Фармацевтическая композиция и способ ее использования для терапии повреждений головного и спинного мозга Российский патент 2022 года по МПК A61K48/00 A61K35/12 A61P9/10 A61P25/02 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Изобретение относится к области медицины, в частности неврологии и нейрохирургии. Касается создания репликативно-дефектных аденовирусных векторов 5 серотипа с фибером 35 серотипа (Ad5/F35), несущих последовательности гена сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF₁₆₅, англ. Vascular Endothelial Growth Factor) человека, гена глиального нейротрофического фактора (GDNF, англ. Glial cell-line Derived Neurotrophic Factor) человека, или гена нейрональной молекулы клеточной адгезии (NCAM1, англ. Neural Cell Adhesion Molecule) человека, создания на основе данных аденовирусных векторов фармацевтической композиции и к способам ее использования в лечебных целях. Фармацевтическая композиция из трех заявленных аденовирусных векторов может использоваться для прямой и клеточно-опосредованной генной терапии, в частности, для получения аутологичного лейкоконцентрата, обогащенного тремя генами, кодирующими рекомбинантные молекулы VEGF₁₆₅, GDNF и NCAM1, для стимулирования регенерации в центральной нервной системе (ЦНС). Изобретение может быть использовано в медицинских учреждениях для нейрореабилитации пациентов после ишемического инсульта, нейротравмы и с нейродегенеративными заболеваниями.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Естественное ограничение регенерации в ЦНС является одним из основных факторов, препятствующих разработке эффективных методов лечения заболеваний головного и спинного мозга различной этиологии. В настоящее время среди активно разрабатываемых подходов к сдерживанию нейродегенерации и стимулированию нейрорегенерации является способ локального повышения в ЦНС продукции молекул, модулирующих нейропластичность мозга. Доставка рекомбинантных генов, кодирующих такие молекулы, в ЦНС после ишемического инсульта, нейротравмы или при нейродегенеративных заболеваниях является многообещающей стратегией, направленной на повышение жизнеспособности нейронов и сдерживании их гибели, а также на стимулирование направленного роста аксонов, их миелинизацию и восстановление утраченных нервных связей (синаптогенез).

Доставка рекомбинантных терапевтических генов, которые могут применяться в различных комбинациях, широко используется в доклинических исследованиях для стимулирования нейрорегенерации при различных патологических процессах в головном мозге [Craig AJ, Housley GD. Evaluation of Gene Therapy as an Intervention Strategy to Treat Brain Injury from Stroke. Front Mol Neurosci. 2016 May 24; 9:34. doi: 10.3389/fhmol.2016.00034. PMID: 27252622; PMCID: PMC4877374] и спинном [Franz S, Weidner N, Blesch A. Gene therapy approaches to enhancing plasticity and regeneration after spinal cord injury. Exp Neurol. 2012 May; 235(1):62-9. doi: 10.1016/j.expneurol.2011.01.015. Epub 2011 Jan 31. PMID: 21281633; PMCID: PMC3116048]. Доставка рекомбинантных терапевтических генов, кодирующих биологически активные молекулы, такие как нейротрофические факторы (BDNF, GDNF, NGF) и факторы роста (VEGF, IGF-1, FGF-2), молекулы клеточной адгезии (NCAM, L1), противовоспалительные (IL-10) и антиапоптотические (Вс1-2) молекулы, для активации или ингибирования определенных клеточных реакций в области нейродегенерации направлена на модулирование нейропластичности мозга и, таким образом, на сдерживание развития патологических процессов и стимулирование процессов нейрорегенерации. Для доставки рекомбинантных терапевтических генов, кодирующих молекулы модуляторы нейропластичности, применяются рекомбинантные генетические конструкции на основе различных вирусных векторов [Lim ST, Airavaara М, Harvey BK. Viral vectors for neurotrophic factor delivery: a gene therapy approach for neurodegenerative diseases of the CNS. Pharmacol Res. 2010 Jan; 61(1):14-26. doi: 10.1016/j.phrs.2009.10.002. Epub 2009 Oct 17. PMID: 19840853; PMCID: РМС2880921].

Доставку рекомбинантных генетических конструкций, содержащих терапевтические гены, осуществляют методом прямой генной терапии (in vivo генная терапия), заключающийся в непосредственном введении в организм реципиента генетических конструкций, или методом клеточно-опосредованной генной терапии (ex vivo генная терапия), заключающийся в использовании аллогенных или аутологичных клеток, трансдуцированных генетическими конструкциями ex vivo перед трансплантацией. Существенным недостатком прямой доставки терапевтических генов с помощью генетических конструкций являются проблемы безопасности вирусного вектора, связанные, с риском его прямого токсического действия на организм реципиента, а также неконтролируемой трансдукцией различных клеточных типов и активацией иммунного ответа на вирусные антигены. В этой связи доставка генетических конструкций, содержащих терапевтические гены, с помощью клеточных носителей является более безопасным и контролируемым методом.

Из уровня техники известен способ клеточно-опосредованной генной терапии, в котором генетические конструкции на основе аденовирусного вектора 5 серотипа, содержащего ген сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF₁₆₅), ген глиального нейротрофического фактора (GDNF) и ген нейрональной молекулы клеточной адгезии (NCAM1), доставляли с помощью мононуклеарных клеток крови пуповины человека для терапии бокового амиотрофического склероза [Islamov R.R., Rizvanov A.A., Fedotova V.Y., Izmailov A.A., Safiullov Z.Z., Garanina Е.Е., Salafutdinov I.I., Sokolov М.Е., Mukhamedyarov М.A., András Palotás. Tandem delivery of multiple therapeutic genes using umbilical cord blood cells improves symptomatic outcomes in ALS // Molecular Neurobiology, 2016. DOI 10.1007/s12035-016-0017-x], ишемического инсульта [патент РФ №2676701, МПК A61K 31/7088, опубл. 10.01.2019, БИ №1] и контузионной травмы спинного мозга [патент РФ №2758760, МПК A61N 1/18, A61K 35/51, А61Р 25/02, опубл. 01.11.2021, Бюл. №31].

