СПОСОБ БИОЛОГИЧЕСКОЙ ИНКРУСТАЦИИ СЕМЯН БОБОВЫХ КУЛЬТУР Российский патент 2022 года по МПК A01N63/20 A01N63/22 A01C1/06 A01C1/08 

Изобретение относится к области биотехнологии и сельского хозяйства и заключается в предварительной инкрустации семян бобовых культур с помощью биополимерных оболочек на основе штаммов полезных микроорганизмов и полисахаридов биологического и микробного происхождения.

Известен Европейский патент ЕР 0454291 А1 на ИЗ «Способ получения улучшенных инокулянтов ризобия» с приоритетом от 26.02.1990 г., зарегистрированный на Grace W.R. & Со (US), МПК A01G 7/00; А01Н 1/00; C12N 1/20; C12N 15/09, опубликован 30.10.1991 г.

В описании к патенту раскрыт способ получения улучшенного инокулянта бактерий Rhizobium, который включает культивирование штамма Rhizobium в среде с мукой из семян бобовых или экстрактом такой муки (в частности, дополнительно содержит вермикулит и источник питательных веществ, например, дрожжевой экстракт-бульон маннита), инокуляцию семян бобовых культур (например, сои), культивированным штаммом бактерий Rhizobium (например, Rhizobium japonicum), стабилизированным вермикулитом, и проращивание семян бобовых.

То есть в данном случае предусмотрена стабилизация только одного штамма клубеньковых бактерий на поверхности семян бобовых.

Из уровня техники известно, что при инокулировании семян полезными бактериями для изоляции и сохранения биологического материала их стабилизацию осуществляют с помощью высокомолекулярных соединений химического происхождения и частично природного, так, например, в американском патенте US 7604807 B2 используют защитные природные полимеры: PVP, PVA, желатин, моно и полисахариды, крахмал, альбумин, альгинат натрия и т.п.

Известна международная заявка WO 09830077 A1 «Готовые к употреблению семена, обработанные бактериями, и способ их получения» с приоритетом от 10.01.1997 г., зарегистрированная на Agronomique Inst Nat Rech (FR); Digat Bernard (FR), МПК A01C 1/06; A01N 63/00, опубликована 16.07.1998 г.

Способ предлагает покрытие семян пленкой, содержащей бактерии (например, рода Rhizobium, Bradyrhizobium, Pseudomonas, Agrobacterium, Bacillus или Azospirillum), биоразлагаемый, водоудерживающий, пленкообразующий, прилипающий к семенам полимер, такой как хитозан, альгинат, целлюлоза или одно из их производных, и агент, например, L-глутаминовая кислота для быстрого увеличения внутриклеточного осмотического давления бактерий.

Известно также изобретение «Способ прикрепления бактерий к семенам и композиция для его осуществления» по патенту US №5113619 А с приоритетом от 05.10.1990 г., зарегистрированному на Leps Walter Т (CA); Thompson Bradley G (СА), МПК А01С 1/06, опубликовано 19.05.1992 г.

В патенте описан способ покрытия семян бактериями, при котором предварительно выращивают бактерии при обеспечении среды, подходящей для поддержания их роста и образования концентрированного, не модифицированного биополимера, с извлечением этого биополимера из среды. После этого на семена наносят инокулянтную композицию, содержащую популяцию бактерий и концентрированный, не модифицированный биополимер с образованием семенной оболочки, в которой популяция бактерий способна выживать по меньшей мере до прорастания семян; и сушки покрытых семян.

В частности, указанная композиция инокулянта содержит популяцию ризобактерий, а указанный биополимер представляет собой кислотный гетеро-эксополисахарид, секретируемый Rhizobium sp.

То есть в данном патенте при инокуляции семян ризобактериями используют полисахариды, продуцируемые самими ризобиями, а не сторонними штаммами.

Известно изобретение «Использование микроорганизмов в сочетании с семенами» по патенту Великобритании GB 2080669 A с приоритетом от 28.07.1980 г., зарегистрированное на Coated Seed Ltd (NZ), МПК A01C1/06; C12N 1/04, опубликовано 10.02.1982 г.

В патенте описан способ получения семян бобовых с предварительным наружным покрытием, в котором покрытие содержит бактерию вида Rhizobium и водорастворимый поливинилпирролидон, включающий формирование суспензии бактерий в водном растворе поливинилпирролидона и нанесение суспензии на семена. В частности, семена покрывают казеинатом натрия, мелкоизмельченным известняком и торфом, сушат для удаления излишков влаги и затем смешивают с суспензией культуры Rhizobium на торфяной среде в растворе поливинилпирролидона в воде (ПВП).

Известно также изобретение «Способ получения семян, покрытых оболочкой» по патенту US 5106648А с приоритетом от 16.09.1991 г., зарегистри-рованн на Agricultural Genetics Со (GB), МПК А01С 1/06; A01N 25/00; A01N 63/00, опубликован 21.04.1992 г. Этот патент выбран в качестве прототипа.

Описан способ получения семян, покрытых оболочкой, при котором сначала смешивают семена (1) с композицией инокулянта (2), содержащей среду-носитель, по меньшей мере, один вид микроорганизмов, оказывающих благоприятное воздействие на растения, вырастающие из этих семян, и первый адгезивный полимер, и с водной суспензией второго адгезивного полимера (3), выбранного из группы, состоящей, в частности, из сополимеров винилпирролидона/винилацетата, причем компонент (3), добавляется отдельно до или во время суспендирования; после чего инокулированные семена сушат на воздухе при температуре не выше 30°С.

Носителем предпочтительно является торф, но может быть использован вермикулит, глина, ил, графит, тальк и т.д. При этом, в частности, семена являются семенами бобовых культур, в качестве первого и второго адгезивных (клеящих) полимеров используют сополимер винилпирролидона и винилацетата, а в качестве микроорганизмов - бактерии ризобия. Кроме того, в покрытие может быть введен совместимый с бактериями химический фунгицид, например, металаксил, карбатин или тирам.

То есть, в способе - прототипе инокулянтная композиция содержит среду-носитель (например, торф, глина), полезные микроорганизмы по меньшей мере одного вида (например, бактерии ризобия) и первый адгезивный полимер, а также содержит водную суспензию второго адгезивного полимера (например, в качестве первого и второго адгезивного полимера использован сополимер винилпирролидона и винилацетата).

