ШТАММ КЛУБЕНЬКОВЫХ БАКТЕРИЙ MESORHIZOBIUM RCAM02723 - СТИМУЛЯТОР УРОЖАЙНОСТИ НУТА И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИНОКУЛЯТА ДЛЯ НУТА Российский патент 2020 года по МПК C12N1/20 A01N63/00 

Изобретение относится к сельскому хозяйству, а именно к технологии активации семян нута перед посевом с помощью бактериальных удобрений.

В настоящее время в мире растет производство бобовых культур, которые имеют неоценимое значение в структуре посевных площадей, в азотном балансе почвы и белковом ресурсе для питания человека и кормления животных. Эти культуры способны синтезировать и накапливать в семенах и зеленой массе большое количество высококачественного белка, а также в симбиозе с клубеньковыми бактериями усваивать молекулярный азот - неисчерпаемый источник питания для растений и для обогащения почвы. Одной из самых перспективных и наиболее ценных бобовых культур является нут бараний или турецкий горох, который сочетает питательную ценность и вкусовые свойства (семена нута содержат белки и витамин Е) с устойчивостью к засухе, что позволяет успешно выращивать его в засушливых районах для обогащения почвы биологическим азотом (последующая культура севооборота получает до 50-100 кг/га биологического азота). Важность выращивания нута делает актуальным проведение исследований направленных на повышение его урожайности, одним из которых является инокуляция семян нута перед посевом (RU 2661815, 2018).

В ходе проведенных исследований было установлено, что нут хорошо отзывается на такие агроприемы, как инокуляция семян ризоторфином, предпосевная обработка семян и обработка растений по вегетации микроэлементными удобрениями и стимулятором роста (Балашов В.В., Балашов А.В., Кудинов В.В., / Плодородие. 2016. Т. 93. №6. С. 14-15; Васильченко С.А., Метлина Г.В. / Зерновое хозяйство России. Т. 51. №3 2017. С. 59-63.).

Выпускаемые в России инокулянты содержат штаммы клубеньковых бактерий, которые в симбиозе с бобовыми растениями способны ассимилировать атмосферный азот, обеспечивая повышенный рост и урожайность растений, а также обогащать почвы азотом, способствуя повышению урожайности последующих культур (https://ekosspb.ru/catalog/microbiologicheskie-preparaty/rizotorfm; http://fialka.tomsk/forum/viewtopic.php?t=35148).

Особенностью ризоторфина, в частности, его жидкой формы является использование основе селекционных штаммов бактерий конкретной высеваемой культуры (Рекомендации по возделыванию многолетних трав на семена. ВРАСХН, ВНИИ кормов, М. 1998, С. 6). Применение высокоэффективных в симбиозе с современными сортами бобовых культур штаммов ризобий повышает продуктивность растений на 20-30% и увеличивает содержание белка в семенах на 2-6% даже при наличии в почве популяции аборигенных или ранее интродуцированных клубеньковых бактерий. В случае нута для этих целей используют штаммы Mesorhizobium ciceri.

Mesorhizobium ciceri является грамотрицательными азотфиксирующими подвижными бактериями из рода Mesorhizobium. Бактерия была выделена из клубеньков нута Cicer arietinum в Испании, а затем Rhizobium cicero был переведен в Mesorhizobium ciceri. (Джарвис, BDW; Van Berkum, Р.et all «Перенос Rhizobium loti, Rhizobium huakuii, Rhizobium ciceri, Rhizobium mediter-raneum и Rhizobium tianshanense в mesorhizobium gen. Nov». Международный журнал систематической бактериологии. 47 (3): 895.doi: 10.1099 / 00207713-47-3-895).

В настоящее время известен штамм LMS-1, увеличивающий устойчивость растения нута к неблагоприятным почвенным условиям, который является ближайшим аналогом к заявляемому штамму. (Наскименто, FX; Бригидо, С и др. «Mesorhizobium ciceri LMS-1, экспрессирующая экзогенную 1-аминоцикло-пропан-1-карбоксилат (АСС) деаминазу, увеличивает свои модуляционные способности и устойчивость растения нута к ограничениям почвы». Письма в прикладной микробиологии. 55 (1): 15-21. doi: 10.1111 / j.1472-765Х.2012.03251.Х. PMID 22486441.)

Недостатком штамма является нестабильность его свойств при хранении и недостаточная эффективность.