В совокупности, приведенные выше примеры клеточно-опосредованной генной терапии с использованием мононуклеарных клеток крови пуповины человека в качестве носителей терапевтических генов, свидетельствуют об эффективности их адресной доставки с помощью лейкоцитов в головной и спинной мозг для коррекции патологических процессов. Однако существенным недостатком использования мононуклеарных клеток крови пуповины человека в качестве клеточных носителей терапевтических генов являются их относительно небольшое количество, которое можно получить от одного донора для однократного введения реципиенту, невозможность повторного введения генетически модифицированных лейкоцитов от одного и того же донора, и связанные с этим риски трансплантации аллогенных лейкоцитов, что накладывает серьезные ограничения для широкого использования мононуклеарных клеток крови пуповины человека для ex vivo генной терапии в практической медицине. Таким образом, использование лейкоцитов периферической крови пациента в качестве клеточных носителей генетических конструкций для временной продукции рекомбинантных биологически активных молекул с целью модулирования нейропластичности может быть одним из прорывных направлений в генной терапии повреждений головного и спинного мозга.

Наиболее близким к заявленному изобретению является способ изготовления генетически модифицированного лейкоконцентрата, включающего лейкоконцентрат, полученный из цельной крови, и рекомбинантный репликативно-дефектный вирусный вектор Ad5/35F, несущий репортерный ген зеленого флуоресцирующего белка в соотношении лейкоцит : вирусный вектор - 1:5 [Патент РФ №2716013, МПК A61K 48/00, A61K 35/00, опубл. 05.03.2020, Бюл. №7].

Однако в уровне техники вышеуказанного изобретения существует необходимость создания конкретных векторов, содержащих конкретные терапевтические рекомбинантные гены, создание на их основе конкретной фармацевтической композиции для использования в конкретных лечебных целях.

Настоящее изобретение, созданное авторами, решает перечисленные выше проблемы и предлагает новые более эффективные аденовирусные векторы, новую фармацевтическую композицию и новый способ терапии повреждений головного и спинного мозга.

ТЕХНИЧЕСКАЯ ЗАДАЧА

Задачей авторов было создание новых аденовирусных векторов и на их основе фармацевтической композиции для использования в клеточно-опосредованной генной терапии повреждений головного и спинного мозга с целью стимулирования регенерации в ЦНС за счет биологически активных белков - сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF₁₆₅) человека, глиального нейротрофического фактора (GDNF) человека и нейрональной молекулы клеточной адгезии (NCAM1) человека.

Указанная задача была решена за счет создания фармацевтической композиции, содержащей аденовирусные векторы на основе генома аденовируса человека 5 серотипа с делетированными Е1 и Е3 областями, с фибером от аденовируса человека 35 серотипа, которые несут последовательности гена сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF₁₆₅), или гена глиального нейротрофического фактора (GDNF) человека, или гена нейрональной молекулы клеточной адгезии (NCAM1) человека, а также использования данной фармацевтической композиции для получения лейкоконцентрата, обогащенного одновременно тремя генами, кодирующими VEGF₁₆₅, GDNF и NCAM1.

Эффективность созданной фармацевтической композиции доказана на примерах лечения ишемического инсульта и контузионной травмы спинного мозга в моделях на мини-свиньях, организм которых по морфо-физиологическим и биохимическим параметрам соотносится с организмом человека. Для доставки созданной фармацевтической композиции был использован аутологичный лейкоконцентрат, полученный из цельной крови мини-свиней.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Сущностью настоящего изобретения является создание новой фармацевтической композиции, содержащей аденовирусные векторы на основе генома аденовируса человека 5 серотипа с делетированными Е1 и Е3 областями, с фибером от аденовируса человека 35 серотипа, которые несут последовательности гена сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF₁₆₅) человека, или гена глиального нейротрофического фактора (GDNF) человека, или гена нейрональной молекулы клеточной адгезии (NCAM1) человека, для использования в лечебных целях. Аденовирусный вектор на основе репликативно-дефектного аденовируса человека 5 серотипа с фибером 35 серотипа (Ad5/F35), экспрессирующим ген сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF₁₆₅) человека, обозначен в настоящем изобретения как «Ad5/F35-VEGF₁₆₅». Аденовирусный вектор на основе репликативно-дефектного аденовируса человека 5 серотипа с фибером 35 серотипа (Ad5/F35), экспрессирующим ген глиального нейротрофического фактора (GDNF) человека, обозначен в настоящем изобретения как «Ad5/F35-GDNF». Аденовирусный вектор на основе репликативно-дефектного аденовируса человека 5 серотипа с фибером 35 серотипа (Ad5/F35), экспрессирующим ген нейрональной молекулы клеточной адгезии (NCAM1) человека, в настоящем изобретении обозначен как «Ad5/F35-NCAM1».

С целью максимальной реализации активности созданной фармацевтической композиции и для предотвращения негативного влияния аденовирусных векторов в составе фармацевтической композиции на организм реципиента в настоящем изобретении эффективная терапевтическая доза фармацевтической композиции доставляется в организм реципиента с помощью его собственных лейкоцитов, выделенных из периферической крови, то есть, путем получения аутологичного лейкоконцентрата, обогащенного фармацевтической композицией, и его последующего внутривенного введения. Для эффективной доставки указанных генов в клетки лейкоконцентрата применяются аденовирусные векторы 5 серотипа с фибером 35 серотипа. Эти аденовирусные вектора эффективно трансдуцируют все ядросодержащие клетки крови через мембранный рецептор CD46 непосредственно в контейнере для крови, что исключает технологию культивирования лейкоцитов in vitro с использованием препаратов животного происхождения, антибиотиков и рекомбинантных факторов роста и их возможные мутации в ходе данной процедуры.