Обработка семян (бобовых культур) описанным способом обеспечивает сохранность высокого количества жизнеспособных ризобиальных клеток (титр) на одно семя в течение не менее 3 месяцев.

Одним из препятствий для внедрения технологии предварительного инокулирования семян является естественная нестабильность микроорганизмов. Некоторые из них не могут перенести резкого процесса сушки при инокулировании семян или при последующих периодах хранения на открытом воздухе. Поэтому виды бактерий, у которых есть стадия покоя в своем жизненном цикле (например, устойчивые споры), легче применять для инокулирования семен.

При этом такие бактерии, как ризобии, не образуют естественных структур покоя, и обычно не могут выдержать быстрой сушки при температурах выше 30°С без гибели значительной части популяции инокулянта; иногда они продолжают погибать во время последующего хранения на воздухе.

Таким образом, из уровня техники не был выявлен способ получения готовых к севу инкрустированных семян бобовых культур со стабильным сроком хранения более 6 месяцев, которые содержат в составе биополимерных оболочек комплекс агрономически ценных микроорганизмов в достаточном количестве для эффективной инокуляции при посеве.

Задачей изобретения является создание стабильного биополимерного покрытия на поверхности семян бобовых культур с агрономически ценными микроорганизмами в титрах, обеспечивающих долговременное сохранение штаммов, достаточных для эффективной инокуляции (10⁴ КОЕ/семя) по истечению 9 месяцев хранения. Настоящее изобретение позволяет исключить у конечного потребителя необходимость применения жидких инокулянтов и других биопрепаратов при посеве семян, используя уже готовые к севу биологически инкрустированные семена.

Указанная задача решается за счет того, что разработан способ инкрустации семян при помощи биополимерных оболочек и микроорганизмов, обеспечивающий сохранность бактерий в титрах, достаточных для эффективной инокуляции при посеве на протяжении не менее 9 месяцев их хранения, заключающийся в закреплении и стабилизации чувствительных к высушиванию микроорганизмов на поверхности семян бобовых при помощи экзополи-сахаридов (ЭПС) и сахаров биологического происхождения и поливинилового спирта, а также в дополнительном покрытии антислипающим агентом.

При этом в изобретении в составе биополимерной оболочки на поверхности семян используют активные микробиологические компоненты. Так, в качестве инокулянта бобовых культур могут быть использованы агрономически ценные микроорганизмы - клубеньковые бактерии класса Bradyrhizobium japomcum, Rhizobium legummosarum bv, viciae или Mesorhizobium ciceri, а также ростостимулирующие и фунгицидные микроорганизмы класса Bacillus subtilis, Pseudomonas fluorescens или Azotobacter chroococcum, а также микроэлементы.

В качестве стабилизатора при высушивании клубеньковых бактерий Bradyrhizobium japonicum, Rhizobium legum inosarum bv. viciae или Mesorhizobium ciceri, могут быть использованы экзополисахариды (ЭПС) микробного происхождения, полученные от другого вида бактерий, например, вида Paenibacillus mucilaginosus.

Согласно изобретению способ инкрустации семян при помощи биополимерных оболочек и микроорганизмов заключается в закреплении и стабилизации чувствительных к высушиванию микроорганизмов на поверхности семян при помощи поливинилового спирта, Сахаров биологического происхождения и экзополисахаридов (ЭПС) микробного происхождения, а также в дополнительном покрытии антислипающим агентом, причем в качестве анти-слипающего агента могут быть использованы, например: цеолит, бентонит» активированный уголь, каолин, глауконит, тальк, диатомит, микрокремнезем,, вермикулит, волластонит, шунгит, декстрин» крахмал. Указанная обработка обеспечивает в нанесенной оболочке сохранность полезных бактерий в титрах, достаточных для эффективной их инокуляции на протяжении не менее 9 месяцев хранения семян.

Кроме того, следует отметить, что процесс сушки семян, обработанных заявленным способом, значительно короче по сравнению с прототипом, где используется сушка при температуре не более 30°С в течение 8-и суток.

То есть новизна изобретения заключается в одновременном включении в состав биополимерной оболочки семян одного или более активных микробиологических компонентов; инокулянта бобовых культур (клубеньковых бактерий класса Bradyrhizobium japonicum, Rhizobium legummosarum bv, viciae или Mesorhizobium ciceri), стабилизированных с помощью ЭПС, полученных от другого вида бактерий (класса Paenibacillus mucilaginosus).

В частных случаях, при необходимости, в состав оболочки могут быть добавлены ростостимулирующие и/или фунгицидные микроорганизмы класса Bacillus subtilis, Pseudomonas fluorescens, Azotobacter chroococcum, а также микроэлементы.

Заявленный способ инкрустации семян бобовых культур при помощи биополимерных оболочек и микроорганизмов включает в себя несколько этапов осуществления.

Сначала, на первом этапе осуществляют раздельное культивирование клубеньковых бактерий Bradyrhizobium japonicum, Rhizobium legummosarum bv. viciae или Mesorhizobium ciceri, на оптимальных для их роста и накопления биомассы средах до достижения титра не менее 10⁹ КОЕ/мл, а также осуществляют культивирование штамма-продуцента внеклеточных полисахаридов класса Paenibacillus mucilaginosus на среде и в условиях, оптимальных для накопления бактериальных экзополисахаридов (ЭПС) и достижения вяз- кости полученной культуры не менее 40,0 мПа⋅с.

Затем, на втором этапе осуществляют стабилизацию клубеньковых бактерий с помощью раствора трегалозы. Для этого в жидкую культуру бактерий Bradyrhizobium japonicum, Rhizobium leguminosarum bv. viciae или Mesorhizobium ciceri вносят 5-25% стерильного раствора трегалозы, полученную суспензию выдерживают в течение 1-3 ч при температуре 20-25°С, а затем охлаждают при +4°С в течение 1-6 ч.

Затем, на третьем этапе проводят стерилизацию культуры штамма-продуцента внеклеточных полисахаридов Paenibacillus mucilaginosus путем автоклавирования полученной на первом этапе культуры с бактериальными экзополисахаридами при 110-125°С в течение 15-25 мин до получения беззародышевой культуры, т.е. иноктивированной культуральной жидкости (ИКЖ), содержащей погибшие клетки микроорганизмов и растворенные ЭПС, а также продукты обмена веществ и остатки питательной среды.