Для получения Ризоторфина для бобовых культур предлагается способ производства торфяного инокулянта на основе гамма-стерильного торфа (SU 922104, 1982). По данному способу жидкие культуры клубеньковых бактерий готовят глубинным способом на колбах и пятилитровых бутылях на качалке, а также в 100 литровых ферментерах на среде следующего состава, %: кукурузный экстракт 0,7-1,0; пекарские дрожжи 0,05-0,1; (NH4)2SO4 - 0,1; KH2PO4 - 0,025; K2HPO4*3Н2O - 0,025; MgO4*7H2O - 0,02; глюкоза - 0,5-1,0; меласса - 1,0; СаCl2*6Н2O - 0,01-0,02.

Торф влажностью 20-25% размалывают, добавляют 3-10% технического мела, 3-25% технического активированного угля. Затем смесь увлажняют до 35-40%, расфасовывают в полиэтиленовые пакеты по 0,35-0,80 кг, при заполнении на 40-80% объема. Пакеты запаивают и стерилизуют гамма-излучением при дозе 2,6 Мрад на промышленной гамма-установке. Стерильный торф в асептических условиях (в боксе) инокулируют введением жидкой культуры, содержащей источники углеводов или защитных веществ, инъекцией непосредственно в пакет. Жидкую культуру вносят из расчета первоначального содержания клубеньковых бактерий 0,5-1,0 млрд./г. Прокол заклеивается клейкой лентой, содержимое пакетов механически перемешивается в специальных смесителях в течение 3-10 мин. Использование данного способа позволяет получить препарат клубеньковых бактерий с титром 1,0-2,5 млрд./г

Недостатками данного способа является неоптимальный периодический режим культивирования клубеньковых бактерий, требующих длительного периода ферментации и нетехнологичная форма сыпучая препарата, не позволяющая осуществлять инокуляцию семян путем опрыскивания через форсунки, ввиду их забивания нерастворимыми частичками торфа.

Наиболее близким к заявляемому способу является технология получения жидкого Ризоторфина Б при котором маточную культуру готовят в пробирках со скошенным агаром при 28-30°С в течении от 4 до 10 суток, культуру переносят в качалочные колбы или 5-ти литровые бутыли с использованием питательной среды на основе отваров бобовых культур, обогащенных сахарами (глюкозой, смесью сахарозы с глюкозой) или маннитом. Пробирки засевают соответствующим штаммом и выдерживают. При этом в колбу на 750 мл наливают 200 мл среды, а в 5-ти литровую бутыль - 2 литра. Бактериями с одного косяка засевают одну колбу. Бутыль засевается 3-5% жидкой культуры, полученной в колбе. Выращивают 48-96 часов после чего полученную культуру охлаждают до 10-15°С и используют для инокуляции Препарат хранят при температуре 5-6°С и влажности воздуха 40-55%. (https://stodopedia.su/8_49299_tema-poluchenie-biologicheskih-udobreniy.htmlБ).

Недостатками способа являлось длительность процесса, недостаточный выход целевого продукта и его недостаточная стабильность при хранении. Ввиду ярко-выраженной сезонности производства препаратов инокулянтов (пик спроса на инокулянты приходится на зимо-весенний период при невозможности многолетнего хранения произведенных инокулянтов), такая низкая производительность процесса периодического культивирования медленнорастущих ризобий представляется явно неудовлетворительной.

Задачей решаемой авторами в отношении штамма являлось создание штамма и технологии его культивирования с целью получения жидкого инокулянта, характеризующегося большей эффективностью и стабильностью, а также повышения технологичности процесса.

Технической задачей заявляемого изобретения в отношении штамма являлась создание более эффективного штамма Mesorhizobium ciceri.

Технической задачей заявляемого изобретения в отношении штамма являлась создание более эффективного штамма Mesorhizobium ciceri.

Технический результат достигается созданием штамма Mesorhizobium ciceri шт. 2013_KZ, депонированного 15.11.2019 в коллекции ФГБНУ ВНИИСХМ под номером №RCAM02723

Штамм обладает следующими свойствами:

Название рода, вида, подвида микроорганизма: Mesorhizobium ciceri

Номер штамма, присвоенный депозитором: 2013_KZ

Источник выделения штамма: Казахстан, г. Уральск, из клубеньков нута сорт «Краснокутский», выращенного на темно-каштановой почве

Методы идентификации штамма, ссылка на использованные определители.

Определитель бактерий Берджи", т. 1, "Мир"., 1997. Девятое издание.

