Изобретение относится к области медицины, а именно к тканевой инженерии, регенеративной медицине, ортобиологии, травматологии и ортопедии, отоларингологии, пластической и восстановительной хирургии.
Надкостница представляет собой тонкую соединительнотканную пластинку мезенхимного происхождения, покрывающую все поверхности костей, кроме суставных, сухожильных прикреплений и поверхностей сесамовидных костей. Прочное крепление надкостницы к подлежащей кости обеспечивается коллагеновыми волокнами Шарпея, которые доходят до внешних периферических и интерстициальных пластинок кости. За небольшой толщиной надкостницы скрывается ее сложное строение, которое обеспечивает выполнение множества функций, включая механическую защиту кости, механосенсорику, функции резервуара биохимических молекул для инициации каскадной передачи сигналов, формирование ниши остеогенных клеток для роста, физиологической и репаративной регенерации кости, а также питание костной ткани многочисленными сосудами надкостницы и иннервация надкостницы и прилежащей костной ткани многочисленными нервными волокнами. Следует отметить, что нервная система является важным регулятором костного метаболизма, в том числе посредством центрального контроля активности остеогенных клеток надкостницы.
Надкостница важна не только для остеогенеза, но при определенных искусственных условиях надкостница может обеспечить репаративный хондрогенез, что существенно расширяет спектр возможностей регенеративных технологий с использованием надкостницы или ее живого эквивалента.
Определенные клетки надкостницы (Periosteum-derived cells (PDCs)) обладают свойствами стволовых клеток, для них характерны самообновление (отсутствие признаков старения до 80 удвоения популяции) и мультипотентность (дифференцируются в фибробласты, остеобласты, хондроциты, адипоциты и скелетные миоциты). Внутренний слой камбия богат клетками и состоит в основном из остеогенных клеток на различных стадиях развития (покоящихся, пролиферирующих, дифференцирующихся предшественников) и остеобластов, которые окружены гораздо более тонким коллагеновом матриксом по сравнению с внешним фиброзным слоем [Li, Chunyi, and Peter Fennessy. "The periosteum: a simple tissue with many faces, with special reference to the antler-lineage periostea. "Biology direct vol. 16,1 17. 18 Oct. 2021, doi: 10.1186/s13062-021-00310-w].
Многие проблемы травматологии и ортопедии, стоматологии и пластической хирургии, связанные с костными и хрящевыми посттравматическими дефектами, превышающими размеры критических дефектов, могут быть эффективно решены за счет изготовления биоискусственной персонифицированной надкостницы, исследуются варианты изготовления из различных типов клеток, материалов с разными свойствами, предназначенные для различных методик трансплантации того или иного полученного конструкта. Крайне важно отметить, что сразу после повреждения костей, например диафиза длинной трубчатой кости, его кортикального слоя, травмированная надкостница претерпевает ряд изменений, которые инициируют как эндохондральное, так и внутримембранозное образование кости в месте повреждения.
Быстро развивающаяся область биотехнологий, включая тканевую инженерию надкостницы, направлена на синтез биоискусственной или бионической надкостниц, способных обеспечить, как саму возможность заживлений костных дефектов, так и ускорения этих процессов. Материалы биоискусственной надкостницы могут стремиться к достижению параметров натуральной надкостницы как по структуре, так и по функциям, что позволяет надеяться на хороший терапевтический и регенеративный потенциалы разрабатываемых тканеинженерных конструктов. Индукция регенерации тканей надкостницы и кости с помощью биомиметической тканеинженерной надкостницы, по мнению ряда авторов, является идеальным целевым процессом для восстановления кости (Zhang W, Wang N, Yang M, Sun T, Zhang J, Zhao Y, Huo N, Li Z. Periosteum and development of the tissue-engineered periosteum for guided bone regeneration. J Orthop Translat. 2022 Feb 16; 33: 41-54. doi: 10.1016/j.jot.2022.01.002. PMID: 35228996; PMCID: PMC8858911).
