Способ получения тканеинженерной надкостницы из клеточных сфероидов для восстановления костных дефектов субъекта Российский патент 2024 года по МПК A61L27/00 A61K33/14 

Область техники

Изобретение относится к области медицины, а именно к тканевой инженерии, регенеративной медицине, ортобиологии, травматологии и ортопедии, стоматологии, пластической и восстановительной хирургии.

Уровень техники

Надкостница представляет собой тонкую соединительнотканную пластинку мезен-химного происхождения, покрывающую все поверхности костей, кроме суставных, сухожильных прикреплений и поверхностей сесамовидных костей. Прочное крепление надкостницы к подлежащей кости обеспечивается коллагеновыми волокнами Шарпея, которые доходят до внешних периферических и интерстициальных пластинок кости. За небольшой толщиной надкостницы скрывается ее сложное строение, которое обеспечивает выполнение множества функций, включая механическую защиту кости, механосенсорику, функции резервуара биохимических молекул для инициации каскадной передачи сигналов, формирование ниши остеогенных клеток для роста, физиологической и репаративной регенерации кости, а также питание костной ткани многочисленными сосудами надкостницы и иннервация надкостницы и прилежащей костной ткани многочисленными нервными волокнами. Следует отметить, что нервная система является важным регулятором костного метаболизма, в том числе посредством центрального контроля активности остеогенных клеток надкостницы.

Надкостница важна не только для остеогенеза, но при определенных искусственных условиях надкостница может обеспечить репаративный хондрогенез, что существенно расширяет спектр возможностей регенеративных технологий с использованием надкостницы или ее живого эквивалента.

Определенные клетки надкостницы (Periosteum-derived cells (PDCs)) обладают свойствами стволовых клеток, для них характерны самообновление (отсутствие признаков старения до 80 удвоения популяции) и мультипотентность (дифференцируются в фибробласты, остеобласты, хондроциты, адипоциты и скелетные миоциты). Внутренний слой камбия богат клетками и состоит в основном из остеогенных клеток на различных стадиях развития (покоящихся, пролиферирующих, дифференцирующихся предшественников) и остеобластов, которые окружены гораздо более тонким коллагеновом матриксе, по сравнению с внешним фиброзным слоем [Li, Chunyi and Peter Fennessy. "The periosteum: a simple tissue with many faces, with special reference to the antler-lineage periostea." Biology direct vol. 16, 1 17. 18 Oct. 2021, doi:10.1186/s13062-021-00310-w].

Многие проблемы травматологии и ортопедии, стоматологии и пластической хирургии, связанные с костными и хрящевыми посттравматическими дефектами, превышающими размеры критических дефектов, могут быть эффективно решены за счет изготовления биоискусственной персонифицированной надкостницы, исследуются варианты изготовления из различных типов клеток, материалов с разными свойствами, предназначенные для различных методик трансплантации того или иного полученного конструкта. Крайне важно отметить, что сразу после повреждения костей, например диафиза длинной трубчатой кости, его кортикального слоя, травмированная надкостница претерпевает ряд изменений, которые инициируют как эндохондральное, так и внутримембранозное образование кости в месте повреждения.

Быстро развивающаяся область биотехнологий, включая тканевую инженерию надкостницы, направлена на синтез биоискусственной или бионической надкостниц, способных обеспечить, как саму возможность заживлений костных дефектов, так и ускорения этих процессов. Материалы биоискусственной надкостницы могут стремиться к достижению параметров натуральной надкостницы как по структуре, так и по функциям, что позволяет надеяться на хороший терапевтический и регенеративный потенциалы разрабатываемых тканеинженерных конструктов.

Индукция регенерации тканей надкостницы и кости с помощью биомиметической тканеинженерной надкостницы, по мнению ряда авторов, является идеальным целевым процессом для восстановления кости (Zhang W., Wang N., Yang M., Sun T., Zhang J., Zhao Y., Huo N., Li Z. Periosteum and development of the tissue-engineered periosteum for guided bone regeneration. J Orthop Translat. 2022 Feb. 16; 33:41-54. doi: 10.1016/j.jot.2022.01.002. PMID: 35228996; PMCID: PMC8858911).

