АДЕНОВИРУСНЫЕ ВЕКТОРЫ И СПОСОБЫ И ПРИМЕНЕНИЯ, СВЯЗАННЫЕ С НИМИ Российский патент 2014 года по МПК C12N15/861 C07K14/535 A61K35/76 A61P35/00 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии и медицины. А именно, изобретение относится к лечению рака. Более конкретно, настоящее изобретение относится к онколитическим аденовирусным векторам и клеткам и фармацевтическим композициям, содержащим указанные векторы. Настоящее изобретение также относится к применению указанных векторов в производстве лекарственного средства для лечения рака у субъекта и к способу лечения рака у субъекта. Кроме того, настоящее изобретение относится к способам продуцирования GM-CSF в клетке и повышения опухолеспецифического иммунного ответа у субъекта, а также к применениям онколитического аденовирусного вектора изобретения для продуцирования GM-CSF в клетке и для повышения опухолеспецифического иммунного ответа у субъекта.

Предшествующий уровень техники

Рак можно лечить оперативно, с помощью гормональной терапии, химиотерапии и/или лучевой терапии, однако во многих случаях злокачественные опухоли, которые часто обнаруживаются на поздней стадии, нельзя излечить существующими терапевтическими способами. Следовательно, существует необходимость в новых способах лечения, нацеленных на раковые клетки, таких как генная терапия.

На протяжении последних двадцати лет технология переноса генов находится в стадии интенсивного исследования. Целью генной терапии рака является введение гена в клетку опухоли. Эти терапевтические гены, вводимые в клетку-мишень, могут, например, корректировать мутировавшие гены, подавлять активный онкогенез или генерировать дополнительные свойства в клетке. Подходящие экзогенные терапевтические гены включают, но не ограничиваются, иммунотерапевтические, антиангиогенные, хемопротективные и "суицидальные" гены, и их можно вводить в клетку, применяя модифицированные вирусные векторы или невирусные способы, включая электропорацию, генную пушку и липидные или полимерные покрытия.

Требования для оптимальных вирусных генов включают эффективную способность находить конкретные клетки-мишени и экспрессировать вирусный геном в клетках-мишенях. Кроме того, оптимальные векторы должны оставаться активными в тканях-мишенях или клетках-мишенях. Все эти свойства вирусных генов были обнаружены в течение последних декад, и, например, ретровирусные, аденовирусные и аденоассоциированные вирусные векторы были широко исследованы в биомедицине.

Для дальнейшего усиления пенетрации опухоли и локального усиления противоопухолевого действия, сконструированы селективные онколитические агенты, например условно репликационные аденовирусы. Онколитические аденовирусы являются перспективным инструментом для лечения рака. Опухолевые клетки погибают от онколитических аденовирусов благодаря репликации вируса в опухолевой клетке, при этом последняя фаза репликации приводит к высвобождению тысяч вирионов в окружающие опухолевые ткани, вследствие чего происходит эффективная пенетрация опухоли и реинфекция сосудов. Опухолевые клетки обеспечивают репликацию вируса, в то время как нормальные клетки сберегаются благодаря сконструированным изменениям в вирусном геноме, который предотвращает репликацию в неопухолевых клетках.

В дополнение к опосредованной репликацией клеточной гибели, онколитические аденовирусы также можно «заряжать» различными терапевтическими трансгенами. Этот подход объединяет преимущества традиционной доставки генов с эффективностью агентов, способных вызывать репликацию. Одна задача заряженных вирусов состоит в индукции иммунной реакции по отношению к клеткам, которые обеспечивают репликацию вируса. Репликация вируса сама по себе, хотя и иммуногенна, обычно недостаточна для индуцирования эффективного противоопухолевого иммунитета. Для усиления индукции терапевтического иммунитета вирусы можно заряжать стимулирующими белками, такими как цитокины, для облегчения введения опухолевых антигенов в антиген-презентирующие клетки, такие как дендритные клетки, и их стимуляции и/или созревания. Введение иммунотерапевтических генов в опухолевые клетки и к тому же трансляция белков приводит к активации иммунного ответа и эффективному разрушению опухолевых клеток. Наиболее соответствующими в этом отношении иммунными клетками являются натуральные киллеры (NK) и цитотоксические CD8+ Т-клетки.

Аденовирусы являются безоболочными икосаэдрическими вирусами среднего размера (90-100 нм), которые имеют двухцепочечную линейную молекулу ДНК примерно в 36 кб в белковом капсиде. Вирусный капсид имеет фиберные структуры, которые участвуют в прикреплении вируса к клетке-мишени. Сначала выступающий домен белка фибера соединяется с рецептором клетки-мишени (например, CD46 или рецептором аденовируса коксаки (CAR)), затем вирус взаимодействует с молекулой интегрина и в итоге вирус подвергается эндоцитозу в клетке-мишени. Затем вирусный геном транспортируется из эндосом в ядро и репликационный аппарат клетки-мишени используется также для вирусных целей (Russell W.С. 2000, J General Virol 81, 2573-2604).

Аденовирусный геном имеет «ранние» (Е1-Е4), «средние» (IX и IVa2) и «поздние» гены (L1-L5), которые транскрибируются в последовательном порядке. Ранние генные продукты влияют на защитные механизмы, клеточный цикл и клеточный метаболизм клетки-хозяина. Средние и поздние гены кодируют структурные вирусные белки для продукции новых вирионов (Wu and Nemerow, 2004, Trends Microbiol 12: 162-168; Russell W.С. 2000, J General Virol 81, 2573-2604; Volpers С.and Kochanek S. 2004, J Gene Med 6 suppi 1, S 164-71; Kootstra N.A. and Verma I.M. 2003, Annu Rev Pharmacol Toxicol 43, 413-439).

У людей найдено более чем 50 различных серотипов аденовирусов. Серотипы подразделяются на шесть подгрупп A-F, и известно, что разные серотипы ассоциированы с разными состояниями, т.е. респираторными заболеваниями, конъюнктивитами и гастроэнтеритами. Известно, что аденовирусный серотип 5 (Ad5) вызывает респираторные заболевания и является наиболее широко изученным серотипом в области генной терапии. В первых Ad5-векторах участки Е1 и/или Е3 были удалены, способствуя вставке чужеродной ДНК в векторы (Danthinne and Imperiale 2000). Кроме того, делеции других участков, а также дополнительные мутации обеспечивают особые свойства вирусным векторам. Фактически, предлагаются различные модификации аденовирусов для достижения эффективного противоопухолевого действия.

Например, патент ЕР 1377671 B1 (Cell Genesys, Inc.) и публикация заявки США 2003/0104625 Al (Cheng С. et al.) описывают онколитический аденовирусный вектор, кодирующий иммунотерапевтический белок гранулоцит-макрофаг колониестимулирующий фактор (GM-CSF). Также публикация ЕР 1767642 A1 (Chengdu Kanghong Biotechnologies Co., Ltd.) выделяет онколитические аденовирусные векторы, оказывающие улучшенные эффекты на иммунную реакцию человека.

Также благодаря генной терапии обеспечивается более эффективный и точный перенос генов, а также повышенная специфичность и достаточная способность поражения опухоли. Также должны быть отличными показатели по безопасности терапевтических векторов. Настоящее изобретение обеспечивает инструмент лечения рака вместе с вышеуказанными свойствами посредством применения обоих онколитического и иммунотерапевтического свойств аденовирусов новым и изобретательным путем.

Краткое описание изобретения

Цель изобретения заключается в обеспечении новых способов и средств достижения вышеуказанных свойств аденовирусов и, следовательно, в решении проблем традиционного лечения рака. Более конкретно, изобретение обеспечивает новейшие способы и средства генной терапии.

Настоящая заявка описывает конструкцию рекомбинантных вирусных векторов, способы, связанные с векторами и их применение в опухолевых клеточных линиях, в экспериментальных моделях и у раковых пациентов.

Настоящее изобретение относится к онколитическому аденовирусному вектору, содержащему остов нуклеиновых кислот 5-го серотипа (Ad5) аденовируса, делецию из 24 п.о. (D24) в Rb-связывающей константной области 2 аденовирусного Е1 и последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую гранулоцит-макрофаг колониестимулирующий фактор (GM-CSF) в месте удаленного gp19k/6.7K в Е3-области аденовируса.

Кроме того, настоящее изобретение относится к клетке, содержащей аденовирусный вектор изобретения.

Также настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей аденовирусный вектор изобретения.

Также настоящее изобретение относится к применению аденовирусного вектора изобретения в производстве лекарственного средства для лечения рака у субъекта.

Также настоящее изобретение относится к способу лечения рака у субъекта, где способ включает введение вектора или фармацевтической композиции изобретения субъекту.

Кроме того, настоящее изобретение относится к способу продуцирования GM-CSF в клетке, который включает:

a) доставку носителя, содержащего онколитический аденовирусный вектор изобретения, к клетке, и

b) экспрессирование GM-CSF указанного вектора в клетке.

Кроме того, настоящее изобретение также относится к способу повышения опухолеспецифического иммунного ответа у субъекта, причем способ включает:

a) доставку носителя, содержащего онколитический аденовирусный вектор изобретения, к клетке-мишени или ткани,

b) экспрессирование GM-CSF указанного вектора в клетке и

c) повышение количества цитотоксичных Т-клеток и/или натуральных киллеров в указанной клетке-мишени или ткани.

Также настоящее изобретение относится к применению онколитического аденовирусного вектора изобретения для продуцирования GM-CSF в клетке.

Также настоящее изобретение относится к онколитическому аденовирусному вектору изобретения для продуцирования GM-CSF в клетке.

Также настоящее изобретение относится к применению онколитического аденовирусного вектора изобретения для повышения опухолеспецифического иммунного ответа у субъекта.

Также настоящее изобретение относится к онколитическому аденовирусному вектору изобретения для повышения опухолеспецифического иммунного ответа у субъекта.

Настоящее изобретение обеспечивает средство лечения злокачественных опухолей, которые резистентны к традиционным подходам. Также остается немного резистентных типов опухолей, подходящих для лечения, по сравнению с другими способами лечения. К тому же с помощью заявленного изобретения можно излечивать все солидные опухоли. Посредством настоящего изобретения могут быть излечены и более крупные опухоли по массе и более смешанные опухоли. Лечение можно проводить путем внутриопухолевого, внутриполостного, внутривенного введения и в комбинации из указанных. Такой способ лечения может оказать системное действие, несмотря на местное введение. Также в результате лечения заявленным способом могут быть уничтожены клетки, которые предположительно вызывают рост опухоли ("раковые стволовые клетки").

Кроме этого, способствуя транспорту вектора к представляющему интерес участку, вектор изобретения также обеспечивает экспрессию и сохранение трансгена. Кроме того, иммунный ответ против вектора, а также трансгена сводится до минимума.

Настоящее изобретение решает проблему терапевтической резистентности при традиционных способах лечения. Кроме того, настоящее изобретение обеспечивает средства и способы селективного лечения, исключающее токсичность или повреждение здоровых тканей. Также преимущества настоящего изобретения включают различные и ослабленные побочные эффекты по сравнению с другими средствами. Важно, что заявленный способ лечения оказывает синергетическое действие со многими другими способами лечения, включая химиотерапию и лучевую терапию, и, следовательно, может использоваться в схемах комбинированного лечения.

В нормальных условиях, индукция иммунного ответа в отношении клеток, которые обеспечивают репликацию «невооруженного» вируса, недостаточна для развития терапевтического иммунитета к опухоли. Для преодоления данного недостатка, настоящее изобретение обеспечивает вирусы, "вооруженные" высокоактивным индуктором противоопухолевого иммунитета. Настоящее изобретение обеспечивает противоопухолевую терапию, при которой опухолевые клетки разрушаются под действием вирионов, вызывающих онколизис. Также оказывают влияние и различные механизмы активирования иммунного ответа человека, включая активацию натуральных киллеров (NK) и дендритных клеток (DC).

По сравнению со способами лечения с использованием аденовирусов, известными из уровня техники, настоящее изобретение обеспечивает более простой, более эффективный, недорогой, нетоксичный и/или безопасный способ противоопухолевой терапии. Кроме того, отпадает необходимость в применении вирусов-помощников.

Новые продукты изобретения способствуют дополнительной оптимизации противоопухолевой терапии.

Краткое описание чертежей

Фиг.1 показывает схему pAd5-D24-GMCSF. Вирус несет 24-п.о. делецию в константную область 2 из Е1А. gp19k и 6.7К в Е3 замещены кДНК GM-CSF человека. ADP относится к белку, убивающему аденовирус.

Фиг.2 показывает схему первой стадии клонирования с созданием шаттл-плазмиды (pTHSN), несущей GM-CSF.

Фиг.3 показывает схему второй стадии клонирования с созданием плазмиды. содержащей все аденовирусные гены с 24-п.о. делецией в области Е1 (которая опосредует селективную репликацию в раковых клетках).

Фиг.4 показывает схему третьей стадии клонирования с созданием плазмиды, содержащей все аденовирусные гены, за исключением gp19k и 6.7К, которые замещены GM-CSF (pAd5D24.GM-CSF (SEQ ID NO 8)). Ad5-RGD-D24-GMCSF (SEQ ID NO 9), Ad5/3-D24-GMCSF (SEQ ID NO 7) и Ad5-pK7-D24-GMCSF (SEQ ID NO 10) создавали аналогично.