Известна группа изобретений, в которой предложены способ получения трансплантата на основе клеточных сфероидов из культивируемых клеток надкостницы и трансплантат для восстановления скелетных соединительных тканей субъекта, полученный указанным способом. Сфероиды в этих изобретениях предназначены для заполнения посттравматических дефектов скелетных тканей и стимуляции костной, в первую очередь трансплантационной регенерации (Патент №2744664 С1 Российская Федерация, МПК C12N 5/077, A61F 2/30. Способ производства сфероидов из культивируемых клеток надкостницы для обеспечения репаративного остеогенеза).
Чжао и соавторами разработали конструкцию тканеинженерной надкостницы, которая по данным авторов играет роль в остеогенезе и ангиогенезе при лечении экспериментальных костных дефектов. Их тканеинженерная надкостница представляет собой гибкую конструкцию, созданную путем объединения остеогенно-индуцированных мезенхимальных стволовых клеток (МСК) костного мозга кролика с бесклеточным каркасом подслизистой оболочки тонкой кишки свиньи. Третий пассаж МСК был выбран для остеогенной дифференцировки. МСК индуцировали в течение 3 недель в DMEM (Invitrogen), содержащей 10% FBS (FBS, Thermo FS) с добавлением 50 мг/л аскорбата натрия, 10 ммоль/л β-глицеролфосфата натрия и 10 нм/л дексаметазона (все от Sigma-Aldrich). при 37°С во влажной камере с 5% СО2. Листы бесклеточных каркасов подслизистой оболочки тонкой кишки свиньи расстилали на дно культуральных чашек, а затем дезинфицировали ультрафиолетовым светом в течение более чем 1 часа. Чистую фетальную бычью сыворотку добавляли к предварительно смоченным листам бесклеточных каркасов подслизистой оболочки тонкой кишки свиньи более чем на 12 часов. Затем на предварительно смоченную поверхность этих листов добавляли 500 мкл суспензии остеогенно-индуцированных МСК с плотностью 1×106 клеток/мл и инкубировали в течение 4 ч, чтобы обеспечить прикрепление клеток. К клеткам добавляли дополнительную среду DMEM с 10% фетальной бычьей сыворотки, и культуру инкубировали при 37°С в среде с 5% СО2 и влажностью 95% в течение 10-15 дней для образования биоактивного тканеинженерного конструкта. Среду меняли каждые 2-3 дня (Zhao L, Zhao J, Tuo Z, Ren G. Repair of long bone defects of large size using a tissue-engineered periosteum in a rabbit model. J Mater Sci Mater Med. 2021; 32(9): 105. Published 2021 Aug 21. doi: 10.1007/s10856-021-06579-7).
Однако известная тканеинженерная надкостница имеет следующие недостатки: мезенхимальные стволовые клетки костного мозга, несмотря на общее эмбриональное происхождение с камбиальными клетками надкостницы не являются тканеспецифичным типом клеток для этой соединительнотканной пластинки в живом организме. Известно, что PDCs демонстрируют гораздо более высокую скорость пролиферации, чем мезенхимальные стволовые клетки, происходящие из костного мозга, и эти клетки надкостницы поддерживают линейный рост в течение более чем 30 удвоений популяции, демонстрируя длинные теломеры без признаков старения примерно до 80 удвоений популяции, что существенно лучше аналогичных показателей, характерных для МСК костного мозга. В целом в постнатальном периоде PDCs проявляют большую клоногенность, способность к росту и дифференцировке в остеогенном и хондрогенном направлениях, чем мезенхимальные стволовые клетки костного мозга (Li, Chunyi, and Peter Fennessy. «The periosteum: a simple tissue with many faces, with special reference to the antler-lineage periostea». Biology direct vol. 16,1 17. 18 Oct. 2021, doi: 10.1186/s13062-021-00310-w).
В конструкции используется ксеногенный материал - бесклеточным каркасом подслизистой оболочки тонкой кишки свиньи, что несет все риски, связанные с любыми ксеногенными материалами.
Используемые клетки пред дифференцированы, подобное состояние снижает пластичность клеток, одновременным снижая пролиферативный и регенеративный потенциал клеток, что отрицательно сказывается на кинетике наращивания клеточной биомассы, уменьшается ее выход при остальных равных условиях культивировании. Использование в питательной среде фетальной бычьей сыворотки уменьшает эффективность культивирования из-за известных проблем со стандартизацией этого типа ксеногенных продуктов и ее ускоряющего влияния на старение культур клеток мезенхимного происхождения этой сыворотки.