Известна группа изобретений, в которой предложены способ получения трансплантата на основе клеточных сфероидов из культивируемых клеток надкостницы и трансплантат для восстановления скелетных соединительных тканей субъекта, полученный указанным способом. Сфероиды в этих изобретениях предназначены для заполнения посттравматических дефектов скелетных тканей и стимуляции костной, в первую очередь трансплантационной регенерации (Патент №2744664 С1 Российская Федерация, МПК C12N 5/077, A61F 2/30. Способ производства сфероидов из культивируемых клеток надкостницы для обеспечения репаративного остеогенеза: №2020109215: заявл. 02.03.2020: опубл. 12.03.2021 / А.В. Ковалев, М.М. Сморчков; заявитель ОБЩЕСТВО С ОГРАНИЧЕННОЙ ОТВЕТСТВЕННОСТЬЮ "МЕЖДУНАРОДНЫЙ ЦЕНТР МЕДИЦИНСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ И РАЗРАБОТОК". - EDN LPAATA).

Чжао и соавт. разработали конструкцию тканеинженерной надкостницы, которая по данным авторов играет роль в остеогенезе и ангиогенезе при лечении экспериментальных костных дефектов. Их тканеинженерная надкостница представляет собой гибкую конструкцию, созданную путем объединения остеогенно-индуцированных мезенхимальных стволовых клеток (МСК) костного мозга кролика с бесклеточным каркасом подслизистой оболочки тонкой кишки свиньи. Третий пассаж МСК был выбран для остеогенной дифференцировки. МСК индуцировали в течение 3 недель в DMEM (Invitrogen), содержащей 10 % FBS (Sijiqing) с добавлением 50 мг/л аскорбата натрия, 10 ммоль/л β-глицеролфосфата натрия и 10 нм/л дексаметазона (все от Sigma-Aldrich).) при 37°С во влажной камере с 5 % СО₂. Листы бесклеточных каркасов подслизистой оболочки тонкой кишки свиньи расстилали на дно культуральных чашек, а затем дезинфицировали ультрафиолетовым светом в течение более чем 1 часа. Чистую фетальную бычью сыворотку добавляли к предварительно смоченным листам бесклеточных каркасов подслизистой оболочки тонкой кишки свиньи более чем на 12 часов. Затем на предварительно смоченную поверхность этих листов добавляли 500 мкл суспензии остеогенно-индуцированных МСК с плотностью 1×10⁶ клеток/мл и инкубировали в течение 4 ч, чтобы обеспечить прикрепление клеток. К клеткам добавляли дополнительную среду DMEM с 10 % фетальной бычьей сыворотки, и культуру инкубировали при 37°С в среде с 5 % СО₂ и влажностью 95 % в течение 10-15 дней для образования биоактивного тканеинженерного конструкта. Среду меняли каждые 2-3 дня (Zhao L, Zhao J, Tuo Z, Ren G. Repair of long bone defects of large size using a tissue-engineered periosteum in a rabbit model. J Mater Sci Mater Med. 2021;32(9): 105. Published 2021 Aug 21. doi: 10.1007/s 10856-021-06579-7).

Однако эта вышеописанная и известная тканеинженерная надкостница имеет следующие недостатки: мезенхимальные стволовые клетки костного мозга, несмотря на общее эмбриональное происхождение с камбиальными клетками надкостницы не являются тканеспецифичным типом клеток для этой соединительнотканной пластинки в живом организме. Известно, что PDCs демонстрируют гораздо более высокую скорость пролиферации, чем мезенхимальные стволовые клетки, происходящие из костного мозга, и эти клетки надкостницы поддерживают линейный рост в течение более чем 30 удвоений популяции, демонстрируя длинные теломеры без признаков старения примерно до 80 удвоений популяции, что существенно лучше аналогичных показателей, характерных для МСК костного мозга. В целом, в постнатальном периоде PDCы проявляют большую клоногенность, способность к росту и дифференцировке в остеогенном и хондрогенном направлениях, чем мезенхимальные стволовые клетки костного мозга (Li, Chunyi, and Peter Fennessy. "The periosteum: a simple tissue with many faces, with special reference to the antler-lineage periostea." Biology direct vol. 16,1 17. 18 Oct. 2021, doi: 10.1186/s13062-021-00310-w).

В конструкции используется ксеногенный материал - бесклеточным каркасом подслизистой оболочки тонкой кишки свиньи, что несет все риски, связанные с любыми материалами ксеногенного происхождения.