Далее, на четвертом этапе готовят жидкий биополимерный стабилизатор, для чего в стерильный 0,85% раствор хлористого натрия добавляют не менее 60% инактивированной культуральной жидкости (ИКЖ) с продуктами метаболизма - ЭПС Paenibacillus mucilaginosus, компоненты перемешивают.

Далее, на пятом этапе получают готовую стабилизированную форму биологического инкрустатора (сокращенно - биоинкрустатора). Для этого суспензию стабилизированной культуры клубеньковых бактерий, полученную как указано на 2-м этапе, смешивают с биополимерным стабилизатором, полученным как указано на 4-м этапе, и 10% раствором поливинилового спирта (ЛВС) в соотношении 1:1:1 с допустимым отклонением ±10% и выдерживают в течение 1 ч при температуре 20-25°С.

После этого, на шестом этапе навески семян бобовых (например, соя, горох, нут) смешивают с 2-5% готового жидкого биологического инкрустатора (биоинкрустатора) к массе семян, после чего для создания плотной оболочки и придания товарного вида, обработанные семена покрывают (обволакивают) антислеживающим агентом в количестве 2-5% к массе семян в зависимости от их размера. При этом в качестве антислеживающего агента может быть использован, например, аморфный диоксид кремния, цеолит, бентонит, активированный уголь, каолин, глауконит, тальк, диатомит, микрокремнезем, вермикулит, волластонит, шунгит, декстрин, крахмал.

В заключении, на седьмом этапе осуществляют мягкую сушку биоинкрустированных семян при температуре 40-42°С в течение 120-180 мин и постоянном перемешивании до влажности 12-15%.

В частном случае выполнения способа инкрустации семян бобовых культур на четвертом этапе, при получении жидкого биополимерного стабилизатора в его состав могут быть дополнительно введены как по отдельности, так и в любом сочетании компоненты: раствор 20% панкреатического гидролизата казеина, водный 20% раствор арабинозы, водный 20% раствор маннита при следующем соотношении всех компонентов жидкого биополимерного стабилизатора:

- инактивированная культуральная жидкость Paenibacillus Mucilaginosus, содержащая ЭПС - не менее 60%

- водный раствор 20% панкреатического гидролизата казеина - 0,5-4,0%

- и/или водный 20% раствор арабинозы - 0,5-4,0%

- и/или водный 20% раствор маннита - 0,5- 4,0%

- стерильный 0,85% раствор хлористого натрия - до 100%.

В частном случае способа инкрустации семян бобовых культур при необходимости усиления его ростостимулирующего и/или фунгицидного эффекта, в состав биологического инкрустатора дополнительно вводят соответствующие микроорганизмы. Для этого в способе осуществляют следующее.

На первом этапе осуществляют раздельное культивирование соответственно ростостимулирующих и/или фунгицидных микроорганизмов Bacillus subtilis, Pseudomonas fluorescens, или Azotobacter chroococcum на среде оптимального состава до достижении титра не менее 10⁹ КОЕ/мл.

На пятом этапе, при получении биологического инкрустатора, вносят вы- ращенные на первом этапе бактерии Bacillus subtilis, Pseudomonas fluorescens, или Azotobacter chroococcum, для обеспечения их содержания в биологическом инкрустаторе в количестве 0,01-0,1%, после чего полученную смесь выдерживают в течение 1 ч при температуре 20-25°С.

В другом частном случае выполнения способа инкрустации семян бобовых культур, для усиления питания будущих растений, особенно при посеве на «бедных» почвах, на пятом этапе способа в жидкий биологический инкрустатор дополнительно вводят в любом сочетании указанные ниже микроэлементы в солевой или хелатной форме для обеспечения содержании ионов металла в биологическом инкрустаторе:

- железо (Fe) - 0,1-0,005%;

- магний (Mg)- 0,2-0,0001%

- цинк (Zn) - 0,04-0,00001%;

- бор (В) - 0,15-0,00001%;

- медь (Cu) - 0,001-0,000001%;

- марганец (Mn) - 0,15-0,00001%

- молибден (Мо) - 0,2-0,0001%

- кобальт (Со) - 0,05-0,000001%

В частности, в жидкий биологический инкрустатор могут быть добавлены: хелат цинка Zn(ЭДТА) - 0,028% и аммоний молибденовокислый (NH₄)₂MoO₄ - 0,16%

с допустимым отклонением ±10%.

Ниже приведены примеры осуществления заявляемого способа инкрустации семян бобовых культур при помощи биополимерных оболочек и микроорганизмов.

Пример 1.

В качестве агрономически полезного микроорганизма взяли штамм клубеньковых бактерий Bradyrhizobium japonicum ПКК, который выращивали, на жидкой среде следующего состава; глицерин - 10,0 г/л; глутамат натрия - 1,0 г/л; дрожжевой экстракт - 0,05 г/л; калий фосфорнокислый даузамещенный - 0,2 г/л; натрий хлористый - 0,2 г/л, магний сернокислый - 0,1 г/л

и культивировали в течение 5 суток при температуре 28°С при перемешивании в устройстве орбитального типа - качалке со скоростью 280 об/мин до достижения титра 10° КОЕ/мл (культура клубеньковых бактерий).

Затем в жидкую культуру Bradyrhizobium. japonicum ПКК для стабилизации ввели 5% стерильного раствора трегалозы; суспензию выдерживали в течение 1 ч при температуре 20°С, а затем охлаждали при 4°С в течение 1 ч.

В качестве штамма-продуцената ЭПС взяли штамм Paenibacillus mucilaginosus 17-2, который культивировали, в течение 5 суток на жидкой, среде следующего состава: сахароза - 15,0 г/л; калий фосфорнокислый - 0,1 г/л, магний сернокислый - 0,1 г/л; натрий хлористый - 0,1 г/л; калий сернокислый - 0,1 г/л, кальций углекислый - 2,0 г/л, до получения культуры (КЖ) с наработкой внеклеточных полисахаридов и достижения ее вязкости 42,0 мПа⋅c.

Полученную КЖ с живыми клетками Paenibacillus mucilaginosus 17-2 и наработанными бактериальными полисахаридами стерилизовали путем авто-клавирования при 110°С в течение 15 мин, в результате чего была получена беззародышевая культура, т.е. инактивированная культуральная жидкость (ИКЖ), содержащая погибшие клетки микроорганизмов и. растворенные ЭПС, а также продукты обмена веществ и остатки питательной среды.