Таким образом, несмотря на известные конструкции тканеинженерной надкостницы, все они характеризуются рядом недостатков и ограничений, а также остается много препятствий, в том числе, связанных с приживлением, участием в тканеспецифической полноценной репаративной регенерации скелетных тканей, недостаточным кровоснабжением конструктов, недостаточным питанием и клеточным дыханием пересаженных клеток в тканеинженерных конструктах на этапе приживления, а также малой эффективности индукции костной регенерации в живом организме на месте костного дефекта, поэтому сохраняется необходимость в разработке и создании новых способов и подходов к решению указанных проблем.
Задачей изобретения является создание способ получения тканеинженерной надкостницы из клеточных сфероидов для восстановления костных дефектов пациентов.
Технический результат при осуществлении изобретения достигается тем, что предложен способ получения тканеинженерной надкостницы из клеточных сфероидов для восстановления костных дефектов пациентов, характеризующийся тем, что коллагеновую мембрану размещают на дне культурального сосуда с боковой крышкой и пропитывают коллагеновую мембрану культуральной питательной средой, далее размещают на коллагеновой мембране сверху прямоугольную выполненную из титана раму с размером сечения 4×4 при высоте рамы 0,5 мм, рамой прижимают края коллагеновой мембраны к дну флакона, сверху на коллагеновую мембрану, ограниченную внутренними стенками рамы, укладывают горизонтальный слой клеточных сфероидов, состоящих из агрегированных культивированных аутологичных клеток надкостницы, в один ряд, культивируют сфероиды на поверхности коллагеновой мембраны в процессе созревания тканеинженерной конструкции в питательной среде: ДМЕМ или ДМЕМ/Ф12 450 мл, L-глутамина 292 мг, тромболизата 50 мл, пенициллина 100 ед./мл, стрептомицина 100 мкг/мл при 100% влажности и 5% содержанием СО2 в воздушной смеси над слоем питательной среды внутри культурального флакона, в течении 6-7 суток с заменой культуральной питательной среды не менее 2 раз. При этом используют гомосфероиды из культивированных адгезивных культивированных клеток камбиального слоя надкостницы в количестве 6000 клеток на сфероид или клеточные гетеросфероиды из адгезивных культивированных клеток надкостницы и мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга в соотношении 2:1 в количестве 6000-8000 клеток на сфероид. При этом используют в качестве культуральной питательной среды среду на основе ксеногенных фетальных сывороток животных, среду на основе аутологичной и аллогенных сывороток человека, среду на основе тромболизатов крови человека, бессывороточную синтетическую среду, бессывороточную синтетическую среду с добавлением индукторов остеогенной дифференцировки. При этом коллагеновая мембрана представляет собой стерильную децеллюляризованную надкостницу - ксеногенные быка, овцы, кролика или аллогенную надкостницу человека. При этом используют сфероиды с размером от 250 до 500 мкм.
Тканеинженерная надкостница выполнена в виде эластичной тонкой пластины коллагеновой мембраны и клеточных сфероидов. Клеточные сфероиды получены из аутологичных культивированных клеток надкостницы, прилипших, слившихся между собой и частично распластанных, проникших в межволоконные пространства коллагеновой мембраны с образованием единого объединяющего тканеинженерную конструкцию коллагенового остова. В состав трансплантата входит альгинатный гель (полученный путем смешивания 2% (масса/объем) альгината натрия (FMC BioPolymer) в 30 мМ Hepes, содержащем 150 мМ NaCl и 10 мМ KCl, с равным объемом раствора, содержащего 75 мМ CaCl2 в 10 мМ Hepes, содержащем 150 мМ NaCl и 10 мМ KCl, с помощью стерильного Y-образного смесителя. Гель отвердевал в течение 1 мин и имел модуль Юнга 0,17 МПа. Факторы роста TGF-β1 и FGF-2 были включены в состав геля в концентрации 10 нг/мл. Альгинатный гель готовится известным способом (Stevens М.М., Marini R.P., Schaefer D., Aronson J., Langer R., Shastri V.P. In vivo engineering of organs: the bone bioreactor. Proc Natl Acad Sci USA. 2005 Aug 9; 102(32): 11450-5. doi: 10.1073/pnas.0504705102. Epub 2005 Jul 29. PMID: 16055556; PMCID: PMC 1183576). Гель способствует реализации регенеративных потенций конструкта в живом организме и удерживал форму тканеинженерной надкостницы, заполняя свободное пространство в месте костного дефекта. Устройство позволяет обеспечить регенерацию костной ткани при костных дефектах, превышающих критический дефект, восстановить форму поврежденной кости.
