ПРИМЕНЕНИЕ ПЕГИЛИРОВАННОГО РЕКОМБИНАНТНОГО ХИМЕРНОГО ФАКТОРА РОСТА ФИБРОБЛАСТОВ-21 МЫШИ ИЛИ ЕГО ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИ ПРИЕМЛЕМОЙ СОЛИ В СОСТАВЕ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ НЕАЛКОГОЛЬНОГО СТЕАТОГЕПАТИТА Российский патент 2022 года по МПК A61K38/18 A61K47/60 A61P1/16 

Область техники изобретения

Настоящее изобретение относится к области биомедицины и, в частности, относится к применению пегилированного рекомбинантного химерного фактора роста фибробластов-21 мыши или его фармацевтически приемлемой соли в составе лекарственных средств для лечения неалкогольного стеатогепатита.

Предпосылки изобретения

Неалкогольную жировую болезнь печени (NAFLD), также известную как жировая инфильтрация печени, вызывает множество причин. При данном заболевании поражения преимущественно возникают в дольке печени, для которой характерен стеатоз клеток паренхимы печени и накопление триглицеридов (TG) (содержание жира в тканях печени составляет более 5% от сырой массы печени, либо у более 1/3 клеток печени проявляется стеатоз, подтвержденный гистологическим исследованием). С точки зрения патологических изменений NAFLD сходна с алкогольной болезнью печени (ALD), за исключением отсутствия в анамнезе чрезмерного употребления алкоголя (эквивалентно потреблению этанола для мужчины <140 г/неделя, женщины <70 г/неделя) и других клинических патологических синдромов, вызванных специфическими факторами, вызывающими повреждение печени. NAFLD и NASH стали основными причинами заболеваний печени в западных странах за последние 20 лет. Без своевременного контроля NAFLD может легко прогрессировать в NASH по мере продолжения избыточного накопления жира. Кроме избыточного накопления жира NASH отличается от NAFLD наличием инфильтрации воспалительных клеток в печень, степенью фиброза печени и степенью повреждения клеток печени. Кроме того, если NASH продолжает прогрессировать без эффективного контроля, это с высокой вероятностью приведет к фиброзу, циррозу и даже раку печени.

В настоящее время отсутствуют такие лекарственные средства для лечения NASH, которые можно было бы безопасно и эффективно применять в клинической практике в течение длительного времени.

Фактор роста фибробластов-21 (FGF-21) представляет собой еще один регулятор обмена веществ, недавно открытый in vivo. Он относится к семейству FGF и специфически воздействует на клетки печени, жировые клетки и островковые клетки поджелудочной железы. FGF-21 может эффективно и безопасно регулировать уровень глюкозы в крови и уровень липидов в крови, независимо от инсулина, что привлекло большое внимание исследователей. Также сообщалось, что FGF-21 может эффективно предупреждать и лечить NAFLD, индуцированную in vitro (Liu Min et al., Effect of fibroblast growth factor-21 on lipid metabolism of non-alcoholic fatty liver cell model induced in vitro. Journal of Jilin University, May 2012, Vol. 38, No. 3, 477-481.)

В CN2013101152100 (номер публикации CN103193878A; заявитель: Harbin Boao Biomedical Technology Development Co., Ltd.) раскрыт новый мутантный FGF человека пролонгированного действия и его конъюгат с полиэтиленгликолем (PEG). Структура белка из указанного конъюгата FGF-PEG показана в последовательности 3, а способ его получения показан в варианте осуществления 4. Позднее авторы изобретения дали данному конъюгату название FG (английское название: пегилированный рекомбинантный химерный фактор роста фибробластов-21 человека-мыши или сокращенно PEG-hmFGF21).

Функции FG заключаются в регуляции уровня глюкозы в крови, снижении уровня триглицеридов в крови и регуляции содержания общего холестеринаи т.д. Однако до настоящего времени не было сообщений о применении FG в лечении NASH.

Описание изобретения

В данном документе раскрыто применение мутантного FGF мыши пролонгированного действия в составе лекарственных средств для лечения NASH.

В контексте данного документа мутантный FGF мыши пролонгированного действия относится к пегилированному рекомбинантному химерному фактору роста фибробластов-21мышиили его фармацевтически приемлемой соли, имеющим последовательность, изложенную в последовательности 3, описанной в патентной заявке CN2013101152100 (номер публикации: CN103193878A).

В контексте данного документа применение предусматривает, что пегилированный рекомбинантный химерный фактор роста фибробластов-21мышиили его фармацевтически приемлемая соль могут снижать уровни аланин аминотрансферазы (ALT) и аспартатаминотрансферазы (AST) в сыворотке крови, уменьшать стеатоз и лобулярное воспаление, снижать степень гепатоцеллюлярной баллонирующей дистрофии и уменьшать поражение печени.

В контексте данного документа NASH охватывает без ограничений индуцированный гепатитом NASH, индуцированный ожирением NASH, индуцированный диабетом NASH, индуцированный инсулинорезистентностью NASH, индуцированный гипертриглицеридемией NASH, индуцированный абеталипопротеинемией NASH, NASH, индуцированный болезнью накопления гликогена, NASH, индуцированный болезнью Уэйка, NASH, индуцированный болезнью Вольмана, и индуцированный липодистрофией NASH и т.д.