Фиг.5a-d показывают, что GMCSF-экспрессия не ослабляет репликацию вируса и эффект гибели клеток. Фиг.5а представляет результаты анализа MTS, показывающего эффективность гибели клеток, полученных из рака легких (А549), вируса Ad5-D24-GMCSF нового поколения. Фиг.5В представляет результаты анализа MTS, показывающего гибель инициирующих рак клеток JIMT-1 ("раковые стволовые клетки") посредством Ad5-D24-GMCSF. Фиг.5с представляет результаты анализа MTS, показывающего эффективность гибели клеток рака молочной железы (MDA-MB-436) вируса Ad5-D24-GMCSF нового поколения. Фиг.5d представляет результаты анализа MTS, показывающего эффективность гибели MDA-MB-436 вирусов Ad5-D24-GMCSF, Ad5-RGD-D24-GMCSF и Ad5/3-D24-GMCSF нового поколения.

Фиг.6а показывает экспрессию GM-CSF человека, связанную с аденовирусом. А549-клеточную линию инфицировали Ad5D24 или Ad5D24-GMCSF, среду собирали и определяли экспрессию GM-CSF с помощью FACSARRAY.

Фиг.6b показывает, что аденовирус-экспрессированный GM-CSF сохраняет свою биологическую активность в лимфоцитах человека. TF1-клетки, которым требуется GM-CSF человека для жизнедеятельности, культивировали в присутствии человеческого рекомбинантного GM-CSF (Е. coli-продуцируемый, получен от Sigma) или супернатанта из Ad5-D24-GMCSF-инфицированных клеток.

Фиг.7а и 7b показывают анализ in vitro трансдукции опухоли пациента для тестирования инфекционности Ad5-основанного вируса.

Фиг.7с показывает предварительную оценку опухолевой трансдукции Ad5-D25-GMCSF путем окрашивания его рецептора CAR (коксаки-аденовирусный рецептор) в архивных опухолевых образцах.

Фиг.8а показывает эффективность in vivo Ad5-D24-GMCSF у сирийских хомяков (пермисивных для репликации аденовируса человека) со злокачественными опухолями поджелудочной железы. Оба Ad5D24 и Ad5-D24-GMCSF ликвидировали опухоли за 16 дней лечения. 1×10⁹ VP вируса вводили на дни 0, 2 и 4.

Фиг.8b показывает, что внутриопухолевая инъекция Ad5-D24-GMCSF привела к высоким уровням hGM-CSF в сыворотке сирийских хомяков. У животных, которым вводили Ad5D24E3 или Ad5-D24-GMCSF, брали пробы на 4 день и концентрацию GMC-SF человека в сыворотке определяли с помощью анализа FACS.

Фиг.8с показывает, что лечение HapT1-опухолей с помощью Ad5-D24-GMCSF (но не Ad5D24) защищало сирийских хомяков от последующего повторного заражения HapT1. Это показывает, что Ad5-D24-GMCSF может индуцировать опухолеспецифический иммунный ответ. Животных, которых ранее лечили с помощью Ad5D24 или Ad5D24-GMCSF (фиг.8а), повторно заражали той же опухолью и измеряли рост опухоли с течением времени.

Фиг.8d показывает индукцию опухолеспецифического иммунного ответа посредством Ad5-D24-GMCSF, лечение опухолей HapT1 с помощью Ad5-D24-GMCSF не защитило сирийских хомяков от опухолей Hak. Животных с опухолями HapT1, подвергшихся ранее лечению Ad5D24 или Ad5D24-GMCSF (фиг.8а), повторно заражали другой опухолью и измеряли рост опухоли с течением времени.

Фиг.9А показывает эффективность Ad5-D24-GMCSF в комбинации с циклофосфамидом при оральном введении. 88% уменьшение размеров опухоли наблюдали с помощью СТ-сканирования через 71 день после начала лечения.

Фиг.9b показывает эффективность лечения с помощью Ad5D24-GMCSF у пациентки с раком яичников. СТ-сканирование показало полное исчезновение всех измеряемых опухолей.

Фиг.10a-d показывают, что Ad5-D24-GMCSF вызывает Т-клеточный ответ против обоих опухолевых эпитопов и аденовируса (присутствующих в опухолевых клетках). Т-клетки, взятые от пациентов, подвергающихся лечению Ad5-D24-GMCSF, анализировали с помощью IFN-гамма ELISPOT при стимуляции смесью пептидов из аденовируса 5 и смесью пептидов опухолевого антигена сурвивин.

Фиг.11 показывает индукцию аденовирусных гексон-специфичных Т-клеток. Лейкоциты, собранные от пациентов, подвергавшихся лечению Ad5-D24-GMCSF, окрашивали CD3, CD8 и гексон-специфичными тетрамерными антителами и анализировали с помощью проточной цитометрии перед и после лечения. Лечение увеличивало гексон-специфические цитотоксические Т-клетки с 0,21 до 2,72%.

Фиг.12 показывает сокращение циркулирующих регуляторных Т-клеток у пациента R73. РВМС, которые положительны по CD4, отрицательны по CD 127 и обогащены Foxp3, являются эффективными регуляторными Т-клетками.

Фиг.13a-i показывают схемы клонирования с получением шаттл-плазмиды (pTHSN), несущей GM-CSF, с получением плазмиды, содержащей все гены с 24 п.о. делецией в E1-участке (который опосредует селективную репликацию в раковых клетках) и с получение плазмиды Ad5/3-D24-GMCSF, содержащей все аденовирусные гены, за исключением gp19k и 6.7К, которые замещены GM-CSF (pAd5D24.GM-CSF).

Фиг.14 показывает нуклеотидную последовательность Ad5/3-D24-GMCSF. Выделенный жирным участок показывает D24-удаленный E1A-участок (нуклеотиды 563-1694). Подчеркнутый участок показывает GM-CSF (нуклеотиды 28380-28814). Область, выделенная курсивом, показывает Ad3 выступающий участок (нуклеотиды 31701-32272). Последовательность, показанная на фигуре, соответствует последовательности SEQ ID NO 7.

Фиг.15 показывает график выживаемости пациентов, подвергшихся лечению Ad5/3-D24-GMCSF.

Подробное описание изобретения

Аденовирусный вектор

В Ad5, а также в других аденовирусах, икосаэдральный капсид состоит из трех главных белков: гексона (II), пентона (III), и выступающего фибера (IV), наряду с минорными белками: VI, VIII, IX, IIIa и IVa2 (Russell W.С. 2000, J General Virol 81, 2573-2604). Белки VII, небольшой пептид mu и терминальный белок (ТР) связаны с ДНК. Белок V обеспечивает структурную связь с капсидом через белок VI. Вирус, кодирующий протеазу, необходим для процессинга некоторых структурных белков.

Онколитический аденовирусный вектор настоящего изобретения основан на остове нуклеиновой кислоты аденовируса серотипа 5 (Ad5), 24 bp делеции (D24) в Rb-связывающей константной области 2 (CR2) аденовирусного Е1 и последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей гранулоцит-макрофаг колониестимулирующий фактор (GM-CSF) в месте удаленного gp19k/6,7K в аденовирусном Е30-участке (фиг.1). В предпочтительном воплощении изобретения аденовирусный вектор основан на аденовирусе человека.

Геном Ad5 содержит ранние (Е1-4), средние (IX и IVa2) и поздние (L1-5) гены, фланкированные по левым и правым инвертированным концевым повторам (LITR и RITR, соответственно), которые содержат последовательности, необходимые для репликации ДНК. Также геном содержит сигнал упаковки ([psi]) и главный поздний промотор (MLP).

Транскрипция раннего гена Е1А начинает репликационный цикл с последующей экспрессией Е1В, Е2А, Е2В, Е3 и Е4. E1-белки модулируют клеточный метаболизм таким путем, который делает клетку более восприимчивой к репликации вируса. Например, они интерферируют с NF-кВ, р53 и pRb-белками. Е1А и Е1В вместе ингибируют апоптоз. Е2 (Е2А и Е2В) и Е4-генные продукты опосредуют репликацию ДНК и Е4-продукты также обеспечивают метаболизм вирусной РНК и предотвращают синтез белка-хозяина. Е3-генные продукты ответственны за защиту против иммунной системы хозяина, повышая лизис клетки, и высвобождение вирусного потомства (Russell W.С. 2000, J General Virol 81, 2573-2604).

Средние гены IX и IVa2 кодируют минорные белки вирусного капсида. Экспрессия поздних генов L1-5, которые приводят к продукции вирусных структурных белков, инкапсулированию и созреванию вирусных частиц в ядре, находится под влиянием MLP (Russell W.С. 2000, J General Virol 81, 2573-2604).

По сравнению с аденовирусным геномом дикого типа, аденовирусный вектор изобретения не содержит 24 п.о. из CR2 в E1-участке, в частности в E1A-участке, и gp19k и 6,7К в Е3-участке. В предпочтительном воплощении изобретения в дополнение к неполным участкам Е1 и Е3, онколитический аденовирусный вектор изобретения дополнительно содержит один или несколько участков, выбранных из группы, состоящей из Е2, Е4 и поздних участков. В предпочтительном воплощении изобретения онколитический аденовирусный вектор содержит следующие участки: левый ITR, неполный E1, pIX, pIVa2, Е2, VA1, VA2, L1, L2, L3, L4, неполный Е3, L5, Е4 и правый ITR. Участки могут располагаться в векторе в любом порядке, но в предпочтительном воплощении изобретения участки располагаются в последовательном порядке в направлении 5'-3'. Открытые рамки считывания (ORF) могут находиться в одной цепи ДНК или в разных цепях ДНК. В предпочтительном воплощении изобретения E1-участок содержит вирусный сигнал упаковки.

В используемом здесь значении выражение "остов нуклеиновой кислоты 5 серотипа аденовируса (Ad5)" относится к геному или неполному геному Ad5, который содержит один или несколько участков, выбранных из группы, состоящей из неполного E1, pIX, pIVa2, Е2, VA1, VA2, L1, L2, L3, L4, неполного Е3, L5 и Е4 Ad5-ориджина. Один предпочтительный вектор изобретения содержит остов нуклеиновой кислоты из Ad5. В другом предпочтительном векторе аденовирусный остов нуклеиновой кислоты по большей части происходит из Ad5 и связывается с частью (например, частью структуры капсида) Ad3.

В используемом здесь значении выражение "неполный" участок относится к участку, который не содержит какую-либо часть по сравнению с соответствующим участком дикого типа. "Неполный Е1" относится к El-участку вместе с D24 и "неполный Е3" относится к Е3-участку, не содержащему gp19k/6.7K.

В используемом здесь значении выражения "VA1" и "VA2" относятся к ассоциированных с вирусом РНК 1 и 2, которые транскрибируются под действием аденовируса, но не транслируются. VA1 и VA2 противодействуют защитным механизмам клетки.

В используемом здесь значении выражение "вирусный сигнал упаковки" относится к части вирусной ДНК, которая состоит из серий АТ-богатых последовательностей и регулирует процесс инкапсулирования.

24 п.о. - делеции (D24) Е1 оказывают влияние на домен CR2, который ответственен за связывание Rb-опухолевого супрессора/регулирующего клеточный цикл белка и тем самым обеспечивает индукцию фазы синтеза (S), т.е. ДНК-синтеза, или фазы репликации. Для взаимосвязи pRb и Е1А необходимо восемь аминокислот - со 121 по 127 из консервативной области ElA-белка (Heise С. et al. 2000, Nature Med 6, 1134-1139), которые удалены в настоящем изобретении. Вектор настоящего изобретения содержит делеции нуклеотидов, соответствующих аминокислотам 122-129 вектора, описанного в работе Heise С. et al. (2000, Nature Med 6, 1134-1139). Известно, что вирусы с D24 обладают пониженной способностью к преодолению контрольной точки G1-S и к репликации, эффективной только в тех клетках, в которых данная взаимосвязь не требуется, например в опухолевых клетках, дефективных по пути Rb-pl6 (Heise С. et al. 2000, Nature Med 6, 1134-1139; Fueyo J et al. 2000, Oncogene 19, 2-12).

Участок Е3 несущественен для вирусной репликации in vitro, однако Е3-белки играют важную роль в регуляции иммунного ответа хозяина, т.е. в ингибировании обоих врожденного и специфического иммунного ответов. gp19k/6.7K-делеция в Е3 относится к делеции, составляющей 965 п.о., из аденовирусного участка Е3А. В полученной аденовирусной конструкции, оба гена gp19k и 6.7К удалены (Kanerva A et al. 2005, Gene Therapy 12, 87-94). Известно, что gp19k-генный продукт связывает и блокирует молекулы главного комплекса гистосовместимости I (MHC1) в эндоплазматическом ретикулюме и предотвращает распознавание инфицированных клеток цитотоксическими Т-лимфоцитами. Поскольку многие опухоли имеют дефицит MHC1, делеция gp19k увеличивает избирательность вирусов (вирус выводится быстрее, чем вирус дикого типа из нормальных клеток, но не существует различия для опухолевых клеток). 6.7К-белки экспрессируются на клеточной поверхности и они участвуют в снижении регуляции TNF-зависимого апоптоза, индуцируя лиганд (TRAIL) рецептор 2.