Биополимерный стабилизатор получали, добавив в стерильный 0,85% раствор хлористого натрия 75% массы ИКЖ, компоненты перемешали.

Затем получали готовый жидкий биоинкрустатор, для чего в коническую колбу объемом 100 мл внесли 33 мл биополимерного стабилизатора (суспензию с ИКЖ. Paenibacillus mucilaginosus 17-2), смешивали с 33 мл стабилизированной культуры клубеньковых бактерий Bradyrhizobium japonicum ГОЖ, и 33 мл 10% раствора поливинилового спирта (ЛВС), т.е. смешали в соотношении 1:1:1, и смесь выдерживали 1 ч при температуре 20°С.

Навеску очищенных семян сои {Glycine max L, сорт. Алена, 1 репр.) массой 100 г вносили в стерильный полиэтиленовый пакет, туда же добавили 5 мл готового биологического инкрустатора. Пакет тщательно встряхивали несколько минут, добиваясь равномерного покрытия семян биологическим инкрустатором. Затем в пакет добавили 5 г антислеживающего агента - аморфного диоксида кремния; пакет тщательно встряхивали до образования у семян плотной оболочки.

Обработанные семена выкладывали на плоский лоток и сушили в сушильном шкафу при периодическом перемешивании при температуре 40°С в течение 120 мин до влажности 15%. После чего 0,1 кг биоинкрустированных семян сои поместили в бумажный пакет.

Пример 2,

В качестве агрономически полезного микроорганизма взяли штамм клубеньковых бактерий Rhizobium legummosarum bv. viciae Щ028Г, который выращивали на жидкой среде следующего состава; глицерин - 20,0 г/л; глутамат натрия - 3,0 г/л; дрожжевой экстракт - 0,1 г/л; калий фосфорнокислый двузамещенный - 0,4 г/л; натрий хлористый - 0,4 г/л, магний сернокислый - 0,2 г/л

и культивировали в течение 6 суток при температуре 32°С при перемешивании в устройстве орбитального типа - качалке со скоростью 280 об/мин до достижения титра 10¹⁰ КОЕ/мл.

Для стабилизации в жидкую культуру бактерий Rhizobium legummosarum bv. viciae Щ028Г ввели 25% стерильного раствора трегалозы. Полученную суспензию выдерживали в течение 3 ч при температуре 25°С, а затем охлаждали при 4°С в течение 6 ч,

В качестве штамма-продуцента ЭПС взяли штамм Paenibacillus mucilaginosus 17-2, который выращивали на жидкой среде следующего состава: сахароза - 25,0 г/л; калий фосфорнокислый - 0,5 г/л, магний сернокислый - 0,2 г/л; натрий хлористый - 0,2 г/л; калий сернокислый - 0,2 г/л, кальций углекислый - 5,0 г/л,

и культивировали 6 суток до получения культуры (КЖ) с наработкой внеклеточных полисахаридов и достижения ее вязкости 45,0 мПа⋅с,

Полученную КЖ с живыми клетками Paenibacillus mucilaginosus 17-2 и наработанными бактериальными полисахаридами стерилизовали путем авто-клавирования при 125°С в течение 25 мин, в результате чего была получена беззародышевая культура, т.е. инактивированная культуральная жидкость (ИКЖ), содержащая погибшие клетки микроорганизмов и растворенные ЭПС, а также продукты обмена веществ и остатки питательной среды.

Биополимерный стабилизатор получили, добавив в инактивированную культуральную жидкость (ИКЖ) с продуктами метаболизма Paenibacillus mucilaginosus 17-2 стерильный 0,85% раствор хлористого натрия в количестве, при котором масса ИКЖ составляет 60% общей массы, а также добавив следующие стабилизирующие добавки в количестве к массе ИКЖ;

- водный 20% раствор панкреатического гидролизата казеина - 4,0%;

- водный 20% раствор арабинозы - 4,0%;

- водный 20% раствор маннита - 4,0%.

Затем получили готовый жидкий биоинкрустатор, для чего в коническую колбу объемом 100 мл внесли 33 мл биополимерного стабилизатора (суспензию с ИКЖ Paenibacillus mucilaginosus 17-2) с добавками, смешали с 33 мл стабилизированной культуры бактерий Rhizobium legummosarum bv. viciae Щ028Г и 33 мл 10% раствора поливинилового спирта (ПВС), т.е. смешали в соотношении 1:1:1, и выдерживали 1 ч при температуре 25°С,

Навеску очищенных семян гороха (Pisum sativum L, сорт Самариус, I репр.) массой 100 г внесли в стерильный полиэтиленовый пакет, туда же добавили 2 мл готового биологического инкрустатора. Пакет тщательно встряхивали несколько минут, добиваясь равномерного покрытия семян биологическим инкрустатором. Затем в пакет добавили 2 г антислеживающего агента

- микрокремнезема; пакет тщательно встряхивали до образования у семян плотной оболочки.

Затем обработанные семена выкладывали на плоский лоток и сушили в сушильном шкафу при периодическом перемешивании при температуре 42°С в течение 180 мин до влажности 12%. После чего 0,1 кг биоинкрустированных семян гороха поместили в бумажный пакет.

Для определения эффективности сохранения титра жизнеспособных агрономически полезных штаммов микроорганизмов на биоинкрустированных. заявленным способом семенах были проведены лабораторные опыты.

Опыт 1.

Определяли эффективность биоинкрустированных заявленным способом семян сои штаммом бактерий Bradyrhizobium japonicum ПКК, по сравнению с другими инокулянтами в период их хранения до I мес.

В качестве агрономически полезного микроорганизма был взят штамм бактерий Bradyrhizobium japonicum ПКК, Биоинкрустатор получали как описано в примере 1,

1-й контрольный инокулянт получали следующим образом; 1 мл культуры Bradyrhizobium japonicum ПКК смешивали с 1 мл 10% водного раствора поливинилового спирта и 1 мл стерильного физиологического раствора.

2-й контрольный инокулянт (Прототип) получали таким образом; 1 мл культуры Bradyrhizobium japonicum ПКК смешивали с 1 мл 15% водного раствора сополимера поливинилпирролидон/винилацетат 60:40 (молекулярная масса 700000) и 1 мл стерильного физиологического раствора.

