Изобретение относится к области медицины, а именно к травматологии и ортопедии, к способу выращивания костного регенерата между отломками травмированной трубчатой кости кролика с применением ин виво биореактора в эксперименте и может быть использовано при хирургическом лечении пациентов в условиях травматолого-ортопедических, хирургических и других стационаров.

Известен способ стимуляции посттравматической частичной регенерации конечностей, хвоста и кожи у млекопитающих, включающий погружение ампутационных поверхностей после отсечений их дистальных частей, в том числе обнаженные костные ткани в пробирки со периодически сменяемыми стерильными изотоническими солевыми растворами, прохождение репаративной регенерации регенерирующей кости, (см. патент РФ №2053775, А61K 33/14).

Однако известный способ при своем использовании обладает следующими недостатками:

- не обеспечивает в достаточной степени необходимый и достаточный рост новообразованного костного регенерата,

- не обеспечивает снабжение новообразованного костного регенерата необходимыми биологически активными и питательными веществами,

- не обеспечивает ортотопическую сборку костей, которые позволяют восстанавливать дефект кости в нужном месте без необходимости вторичной операции по пересадке созданного искусственным путем костного трансплантата,

- не обеспечивает одновременное с построением новой ткани врастания в нее сосудов и нервов из отломков костей.

Задачей изобретения является создание способа выращивания костного регенерата между отломками травмированной трубчатой кости животного с применением ин виво биореактора в эксперименте.

Техническим результатом является обеспечение в достаточной степени необходимого и достаточного роста новообразованного костного регенерата, обеспечение надежного снабжения новообразованного костного регенерата необходимыми биологически активными и питательными веществами, обеспечение ортотопической сборки костей, которые позволят восстанавливать дефект кости в нужном месте без необходимости вторичной операции по пересадке созданного искусственным путем костного трансплантата, а также обеспечение одновременного с построением новой ткани врастания в нее сосудов и нервов из отломков костей.

