракций с помощью тонкослойной хроматографии и путем сравнения с ранее известным образцом генипина. Фракцию, содержащую генипин, очищали несколько раз на хроматографической колонке с силикагелем и с применением подвижной фазы гексан/этилацетат, пока не был получен чистый продукт (200 мг генипина) в соответствии со спектром ЯМР.

Пример 2. Взаимодействие генипина с глицином

[0149] Глицин (2 г), растворенный в воде (200 мл), нагревали до 70°. Затем добавляли генипин (5 г) в метаноле (10 мл) и смесь взбалтывали в течение четырех часов. Реакционную смесь лиофилизировали (сушили путем сублимации) и синий порошок экстрагировали этилацетатом для удаления избытка генипина и других слабо полярных компонентов.

Пример 3. Фракционирование компонентов

[0150] Синий порошок (5,7 г) экстрагировали метанолом (5×100 мл), полученный растворитель выпаривали при пониженном давлении и получали синюю смолу (2,2 г). Синюю смолу, растворенную в 90% метаноле, разделяли с помощью Sephadex® LH 20 (метанольная подвижная фаза) с получением четырех фракций, которые были обозначены (для целей настоящей заявки) как S1 (1,5 г), S2 (0,3 г), S3 (100 мг) и S4 (5 мг).

[0151] Фракцию S1 отделяли с использованием адсорбционной смолы (Amberlite© XAD-7), используя сначала 15% этанол и заканчивая чистой водой. Отделяли три фракции с идентичными спектрами ИК и ЯМР. Объединяли три фракции, в которых определяли наличие полимера.

[0152] Фракцию S2 разделяли с использованием адсорбционной смолы (Amberlite® XAD-7), используя сначала 15% этанол и заканчивая 95% этанолом. Из S2 были получены четыре субфракции. Эти субфракции из S2 были обозначены (для задач настоящей патентной заявки) как M2S1R, M2S2R, M2S3R и M2S4R. M2S1R была разделена на колонке RP-C18 несколько раз с применением различных подвижных фаз (смеси этанол-вода и метанол-вода) до получения двух соединений, при этом одно из этих двух соединений было обозначено как соединение №1 (7 мг). Спектроскопические характеристики соединения №1 (ФИГУРА 5):

[0153] ¹H-ЯМР (400 МГц, D₂O). δ 8,77, 8,53, 7,54, 5,30-4,95, 3,94, 2,25, 1,66 ppm.

[0154] ¹³С ЯМР (100 МГц). δ 170,0, 164,16, 157,80, 157,44, 148,29, 146,41, 139,76, 137,83, 124,16, 63,35, 62,6, 56,19, 53,89. 17,43, 14,93 ppm.

[0155] Дополнительный анализ соединения №1 показал следующее:

[0156] В ¹Н ЯМР отображается несколько сигналов: два ароматических протона как синглеты при δ 8,77 и 8,53, винильные протоны при 7,54, синглет при 4,95, (2Н) и три синглета, интегрированных для 3Н, каждый при 3,94 (ОСН₃), 2,25 (винильная метильная группа) и 1,66.

[0157] JMOD-исследование показало следующие сигналы: три метальные группы при 14,93, 17,43 и 53,89, один метилен при 62,68, приписываемый метилену, полученному от глицина, три метина при 157,44, 146,41, 137,83 и, наконец, семь четвертичных атомов углерода при 170,00 (карбоксильные), 164,16 (карбонил сложного метилового эфира), 157,80, 148,29, 139,76, 124,16 и 53,89. Таким образом, фрагмент генипина и остаток глицина сохранились, но молекула теперь является ароматической с остатком пиридила согласно расположению протонов и атомов углерода в спектрах ЯМР. Однако, в структуре появилась новая метальная группа, и ее расположение было установлено на основании исследований JMOD, HMQC и НМВС. Таким образом, исследование COSY 1Н-1Н показало наличие аллильной связи между метальной группой при 2,25 и винильным протоном при 7,54; в НМВС-исследовании этот протон показал 3J взаимодействие с этим метилом (157,44 в ¹³С ЯМР) и алифатической метальной группой при 14,93 (1,66 в ¹Н ЯМР), что, в свою очередь, устанавливает корреляцию с четвертичным атомом углерода при 53,89 и ароматической группой при 157,80 и 148,29. Другие обнаруженные дальние взаимодействия представляли собой: N-CH2 (62,68) с обоими ароматическими протонами при 8,77 и 8,53, и первого из указанных с карбонилом сложного метилового эфира. Наконец, МС-анализ выявил m/z 522 [М⁺+Н], что указывает на симметричную димерную молекулу, как показано на ФИГУРАХ 1А-В и 2А-В. Было установлено, что соединяющая мостиковая связь между мономерами присутствует между С-8 и С-8' атомами углерода, поскольку метальная группа проявляется как синглет, взаимно связанный с другой метальной группой, в НМВС-исследовании. Существуют два возможных изомера, такие, как имеющие формулу 1А и 1В (см. ФИГУРЫ 1А, 1B, 2А и 2В).

[0158] Фракцию S3 разделяли путем хроматографии на Sephadex® с использованием 95% метанола в качестве подвижной фазы с получением четырех фракций S3, обозначенных для задач настоящей патентной заявки как S31, S32, S33 и S34. Фракцию S33 разделяли несколько раз путем обращенно-фазовой хроматографии на колонке RP-C18 с применением различных подвижных фаз (смеси этанол-вода и метанол-вода) до получения соединения, которое было обозначено как соединение №3 (4 мг). Спектроскопические характеристики соединения №3 (ФИГУРА 6):

[0159] ¹Н-ЯМР (400 МГц, D₂O). δ 8,6, 8,0, 7,9, 6,7, 3,90, 1,8 ppm.

[0160] ¹³С ЯМР (100 МГц). δ 172,2, 166,3, 138,8, 135,6, 135,1, 133,3, 131,4, 127,1, 120,46, 118,9, 61,0, 53,3, 11,2 ppm.

[0161] m/z 505 [M+H]

[0162] Дальнейший анализ соединения №3 показал следующее:

[0163] Масс-спектр соединения 3 показывает m/z=505 [М+Н]⁺ согласно масс-спектрометрии, что указывает на изомер описанного ранее соединения. Тем не менее, спектры ¹Н и ¹³С ЯМР очень отличались от него. В протонных спектрах были обнаружены следующие синглеты: δ 8,0, δ 7,9 и δ 6,7 (2Н каждый) и один дополнительный синглет при δ 8,6, интегрированный для 1Н. Другие сигналы представляли собой синглет при δ 4,7 (N-CH2) и две метальные группы при δ 3,9 (ОСН₃) и δ 1,8 (СН₃ винил). Согласно JMOD-исследованию, также наблюдались следующие атомы углерода: карбоксильная группа при δ 172,2, сложный метиловый эфир при δ 166,3, (СООН), пять четвертичных атомов углерода при δ 138,8, δ 135,1, δ 127,1, δ 120,4, δ 118,9, четыре метина при δ 135,6, δ 133,3, δ 131,4, δ 131,4, один метилен (N-СН₂) при δ 61,0 и две метальные группы при δ 53,3 (ОСН₃) и δ 11,2 (СН₃ винил). Структура каждого мономерного звена была установлена согласно НМВС-исследованию: сигналы при δ 7,9 и δ 8,0 были отнесены к протонам пиридильной группы, так как была обнаружена корреляция в широком диапазоне с N-метиленовой группой при δ 61,0; кроме того, последний протон показывает ³J взаимодействие с карбонилом сложного метилового эфира при δ 172,2. Кроме того, было показано другое важное взаимодействие между синглетом при δ 131,4 (С-7) и протонами метильной группы. Небольшое количество ароматических и винильных протонов указывает на присутствие симметричной димерной молекулы, такой, как показано па ФИГУРАХ 3A-В. К этой молекуле могут быть отнесены две структуры в зависимости от относительной ориентации группы сложного метилового эфира (ФИГУРЫ 3A-В), но структура 3B имеет низкую вероятность из-за стерических затруднений.

Пример 4. Очистка фракции, не растворимой в метаноле

[0164] Компоненты, не растворимые в метаноле, разделяли с использованием Sephadex LH-20, элюируя смесью МеОН-вода, и собирали субфракции i1 (3,1 г) и i2 (100 мг). Субфракцию i2 разделяли несколько раз на колонке RP-C18, элюируя смесью МеОН/вода, с получением чистого соединения №2 (25 мг). Было показано, что соединение 2 имеет структуру формулы 2.

[0165] Субфракцию i1 разделяли на две основные фракции на колонке RP-C18. Тем не менее, две фракции имели идентичные спектры ИК и ЯМР, и их объединяли с получением очищенного полимера. Схематическая структура очищенного полимера показана на ФИГУРЕ 8.