Основание для депонирования Штамм 2013_KZ дал высокую прибавку семян и зеленой массы нута в неблагоприятных погодных условиях. Прибавки урожая составила - до 25% Повышает плодородие почвы за счет накопления азота. Повышает устойчивость растений к высоким температурам и повышенному содержанию солей в почвах.

Культурально-морфологические особенности штамма. Медленнорастущая культура. Штрих на 79 среде обильный, слабо-беловатый, плоский, слизистый, стекающий. Колонии однотипные, круглые, белые, слизистые, выпуклые, 1-1,5 мм - появляются на 3-5 сутки. На МПА не растет. Среду подщелачивает. Палочки мелкие, короткие. Размер 1,0-2,0*0,8-0,9 мкм.

Известные Физиолого-биохимические свойства штамма. Хемоорганотрофы: используют в качестве источников углерода разнообразные углеводы (глюкозу, сахарозу, манит, арабинозу) и соли органических кислот, газ не образуют. Целлюлозу и крахмал не используют. Источниками азота могут служить соли аммония, нитрат, нитрит и большинство аминокислот. Пептон используют слабо.

Условия культивирования: Растет на 79 среде. рН среды 6,5-7. Оптимальный диапазон температуры 25-28°С.

Срок хранения штамма при периодическом пересеве. При температуре 3-5°С в течении 6 месяцев.

Технической задачей в отношении способа получения инокулянта для нута являлось разработка технологии культивирования бактерий Mesorhizobium ciceri, обеспечивающего получения препарата более стабильного при хранении. Для оптимального применения препарат должен содержать клубеньковые бактерии в количестве не менее 2,0-2,5*10⁹ КОЕ/мл на протяжении 1 года хранения. Поставленная задача решается путем оптимизации режима культивирования и обогащения используемых сред элементами питания.

Технический результат в отношении способа заключается в проведении процесса культивирования бактерий Mesorhizobium ciceri. в две стадии. На первой стадии бактерии Mesorhizobium ciceri культивируют глубинным способом при непрерывной аэрации и перемешивании содержимого ферментера в жидкой питательной среде, содержащей маточную культуру, содержащую (г/л): маннит10-15; пептон ферментативный 5-10; магний сернокислый 0,5-1,0; калий фосфорнокислый (однозамещенный) 0,5-1,0; натрий хлористый 0,1-0,2. Засев среды производят маточной культурой клубеньковых бактерий в экспоненциальной фазе роста с концентрацией 1,0-2,0*10⁹ КОЕ/мл. Первоначальное культивирование осуществляют в течение 72-96 ч при температуре 25-27°С до установления стабильного уровня клеточного титра в бактериальной суспензии около 2,0-2,5*10⁹ КОЕ/мл. Затем из ферментера отбирается около половины содержимого, после этого уровень жидкости в ферментере доводится до первоначального объема жидкости питательной средой с повышенной концентрацией элементов питания манит 30-40; пептон ферментативный 15-30; магний сернокислый 1,5-2,0; калий фосфорнокислый (однозамещенный) 1,5-2,0; натрий хлористый 0,2-0,4 и культивирование запускается заново в первоначальном режиме до достижения концентрации клеток уже в 4,0-5,0*10⁹ КОЕ/мл, что занимает около 10-12 часов. Данный цикл может повторяться неоднократно. Полученный конечный продукт смешивается с ранее отобранными фракциями и разливается в качестве жидкой формы инокулянта по стерильным пластиковым канистрам.

Используемые концентрации ингредиентов питательных сред являются оптимальными для роста бактерии Mesorhizobium ciceri шт. 2013_KZ. Снижение одного из ингредиентов ниже заявленного интервала снижает скорость роста бактерий, введение больших количеств экономически нецелесообразно.

Как показали проведенные эксперименты использование заявляемого способа оказалось эффективным не только для штамма 2013_KZ, но и для других штаммов Mesorhizobium ciceri, обеспечивая поддержание их титра на уровне не менее 2,0-2,5*10⁹ КОЕ/мл на протяжении, как минимум, 1 года хранения в надлежащих условиях.

Стоит отметить, что с каждым новым циклом культивирования клубеньковых бактерий по заявляемой технологии их титр несколько возрастает вплоть до двухкратной прибавки, по сравнению с известными аналогами. Это связано как с использованием обогащенных питательных сред, используемых при доведении культуры, так и с тем, что бактерии искусственно поддерживаются в экспоненциальной фазе роста и при этом продукты их жизнедеятельности постоянно разбавляются новыми порциями среды.