Используемые клетки более специализированы, подобное состояние снижает пластичность клеток, одновременным снижая пролиферативный и регенеративный потенциал клеток, что отрицательно сказывается на кинетике наращивания клеточной биомассы, уменьшается ее выход при остальных равных условиях культивировании.

Использование в питательной среде фетальной бычьей сыворотки уменьшает эффективность культивирования из-за известных проблем со стандартизацией этого типа ксеногенных продуктов, а также влияния фетальной сыворотки на дифференцировку клеток и ускорение старения культур клеток мезенхимного происхождения.

Таким образом, несмотря на известные способы получения различных конструкций тканеинженерной надкостницы, все эти конструкции характеризуются рядом недостатков и ограничений, а также остается много препятствий, в том числе, связанных с приживлением, участием в тканеспецифической полноценной репаративной регенерации скелетных тканей, недостаточным кровоснабжением конструктов, недостаточным питанием и дыханием пересаженных клеток в тканеинженерных конструктах на этапе приживления и малой эффективности индукции костной регенерации в живом организме на месте костного дефекта, поэтому сохраняется необходимость в разработке и создании новых способов получения тканеинженерной надкостницы и решения указанных проблем.

Раскрытие изобретения

Задачами настоящего изобретения является разработка способа получения персонифицированного биотрансплантата - тканеинженерной надкостницы из агрегатов аутологичных культивированных клеток надкостницы - клеточных сфероидов, объединенных с коллагеновой мембраной и альгинатного геля с цитокинами, обладающего влиянием на остеогенную дифференцировку клеток.

Техническим результатом данного изобретения является разработка способа получения биоискусственной надкостницы - тканеинженерной конструкции в виде эластичной тонкой пластины на основе коллагеновой мембраны и клеточных сфероидов из аутологичных культивированных клеток надкостницы, прилипших к мембране, слившихся между собой и частично распластанных, часть клеток проникает в межволоконные пространства коллагеновой мембраны с формированием объединяющего тканеинженерную конструкцию коллагенового остова. В состав трансплантата входит альгинатный гель (полученный путем смешивания 2 % (масса/объем) альгината натрия (FMC BioPolymer) в 30 мМ Hepes, содержащем 150 мМ NaCl и 10 мМ KCl, с равным объемом раствора, содержащего 75 мМ CaCl2 в 10 мМ Hepes, содержащем 150 мМ NaCl и 10 мМ KCl, с помощью стерильного Y-образного смесителя. Гель отверждался в течение 1 мин и имел модуль Юнга 0,17 МПа. Факторы роста (TGF-β1 и FGF-2) были включены в состав геля в концентрации 10 нг/мл), способствующий реализации регенеративных потенций конструкта в живом организме. Гель вноситься в конструкцию интраоперационно, заполняя пространство костного дефекта, ограниченное коллагеновой мембраной со сфероидами. Полученная таким способом тканеинженерная надкостница содержит культивированные остеогенные клетки надкостницы и обладает регенеративным остеогенным потенциалом при пересадке в живой организм.

Способ получения указанной тканеинженерной конструкции включает следующие этапы:

а) размещение на дне культурального сосуда с боковой крышкой коллагеновой мембраны и ее пропитывание культуральной питательной средой:

б) установка титановой рамы (размер сечения бруска рамы - боковая сторона - 0,5 мм ширина - 4 мм, скрепленных между собой под прямым углом) сверху на коллагеновую мембрану, мембрана расправляется и рамой прижимается ко дну культурального флакона, во флакон вносится культуральная питательная среда, размер титановой рамы соответствует размеру коллагеновой мембраны;

в) в пространство, образуемое коллагеновой мембраной и внутренними боковыми краями титановой рамы, проводится укладка одного ряда клеточных сфероидов из аутологичных культивированных клеток надкостницы, для чего клеточные сфероиды в суспензии с помощью аппликатора наносятся на коллагеновую мембрану, сфероиды осаждаются под собственным весом, распределяются титановой полоской длина которой соответствует размерам раны по поверхности мембраны до полного заполнения слоя в 1 сфероид по высоте по всей площади мембраны, ограниченной внутренними краями рамы, для выравнивания слоя сфероидов полоска перемещается по верхней поверхности ребер рамы;