[0166] Анализ ЯМР, ИК и масс-спектроскопии очищенного полимера показал следующее:

[0167] Спектр ИК (ФИГУРА 12) показал полосы, которые можно отнести к карбоновой кислоте (3393 см^-1), алифатическому СН (2949), сложному эфиру (1726) и ароматической пиридиниевой системе (1630, 1540).

[0168] Были построены характерные кривые ¹Н и ¹³С ЯМР небольших синих молекул, в частности димеров, выделенных и идентифицированных ранее, и генипина. Спектр ¹Н ЯМР (ФИГУРА 9) имел следующие сигналы: δ 9,50 (мостиковый протон при двойной связи), δ 8,00-9,00 (ароматические производные пиридина или сопряженные двойные связи), δ 5,0-7,0 (двойная связь в циклопентановом кольце), δ 5,0-4,5 (CH₂, присоединенный к четвертичному атому азота), δ 3,8-4,1 (ОСН₃), δ 1,5-2,3 (СН₃). Спектр ¹³С ЯМР имел сигналы при δ 160-175 (карбоксильная и сложноэфирная группы), δ 150,0-120,0 (ароматические и/или двойные связи), δ 60,0-62,0 (СН₂, присоединенный к четвертичному атому азота), δ 50,0-55,0 (ОСН₃), δ 42,0-48,0 (СН₂) и, наконец, δ 10,0-15,0 (СН₃).

[0169] Затем получали спектры ¹Н-¹³С ЯМР в твердой фазе (ФИГУРА 10) и детектировали характеристические полосы или пики: карбонила, ароматики, двойных связей, N-метилена, метокси и метиленовых групп. Сигналы метальных групп или экзоциклических метиленов отсутствовали, что указывает на участие исходного экзоциклического метилена (или гидрометильной группы) в процессе полимеризации.

[0170] Анализ ВЭЖХ/MALDI показывал, что очищенный полимер имел молекулярную массу примерно 6000, что соответствовало примерно 12 димерным звеньям. Обнаруживали фрагменты МС, соответствующие m/e 701 и 475, см. структуру, показанную на формуле 9.

Пример 5. Взаимодействие сока Genipa americana с глицином

[0171] Неочищенный жидкий сок (100 мл) смешивали с глицином (0,8 г, количество глицина можно регулировать в зависимости от содержания генипина в неочищенном жидком соке, чтобы мольное отношение глицина к генипину составляло примерно 1:1) и поддерживали температуру реакционной смеси, составляющую 70°C, в течение 2 часов. После этого выпаривали растворитель при пониженном давлении или лиофилизировали с получением темно-синей порошковой смеси.

[0172] Затем темно-синий порошок экстрагировали сначала этилацетатом, а затем более тщательно метанолом. Компонент, растворимый в метаноле (800 мг), отделяли путем колоночной хроматографии с использованием Sephadex LH-20 и метанола. В составе первой фракции получали основную часть темно-синего продукта (600 мг), представлявшего собой очищенный полимер после выпаривания метанола. Также из фракции, растворимой в метаноле, получали небольшие количества соединения 1 (1 мг), соединения 2 (1,5 мг) и соединения 3 (1 мг).

[0173] Фракцию, не растворимую в метаноле, (1,2 г) также разделяли на колонке Sephadex LH-20, элюируя смесью метанол : вода (9:1). После этого проводили разделение на обращенно-фазовой колонке С18 с получением очищенного полимера. Очищенный полимер из фракции, не растворимой в метаноле, объединяли с очищенным полимером из фракции, растворимой в метаноле, с получением суммарно 1,8 грамма полимера. Данные анализа полимера, полученного в результате взаимодействия сока Genipa americana с глицином, идентичны данным, полученным после взаимодействия очищенного генипина с глицином.

Пример 6. Количественная оценка полимера

[0174] Для оценки чистоты синего полимера и количественной оценки его содержания в экстракте джагуа (получен после взаимодействия сока Genipa americana с глицином) был разработан способ ВЭЖХ/ФДМД.

[0175] Для указанных аналитических исследований использовали UFLC Shimadzu Prominence с подключенным дегазатором (DGU-20 А5), насос для четырехкомпонентных смесей (LC 20АТ), автоматический дозатор (SIL 20А НТ), колоночный термостат (СТО 20А) и фотодиодный матричный детектор (SPD М20А) под управлением модуля коммуникационной шины (СВМ 20А).

[0176] Использовали несколько колонок, таких как обращенно-фазовая колонка Luna С18 (Phenomenex) 150×4,6 мм, 5 мкм, Supelcosil (Sigma) С8, 150×4,6 мм, 5 мкм, и Luna PFP 150×4,6 мм, 5 мкм.

[0177] Высокая полярность, присущая полимеру, присутствующему в экстракте джагуа, ограничивала применение нормально-фазовых колонок.

[0178] Использовали ацетонитрил и метанол в отношениях в диапазоне от 100% до 100% воды.

[0179] Расход составлял 1 мл/мин, по ходу процесса модификации не проводили.

[0180] Использовали ФДМ детектор, отслеживали длины волн в диапазоне от 200 до 800 нм в режиме Max Plot и 590 нм для детектирования синего полимера.

[0181] Несмотря на то, что проводили оценку нескольких колонок и температур ячейки детектора, наилучшие результаты получали при использовании колонки Luna PFP. Результаты анализов, проводившихся с использованием других колонок, были неудовлетворительными, так как обнаруживали только неудерживаемые пики независимо от смеси растворителей, колонки и температуры детектора, расхода или впрыскиваемого объема.

[0182] После выбора колонки проводили оценку градиента растворителей, при этом наилучшие результаты при разделении получали при использовании метанола и воды в качестве элюентов, но на указанной стадии требовалось улучшение формы и ширины пика, несколько испытаний различных температур колоночного термостата позволили определить хорошую форму и ширину в отсутствие влияния на время удерживания.

[0183] Вкратце, наилучшие условия разделения включали следующие параметры:

[0184] Колонка Luna PFP 100А (Phenomenex) с защитным картриджем:

Длина 150 мм Внутренний диаметр 4,6 мм Размер частиц 5 мкм

[0185] Подвижная фаза: элюент А: вода, и элюент В: метанол

[0186] Линейный градиент:

[0187] Расход: 1 мл/мин

[0188] Температура:

T_{образцы}: окружающая среда (20-24°C)

T_{колонка}: 40°C

T_{ячейка детектора}: 40°C

[0189] Детектирование: Maxplot 230-800 нм (профиль экстракта);

Maxplot 590 нм (количественная оценка синего полимера)

[0190] Подготовка образца: в 10 или 25 мл мерной колбе взвешивали 10 мг навески образца, подвергающегося анализу, и доводили объем деионизованной водой. 10 мкл полученного раствора вводили с использованием автоматического дозатора.

[0191] Характеристики системы: В стандартном способе синий полимер элюировался через 10,3 минуты.

Пример 7. Очистка синего полимера, не содержащего сахара

[0192] Синий полимер, не содержащий сахара, очищали путем колоночной хроматографии с использованием Sephadex LH-20.

[0193] 10 г лиофилизированного экстракта джагуа (полученного в результате взаимодействия сока Genipa americana с глицином) растворяли в 10 мл деионизованной воды и фильтровали. После этого раствор красителя помещали в верхнюю часть колонки. Использовали подвижные фазы следующего состава: 100% метанол, 80% метанол, 50% метанол и 100% вода. Всего собирали 14 фракций и содержание Сахаров проверяли путем тонкослойной хроматографии, элюируя раствором изопропанол : вода : уксусная кислота (2:0,5:0,5). На пластину распыляли серную кислоту (5%) и грели при 105°C. Смешивали фракции, элюируемые первыми и не содержащие сахара, и сушили в условиях вакуума, а затем направляли на стадию очистки с использованием условий элюирования, описанных выше, до обнаружения желаемой чистоты путем ВЭЖХ.

[0194] Аликвоту фракций разбавляли и фильтровали через 0,45 мкм нейлоновый мембранный фильтр (Acrodisc, Pall) перед анализом ВЭЖХ при помощи способа согласно примеру 6.

[0195] В качестве критериев отбора желаемой чистоты синего полимера из экстракта джагуа использовали поглощение в УФ-видимой области и стандарты ВЭЖХ, т.е. фракции, выходящие из колонки Sephadex, не содержали сахар согласно анализу при помощи способа ТСХ, и поглощение основного пика, обнаруженного при 590 нм, было равно или превышало поглощение при 240 нм, соответственно.

[0196] На ФИГУРАХ 13A-D показаны кривые (спектры) ВЭЖХ исходной навески и трех фракций с различной чистотой. На ФИГУРЕ 13С приведена кривая ВЭЖХ чистого синего полимера (используемого в качестве «стандартного образца»), не содержащего сахара.

