СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КЛУБЕНЬКОВЫХ БАКТЕРИЙ СОИ Bradyrhizobium japonicum RZ300 Российский патент 2023 года по МПК C05F11/00 

Заявленное изобретение относится к области биотехнологии и сельского хозяйства, в частности относится к способу получения микробиологических препаратов путем культивирования осмотически устойчивого штамма клубеньковых бактерий сои с добавлением в культуру углеводных осмопротекторов и полимерных пленкообразователей для дополнительного повышения устойчивости клеток к высыханию и получения ризобиального инокулянта под сою, эффективного при заблаговременной обработке семян.

Инокуляция ризобиями способствует развитию сельскохозяйственного производства за счет улучшения роста растений, доступности и усвоения питательных веществ, а также урожайности за счет усиления биофиксации атмосферного азота и солюбилизации питательных веществ почвы. Кроме того, ризобиальные инокулянты обеспечивают биоконтроль болезней растений, обеспечивая устойчивость к вызывающим болезнь патогенам или подавляя болезни.

В связи с чем появилась необходимость в получении микробиологического препарата для обработки семян сои, бактерии которого будут иметь большую жизнеспособность после их внесения на семенной материал.

Из уровня техники известна группа изобретений, которая относится к штаммам Bradyrhizobium japonicum для улучшения роста растения и композиции на основе данных штаммов и семени, покрытому указанной композицией. Для улучшения роста растений предложены штамм Bradyrhizobium japonicum NRRL В-50608, Bradyrhizobium japonicum NRRL В-50609, Bradyrhizobium japonicum NRRL В-50610, Bradyrhizobium japonicum NRRL В-50611, Bradyrhizobium japonicum NRRL В-50612 (RU 2588483 C2, опубл. 27.06.2016).

Из документа RU 2428467 C2, опубл. 10.09.2021 известен способ получения препарата частично обезвоженного жидкого инокулянта бактерий включает, который включает получение жидкого инокулянта бактерий, выращенных по существу до стационарной фазы, где бактерии представляют собой бактерии одного или нескольких родов из Rhizobium, Bradyrhizobium, Pseudomonas и Serratia; и добавление в количестве, достаточном для частичного обезвоживания жидкого инокулянта бактерий, обезвоживающей добавки, включающей десикант, к жидкому инокулянту бактерий для получения препарата частично обезвоженного жидкого инокулянта бактерий, где десикант представляет собой одно или несколько соединений, выбранных из трегалозы, сахарозы, глицерина, триэтиленгликоля и маннита, в количестве от примерно 5% до примерно 50% (мас./об.) препарата частично обезвоженного жидкого инокулянта бактерий. Последующее нанесение полученного препарата, частично обезвоженного инокулянта бактерий на сухой носитель, позволит получить сухой сыпучий препарат инокулянта бактерий.

В качестве аналога выбран способ инкрустации семян бобовых культур, который на первом этапе включает раздельное культивирование штаммов клубеньковых бактерий Bradyrhizobium japonicum, Rhizobium leguminosarum bv. viciae или Mesorhizobium cicer и культивирование штамма-продуцента внеклеточных полисахаридов Paenibacillus mucilaginosus для накопления бактериальных экзополисахаридов (ЭПС); на втором этапе осуществляют стабилизацию клубеньковых бактерий с помощью раствора трегалозы, поливинилпирролидона и др, для чего в жидкую культуру Bradyrhizobium japonicum, Rhizobium leguminosarum bv. viciae или Mesorhizobium ciceri вносят стерильный раствор, например, трегалозы, полученную суспензию выдерживают 1-3 ч при температуре 20-25°С, а затем охлаждают при 4°С; на третьем этапе проводят стерилизацию культуры штамма-продуцента внеклеточных полисахаридов класса Paenibacillus mucilaginosus путем автоклавирования; на четвертом этапе готовят жидкий биополимерный стабилизатор, для чего в стерильный 0,85% раствор хлористого натрия добавляют не менее 60% инактивированной культуральной жидкости Paenibacillus mucilaginosus и компоненты перемешивают; на пятом этапе получают стабилизированную форму биологического инкрустатора, для чего суспензию стабилизированной культуры клубеньковых бактерий, полученную на втором этапе, смешивают с биополимерным стабилизатором, полученным на четвертом этапе, и 10% раствором поливинилового спирта в соотношении 1:1:1, смесь выдерживают в течение 1 ч при температуре 20-25°С; на шестом этапе семена бобовых культур смешивают с готовым жидким биологическим инкрустатором в количестве 2-5% к массе семян, после чего обработанные семена покрывают антислеживающим агентом в количестве 2-5% к массе семян; на седьмом этапе осуществляют мягкую сушку инкрустированных семян при постоянном перемешивании при температуре 40-42°С в течение 120-180 мин до влажности 12-15% (RU 2784970 С1, 01.12.2022).