Технический результат достигается тем, что тканеинженерная надкостница в ходе хирургической операции подшивается к интактной надкостнице, окружающей костный дефект, альгинатный гель с цитокинами TGF-β1 и FGF-2 заполняет пространство между тканеинженерной надкостницей и краями травмированной и восстанавливаемой кости. Место костного дефекта с установленной тканеинженерной надкостницей фиксируют (иммобилизуют) с целью правильного сращения костей, костные отломки должны быть сопоставлены и зафиксированные с помощью медицинских устройств, в том числе чрескостных компрессионно-дистракционных аппаратов до полной регенерации костной ткани. Проводится послойное ушивание раны.
Сущность предложенного способа получения тканеинженерной надкостницы из клеточных сфероидов для восстановления костных дефектов пациентов поясняется рисунком, где на фиг. 1 показан продольный срез тканеинженерной надкостницы на основе клеточных сфероидов для восстановления костей, свернутая в форме трубы и подшитая к интактной надкостнице опилов костей по краям посттравматического костного дефекта: 1 - клеточный сфероид; 2 - коллагеновая мембрана; 3 - альгинатный гель с цитокинами; 4 - хирургический шов для соединения тканеинженерной надкостницы с интактной надкостницей костных опилов; 5 - компактное костное вещество диафиза длинной трубчатой кости; 6 - костномозговой канал, заполненный костным мозгом; 7 - интактная надкостница опила кости.
Сборка тканеинженерной надкостницы из агрегатов аутологичных культивированных клеток надкостницы - клеточных сфероидов, объединенных с коллагеновой мембраной и альгинатного геля с цитокинами, обладающего остео- и хондрогенным регенеративными потенциалами включает следующие этапы:
а) размещение на дне культурального сосуда с боковой крышкой коллагеновой мембраны и ее пропитывание культуральной питательной средой:
б) установка титановой рамы (размер сечения бруска рамы - боковая сторона - 0,5 мм ширина - 4 мм, скрепленных между собой под прямым углом) сверху на коллагеновую мембрану, мембрана расправляется и рамой прижимается ко дну культурального флакона, во флакон вносится культуральная питательная среда, размер титановой рамы соответствует размеру коллагеновой мембраны;
в) в пространство, образуемое коллагеновой мембраной и внутренними боковыми краями титановой рамы, проводится укладка одного ряда клеточных сфероидов из аутологичных культивированных клеток надкостницы, для чего клеточные сфероиды в суспензии с помощью аппликатора наносятся на коллагеновую мембрану, сфероиды осаждаются под собственным весом, распределяются титановой полоской длина которой соответствует размерам раны по поверхности мембраны до полного заполнения слоя в 1 сфероид по высоте по всей площади мембраны, ограниченной внутренними краями рамы, для выравнивания слоя сфероидов полоска перемещается по верхней поверхности ребер рамы;
г) 3D культивирование сфероидов на поверхности коллагеновой мембраны проводиться в течении 5 суток в питательной среде состава: ДМЕМ (или ДМЕМ/F12) 450 мл, L-глутамин 292 мг, 50 мл тромболизата, пенициллин 100 ед./мл, стрептомицин 100 мкг/мл (при 100% влажности над слоем питательной среды внутри культурального флакона и 5% СО2 в воздушной газовой смеси), замена питательной среды во флаконе проводиться не менее 1 раз в 3 суток;
д) края коллагеновой мембраны прошиваются хирургическими рассасывающимися нитями для последующего крепления к свободным краям надкостницы реципиента вокруг костного дефекта при трансплантации этой тканеинженерной конструкции, слой сфероидов располагается снаружи, коллагеновая мембрана обращена к центру костного дефекта, внутреннее пространство ограниченное коллагеновой мембраной и поверхностями костного дефекта заполняется с помощью шприца гелем, который получен путем смешивания 2% (масса/объем) альгината натрия (FMC BioPolymer) в 30 мМ Hepes, содержащем 150 мМ NaCl и 10 мМ KCl, с равным объемом раствора, содержащего 75 мМ CaCl2. в 10 мМ Hepes, содержащем 150 мМ NaCl и 10 мМ KCl, с помощью стерильного Y-образного смесителя, гель отверждается в течение 1 мин и имеет модуль Юнга 0,17 Мпа, в составе геля присутствуют факторы роста TGF-β1 и FGF-2 в количестве 10 нг/мл каждый.