Пример 8. Количественная оценка содержания синего полимера в образцах экстрактов джагуа

[0197] Стандартный образец синего полимера, не содержащего сахара, полученный в примере 7, использовали в качестве внешнего стандарта для количественной оценки содержания синего полимера в образцах экстракта джагуа с использованием способа анализа, описанного в примере 6.

Калибровочные кривые

[0198] Стандартные растворы получали из стандартного образца синего полимера. Строили график зависимости площади под кривой (AUC) стандартного образца от концентрации и использовали линейную регрессию для получения уравнения калибровочной кривой.

[0199] Стандартные растворы вводили в трех повторностях в пяти концентрациях, а в некоторых случаях вводили и более высокое количество проб.

[0200] Было показано, что способ является линейным в диапазоне 20-100 мкг/мл.

[0201] Получали шесть различных калибровочных кривых. Калибровочные кривые 1-6 показаны на ФИГУРАХ 14A-F, соответственно.

Пределы обнаружения и количественной оценки

[0202] Способ, разработанный для измерения концентрации синего полимера в экстракте джагуа, позволял обнаруживать сигналы через 10,2 мин при 590 нм при нижней предельной концентрации 2 мкг/мл. Согласно формуле 2H/h, где Н представляет собой высоту пика стандартного образца, a h представляет собой высоту при времени удерживания на пустой хроматограмме (при вводе 10 мкл метанола или воды). Значение (2×3423/2836=2,4) является нижним пределом, который можно принять за предел обнаружения. Для расчетов использовали средние значения высоты пика стандартного образца и на пустых хроматограммах.

[0203] Определили, что предел количественной оценки синего полимера составлял 20 мкг/мл.

Количественная оценка содержания синих полимеров в образцах экстрактов джагуа

[0204] Проводили количественную оценку процентного содержания синего полимера в экстракте джагуа при помощи способа с использованием внешнего стандарта.

[0205] Образцы каждой партии взвешивали в трех повторностях для проведения трех независимых измерений разбавления до 10 мл в течение двух дней; разбавление в 25 мл исследовали в трех повторностях в течение только одного дня. Для образца 5312005 проводили только анализ разбавления в 10 мл, так как задачей исследования двух способов разбавления образца являлась оценка значимости параметра концентрации при анализе экстракта джагуа. В таблице 1 показаны результаты разбавления в 25 и 10 мл для партий 5312001 - 5312004, где можно проводить сравнение средних значений.

[0206] Для расчета концентрации синего полимера при разбавлении до 10 мл использовали следующую формулу:

, или

,

если образец разбавляли до 25 мл; y = площадь пика исследуемого синего полимера при 590 нм; b = отрезок, отсекаемый линией регрессии на координатной оси; а = коэффициент наклона линии регрессии; w = масса (мг) образца.

[0207] Вычисляли содержание в процентах в образцах для каждой полученной калибровочной кривой. Данные, полученные для калибровочной кривой 1, исключали. При получении данных из уравнений шести калибровочных кривых для каждой анализируемой партии результаты, полученные для калибровочной кривой 1, отличались от других значений, и при усреднении наблюдали увеличение %ОСО, вероятно связанное с ошибками при разбавлении и получении образца или на стадии взвешивания.

Пример 9. Удаление сахара путем брожения

[0208] Экстракт джагуа (4,5 л, полученный в результате взаимодействия сока Genipa americana с глицином, партия 5113003) стерилизовали в вертикальном автоклаве Tuttnauer 3870 ELV (85 литров) (Tuttnauer Europe BV, Нидерланды) при 121°C, 15 psi (103 кПа) в течение 20 минут. Затем стерилизованный экстракт джагуа оставляли охлаждаться в автоклаве. Полученную жидкую среду инокулировали 25 г дрожжей (Saccharomyces cerevisiae) для технического применения (Levapan, Колумбия), предварительно активированных в указанной стерильной среде при 30°C. Брожение проводили в 7 л биореакторе в рабочем объеме 5 л.

[0209] Смесь инкубировали в течение 24 часов в биореакторе BioFlo 110 (New Brunswick Scientific, США) с использованием переменных Batch Control в программном обеспечении Biocommand 6.1.7601 для отслеживания процесса. Исследовали четыре 500-мл образца (каждые 3 часа в течение первых 12 часов инкубации). После этого рабочий объем составлял примерно 2,5 л среды.

[0210] Рабочие условия способа брожения показаны в таблице 2. Систему запускали в условиях анаэробиоза, и в процессе брожения кислород из внешних источников не добавляли. Обнаруженное содержание кислорода в процентах (DO₂ (%)) определяет количество кислорода, присутствующее в образце без добавления кислорода из внешних источников. В процессе брожения поддерживали постоянную температуру 30±2°C.

[0211] Через 23 часа 19 минут процесс брожения завершали. Охлаждали реакционную смесь и центрифугировали в Labofuge Thermo Scientific при 200-4800 об./мин в течение 20 минут (Thermo Fisher Scientific, NJ, США). Затем удаляли дрожжи.

[0212] Проводили анализ содержания растворимых твердых веществ (°Брикса) в центрифугированных образцах с использованием цифрового рефрактометра Atago PAL-3 (Atago Co. Ltd. Tokyo, Япония) и содержания влаги с использованием МА35М Brand Sartorius (The Sartorius Group, Goettingen, Германия). Содержание сахара в образцах анализировали при помощи способа ТСХ на алюминиевых пластинах с покрытием силикагеля 60 F254 4×5 см, элюируя смесью изопропанол : уксусная кислота : вода (2:0,5:0,5). На пластины ТСХ распыляли 10% серную кислоту в этаноле и нагревали до 110°C. В качестве стандартов использовали чистую глюкозу, фруктозу и сахарозу. Анализ реакционных смесей через 3, 6, 9 и 12 часов показал, что брожение в течение 6 часов было достаточным для удаления всех сахаров. После брожения в течение 6 часов способ ТСХ, описанный выше, указывал на отсутствие Сахаров в реакционной смеси.

Пример 10. Сравнение характеристик ферментированных продуктов и неферментированных продуктов

Получение образца

[0213] Ферментированный экстракт джагуа, полученный в примере 9 (центрифугированный и отфильтрованный), концентрировали в роторном испарителе, а затем сушили путем распыления при помощи В-290 ( Labortechnik AG, Flawil, Швейцария) с использованием носителя (модифицированный пищевой крахмал (Capsul®)) или без него. Условия сушки включали: температура на входе 150°C и температура на выходе 103-110°C; нагнетающий насос 25% (290 мл/ч), расход воздуха при сушке 400 и аспирирующий насос 85%.

[0214] Неферментированный экстракт джагуа (полученный из той же партии, что использовали для получения ферментированных продуктов) сушили в условиях, таких, как описано выше для ферментированных продуктов.

[0215] Всего получали три продукта:

(1) PF: ферментированный продукт, центрифугированный и концентрированный, без носителя;

(2) FC: ферментированный продукт, центрифугированный и концентрированный, содержащий носитель (Capsul®) (60% общего количества твердых веществ из продукта - 40% общего количества твердых веществ из носителя);

(3) PC: неферментированный продукт, содержащий носитель (Capsul®) (60% общего количества твердых веществ из продукта - 40% общего количества твердых веществ из носителя).

[0216] Проводили анализ содержания влаги, содержания полимера, интенсивности окраски и стабильности в буферном растворе при pH 3 для трех порошковых продуктов (PF, FC и PC). Также исследовали микробиологическую стабильность продуктов.

Содержание полимера

[0217] Содержание полимера в PF, FC и PC измеряли при помощи способа ВЭЖХ, описанного в примерах 6-8. Результаты ВЭЖХ показаны в таблице 3. Хроматограммы ВЭЖХ показаны на ФИГУРЕ 15.

Интенсивность окраски

Параметры окраски

[0218] Проводили анализ водных растворов красителей (0,015 г порошка/40 мл) PF, FC и PC в трех повторностях с использованием спектрометра УФ-видимой области GENESYS 10S и программного обеспечения VISIONlite для определения параметров CIELab. Параметры окраски трех образцов показаны на ФИГУРЕ 16.

[0219] Согласно параметрам CIELab было показано, что ферментированные продукты (PF и FC) имели более интенсивную синюю окраску по сравнению с неферментированным продуктом. PF и FC имели более низкие значения L (пониженная яркость), менее отрицательные значения а (которые могут соответствовать более фиолетовой окраске), но значения b, схожие с PC. На ФИГУРЕ 16 также показано, что PF имел наивысшее поглощение, в два раза превышающее поглощение PC; и FC имел поглощение, в 1,6 раза превышающее поглощение PC.

Стабильность продуктов в буферном растворе при pH 3

[0220] Проводили оценку стабильности PF, FC и PC в буферном растворе при pH 3,0 в трех условиях хранения: холодильник (6°C), температура (20°C) и камера (45°C) в течение 19 дней.