Сущность предполагаемого изобретения иллюстрируется в нижеприведенных примерах, описывающих создание аденовирусных векторов Ad5/F35-VEGF₁₆₅, Ad5/F35-GDNF и Ad5/F35-NCAM1, получения на их основе фармацевтической композиции, способ изготовления аутологичного лейкоконцентрата, обогащенного фармацевтической композицией, а именно комбинацией в равном соотношении трех генов, кодирующих VEGF₁₆₅, GDNF и NCAM1, и способ использования аутологичного лейкоконцентрата, обогащенного фармацевтической композицией, для терапии повреждений головного и спинного мозга, в частности ишемического инсульта головного мозга и контузионной травмы спинного мозга в моделях на мини-свиньях.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На фиг. 1 представлена схематическая диаграмма аденовирусного вектора Ad5/F35 с экспрессионной кассетой, где:

Ad5 - линия черным цветом, обозначает полный геном рекомбинантного аденовируса человека пятого серотипа, с делецией регионов Е1 и Е3; Ψ - сигнал упаковки аденовируса, Ad35 fiber - ген фибера аденовируса человека 35 серотипа; ΔЕ1, ΔЕ3 - области делеций аденовирусного генома.

Экспрессионная кассета в области Е1 области аденовируса:

1 - Промотор;

2 - Целевой ген;

3 - Сигнал полиаденилирования.

На фиг. 2 показаны репликативно-дефектные аденовирусные векторы на основе аденовируса человека 5 серотипа с фибером 35 серотипа, несущие ген VEGF₁₆₅ человека.

Обозначения: «-» Контроль отрицательный; «+» Контроль положительный; «1» - проба; «М» - маркер молекулярного веса. На треках представленной электрофореграммы наличие черной поперечной полосы в пробе, соответствующей полосе положительного контроля искомого молекулярного веса, при отсутствии черной полосы в отрицательном контроле, обозначает положительный результат полимеразной цепной реакции (ПЦР) (генетическая последовательность есть). Таким образом, на представленной электрофореграмме показано отсутствие Е1 области аденовируса, наличие аденовирусного генома 5 серотипа, наличие фибера аденовируса 35 серотипа, наличие целевого гена - VEGF₁₆₅ человека.

Праймеры:

Adeno: AdH01/AdH02; ACTACAAYATTGGCTACCAGG/ CAAAACATAAAGAAGKGTGGGC, ПЦР-продукт = 440 п.о.

E1 область аденовирусного генома (должна отсутствовать): E1bF/pIV-R; GATGTGACCGAGGAGCTGAG/GCTGGGAACATAGCCAACCT, ПЦР-продукт = 1034 п.о.

35 fiber: Ad-35-for/Ad35-rev; GGGCTTGTTAATGGCTACGTG/ GGGGGATGTGGTCAGCGTAGC, ПЦР-продукт = 441 п.о.

Ген VEGF₁₆₅: pSVP21/SV165-rev; GCTGCTCTACCTCCACCATG/ CACGTCTGCGGATCTTGTAC, ПЦР-продукт = 440 п.о.

На фиг. 3 показаны репликативно-дефектные аденовирусные векторы на основе аденовируса человека 5 серотипа с фибером 35 серотипа, несущие ген GDNF человека.

Обозначения: «-» Контроль отрицательный; «+» Контроль положительный; «1» - проба; «М» - маркер молекулярного веса. На треках представленной электрофореграммы наличие черной поперечной полосы в пробе, соответствующей полосе положительного контроля искомого молекулярного веса, при отсутствии черной полосы в отрицательном контроле, обозначает положительный результат ПЦР (генетическая последовательность есть). Таким образом, на представленной электрофореграмме показано отсутствие Е1 области аденовируса, наличие аденовирусного генома 5 серотипа, наличие фибера аденовируса 35 серотипа, наличие целевого гена - GDNF человека. Праймеры:

Adeno: AdH01/AdH02; ACTACAAYATTGGCTACCAGG/ CAAAACATAAAGAAGKGTGGGC, ПЦР-продукт = 440 п.о.

El область аденовирусного генома (должна отсутствовать): E1bF/pIV-R; GATGTGACCGAGGAGCTGAG/GCTGGGAACATAGCCAACCT, ПЦР-продукт = 1034 п.о.

35 fiber: Ad-35-for/Ad35-rev; GGGCTTGTTAATGGCTACGTG/ GGGGGATGTGGTCAGCGTAGC, ПЦР-продукт = 441 п.о.

Ген GDNF: GDNF890-907-for/GDNF651-630-rev,

GGATGTCGTGGCTGTCTGCCTGG / TGCCCCTCTGGCCTCTCCGACC, ПЦР-продукт = 300 п.о.

На фиг. 4 показаны репликативно-дефектные аденовирусные векторы на основе аденовируса человека 5 серотипа с фибером 35 серотипа, несущие ген NCAM1 человека.

Обозначения: «-» Контроль отрицательный; «+» Контроль положительный; «1» - проба; «М» - маркер молекулярного веса. На треках представленной электрофореграммы наличие черной поперечной полосы в пробе, соответствующей полосе положительного контроля искомого молекулярного веса, при отсутствии черной полосы в отрицательном контроле, обозначает положительный результат ПЦР (генетическая последовательность есть). Таким образом, на представленной электрофореграмме показано отсутствие Е1 области аденовируса, наличие аденовирусного генома 5 серотипа, наличие фибера аденовируса 35 серотипа, наличие целевого гена-NCAMI.

Праймеры:

Adeno: AdH01/AdH02; ACTACAAYATTGGCTACCAGG/ CAAAACATAAAGAAGKGTGGGC, ПЦР-продукт = 440 п.о.

E1 область аденовирусного генома (должна отсутствовать): E1bF/pIV-R; GATGTGACCGAGGAGCTGAG/GCTGGGAACATAGCCAACCT, ПЦР-продукт = 1034 и.о.

35 fiber: Ad-35-for/Ad35-rev; GGGCTTGTTAATGGCTACGTG/ GGGGGATGTGGTCAGCGTAGC, ПЦР-продукт = 441 п.о.

Ген NCAM1: ncam-for/ncam-r, GCCGTGATTGTGTGTGATGT/ GCCTCGTCGTTCTTATCCAC, ПЦР-продукт = 450 п.о.

На фиг. 5 представлены результаты поведенческого теста «Открытое поле». Анализ горизонтальной активности у экспериментальных мини-свиней до моделирования инсульта (Тренировка) и на 3, 7 и 14 и 21 сутки после окклюзии средней мозговой артерии. Темными прямоугольниками отображены данные по контрольным животным, светло-серыми - по опытным животным. Точки - индивидуальные значения; поперечные линии - медиана значений, 1-ый и 3-ий квартили.