Обработанные указанными инокулянтами и биоинкрустратором группы семян сои (Glycine max L., сорт Алена, 1 репр.) в количестве по 50 г выкладывали на плоский лоток и сушили в сушильном шкафу при температуре 41°С в течение 160 мин и периодическом перемешивании до влажности 14%.

Высушенные семена сои хранили в вентилируемых лотках при 22°С в темноте на протяжении 1 мес.В процессе хранения периодически из каждой группы отбирали навески семян сои массой 5 г и определяли численность жизнеспособных бактерий на их поверхности следующим образом. Семена сои в количестве 10 шт. суспендировали в 10 мл физиологического раствора периодически встряхивая на шейкере в течение 10 мин.

Суспензию, полученную методом серийных разведений (Теппер В.З, Шилъникова В.К. Переверзева Г.И. Практикум по микробиологии: учеб. пособие для ВУЗ, М.: Дрофа, 2004, 256 с.), высевали на поверхность маннитио-дрожжевого агара (маннит - 10,0 г, дрожжевой экстракт - 2,0 г, калий фосфорнокислый двузамещенный -0,5; магний сернокислый - 0,2; натрий хлористый - 0,1, агар-агар - 18,0 г, вода - 1000 г). Подсчет выросших колоний после инкубирования ори температуре 28°С проведали на 5-е сутки, Результаты представлены в Таблице 1.

Из данных, приведенных в Таблице 1 видно, что инокулянт в виде композиция биоинкрустратора, полученного заявленным способом (поливиниловый спирт + биостабилизатор) значительно лучше способствует сохранению численности жизнеспособных клеток Bradyrhizobium japonicum ПКК на семенах сои в течение 1 мес.

Опыт 2.

Для определения влияния различных добавок на продолжительность сохранения титра жизнеспособных штаммов клубеньковых микроорганизмов в течение длительного срока хранения был проведен опыт на биоинкрустированных заявленным способом семенах сои с различными стабилизирующими добавками по определению титра Bradyrhizobium japonicum ПКК на семенах сои при их хранении на протяжении 12 месяцев.

При этом:

В качестве агрономически полезного микроорганизма был взят штамм клубеньковых бактерий Bradyrhizobium japonicum ПКК, а в качестве штамма-продуцента ЭПС - штамм Paenibacillm mucilaginosus 17-2, которые выращивали как описано в примере 1.

Для повышения стабильности бактерий Bradyrhizobium japonicum ПКК, в жидкую культуру вносили стерильный раствор трегалозы в концентрации 15%, выдерживали 3 ч при температуре 20°С, затем охлаждали при 4°С в течение 4 ч.

Биостабилизатор готовили в базовом варианте - как описано в примере 1, в других вариантах - с внесением как по отдельности, так и в сочетаниях следующих дополнительных стабилизирующих, компонентов: водный 20% раствор панкреатического гидролизата казеина - 2,0%, водные 20% растворы арабинозы и маннита - по 2,0%.

Для обозначения вариантов опыта использованы следующие обозначения: «ПВС» - поливиниловый спирт;

«ПВС+БС» -поливиниловый спирт + биостабилизатор, - т.е. Биоинкрустатор (с ТРЕ-трегалозой), полученный как описано в примере 1; ГК- гидролизат казеина; МАН- маннит; АР-арабиноза,

Для получения вариантов биоинкрустатора стабилизированную с трегалозой культуру клубеньковых бактерий Bradyrhizobium japonicum ПКК смешивали с указанными в таблице вариантами биополимерного стабилизатора и раствором 10% поливинилового спирта в соотношении 1:1:1, выдерживали 1 ч при 22°С,

Навески семян сои массой по 100 г вносили в стерильные полиэтиленовые пакеты, туда же добавляли по 3 мл вариантов готового биоинкрустатора. Пакеты встряхивали несколько минут, добиваясь равномерного покрытия семян биологическим инкрустатором.

Далее в каждый в пакет вносили по 3 г аморфного диоксида кремния. Пакеты встряхивали несколько минут, добиваясь равномерного покрытия семян антислеживающим агентом для создания плотной видимой оболочки.

Обработанные по разным вариантам семена сои выкладывали на плоский лоток и сушили в сушильном шкафу при температуре 42°С в течение 140 мин и периодическом перемешивании до влажности 12%.

Высушенные семена, обработанные по разным вариантам, хранили в вентилируемых лотках при 20°С в темноте на протяжении 12 мес.

В процессе хранения проводили отбор навесок семян по всем вариантам обработки массой по 5 г с интервалом 1 мес.Численность жизнеспособных бактерий на поверхности семян определяли следующим образом. Семена в каждом варианте обработки в количестве 10 шт суспендировали в 10 мл физиологического раствора периодически встряхивая на шейкере в течение 10 мин.

Суспензии, полученные во всех вариантах опыта, методом серийных разведений (Теппер В.З, Шильникова В.К., Переверзева Г.И. Практикум по микробиологии: учеб. пособие для ВУЗ, М.: Дрофа, 2004, 256 с. ), высевали на поверхность маннитно-дрожжевого агара (маниит - 10,0 г, дрожжевой экстракт - 2,0 г, калий фосфорнокислый двузамещенный - 0,5; магний сернокислый - 0,2; натрий хлористый - 0,1, агар-агар - 18,0 г, вода - 1000 г).

Подсчет выросших колоний после инкубирования при температуре 28°С проводили на 5-е сутки. Результаты представлены в Таблице 2.

Таким образом, из данных Таблицы 2, можно сделать вывод, что наиболее эффективная композиция, обеспечивающая сохранность тира клубеньковых бактерий не менее 10⁴ КОЕ/семя на протяжении 12 мес, включает сочетание ПВС, биостабилизатора на основе стабилизированной трегалозой культуры бактерий Bradyrhizobium japonicum ПКК, ЭПС Paenibacillus mucilaginosus 17-2 и добавок гидролизата казеина, маннита и арабинозы, то есть биоинкрустатора, полученного, заявленным способом с тремя добавками.

Опыт 3

Исследовали стабильность штамма бактерий Mesorhizobium ciceri ST282 на поверхности семян нута (Cicer arietinum L.) в течение 12 мес хранения.

Штамм бактерий Mesorhizobium ciceri ST282 выращивали на среде, описанной в Примере 2.