Технический результат достигается тем, что предложен способ выращивания костного регенерата между отломками травмированной трубчатой кости кролика с применением ин виво биореактора в эксперименте, характеризующийся тем, что подготавливают операционное поле и выполняют хирургический доступ к диафизу трубчатой кости животного, проводят сегментарную резекцию диафиза нижней трети большеберцовой кости длиной 3 см, снимают с краев опилов кости надкостницу шириной 0,5 см, надевают на концы полой трубки ин виво биореактора воронки в виде усеченного полого конуса из биоинертного натурального латекса, в отверстие трубки ин виво биореактора вставляют сначала опил отломка дистальной части большеберцовой кости, затем опил отломка проксимальной части большеберцовой кости с прилеганием манжет воронки к наружным поверхностям опилов большеберцовой кости, в полости ин виво биореактора дополнительно размещают трубки из силиконовой резины, свободные концы которых выводят через проколы на поверхность кожного покрова, при этом свободные концы трубок ин виво биореактора закрепляют через металлический штуцер к разъему типа "Луер-Лок" с защитным колпачком, затем выполняют стабилизацию костных отломков с помощью аппарата внешней фиксации для чрескостного остеосинтеза, ушивают операционную рану с наложением асептической повязки, укладывают животное на здоровый бок, переводят выведенные на поверхность кожного покрова животного трубки из силиконовой резины с металлическим штекером соединительного разъема для шприца типа "Луер-Лок" с защитным колпачком в вертикальное положение, открывают защитный колпачок и через силиконовую трубку вводят жидкую композицию, заполняют ин виво биореактор с контролем уровня жидкости композиции в другой трубке, при этом в качестве жидкой композиции используют питательную среду для клеточных культур ДМЕМ DMEM с глутамином, содержащую 1 г/л глюкозы, с пируватом Na с добавлением фактора роста эндотелия сосудов-А человека, изоформа 165, рекомбинантный rhVEGF-A165 в количестве 0,25 нг на 1 мл питательной среды, при этом производят замену жидкой композиции два раза в сутки в первые 2 суток от момента начала операции, после слива раствора жидкой композиции ин виво биореактор промывают однократно стерильным изотоническим раствором натрия хлорида, далее 1 раз в сутки в течение 8 дней пространство ин виво биореактора заполняют питательной средой для клеточных культур с глутамином, содержащей 1 г/л глюкозы, пируват Na с добавлением 10% лизата кроличьих тромбоцитов, с добавлением фактора роста эндотелия сосудов-А человека, изоформа 165, рекомбинантного rhVEGF-A165 в количестве 0,25 нг на 1 мл среды, далее 1 раз в сутки в течение 15 дней пространство ин виво биореактора заполняют питательной средой для клеточных культур F12 с добавлением ВМР-7 рекомбинантного человеческого морфогенетического белка-7 (rhBMP-7) в концентрации 25 нанограммов на миллилитр питательной среды по четным дням, а также заполняют питательной средой для культур клеток F12 с добавлением ВМР-2 рекомбинантного человеческого морфогенетического белка-2 (rhBMP-2) в концентрации 25 нанограммов на миллилитр по нечетным дням, затем через 25-30 дней выполняют хирургическое извлечение ин виво биореактора с доступом через шов от предшествующей операции по установке биореактора, обнажают со стороны трубок из силиконовой резины стенку ин виво биореактора, отсекают трубки из силиконовой резины у места вхождения трубки в стенку полой трубки ин виво биореактора, удаляют металлический штуцер и с обоих концов полой трубки ин виво биореактора удаляют воронки, кусачками рассекают стенки воронки по всей длине, кусачками раскалывают стенку полой трубы ин виво биореактора вдоль и после удаления осколков поворачивают полую трубку ин виво биореактора вокруг своей оси и кусачками раскалывают вдоль, образованные две части трубки ротационными движениями извлекают из тканей, удаляют трубки из силиконовой резины вытягиванием их зажимом за торчащие из поверхности кожи животного концы, выполняют послойное ушивание раны, аппарат Илизарова демонтируют через 140-150 дней после минерализации и ремоделирования костного регенерата. При этом трубки из силиконовой резины могут быть подключены к промывной системе и ин виво биореактор может быть использован для активного промывного дренирования тканей, расположенных в его пространстве.

Способ осуществляется следующим образом. Подготавливают операционное поле и выполняют хирургический доступ к диафизу трубчатой кости животного. Проводят сегментарную резекцию диафиза нижней трети большеберцовой кости длиной 3 см, снимают с краев опилов кости надкостницу шириной 0,5 см. Надевают на концы полой трубки ин виво биореактора воронки в виде усеченного полого конуса из биоинертного натурального латекса. В отверстие трубки ин виво биореактора вставляют сначала опил отломка дистальной части большеберцовой кости, затем опил отломка проксимальной части большеберцовой кости с плотным прилеганием манжет воронки к наружным поверхностям опилов большеберцовой кости.

В полости ин виво биореактора дополнительно размещают трубки из силиконовой резины, свободные концы которых выводят через проколы на поверхность кожного покрова животного.

При этом свободные концы трубок ин виво биореактора закрепляют через металлический штуцер к разъему типа "Луер-Лок" с защитным колпачком. Затем выполняют стабилизацию костных отломков с помощью аппарата внешней фиксации для чрескостного остеосинтеза. Ушивают операционную рану с наложением асептической повязки.

Укладывают животное на здоровый бок, переводят выведенные на поверхность кожного покрова животного трубки из силиконовой резины с металлическим штекером соединительного разъема для шприца типа "Луер-Лок" с защитным колпачком в вертикальное положение. Открывают защитный колпачок и через силиконовую трубку вводят жидкую композицию. Заполняют ин виво биореактор с контролем уровня жидкости композиции в другой трубке.