Использование сфероидов, позволяет усилить регенеративный потенциал конструкции за счет преимуществ, присущих сфероидам по сравнению с разрозненными клетками в составах суспензий, а именно: увеличение жизнеспособности клеток в сфероидах; микросреды внутри сфероидов, приближенной к ин виво; высокой клеточной емкости для реконструкции и инициации регенерации; большая биосовместимость; способность к механотрансдукции; способность к биоинтеграции и органотипичной клеточной дифференцировке. Ассоциация сфероидов со скаффолдами - это новейший подход в тканевой инженерии. Каркасы в этом случае должны предоставлять внеклеточный матрикс, в котором клетки сфероидов могут прикрепляться, пролиферировать и дифференцироваться, при этом каркас обеспечивает механическую прочность конструкции и ее гибкость, а сфероиды оптимизируют внутриклеточную передачу сигналов, улучшая процесс дифференцировки, что, в свою очередь, позволяет клеткам организовываться в более сходную структуру тканей in vivo. В данном изобретении тканеинженерная надкостница предназначена для инициации костной регенерации по типу поднадкостничной регенерации, описанной в экспериментальной модели при изучении костеобразовательных возможностей надкостницы диафиза трубчатых костей (Студитский А. Н. Восстановление органов и тканей животного организма (биологическая теория регенерации): стенограмма публичной лекции, прочитанной в Центральном лектории Общества в Москве. - М.: Знание, 1952. - 40 с. (Всесоюзное общество по распространению политических и научных знаний. Серия 2. 1952. №58). Условиями костной регенерации в этой модели являлись: вылущивание кости с сохранением хрящей и надкостницы; надкостница и суставные хрящи оставляются на своем прежнем месте; экспериментально удаляли («вылущивание из-под надкостницы») плечевых, бедренных, берцовых костей кроликов, собак, кур; формируется «грубая модель будущей кости», которая состоит в значительной мере из хряща; при дальнейшем наблюдении под влиянием определенной мышечной нагрузки - движений - из грубой костно-хрящевой модели возникает сформированная плечевая, бедренная или берцовая кость со всеми особенностями строения.
Разработанная тканеинженерная конструкция надкостницы позволяет реализовать биомиметический подход в тканевой инженерии, когда продукт при трансплантации инициирует костную регенерацию по сценарию поднадкостничной остеорегенерации, и представляет собой частный вариант тканевой инженерии вторичного развития.