г) 3D культивирование сфероидов на поверхности коллагеновой мембраны проводиться в течении 5 суток в питательной среде состава: ДМЕМ (или ДМЕМ/F12) 450 мл, L-глутамин 292 мг, 50 мл тромболизата, пенициллин 100 ед./мл, стрептомицин 100 мкг/мл (при 100 % влажности над слоем питательной среды внутри культурального флакона и 5 % СО₂ в воздушной газовой смеси), замена питательной среды во флаконе проводиться не менее 1 раз в 3 суток;

д) края коллагеновой мембраны прошиваются хирургическими рассасывающимися нитями для последующего крепления к свободным краям надкостницы реципиента вокруг костного дефекта при трансплантации этой тканеинженерной конструкции, слой сфероидов располагается снаружи, коллагеновая мембрана обращена к центру костного дефекта, внутреннее пространство ограниченное коллагеновой мембраной и поверхностями костного дефекта заполняется с помощью шприца гелем, который получен путем смешивания 2 % (масса/объем) альгината натрия (FMC BioPolymer) в 30 мМ Hepes, содержащем 150 мМ NaCl и 10 мМ KCl, с равным объемом раствора, содержащего 75 мМ CaCl2 в 10 мМ Hepes, содержащем 150 мМ NaCl и 10 мМ KCl, с помощью стерильного Y-образного смесителя, гель отверждается в течение 1 мин и имеет модуль Юнга 0,17 МПа, в составе геля присутствуют факторы роста TGF-β1 и FGF-2 в количестве 10 нг/мл каждый.

Определение и термины

Различные термины, относящиеся к объектам настоящего изобретения, используются выше и также в описании и в формуле изобретения. Если иное не оговаривается, все технические и научные термины, используемые в данной заявке, имеют то же самое значение, которое понятно для специалистов в данной области. Ссылки на методики, используемые при описании данного изобретения, относятся к хорошо известным методам, включая изменения этих методов и замену их эквивалентными методами, известными специалистам.

Мезенхимальные стволовые клетки (МСК) представляют собой подмножество гетерогенных некроветворных фибробластоподобных клеток, которые могут дифференцироваться в клетки нескольких клонов, такие как хондроциты, остеобласты, адипоциты, миобласты и другие. Эти мультипотентные МСК могут быть обнаружены почти во всех тканях, но в основном расположены в периваскулярных нишах, играя важную роль в восстановлении и регенерации тканей. Кроме того, МСК взаимодействуют с иммунными клетками как врожденной, так и адаптивной иммунной системы, модулируя иммунный ответ и обеспечивая иммуносупрессию и индукцию толерантности.

Трансформирующий фактор роста бета (англ. Transforming growth factor beta, TGF-beta) - белок (представитель цитокинов), который контролирует пролиферацию, клеточную дифференцировку и другие функции в большинстве клеток. Трансформирующий ростовой фактор, бета-1 (TGF - бета-1) - белок человека, поливалентный цитокин, являющийся первым описанным членом семейства ТРФ-бета, которое, в свою очередь, является частью обширного суперсемейства ТРФ-бета. TGF-β1 проявляет все основные типы биологической активности, присущие всем изоформам. Первоначально TGF-β1 был описан как фактор, вызывающий рост фибробластов у грызунов. TGF-β1-непрямой митоген для некоторых ме-зенхимных клеток.

Основной фактор роста фибробластов (англ. Basic fibroblast growth factor, bFGF, FGF-β, FGF2), представляет собой фактор роста и сигнальный белок, кодируемый геном FGF2. Он связывается и оказывает действие через специфические белки рецептора фактора роста фибробластов (FGFR), сами по себе являющиеся семейством близкородственных молекул, обладает широкой митогенной активностью и активностью выживания клеток и участвует во множестве биологических процессов, включая эмбриональное развитие, рост клеток, морфогенез, восстановление тканей, рост опухоли и инвазию. Гепарансульфат, активирует bFGF, тем самым опосредуя образование новых кровеносных сосудов, процесс, известный как ангиогенез.

Скаффолд - это важная часть тканеинженерной конструкции - каркас, временная поддержка, постепенно разрушающаяся в живом организме после пересадки, который используется для того, чтобы клетки прилипли к нему и образовали конструкт определенной формы, несущий живые клетки для пересадки в живой организм с целью ремонта или замещения органов.

Гель - физическое студенистое состояние вещества, обладающее некоторыми свойствами твердых тел (способность сохранять форму, прочность, упругость).