Использование жидкой формы в качестве формуляции биопрепарата избавляет от необходимости предварительного приготовления суспензии торфяной формы перед непосредственным использованием инокулянта и позволяет обрабатывать семена более производительным и технологичным путем - через опрыскивание рабочим раствором через форсунки.

Использование заявляемого способа делает процесс более контролируемым по сравнению с периодическим режимом. Также появляется возможность кратно увеличить производительность процесса, ввиду того, что в качестве "посевного материала" выступает 20-50% объема ферментера, а не 2-5% как в случае с периодическим режимом. Культура при этом поддерживается в, преимущественно, экспоненциальной фазе роста, что обеспечивает минимальные потери рабочего времени на непроизводительную лаг-фазу. Предлагаемый способ культивирование медленнорастущих клубеньковых бактерий нута позволяет получать полный объем препарата (рабочий объем ферментера) за 24 часа (против 72 часов при периодическом культивировании).

Результаты испытаний показали, что штамм 2013_KZ дает прибавку около 25% семян и зеленой массы нута в неблагоприятных погодных условиях.

Сущность и промышленная применимость изобретения иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Штамм 2013_KZ бактерии Mesorhizobium ciceri культивировали глубинным способом при непрерывной аэрации и перемешивании содержимого ферментера с частотой вращения мешалки 175-200 об/мин в жидкой питательной среде, имеющей следующий состав (г/л): манит-13; пептон ферментативный - 8; магний сернокислый 0,8; калий фосфорнокислый (однозамещенный) 0,8; натрий хлористый 0,15 вода-остальное (далее среда 1).

Засев среды производили маточной культурой штамма KZ_2013 бактерий в экспоненциальной фазе роста с концентрацией 2,2*10⁹ КОЕ/мл. Первоначальное культивирование осуществляют в течение 72 ч при температуре 25-27°С до установления стабильного уровня клеточного титра в бактериальной суспензии 2,5*10⁹ КОЕ/мл. Затем из ферментера отливали половину содержимого, после этого уровень жидкости в ферментере доводили до первоначального объема жидкости питательной средой, содержащей (г/л): манит 35; пептон ферментативный 20; магний сернокислый 2,0; калий фосфорнокислый (однозамещенный) 1,5; натрий хлористый 0,3, вода - остальное (далее среда 2). Культивирование осуществлялось в первоначальном режиме в течении 12 часов до достижения концентрации клеток 5,0*10⁹ КОЕ/мл.

Затем половина содержимого ферментера сливалась в бак накопитель конечного продукта, а содержимое ферментера снова доводилось концентрированной питательной средой 2 до первоначального уровня и цикл культивирования повторялся снова. Периодически содержимое наполнившегося бака накопителя смешивалось для предотвращения расслоения на богатый бактериями осадок и бедную бактериями надосадочную жидкость и разливалось в качестве жидкой формы инокулянта по стерильным пластиковым канистрам. Использование данной упаковки позволяло поддерживать титр целевого микроорганизма на уровне 2,0-2,5*10⁹ КОЕ/мл на протяжении, как минимум, 1 года хранения при температуре +4°С.

Пример 2. Штамм 2013_KZ Mesorhizobium ciceri, культивировали в условиях примера 1 с внесением изменения в применяемые питательные среды. Полученные результаты приведены в таблице 2. Анализ приведенных данных показал, что лучшие результаты были получены при использовании следующих питательных сред:

Среда 1: манит - 12; пептон ферментативный - 8; магний сернокислый 0,8; калий фосфорнокислый (однозамещенный) 0,8; натрий хлористый 0,2, вода-остальное

Среда 2: манит-35; пептон ферментативный - 25; магний сернокислый 1,7; калий фосфорнокислый (однозамещенный) 1,9; натрий хлористый 0,3, вода - остальное

Пример 3 Образцы штаммов Mesorhizobium ciceri, полученных по технологии, описанной в примере 1, загружались на хранение в холодильник при температуре +4°С. Отбор проб проводился ежемесячно. Полученные результаты приведены в таблице 3

Пример 4. Исследовательская работа по испытанию штамма 2013_KZ Mesorhizobium ciceri была выполнена на полях «Аграрного научного центра «Донской» (лаборатория технологии возделывания пропашных культур), в 2017 г. расположенного в южной почвенно-климатической зоне Ростовской области. Почва опытного участка - чернозем обыкновенный тяжелосуглинистый карбонатный на лессовидных суглинках. Объектом исследований являлся сорт нута Волгоградский 10, допущенный к использованию по Ростовской области.