В настоящем изобретении GM-CSF-трансген помещают в gp19k/6.7k удаленный участок Е3, сверху промотора Е3. Это ограничивает экспрессию трансгена в опухолевых клетках, что обеспечивает репликацию вируса и последующую активацию Е3-промотора. Е3-промотор может быть любым экзогенным или эндогенным промотором, известным из уровня техники, предпочтительно эндогенным промотором. В предпочтительном воплощении изобретения последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая GM-CSF, находится под контролем вирусного промотора Е3.

GM-CSF принимает участие в иммунном ответе за счет воздействия на разные механизмы, включая рекрутинг клеток натуральных киллеров (NK) и стимуляцию антиген-презентирующих клеток (АРС). АРС могут потом обновлять, активировать и нацеливать Т-клетки относительно опухоли. Нуклеотидная последовательность, кодирующая GM-CSF, может быть от любого животного, такого как человек, обезьяна, кролик, мышь, хомяк, собака или кошка, но предпочтительно GM-CSF кодируется последовательностью человека. Нуклеотидную последовательность, кодирующую GM-CSF, можно модифицировать для повышения эффектов GM-CSF или можно не модифицировать, т.е. взять из дикого типа. В предпочтительном воплощении изобретения последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая GM-CSF, принадлежит дикому типу.

Вектор изобретения может также содержать другие модификации, чем неполные делеции CR2 и Е3 и вставки последовательности GM-CSF, как указано выше. В предпочтительном воплощении изобретения все другие участки вектора Ad5 принадлежат дикому типу. В другом предпочтительном воплощении изобретения Е4-участок принадлежит дикому типу. В предпочтительном воплощении изобретения участки дикого типа расположены выше участка Е1. "Выше" относится к непосредственно перед E1-участком в направлении экспрессии. Е1В участок также можно модифицировать в векторе изобретения.

Вставка экзогенных элементов может усилить действия векторов в клетках-мишенях. Применение экзогенных тканевых или опухолеспецифичных промоторов широко распространено в рекомбинантных аденовирусных векторах, и они также могут использоваться в настоящем изобретении. Например, вирусную репликацию можно ограничить в клетках-мишенях, например, под действием промоторов, которые включают, но не ограничиваются, СЕА, SLP, Cox-2, Midkine, hTERT, варианты hTERT, E2F, варианты E2F, CXCR4, SCCA2 и TTS. Их обычно добавляют к контрольному участку Е1А, но, в дополнение к или альтернативно, другие гены, такие как Е1В или Е4, также могут регулироваться. Экзогенные инсуляторы, т.е. блокирующие элементы против неспецифических энхансеров, левый ITR, нативный E1A-промотор или белки хроматина также могут быть включены в рекомбинантные аденовирусные векторы. Любые дополнительные компоненты или модификации могут, при необходимости, использоваться, но не обязательно, в векторах настоящего изобретения.

Большинство взрослых подвержены воздействию наиболее широко применяемого аденовируса 5 серотипа (Ad5), и вследствие этого иммунная система может быстро продуцировать нейтрализующее антитело (NAb) против него. Фактически распространенность анти-AdS NAb может составлять до 50%. Показано, что NAb может индуцироваться против многих из множества иммуногенных белков аденовирусного капсида, и, с другой стороны, показано, что даже небольшие изменения в выступе фибера Ad5 могут обеспечить «ускользание» от капсид-специфичного NAb. Следовательно, модификация выступа является существенным для сохранения или повышения доставки генов вместе с применением аденовирусов у людей.

Кроме того, известно, что Ad5 связывается с рецептором, называемым CAR, посредством выступающей части фибера, и модификации этой выступающей части или фибера могут повысить вхождение в клетку-мишень и вызвать усиленный онколизис в некоторых злокачественных опухолях (Ranki Т. et al. 2007, Int J Cancer 121, 165-174). В действительности, капсид-модифицированные аденовирусы являются подходящими инструментами для улучшения доставки генов в раковые клетки.

В одном воплощении изобретения онколитический аденовирусный вектор содержит капсидную модификацию. В используемом здесь значении "капсид" относится к белковой оболочке вируса, которая включает белки гексон, фибер и основания пентона. В настоящем изобретении можно применять любую модификацию капсида, т.е. модификацию белков гексона, фибера и пентона, известную из уровня техники, которая улучшает доставку вируса к опухолевой клетке. Модификации могут быть генетическими и/или физическими и включают, но не ограничиваются, модификации для объединения лиганд, которые распознают клеточные рецепторы и/или блокируют связывание нативных рецепторов, для замещения фибера или выступающего домена аденовирусного вектора выступом другого аденовируса (химеризм) и для добавления специфических молекул (например, FGF2) к аденовирусам. Таким образом, капсидные модификации включают, но не ограничиваются, включение небольших пептидных молекул(ы), пептида(ов), химеризм(ы) или мутацию(и) в фибере (например, в выступающей, хвостовой или стержневой части), гексоне и/или основании пентона. В предпочтительном воплощении изобретения капсидная модификация представляет Ad5/3-химеризм, вставку интегрин-связывающего участка (RGD) и/или модификацию полилизина, связанного с гепарин сульфатом, в фибере. В конкретном воплощении изобретения капсидная модификация представляет собой Ad5/3-химеризм.

В используемом здесь значении "Ad5/3-химеризм" капсида относится к химеризму, в котором выступающая часть фибера происходит из 3 серотипа Ad и остальная часть фибера происходит из 5 серотипа Ad.

В используемом здесь значении "RGD-область" относится к мотиву аргинин-глицин-аспарагиновой кислоты (RGD), который воздействует на основание пентона и связывается с клеточными αυ интегринами, обеспечивая аденовирусную интернализацию. В предпочтительном воплощении изобретения капсидная модификация представляет собой RGD-4C модификацию. "RGD-4C модификация" относится к вставке интегрин-связывающего RGD-4C-мотива в H1-петле домена выступающего фибера. 4С относится к четырем молекулам цистеина, которые формируют сульфидные мостики в RGD-4C. Конструкция рекомбинантного Ad5 фиберного гена, кодирующего фибер вместе с RGD-4C пептидом, описана подробно, например, в статье Dmitriev I. et al. (1998, Journal of Virology, 72, 9706-9713).

В используемом здесь значении "модификация полилизина, связанного с гепарин сульфатом" относится к добавлению удлинения из семи молекул лизина к с-концу выступа фибера.

Экспрессионные кассеты используются для экспрессирования трансгенов в мишени, такой как клетка, при использовании векторов. В используемом здесь значении выражение "экспрессионная кассета" относится к ДНК-вектору или его части, содержащему нуклеотидные последовательности, которые кодируют сДНК или гены, и нуклеотидные последовательности, которые контролируют и/или регулируют экспрессию указанных кДНК или генов. Одинаковые или разные экспрессионные кассеты можно вставлять в один вектор или в несколько разных векторов. Ad5-векторы настоящего изобретения могут содержать как несколько, так и одну экспрессионную кассету. Однако эффективным является только одна экспрессионная кассета. В предпочтительном воплощении изобретения онколитический аденовирусный вектор содержит, по меньшей мере, одну экспрессионную кассету. В предпочтительном воплощении изобретения онколитический аденовирусный вектор содержит только одну экспрессионную кассету.

Клетка, содержащая аденовирусный вектор изобретения, может быть любой клеткой, такой как клетка эукариота, клетка бактерии, клетка животного, клетка человека, клетка мыши и т.д. Клетка может быть клеткой in vitro, ex vivo или in vivo. Например, клетку можно использовать для получения аденовирусного вектора in vitro, ex vivo или in vivo, или клетка может быть мишенью, такой как клетка опухоли, которая инфицирована аденовирусным вектором.

В способе получения GM-CSF в клетке носитель, содержащий вектор изобретения, вводится в клетку и в дальнейшем экспрессируется ген GM-CSF и белок транслируется и секретируется паракринным образом. "Носителем" может быть любой вирусный вектор, плазмида или другой инструмент, такой как частица, который способен доставлять вектор изобретения к клетке-мишени. Любой традиционный способ, известный из уровня техники, можно применять для доставки вектора к клетки.

Опухолеспецифический иммунный ответ можно усилить у субъекта посредством настоящего изобретения. Цитотоксические Т-клетки и/или натуральные киллеры стимулируются, продуцируются и нацеливаются как результат экспрессии GM-CSF. В предпочтительном воплощении изобретения количество натуральных киллеров и/или цитотоксических Т-клеток увеличивается в клетке-мишени или ткани. Для доведения до конца или изучения эффектов изобретения можно определить различные маркеры иммунного ответа (например, маркеры воспаления). Наиболее распространенные маркеры включают, но не ограничиваются, повышение уровней провоспалительных цитокинов, опухоле- или аденовирус-специфических цитотоксических Т-клеток, рекрутинг и активация антиген-презентирующих клеток или увеличение размера локальных лимфатических узлов. Уровни этих маркеров можно исследовать любыми традиционными способами, известными из уровня техники, включая те, но не ограничиваясь, в которых используются антитела, зонды, праймеры и т.д., такие как анализ ELISPOT, тетрамерный анализ, пентамерный анализ и анализ разных типов клеток в крови или в опухолях.

Рак

Рекомбинантные Ad5-векторы изобретения были сконструированы для ведения репликации в клетках, которые имеют дефекты в Rb-пути, в особенности пути Rb-p16. Эти дефективные клетки включают все опухолевые клетки у животных и людей (Sherr С.J. 1996, Science 274, 1672-1677). В предпочтительном воплощении изобретения вектор способен к селективной репликации в клетках, имеющих дефекты в Rb-пути. В используемом здесь значении понятие "дефекты Rb-пути" относится к мутациям и/или эпигенетическим изменениям в любых генах или белках указанного пути. Вследствие этих дефектов опухолевые клетки сверхэкспрессируют E2F и, следовательно, связывание Rb посредством Е1А CR2, что требуется для эффективной репликации в нормальных условиях, не является необходимым.

Любой рак или любые опухоли, включая злокачественные и доброкачественные опухоли, а также первичные опухоли и метастазы, могут являться мишенями генной терапии. В конкретном воплощении изобретения рак представляет собой любую солидную опухоль. В предпочтительном воплощении изобретения рак выбирают из группы, состоящей из назофарингеального рака, синовиального рака, гепатоцеллюлярного рака, рака почек, рака соединительных тканей, меланомы, рака легких, колоректального рака, рака толстой кишки, рака прямой кишки, рака ободочной и прямой кишки, рака мозга, рака гортани, рака полости рта, рака печени, рака костей, рака поджелудочной железы, хориокарциномы, гастриномы, феохромоцитомы, пролактиномы, Т-клеточной лейкемии/лимфомы, нейромы, болезни фон Гиппеля-Линдау, синдром Золлингера-Эллисона, рака надпочечников, рака анального канала, рака желчных протоков, рака мочевого пузыря, рака уретры, рака мозга, олигодендроглиомы, нейробластомы, менингиомы, опухоли позвоночника, рака костей, остеохондромы, хондросаркомы, саркомы Юинга, рака без выявленного первичного очага, карциноида, карциноида желудочно-кишечного тракта, фибросаркомы, рака молочной железы, болезни Пэджета, рака шейки матки, колоректального рака, ректального рака, рака пищевода, рака желчного пузыря, рака головы, рака глаз, рака шеи, рака почки, опухоли Вильмса, рака печени, саркомы Капоши, рака предстательной железы, рака легких рака яичков, болезни Ходжкина, неходжкинской лимфомы, рака полости рта, рака кожи, мезотелиомы, множественной миеломы, рака яичников, внутрисекреторного рака поджелудочной железы, глюкаганомы, рака поджелудочной железы, рака паращитовидной железы, рака пениса, гипофизарного рака, саркомы мягких тканей, ретинобластомы, рака тонкой кишки, рака желудка, рака тимуса, рака щитовидной железы, трообластного рака, хорионаденомы, рака матки, рака эндометрия, рака влагалища, рака вульвы, невриномы слухового нерва, грибовидной гранулемы, инсулиномы, карциноидного синдрома, соматостатиномы, рака десен, рака сердца, рака губ, рака оболочки головного мозга, рака ротовой полости, рака нервов, рака неба, рака паращитовидной железы, рака брюшной полости, рака глотки, рака плевры, рака слюнных желез, рака языка, рака небных миндалин.

Фармацевтическая композиция

Фармацевтическая композиция изобретения содержит, по меньшей мере, один тип векторов изобретения. Кроме того, композиция может содержать, по меньшей мере, два, три или четыре разных векторов изобретения. В дополнение к вектору изобретения фармацевтическая композиция также может содержать любые другие векторы, например другие аденовирусные векторы, другие терапевтически эффективные агенты, любые другие агенты, такие как фармацевтически подходящие носители, буферы, эксципиенты, адъюванты, антисептики, наполнители, стабилизаторы или загустители и/или любые компоненты, обычно находящиеся в соответствующих продуктах.

Фармацевтическая композиция может быть в любой форме, такой как твердой, полутвердой или жидкой форме, подходящей для введения. Состав можно выбрать из группы, состоящей из, но не ограничиваясь, растворов, эмульсий, суспензий, таблеток, пилюль и капсул.