Реализация предложенного способа получения тканеинженерной надкостницы из клеточных сфероидов для восстановления костных дефектов пациентов иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1. У кроликов-самцов калифорнийской породы массой 1 кг в ходе экспериментальной операции иссекли лоскут надкостницы с передней поверхности большеберцовой кости. Из надкостницы выделили клеточную культуру адгезивных клеток. Клеточные сфероиды стандартного размера получили с использованием трехмерного культивирования клеток надкостницы в агарозных лунках (MicroTissues Inc.®). В качестве скаффолда использовали коллагеновую мембрану ТМО «ЛИОПЛАСТ-С», которую извлекли из стерильной упаковки и разместили на дне культурального флакона (матраса для клеточных культур) с поддающейся повторной герметизации боковой крышкой. Такой флакон позволил производить любые манипуляции с тканеинженерной конструкцией в стерильных условиях внутри ламинарного шкафа. Для удержания коллагеновой мембраны в правильном положении проводили размещение титановой рамы сверху на коллагеновую мембрану, мембрану расправили прижатием рамой ко дну культурального флакона, причем размер титановой рамы соответствует размеру коллагеновой мембраны таким образом, чтобы под рамой оказывалась лишь узкая полоска по краям мембраны. Пространство, образуемое коллагеновой мембраной и внутренними боковыми краями титановой рамы использовали для внесения сфероидов. Проводили укладку одного ряда клеточных сфероидов из аутологичных культивированных клеток надкостницы, клеточные сфероиды в суспензии с помощью аппликатора нанесли сверху на коллагеновую мембрану, сфероиды осадили под собственным весом, сфероиды распредели по поверхности коллагеновой мембраны титановой полоской, длина которой соответствует размерам рамы. По поверхности мембраны провели полное заполнение слоя сфероидов в 1 сфероид по высоте по всей площади верхней поверхности мембраны, ограниченной внутренними краями рамы, для выравнивания слоя сфероидов титановую полоску переместили по верхней поверхности ребер рамы несколько раз до равномерного распределения сфероидов. Для закрепления сфероидов и их частичного проникновения внутрь коллагеновой мембраны провели 3D культивирование сфероидов на поверхности коллагеновой мембраны. При этом происходит тканевое слияние сфероидов с объединением коллагенового остова сфероидов между собой в единый пласт. Этот этап 3D культивирования провели в течение 5 суток в питательной среде состава: ДМЕМ (или ДМЕМ/F12) 450 мл, L-глутамин 292 мг, 50 мл тромболизата (в качестве тромболизата у 3 животных использовали тромболизат кроликов, а у 3 кроликов - тромболизат тромбоцитов человека (PLTGold® Human Platelet Lysate Merck), пенициллин 100 ед./мл, стрептомицин 100 мкг/мл (при 100% влажности над слоем питательной среды внутри культурального флакона и 5% CO2 в воздушной газовой смеси. Замену питательной среды во флаконе проводили не менее 1 раз в 3 суток. Смену среды осуществляли путем аккуратной аспирации питательной среды с помощью пипеток для сохранения положения сфероидов на поверхности мембраны. Края коллагеновой мембраны, свободные от слоя сфероидов, которые были под титановой рамкой, прошили хирургическими рассасывающимися нитями для возможности последующего крепления тканеинженерной конструкции к свободным краям надкостницы реципиентного ложа вокруг костного дефекта при трансплантации созданной тканеинженерной конструкции в живой организм. Слой сфероидов расположили снаружи, вне зависимости, в трубчатую конструкцию сворачивали коллагеновую мембрану, либо если использовали в виде заплатки. Коллагеновая мембрана всегда обращена к центру костного дефекта, внутреннее пространство ограниченное коллагеновой мембраной и поверхностями костного дефекта заполнили с помощью шприца гелем, который получили путем смешивания 2% (масса/объем) альгината натрия (FMC BioPolymer) в 30 мМ Hepes, содержащего 150 мМ NaCl и 10 мМ KCl, с равным объемом раствора, содержащего 75 мМ CaCl2. в 10 мМ Hepes, содержащем 150 мМ NaCl и 10 мМ KCl, с помощью стерильного Y-образного смесителя. Гель отверждается в течение 1 мин и имеет модуль Юнга 0,17 Мпа, в составе геля присутствуют факторы роста TGF-β1 и FGF-2 в количестве 10 нг/мл каждый. Этот гель необходим для заполнения пространства костного дефекта и поддержания тканеинженерной конструкции в расправленном состоянии. Фактически гель необходим для реализации остеогенных потенций тканеинженерной конструкции, свободное пространство под мембраной или между мембраной и костной тканью восстанавливаемой кости, заполненное альгинатным гелем, является по сути in vivo биореактором, внутри которого протекает репаративный остеогенез. После созревания тканеинженерная надкостница представляет собой трансплантат -биоискусственную надкостницу в виде эластичной тонкой пластины из коллагеновой мембраны и клеточных сфероидов из аутологичных культивированных клеток надкостницы, прилипших к мембране, слившихся между собой (тканевое слияние) и частично распластанных, клетки сфероидов проникают в межволоконные пространства коллагеновой мембраны, продуцируют в том числе коллагеновые волокна, преимущественно 1 типа, с образованием единого, объединяющего тканеинженерную конструкцию, коллагенового остова.