Модуль Юнга (синонимы: модуль продольной упругости, модуль нормальной упругости) - физическая величина, характеризующая способность материала сопротивляться растяжению, сжатию при упругой деформации.

Дефект кости - отсутствие участка костной ткани, обусловленное травмой или ятрогенным вмешательством (резекция кости).

Подробное раскрытие изобретения.

Использование сфероидов, позволяет повысить регенеративный потенциал конструкции за счет преимуществ, присущих клеточным сфероидам в сравнении с разрозненными клетками в виде суспензии, используемые при трансплантации путем инъекций, или же при нанесении отдельных клеток на скаффолд, а именно происходит: увеличение жизнеспособности клеток в сфероидах; формируется микросреда внутри сфероидов, приближающая клетки в составе сфероида к условиям микроокружения ин виво; создается высокая клеточная емкость тканеинженерной конструкции, что способствует инициации костной регенерации; характерна большая биосовместимость; в отличие от разрозненных клеток, клетки в сфероидах более вовлечены в механотрансдукцию; высокая способность сфероидов к биоинтеграции, а также обеспечиваются более благоприятные условия к органотипичной дифференцировке клеток в составе сфероида. Соединение сфероидов со скаффолдами - это новейший подход в тканевой инженерии. Каркасы в этом случае должны предоставлять волоконный остов внеклеточного матрикса, к которому мигрирующие из сфероидов клетки могут прикрепляться, пролиферировать и дифференцироваться, при этом каркас обеспечивает механическую прочность конструкции и ее гибкость, а сфероиды оптимизируют внутриклеточную передачу сигналов, улучшая процесс дифференцировки, что, в свою очередь, позволяет клеткам участвовать в остеогенезе после трансплантации. В данном изобретении предложен способ получения тканеинженерной надкостницы, которая предназначена для инициации костной регенерации по способу поднадкостничной костной репаративной регенерации, описанной в экспериментальной модели при изучении костеобразовательных возможностей надкостницы диафиза трубчатых костей (Студитский А. Н. Восстановление органов и тканей животного организма (биологическая теория регенерации): стенограмма публичной лекции, прочитанной в Центральном лектории Общества в Москве. - М.: Знание, 1952. - 40 с. (Всесоюзное общество по распространению политических и научных знаний. Серия 2. 1952. № 58). Условиями костной регенерации в этой животной модели являлись: вылущивание кости с сохранением суставных хрящей и надкостницы; надкостница и суставные хрящи оставляются на своем прежнем месте; в эксперименте удаляли («вылущивание из-под надкостницы») плечевые, бедренные, берцовые кости кроликов, собак, кур; в ходе эксперимента под надкостницей на месте костного дефекта формируется «грубая модель будущей кости», которая состоит в значительной мере из хряща; при дальнейшем наблюдении под влиянием мышечной нагрузки - движений - из грубой костно-хрящевой модели возникает сформированная плечевая, бедренная или берцовая кости со всеми особенностями строения, присущими нормальному костному органу.

Способ получения тканеинженерной конструкции надкостницы позволяет реализовать биомиметический подход в тканевой инженерии, когда биоискусственный продукт после трансплантации обеспечивает костную регенерацию по известному сценарию поднадкост-ничной остеорегенерации, и представляет собой частный вариант тканевой инженерии развития.

Пример осуществления изобретения

У кроликов-самцов калифорнийской породы массой 1 кг в ходе экспериментальной операции иссекался лоскут надкостницы с передней поверхности большеберцовой кости. Из надкостницы выделялась клеточная культура адгезивных клеток. Клеточные сфероиды стандартного размера были получены с использованием трехмерного культивирования клеток надкостницы в агарозных лунках (MicroTissues Inc.®).