В качестве жидкой композиции используют питательную среду для клеточных культур DMEM с глутамином, содержащую 1 г/л глюкозы, с пируватом Na с добавлением фактора роста эндотелия сосудов-А человека, изо-форма 165, рекомбинантный rhVEGF-A165 в количестве 0,25 нг на 1 мл питательной среды. При этом производят замену жидкой композиции два раза в сутки в первые 2 суток от момента начала операции. После слива раствора жидкой композиции ин виво биореактор промывают однократно стерильным изотоническим раствором натрия хлорида. Трубки из силиконовой резины могут быть подключены к промывной системе и ин виво биореактор может быть использован для активного промывного дренирования тканей, расположенных в его пространстве.

Далее 1 раз в сутки в течение 8 дней пространство ин виво биореактора заполняют питательной средой для клеточных культур DMEM с глутамином, содержащей 1 г/л глюкозы, пируват Na с добавлением 10% лизата кроличьих тромбоцитов, с добавлением фактора роста эндотелия сосудов-А человека, изоформа 165, рекомбинантного rhVEGF-A165 в количестве 0,25 нг на 1 мл среды.

Далее 1 раз в сутки в течение 15 дней пространство ин виво биореактора заполняют питательной средой для клеточных культур F12 с добавлением ВМР- 7 рекомбинантного человеческого морфогенетического белка-7 (rhBMP-7) в концентрации 25 нанограммов на миллилитр питательной среды по четным дням, а также заполняют по нечетным дням питательной средой для культур клеток F12 с добавлением ВМР-2 рекомбинантного человеческого морфогенетического белка-2 (rhBMP-2) в концентрации 25 нанограммов на миллилитр.

Через 25-30 дней выполняют хирургическое извлечение ин виво биореактора с доступом через шов от предшествующей операции по установке биореактора. Обнажают со стороны трубок из силиконовой резины стенку ин виво биореактора, отсекают трубки из силиконовой резины у места вхождения трубки в стенку полой трубки ин виво биореактора. Удаляют металлический штуцер и с обоих концов полой трубки ин виво биореактора удаляют воронки.

Рассекают кусачками стенки воронки по всей длине, кусачками раскалывают стенку полой трубы ин виво биореактора вдоль и, после удаления осколков поворачивают полую трубку ин виво биореактора вокруг своей оси и кусачками раскалывают вдоль. Образованные две части трубки ротационными движениями извлекают из тканей, удаляют трубки из силиконовой резины вытягиванием их зажимом за торчащие из поверхности кожи животного концы.

Выполняют послойное ушивание раны, аппарат Илизарова демонтируют через 140-150 дней после минерализации и ремоделирования костного регенерата.

Среди существенных признаков, характеризующих предложенный способ выращивания костного регенерата между отломками травмированной трубчатой кости животного с применением ин виво биореактора в эксперименте, отличительными являются:

- надевание на концы полой трубки ин виво биореактора воронок в виде усеченного полого конуса из биоинертного натурального латекса, в отверстие трубки ин виво биореактора вставляют сначала опил отломка дистальной части большеберцовой кости, затем опил отломка проксимальной части большеберцовой кости с прилеганием манжет воронки к наружным поверхностям опилов большеберцовой кости,

- размещение в полости ин виво биореактора дополнительно трубки из силиконовой резины, свободные концы которых выводят через проколы на поверхность кожного покрова, при этом свободные концы трубок ин виво биореактора закрепляют через металлический штуцер к разъему типа "Луер-Лок" с защитным колпачком,

- выполнение стабилизации костных отломков с помощью аппарата внешней фиксации для чрескостного остеосинтеза,

- переведение выведенных на поверхность кожного покрова животного трубок из силиконовой резины с металлическим штекером соединительного разъема для шприца типа "Луер-Лок" с защитным колпачком в вертикальное положение,