[0221] Каждый из продуктов (PF, FC и PC) исследовали в трех повторностях в концентрации 15 мг образца в 40 мл буфера. Отслеживали образцы в одном спектрофотометре в диапазоне от 350 до 800 нм (измерения проводили с шагом 2 нм). Изменения окраски определяли по параметрам CIELab при помощи программного обеспечения VISIONlite версии 2, использовали D₆₅ и угол наблюдения 10°. Изменения окраски рассчитывали при помощи уравнения [1] (показано ниже) с использованием параметров L (цвет, белый 0, черный 100), а (- зеленый / красный +) и b (- синий / желтый +).

[0222] В ходе анализа отслеживали параметры, связанные с окраской, А (поглощение), L, a, b и ΔE_ab для PF, FC и PC.

[0223] Период полураспада вычисляли согласно кинетике первого порядка по константе скорости реакции (коэффициент наклона графика зависимости Ln (площадь для синего полимера)_t / (площадь для синего полимера)₀ от времени). Статистический анализ проводили в испытании Statgraphics Centurion XV. Для проведения различий в средних использовали критерий наименьшей значимой разницы Фишера (LSD).

[0224] В таблице 4 показаны результаты периода полураспада в днях для PF, FC и PC.

[0225] Содержание влаги в PF, FC и PC, определенное при помощи анализатора влаги (Sartorius Brand МА35М), составляло 4,12%, 3,24% и 3,15%, соответственно.

[0226] В способе брожения эффективно удаляли все сахара из экстрактов джагуа в течение шести часов. Полученные ферментированные продукты (PF и PC) имели более интенсивную синюю окраску. Интенсивность синей окраски PF в два раза превышала интенсивность окраски неферментированного продукта PC.

[0227] Ферментированный продукт PF был стабильным после сушки распылением без добавления инкапсулирующего носителя (например, крахмала).

[0228] Микробиологическую стабильность ферментированных продуктов можно исследовать путем добавления известного количества микроорганизма (например, бактерии, грибка или дрожжей) в ферментированные продукты и последующего (например, через 7 дней) измерения микробиологической стабильности ферментированных продуктов (например, путем измерения активности вводимого микроорганизма).

Пример 11. Удаление сахара из экстракта джагуа с использованием XAD-7

[0229] Проводили взаимодействие неочищенного сока Genipa americana (150 мл) с глицином (1,5 г) в течение 2 часов при 70°C. Реакционную смесь оставляли охлаждаться до комнатной температуры. Затем в охлажденную реакционную смесь добавляли смолу XAD-7 (100 г). Через 24 часа отфильтровывали смолу XAD-7.

[0230] Сначала через полученную смолу элюировали воду с получением водной фракции, а затем элюировали смесью воды и этанола с получением фракции полимера. Наличие полимера во фракции полимера подтверждали путем анализа ВЭЖХ при помощи способа согласно примеру 6. Содержание сахара во фракции полимера определяли при помощи способа ТСХ, описанного в примере 9. Анализ ТСХ указывал на отсутствие сахаров во фракции полимера. Водная фракция, с другой стороны, была обогащена сахарами. Анализ ВЭЖХ также позволял предположить, что водная фракция содержала некоторое количество полимера. На ФИГУРЕ 17 показаны спектры ВЭЖХ фракции полимера и водной фракции.

[0231] В таблице 5 показаны спектрофотометрические характеристики фракций, полученных после очистки с использованием смолы HP XAD7.

Пример 12. Взаимодействие сока Genipa americana с различными аминокислотами

[0232] Проводили взаимодействие сока Genipa americana с определенными аминокислотами для определения получаемых профилей окраски. Сок Genipa americana (50 мл) в 100 мл колбе Эрленмейера (содержание генипина 2,42%, определенное путем ВЭЖХ на UFLC Shimadzu Prominence (Япония), оборудованном диодным матричным детектором и ФДМД) смешивали с эквимолярными количествами глицина (GLY), валина (VAL), лизина (LYS), пролина (PRO), метионина (МЕТ), тирозина (TYR) или триптофана (TRP). Полученные смеси сок + аминокислота перемешивали в течение 2 часов при 70°C. Прохождение взаимодействия отслеживали путем тонкослойной хроматографии на алюминиевых пластинах с покрытием силикагеля F254 4×5 см, элюируя смесью метанол-вода 4:1. Продукты реакции анализировали путем ВЭЖХ при помощи способа, описанного в примере 6. Спектрофотометрическое определение характеристик продуктов реакции проводили в УФ-видимой области на спектрофотометре GENES YS 10S с использованием программного обеспечения VISIONlite версии 2.0. В экспериментах для определения характеристик образцы готовили путем разбавления 20 мкл реакционного раствора в 5 мл деионизованной воды за исключением взаимодействий с триптофаном и пролином, где образцы готовили путем разбавления 100 и 200 мкл реакционного раствора в 5 мл деионизованной воды, соответственно.

[0233] Стабильность полученных продуктов реакции оценивали аналогично способу, описанному в примере 10, в буферном растворе с pH 3,0 за исключением того, что в данном примере продукты реакции также подвергали облучению ультрафиолетовой лампы UVGL-58 Handheld UV (Ultra-Violet Products Ltd, Cambridge, UK) при 254 нм в течение 7,46 часа. Продукты реакции исследовали в трех повторностях в концентрации 40 мкл продукта реакции на 10 мл буфера с pH 3,0.

[0234] На ФИГУРЕ 18 показаны спектры поглощения продуктов взаимодействия сока Genipa americana с различными аминокислотами. Параметры окраски указанных продуктов показаны в таблице 6.

[0235] На ФИГУРАХ 19А-С показан анализ ВЭЖХ продуктов взаимодействия сока Genipa americana с различными аминокислотами, где изображения сгруппированы по аминокислотам. На ФИГУРАХ 19А-С для каждой аминокислоты показаны спектры ВЭЖХ продуктов взаимодействия сока Genipa americana с аминокислотой, полученные при помощи способа согласно примеру 6; увеличенное изображение области ВЭЖХ, где был выявлен полимер; и спектры в УФ-видимой области выбранного сигнала.

[0236] Продукты взаимодействия аминокислот LYS, VAL, МЕТ и PRO с соком Genipa americana имели время удерживания примерно 10,3 минуты (10,3 минуты ±5%). Указанное значение времени удерживания схоже с временем удерживания, наблюдаемым для полимера, полученного из сока Genipa americana с глицином, тем не менее, сигналы продуктов взаимодействия сока Genipa americana с аминокислотами LYS, VAL, МЕТ и PRO были более сложными по сравнению с сигналами продуктов взаимодействия сока Genipa americana с глицином (см. ФИГУРЫ 19А-В). Не желая быть связанными теорией, полагают, что указанные результаты могут указывать на образование повышенного количества соединений или полимерных цепей различного размера при использовании аминокислот LYS, VAL, МЕТ и PRO.

[0237] Взаимодействие сока Genipa americana с тирозином или триптофаном не приводило к получению продуктов со временем удерживания примерно 10,3 минуты (т.е. 10,3 минуты ±5%). Длина волны максимального поглощения (λ_max) для указанных продуктов составляла более 600 нм (см. ФИГУРУ 19С).

[0238] На ФИГУРЕ 20 показаны значения стабильности (выраженные как период полураспада) продуктов взаимодействия различных кислот с соком Genipa americana в буферном растворе с pH 3,0 при УФ облучении при 254 нм.

[0239] Взаимодействие сока Genipa americana с различными аминокислотами приводило к получению продуктов с различной окраской: синей (GLY и LYS), сине-зеленой (VAL, МЕТ и TYR), зеленой (TRP) и черной (PRO).

[0240] Продукт взаимодействия метионина (МЕТ) с соком Genipa americana был в два раза более стабильным по сравнению с продуктом, полученным из глицина (GLY) и сока Genipa americana, при исследовании в буферном растворе с pH 3,0 при УФ облучении при 254 нм в течение 7,46 часа.

[0241] Анализ ВЭЖХ показывал, что при взаимодействии сока Genipa americana с тирозином (TYR) или триптофаном (TRP) получали соединения с незначительно пониженной полярностью по сравнению с полимером, полученным из глицина (GLY) и сока Genipa americana (на что указывает повышенное время удерживания продуктов взаимодействия TYR и TRP по сравнению с GLY).