Недостатком аналога RU 2784970 является сложный и многоступенчатый процесс приготовления стабилизирующих компонентов, который состоит из 5 этапов, каждый из которых требует большого количества специализированных ёмкостей и временных затрат. Данный способ не может быть использован в современном биотехнологическом производстве из-за сложности его реализации. Кроме того, в производственных условиях обрабатывать семена данным составом, затем покрывать их антислёживателем, а затем сушить - невыполнимая задача, особенно когда речь идёт о десятках или сотнях тонн семенного материала.

Технический результат заявленного способа заключается в высокой эффективности клубенькообразования с последующей их азотфиксирующей активностью, обеспеченных за счет симбиотической активности жизнеспособных бактерий, нанесенных в составе инокулянта на семена заблаговременно за несколько суток до посева.

Технический результат заявленного способа достигается за счет использования осмотически устойчивого штамма Bradyrhizobium japonicum RZ300 и добавления углеводного осмопротектора на основе трегалозы и полимерного пленкообразователя на основе поливинилпирролидона в стационарную фазу роста бактерий при приготовлении препаративных форм, что позволяет дополнительно повысить осмоустойчивость бактерий на поверхности инокулированного семенного материала.

Технический результат заявленного способа реализуется путем культивирования осмотически устойчивого штамма клубеньковых бактерий сои Bradyrhizobium japonicum RZ300 для получения жидкого ризобиального инокулянта под сою, включающий последовательные этапы: стерилизацию жидкой питательной среды следующего состава: маннит - 10,0 г/л; дрожжевой экстракт - 0,5 г/л; глутамат натрия - 0,1 г/л; калий фосфорнокислый двузамещенный - 0,4 г/л; натрий хлористый - 0,2 г/л; магний сернокислый - 0,1 г/л; вода, асептическое внесение посевной культуры клубеньковых штамма Bradyrhizobium japonicum RZ300 в количестве 2% от объёма стерилизованной жидкой питательной среды, глубинное культивирование целевого микроорганизма в течение 7 сут. при температуре 28-30°С, механическом перемешивании со скоростью 100-150 об/мин, интенсивности аэрации от 0,7 до 1 литра воздуха/литр жидкой питательной среды в минуту, с асептическим внесением в культуру на 7 сут. выращивания стерилизованных растворов осмопротектора трегалозы в количестве 5-15% от объема культуры и полимерного пленкообразователя поливинилпирролидона в количестве 5-10% от объема культуры.

Растворы осмопротектора трегалозы и пленкообразователя поливинилпирролидона стерилизуют острым паром при температуре 121°С в течение 40 минут или обеззараживают УФ-излучением в дозе не менее 30 мДж/см²

Углеводный осмопротектор и полимерный пленкообразователь на 7 сут. выращивания вводят в культуру дробно двукратно в равных долях с интервалом 8 ч между внесениями в общем количестве 5-15% от объема культуры осмопротектора трегалозы и 5-10% от объема культуры полимерного пленкообразователя поливинилпирролидона.

Добавление углеводного осмопротектора трегалозы и полимерного пленкообразователя на основе поливинилпирролидона в стационарную фазу роста бактерий при приготовлении препаративных форм клубеньковых бактерий позволяет повысить осмоустойчивость бактерий на поверхности семенного материала при инокуляции.

Питательная среда для выращивания штамма Bradyrhizobium japonicum RZ300 готовится посредством растворения компонентов (маннит - 10,0 г/л; дрожжевой экстракт - 0,5 г/л; глутамат натрия - 0,1 г/л; калий фосфорнокислый двузамещенный - 0,4 г/л; натрий хлористый - 0,2 г/л, магний сернокислый - 0,1 г/л,) в воде с последующей стерилизацией раствора острым паром при 121°С в течение 40 минут.

Затем в данную питательную среду асептически производится посев клубеньковых бактерий штамма Bradyrhizobium japonicum RZ300 посредством внесения инокулюма клеток с титром 1-3*10⁹ КОЕ/мл в количестве 2% от объёма питательной среды.