- заполнение ин виво биореактора с контролем уровня жидкости композиции в другой трубке, при этом в качестве жидкой композиции используют питательную среду для клеточных культур DMEM с глутамином, содержащую 1 г/л глюкозы, с пируватом Na с добавлением фактора роста эндотелия сосудов-А человека, изоформа 165, рекомбинантный rhVEGF-A165 в количестве 0,25 нг на 1 мл питательной среды,

- выполнение замены жидкой композиции два раза в сутки в первые 2 суток от момента начала операции,

- промывание после слива раствора жидкой композиции ин виво биореактора однократно стерильным изотоническим раствором натрия хлорида,

- заполнение далее 1 раз в сутки в течение 8 дней пространство ин виво биореактора заполняют питательной средой для клеточных культур DMEM с глутамином, содержащей 1 г/л глюкозы, пируват Na с добавлением 10% лизата кроличьих тромбоцитов, с добавлением фактора роста эндотелия сосудов-А человека, изоформа 165, рекомбинантного rhVEGF-A165 в количестве 0,25 нг на 1 мл среды,

- заполнение далее 1 раз в сутки в течение 15 дней пространство ин виво биореактора заполняют питательной средой для клеточных культур F12 с добавлением ВМР-7 рекомбинантного человеческого морфогенетического белка- 7 (rhBMP-7) в концентрации 25 нанограммов на миллилитр питательной среды по четным дням, а также заполняют питательной средой для культур клеток F12 с добавлением ВМР-2 рекомбинантного человеческого морфогенетического белка-2 (rhBMP-2) в концентрации 25 нанограммов на миллилитр по нечетным дням,

- выполнение через 25-30 дней хирургического извлечения ин виво биореактора с доступом через шов от предшествующей операции по установке биореактора, обнажение со стороны трубок из силиконовой резины стенки ин виво биореактора, отсечение трубки из силиконовой резины у места вхождения трубки в стенку полой трубки ин виво биореактора,

- удаление металлического штуцера и удаление с обоих концов полой трубки ин виво биореактора удаляют воронки,

- удаление трубки из силиконовой резины вытягиванием их зажимом за торчащие из поверхности кожи животного концы,

- демонтаж аппарата Илизарова через 140-150 дней после минерализации и ремоделирования костного регенерата.

Экспериментальные исследования предложенного способа выращивания костного регенерата между отломками травмированной трубчатой кости животного с применением ин виво биореактора в эксперименте показали его высокую эффективность. Предложенный способ выращивания костного регенерата между отломками травмированной трубчатой кости животного с применением ин виво биореактора в эксперименте при своем использовании обеспечил в достаточной степени необходимый и достаточный рост новообразованного костного регенерата, обеспечил надежное снабжение новообразованного костного регенерата необходимыми биологически активными и питательными веществами, обеспечил ортотопической сборку костей, которые позволили восстановить дефект кости в нужном месте без необходимости вторичной операции по пересадке созданного искусственным путем костного трансплантата, а также обеспечил одновременное с построением новой костной ткани врастания в нее сосудов и нервов из отломков костей.

Реализация предложенного способа выращивания костного регенерата между отломками травмированной трубчатой кости животного с применением ин виво биореактора в эксперименте иллюстрируется следующими клиническими примерами.

Пример 1. В условиях операционной подопытное животное - кролика ввели в состояние наркоза. Подготовили операционное поле, удаляли шерсть с бедра и голени задней конечности животного, произвели обработку операционного поля антисептиками.

Выполнили хирургический доступ к диафизу трубчатой кости животного. Провели сегментарную резекцию диафиза нижней трети большеберцовой кости длиной 3 см, сняли с краев опилов кости надкостницу шириной 0,5 см. Надели на концы полой трубки ин виво биореактора воронки в виде усеченного полого конуса из биоинертного натурального латекса. В отверстие трубки ин виво биореактора вставили сначала опил отломка дистальной части большеберцовой кости, затем опил отломка проксимальной части большеберцовой кости с плотным прилеганием манжет воронки к наружным поверхностям опилов большеберцовой кости.