Пример 13. Окраска продуктов взаимодействия экстрактов мезокарпия плодов Genipa americana с глицином

Водные экстракты мезокарпия плодов Genipa americana

[0242] Получали водные экстракты из мезокарпия плодов Genipa americana (т.е. кожуры плодов). Использовали неспелые плоды, которые были твердыми и имели однородную кожуру, в отличие от спелых плодов, которые были мягкими и имели неоднородную кожуру. Мезокарпий свежих (т.е. используемых в течение 1-2 дней после сбора) плодов Genipa americana (76 г) размачивали в 300 мл деионизованной воды. Полученный сок фильтровали и анализировали путем ТСХ и ВЭЖХ (на UFLC Shimadzu Prominence, оборудованном диодным матричным детектором (ДМД)) для определения содержания генипина и других иридоидов генипина. Для сравнения необработанные плоды, собранные в то же время, оставляли при комнатной температуре на три дня (несвежие плоды) перед проведением экстракции деионизованной водой согласно приведенному выше описанию. Полученный сок также анализировали путем ТСХ и ВЭЖХ для определения содержания генипина и других иридоидов генипина.

[0243] На ФИГУРЕ 21А показан спектр ВЭЖХ водного экстракта мезокарпия свежих плодов Genipa americana, который имел пик со временем удерживания от 19 до 20 минут, которое примерно соответствовало времени удерживания генипина (22-23 минуты), где длина волны максимального поглощения составляла 240 нм.

[0244] На ФИГУРЕ 21В показан спектр ВЭЖХ водного экстракта мезокарпия плодов Genipa americana, собранных в то же время, что и плоды, показанные на ФИГУРЕ 21А, но оставленных при комнатной температуре на три дня (несвежие) перед экстракцией. Спектр имел пики со временем удерживания 19-20 минут и 22-23 минуты.

Взаимодействие водного экстракта мезокарпия (кожуры) с глицином

[0245] Водный экстракт мезокарпия (отфильтрованный сок, 300 мл), полученный согласно приведенному выше описанию, смешивали с глицином (450 мг) в 500 мл колбе Эрленмейера. Затем полученную смесь перемешивали в течение 90 минут при 4000 об./мин и 75°C на горячей плитке с магнитным перемешиванием (VELP, Италия). При помощи указанного способа получали темно-пурпурный продукт.

[0246] Отфильтровывали продукт реакции и определяли характеристики в УФ-видимой области на спектрофотометре марки GENESYS 10S с использованием программного обеспечения VISIONlite версии 2.0. Характеристики неочищенного продукта реакции определяли путем ¹Н ЯМР и масс-спектрометрии (МС). На ФИГУРЕ 22 показан спектр ¹Н ЯМР пурпурного продукта, полученного при помощи указанного способа смешивания водного экстракта с глицином.

[0247] В таблице 7 показаны некоторые сигналы, обнаруженные в смеси пурпурного красителя.

[0248] Преобразования, сделанные в таблице 7, показывают преобразование сигнала компонентов с m/z 257,2.

[0249] В качестве альтернативы проводили способ, где водный экстракт предварительно нагревали до 70°C перед добавлением глицина, полученный продукт имел синюю окраску. Продукт имел такую же синюю окраску, что и продукт, полученный из смеси генипина с глицином. На ФИГУРЕ 23 показан спектр ¹Н ЯМР синего продукта, полученного при помощи указанного способа смешивания предварительно нагретого водного экстракта с глицином.

[0250] Полученные результаты указывают на то, что свойства продукта взаимодействия сока, полученного из мезокарпия плодов Genipa americana, с глицином зависели от возможного предварительного нагревания водного экстракта перед добавлением глицина. При помощи способа, в котором глицин смешивали с водным экстрактом (без предварительного нагревания), получали продукт с темно-пурпурной окраской. При помощи способа, в котором водный экстракт предварительно нагревали до 70°C перед добавлением глицина, получали продукт с синей окраской.

Определение характеристик предшественника генипина в водном экстракте мезокарпия

I. Способ экстракции водой и лиофилизации

[0251] Свежие неспелые плоды (два дня после сбора) Genipa americana разрезали на четыре части и отделяли мезокарпий (кожуру) от эндокарпия (мякоть) и перикарпия (внешняя кожура). Изображение неспелых Genipa americana показано на ФИГУРЕ 24. 360 г мезокарпия измельчали с 300 мл деионизованной воды в блендере и полученный сок фильтровали в вакууме через вату, сок немедленно лиофилизировали в течение ночи с использованием устройства LABCONCO.

[0252] 50 мг лиофилизированного продукта экстрагировали 1 мл CD₃OD при обработке ультразвуком в течение 5 минут и фильтровали. Проводили анализ ¹Н и ¹³С ЯМР раствора при 300 и 75 МГц, соответственно, на Bruker Fourier 300 с подавлением сигнала воды.

II. Способ заморозки жидким азотом

[0253] Свежие нарезанные мезокарпии измельчали после заморозки в жидком азоте и 50 мг полученного порошка экстрагировали 1 мл CD₃OD при обработке ультразвуком в течение 5 минут и фильтровали, проводили анализ ¹Н и ¹³С ЯМР раствора при 300 и 75 МГц, соответственно, на Bruker Fourier 300 с подавлением сигнала воды.

III. Результаты

[0254] Результаты ¹Н ЯМР лиофилизированных и замороженных в азоте мезокарпиев показывают спектр с очень хорошим разделением, схожий с характеристическим профилем генипина (ФИГУРЫ 25А-В).

[0255] Водный экстракт мезокарпия джагуа имел пик ВЭЖХ (240 нм), соответствующий 19 минутам, который исчезал после нагревания или экстракции этилацетатом. Детектировали пик генипина через 21-22 минуты. На ФИГУРАХ 26А-В показаны профили ВЭЖХ (240 нм) водного экстракта мезокарпия и водного экстракта после разделения водного экстракта в этилацетате, соответственно.

[0256] Образование генипина из предшественника в мезокарпии плодов джагуа было самопроизвольным, что было определено по профилям ВЭЖХ водных экстрактов, полученных после выдерживания плодов в комнатных условиях в течение нескольких дней после анализа, приведенного на ФИГУРЕ 26А. Пик генипина наблюдали через 21-22 минуты, а его предшественник можно детектировать через 19 минут при 240 нм (ФИГУРА 27).

[0257] Быстрое и самопроизвольное образование генипина из предшественника, присутствующего в мезокарпии джагуа, указывало на структурные изменения (т.е. образование гемиацетального кольца) предшественника, инициируемые кислородом или нагреванием, которые приводили к образованию генипина или ферментативному расщеплению молекулы предшественника с высвобождением генипина в эндокарпий плода. В спектре ¹Н ЯМР водного экстракта мезокарпия отсутствует протон альдегида (12 ppm), см. ФИГУРУ 28.

[0258] Обнаруживали два дублета при 5,1 и 4,7 ppm и сигналы углерода при 100 и 70-80 ppm, которые отсутствовали в генипине, и являются характерными для аномерных протонов и фрагментов СНО в сахарах, что подтверждает версию о том, что предшественник представлял собой гликозид генипина. Спектры ¹Н (ФИГУРА 29) и ¹³С ЯМР (ФИГУРА 30) предшественника генипина соответствуют молекуле (+)-генипозида и иридоидному В-гликозидному предшественнику генипина.

[0259] Спектральные данные (+)-генипозида:

[0260] ¹Н ЯМР: (300 МГц, CD₃OD): δ 7,53 (s, 1Н), δ 5,81 (s, 1H), δ 5,17 (d, J=7,6, 1H), δ 4,73 (d, J=7,8 Гц, 1H), δ 4,33 (d, J=14,6 Гц, 1H), δ 4,20 (d, J=14,3 Гц, 1H), δ 3,83 (d, J=11,7 Гц, 1H), δ 3,72 (s, 3H), δ 3,66 (dd, J=12,2, 5,7 Гц, 1H), δ 3,39-3,42 (m, 1H), δ 3,15-3,28 (m, 3H), δ 2,83 (dd, 16,5, 8,4 Гц, 1H), δ 2,53 (dd, J=7,95, 15,75 Гц, 1H), δ 2,05-2,14 (m, 1H).

[0261] ¹³C ЯМР: (75 МГц, CD₃OD): δ 168,71, 152,23, 142,98, 127,37, 111,15, 98,90, 96,99, 76,82, 76,34, 73,39, 71,43, 61,12, 60,00, 50,77, 45,58, 38,29, 35,03.

Пример 14. Добавление метионина и глицина к соку Genipa americana

[0262] Проводили взаимодействие сока Genipa americana с метионином и глицином для определения профилей окраски полученных продуктов. Сок Genipa americana (50 мл) добавляли в смесь 100 мг метионина и 100 мг глицина, реакционную смесь выдерживали при 70°C в течение 2 часов.

[0263] Во втором эксперименте сок Genipa americana (50 мл) сначала добавляли к 100 мг метионина, а после проведения взаимодействия в течение одного часа дополнительно добавляли 100 мг глицина и реакционную смесь выдерживали в течение еще одного часа.