Для повышения стабильности в жидкую культуру бактерий Mesorhizobium ciceri ST282, внесли стерильный раствор трегалозы в концентрации 20% и выдерживали 3 ч при температуре 23°С, затем охлаждали 5 ч при 4°С.

Штамм-продуцент внеклеточных полисахаридов - Paenibacillus mucilaginosus 17-2 выращивали и культивировали как описано в примере 2.

Биостабилизатор готовили в базовом варианте - как описано в примере 2, в других вариантах - с внесением дополнительно стабилизирующих компонентов: водного 20% раствора панкреатического гидролизата казеина - 3,0%, водных 20% растворов арабинозы и маннита - по 3,0%.

Для получения готового биоинкрустатора стабилизированную трегалозой культуру бактерий Mesorhizobium ciceri ST282 смешивали с вариантами биополимерного стабилизатора и 10% водным раствором поливинилового спирта в соотношении 1:1:1 и выдерживали 1 ч при температуре 21°С.

Затем в жидкий биоинкрустатор добавили микроэлементы в хелатной и солевой форме: хелат цинка Zn(ЭДТА) - 0,028% и аммоний молибденово-кислый (NH₄)₂MoO₄ - 0,16%, смесь тщательно перемешали.

Навески семян нута (сорт Краснокутский, 1 репр.) массой по 100 г вносили в стерильные полиэтиленовые пакеты по вариантам, туда же добавляли по 2 мл готового биологического инкрустатора. Пакеты встряхивали несколько минут, добиваясь равномерного покрытия семян биоинкрустатором.

Далее в каждый пакет вносили по 4 г антислеживающего агента - аморфного диоксида кремния. Пакеты встряхивали до образования на семенах плотной видимой оболочки.

Варианты опыта: Контроль 1 - ПВС (поливиниовый спирт); Контроль 2 - (ПВС+БС) - (поливиниловый спирт + биостабилизатор) = Биоинкрустатор, как описано в примере 2.

Обработанные семена по всем вариантам опыта выкладывали на плоский лоток и сушили в сушильном шкафу при температуре 40°С в течение 180 мин и периодическом перемешивании до влажности 13%. Высушенные семена хранили в вентилируемых лотках при 20°С в темноте на протяжении 12 мес.

В процессе хранения проводили отбор навесок семян нута массой по 5 г с интервалом в 1 мес.

Численность жизнеспособных бактерий на поверхности семян определяли следующим образом. Семена в количестве 10 шт суспендировали в 10 мл физиологического раствора периодически встряхивая на шейкере в течение 10 мин. Полученную суспензию методом серийных разведений (Теппер В.З, Шильникова В.К. Переверзева Г.И. Практикум по микробиологии: учеб. пособие для ВУЗ, М.: Дрофа, 2004, 256 с.), высевали на поверхность маннитно-дрожжевого агара (маннит - 10,0 г, дрожжевой экстракт - 2,0 г, калий фосфорнокислый двузамещенный - 0,5; магний сернокислый - 0,2; натрий хлористый - 0,1, агар-агар - 18,0 г, вода - 1000 г).

Подсчет выросших колоний после инкубирования при 28°С проводили на 5 сутки. Результаты опыта приведены в Таблице 3.

Из данных в Таблице 3 следует, что наиболее эффективная композиция инокулята, обеспечивающая сохранность титра Mesorhizobium ciceri ST282 на семенах нута не менее 10⁴ КОЕ/семя в течение 12 мес, включает ПВС, стабилизированную треголазой культуру бактерий, биостабилизатор на основе ЭПС Paenibacillus mucilaginosus 17-2 (т.е. биоинкрустатор, полученный заявленным способом) с тремя стабилизирующими добавками: ГК, МАЛ, АР.

Опыт 4.

Исследовали совместное нанесение нескольких штаммов агрономически ценных бактерий и микроэлементов на поверхность семян сои и их жизнеспособность на различных сроках хранения.

Штамм бактерий Bradyrhizobium japonicum ПКК выращивали и стабилизировали, как описано в примере 1.

Для повышения стабильности Bradyrhizobium japonicum ПКК, в жидкую культуру вносили стерильный раствор трегалозы в концентрации 20% и выдерживали 3 ч при температуре 20°С, затем охлаждали при 4°С в течение 2 ч.

Штамм-продуцент ЭПС - Paenibacillus mucilaginosus 17-2 выращивали, как описано в примере 1.

Полученную КЖ с живыми клетками Paenibacillus mucilaginosus 17-2 и наработанными бактериальными полисахаридами стерилизовали путем авто-клавирования, как описано в примере 1.

Биостабилизатор готовили как описано в примере 1 с дополнительным внесением стабилизирующих компонентов: водный 20% раствор панкреатического гидролизата казеина в концентрации 2,0%; водные 20% растворы арабинозы и маннита в концентрации по 2,0%.

Ростостимулирующий и фунгицидный штамм бактерий Bacillus subtilis АМ7 выращивали на жидкой среде следующего состава:

изолят соевого белка - 3,0 г/л;

мука из картофельных хлопьев - 7,0 г/л;

калий сернокислый двузамещенный - 1,0 г/л;

магний сернокислый - 0,5 г/л;

кальций хлористый - 0,2 г/л;

натрий хлористый - 0,2 г/л;

марганец сернокислый - 0,02 г/л и культивировали в течение 85 ч при 32°С до получения титра спор не менее 10⁹ КОЕ/мл.

Для получения готового биоинкрустатора в базовом варианте культуру клубеньковых бактерий Bradyrhizobium japonicum ПКК смешивали с биополимерным стабилизатором и 10% раствором поливинилового спирта в соотношении 1:1:1, и выдерживали 1 ч при температуре 22°С.

В другом варианте опыта после смешивания стабилизированных трегалозой бактерий Bradyrhizobium japonicum ПКК с биополимерным стабилизатором и раствором поливинилового спирта, в полученную смесь вносили 0,1% жидкой культуры Bacillus subtilis АМ7 и выдерживали 1 ч при 22°С.

Навески семян сои массой по 100 г вносили в стерильные полиэтиленовые пакеты, туда же добавляли по 3 мл вариантов готового биоинкрустатора. Пакеты тщательно встряхивали несколько минут, добиваясь равномерного покрытия семян биологическим инкрустатором.