В полости ин виво биореактора дополнительно разместили трубки из силиконовой резины, свободные концы которых вывели через проколы на поверхность кожного покрова.

При этом свободные концы трубок ин виво биореактора закрепили через металлический штуцер к разъему типа "Луер-Лок" с защитным колпачком. Затем выполнили стабилизацию костных отломков с помощью аппарата внешней фиксации для чрескостного остеосинтеза. Ушили операционную рану с наложением асептической повязки.

Уложили животное на здоровый бок, перевели выведенные на поверхность кожного покрова животного трубки из силиконовой резины с металлическим штекером соединительного разъема для шприца типа "Луер-Лок" с защитным колпачком в вертикальное положение. Открыли защитный колпачок и через силиконовую трубку ввели жидкую композицию. Заполнили ин виво биореактор с контролем уровня жидкости композиции в другой трубке.

В качестве жидкой композиции использовали питательную среду для клеточных культур DMEM с глутамином, содержащую 1 г/л глюкозы, с пируватом Na с добавлением фактора роста эндотелия сосудов-А человека, изоформа 165, рекомбинантный rhVEGF-A165 в количестве 0,25 нг на 1 мл питательной среды. При этом произвели замену жидкой композиции два раза в сутки в первые 2 суток от момента начала операции. После слива раствора жидкой композиции ин виво биореактор промыли однократно стерильным изотоническим раствором натрия хлорида. Трубки из силиконовой резины могут быть подключены к промывной системе и ин виво биореактор может быть использован для активного промывного дренирования тканей, расположенных в его пространстве.

Далее 1 раз в сутки в течение 8 дней пространство ин виво биореактора заполнили питательной средой для клеточных культур DMEM с глутамином, содержащей 1 г/л глюкозы, пируват Na с добавлением 10% лизата кроличьих тромбоцитов, с добавлением фактора роста эндотелия сосудов-А человека, изоформа 165, рекомбинантного rhVEGF-A165 в количестве 0,25 нг на 1 мл среды.

Далее 1 раз в сутки в течение 15 дней пространство ин виво биореактора заполнили питательной средой для клеточных культур F12 с добавлением ВМР-7 рекомбинантного человеческого морфогенетического белка-7 (rhBMP-7) в концентрации 25 нанограммов на миллилитр питательной среды по четным дням, а также заполнили по нечетным дням питательной средой для культур клеток F12 с добавлением ВМР-2 рекомбинантного человеческого морфогенетического белка-2 (rhBMP-2) в концентрации 25 нанограммов на миллилитр.

Через 30 дней выполнили хирургическое извлечение ин виво биореактора с доступом через шов от предшествующей операции по установке биореактора. Обнажили со стороны трубок из силиконовой резины стенку ин виво биореактора, отсекли трубки из силиконовой резины у места вхождения трубки в стенку полой трубки ин виво биореактора. Удалили металлический штуцер и с обоих концов полой трубки ин виво биореактора удалили воронки.

Рассекли кусачками стенки воронки по всей длине, кусачками раскололи стенку полой трубы ин виво биореактора вдоль и, после удаления осколков повернули полую трубку ин виво биореактора вокруг своей оси и кусачками раскололи вдоль. Извлекли образованные две части трубки ротационными движениями из тканей кожи животного, удалили трубки из силиконовой резины вытягиванием их зажимом за торчащие из поверхности кожи животного концы.

Выполнили послойное ушивание раны, аппарат Илизарова демонтировали через 140 дней после минерализации и ремоделирования костного регенерата.

Пример 2. В условиях операционной подопытное животное - кролик ввели в состояние наркоза. Подготовили операционное поле, удаляли шерсть с бедра и голени задней конечности животного, произвели обработку операционного поля антисептиками.