На фиг. 6 представлены данные морфометрического анализа относительного объема инфаркта головного мозга контрольных и опытных мини-свиней на 21 сутки после окклюзии средней мозговой артерии. Темными прямоугольниками отображены данные по контрольным животным, светло-серыми - по опытным животным. Точки - индивидуальные значения; поперечные линии - медиана значений, 1-ый и 3-ий квартили.

На фиг. 7 представлены результаты поведенческого теста PTIBS (Porcine Thoracic Injury Behavioral Scale - шкала поведения свиньи при травме грудного отдела спинного мозга). Двигательную активность экспериментальных мини-свиней оценивали с помощью PTIBS через 4 и 8 недель после моделирования контузионной травмы спинного мозга. Темная линия - контрольная группа животных; светло-серая линия - опытная группа животных. Вертикальные линии - стандартное отклонение.

На фиг. 8 представлены результаты морфометрического анализа сохранности серого вещества в задних рогах спинного мозга в ростральном (Р) и каудальном (К) сегментах относительно эпицентра повреждения у контрольных и опытных мини-свиней через 8 недель после моделирования нейротравмы. Поперечные линии - медиана значений, 1-й и 3-й квартили. * - р<0,005.

Пример 1. Создание аденовирусных векторов Ad5/F35-VEGF₁₆₅, Ad5/F35-GDNF и Ad5/F35-NCAM1

Основные работы по созданию аденовирусных векторов на основе аденовируса человека 5 серотипа с фибером от аденовируса человека 35 серотипа, несущих целевые трансгены VEGF₁₆₅, GDNF или NCAM1 (Ad5/F35-VEGF₁₆₅, Ad5/F35-GDNF, Ad5/F35-NCAM1, соответственно) (Фигура 1), проводили с использованием общеизвестных стандартных методик, описанных в руководствах для специалистов данной области (например, Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Vols 1, 2 and 3 // Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001, 2100 pp.).

С целью получения аденовирусных векторов на основе аденовирусов человека пятого серотипа (Ad5) был использован способ получения, описанный Graham в 2000 году (Р Ng, DT Cummings, CM Evelegh, FL Graham. Yeast recombinase FLP functions effectively in human cells for construction of adenovirus vectors. Biotechniques. 2000 Sep; 29(3):524-6, 528). Согласно этому способу, для конструирования аденовирусного вектора, необходимо было получить две плазмиды: 1) плазмиду несущую геном рекомбинантного аденовируса и 2) шаттл-вектор, несущий экспрессионную кассету. В итоге были сконструированы две плазмиды. Первая плазмида, несущая геном рекомбинантного аденовируса и ген фибера аденовируса человека 35 серотипа pAd5-F35-frt, в своем составе содержала:

- полный геном рекомбинантного аденовируса человека 5 серотипа, с делецией регионов Е1 и Е3

- экспрессионную кассету, состоящую из CMV-промотора, Flp-рекомбиназы и SV40-терминатора;

- инвертированные терминальные повторы (ITR) аденовирусного генома;

- сайт рекомбинации fit, по которому происходит рекомбинация в клетках HEK293 между плазмидой pAd5-F35-frt и шаттл-вектором pGamal.

Второй сконструированной плазмидой, необходимой для получения аденовирусных векторов Ad5/F35, был шаттл-вектор pGamal, который содержал:

- инвертированные терминальные повторы (ITR) аденовирусного генома;

- сигнал упаковки аденовирусного генома - Encap;

- экспрессионную кассету, состоящую из CMV-промотора, полилинкера для клонирования гена интереса и SV40-терминатора;

- сайт рекомбинации fit, по которому происходит рекомбинация в клетках HEK293 между плазмидой pAd5-F35-frt и шаттл-вектором pGamal.

Таким образом, были получены плазмиды, при совместной трансфекции которых в пермиссивных клетках HEK293 происходит рекомбинация по сайту fit, с образованием рекомбинантного генома аденовируса, способного к образованию вирионов и к размножению.

Этап II. Получение плазмид, несущих гены VEGF₁₆₅, или GDNF, или NCAM1.

В плазмиду pGamal были клонированы нуклеотидные последовательности, кодирующие VEGF₁₆₅ (SEQ ID NO: 1), или GDNF (SEQ ID NO: 2) или NCAM1 (SEQ ID NO: 3). Нуклеотидные последовательности, кодирующие VEGF₁₆₅, или GDNF, или NCAM1, и аминокислотные последовательности их белковых продуктов приведены в Списке последовательностей.

Таким образом, были получены плазмиды pGamal-VEGF₁₆₅, pGamal-GDNF, pGamal-NCAM1.

Этап III. Получение аденовирусных векторов 5 серотипа с фибером аденовируса 35 серотипа, в области делеции Е1 несущих экспрессионную кассету с последовательностями гена VEGF₁₆₅, или гена GDNF, или гена NCAM1.

На данном этапе были получены репликативно-дефектные аденовирусные векторы на основе генома аденовируса человека 5-го серотипа, с фибером 35 серотипа, содержащие генетические конструкции, созданные на этапе II.

Все нижеописанные работы по трансфекции эукариотических клеток и наращивания вирионов, проводили с использованием общеизвестных стандартных методик, широко описанных в руководствах для специалистов данной области.

Содержание аденовирусных векторов измеряется культуральным методом в единицах активности (БОЕ, бляшкобразующие единицы), которые при необходимости могут быть измерены спектрофотометрически в количестве вирусных частиц, при этом предпочтительное соотношение единиц активности к вирусным частицам находится в диапазоне от 1:100 до 1:500.

Котрансфекцию плазмидами pAd5-F35 совместно с pGamal-VEGF₁₆₅, или pGamal-GDNF, или pGamal-NCAM1, проводили на пермиссивной клеточной культуре клеток эмбриональной почки человека линии 293 НЕК. Клетки линии 293 НЕК содержат в своем геноме встроенную область Е1 генома аденовируса человека 5 серотипа, благодаря чему в них может происходить размножение репликативно-дефектных аденовирусных векторов 5 серотипа. Через несколько суток после трансфекции наблюдали цитопатическое действие вируса. Полученные аденовирусные векторы Ad5/F35-VEGF₁₆₅, Ad5/F35-GDNF и Ad5/F35-NCAM1, в виде вируссодержащей жидкости с титром 10⁸ БОЕ/мл, хранили при температуре минус 70 °.