В предпочтительном воплощении изобретения онколитический аденовирусный вектор или фармацевтическая композиция действует как противораковая вакцина in situ. В используемом здесь значении "противораковая вакцина in situ" относится к противораковой вакцине, которая одновременно убивает опухолевые клетки и повышает иммунный ответ против опухолевых клеток. Репликация вируса является очень опасным сигналом для иммунной системы (необходимым для ответа TH1-типа) и, вследствие чего, действует как мощный костимулирующий феномен GM-CSF-опосредованного созревания и активации АРС, и рекрутинг NK-клеток. Лизис опухолевых клеток также помогает презентовать опухолевые фрагменты и эпитопы для АРС и, кроме того, продуцируется костимуляция посредством воспаления. Таким образом, эпитоп-независимый (т.е. не HLA-ограниченный) ответ продуцируется в рамках каждой опухоли и тем самым протекает in situ. Опухолеспецифический иммунный ответа активируется в клетке-мишени, а также окружающих клетках, например в ткани-мишени.

Эффективная доза векторов зависит, по меньшей мере, от субъекта, нуждающегося в лечении, типа опухоли, локализации опухоли и стадии процесса. Доза может изменяться, например, от около 10е8 вирусных частиц (VP) до около 10е14 VP, предпочтительно от около 5×10е9 VP до около 10е13 VP и более предпочтительно от около 8×10е9 VP до около 10×12 VP. В одном конкретном воплощении изобретения доза составляет от около 5×10е10 до около 5×10е11 VP.

Фармацевтические композиции можно получать любыми традиционными способами, известными из уровня техники, например путем применения одного из следующих: способов с применением порционных культур, культур с подпиткой и перфузионных культур, очистки колоночной хроматографией, CsC1-градиентной очистки и способов перфузии с помощью удерживающих клетки устройств с малым усилием сдвига.

Введение

Вектор или фармацевтическую композицию изобретения можно вводить любому субъекту-эукариоту, выбранному из группы, состоящей из растений, животных и человека. В предпочтительном воплощении изобретения субъектом является человек или животное. Животное можно выбрать из группы, состоящей из комнатных животных, домашних животных и продуктивных животных.

Можно применять любой традиционный способ введения вектора или композиции субъекту. Путь введения зависит от состава или формы композиции, заболевания, локализации опухоли, пациента, сопутствующих заболеваний и других факторов. В предпочтительном воплощении изобретения введение осуществляют посредством внутриопухолевой, внутримышечной, внутриартериальной, внутривенной, внутриплевральной, интравезикулярной, внутриполостной или перитонеальной инъекции или орального введения.

Даже однократное введение онколитических аденовирусных векторов изобретения может иметь терапевтический эффект. Однако в предпочтительном воплощении изобретения онколитические аденовирусные векторы или фармацевтические композиции вводят несколько раз в процессе лечения. Онколитические аденовирусные векторы или фармацевтические композиции можно вводить, например, от 1 до 10 раз в первые 2 недели, 4 недели, ежемесячно или в процессе лечения. В одном воплощении изобретения введение осуществляют от трех до семи раз в первые 2 недели, затем за 4 недели и затем в месяц. В конкретном воплощении изобретения введение осуществляют четыре раза в первые 2 недели, затем за 4 недели и затем в месяц. Продолжительность лечения может изменяться и, например, может длиться до 12 месяцев или более.

Для преодоления нейтрализации антител у субъекта векторы изобретения могут меняться между лечениями. В предпочтительном воплощении изобретения субъекту вводят онколитический аденовирусный вектор, имеющий различные фиберные выступы капсида, по сравнению с вектором предыдущей терапии. В используемом здесь значении понятие "фиберные выступы капсида" относится к выступающей части белка фибера (фиг.1).

Генная терапия изобретения эффективна сама по себе, однако комбинация аденовирусной генной терапии с любыми другими способами лечения, например традиционными способами, может быть более эффективной, чем эти способы сами по себе. Например, каждый агент комбинированного лечения может «работать» независимо в ткани опухоли, аденовирусные векторы могут сенсибилизировать клетки для химиотерапии или радиотерапии, и/или агенты для химиотерапии могут увеличивать уровень репликация вируса или обеспечивать рецепторный статус клеток-мишеней. Агенты комбинированного лечения можно вводить одновременно или последовательно.

В предпочтительном воплощении изобретения способ или применение дополнительно содержит проведение конкурентной радиотерапии для субъекта. В другом предпочтительном воплощении изобретения способ или применение дополнительно содержит проведение конкурентной химиотерапии для субъекта. В используемом здесь значении "конкурентная" относится к терапии, которую проводят перед, после или одновременно с генной терапией изобретения. Длительность конкурентной терапии может изменяться от минут до нескольких недель. Предпочтительно конкурентная терапия длится несколько часов.

Агенты, подходящие для комбинированного лечения, включают, но не ограничиваются, политрансретиноевую кислоту, азацитидин, азатиоприн, блеомицин, карбоплатин, капецитабин, цисплатин, хлорамбуцил, циклофосфамид, цитарабин, даунорубицин, доцетаксель, доксифлуридин, доксорубицин, эпирубицин, эпотилон, этопозид, фторурацил, гемцитабин, гидроксимочевину, идарубицин, иматиниб, хлорметин, меркаптопурин, метотрексат, митоксантрон, оксалиплатин, паклитаксель, пеметрексед, темозоломид, тенипозид, тиогуанин, вальрубицин, винбластин, винкристин, виндезин и винорелбин.

В предпочтительном воплощении изобретения способ или применение дополнительно содержит введение верапамила с другим блокатором кальциевых каналов субъекту. Термин "блокатор кальциевых каналов" относится к классу лекарственных веществ и природным веществам, которые нарушают проводимость кальциевых каналов, и их можно выбирать из группы, состоящей из верапамила, дигидропиридинов, галлопамила, дилтиазема, мибефрадила, бепридила, флуспирилена и фендилина.

В предпочтительном воплощении изобретения способ или применение дополнительно содержит введение субъекту агентов, индуцирующих аутофагию. Аутофагия относится к катаболическому процессу, включающему деградацию внутренних компонентов клетки посредством лизосомального аппарата. "Индуцирующие аутофагию агенты" относятся к агентам, способным индуцировать аутофагию, и могут быть выбраны из группы, состоящей из, но не ограничиваясь, mTOR-ингибиторов, PI3K-ингибиторов, лития, тамоксифена, хлоргинона, бафиломицина, темсиролимуса, сиролимуса и темозоломида. В конкретном воплощении изобретения способ дополнительно включает введение темозоломида субъекту. Темозоломид можно вводить орально или внутривенно.

В одном воплощении изобретения способ или применение дополнительно содержит проведение химиотерапии или анти-CD20 терапии или других подходов блокирования нейтрализующих антител. "Анти-CD20 терапия" относится к агентам, способным убивать CD20-положительные клетки и которые можно выбирать из группы, состоящей из ритуксимаба и других анти-CD20 моноклональных антител. Понятие "подходы блокирования нейтрализующих антител" относится к агентам, способным ингибировать генерацию антивирусных антител, которые обычно образуются вследствие инфекции, и могут быть выбраны из группы, состоящей из различных препаратов для химиотерапии, иммуномодулирующих веществ, кортикоидов и других лекарственных веществ. Эти вещества могут быть выбраны из группы, состоящей, но не ограничиваясь, из циклофосфамида, циклоспорина, азатиоприна, метилпреднизолона, этопозида, CD40L, CTLA4Ig4, FK506 (такролисмуса), IL-12, IFN-гамма, интерлейкина 10, анти-CD8, анти-CD4 антител, миоабляционных и аденовирусных белков для орального применения.

Онколитический аденовирусный вектор изобретения индуцирует вирион-опосредованный онколизис опухолевых клеток и активирует иммунный ответ человека против опухолевых клеток. В предпочтительном воплощении изобретения способ или применение дополнительно содержит введение веществ, способных снижать регуляцию регуляторных Т-клеток у субъекта. Понятие "вещества, способные снижать регуляцию регуляторных Т-клеток" относится к агентам, которые снижают количество клеток, идентифицированных как Т-супрессор или регуляторные Т-клетки. Эти клетки идентифицированы как содержащие один или несколько следующих иммунофенотипических маркеров: CD4+, CD25+, FoxP3+, CD127- и GITR+. Такие агенты, снижающие уровень Т-супрессоров или регуляторы Т-клеток, могут быть выбраны из группы, состоящей из анти-CD25 антител или химиотерапевтических препаратов.

В предпочтительном воплощении изобретения способ или применение дополнительно содержит введение циклофосфамида субъекту. Циклофосфамид является распространенным химиотерапевтическим агентом, который также применяют при лечении некоторых аутоиммунных заболеваний. В настоящем изобретении циклофосфамид может использоваться для усиления вирусной репликации и для воздействия на GM-CSF-индуцированную стимуляцию NK- и цитотоксичных Т-клеток для повышения иммунного ответа против опухоли. Его можно применять в виде внутривенного струйного введения или орального равномерного введения небольшими дозами.

Любой способ или применение изобретения может быть способом или применением in vivo, ex vivo или in vitro.

Настоящее изобретение иллюстрируется следующими примерами, которые не ограничивают изобретение каким бы то ни было образом.

Примеры

Пример 1

Клонирование трех типов вирусов D24-GM-CSF

ПЦР из hGM-CSF,

создание сайтов SunI/MunI=>445 bp (pORF-GM-CSF в качестве матрицы)

SunI/MunI-расщепление продукта ПЦР и pTHSN

Лигирование по «липким» концам=>

Pmel линеаризованный pShuttle-D24+pTG3602=>pAd5-D24

Ad5-D24-GM-CSF (SEQ ID NO 8: E1A участок с делецией D24 в нуклеотидных положениях 563-1524 и участок фибера в нуклеотидных положениях 30490-32236)

Homol recomb: SrfI линеаризованный pAd5-D24+FspI линеаризованный

pTHSN-GM-CSF=>pAd5-D24-GM-CSF

Pad линеаризация & трансфекция=>Ad5-D24-GM-CSF

Все фазы клонирования осуществляли с помощью ПЦР и множественных расщеплений рестрикционными эндонуклеазами. Секвенировали шаттл-плазмиду pTHSN-GMCSF. Отсутствие дикого типа Е1 подтверждали ПЦР PCR. Участок Е1, трансген и фибер проверяли в итоговом вирусе путем секвенирования и ПЦР, который затем извлекали в чистой лаборатории для продукции. В этом конце экстрагировали вирусную ДНК путем ночной (ON) инкубации с соответствующим буферным раствором и затем выполняли ПЦР и секвенирование для анализа целостности фибера, а также GMCSF кДНК. Все фазы продукции вируса, включая трансфекцию, осуществляли на А549-клетках для избежания риска рекомбинации дикого типа, как описывалось прежде (Kanerva A et al. 2003, Mol Ther 8, 449-58; Baeurschmitz G J et al. 2006, Mol Ther 14, 164-74). GM-CSF находится под действием Е3-промотора (конкретно под действием эндогенных элементов, контролирующих экспрессию гена Е3А вируса), что приводит к экспрессии трансгена, ассоциированного с репликацией, которая начинается через около 48 часов после инфицирования. Е3 является интактным, за исключением делеции 6,7K/gp19K.

Ad5/3-D24-GM-CSF (SEQ ID NO 7) и Ad5-RGD-D24-GM-CSF (SEQ ID NO 9: E1A участок с D24-делецией в нуклеотидных положениях 580-1541, участок фибера в нуклеотидных положениях 30514-32286 и RGD-модификация в нуклеотидных положениях 32128-32183) были сконструированы идентично, за исключением характеристики спасательной плазмиды, использовали либо выступ из серотипа 3 либо RGD-4C в H1-петле фибера Ad5. Ad5-pK7-D24-GMCSF (SEQ ID NO 10: E1A-участок с D24-neneuHeu в нуклеотидных положениях 561-1526, фиберный участок в нуклеотидных положениях 30499-32255 и рК7-модификация в нуклеотидных положениях 32247-32378) также создавали аналогичным образом (фиг.2-4).

Ad5/3-D24-GM-CSF был сконструирован следующим образом. Плазмида pAdEasy5/3, происходящая из pAdEasy-1 и содержащая химерный фибер 5/3, была создана путем гомологичной рекомбинации в Е. Coli вирусного генома Ad5/31uc1 и BstXI-расщепленного 8,9 kb фрагмента pAdEasy-1. Затем шаттл-вектор, содержащий 24-bp делецию в E1A (pShuttleD24), был линеаризован с помощью PmeI и рекомбинирован с pAdEasy5/3, что привело к получению pAd5/3-D24. Для вставки человеческого гена GMCSF в участок Е3, был создан Е3-клонирующий вектор pTHSN путем вставки SpeI в фрагмент NdeI из генома Ad5 в мульти-клонирующий сайт из pGEM5Zf+(Promega, Madison, Wis.). Затем pTHSN был расщеплен SunI/MunI, создавая 965-bp делецию в Е3-участке (6.7К and gp19K deleted). 432bp кДНК, кодирующая GMCSF человека (Invitrogen, Carlsbad Calif.), была амплифицирована с праймерами, характеризующими специфичные сайты рестрикции SunI/MunI, фланкирующие ген, и затем введены в SunI/MunI-расщепленную pTHSN (pTHSN-GMCSF). pAd5/3-D24-GMCSF была создана путем гомологичной рекомбинации в Е. coli между FspI-линеаризованной pTHSN-GMCSF и SrfI-линеаризованной pAd5/3-D24. Ad5/3-D24-GMCSF вирусный геном высвобождался при Pacl-расщеплении и трансфекции в А549-клетки для амплификации и освобождения (фиг.13 и 14, SEQ ID NO 7).