Культивируют клубеньковые бактерии штамма Bradyrhizobium japonicum RZ300 с определёнными режимами аэрации и температуры. Культивирование клеток осуществляется при температуре 28-30°С, механическом перемешивании со скоростью 100-150 об/мин, интенсивности аэрации от 0,7 до 1 литра воздуха/литр жидкой питательной среды в минуту в течение 7 сут.

На конечных стадиях культивирования, т.е. на 7 сут., когда бактерии выходят в стационарную фазу роста - асептически добавляется стерильный раствор углеводного осмопротектора трегалозы и полимерного пленкообразователя поливинилпирролидона для дополнительного повышения устойчивости клубеньковых бактерий Bradyrhizobium japonicum RZ300 к высыханию.

Из полученной культуральной жидкости готовят препаративную форму, путём ее асептического розлива по канистрам.

Пример 1: в качестве агрономически полезного микроорганизма взяли штамм клубеньковых бактерий Bradyrhizobium japonicum RZ300, который выращивали, на простерилизованной при 121°С в течение 40 минут, манитно-дрожжевой среде следующего состава: маннит - 10,0 г/л; дрожжевой экстракт - 0,5 г/л; глутамат натрия - 0,1 г/л; калий фосфорнокислый двузамещенный - 0,4 г/л; натрий хлористый - 0,2 г/л; магний сернокислый - 0,1 г/л. Затем в данную питательную среду производится асептическое внесение бактериального посевного материала в количестве 2% от объёма питательной среды. Культивирование целевого микроорганизма производят глубинным способом в периодическом режиме в течение 7 сут. при перемешивании со скоростью 100-150 об/мин, интенсивности аэрации от 0,7 до 1 литра воздуха/литр питательной среды в минуту и температуре 28-30°С. В момент достижения клетками стационарной фазы роста в культуру аспептически вводится предварительно простерилизованный при 121°С в течение 40 минут 25% р-р трегалозы из расчета получения 5-15% ее концентрации в препарате. Дополнительно в препарат асептически вводится предварительно простерилизованный при 121°С в течение 40 минут 50% р-р поливинилпирролидона из расчета получения 10-20% его концентрации в препарате.

Пример 2: в качестве агрономически полезного микроорганизма взяли штамм клубеньковых бактерий Bradyrhizobium japonicum RZ300, который выращивали, на простерилизованной при 121°С в течение 40 минут, манитно-дрожжевой среде следующего состава: маннит - 10,0 г/л; дрожжевой экстракт - 0,5 г/л; глутамат натрия - 0,1 г/л; калий фосфорнокислый двузамещенный - 0,4 г/л; натрий хлористый - 0,2 г/л, магний сернокислый - 0,1 г/л. Затем в данную питательную среду производится асептическое внесение бактериального посевного материала в количестве 2% от объёма питательной среды. Культивирование целевого микроорганизма производят глубинным способом в периодическом режиме в течение 7 сут. при перемешивании со скоростью 100-150 об/мин, интенсивности аэрации от 0,7 до 1 литра воздуха/литр питательной среды в минуту и температуре 28-30°С. В момент достижения клетками стационарной фазы роста в культуру аспептически дробно двукратно в равных долях с интервалом в 8 ч вводится предварительно обеззараженный УФ-излучением в дозе не менее 30 мДж/см² 25% р-р трегалозы из расчета получения 5-15% ее конечной концентрации в препарате. Дополнительно в препарат асептически вводится предварительно обеззараженный УФ-излучением в дозе не менее 30 мДж/см² 50% р-р поливинилпирролидона из расчета получения 10-20% его конечной концентрации в препарате.

Преимущество предложенного способа достигается за счёт использования осмотически устойчивого штамма, питательной среды специального состава и определенных технологических параметрах процесса культивирования, добавления в культуру осмопротектора трегалозы и полимерного пленкообразователя поливинилпирролидона, что обеспечивает повышенную устойчивость бактериальных клеток к высыханию на семенах и позволяет эффективно заблаговременно инокулировать семенной материал.