Таким образом, авторы изобретения получили репликативно-дефектные (отсутствуют Е1 и Е3 регионы генома аденовируса) аденовирусные векторы, созданные на основе аденовируса человека 5 серотипа с фибером аденовируса человека 35 серотипа, несущие последовательность кодирующую VEGF₁₆₅, или последовательность кодирующую GDNF, или последовательность кодирующую NCAM1, что говорит о соответствии данных аденовирусных векторов заявляемым по изобретению требованиям, и было подтверждено результатами полимеразной цепной реакции (ПЦР) (Фигуры 2, 3, 4).

Пример 2. Получение фармацевтической композиции, содержащей аденовирусные векторы Ad5/F35-VEGF₁₆₅, Ad5/F35-GDNF и Ad5/F35-NCAM1

Для получения фармацевтической композиции, содержащей аденовирусные векторы Ad5/F35-VEGF₁₆₅, Ad5/F35-GDNF и Ad5/F35-NCAM1, использовали культуру клеток почки эмбриона человека НЕК 293, адаптированную для роста в суспензии. Клеточную суспензию, полученную в примере 1, использовали для дальнейшего наращивания титра аденовирусных векторов с целью достижения эффективного количества в фармацевтической композиции и возможности ее использования в лечебных целях.

Волновой биореактор, содержащий 4500,0 мл суспензии пермиссивной клеточной культуры 293НЕК заражали вируссодержащей жидкостью из примера 1 после размораживания объемом 500,0 мл, содержащей аденовирусные векторы Ad5/F35-VEGF₁₆₅, или Ad5/F35-GDNF, или Ad5/F35-NCAM1 с титром 5×10⁷-10⁸ БОЕ/мл. Для наращивания аденовирусных векторов и достижения более высокого титра, их культивировали в течение 48 часов. Затем клеточную массу очищали с помощью общеизвестных методов ультрафильтрации и высокоэффективной жидкостной хроматографии в несколько этапов: осаждение клеточной массы центрифугированием; перемораживание осадка; обработка бензоназой; центрифугирование для удаления клеточного дебриса; ультрафильтрация супернатанта; анионобменная хроматография; эксклюзионная хроматогафия; диафильтрация с заменой буфера на фармацевтически приемлемый буфер.

Для стерилизации полученные монополупродукты фильтровали через систему фильтров с размером пор 0,22 мкМ, с получением препарата с активностью 1×10⁹-1×10¹⁰ БОЕ аденовирусных векторов Ad5/F35-VEGF₁₆₅, или Ad5/F35-GDNF, или Ad5/F35-NCAM1 на 1 мл.

Фармацевтически приемлемый буферный раствор может быть водный раствор, содержащий: 10 mM TrisHCl, 75 mM NaCl, 1 mM MgCl₂, 5% сахароза, 0,05% полисорбат 80, 0,5% этанол, 100 мкМ ЭДТА. Но не ограничивается им.

Далее для получения фармацевтической композиции по настоящему изобретению, монополупродукты полученные на конечной стадии производства, описанного в данном примере выше, смешивали в условиях стерильности и доводили стерильным фармацевтически приемлемым буферным раствором до требуемой эффективной концентрации. При этом соотношение аденовирусных векторов Ad5/F35-VEGF165, Ad5/F35-GDNF, Ad5/F35-NCAM1 в смеси составляло 1:1:1.

Изобретенная фармацевтическая композиция может использоваться для изготовления по GMP-технологии лекарственных препаратов в стеклянных флаконах, ампулах и может применяться для прямой генной терапии или для клеточно-опосредованной генной терапии, например, для получения лейкоконцентрата, обогащенного данной фармацевтическая композицией.

При этом, приемлемая первичная упаковка может содержать: 1 мл, 3 мл, 5 мл, 10 мл фармацевтической композиции для удобства использования в практической медицине.

Дополнительно, для длительного хранения фармацевтическая композиция подлежит заморозке после розлива в первичную упаковку при температуре от минус 18°С и ниже.

Таким образом, в результате проведенных работ была получена фармацевтическая композиция, содержащая следующие активные вещества:

1. Аденовирусный вектор Ad5/F35-VEGF₁₆₅, на основе аденовируса человека 5 серотипа с фибером 35 серотипа, несущий последовательность гена VEGF₁₆₅ человека представленный SEQ ID NO: 1;

2. Аденовирусный вектор Ad5/F35-GDNF на основе аденовируса человека 5 серотипа с фибером 35 серотипа, несущий последовательность гена GDNF представленный SEQ ID NO: 2;

3. Аденовирусный вектор Ad5/F35-NCAM1 на основе аденовируса человека 5 серотипа с фибером 35 серотипа, несущий последовательность гена NCAM1 представленный SEQ ID NO: 3.

Вышеуказанные аденовирусные векторы находятся в составе композиции в соотношении 1:1:1. Дополнительно, полученная фармацевтическая композиция содержит фармацевтически приемлемый буферный раствор, для сохранения стабильности аденовирусных векторов. Таким образом, задача по созданию фармацевтической композиции по настоящему изобретению выполнена.

Пример 3. Способ получения аутологичного лейкоконцентрата, обогащенного генетическим материалом, а именно аденовирусными векторами в составе фармацевтической композиции из примера 2, и его использование для терапии ишемического инсульта головного мозга в моделях на мини-свиньях

В исследовании были использованы самки мини-свиней (вьетнамская вислобрюхая) весом 20-25 кг. Протокол эксперимента, включающий анестезию, хирургические вмешательства, послеоперационный уход и эвтаназию на конечных точках эксперимента, был одобрен Локальным этическим комитетом Казанского государственного медицинского университета (№5 от 26 мая 2020 года).

Этап I. Изготовление аутологичного лейкоконцентрата, обогащенного генами, кодирующими VEGF₁₆₅, GDNF и NCAM1.