Пример 2

Анализ in vitro вирусов типа D24-GM-CSF

In vitro эффективность вирусов типа D24-GM-CSF исследовали в клетках рака легких (А549), клеточных эксплантатах, полученных из стволовых клеток рака молочной железы, (ЛМТ-1) и клетках рака молочной железы (MDA-MB-436) при использовании анализа клеточной гибели MTS. MTS-анализ является традиционно стандартным анализом для определения жизнеспособности клеток, как указывается в публикациях по генной терапии рака. Ad5Luc1 является дефектным по репликации вирусом и участвует в качестве отрицательного контроля. Ad5wt является вирусом Ad5 дикого типа (штамм Ad300wt) и использовался в качестве положительного контроля. Ad5-d24-E3 содержит изогенную 24 п.о. делецию в Е1, но интактен вЕ3. VP представляет вирусные частицы.

Таким образом, Ad5-D24-GMCSF обладал онколитической активностью в отношении положительных контролей in vitro, и, следовательно, трансгенная продукция не нарушает онколитическую эффективность вируса (фиг.5а-с). Аналогичные данные показаны для Ad5/3-D24-GM-CSF и Ad5.RGD-D24-GM.CSF (фиг.5d).

Для тестирования способности Ad5D24-GMCSF экспрессировать трансген А549 клеточную линию инфицировали 1000 VP/клетку и собирали среду с течением времени. Концентрацию GMCSF (фиг.6а) в среде измеряли с помощью FACSARRAY (BD Biosciences, San Diego, Calif. USA) в соответствии с инструкциями производителя. В дополнение к этому мы также анализировали, сохраняет ли вирус-экспрессирующий GMCSF свои биологические свойства. С этой целью TF1-клеточную линию, чей рост и выживаемость прямо зависят от GMCSF человека, обрабатывали средой из клеточной линии А549, ранее инфицированной Ad5D24-GMCSF. Выживаемость TF1 определяли с течением времени с помощью анализа MTS. Результат данного эксперимента показал, что экспрессирующий вирус GMCSF способен стимулировать рост клеточной линии и не обнаружилось разницы с той же клеточной линией, обработанной рекомбинантным человеческим GMCSF (Sigma) (фиг.6b).

Пример 3

Анализ трансдукции перед обработкой

I. Инфекция опухолевых клеток с помощью Ad5Luc1

Для установления, что опухоль может быть инфицирована вирусом, основанным на Ad5, гомогенизировали взятые из тканей биопсии и инфицировали люциферазой, кодирующей Ad5Luc1 в соответствии со стандартным протоколом инфицирования. Вкратце, клетки, высеянные в лунки, промывали дважды PBS, вирус размораживали и ресуспендировали в минимальном количестве ростовой среды и аккуратно заливали на клетки. Инфицирование происходило в течение 30 минут 30, и после этого клетки промывали снова в PBS и добавляли соответствующее количество полной ростовой среды. Количественное определение люциферазы выполняли через 24 часа. Необходимо отметить, что было получено только незначительное количество ткани, вследствие чего не смогли рассчитать ни число клеток, ни количество вируса, приведенного к количеству ткани. Таким образом, количественный анализ не состоялся, но качественные данные показали успешный перенос генов у пациентов O12 и С3 (фиг.7А-b). Фоновые значения люциферазы (около 200 RLU) вычитали.

II. Иммуногистохимическое окрашивание CAR

Доступные архивные образцы опухолей пациентов (пациенты для Ad5-D24-GM-CSF-лечения) собирали и анализировали относительно экспрессии CAR (рецептор 5 серотипа аденовируса) с помощью иммуногистохимии. Аденовирусный рецептор CAR окрашивает цитоплазмы раковых клеток (М3), аденокарцинома тонкой кишки (С3), карцинома поджелудочной железы (Н7), карциномная лобулярная инфильтрация (R8), печеночные метастазы рака яичников (012) и легочные метастазы синовиальной саркомы (S23) представлены на фиг.7с.

III. Титры нейтрализующих антител против капсида Ad5/3

293 клеток высеивали на 96-луночные планшеты при плотности 1×10⁴ клеток/лунку и культивировали в течение ночи. Затем днем клетки промывали DMEM без FCS. Для инактивации комплемента образцы сыворотки человека инкубировали при 56°С в течение 90 мин. Получали серии четырехкратных разведений (1:1 до 1:16) в DMEM, не содержащей сыворотку (Sarkioja M et al. 2008, Gene Ther 15 (12): 921-9). Ad5/31uc1 смешивали с разведениями и инкубировали при комнатной температуре в течение 30 мин. Затем клетки трижды инфицировали с 100 VP/клетку в 50 мкл смеси и через 1 ч добавляли 100 мкл ростовой среды с 10% FCS. Через 24 ч после инфицирования клетки лизировались и люциферазную активность измеряли с помощью Luciferase Assay System (Promega, Madison, Wis.), используя люминометр TopCount (PerkinElmer, Waltham, Mass.). Люциферазные данные наносили на график относительно генного переноса, достигаемого вместе с Ad5/31uc1, для оценки эффекта нейтрализующего антитела в сыворотке пациентов, лечившихся Ad5/3-d24-GMCSF. Титр нейтрализующего антитела определяли при самой низкой степени разведения, которая блокирует перенос генов более чем на 80%.

Пример 4

Ex Vivo анализ эффективности Ad5/3-D24-GMCSF в образцах перитонеальных и плевральных выпотов.

Свежий образец перитонеального/плеврального выпота хранили при +4°С в течение ночи. Образец разводили в 50 мл пробирках фирмы Falkon и выделяли клетки путем центрифугирования при 900 rpm, 8 мин, +4°С. Для лизиса эритроцитов образец инкубировали в течение 5-10 мин при комнатной температуре вместе с 25 мл лизирующего буфера АСК Lysis Buffer (Invitrogen, Carlsbad, Calif.). Пробирки наполняли 2% DMEM и клетки центрифугировали (900 rpm, 8 мин, +4°С.). Была приготовлена клеточная суспензия, содержащая 100000 клеток/мл в 2% растворе DMEM-фунгизон (50 мл 2% DMEM+200 мкл Фунгизон (BMS, Espoo, Finland)).

Относительно анализа люциферазы для определения эффекта капсидной модификации на эффективность трансдукции клетки высеивали в две 24-луночные планшеты с плотностью 50000 клеток/лунку. Через 24 часа клетки трижды инфицировали Ad51uc1 или Ad5/31uc1 в концентрациях 500 vp/клетку и 5000 vp/клетку в 2% DMEM. Экспрессию люциферазы анализировали аналогично, как указано в Примере 3 III (определение титров нейтрализующих антител).

Свежие образцы перитонеального и плеврального выпотов, взятые перед лечением у пациентов К75 и V136 соответственно, анализировали и в обоих образцах наблюдали высокую трансдукцию с Ad5/3.

Относительно анализа MTS для тестирования активности Ad5/3-d24-GMCSF в клинических образцах, клетки высеивали в 96-луночные планшеты с плотностью 10000 клеток/лунку. Клетки инфицировали после 24 ч инкубации. Инфицирования выполняли в 2% DMEM. Через день добавляли 10% DMEM. Клетки проверяли ежедневно и культуральную среду меняли каждый следующий день. Перед измерением среду отсасывали и в лунки добавляли 100 мкл свежего 10% DMEM. Добавляли 20 мкл буфера для анализа MTS (Promega, Madison, Wis.) и клетки инкубировали в течение 1,5-4 часов. Оптическую плотность измеряли с помощью Multiscan Ascent и программного обеспечения Ascent Software v2.6 (Thermo Labsystems, Helsinki, Finland) при длине волны 490 нм и фоновую оптическую плотность вычитали из оптической плотности образцов.

В образцах плеврального выпота, взятых перед лечением у V136 и М137, определяли онколитическую активность Ad5/3-d24-GMCSF. Через шесть дней после инфицирования в них было на 62% и 29% меньше жизнеспособных клеток (р<0.001) соответственно, чем в неинфицированном контрольном образце, из чего можно сделать предположение, что Ad5/3-d24-GMCSF способен убивать опухолевые клетки, присутствующие в плевральном выпоте.

Для определения присутствия вируса в образцах, полученных после лечения, клетки ресуспендировали в 3 мл 2% DMEM после лизиса эритроцитов и замораживали-размораживали четыре раза при -80°С. 293 клеток высеивали в 96-луночные планшеты при плотности 10000 клеток/лунку и инкубировали в течение 24 часов. Образец центрифугировали 15 мин, 4000 rpm, +4°C, и собирали супернатант. 293 клетки инфицировали 100 мкл/лунку супернатанта. Через 10 дней инкубации, в лунках определяли присутствие цитопатического эффекта.

Для определения репликации Ad5/3-d24GMCSF в опухоли мы также анализировали образец перитонеального выпота, взятый от пациента O82 через 7 дней после лечения. Это привело к цитопатическому эффекту у 70% клеток, тогда как неинфицированные контрольные клетки не показали аналогичных эффектов.

Пример 5

Анализ in vivo вирусов типа D24-GM-CSF у животных

Эффективность Ad5-D24-GM-CSF in vivo тестировали у иммуннокомпетентных сирийских хомяков, которые наполовину допускают репликацию аденовируса человека (мыши не допускают) (Ying В. et al. 2009, Cancer Gene Ther doi:10.1038/cgt.2009.6.). 7×10⁶ HapT1 клеток поджелудочной железы инъецировали подкожно и 1×10⁹ вирусных частиц (VP) из Ad5-D24-GM-CSF или Ad5D24E3 (которые не экспрессируют GM-CSF) инъецировали внутриопухолево на день 0, 2 и 4. Контрольной группе вводили такое же количество ростовой среды в то же время. Фиг.8b показывает, что внутриопухолевые инъекции Ad5-D24-GMCSF привели к высоким уровням hGM-CSF в сыворотке сирийских хомяков. Известно, что GM-CSF человека активен у сирийских хомяков (Cho, Exp Toxicol Pathol 2006 vol.57 (4) p.321-8). Интересно, что все животные не имели опухоли на шестнадцатый день, за исключением контрольной группы (фиг.8а). Также анализировали опухолевые рубцы в течение дополнительных двух недель для определения могла ли опухоль возникнуть повторно. Однако на 32 день признаков опухоли не было обнаружено, так что первая часть эксперимента была завершена и животные из контрольной группы были подвергнуты эвтаназии. Оставшихся опытных животных на этой стадии заражали аналогичной опухолью посредством подкожной инъекции 7×10⁶ HapT1-клеток на правой стороне верхней части тела, тогда как на левой стороне заражали другой опухолью (1×10⁶ НаК-опухоль), к развитию которой животные не были подвержены. Рост опухоли определяли с течением времени, что показано на фиг.8c-d. Интересно, что животные, которым прежде вводили Ad5D24GMCSF, полностью отторгали зараженную HapT1-опухоль, тогда как Hak-опухоли росли нормально, при этом у животных, которым ранее вводили Ad5D24E3, независимо наблюдался рост HapT1- и НаК-опухолей (фиг.8C-d).

Таким образом, данные показывают, что Ad5-D24-GM-CSF имеет противоопухолевую активность у иммунокомпетентных животных-опухоленосителей, и он способен устанавливать опухолеспецифический иммунитет до степени отторжения последующего заражения той же опухолью.

Пример 6

Анализ in vivo вирусов типа D24-GM-CSF у пациентов-людей

I. Пациенты

Пациенты с прогрессирующими и резистентными к лечению солидными опухолями были занесены в благотворительный протокол лечения, одобренный правительством. Информация о пациентах, получающих Ad5-D24-GM-CSF, перечислена в таблице 1.

22 пациентов с прогрессирующими солидными опухолями, резистентными к стандартному лечению (таблица 6), лечили одним курсом Ad5/3-d24-GMCSF внутривенно и внутриопухолево (таблица 7). Внутриопухолевую инъекцию выполняли интраперитонеально или интраплеврально для случая карциноматоза или плевральных метастазов соответственно. Критериями включения послужили солидные опухоли, резистентные традиционным способам лечения, индекс общего состояния по шкале ВОЗ 3 или более и отсутствие функциональных дефектов жизненно важных органов. Критериями исключения послужили органный трансплантат, ВИЧ, тяжелые сердечнососудистые, метаболические или легочные заболевания или другие симптомы, данные анализов или заболевания, предотвращающие лечение онколитическим вирусом. Получали письменное информированное согласие и лечение проводили в соответствии с Правилами проведения качественных клинических исследований и Декларацией, Helsinki.