[0264] Окраску продуктов каждого из указанных взаимодействий измеряли с использованием водных растворов порошковых красителей (0,015 г/40 мл) по поглощению в УФ-видимой области на спектрофотометре GENESYS 10S в диапазоне длин волн от 400 до 700 нм для определения максимального поглощения и параметров CIELab.

[0265] Независимо от порядка добавления аминокислот наблюдали появление темно-синей окраски. Анализ тонкослойной хроматографии показывал образование полимера и указывал на то, что основное соединение было одинаковым независимо от порядка добавления реагентов, и окраска была одинаковой при добавлении метионина или глицина по отдельности или в виде смесей метионина и глицина. Анализ ТСХ указывал на образование синего красителя. Продукты взаимодействия анализировали путем спектрофотометрии, как показано в таблице 8.

[0266] Время удерживания полимера на хроматограмме ВЭЖХ было определено для большей части смесей сока Genipa americana с аминокислотой и было таким же, что и у красителя, получаемого в результате взаимодействия только глицина с соком Genipa americana. Максимальное поглощение наблюдали при 590 нм. Глицин и метионин одновременно взаимодействовали с соком Genipa americana. Хроматограммы, полученные для продуктов взаимодействия сока Genipa americana с аминокислотами глицином и метионином, а также только с глицином, показаны на ФИГУРЕ 31.

Изобретение относится к новым соединениям, выделенным в результате взаимодействия сока Genipa americana, генипина или аналогов генипина, с амином, которые могут быть использованы в качестве природных красителей в пищевой, косметической и текстильной промышленности. Описываются: композиция, содержащая указанные соединения, способы их получения и применения. Очищенный многократным хроматографическим фракционированием полимер или димер предлагается применять в качестве красителя отдельно или в комбинации с другим красителем для придания окраски пищевому продукту, лекарственному средству, косметическому средству, медицинскому устройству и текстильным изделиям. 35 н. и 98 з.п. ф-лы, 31 ил., 8 табл., 14 пр.

1. Композиция красителя, содержащая полимер формулы 4

его геометрический изомер или соль,

где n представляет собой целое число от 2 до 20;

каждый А независимо выбран из группы, состоящей из фрагмента формулы 5'А, формулы 5'В, формулы 5'С, их геометрического изомера, соли и их комбинации:

причем

R¹ представляет собой водород, метил, этил, пропил, изопропил, бутил, втор-бутил, изобутил или трет-бутил;

Т¹ представляет собой водород или метильную группу и Т² представляет собой водород или А-Т¹, где А и Т¹ определены выше;

при этом композиция красителя содержит менее 5% по массе первого дополнительного соединения, выбранного из группы, состоящей из соединений формулы 2', формулы 3'А, формулы 3'В, их геометрического изомера и соли:

где противоион соли представляет собой катион, выбранный из группы, состоящей из ионов щелочных металлов, ионов щелочноземельных металлов и ионов аммония; или где противоион соли представляет собой анион, выбранный из группы, состоящей из неорганических анионов и органических анионов.

2. Композиция красителя по п. 1, отличающаяся тем, что общая масса первого дополнительного соединения составляет менее 1% относительно массы полимера.

3. Композиция красителя по п. 1, отличающаяся тем, что общая масса первого дополнительного соединения составляет менее 0,1% относительно массы полимера.

4. Композиция красителя по п. 1, отличающаяся тем, что общая масса первого дополнительного соединения составляет менее 0,01% относительно массы полимера.

5. Композиция красителя по п. 1, отличающаяся тем, что композиция красителя содержит менее 5% по массе второго дополнительного соединения, выбранного из группы, состоящей из соединений формулы 1А, формулы 1В, их геометрического изомера и соли:

6. Композиция красителя по п. 5, отличающаяся тем, что общая масса второго дополнительного соединения составляет менее 1% относительно массы полимера.

7. Композиция красителя по п. 5, отличающаяся тем, что общая масса второго дополнительного соединения составляет менее 0,1% относительно массы полимера.

8. Композиция красителя по п. 5, отличающаяся тем, что общая масса второго дополнительного соединения составляет менее 0,01% относительно массы полимера.

9. Композиция красителя по п. 1, отличающаяся тем, что полимер составляет более 80% относительно массы композиции красителя.

10. Композиция красителя по п. 1, отличающаяся тем, что полимер составляет более 90% относительно массы композиции красителя.

11. Композиция красителя по п. 1, отличающаяся тем, что в формуле 5'А, формуле 5'В и формуле 5'С R¹ представляет собой метил.

12. Композиция красителя по п. 1, отличающаяся тем, что каждый А представляет собой фрагмент формулы 5'А, его геометрический изомер или соль.

13. Композиция красителя по п. 12, отличающаяся тем, что в формуле 5'А R¹ представляет собой метил.

14. Композиция красителя по п. 1, отличающаяся тем, что каждый А представляет собой фрагмент формулы 5'В, его геометрический изомер или соль.

15. Композиция красителя по п. 14, отличающаяся тем, что в формуле 5'В R¹ представляет собой метил.

16. Композиция красителя по п. 1, отличающаяся тем, что каждый А представляет собой фрагмент формулы 5'С, его геометрический изомер или соль.

17. Композиция красителя по п. 16, отличающаяся тем, что в формуле 5'С R¹ представляет собой метил.

18. Композиция красителя по п. 1, отличающаяся тем, что длина волны максимального поглощения (λ_max) полимера находится в диапазоне 580-610 нм.

19. Композиция красителя по п. 1, отличающаяся тем, что среднечисловая молекулярная масса (M_n) полимера составляет от 3000 до 10000.

20. Композиция красителя по п. 19, отличающаяся тем, что среднечисловая молекулярная масса (M_n) полимера составляет от 4500 до 7500.

21. Композиция красителя по п. 20, отличающаяся тем, что среднечисловая молекулярная масса (M_n) полимера составляет примерно 6000.

22. Композиция красителя по п. 1, отличающаяся тем, что полимер характеризуется ИК-спектром, имеющим следующие пики (±5 см^-1): 3393, 2949, 1726, 1630 и 1540 см^-1.

23. Композиция красителя по п. 1, отличающаяся тем, что композиция красителя содержит менее 5% по массе соединений, отличных от указанного полимера, имеющих длину волны максимального поглощения (λ_max) в диапазоне 580-610 нм.

24. Композиция красителя по п. 23, отличающаяся тем, что общая масса соединений, отличных от указанного полимера, имеющих длину волны максимального поглощения (λ_max) в диапазоне 580-610 нм, составляет менее 5% относительно массы полимера.

25. Композиция красителя по п. 1, отличающаяся тем, что полимер представляет собой продукт взаимодействия генипина с глицином.

26. Композиция красителя по п. 25, отличающаяся тем, что полимер представляет собой продукт взаимодействия очищенного генипина с глицином.

27. Композиция красителя по п. 25, отличающаяся тем, что полимер представляет собой продукт взаимодействия глицина с соком, содержащим генипин.

28. Композиция красителя по п. 27, отличающаяся тем, что полимер представляет собой продукт взаимодействия глицина с соком, выделенным из плодов Genipa americana.

29. Композиция красителя по п. 1, отличающаяся тем, что полимер имеет форму димерной структуры, образованной двумя молекулами полимера.

30. Композиция красителя по любому из пп. 1-29, отличающаяся тем, что композиция красителя содержит менее 5% по массе углеводов.

31. Композиция красителя по п. 30, отличающаяся тем, что композиция красителя не содержит углеводы.

32. Композиция красителя по п. 30, отличающаяся тем, что время удерживания в анализе ВЭЖХ полимера составляет примерно 10,3 минуты.

33. Композиция красителя по п. 30, отличающаяся тем, что кривая ВЭЖХ полимера по существу идентична изображенной на фиг. 13С.

34. Композиция красителя по п. 30, дополнительно содержащая димер формулы 1А, 1В, определенные выше, 2, 3А или 3В:

35. Композиция красителя по п. 30, отличающаяся тем, что композиция красителя по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% свободна от мономеров, димеров, жирных кислот, жиров, белков и органических кислот.

36. Соединение формулы 3'А или формулы 3'В, имеющее чистоту более 80%, его геометрический изомер, соль или их комбинация:

где R¹ представляет собой метил.

37. Соединение формулы 1А или формулы 1В, имеющее чистоту более 80%, его соль или комбинация:

38. Полимер формулы 4, имеющий чистоту более 80%:

его геометрический изомер или соль,

где n представляет собой целое число от 2 до 20;

каждый А представляет собой фрагмент формулы 5'А, его геометрический изомер или соль

где R¹ представляет собой метил, Т¹ представляет собой водород или метильную группу и Т² представляет собой водород или А-Т¹, где А и Т¹ определены выше; где противоион соли представляет собой катион, выбранный из группы, состоящей из ионов щелочных металлов, ионов щелочноземельных металлов и ионов аммония; или где противоион соли представляет собой анион, выбранный из группы, состоящей из неорганических анионов и органических анионов.