За сутки до моделирования ишемического инсульта головного мозга у мини-свиней под глубоким наркозом в асептических условиях из подключичной вены забирали 50 мл крови в стерильные закрытые контейнеры (гемакон) объемом 250 мл с антикоагулянтом CPDA-1 (Green Cross, Корея) (объем консерванта в каждом пакете 35 мл). Забранную кровь процессировали для получения лейкоконцентрата по способу [Патент РФ №2716013, МПК A61K 48/00, A61K 35/00, опубл. 05.03.2020, Бюл. №7].

В контейнер для крови, содержащий лейкоконцентрат, через порт с помощью стерильного шприца вводили фармацевтическую композицию, полученную в Примере 2, в составе которой аденовирусные векторы Ad5/F35-VEGF₁₆₅, Ad5/F35-GDNF и Ad5/F35-NCAM1, находились в равном соотношении каждого вектора 1:1:1. Объем фармацевтической композиции составлял объем, необходимый для достижения параметра MOI (multiplicity of infection - множественность инфицирования) равному 10 (MOI=10), т.е. соотношение клеток лейкоконцентрата и аденовирусных векторов фармацевтической композиции являлось 1:10. При указанном значении параметра MOI была достигнута эффективность трансдукции клеток лейкоконцентрата в 1,7%. Для повышения эффективности трансдукции, MOI может быть повышен до 100 аденовирусных векторов в расчете на одну клетку лейкоконцентрата. Трансдукцию лейкоконцентрата проводили в течение 12 часов при постоянном покачивании на шейкере (ELMI) при комнатной температуре (21-22°С).

Через 12 часов в контейнер для крови, содержащий лейкоконцентрат, обогащенный генетическим материалом, добавляли 200 мл стерильного физиологического раствора и центрифугировали при 1000 rpm и температуре 10°С в течение 10 минут с помощью центрифуги Presvac. Надосадочную жидкость (физиологический раствор, содержащий фрагменты клеток и свободные вирусные частицы) из контейнера экстрагировали таким образом, чтобы в контейнере осталось приблизительно 30 мл физиологического раствора, включающего клеточную суспензию - лейкоконцентрат, обогащенный фармацевтической композицией, который хранили до использования при комнатной температуре.

Этап II. Моделирование ишемического инсульта головного мозга у мини-свиней.

На следующий день после забора крови экспериментальных животных наркотизировали с помощью Zoletil®100 (Virbac Sante Animale, France), 3 мг/кг внутримышечно. На операционном столе животных подключали к ингаляционному наркозному аппарату (Minor Vet Optima, Zoomed), по которому подавали изофлуран (Laboratories Karizoo, S.A., Spain) в 2,0-2,5% в смеси с кислородом. Все хирургические манипуляции проводили в соответствии с правилами асептики и антисептики. На первом этапе для уменьшения кровотока в вилизиевом круге перевязывали правую сонную артерию. На втором этапе доступ к средней мозговой артерии осуществлялся через трепанационное отверстие в левой височной кости. После трепанации рассекали твердую мозговую оболочку и путем электрокоагуляции прижигали дистальные ветви средней мозговой артерии под операционным микроскопом.

Опытным животным (n=3) аутологичный лейкоконцентрат, обогащенный фармацевтической композицией, вводили через 4 часа после моделирования инсульта внутривенно в объеме 30 мл через ушную вену. Контрольным животным вводили 30 мл физиологического раствора (n=3).

В послеоперационном периоде все экспериментальные животные получали антибактериальную (Цефотаксим 50 мг/кг, в/м, разбавляя вместе с 2% лидокаином и водой для инъекций, 1 раз в сутки, 10 дней) и обезболивающую терапию (Кеторол 2,5 мг/кг, в/м, 3 раза в сутки, 10 дней).

Этап III. Оценка эффективности клеточно-опосредованной генной терапии ишемического инсульта у мини-свиней с помощью аутологичного лейкоконцентрата, обогащенного фармацевтической композицией.

Двигательную активность мини-свиней оценивали с помощью теста «Открытое поле». На 3 сутки после моделирования ишемического инсульта головного мозга горизонтальная активность контрольных и опытных мини-свиней была снижена при сравнении с данными, полученными от этих животных до операции (Тренировка). Через 7 суток у контрольных животных горизонтальная активность продолжала снижаться, а у опытных животных стала увеличиваться. К 21 суткам значения у мини-свиней из опытной группы не отличались от интактных значений и были в два раза выше, чем у контрольных животных (Фигура 5).

Морфометрический анализ относительного объема инфаркта мозга у экспериментальных животных через 21 сутки после моделирования ишемического инсульта обнаружил, что объем инфаркта головного мозга у мини-свиней из опытной группы был меньше по сравнению с животными из контрольной группы (Фигура 6).

Полученные нами данные о восстановлении двигательной активности и объеме инфаркта мозга у мини-свиней после моделирования ишемического инсульта свидетельствуют о положительном терапевтическом эффекте клеточно-опосредованной генной терапии с помощью аутологичного лейкоконцентрата, обогащенного фармацевтической композицией.

Пример 4. Способ изготовления аутологичного лейкоконцентрата, обогащенного генетическим материалом, а именно аденовирусными векторами в составе фармацевтической композиции из примера 2, и его использование для терапии контузионной травмы спинного мозга в моделях на мини-свиньях

В исследовании были использованы самки мини-свиней (вьетнамская вислобрюхая) весом 20-25 кг. Протокол эксперимента, включающий анестезию, хирургические вмешательства, послеоперационный уход и эвтаназию на конечных точках эксперимента, был одобрен Локальным этическим комитетом Казанского государственного медицинского университета (№5 от 26 мая 2020 года).

Этап I (см. Этап I в Примере 3).

Этап II. Моделирование контузионной травмы спинного мозга у мини-свиней.