II. Тактика лечения аденовирусным вектором, кодирующим GM-CSF

а) Лечение Ad5-D24-GM-CSF, Ad5/3-D24-GM-CSF или Ad5-RGD-D24-GM-CSF

Продуцировали Ad5-D24-GM-CSF, Ad5/3-D24-GM-CSF и Ad5-RGD-D24-GM-CSF в соответствии с клинической стадией и начинали лечение пациентов. Эта программа "фазы 0", применяемая благотворительно, обсуждалась в Комитете по хирургической этике HUCH. Программу также обсуждали в FinOHTA (национальная оценка медицинских технологий) и в Ethics Negotiation Board (Finnish Medical Association). Правовые аспекты контролировались Министерством социального обеспечения и здравоохранения, Национальным агентством по лекарственным средствам, юридическим консулом при Финской ассоциации медицинских работников, Органом федеральной власти по судебно-медицинской экспертизе и Парламентским комитетом комиссии по социальным вопросам и здравоохранению. Лечение подтверждалось комиссией по генной инженерии Финляндии.

Пациенты получали однократный курс лечения на день 0. Введение осуществляли путем внутриопухолевой инъекции под контролем ультразвука и почти одну пятую часть дозы вводили внутривенно. Исходная доза, составляющая 8×10¹⁰ VP, была выбрана с учетом безопасности результатов, которые опубликовали другие исследователи.

Вирус разводили в стерильном физиологическом растворе во время введения в подходящих условиях. После введения вируса все пациенты находились в госпитале под наблюдением в течение ночи и впоследствии в течение следующих 4 недель в амбулаторном режиме. Оценку физического состояния и записи в медицинской истории выполняли при каждом посещении и контролировали клинически релевантные лабораторные показатели. Побочные эффекты лечения записывали и оценивали в соответствии с Общей терминологией критериев нежелательных явлений v3.0 (CTCAE).

Поскольку многие раковые пациенты имели симптомы вследствие болезни, уже существующие симптомы не оценивали, если они не становились тяжелее. Однако если симптом становился более тяжелым, например исходная степень 1 изменялась на степень 2 после лечения, то записывали как степень 2. Сывороточные уровни GMCSF четырех других цитокинов (IL-6, IL-8, IL-10 и TNF-альфа) анализировали с помощью набора множества шариков для цитометрического анализа (BD Cytometric Bead Array (CBA)) Human Soluble Protein Flex Set (Becton Dickinson, Franklin Lakes, N.J., US). Размер опухоли оценивали с помощью компьютерной томографии (СТ) с применением контрастного вещества. Были получены максимальные диаметры опухоли. Критерии оценки ответа солидных опухолей (RECIST1.1) применяли для всего заболевания, включая инъецированные и неинъецированные очаги. Эти критерии включают: частичный ответ PR (>30% снижение суммы измерения диаметров опухоли), стабильное заболевание SD (нет уменьшения/увеличение), прогрессирующее заболевание PD (>20% увеличение). Четкое уменьшение опухоли, не соответствующей PR, оценивали как неполный ответ (MR). Также оценивали сывороточные опухолевые маркеры, при увеличении от исходного уровня, и использовались одинаковые проценты.

Образцы крови собирали перед и после лечения для анализа. В таблице 1 представлена вирусная нагрузка в сыворотке пациентов, которые подвергались лечению с Ad5-D24-GMCSF. Количественная ПЦР (qPCR) применялась для такого анализа (см. часть III для описания способов).

Таблицы 2, 3 и 4 показывают все побочные эффекты, которые были зафиксированы в течение и после лечения Ad5-D24-GM-CSF. Все побочные эффекты подразделяли в соответствии с Общей терминологией критериев нежелательных явлений v3.0 (CTCAE). Необходимо отметить, что у всех пациентов проявились гриппоподобные симптомы 1 или/и 2 степени, при этом только у двух наблюдались симптомы 3 степени, только один случай запора у пациентки с раком яичников, которая страдала от запоров прежде, один случай гипонатриемии 3 степени.

В таблице 5 представлена оценка эффективности Ad5-D24-GM-CSF в соответствии с критериями RECIST (Therasse P et al. 2000, J Natl Cancer Inst 92, 205-16). Интересно, что два полных ответа (CR) и пять стабильных заболеваний (SD) наблюдались у 14 анализируемых пациентов с 50% уровнем клинической эффективности.

b) Безопасность Ad5/3-d24-GMCSF у раковых пациентов

Лечение хорошо переносилось даже при высокой дозировке: 4×10¹¹ VP/пациента. Не наблюдали развития побочных эффектов до 4-5 степени. Гриппоподобные симптомы 1 -2 степени наблюдались у 19/22, 17/22 и 8/22 пациентов, что проявлялось в повышенной температуре, утомляемости или симптомах заболевания верхних дыхательных путей соответственно. Боль в месте инъекции (6 пациентов), абдоминальная боль (10 пациентов) и тошнота (9 пациентов) также были распространенными побочными эффектами 1-2 степени в дополнение (таблица 8). Бессимптомные и самоизлечивающиеся гематологические побочные эффекты 3 степени наблюдали у 4 пациентов: анемия (2 степень на исходном уровне), нейтропения, повышение уровня аспартатаминотрансферазы и гипонатриемия. Холестаз как негематологичексий побочный эффект 3 степени проявился у пациента с раком поджелудочной железы Н83 спустя три недели после лечения. Он также имел 3 степень по повышенным уровням аланинаминотрансферазы и биллирубина. Взятые в совокупности эти симптомы предполагают сжатие желчного протока, опосредованное опухолью. При этом неясно, была ли это воспалительная припухлость, опосредованная лечением, или произошел рост опухоли, вызванный прогрессированием заболевания.

III. Определение вируса в крови

Собирали образцы сыворотки от пациентов, получавших лечение Ad5-D24-GM-CSF или Ad5/3-D24-GM-CSF (см. пример 6, I.), и проводили традиционную ПЦР с праймерами и условиями, указанными в Takayama et al. 2007, J. Med. Virol. 79: 278-284. Коротко, экстрагировали общую ДНК путем добавления 3 мкг ДНК-носителя (полидеоксиадениловая кислота; Roche, Mannheim, Germany) к 400 мкл сыворотки и применяли набор для выделения геномной ДНК «QIAamp DNA mini kit». Экстрагированную ДНК элюировали в 60 мкл свободной от нуклеаз воде и измеряли концентрацию ДНК с помощью спектрометрии. Амплификация ПЦР основывалась на праймерах и нацеливании зонда на E1A-участок, фланкированный 24-bp делецией (прямой праймер 5'-TCCGGTTTCTATGCCAAACCT-3' (SEQ ID NO 1), обратный праймер 5'-TCCTCCGGTGATAATGACAAGA-3' (SEQ ID NO 2) и онко-зонд 5'^FAM-TGATCGATCCACCCAGTGA-3'^MGBNFQ (SEQ ID NO 3)). В дополнение, зонд, комплементарный последовательности, включенной в 24-bp участок, намеченный для делеции, использовался для тестирования образцов на присутствие аденовирусной инфекции дикого типа (зонд wt 5'^VIC-TACCTGCCACGAGGCT-3'^MGBNFQ (SEQ ID NO 4)).

Условия ПЦР в реальном времени PCR для каждой 25 мкл-реакции были следующими: 2-зондовый мастер-микс LightCycler480 Probes Master Mix (Roche, Mannheim, Germany), 800 нМ каждого прямого и обратного праймеров, 200 нМ каждого зонда и 250 нг экстрагированной ДНК. ПЦР-реакции осуществляли в LightCycler (Roche, Mannheim, Germany) при следующих цикличных условиях: 10 мин при 95°С, 50 циклов 10 с при 95°С, 30 с при 62°С и 20 сек при 72°С и 10 мин при 40°С. Все образцы тестировали дважды. Во всех ПЦР-сериях использовали реагенты для экзогенного внутреннего положительного контроля TaqMan (Applied Biosystems) для тестирования каждого образца на присутствие ингибиторов ПЦР.

Создавали регрессионную калибровочную кривую, используя ДНК, экстрагированную из серий разведении Ad5/3-D24-Cox2L (1×10⁸-10 vp/мл) в нормальной сыворотке человека. Предел обнаружения и предел количественного определения для анализа составлял 500 vp/мл сыворотки.

Положительные образцы проверяли с помощью ПЦР в реальном времени, используя мастер-микс LightCycler480 SYBR Green I Master mix (Roche, Mannheim, Germany) и праймеры, специфичные для аденовируса и последовательностей GM-CSF (прямой праймер 5'-AAACACCACCCTCCTTACCTG-3' (SEQ ID NO 5) и обратный праймер 5'-TCATTCATCTCAGCAGCAGTG-3' (SEQ ID NO 6)).

IV. Присутствие Ad5/3-d24-GMCSF в сыворотке после лечения

Все пациенты были отрицательными для Ad5/3-d24-GMCSF перед лечением Ad5/3-d24-GMCSF. На 1 день 17/19 пациентов имели измеряемые уровни вирусных геномов в сыворотке, с наибольшим титром 2061 VP/мл сыворотки. Из образцов, взятых в течение 3-7 дней, 12/15 пациентов были положительными, с наибольшим титром 3,36×10⁵ vp/мл сыворотки. Положительные образцы наблюдались плоть до 58 дней после лечения (таблица 9).

V. Титры GMCSF и нейтрализующих антител в сыворотке после лечения

Не существовало значимого изменения в системных уровнях GMCSF после лечения Ad5/3-d24-GMCSF, которые хорошо коррелируют с незначительными эффектами, наблюдаемыми в уровнях общего числа лейкоцитов. Это предполагает полное расщепление GMCSF-продукции в локальных участках репликации вируса в опухолях. У одной пациентки, S70, внезапное увеличение в сыворотке GMCSF наблюдали на 4 день, что сопровождалось внезапным повышением содержания лейкоцитов. Это может быть связано с эффективной репликацией вируса, так как у пациентки одновременно наблюдалась лихорадка и 3,36×10⁵ vp/мл вируса в сыворотке (таблица 9). Эта пациентка не испытывала каких-либо серьезных побочных эффектов в течение периода наблюдения. Однако проведенное после лечения СТ-сканирование подтвердило противоопухолевую активность (SD), и на протяжении 4 недель после лечения она чувствовала себя лучше и ее непрекращающиеся боли в груди исчезли. Наивысшая концентрация GMCSF, измеренная в крови этой пациентки, составляла 115 пг/мл, что было примерно в 10 раз ниже, чем токсичные уровни GMCSF у людей.

На исходном уровне 4/15 пациента были полностью негативными относительно нейтрализующего антитела против Ad5/3. Другие 2 пациента имели едва детектируемые (1-4), тогда как 8 пациентов имели низкий титр (16-64). Никто из пациентов не имел средний и высокий титр нейтрализующих антител против Ad5/3 на исходном уровне. После лечения титр увеличивался у всех пациентов (р<0,005) (таблица 9). Не наблюдали четкой корреляции между титрами нейтрализующих антител и дозой вируса, противоопухолевой активности или токсичности. Интригующе, относительно вирусной нагрузки в сыворотке два пациента, Y62 и O79, были положительными на нейтрализующее антитело в исходном уровне и имели высокие титры на протяжении 2-4 недель, но также имели измеряемые нагрузки вируса, присутствующего в их сыворотке, по меньшей мере, 28 и 58 дней соответственно (таблица 9). Это показывает, что даже высокие титры антител не могут препятствовать репликации вируса в опухолях Интересно, титр антител не достигал максимума у всех пациентов. Например, S70, X122 и Н83 имели большое количество вируса, циркулирующего в течение 1 недели, и их титр антител возрастал медленно.

VI. Гибель дифференцированных опухолевых клеток

СТ-сканирования пациентки, страдающей от рака яичников, и пациента, страдающего мезотелиомой, (см. таблицу 1) перед и после лечения Ad5-D24-GM-CSF представлены на фиг.9а-b.

VII. Эффективность Ad5/3-D24-GMCSF

Все пациенты имели прогрессирующие опухоли перед лечением. Была определена польза проведения радиотерапии для 12 пациентов в соответствии с RECIST1.1 (Table 9). 2 пациента имели неполный ответ, 6 пациентов имели стабильное заболевание и 4 пациента имели прогрессивное заболевание (PD). Следовательно, уровень клинической пользы от радиотерапии составлял 67%. Необходимо отметить, что быстрорастущая опухоль поджелудочной железы у Н96 прекратила рост, но метастатические повреждения проявились в легких, и поэтому было классифицировано как PD. Аналогично, пациент O129 имел 6% снижение инъецируемой опухоли, но у него образовались новые метастазы. У пациента V136, который имел две метастатические опухоли, исчез неинъецированный очаг в печени, тогда как другие опухоли остались как SD.

Относительно опухолевых маркеров, определяемых для пациентов, у которых маркеры определялись на исходном уровне, у 2/6 наблюдали снижение уровней маркеров и у 4/6 возрастание (таблица 9).

Общая выживаемость пациентов после лечения представлена на фиг.14.