В качестве скаффолда использовалась коллагеновая мембрана ТМО «ЛИОПЛАСТ-С», которая извлекалась из стерильной упаковки и размещалась на дне культуральные флакона (матраса для клеточных культур) с поддающейся повторной герметизации боковой крышкой. Такой флакон позволяет производить любые манипуляции с тканеинженерной конструкцией в стерильных условиях внутри ламинарного шкафа. Для удержания коллагеновой мембраны в правильном положении проводилась установка титановой рамы сверху на коллагеновую мембрану, мембрана расправляется рамой прижимается ко дну культурального флакона, причем размер титановой рамы соответствует размеру коллагеновой мембраны таким образом, чтобы под рамой оказывалась лишь узкая полоска по краям мембраны. Пространство, образуемое коллагеновой мембраной и внутренними боковыми краями титановой рамы, используется для внесения сфероидов. Проводится укладка одного ряда клеточных сфероидов из аутологичных культивированных клеток надкостницы, клеточные сфероиды в суспензии с помощью аппликатора наносятся сверху на коллагеновую мембрану, сфероиды осаждаются под собственным весом, сфероиды распределяются по поверхности коллагеновой мембраны титановой полоской, длина которой соответствует размерам рамы. По поверхности мембраны проводится полное заполнение слоя сфероидов в 1 сфероид по высоте по всей площади верхней поверхности мембраны, ограниченной внутренними краями рамы, для выравнивания слоя сфероидов полоска перемещается по верхней поверхности ребер рамы несколько раз до равномерного распределения сфероидов. Для закрепления сфероидов и их частичного проникновения внутрь коллагеновой мембраны проводится 3D культивирование сфероидов на поверхности коллагеновой мембраны. При этом происходит тканевое слияние сфероидов с объединением коллагенового остова сфероидов между собой в единый пласт, этот этап 3D культивирования проводиться в течение 5 суток в питательной среде состава: ДМЕМ (или ДМЕМ/Р12) 450 мл, L-глутамин 292 мг, 50 мл тромболизата (в качестве тромболизата у 3 животных использовался тромболизат кроликов, а у 3 кроликов - тромболизат тромбоцитов человека (PLTGold® Human Platelet Lysate Merck), пенициллин 100 ед./мл, стрептомицин 100 мкг/мл (при 100 % влажности над слоем питательной среды внутри культурального флакона и 5 % СО₂ в воздушной газовой смеси), замена питательной среды во флаконе проводиться не менее 1 раз в 3 сут. Смена среды осуществляется путем аккуратной аспирации питательной среды с помощью пипеток для сохранения положения сфероидов на поверхности мембраны. Края коллагеновой мембраны, свободные от слоя сфероидов, которые были под титановой рамкой, прошиваются хирургическими рассасывающимися нитями для возможности последующего крепления тканеинженерной конструкции к свободным краям надкостницы реципиентного ложа вокруг костного дефекта при трансплантации этой тканеинженерной конструкции в живой организм. Слой сфероидов располагается снаружи, вне зависимости, в трубчатую конструкцию сворачивается коллагеновая мембрана, либо если она используется в виде заплатки. Коллагеновая мембрана всегда обращена к центру костного дефекта, внутреннее пространство ограниченное коллагеновой мембраной и поверхностями костного дефекта заполняется с помощью шприца гелем, который получен путем смешивания 2 % (масса/объем) альгината натрия (FMC BioPolymer) в 30 мМ Hepes, содержащем 150 мМ NaCl и 10 мМ KCl, с равным объемом раствора, содержащего 75 мМ CaCl2 в 10 мМ Hepes, содержащем 150 мМ NaCl и 10 мМ KCl, с помощью стерильного Y-образного смесителя, гель отвердевает в течение 1 мин и имеет модуль Юнга 0,17 МПа, в составе геля присутствуют факторы роста TGF-β1 и FGF-2 в количестве 10 нг/мл каждый. Этот гель необходим для заполнения свободного пространства костного дефекта и поддержания тканеинженерной конструкции в расправленном состоянии в живом организме. Фактически гель необходим для реализации остеогенных потенций тканеинженерной конструкции, пространство под ТИК заполненная альгинатным гелем является по сути ин виво биореактором, внутри которого протекает репаративный остеогенез. После созревания ТИК полученная заявленным способом представляет собой трансплантат - биоискусственную надкостницу в виде эластичной тонкой пластины из коллагеновой мембраны и клеточных сфероидов из аутологичных культивированных клеток надкостницы, прилипших к мембране, слившихся между собой и частично распластанных, клетки проникают в межволоконные пространства коллагеновой мембраны и продуцируют собственные коллагеновые волокна с образованием связанного и объединяющего тканеинженерную конструкцию коллагенового остова.