На следующий день после забора крови экспериментальных животных наркотизировали с помощью Zoletil®100 (Virbac Sante Animale, France), 3 мг/кг внутримышечно. На операционном столе животных подключали к ингаляционному наркозному аппарату (Minor Vet Optima, Zoomed), по которому подавали изофлуран (Laboratorios Karizoo, S.A., Spain) в 2,0-2,5% в смеси с кислородом. Все хирургические манипуляции проводили в соответствии с правилами асептики и антисептики. Контузионную травму спинного мозга моделировали на уровне Th8-Th9 позвонков при помощи импактора (металлический цилиндр со штативом, с вертикально падающим внутри цилиндра металлическим стержнем весом 50 г). Доступ к спинному мозгу получали после ламинэктомии на уровне соответствующих позвонков. Металлический цилиндр импактора фиксировали на расстоянии 50 см от открытой поверхности спинного мозга. Удар металлическим стержнем по спинному мозгу наносился однократного при фиксации животного с вытянутым прямым позвоночником.

Опытным животным (n=4) аутологичный лейкоконцентрат, обогащенный фармацевтической композицией, вводили через 4 часа после моделирования нейротравмы внутривенно в объеме 30 мл через ушную вену. Контрольным животным вводили 30 мл аутологичного лейкоконцентрата (n=4).

В послеоперационном периоде все опытные и контрольные животные получали:

1) Цефотаксим 50 мг/кг, в/м, разбавляя вместе с 2% лидокаином и водой для инъекций, 1 раз в сутки, 10 дней,

2) Кеторол 2,5 мг/кг, в/м, 3 раза в день, 10 дней,

3) Тиамин (B₁) / Пиридоксин (В₆) 2 мл (чередовать дни), в/м, 1 раз в день, 10 дней,

4) Цианокобаламин (В₁₂) 2 мл, в/м, 1 раз в день, 10 дней,

5) Аскорбиновая кислота (С) 4 мл, в/м, 1 раз в день, 10 дней,

6) Рибоксин 5 мл, в/м, 1 раз в день, 10 дней,

7) Димедрол 1 мл, в/м, 1 раз в день, 10 дней,

8) Актовегин 2 мл, в/м, 1 раз в день, 3 дня,

9) Прозерин 0,5 мл, п/к, 1 раз в день, 10 дней,

10) Дексаметазон 1 мл, п/к, 1 раз в день, 10 дней.

11) Физиологический раствор (0,9% NaCl) 400,0 мл, п/к, 1 раз в день, 5 дней.

Этап III. Оценка эффективности клеточно-опосредованной генной терапии контузионной травмы спинного мозга у мини-свиней с помощью аутологичного лейкоконцентрата, обогащенного фармацевтической композицией.

Двигательную активность у экспериментальных животных оценивали по шкале поведения мини-свиньи при травме грудного отдела спинного мозга (Porcine Thoracic Injury Behavioral Scale - PTIBS). Анализ данных позволил установить, что через 4 недели после нейротравмы значение теста у экспериментальных животных были значительно снижены, при этом у контрольных животных значения были ниже, чем у мини-свиней из опытной группы. Через 8 недель после моделирования нейротравмы двигательная активность у контрольных мини-свиней не изменялась, а у опытных животных продолжала увеличиваться (Фигура 7).

Морфометрический анализ сохранности серого вещества в задних рогах спинного мозга (место нанесения удара) обнаружил, что у мини-свиней из опытной группы через 8 недель после моделирования контузионной травмы спинного мозга площадь сохранившейся ткани в ростральном сегменте (выше эпицентра травмы) не отличалась у контрольных и опытных животных. Однако в каудальном сегменте (ниже эпицентра травмы) у опытных животных сохранность серого вещества была значительно выше, чем у контрольных мини-свиней (Фигура 8).

Полученные нами данные о восстановлении двигательной активности и сохранности серого вещества спинного мозга у мини-свиней с контузионной травмой спинного мозга свидетельствуют о терапевтической эффективности клеточно-опосредованной генной терапии с помощью аутологичного лейкоконцентрата, обогащенного фармацевтической композицией.

Таким образом, Примеры 3 и 4 свидетельствует что, аутологичный лейкоконцентрат, обогащенный фармацевтической композицией, а именно комбинацией из трех генов, кодирующих VEGF165, GDNF и NCAM1, каждый из которых в качестве целевого гена встроен в экспрессионную кассету аденовирусного вектора 5 серотипа с фибером 35 серотипа и используется в составе единой фармацевтической композиции, является эффективным генно-клеточным препаратом для терапии ишемических и травматических повреждений головного и спинного мозга. Тот факт, что терапевтическая эффективность данной комбинации генов, доставленных с помощью лейкоцитов крови пуповины человека, была доказана в экспериментах на мышах с моделью бокового амиотрофического склероза (Islamov R.R., Rizvanov A.A., Fedotova V.Y., Izmailov A.A., Safiullov Z.Z., Garanina Е.Е., Salafutdinov I.I., Sokolov М.Е., Mukhamedyarov М.A., András Palotás. Tandem delivery of multiple therapeutic genes using umbilical cord blood cells improves symptomatic outcomes in ALS // Molecular Neurobiology, 2016. DOI 10.1007/s 12035-016-0017-х), предполагает использование аутологичного лейкоконцентрата, обогащенного созданной фармацевтической композицией, и для лечения нейродегенеративных заболеваний, в частности, бокового амиотрофического склероза, болезни Альцгеймера, болезни Паркинсона и др.

Преимущество заявленного способа терапии ишемического инсульта, нейротравм и нейродегенеративных заболеваний от известных в мире на дату подачи заявки методов прямой генной терапии или клеточно-опосредованной генной терапии заключается в использовании аутологичного лейкоконцентрата, обогащенного генетическим материалом, а именно комбинацией из трех генов, кодирующих VEGF₁₆₅, GDNF и NCAM1. Применение такой комбинации рекомбинантных генов для стимулирования нейрорегенерации в ЦНС является обоснованным. GDNF имеет выраженное нейропротекторное действие. VEGF, кроме известного ангиогенного действия, также проявляет свойства типичного нейротрофического фактора. Экспрессия нейрональной молекулы клеточной адгезии (NCAM1) на поверхности генетически модифицированных лейкоцитов усиливает их адресную миграцию в область нейродегенерации любой этиологии и повышает их жизнеспособность, что в свою очередь обеспечивает продукцию рекомбинантных нейротрофических факторов (VEGF₁₆₅ и GDNF) генетически модифицированными лейкоцитами не только в кровяное русло, но и локально в месте патологического процесса. При этом рекомбинантные нейротрофические факторы (VEGF₁₆₅ и GDNF) секретируемые генетически модифицированными лейкоцитами в кровеносное русло, также могут эффективно достигать область нейродегенерации через поврежденный патологическим процессом гематоэнцефалический барьер. Кроме того продукция рекомбинантных терапевтических молекул генетически модифицированными лейкоцитами начнется уже в первые сутки после аутоинфузии и продолжится в течение трех недель, что обусловлено периодом полувыведения генетических конструкций. Таким образом, введение в организм аутологичного лейкоконцентрата, обогащенного генетическим материалом, а именно комбинацией их трех генов, кодирующих VEGF165, GDNF и NCAM1, обеспечивает временную продукцию биологически активных белковых молекул, стимулирующих нейрорегенерацию, и не исключает повторное введение аутологичного лейкоконцентрата, обогащенного генетическим материалом, с целью продолжения лечения.