Далее в каждый в пакет вносили по 3 г аморфного диоксида кремния. Пакеты тщательно встряхивали несколько минут, добиваясь равномерного покрытия семян антислеживающим агентом для создания плотной оболочки.

Обработанные по разным вариантам семена сои выкладывали на плоский лоток и сушили в сушильном шкафу при температуре 42°С в течение 140 мин и периодическом перемешивании до влажности 12%.

Высушенные семена, обработанные по разным вариантам, хранили в вентилируемых лотках при 20°С в темноте на протяжении 12 мес. В процессе хранения проводили отбор навесок семян массой по 5 г с интервалом в 1 мес.

Численность жизнеспособных бактерий на семенах определяли следующим образом. Семена в количестве 10 шт суспендировали в 10 мл физиологического раствора периодически встряхивая на шейкере в течение 10 мин. Полученную суспензию методом серийных разведений (Теппер В.З, Шильникова В.К. Переверзева Г.И. Практикум по микробиологии: учеб. пособие для ВУЗ, М.: Дрофа, 2004, 256 с), высевали на поверхность маннитно-дрожжевого агара (маннит - 10 г, дрожжевой экстракт - 2 г, калий фосфорнокислый двузамещенный - 0,5; магний сернокислый - 0,2; натрий хлористый - 0,1, агар-агар - 18 г, вода -1000 г). Подсчет колоний после инкубирования - при 28°С на 5 сутки.

В качестве контроля приведены результаты Опыта 2 с использованием одной клубеньковой бактерией Bradyrhizobium japonicum ПКК и биоинкрустатором аналогичного состава. Результаты опыта приведены в Таблице 4.

Как видно из данных Таблицы 4, титр бактерий Bacillus subtilis АМ7 падает незначительно на протяжении 12 месяцев хранения с 9⋅10⁵ до 7⋅10⁵ КОЕ/семя при применении биологического стабилизатора. В то же время титр бактерий Bradyrhizobium japonicum ПКК падает гораздо значительнее до 10⁴ КОЕ/семя. Однако данная концентрация жизнеспособных клеток (КОЕ/мл) достаточна для формирования эффективного симбиоза клеток бактерий на семенах.

Опыт 5.

Был проведен полевой мелкоделяночный опыт, в котором исследовали влияние вариантов обработки семян сои на количество образуемых клубеньков и морфометрические показатели растений.

Обработанные и необработанные семена сои (сорт Алена, 1 репр.) после 9 месяцев хранения высевали в полевых условиях в делянки 1,5×10 м с расчетной нормой высева 120 кг/га. При этом исследовали следующие варианты: вариант 1 - контроль - без обработки семян; вариант 2 - обработка семян непосредственно перед посевом жидким биопрепаратом на основе штамма бактерий Bradyrhizobium japonicum ПКК с расчетным титром 10⁵ КОЕ на семя; вариант 3 - семена, биоинкрустированные заявленным способом со стабилизирующими добавками в виде растворов панкреатического гидролизата казеина, арабинозы и маннита, как описано в опыте 2; вариант 4 - семена, биоинкрустированные заявленным способом двумя бак териями совместно Bradyrhizobium japonicum ПКК и Bacillus subtilis АМ7 с использованием стабилизирующих добавок, как описано в опыте 4. Из семян сои, обработанных по указанным вариантам, выращивали растения сои до достижения фазы начала цветения.

Повторность опыта - трехкратная. С каждой повторности отбиралось по 30 растений. Учет опыта велся по следующим показателям: среднее количество клубеньков на 1 растение (СКК), средняя высота растения (СВР), среднее число продуктивных узлов (СЧПУ), среднее число цветков (СЧЦ). Результаты опыта приведены в Таблице 5.

Из анализа приведенных в Таблице 5 данных видно, что после 9 месяцев хранения из посеянных семян сои с биологической инкрустацией на основе штамма бактерий Bradyrhizobium japonicum ПКК в разных вариантах, а также семян, обработанных перед посевом жидким биопрепаратом на основе штамма такой же бактерии непосредственно перед посевом, вырастают растения сои с практически одинаковым количеством клубеньков и с очень близкими морфометрическими показателями.

В то же время дополнительное внесение в биоинкрустатор ростостимулирующего и фунгицидного штамма Bacillus subtilis АМ7 положительно сказывается на морфометрических показателях растений сои: увеличении средней высоты растений, увеличения числа продуктивных узлов и среднего числа цветков.

Таким образом, в результате проведенных опытов показано, что биоинкрустирование семян бобовых культур заявленным способом обеспечивает в нанесенной на семена оболочке сохранность в течение не менее 9 месяцев хранения полезных бактерий в титрах ≥10⁴ КОЕ/семя, достаточных для эффективной их инокуляции при посеве.

При этом заявленное изобретение позволяет получать готовые биологически инкрустированные семена, несущие как штаммы клубеньковых бактерий, так и дополнительные штаммы ростостимулирующих и/или фитопротекторных бактерий, а также необходимые микроэлементы, что является эффективным средством повышения продуктивности бобовых культур.

Кроме того, настоящее изобретение позволяет исключить у конечного потребителя необходимость применения жидких инокулянтов и других биопрепаратов при посеве семян, используя уже готовые к севу биологически инкрустированные семена даже после их хранения в течение 9 мес.