В дополнение к объективным измерениям противоопухолевой активности мы также рассматривали клинический и/или субъективный эффект в некоторых случаях (таблица 9). Это включало пациентов с улучшенным общим состоянием, пальпируемую опухоль на ощупь мягче и/или меньше и ослабление симптомов, вызванных опухолью. Важность состояла в том, что пациенты, прежде страдающие от быстрого накопления перитонеального и/или плеврального выпота, имели четкое снижение этого накопления после проведенного вирусного лечения, при этом этот эффект длился в течение нескольких месяцев в обоих случаях.

В целом, признаки противоопухолевой эффективности наблюдали у 13/21 пациентов (62%).

VIII. Гематологические эффекты лечения

После лечения Ad5/3-D24-GM-CSF исследовали уровни лейкоцитов, эритроцитов, Нb, тромбоцитов, билирубина, INR, ALT, AST, ALP, креатинина, К, Na, CRP, CA19-9, GT, фибриновых D-димеров и СЕА (таблицы 3-4).

IX. Иммунный ответ на вирус

a) IL-6, IL-10, TNF-α и IL-8

Одним возможным недостатком аденовирусной генной терапии является ранняя токсичность, возникающая вследствие воздействия вирусных компонентов, которые могут быть иммуногенными и могут приводить к сепсис-подобному шоку и даже к смерти (Brunetti-Pierri et al. Gene Ther 2004; Raper et al., 2002). Следовательно, очень важно контролировать признаки возможной «цитокиновой бури», которая может привести к развитию органной недостаточности. В связи с этим вскоре после лечения и в обозначенный период времени у пациентов брали кровь, в которой определяли уровни провоспалительных цитокинов с помощью анализа FACSARRAY, как описано в статье Cerullo V et al. (2007, Mol Ther 15, 378-85). Не наблюдали значимых изменений у пациентов, лечившихся Ad5-D24-GM-CSF, что показывает отсутствие ранней врожденной токсичности.

Результаты недостатка ранней врожденной токсичности, связанной с Ad5/3-D24-GM-CSF, представлены в таблице 10.

b) Индукция цитотоксических Т-клеток против опухолей и специфический иммунитет против опухолевого эпитопа

Онколитическая гибель клеток позволяет иммунной системе приобретать способность распознавать и убивать опухолевые клетки. Это особенно полезно для уничтожения опухоли и может способствовать выздоровлению. Аденовирус выводится из организма за относительно короткое время после введения; следовательно, ключевым значением является стимуляция иммунной системы, чтобы она смогла распознать специфический опухолевый антиген с тем, чтобы лечение могло привести к длительному положительному действию для пациента. В дополнение, в присутствии антитела вирус нейтрализуется, так что он может потерять свою эффективность в отношении инфицирования метастазов. Однако эффекторные Т- или NK-клетки, индуцированные против опухоли, могут свободно циркулировать и, в конечном счете, убивать метастазы, которые находятся далеко от инъецированной опухоли. Для демонстрации того, что GMCSF-экспрессирующий аденовирус способен устанавливать аденовирус- и опухолевый специфический иммунитет, РВМС, собранные от пациентов, анализировали с помощью INF-гамма ELISPOT. ELISPOT выполняли в «слепом» порядке внешней компанией, которая не представляла информацию о тактике лечения пациентов, которые прошли через это (Proimmune). На фиг.10а-d представлены результаты такого анализа. Видно, что у одинаковых пациентов, если Т-клетки стимулировали пулом пептида, полученного или из опухолевого антигена (сурвивин), или из аденовируса (пентон), то эти клетки становились активированными и поэтому продуцировали INF-гамма (IFN-гамма является специфическим маркером активации стимулированных Т-клеток).

Фиг.11 показывает индукцию аденовирусных гексон-специфичных Т-клеток. Лейкоциты, собранные от пациентов, лечившихся с Ad5-D24-GMCSF, окрашивали CD3, CD8 и гексон-специфичными тетрамерными антителами и анализировали с помощью проточной цитометрии перед и после лечения. Лечение увеличивало гексон-специфические цитотоксические Т-клетки с 0,21 до 2,72%.

с) Сокращение регуляторных Т-клеток

Предыдущие данные продемонстрировали, что периодическое введение циклофосфамида сокращает число регуляторных Т-клеток (T-Reg) у лабораторных животных.

Этот подход применяли у пациентов, которые получали периодическое введение циклофосфамида перед и после лечения Ad5-D24-GMCSF, и выполняли T-reg анализ на мононуклеарных клетках периферической крови (РВМС), взятых от этих пациентов. В примере, проиллюстрированном на фиг.12, представлен один пример от пациента R73, и он показывает сокращение циркулирующих T-reg. Общие РВМС собирали от пациентов и замораживали в соответствующей среде. Во время анализа все образцы размораживали и сначала окрашивали с помощью CD4 и CD127-антител, а затем клетки пермеабилизировали и окрашивали для фактора транскрипции Foxp3. Предполагается, что клетки, которые по результатам были положительными для CD4, отрицательными для CD 127, но богатые по Foxp3, являются эффективными регуляторными Т-клетками (T-reg) (фиг.12).

Пример 7

Статистический анализ

Для сравнения активности люциферазы и титров нейтрализующих антител перед и после лечения, уровней цитокинов и концентраций GM-CSF применяли двусторонний критерий Стьюдента. Данные по выживаемости обрабатывали с помощью анализа Каплана-Мейеоа.

Таблица 1 Таблица, показывающая присутствие Ad5-D24-GMCSF в сыворотке получающих лечение пациентов   Дни после лечения Пациенты (Код) Первичная опухоль Доза вируса (общие vp) Предварительное лечение 1 2 3-7 8-12 13-20 21-40 Вирусная нагрузка в сыворотке (vp/мл) С3 Рак тонк. кишк. 8×109 0 0 500 500 NA NA 0 M3 Гепатоцеллюлярный рак 1×10¹⁰ 0 0 4896 0 0 0 0 O12 Рак яичник. 3,6×10¹⁰ 0 0 0 0 0 0 0 O14 Рак яичник. 1×10¹¹ 0 0 0 500 0 0 0 G15 Рак желудка 1×10¹¹ 0 0 565 500 0 0 0 К18 Мелкокл. рак легких 2×10¹¹ 0 500 NA 0 0 0 856 Т19 Рак щитовид. желез. 2×10¹¹ 0 765 500 500 0 0 0 U89 Ренальн. рак 2×10¹¹ 0 0 NA NA NA NA 0 S100 Лейомиосаркома 2×10¹¹ 0 500 NA 500 NA NA NA S108 Синовиальная саркома 2×10¹¹ 0             М50 Мезотелиома 2,5×10¹¹ 0 0 NA 500 NA 0 0 R8 Рак молочн. железы 3×10¹¹ 0 500 NA 500 NA 0 0 М32 Мезотелиома 3×10¹¹ 0 0 0 NA NA 0 0 Х49 Рак шейки матки 3×10¹¹ 0 4290 NA NA 37975 6706 1211 152 Меланома 3×10¹¹ 0 576           178 Хороидальн. рак 3×10¹¹ 0 44867 NA NA NA NA 500 C58 Рак толстой кишки 4×10¹¹ 0 1978 NA 4236 878 NA NA R73 Рак молочн. желез. 4×10¹¹ 0             O88 Рак яичников 4×10¹¹ 0            

Таблица 2 Таблица, которая суммирует побочные эффекты, сообщенные пациентами, получившими лечение Ad5-D24-GMCSF   Кол-во пациентов   степень 1 степень 2 степень 3 степень 4 Диапазон доз Сообщенные симптомы           Лихорадка 3       L     1     M   6 4     Н Боль в области инъекции         L     1     М           Н Мышечная боль 1       L           М   1 1     Н Головная боль   1     L     1     М   1       Н Слабость   1     L   1       М   2 3     Н Одышка         L     1     М   2       Н Диарея         L           М   1       Н Гипотензия         L   1       М   1       Н Тошнота         L   2       М   3       Н Рвота         L           М   3       Н Головокружение         L           М   2       Н Кашель 1       L   1 1     М   3 3     Н Озноб         L   4       М   1       Н L (Низкая доза) = Дозовый интервал 1 Группы 8×10⁹≤D≤3,6×10¹⁰ М (Средняя доза) = Дозовый интервал 2 Группы 1×10¹¹≤D≤2,5×10¹¹ Н (Высокая доза) = Дозовый интервал 3 Группы 3×10¹¹≤D≤4×10¹¹

Таблица 3 Гематологические побочные эффекты после введения Ad5-D24-GMCSF Эффект Ранняя токсичность (1-7 дней) Поздняя токсичность (>7 дней) Интервал доз Стадия 1 Стадия 2 Стадия 3 Стадия 4 Стадия 1 Стадия 2 Стадия 3 Стадия 4 Гипонатриемия 1               L   1       1 1     М   6   1           Н Гипокалиемия 1       2       L   2       1       М   1               Н Анемия 1               L   1               М   2 4       3     Н Тромбоцитопения           1     L                   М   1               Н Лейкопения                       1                                   L (Низкая доза) = Дозовый интервал 1 Группы 8×10⁹≤D≤3,6×10¹⁰ М (Средняя доза) = Дозовый интервал 2 Группы 1×10¹¹≤D≤2,5×10¹¹ Н (Высокая доза) = Дозовый интервал 3 Группы 3×10¹¹≤D≤4×10¹¹

Таблица 4 Печеночные ферменты после введения Ad5-D24-GMCSF Эффект Ранняя токсичность (1-7 дней) Стадия Поздняя токсичность (>7 дней) Стадия Интервал доз 1 2 3 4 1 2 3 4 АЛТ Кол-во пациентов                 L     1       1     М   3       1       Н ACT Кол-во пациентов                 L     1       1     М   1 1     1 1     Н Гипербилирубинемия                 L                   М   2       1       Н L (Низкая доза) = Дозовый интервал 1 Группы 8×10⁹≤D≤3,6×10¹⁰ М (Средняя доза) = Дозовый интервал 2 Группы 1×10¹¹≤D≤2,5×10¹¹ Н (Высокая доза) = Дозовый интервал 3 Группы 3×10¹¹≤D≤4×10¹¹

Таблица 5 Эффективность лечения Ad5-D24-GMCSF у пациентов, принимавших лечение разными дозами Ad5-D24-GMCSF. Доза вируса (общие VP)             Выживаемость (Дни) Кол-во пациентов       RECIST   300< 200< CR PR SD PD NA S>300 S>200 S>100 S<100 8×109 VP 1         1     1   1×1010 VP 1       1   1       3.6×1010 VP 1     1         1   1×1011 VP 2 1       1 1 1     2×1011 VP 4     1 4   1   2 1 2.5×1011 VP 1     1       1     3×1011 VP 5 1     3 1 1   2   3.6×1011 VP 1                   4×1011 VP 3   1 1   1     3   Анализ выполнен в соответствии с критерием RECIST. CR = полный ответ, PR = неполный ответ, SD = стабильное заболевание, PD = прогрессирующее заболевание, NA = нет данных

Таблица 6 Сводная характеристика пациентов для лечения Ad5/3-D24-GM-CSF на исходном уровне. Числа показывают количество пациентов из 22   Кол-во пациентов Пол   Мужчины 11 Женщины 11 Индекс общего состояния WHO   Среднее 1 Диапазон 0-3 Тип опухоли   Холангиокарцинома 1 Рак поджелудочной железы 3 Колоректальный рак 2 Рак простаты 2 Рак легких 1 Рак яичников 4 Меланома (хороидальная или кожи) 3 Плоскоклеточный рак головы и шеи 1 Саркома (кости, сустава или хряща) 3 Рак матки 1 Рак мочевого пузыря 1 Мезотелиома 1 Предыдущее лечение   Химиотерапия 22 Средние режимы химиотерапии на пациента   Радиотерапия 6 Гормональная терапия 1 Хирургические вмешательства 15 Ad5/3 нейтрализирующие антитела (исходный уровень)   Положительный 11 Отрицательный 4 Возраст Лет Средний 61 Средний 56 Диапазон 17-78

Таблица 7 Характеристика пациентов для лечения Ad5/3-D24-GM-CSF на исходном уроне и описание лечения   ID Возраст Пол Диагноз Предыдущее лечение WHO^a Циклофосфамид^d Доза (vp)^b Путь введения^c Y62 55 Холангиокарцинома и светлоклеточная гипернефрома. Метастазы в печень и шею Гемцитабин 2 + 1×10¹¹ 3/4 i.t. Печен. мет., шеи, почки 1/4 I.v. 3/4 i.t. Печен. Мет. 1/4 I.v. 2/3 i.t. Печен. Мет. 1/3 I.v 2/3 i.t. Бедра 1/3 I.v. 1/10 I.pl. 6/10 1.1 легких 3/10 I.v   М                     НН64 54 Карцинома поджелудочной железы. Метастазы в печень Операция, гемцитабин 0 - 8×10¹⁰   Ж       С66 63 Карцинома толстой кишки. Метастазы в печень, легкие, лимф. узлы. Операция, леиковорин, оксиплатин, 5-фторурацил и бевацизумаб 0 + 2×10¹¹   Ж                 S67 55 Хондросаркома бедра Опреация, облучение, цисплатин 1 + 2×10¹¹   М       S70 24 Синовиальная саркома голени. Метастазы в легкие Операция (2 раза), ифосфамид, доксорубицин, уромитексан, цисплатин, гемцитабин, сорафениб, этопозид. 2 - 1×10¹¹   Ж        

Таблица 8   Побочные явления. У всех 22 пациентов оценивались побочные явления (АЕ) согласно критериям CTCEA v.3.0 в течение 4 недель после обработки Ad5/3D24-GMCSF. Побочные явления стадии 1 сообщаются, только если присутствуют у 2 или большего количества пациентов. Представлены все АЕ стадий 2-5. Числа указывают количество пациентов из 22.  