39. Полимер по п. 38, среднечисловая молекулярная масса (M_n) которого составляет примерно 6000.

40. Полимер по п. 38, характеризующийся ИК-спектром, имеющим следующие пики (±5 см^-1): 3393, 2949, 1726, 1630 и 1540 см^-1.

41. Полимер по п. 38, отличающийся тем, что полимер получают при помощи способа, включающего:

a) экстракцию синей смеси, полученной в результате взаимодействия генипина и глицина, метанолом с получением фракции, растворимой в метаноле, и фракции, нерастворимой в метаноле, и

b) очистку фракции, нерастворимой в метаноле.

42. Полимер по п. 41, отличающийся тем, что синюю смесь получают в результате взаимодействия очищенного генипина с глицином.

43. Полимер по п. 41, отличающийся тем, что синюю смесь получают в результате взаимодействия глицина с соком, полученным из Genipa americana.

44. Комбинированная композиция красителя, содержащая окрашивающую добавку и композицию красителя по любому из пп. 1-35, соединение по п. 36 или 37 или полимер по любому из пп. 38-43.

45. Способ получения композиции красителя, включающий смешивание соединения по п. 36 или 37 с полимером по любому из пп. 38-43.

46. Способ придания синей окраски субстрату, включающий приведение субстрата в контакт с композицией красителя по любому из пп. 1-35, соединением по п. 36 или 37 или полимером по любому из пп. 38-43.

47. Способ по п. 46, отличающийся тем, что субстрат представляет собой продукт питания.

48. Способ по п. 46, отличающийся тем, что субстрат представляет собой медицинское устройство.

49. Способ по п. 46, отличающийся тем, что субстрат представляет собой лекарственный или нутрицевтический продукт.

50. Способ по п. 46, отличающийся тем, что субстрат представляет собой косметический продукт.

51. Пищевой продукт, содержащий продукт питания и композицию красителя по любому из пп. 1-35, соединение по п. 36 или 37 или полимер по любому из пп. 38-43.

52. Пищевой продукт по п. 51, отличающийся тем, что продукт питания представляет собой твердый продукт питания или жидкий продукт питания.

53. Пищевой продукт по п. 51, отличающийся тем, что продукт питания представляет собой напиток.

54. Пищевой продукт по п. 53, отличающийся тем, что продукт питания представляет собой газированный напиток.

55. Медицинское устройство, окрашенное композицией красителя по любому из пп. 1-35, соединением по п. 36 или 37 или полимером по любому из пп. 38-43.

56. Лекарственный или нутрицевтический продукт, содержащий лекарственное средство или нутрицевтическое средство и композицию красителя по любому из пп. 1-35, соединение по п. 36 или 37 или полимер по любому из пп. 38-43.

57. Лекарственный или нутрицевтический продукт по п. 56, отличающийся тем, что лекарственное средство или нутрицевтическое средство выполнено в виде лекарственной формы, выбранной из группы, состоящей из таблеток, желатиновых капсул, шариков, гранул, пилюль, драже, пастилок, мазей, капсул, порошков, жидкостей, гелей, сиропов, взвесей и суспензий.

58. Косметический продукт, содержащий композицию красителя по любому из пп. 1-35, соединение по п. 36 или 37 или полимер по любому из пп. 38-43.

59. Композиция красителя, содержащая полимер формулы 4

его геометрический изомер или соль,

где n представляет собой целое число от 2 до 20;

каждый А независимо выбран из группы, состоящей из формулы 5А, формулы 5В, формулы 5С, их геометрического изомера, соли и их комбинации:

причем

R¹ представляет собой водород, метил, этил, пропил, изопропил, бутил, втор-бутил, изобутил или трет-бутил;

R² и R'² независимо представляют собой водород или C_1-10 алкил;

R³ представляет собой водород или СООН;

Т¹ представляет собой водород или метильную группу и Т² представляет собой водород или А-Т¹, где А и Т¹ определены выше;

при этом композиция красителя содержит менее 5% по массе первого дополнительного соединения, выбранного из группы, состоящей из соединений формулы 6, формулы 7, формулы 8, их геометрического изомера и соли:

где противоион соли представляет собой катион, выбранный из группы, состоящей из ионов щелочных металлов, ионов щелочноземельных металлов и ионов аммония; или где противоион соли представляет собой анион, выбранный из группы, состоящей из неорганических анионов и органических анионов.

60. Композиция красителя по п. 59, отличающаяся тем, что представляет собой остаток аминокислоты, где R³ представляет собой СООН и R² и/или R'² представляют собой боковую(ые) цепь(и) аминокислоты, и аминокислота выбрана из группы, состоящей из глицина, аланина, валина, лейцина, изолейцина, серина, цистеина, треонина, метионина, пролина, фенилаланина, тирозина, триптофана, гистидина, лизина, аргинина, аспартата, глутамата, аспарагина, глутамина, таурина, карнитина, орнитина и цитруллина, причем аминокислота может иметь D- или L-конфигурацию.

61. Композиция красителя по п. 60, отличающаяся тем, что аминокислота представляет собой глицин.

62. Композиция красителя по п. 59, отличающаяся тем, что R³ представляет собой Н и один из R² и R'² представляет собой водород, а другой из R² и R'² представляет собой незамещенную C_1-10 линейную алкильную цепь.

63. Композиция красителя по п. 59, отличающаяся тем, что R³ представляет собой Н и один из R² и R'² представляет собой водород, а другой из R² и R'² представляет собой C_1-10 линейную алкильную цепь, замещенную 1-3 метильными группами.

64. Композиция красителя по любому из пп. 59-63, отличающаяся тем, что композиция красителя содержит менее 5% по массе углеводов.

65. Композиция красителя по п. 64, отличающаяся тем, что композиция красителя не содержит углеводы.

66. Композиция красителя по п. 64, отличающаяся тем, что время удерживания в анализе ВЭЖХ полимера составляет примерно 10,3 минуты.

67. Композиция красителя по п. 64, отличающаяся тем, что кривая ВЭЖХ полимера по существу идентична изображенной на фиг. 13С.

68. Композиция красителя по п. 64, дополнительно содержащая димер формулы 1А, 1В, 2, 3А или 3В.

69. Композиция красителя по п. 64, отличающаяся тем, что композиция красителя по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% свободна от мономеров, димеров, жирных кислот, жиров, белков и органических кислот.

70. Способ придания синей окраски субстрату, включающий приведение субстрата в контакт с композицией красителя по п. 30 или 64.

71. Пищевой продукт, содержащий продукт питания и композицию красителя по п. 30 или 64.

72. Медицинское устройство, окрашенное композицией красителя по п. 30 или 64.

73. Способ получения композиции красителя по п. 30 или 64, включающий: (1) проведение первой очистки неочищенной композиции красителя путем колоночной хроматографии с получением различных фракций; (2) анализ фракций на наличие углеводов и (3) сбор фракций, по существу не содержащих углеводы, с получением композиции красителя.

74. Способ по п. 73, отличающийся тем, что колоночная хроматография представляет собой гельпроникающую хроматографию.

75. Способ по п. 73, отличающийся тем, что стадия анализа включает применение тонкослойной хроматографии.

76. Способ по п. 73, отличающийся тем, что композиция красителя имеет кривую ВЭЖХ, по существу идентичную приведенной на фиг. 13С.

77. Композиция красителя, содержащая полимер по любому из пп. 38-43, отличающаяся тем, что композиция красителя по меньшей мере на 80%, 90%, 95%, 99% или 100% свободна от сахаров и высушена распылением без крахмала.

78. Способ получения композиции красителя, включающий

(a) смешивание сока Genipa americana с аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из глицина, валина, лизина, метионина, пролина, тирозина, триптофана и любой их комбинации;

(b) удаление сахара из смеси, полученной на стадии (а) и

(с) выделение композиции красителя из продукта, не содержащего сахар, полученного на стадии (b),

при этом интенсивность окраски композиции красителя, полученной при помощи указанного способа, превышает интенсивность окраски композиции красителя, полученной из смеси, полученной на стадии (а), из которой не удаляли сахар.

79. Способ по п. 78, отличающийся тем, что сахар удаляют на стадии (b) путем брожения, колоночной хроматографии, ВЭЖХ, гельпроникающей хроматографии, фильтрования с обратным осмосом, ультрафильтрования, микрофильтрования, диализа, разделения на смоле XAD4, разделения на смоле XAD7 или любой их комбинации.

80. Способ по любому из пп. 78, 79, дополнительно включающий сушку распылением композиции красителя.

81. Способ по п. 80, отличающийся тем, что композиция красителя не содержит крахмал.