Было показано, что бактерии осмотически устойчивого штамма Bradyrhizobium japonicum RZ300 в составе препарата, произведенного по предложенному способу, имеют большую жизнеспособность после их нанесения на семенной материал. Так, при нанесении инокулянта на основе штамма Bradyrhizobium japonicum RZ300 жизнеспособность клубеньковых бактерий на поверхности семенного материла через 1 сутки составляет 495 тыс. КОЕ на 1 семени, в отличие от 15 тыс. КОЕ при обработке инокулянтами на основе стандартных производственных штаммов (при равной биологической нагрузке в момент обработки семян). На 2 и 3 сутки численность стандартных штаммов практически равно 0, в то время как штамм Bradyrhizobium japonicum RZ300 сохраняется в количестве 250-300 тыс. КОЕ на 1 семени, чего вполне достаточно для эффективной инокуляции.

Работа поддержана грантом Министерства науки и высшего образования Российской Федерации (соглашение № 075-15-2022-320 от 20 апреля 2022 г.) на создание и развитие Научного центра мирового уровня «Агротехнологии будущего».

Заявленное изобретение относится к области биотехнологии, в частности относится к способу получения микробиологических препаратов путем культивирования осмотически устойчивого штамма клубеньковых бактерий сои с добавлением в культуру углеводных осмопротекторов и полимерных пленкообразователей для дополнительного повышения устойчивости клеток к высыханию и получения ризобиального инокулянта под сою, эффективного при заблаговременной обработке семян. Cпособ реализуется путем культивирования осмотически устойчивого штамма клубеньковых бактерий сои Bradyrhizobium japonicum RZ300 для получения жидкого ризобиального инокулянта под сою, включающий последовательные этапы: стерилизацию жидкой питательной среды следующего состава: маннит - 10,0 г/л; дрожжевой экстракт - 0,5 г/л; глутамат натрия - 0,1 г/л; калий фосфорнокислый двузамещенный - 0,4 г/л; натрий хлористый - 0,2 г/л; магний сернокислый - 0,1 г/л, вода, асептическое внесение посевной культуры клубеньковых штамма Bradyrhizobium japonicum RZ300 в количестве 2% от объёма стерилизованной жидкой питательной среды, глубинное культивирование целевого микроорганизма в течение 7 суток при температуре 28-30°С, механическом перемешивании со скоростью 100-150 об/мин, интенсивности аэрации от 0,7 до 1 литра воздуха/литр жидкой питательной среды в минуту, с асептическим внесением в культуру на 7 сутки выращивания стерилизованных растворов осмопротектора трегалозы в количестве 5-15% от объема культуры и полимерного пленкообразователя поливинилпирролидона в количестве 5-10% от объема культуры. Cпособ позволяет получить высокую эффективность клубенькообразования с последующей их азотфиксирующей активностью, обеспеченные за счет симбиотической активности жизнеспособных бактерий, нанесенных в составе инокулянта на семена заблаговременно за несколько суток до посева. 2 з.п. ф-лы.

1. Способ культивирования осмотически устойчивого штамма клубеньковых бактерий сои Bradyrhizobium japonicum RZ300 для получения эффективного при заблаговременной обработке семян жидкого ризобиального инокулянта под сою, включающий последовательные этапы: стерилизацию жидкой питательной среды следующего состава: маннит - 10,0 г/л; дрожжевой экстракт - 0,5 г/л; глутамат натрия - 0,1 г/л; калий фосфорнокислый двузамещенный - 0,4 г/л; натрий хлористый - 0,2 г/л; магний сернокислый - 0,1 г/л; вода; асептическое внесение посевной культуры клубеньковых штамма Bradyrhizobium japonicum RZ300 в количестве 2% от объёма стерилизованной жидкой питательной среды; глубинное культивирование целевого микроорганизма в течение 7 суток при температуре 28-30°С, механическом перемешивании со скоростью 100-150 об/мин, интенсивности аэрации от 0,7 до 1 литра воздуха/литр жидкой питательной среды в минуту; с асептическим внесением в культуру на 7 сутки выращивания стерилизованных осмопротектора трегалозы в количестве 5-15% от объема культуры и полимерного пленкообразователя поливинилпирролидона в количестве 5-10% от объема культуры.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что растворы осмопротектора трегалозы и пленкообразователя поливинилпирролидона стерилизуют острым паром при температуре 121°С в течение 40 минут или обеззараживают УФ-излучением в дозе не менее 30 мДж/см².

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что углеводный осмопротектор и полимерный пленкообразователь на 7 сутки выращивания вводят в культуру дробно двукратно в равных долях с интервалом 8 ч между внесениями суммарно в количестве 5-15% от объема культуры осмопротектора трегалозы и 5-10% от объема культуры полимерного пленкообразователя поливинилпирролидона.