Для исследований остеогенных свойств тканеинженерной надкостницы, надкостница сворачивали в трубочку, заполняли альгинатным гелем и помещали в диффузную камеру. Камеры позволяют пассивно диффундировать нутриентам и сигнальным молекулам реципиента, но не вызывают иммунного ответа. Фильтры также предотвращают прямое взаимодействие между клетками донора и реципиента. Камеры были изготовлены по известной технологии (Friedenstein AJ, Chailakhyan RK, Gerasimov UV. Bone marrow osteogenic stem cells: in vitro cultivation and transplantation in diffusion chambers. Cell Tissue Kinet. 1987 May; 20(3): 263-72. doi: 10.1111/j.1365-2184.1987.tb01309.x. PMID: 3690622).
Камеры трансплантировали в организм кроликов, причем тканеинженерная надкостница содержала для каждого кролика аутологичный клеточный материал. Камеры пересаживали кроликам в бедро в область межмышечных фасций (межмышечных перегородок) по 1 камере одному животному. Через 75 суток при гистологическом исследовании тканей внутри диффузной камеры обнаружили косно-хрящевой регенерат.
Пример 2. У кроликов под общим наркозом в условиях операционной производили хирургический доступ к большеберцовой кости кролика. Иссекли лоскут надкостницы, которую в культуральной питательной среде с антибиотиками передали в лабораторию клеточных технологий.
В лабораторных условиях производили тканеинженерную надкостницу описанным выше способом, но клеточные сфероиды, собранные в агарозных лунках, состояли из смеси аутологичных культивированных клеток камбиального слоя надкостницы и культивированных мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга в соотношении 2:1 в количестве 6000 клеток на сфероид. При готовности тканеинженерной надкостнице к пересадке начинали второй этап эксперимента. У того же кролика под общим наркозом в условиях операционной с помощью хирургической проволочной пилы Джильи выпиливали в нижней трети диафиза большеберцовой кости часть (сегмент) длиной 3 см, сформировали костный дефект, превышающий критический размер. Наложили аппарат внешней фиксации (типа аппарата Илизарова). В области костного дефекта тканеинженерную надкостницу, сложенную в форме трубы с прошитыми шовным рассасывающимся материалом двумя смыкающимися краями подшили к краям интактной надкостницы костных опилов по типу конец в конец. Образуемое тканеинженерной надкостницей внутреннее пространство заполнили описанным выше альгинатным гелем с цитокинами инъекционным путем через прокол тканеинженерной надкостницы иглой заполненного гелем шприца. При надавливании на поршень шприца пространство, ограниченное тканеинженерной надкостницей, медленно заполнили гелем, способствуя расправлению мембраны тканеинженерной надкостницы и сохранения внутреннего пространства, ограниченного коллагеновой мембраной со сфероидами. Произвели послойное ушивание раны с наложением асептической повязки. Животное выводили из наркоза и содержали в виварии в отдельной клетке.
Обнаружено формирование регенерата скелетных тканей под тканеинженерной надкостницей между костными отломками с их объединением в единый орган. Контроль роста регенерата проводили в динамике в течение 6 месяцев с помощью компьютерной томографии, гистологических и иммуногистохимических исследований.
Пример 3. Кролику с хирургическим моделированием посттравматической потери окружности большеберцовой кости на 55% и длиной 3 см подшили тканеинженерную надкостницу к интактной надкостнице в виде заплатки. Под заплаткой внутреннее свободное пространство заполнили альгинатным гелем с цитокинами инъекционным путем через прокол тканеинженерной надкостницы иглой шприца. Заплаткой восстанавливили целостность соединительнотканного чехла надкостницы окружающей кость. Провели послойное ушивание раны. Животное выводили из наркоза и содержали в виварии в отдельной клетке, фиксирующие аппараты не накладывали. В эксперименте использовали 6 кроликов опытной группы с установкой тканеинженерной надкостницей и 6 кроликов контрольной группы, в которой только формировали костный дефект.