Преимуществами заявляемого штамма является более эффективное воздействие на семена нута и более высокая стабильность при хранении. Заявляемый способ позволяет интенсифицировать процесс получения бактериальной суспензии при сокращение времени получения заданного объема бактериальной суспензии и обеспечивает получение титра целевых микроорганизмов в 4,0-5,0*10⁹ КОЕ/мл и обеспечивают более продолжительный срок хранения инокулянта, что выражается в поддержании титра целевого микроорганизма на уровне 2,0-2,5*10⁹ КОЕ/мл на протяжении, как минимум, 1 года хранения в надлежащих условиях.

Группа изобретений относится к сельскому хозяйству, а именно к технологии активации семян нута перед посевом с помощью бактериальных удобрений. Предложены штамм Mesorhizobium ciceri, депонированный в коллекции ФГБНУ ВНИИСХМ 15.11. 2019 под №RCAM02723, - стимулятор урожайности нута и способ получения инокулянта для повышения урожайности нута. Способ предусматривает культивирование бактерий Mesorhizobium ciceri штамма №RCAM02723 методом глубинного культивирования в экспоненциальной фазе роста в две стадии. На первой стадии культивирование осуществляют в течение 72-96 ч при температуре 25-27°С на питательной среде, содержащей (г/л): маннит 10-15, пептон ферментативный 5-10, MgSO₄ 0,5-l,0, KH₂PO₄ 0,5-1,0, NaCl 0,1-0,2 и воду - остальное, до установления стабильного уровня клеточного титра в бактериальной суспензии около 2,0-2,5*10⁹ КОЕ/мл. После чего на второй стадии из ферментера отбирается часть содержимого и уровень жидкости в ферментере доводится до первоначального объема жидкой питательной средой, содержащей (г/л): маннит 30-40; пептон ферментативный 15-30; MgSO₄ 1,5-2,0, KH₂PO₄ 1,5-2,0, NaCl 0,2-0,4, воду - остальное, до достижения концентрации клеток в 4,0-5,0*10⁹ КОЕ/мл. При этом цикл удаления части содержимого из ферментера и введение в него питательной среды проводят неоднократно до достижения заданной концентрации клеток, а после первой стадии из ферментера удаляют половину содержимого. Заявленная группа изобретений позволяет повысить урожайность нута. 2 н. и 2 з.п. ф-лы, 4 табл., 4 пр.

1. Штамм Mesorhizobium ciceri, депонированный в коллекции ФГБНУ ВНИИСХМ под №RCAM02723, - стимулятор урожайности нута.

2. Способ получения инокулянта для повышения урожайности нута, включающий в себя культивирование бактерий Mesorhizobium ciceri методом глубинного культивирования на питательной среде, содержащей источник углерода и солевые добавки, отличающийся тем, что культивирование проводят с использованием культуры бактерий Mesorhizobium ciceri штамма №RCAM02723 в экспоненциальной фазе роста в две стадии, на первой из которых культивирование осуществляют в течение 72-96 ч при температуре 25-27°С, на питательной среде, содержащей (г/л): маннит 10-15; пептон ферментативный 5-10; MgSO₄ 0,5-1,0; KH₂PO₄ 0,5-1,0; NaCl 0,1-0,2 и воду - остальное, до установления стабильного уровня клеточного титра в бактериальной суспензии около 2,0-2,5*10⁹ КОЕ/мл, после чего на второй стадии из ферментера отбирается часть содержимого и уровень жидкости в ферментере доводится до первоначального объема введением жидкой питательной средой, содержащей (г/л): маннит 30-40, пептон ферментативный 15-30, магний сернокислый 1,5-2,0, калий фосфорнокислый однозамещенный 1,5-2,0, натрий хлористый 0,2-0,4 и воду - остальное, до достижения концентрации клеток в 4,0-5,0*10⁹ КОЕ/мл.

3. Способ по п. 2, отличающийся тем, что цикл удаления части содержимого из ферментера и введение в него питательной среды проводят неоднократно до достижения заданной концентрации клеток.

4. Способ по п. 2, отличающийся тем, что после первой стадии из ферментера удаляют половину объема содержимого.