Таблица 9   Титр нейтрализующих антител, вирусная нагрузка в сыворотке и ответ после обработки Ad5/3-D24-GVCSF  

Таблица 10   Иммунный ответ на Ad5/3-D24-GM-CSF  

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой онколитический аденовирусный вектор, клетку и фармацевтическую композицию, содержащую указанный вектор, а также применение указанных векторов в производстве лекарственного средства для лечения рака у субъекта и к способу лечения рака у субъекта. Предложенное изобретение может быть использовано при лечении рака. Онколитический аденовирусный вектор содержит остов нуклеиновой кислоты аденовируса 5-го серотипа (Ad5), делецию в 24 нуклеотида, соответствующих аминокислотам 122-129 в E1A константной области 2, и последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую человеческий колониестимулирующий фактор гранулоцитов-макрофагов (GM-CSF) на месте удаленного gp19k/6.7K в участке E3, и при необходимости капсидную модификацию. Предложенное изобретение позволяет повысить опухолеспецифический иммунный ответ у субъекта. 9 н. и 31 з.п. ф-лы, 36 ил., 10 табл., 7 пр.

1. Онколитический аденовирусный вектор, отличающийся тем, что он содержит остов нуклеиновой кислоты аденовируса 5-го серотипа (Ad5), делецию в 24 нуклеотида, соответствующих аминокислотам 122-129 в E1A константной области 2, и последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую человеческий колониестимулирующий фактор гранулоцитов-макрофагов (GM-CSF) на месте удаленного gp19k/6.7K в участке E3, и при необходимости капсидную модификацию.

2. Онколитический аденовирусный вектор по п.1, отличающийся тем, что он дополнительно содержит один или нескольких участков, выбранных из группы, состоящей из Е2, Е4 или поздних участков.

3. Онколитический аденовирусный вектор по п.2, отличающийся тем, что он содержит следующие участки: левый ITR, неполный E1, pIX, pIVa2, Е2, VA1, VA2, L1, L2, L3, L4, неполный E3, L5, E4 и правый ITR.

4. Онколитический аденовирусный вектор по п.3, отличающийся тем, что участки расположены последовательно в направлении 5′-3′.

5. Онколитический аденовирусный вектор по п.1, отличающийся тем, что участок дикого типа расположен перед участком E1.

6. Онколитический аденовирусный вектор по п.1, отличающийся тем, что участок E1 содержит вирусный сигнал упаковки.

7. Онколитический аденовирусный вектор по п.1, отличающийся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая GM-CSF, находится под контролем вирусного промотора E3.

8. Онколитический аденовирусный вектор по п.1, отличающийся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая GM-CSF, принадлежит дикому типу.

9. Онколитический аденовирусный вектор по п.2, отличающийся тем, что участок Е4 принадлежит дикому типу.

10. Онколитический аденовирусный вектор по п.1, отличающийся тем, что он содержит капсидную модификацию.

11. Онколитический аденовирусный вектор по п.10, отличающийся тем, что капсидная модификация представляет собой химеризм Ad5/3, вставку участка связывания интегрина (RGD) и/или модификацию связывающего гепаринсульфат полилизина в фибре.

12. Онколитический аденовирусный вектор по п.11, отличающийся тем, что капсидная модификация представляет собой модификацию RGD-4C.

13. Онколитический аденовирусный вектор по п.1, отличающийся тем, что он содержит по меньшей мере одну экспрессионную кассету.

14. Онколитический аденовирусный вектор по п.1, отличающийся тем, что он содержит только одну экспрессионную кассету.

15. Онколитический аденовирусный вектор по п.1, отличающийся тем, что вектор способен селективно реплицироваться в клетках, имеющих дефекты в Rb-пути.

16. Клетка, отличающаяся тем, что она содержит аденовирусный вектор по любому из пп.1-15 для получения аденовирусного вектора in vitro, ex vivo или in vivo, или в качестве мишени, которая инфицирована аденовирусным вектором по любому из пп.1-15.

17. Фармацевтическая композиция для лечения рака, отличающаяся тем, что она содержит аденовирусный вектор по любому из пп.1-15 в эффективном количестве и фармацевтически приемлемый носитель, буфер, эксципиент, адъювант, антисептик, наполнитель или стабилизатор.

18. Онколитический аденовирусный вектор по п.1, отличающийся тем, что он действует как противораковая вакцина in situ.

19. Фармацевтическая композиция по п.17, отличающаяся тем, что она действует как противораковая вакцина in situ.

20. Применение аденовирусного вектора по любому из пп.1-15 при изготовлении лекарственного средства для лечения рака у субъекта, при необходимости в комбинации с другими видами терапии.

21. Применение по п.20, отличающееся тем, что рак выбирают из группы, состоящей из назофарингеального рака, синовиального рака, гепатоцеллюлярного рака, рака почек, рака соединительных тканей, меланомы, рака легких, рака кишечника, рака толстой кишки, рака прямой кишки, колоректального рака (ободочной и прямой кишки), рака мозга, рака гортани, рака полости рта, рака печени, рака костей, рака поджелудочной железы, хориокарциномы, гастриномы, феохромоцитомы, пролактиномы, T-клеточной лейкемии/лимфомы, нейромы, болезни фон Гиппеля-Линдау, синдрома Золлингера-Эллисона, рака надпочечников, рака анального канала, рака желчных протоков, рака мочевого пузыря, рака мочеточников, рака мозга, олигодендроглиомы, нейробластомы, менингиомы, опухолей спинного мозга, рака костей, остеохондромы, хондросаркомы, саркомы Юинга, рака без выявленного первичного очага, карциноида, карциноида желудочно-кишечного тракта, фибросаркомы, рака молочной железы, болезни Пэджета, рака шейки матки, колоректального рака, ректального рака, рака пищевода, рака желчного пузыря, рака головы, рака глаз, рака шеи, рака почек, опухоли Вильмса, рака печени, саркомы Капоши, рака предстательной железы, рака легких, рака яичек, болезни Ходжкина, неходжкинской лимфомы, рака полости рта, рака кожи, мезотелиомы, множественной миеломы, рака яичников, внутрисекреторного рака поджелудочной железы, глюкагономы, рака поджелудочной железы, рака паращитовидной железы, рака пениса, гипофизарного рака, саркомы мягких тканей, ретинобластомы, рака тонкой кишки, рака желудка, рака тимуса, рака щитовидной железы, трообластного рака, хорионаденомы, рака матки, рака эндометрия, рака влагалища, рака вульвы, невриномы слухового нерва, грибовидной гранулемы, инсулиномы, карциноидного синдрома, соматостатиномы, рака десен, рака сердца, рака губ, рака оболочки головного мозга, рака ротовой полости, рака нервов, рака неба, рака паращитовидной железы, рака брюшной полости, рака глотки, рака плевры, рака слюнных желез, рака языка, рака небных миндалин.

22. Применение по п.20, отличающееся тем, что субъектом является человек или животное.

23. Применение по п.20, отличающееся тем, что лекарственное средство вводится посредством внутриопухолевой, внутримышечной, внутриартериальной, внутривенной, внутриплевральной, интравезикулярной, внутриполостной или внутрибрюшинной инъекции либо перорально.

24. Применение по п.20, отличающееся тем, что лекарственное средство вводится несколько раз за курс лечения.

25. Применение по п.20, отличающееся тем, что субъекту вводится онколитический аденовирусный вектор, имеющий другой фиберный выступ капсида по сравнению с вектором предыдущего лечения.

26. Применение по п.20, отличающееся дополнительно тем, что лекарственное средство комбинируют с назначением субъекту сопутствующей радиотерапии и/или сопутствующей химиотерапии.

27. Применение по п.20, отличающееся дополнительно тем, что лекарственное средство комбинируют с назначением субъекту верапамила или другого блокатора кальциевых каналов, средств, индуцирующих аутофагию, темозоломида, химиотерапии или терапии против CD20 либо других подходов, направленных на блокирование нейтрализующих антител, веществ, способных понизить уровень регуляторных Т-клеток у субъекта, и/или циклофосфамида.

28. Способ лечения рака у субъекта, отличающийся тем, что он включает введение субъекту вектора по любому из пп.1-15 или фармацевтической композиции по п.17 в эффективном количестве при необходимости в комбинации с другими видами терапии.

29. Способ по п.28, отличающийся тем, что рак выбирают из группы, состоящей из назофарингеального рака, синовиального рака, гепатоцеллюлярного рака, рака почек, рака соединительных тканей, меланомы, рака легких, рака кишечника, рака толстой кишки, рака прямой кишки, колоректального рака (ободочной и прямой кишки), рака мозга, рака гортани, рака полости рта, рака печени, рака костей, рака поджелудочной железы, хориокарциномы, гастриномы, феохромоцитомы, пролактиномы, T-клеточной лейкемии/лимфомы, нейромы, болезни фон Гиппеля-Линдау, синдрома Золлингера-Эллисона, рака надпочечников, рака анального канала, рака желчных протоков, рака мочевого пузыря, рака мочеточников, рака мозга, олигодендроглиомы, нейробластомы, менингиомы, опухолей спинного мозга, рака костей, остеохондромы, хондросаркомы, саркомы Юинга, рака без выявленного первичного очага, карциноида, карциноида желудочно-кишечного тракта, фибросаркомы, рака молочной железы, болезни Пэджета, рака шейки матки, колоректального рака, ректального рака, рака пищевода, рака желчного пузыря, рака головы, рака глаз, рака шеи, рака почек, опухоли Вильмса, рака печени, саркомы Капоши, рака предстательной железы, рака легких, рака яичек, болезни Ходжкина, неходжкинской лимфомы, рака полости рта, рака кожи, мезотелиомы, множественной миеломы, рака яичников, внутрисекреторного рака поджелудочной железы, глюкагономы, рака поджелудочной железы, рака паращитовидной железы, рака пениса, гипофизарного рака, саркомы мягких тканей, ретинобластомы, рака тонкой кишки, рака желудка, рака тимуса, рака щитовидной железы, трообластного рака, хорионаденомы, рака матки, рака эндометрия, рака влагалища, рака вульвы, невриномы слухового нерва, грибовидной гранулемы, инсулиномы, карциноидного синдрома, соматостатиномы, рака десен, рака сердца, рака губ, рака оболочки головного мозга, рака ротовой полости, рака нервов, рака неба, рака паращитовидной железы, рака брюшной полости, рака глотки, рака плевры, рака слюнных желез, рака языка, рака небных миндалин.

30. Способ по п.28, отличающийся тем, что субъектом является человек или животное.

31. Способ по п.28, отличающийся тем, что лекарственное средство вводится посредством внутриопухолевой, внутримышечной, внутриартериальной, внутривенной, внутриплевральной, интравезикулярной, внутриполостной или внутрибрюшинной инъекции либо перорально.

32. Способ по п.28, отличающийся тем, что лекарственное средство вводится несколько раз за курс лечения.

33. Способ по п.28, отличающийся тем, что субъекту вводится онколитический аденовирусный вектор, имеющий другой фиберный выступ капсида по сравнению с вектором предыдущего лечения.

34. Способ по п.28, отличающийся тем, что он дополнительно включает назначение субъекту сопутствующей радиотерапии и/или сопутствующей химиотерапии.

35. Способ по п.28, отличающийся тем, что он дополнительно включает назначение субъекту верапамила или другого блокатора кальциевых каналов, средств, индуцирующих аутофагию, темозоломида, химиотерапии или терапии против CD20 либо других подходов, направленных на блокирование нейтрализующих антител, веществ, способных понизить уровень регуляторных T-клеток у субъекта, и/или циклофосфамида.

36. Способ продуцирования GM-CSF в раковых клетках, отличающийся тем, что он включает:
a) доставку носителя, содержащего онколитический аденовирусный вектор по любому из пп.1-15, в раковые клетки, и
b) экспрессирование GM-CSF из данного вектора в клетках.

37. Способ повышения опухолеспецифичного иммунного ответа у субъекта, отличающийся тем, что он включает:
a) доставку носителя, содержащего онколитический аденовирусный вектор по любому из пп.1-15 в раковые клетки или ткань мишени,
b) экспрессирование GM-CSF из данного вектора в клетках и
c) повышение количества цитотоксических T-клеток и/или натуральных киллеров в данных клетках или ткани мишени субъекта с помощью GM-CSF.

38. Применение онколитического аденовирусного вектора по любому из пп.1-15 для продуцирования GM-CSF в раковых клетках.

39. Применение онколитического аденовирусного вектора по любому из пп.1-15 для повышения опухолеспецифичного иммунного ответа у субъекта.

40. Применение онколитического аденовирусного вектора по п.39, отличающееся тем, что в клетках или ткани мишени повышается количество натуральных киллеров и/или цитотоксических T-клеток.