Для исследований остеогенных свойств тканеинженерной надкостницы, надкостница сворачивалась в трубочку, заполнялась альгинатным гелем и помещалась в диффузную камеру 2 мм толщиной с порами 0,45 мм. Камеры позволяют пассивно диффундировать нутриентам и сигнальным молекулам из реципиента, но не вызывают иммунного ответа. Фильтры также предотвращают прямое взаимодействие между клетками донора и реципиента. Камеры были изготовлены по известной технологии (Friedenstein A.J., Chailakhyan R.K., Gerasimov U.V. Bone marrow osteogenic stem cells: in vitro cultivation and transplantation in diffusion chambers. Cell Tissue Kinet. 1987 May; 20(3):263-72. doi: 10.1111/j.1365-2184.1987.tb01309.x. PMID: 3690622).

Камеры трансплантировались в организм кроликов, причем ТИК содержал для каждого кролика аутологичный клеточный материал. Камеры пересаживались кроликам в бедро в межмышечные фасции. По 1 камере одному животному. Через 75 суток при гистологическом исследовании тканей внутри диффузной камеры обнаружен косно-хрящевой регенерат.

Изобретение относится к медицинской технике, а именно к способу получения тканеинженерной надкостницы из клеточных сфероидов для восстановления костных дефектов субъекта. В способе коллагеновую мембрану размещают на дне культурального сосуда с боковой крышкой и пропитывают коллагеновую мембрану культуральной питательной средой. Далее размещают на коллагеновой мембране сверху прямоугольную выполненную из титана раму с размером сечения 4×4 мм при высоте рамы 0,5 мм, рамой прижимают края коллагеновой мембраны к дну флакона. Сверху на коллагеновую мембрану, ограниченную внутренними стенками рамы, укладывают горизонтальный слой клеточных сфероидов, состоящих из агрегированных культивированных аутологичных клеток надкостницы, в один ряд. Культивируют сфероиды на поверхности коллагеновой мембраны в процессе созревания тканеинженерной конструкции в питательной среде: DMEM или DMEM-F12 450 мл, L-глутамина 292 мг, тромболизата 50 мл, пенициллина 100 ед./мл, стрептомицина 100 мкг/мл при 100 % влажности и с 5 % содержанием СО₂ в воздушной смеси над слоем питательной среды внутри культурального флакона, в течение 6-7 суток с заменой культуральной питательной среды не менее 2 раз. Техническим результатом является разработка способа получения биоискусственной надкостницы, содержащей культивированные остеогенные клетки надкостницы и обладающей регенеративным остеогенным потенциалом при пересадке в живой организм. 4 з.п. ф-лы.

1. Способ получения тканеинженерной надкостницы из клеточных сфероидов для восстановления костных дефектов субъекта, характеризующийся тем, что коллагеновую мембрану размещают на дне культурального сосуда с боковой крышкой и пропитывают коллагеновую мембрану культуральной питательной средой, далее размещают на коллагеновой мембране сверху прямоугольную выполненную из титана раму с размером сечения 4×4 мм при высоте рамы 0,5 мм, рамой прижимают края коллагеновой мембраны к дну флакона, сверху на коллагеновую мембрану, ограниченную внутренними стенками рамы, укладывают горизонтальный слой клеточных сфероидов, состоящих из агрегированных культивированных аутологичных клеток надкостницы, в один ряд, культивируют сфероиды на поверхности коллагеновой мембраны в процессе созревания тканеинженерной конструкции в питательной среде: DMEM или DMEM-F12 450 мл, L-глутамина 292 мг, тромболизата 50 мл, пенициллина 100 ед./мл, стрептомицина 100 мкг/мл при 100 % влажности и с 5 % содержанием СО₂ в воздушной смеси над слоем питательной среды внутри культурального флакона, в течение 6-7 сут. с заменой культуральной питательной среды не менее 2 раз.

2. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что используют гомосфероиды из культивированных адгезивных культивированных клеток камбиального слоя надкостницы в количестве 6000 клеток на сфероид или клеточные гетеросфероиды из адгезивных культивированных клеток надкостницы и мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга в соотношении 2:1 в количестве 6000-8000 клеток на сфероид.

3. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что используют в качестве культуральной питательной среды среду на основе ксеногенных фетальных сывороток животных, среду на основе аутологичной и аллогенных сывороток человека, среду на основе тромболизатов крови человека, бессывороточную синтетическую среду, бессывороточную синтетическую среду с добавлением индукторов остеогенной дифференцировки.

4. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что коллагеновая мембрана представляет собой стерильную децеллюляризованную надкостницу - быка, овцы, кролика или человека.

5. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что используют сфероиды с размером от 250 до 500 мкм.