Аутологичный лейкоконцентрат, обогащенный генетическим материалом, а именно фармацевтической композицией, включающей аденовирусные вектора Ad5/F35-VEGF₁₆₅, Ad5/F35-GDNF, Ad5/F35-NCAM1 в соотношении 1:1:1, используют в лечебных целях по конкретному назначению, например, путем внутривенного введения пациентам после ишемического инсульта головного мозга, травмы спинного мозга или с нейродегенеративными заболеваниями.

Группа изобретений относится к области медицины и фармацевтики и может быть использована для нейрореабилитации пациентов после ишемического инсульта, нейротравмы и с нейродегенеративными заболеваниями. Предложена фармацевтическая композиция для терапии при повреждениях головного и спинного мозга, содержащая аденовирусный вектор на основе аденовируса человека 5 серотипа с фибером 35 серотипа, содержащий кодирующую последовательность гена VEGF165 человека, представленную SEQ ID NO: 1, аденовирусный вектор на основе аденовируса человека 5 серотипа с фибером 35 серотипа, содержащий кодирующую последовательность гена GDNF человека, представленную SEQ ID NO: 2, аденовирусный вектор на основе аденовируса человека 5 серотипа с фибером 35 серотипа, содержащий кодирующую последовательность гена NCAM человека, представленную SEQ ID NO: 3, а также фармацевтически приемлемый буферный раствор. Также раскрыты способ получения лейкоконцентрата, обогащенного генетическим материалом, применение этого лейкоконцентрата в составе комплексной терапии повреждений головного и спинного мозга и способ терапии повреждений головного и спинного мозга у пациента. Обеспечивается эффективная клеточно-опосредованная генная терапия ишемических и травматических повреждений головного и спинного мозга. 4 н. и 10 з.п. ф-лы, 8 ил., 4 пр.

1. Фармацевтическая композиция для терапии при повреждениях головного и спинного мозга, содержащая аденовирусный вектор на основе аденовируса человека 5 серотипа с фибером 35 серотипа, содержащий кодирующую последовательность гена VEGF₁₆₅ человека, представленную SEQ ID NO: 1, аденовирусный вектор на основе аденовируса человека 5 серотипа с фибером 35 серотипа, содержащий кодирующую последовательность гена GDNF человека, представленную SEQ ID NO: 2, аденовирусный вектор на основе аденовируса человека 5 серотипа с фибером 35 серотипа, содержащий кодирующую последовательность гена NCAM человека, представленную SEQ ID NO: 3, а также фармацевтически приемлемый буферный раствор.

2. Фармацевтическая композиция по п. 1, в которой аденовирусный вектор на основе аденовируса человека 5 серотипа с фибером 35 серотипа имеет делеции в областях Е1 и Е3 аденовирусного генома, причем экспрессионная кассета с целевым геном находится в области Е1.

3. Фармацевтическая композиция по п. 2, в которой экспрессионная кассета также включает промотор и сигнал полиаденилирования.

4. Фармацевтическая композиция по любому из пп. 1-3, где аденовирусные векторы находятся в соотношении 1:1:1.

5. Фармацевтическая композиция по любому из пп. 1-4, где суммарная активность аденовирусных векторов от 1×10⁹ до 1×10¹⁰ БОЕ на мл.

6. Фармацевтическая композиция, по пп. 1-5, где каждый аденовирусный вектор находится в количестве, эффективном для осуществления трансдукции лейкоцитов крови человека ex vivo.

7. Фармацевтическая композиция по пп. 1-6, в которой фармацевтический приемлемый буферный раствор может быть водным раствором следующего состава: 10 mM TrisHCl, 75 mM NaCl, 1 mM MgCl₂, 5% сахароза, 0,05% полисорбат 80, 0,5% этанол, 100 мкМ ЭДТА.

8. Способ получения лейкоконцентрата, обогащенного генетическим материалом, где способ включает трансдукцию лейкоконцентрата аденовирусными векторами в составе фармацевтической композиции по п. 1.

9. Способ по п. 8, где лейконцентрат является аутологичным лейкоконцентратом.

10. Способ по любому из пп. 8 или 9, где трансдукция осуществляется при соотношении клеток лейкоконцентрата и аденовирусных векторов от 1:10 до 1:100.

11. Способ терапии повреждений головного и спинного мозга у пациента, включающий последовательные действия: забор крови у пациента с получением аутологичного лейкоконцентрата; трансдукция полученного лейкоконцентрата ex vivo аденовирусными векторами в составе фармацевтической композиции по п. 1 с получением аутологичного лейкоконцентрата, обогащенного генетическим материалом; обратное введение пациенту лейкоконцентрата, обогащенного генетическим материалом, в количестве, эффективном для терапии повреждений головного и спинного мозга.

12. Способ по п. 11, где аутологичный лейкоконцентрат, обогащенный генетическим материалом, вводят внутривенно.

13. Применение аутологичного лейкоконцентрата, обогащенного генетическим материалом, полученного способом по любому из пп. 8-10, в составе комплексной терапии повреждений головного и спинного мозга.

14. Применение по п. 13, где повреждением головного и спинного мозга, в частности, являются ишемический инсульт головного мозга, травма спинного мозга.