Изобретение относится к области биотехнологии и сельского хозяйства и заключается в предварительной инкрустации семян бобовых культур с помощью биополимерных оболочек на основе штаммов полезных микроорганизмов и полисахаридов биологического и микробного происхождения. Способ инкрустации семян бобовых культур на первом этапе включает раздельное культивирование штаммов клубеньковых бактерий Bradyrhizobium japonicum, Rhizobium leguminosarum bv. viciae или Mesorhizobium cicer и культивирование штамма-продуцента внеклеточных полисахаридов Paenibacillus mucilaginosus для накопления бактериальных экзополисахаридов (ЭПС); на втором этапе осуществляют стабилизацию клубеньковых бактерий с помощью раствора трегалозы, для чего в жидкую культуру Bradyrhizobium japonicum, Rhizobium leguminosarum bv. viciae или Mesorhizobium ciceri вносят стерильный раствора трегалозы, полученную суспензию выдерживают 1-3 ч при температуре 20-25°С, а затем охлаждают при 4°С; на третьем этапе проводят стерилизацию культуры штамма-продуцента внеклеточных полисахаридов класса Paenibacillus mucilaginosus путем автоклавирования; на четвертом этапе готовят жидкий биополимерный стабилизатор, для чего в стерильный 0,85% раствор хлористого натрия добавляют не менее 60% инактивированной культуральной жидкости Paenibacillus mucilaginosus и компоненты перемешивают; на пятом этапе получают стабилизированную форму биологического инкрустатора, для чего суспензию стабилизированной культуры клубеньковых бактерий, полученную на втором этапе, смешивают с биополимерным стабилизатором, полученным на четвертом этапе, и 10% раствором поливинилового спирта в соотношении 1:1:1, смесь выдерживают в течение 1 ч при температуре 20-25°С; на шестом этапе семена бобовых культур смешивают с готовым жидким биологическим инкрустатором в количестве 2-5% к массе семян, после чего обработанные семена покрывают антислеживающим агентом в количестве 2-5% к массе семян; на седьмом этапе осуществляют мягкую сушку инкрустированных семян при постоянном перемешивании при температуре 40-42°С в течение 120-180 мин до влажности 12-15%. Предлагаемый способ инкрустации семян бобовых культур обеспечивает в нанесенной на семена оболочке сохранность в течение не менее 9 месяцев хранения полезных бактерий в титрах >10⁴КОЕ/семя, достаточных для эффективной их инокуляции при посеве, что является эффективным средством повышения продуктивности бобовых культур, а также исключает необходимость применения жидких инокулянтов и других биопрепаратов при посеве семян бобовых культур. 4 з.п. ф-лы, 5 табл., 2 пр.

1. Способ инкрустации семян бобовых культур, характеризующийся тем, что включает следующие этапы:

на первом этапе осуществляют раздельное культивирование штаммов клубеньковых бактерий Bradyrhizobium japonicum, Rhizobium leguminosarum bv. viciae или Mesorhizobium cicer до достижения титра не менее 10⁹ КОЕ/мл и культивирование штамма-продуцента внеклеточных полисахаридов Paenibacillus mucilaginosus для накопления бактериальных экзополисахаридов (ЭПС) и достижения вязкости полученной культуры не менее 40,0 мПа⋅с;

на втором этапе осуществляют стабилизацию клубеньковых бактерий с помощью раствора трегалозы, для чего в жидкую культуру Bradyrhizobium japonicum, Rhizobium leguminosarum bv. viciae или Mesorhizobium ciceri вносят 5-25% стерильного раствора трегалозы, полученную суспензию выдерживают 1-3 ч при температуре 20-25°С, а затем охлаждают при 4°С в течение 1-6 ч;

на третьем этапе проводят стерилизацию культуры штамма-продуцента внеклеточных полисахаридов класса Paenibacillus mucilaginosus путем автоклавирования при температуре 110-125°С в течение 15-25 мин до получения инактивированной культуральной жидкости, содержащей растворенные ЭПС;

на четвертом этапе готовят жидкий биополимерный стабилизатор, для чего в стерильный 0,85% раствор хлористого натрия добавляют не менее 60% инактивированной культуральной жидкости Paenibacillus mucilaginosus и компоненты перемешивают;

на пятом этапе получают стабилизированную форму биологического инкрустатора, для чего суспензию стабилизированной культуры клубеньковых бактерий, полученную на втором этапе, смешивают с биополимерным стабилизатором, полученным на четвертом этапе, и 10% раствором поливинилового спирта в соотношении 1:1:1 с допустимым отклонением ±10%, смесь выдерживают в течение 1 ч при температуре 20-25°С;

на шестом этапе семена бобовых культур смешивают с готовым жидким биологическим инкрустатором в количестве 2-5% к массе семян, после чего обработанные семена покрывают антислеживающим агентом в количестве 2-5% к массе семян;

на седьмом этапе осуществляют мягкую сушку инкрустированных семян при постоянном перемешивании при температуре 40-42°С в течение 120-180 мин до влажности 12-15%.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что при получении жидкого биополимерного стабилизатора, на четвертом этапе способа, в его состав включают дополнительные компоненты, используемые как по отдельности, так и в любом сочетании: водный 20% раствор панкреатического гидролизата казеина, водный 20% раствор маннита, водный 20% раствор арабинозы, при следующем соотношении всех компонентов жидкого биополимерного стабилизатора:

инактивированная культуральная жидкость Paenibacillus Mucilaginosus, содержащая ЭПС не менее 60% водный раствор 20% панкреатического гидролизата казеина 0,5-4,0% и/или водный 20% раствор арабинозы 0,5-4,0% и/или водный 20% раствор маннита 0,5-4,0% стерильный 0,85% раствор хлористого натрия до 100%

3. Способ по пп. 1, 2, отличающийся тем, что биологическую инкрустацию семян осуществляют с дополнительным использованием ростостимулирующих и/или фунгицидных микроорганизмов, для чего:

на первом этапе способа дополнительно осуществляют раздельное культивирование бактерий Bacillus subtilis, Pseudomonas fluorescens, Azotobacter chroococcum до достижения титра не менее 10⁹ КОЕ/мл;

на пятом этапе, при получении биологического инкрустатора, вносят выращенные на первом этапе бактерии Bacillus subtilis, Pseudomonas fluorescens, или Azotobacter chroococcum, для обеспечения их содержания в биологическом инкрустаторе 0,01-0,1%, после чего полученную смесь выдерживают в течение 1 ч при температуре 20-25°С.

4. Способ по любому из пп. 1-3, отличающийся тем, что на пятом этапе способа в жидкий биологический инкрустатор дополнительно добавляют в любом сочетании указанные ниже микроэлементы в солевой или хелатной форме для обеспечения содержания ионов металла в биологическом инкрустаторе:

железо (Fe) 0,1-0,005% магний (Mg) 0,2-0,0001% цинк (Zn) 0,04-0,00001% бор (В) 0,15-0,00001% медь (Cu) 0,001-0,000001% марганец (Mn) 0,15-0,00001% молибден (Мо) 0,2-0,0001% кобальт (Со) 0,05-0,000001%

5. Способ по п. 4, отличающийся тем, что на пятом этапе в жидкий биологический инкрустатор в качестве микроэлементов добавляют хелат цинка Zn(ЭДТА) - 0,028% и аммоний молибденовокислый (NH₄)₂MoO₄ - 0,16% с допустимым отклонением ±10%.