82. Способ по любому из пп. 78, 79, отличающийся тем, что аминокислота представляет собой глицин или лизин.

83. Способ по любому из пп. 78, 79, отличающийся тем, что композиция красителя является синей или пурпурной.

84. Способ по любому из пп. 78, 79, отличающийся тем, что аминокислота представляет собой валин, метионин или тирозин.

85. Способ по п. 84, отличающийся тем, что композиция красителя является сине-зеленой.

86. Способ по любому из пп. 78, 79, отличающийся тем, что аминокислота представляет собой пролин.

87. Способ по п. 86, отличающийся тем, что композиция красителя является черной.

88. Способ по любому из пп. 78, 79, отличающийся тем, что аминокислота представляет собой триптофан.

89. Способ по п. 88, отличающийся тем, что композиция красителя является зеленой.

90. Способ по любому из пп. 78, 79, отличающийся тем, что интенсивность окраски композиции красителя по меньшей мере в два раза превышает интенсивность окраски композиции красителя, полученной из смеси, полученной на стадии (а), без проведения брожения.

91. Способ получения композиции красителя, включающий

(a) смешивание сока Genipa americana с аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из глицина, валина, лизина, метионина, пролина, тирозина, триптофана и любой их комбинации;

(b) стерилизацию смеси, полученной на стадии (а);

(c) инокуляцию стерилизованной смеси, полученной на стадии (b), дрожжами или бактериями;

(d) инкубацию инокулированной смеси, полученной на стадии (с), в условиях брожения с получением ферментированного продукта и

(e) выделение композиции красителя из ферментированного продукта, полученного на стадии (d),

при этом интенсивность окраски композиции красителя, полученной при помощи указанного способа, превышает интенсивность окраски композиции красителя, полученной из смеси, полученной на стадии (а), без проведения брожения.

92. Способ по п. 91, отличающийся тем, что инкубацию на стадии (d) проводят в течение по меньшей мере 6 часов.

93. Способ по любому из пп. 91, 92, дополнительно включающий сушку распылением композиции красителя.

94. Способ по п. 93, отличающийся тем, что композиция красителя не содержит крахмал.

95. Способ по любому из пп. 91, 92, отличающийся тем, что аминокислота представляет собой глицин или лизин.

96. Способ по любому из пп. 91, 92, отличающийся тем, что композиция красителя является синей или пурпурной.

97. Способ по любому из пп. 91, 92, отличающийся тем, что аминокислота представляет собой валин, метионин или тирозин.

98. Способ по п. 97, отличающийся тем, что композиция красителя является сине-зеленой.

99. Способ по любому из пп. 91, 92, отличающийся тем, что аминокислота представляет собой пролин.

100. Способ по п. 99, отличающийся тем, что композиция красителя является черной.

101. Способ по любому из пп. 91, 92, отличающийся тем, что аминокислота представляет собой триптофан.

102. Способ по п. 101, отличающийся тем, что композиция красителя является зеленой.

103. Способ по любому из пп. 91, 92, отличающийся тем, что интенсивность окраски композиции красителя по меньшей мере в два раза превышает интенсивность окраски композиции красителя, полученной из смеси, полученной на стадии (а), без проведения брожения.

104. Композиция красителя, полученная при помощи способа по любому из пп. 78-103.

105. Композиция красителя по п. 104, содержащая менее 5% по массе углеводов.

106. Композиция красителя по п. 105, не содержащая углеводы.

107. Композиция красителя по п. 104, отличающаяся тем, что время удерживания в анализе ВЭЖХ полимера составляет примерно 10,3 минуты.

108. Композиция красителя по п. 104, отличающаяся тем, что полимер имеет кривую ВЭЖХ, по существу идентичную приведенной на фиг. 13С.

109. Композиция красителя по п. 104, дополнительно содержащая димер формулы 1А, 1В, 2, 3А или 3В.

110. Композиция красителя по п. 104, которая по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% свободна от мономеров, димеров, жирных кислот, жиров, белков и органических кислот.

111. Композиция красителя по п. 104, имеющая повышенную устойчивость к микробному загрязнению по сравнению с композицией красителя, полученной из смеси, полученной на стадии (а).

112. Способ получения композиции пурпурного красителя, включающий

(a) выделение мезокарпия из плодов Genipa americana;

(b) получение экстракта сока из мезокарпия;

(c) смешивание экстракта сока с глицином;

(d) нагревание смеси сока с глицином после стадии (с) и

(e) выделение композиции пурпурного красителя после стадии (d).

113. Способ по п. 112, отличающийся тем, что нагревание на стадии (d) проводят в течение по меньшей мере 90 минут.

114. Способ получения композиции пурпурного красителя, включающий

(a) выделение мезокарпия из плодов Genipa americana;

(b) выделение генипозида из мезокарпия;

(c) смешивание генипозида с глицином и

(d) выделение композиции пурпурного красителя после стадии (с).

115. Композиция красителя, полученная при помощи способа по любому из пп. 112-114.

116. Способ получения композиции черного красителя, включающий

(а) получение экстракта сока из плодов Genipa americana;

(с) смешивание экстракта сока с пролином и

(e) выделение композиции черного красителя после стадии (с).

117. Композиция красителя, полученная при помощи способа по п. 116.

118. Способ получения композиции зеленого красителя, включающий

(а) получение экстракта сока из плодов Genipa americana;

(с) смешивание экстракта сока с триптофаном и

(е) выделение композиции зеленого красителя после стадии (с).

119. Композиция красителя, полученная при помощи способа по п. 118.

120. Пищевой продукт, содержащий продукт питания и композицию красителя по любому из пп. 77, 104, 115, 117 или 119.

121. Пищевой продукт по п. 120, отличающийся тем, что продукт питания представляет собой твердый продукт питания или жидкий продукт питания.

122. Пищевой продукт по п. 121, отличающийся тем, что продукт питания представляет собой напиток.

123. Пищевой продукт по п. 122, отличающийся тем, что продукт питания представляет собой газированный напиток.

124. Медицинское устройство, окрашенное с применением композиции красителя по любому из пп. 77, 104, 115, 117 или 119.

125. Лекарственный или нутрицевтический продукт, содержащий лекарственное средство или нутрицевтическое средство и композицию красителя по любому из пп. 77, 104, 115, 117 или 119.

126. Лекарственный или нутрицевтический продукт по п. 125, отличающийся тем, что лекарственное или нутрицевтическое средство выполнено в виде лекарственной формы, выбранной из группы, состоящей из таблеток, желатиновых капсул, шариков, гранул, пилюль, драже, пастилок, мазей, капсул, порошков, жидкостей, гелей, сиропов, взвесей и суспензий.

127. Косметический продукт, содержащий композицию красителя по любому из пп. 77, 104, 115, 117 или 119.

128. Способ получения композиции, содержащей предшественник генипина, включающий

(a) выделение мезокарпия из плодов Genipa americana;

(b) измельчение мезокарпия в деионизованной воде;

(c) фильтрование продукта, полученного на стадии (b) и

(d) лиофилизацию или сверхбыстрое замораживание фильтрованного продукта, полученного на стадии (с).

129. Способ по п. 128, отличающийся тем, что предшественник генипина представляет собой генипозид.

130. Лекарственный продукт, содержащий лекарственное средство и композицию красителя по п. 30 или 64.

131. Нутрицевтический продукт, содержащий нутрицевтическое средство и композицию красителя по п. 30 или 64.

132. Косметический продукт, содержащий косметическое средство и композицию красителя по п. 30 или 64.

133. Композиция красителя, содержащая очищенный полимер формулы 4

его геометрический изомер или соль,

где полимер формулы 4 образован взаимодействием

где n представляет собой целое число от 2 до 20;

каждый А независимо выбран из группы, состоящей из фрагмента формулы 5А, формулы 5В, формулы 5С, их геометрического изомера, соли и их комбинации:

где R¹ представляет собой метил; и

представляет собой первичный алкиламин или представляет собой остаток аминокислоты, где R³ представляет собой СООН и R² и/или R'² представляют собой боковую(ые) цепь(и) аминокислоты, и аминокислота выбрана из группы, состоящей из глицина, аланина, валина, лейцина, изолейцина, серина, цистеина, треонина, метионина, фенилаланина, тирозина, триптофана, гистидина, лизина, аргинина, аспартата, глутамата, аспарагина, глутамина, таурина, орнитина и цитруллина, причем аминокислота может иметь D- или L-конфигурацию; и где Т¹ представляет собой водород или метильную группу и Т² представляет собой водород или А-Т¹, где А и Т¹ определены выше;

где противоион соли представляет собой катион, выбранный из группы, состоящей из ионов щелочных металлов, ионов щелочноземельных металлов и ионов аммония; или где противоион соли представляет собой анион, выбранный из группы, состоящей из неорганических анионов и органических анионов.