Обнаружили формирование регенерата скелетных тканей под тканеинженерной надкостницей. Контроль формирования регенерата проводили в динамике в течение 9 месяцев с помощью компьютерной томографии, гистологических и иммуногистохимических исследований.
Изобретение относится к области медицины, а именно к тканевой инженерии, регенеративной медицине, ортобиологии, травматологии и ортопедии, отоларингологии, пластической и восстановительной хирургии. Представлен способ получения тканеинженерной надкостницы из клеточных сфероидов для восстановления костных дефектов пациентов, характеризующийся тем, что коллагеновую мембрану размещают на дне культурального сосуда с боковой крышкой и пропитывают культуральной питательной средой. Далее размещают на коллагеновой мембране сверху прямоугольную выполненную из титана раму с размером сечения 4×4 при высоте рамы 0,5 мм. Рамой прижимают края коллагеновой мембраны ко дну флакона, сверху на коллагеновую мембрану, ограниченную внутренними стенками рамы, укладывают горизонтальный слой клеточных сфероидов, состоящих из агрегированных культивированных аутологичных клеток надкостницы, в один ряд. Затем культивируют сфероиды на поверхности коллагеновой мембраны в процессе созревания тканеинженерной конструкции в питательной среде: ДМЕМ или ДМЕМ/Ф12 450 мл, L-глутамина 292 мг, тромболизата 50 мл, пенициллина 100 ед./мл, стрептомицина 100 мкг/мл при 100% влажности и с 5% содержанием СО2 в воздушной смеси над слоем питательной среды внутри культурального флакона, в течение 6-7 суток с заменой культуральной питательной среды не менее 2 раз. Достигается эффективность приживления и регенерации скелетных тканей. 4 з.п. ф-лы, 1 ил., 3 пр.
1. Способ получения тканеинженерной надкостницы из клеточных сфероидов для восстановления костных дефектов пациентов, характеризующийся тем, что коллагеновую мембрану размещают на дне культурального сосуда с боковой крышкой и пропитывают коллагеновую мембрану культуральной питательной средой, далее размещают на коллагеновой мембране сверху прямоугольную выполненную из титана раму с размером сечения 4×4 при высоте рамы 0,5 мм, рамой прижимают края коллагеновой мембраны к дну флакона, сверху на коллагеновую мембрану, ограниченную внутренними стенками рамы, укладывают горизонтальный слой клеточных сфероидов, состоящих из агрегированных культивированных аутологичных клеток надкостницы, в один ряд, культивируют сфероиды на поверхности коллагеновой мембраны в процессе созревания тканеинженерной конструкции в питательной среде: ДМЕМ или ДМЕМ/Ф12 450 мл, L-глутамина 292 мг, тромболизата 50 мл, пенициллина 100 ед./мл, стрептомицина 100 мкг/мл при 100% влажности и с 5% содержанием СО2 в воздушной смеси над слоем питательной среды внутри культурального флакона, в течение 6-7 суток с заменой культуральной питательной среды не менее 2 раз.
2. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что используют гомосфероиды из культивированных адгезивных культивированных клеток камбиального слоя надкостницы в количестве 6000 клеток на сфероид или клеточные гетеросфероиды из адгезивных культивированных клеток надкостницы и мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга в соотношении 2:1 в количестве 6000-8000 клеток на сфероид.
3. Способ по п. 2, характеризующийся тем, что используют в качестве культуральной питательной среды среду на основе ксеногенных фетальных сывороток животных, среду на основе аутологичной и аллогенных сывороток человека, среду на основе тромболизатов крови человека, бессывороточную синтетическую среду, бессывороточную синтетическую среду с добавлением индукторов остеогенной дифференцировки.
4. Способ по п. 2, характеризующийся тем, что коллагеновая мембрана представляет собой стерильную децеллюляризованную надкостницу - ксеногенные материалы быка, овцы, кролика или аллогенную надкостницу человека.
5. Способ по п. 2, характеризующийся тем, что используют сфероиды с размером от 250 до 500 мкм.