В контексте данного документа лекарственные средства подразумевают фармацевтические композиции, содержащие пегилированный рекомбинантный химерный фактор роста фибробластов-21мыши или его фармацевтически приемлемую соль в качестве активного фармацевтического ингредиента. Фармацевтические композиции могут быть получены в виде любой фармацевтически приемлемой лекарственной формы, включая таблетки, капсулы, гранулы, пилюли, порошки, мазь, препарат, полученный с помощью сублимационной сушки, пылеобразные порошки, растворы, инъекционные препараты, суппозитории, распыляемые растворы, капли, пластыри и драже. Лекарственные средства по настоящему изобретению предпочтительно получают в виде инъекционных лекарственных средств, таких как порошки для приготовления инъекционного препарата или жидкие инъекционные препараты. Жидкие инъекционные препараты охватывают водные инъекционные препараты, инъекционные препараты, содержащие органический растворитель, суспензионные инъекционные препараты и т.д.

Препараты фармацевтических композиций для перорального применения могут содержать традиционные вспомогательные вещества, такие как связующее средство, заполняющее объемообразующее средство, разбавляющее средство, средство, содействующее прессованию таблеток, смазывающее средство, средство для улучшения распадаемости таблеток, окрашивающее средство, ароматизирующее средство и смачивающее средство. К подходящим заполняющим объемообразующим средствам относятся крахмал, сахароза, целлюлоза, маннит, лактоза и другие аналогичные средства. К подходящим средствам для улучшения распадаемости таблеток относятся крахмал, поливинилпирролидон и производные крахмала, такие как крахмалгликолят натрия. К подходящим смазывающим средствам относится, например, стеарат магния. Твердая форма композиций для перорального применения может быть получена с помощью традиционных способов, предусматривающих смешивание, заполнение, прессование таблеток и т.д.

Многократное смешивание позволяет активной фармацевтической субстанции распределиться по всему объему композиций, содержащих большое количество заполняющего объемообразующего средства. К общепринятым вспомогательным веществам относятся маннит, сорбит, пиросульфит натрия, гидросульфит натрия, тиосульфат натрия, цистеингидрохлорид, тиогликолевая кислота, метионин, витамин C, динатриевая соль ЭДТА, эдетат динатрия кальция, карбонаты щелочных металлов и их водные растворы, ацетаты щелочных металлови их водные растворы, фосфаты щелочных металлов и их водные растворы, соляная кислота, уксусная кислота, серная кислота, фосфорная кислота, аминокислота, хлорид натрия, хлорид калия, лактат натрия, ксилит, мальтоза, глюкоза, фруктоза, декстран, глицин, крахмал, сахароза, лактоза, D-маннит, производные кремнийорганических соединений, целлюлоза и ее производные, альгинат, желатин, поливинилпирролидон, глицерин, Твин 80, агар, карбонат кальция, бикарбонат кальция, поверхностно-активное вещество, полиэтиленгликоль, циклодекстрин, β-циклодекстрин, фосфолипиды, каолин, тальк, стеарат кальция, стеарат магния и т.д.

Применение и дозировка фармацевтической композиции по настоящему изобретению определяются, исходя из стадий заболевания во время применения. Например, фармацевтическую композицию можно применять 1-6 раз в день в количестве 1-10 доз за каждый раз, при этом каждая доза может составлять 0,1 мг-1000 мг.

Применение пегилированного рекомбинантного химерного факторароста фибробластов-21 мыши, предусмотренное настоящим изобретением, характеризуется следующими преимуществами.

Пегилированный рекомбинантный химерный фактор роста фибробластов-21мышиможет значимо снижать уровни ALT и AST в сыворотке крови, уменьшать стеатоз и лобулярное воспаление, снижать степень гепатоцеллюлярной баллонирующей дистрофии и уменьшать патологический показатель поражения печени. Конечные результаты показывают, что настоящее изобретение можно применять для лечения NASH с эффективностью, которая превосходит таковую из предшествующего уровня техники.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение теперь будет дополнительно описано с помощью следующих вариантов осуществления.

Способ получения FG, применяемый в настоящем изобретении, описан в варианте осуществления 4 из CN2013101152100 (номер публикации: CN103193878A).

Вариант осуществления 1. Получение водных инъекционных препаратов

1. Состав: белок FG (концентрация: 10мг/мл), гистидин (фармацевтическая степень чистоты, концентрация: 10мг/мл), буфер на основе лимонной кислоты-цитрата натрия (20мМ цитрат натрия-лимонная кислота, 100мМ NaCl, pH5,5±0,1).

2. Способ получения

1) получают для дальнейшего использования 12,5мг/мл раствор белка FG в буферной системе на основе лимонной кислоты-цитрата натрия и pH доводят до 5,5±0,1;

2) получают для дальнейшего использования 50мг/мл маточный раствор гистидина в буферной системе на основе лимонной кислоты-цитрата натрия, pH доводят до 5,5±0,1;

3) смешивают раствор белка FG из стадии 1) с маточным раствором гистидина из стадии 2) при объемном соотношении 4:1 и переносят 500мкл смешанного раствора в 2-мл пенициллиновые флаконы.

Экспериментальный пример 1. Терапевтический эффект FG в диапазоне эффективных доз на мышиной модели NASH, индуцированного рационом с MCD (дефицит метионина-холина).

В данном эксперименте использовали мышиную модель NASH, индуцированного рационом с MCD, в первую очередь потому, что данная модель используется уже более 40 лет и процесс ее получения достаточно хорошо отработан. Кроме того, для состояния, вызываемого данным рационом, получено множество подтверждений с точки зрения скорости возникновения (т.е. симптомы, обусловленные NASH, могут появиться через приблизительно 4 недели) и эффективности (т.е. индуцируемые симптомы очень похожи на симптомы NASH у человека).

1. Способ проведения эксперимента

После адаптирующего кормления в течение двух недель самцов мышей C57BL возрастом восемь недель начинали кормить рационом с MCD. После кормления рационом с MCD в течение двух недель мышей случайным образом разделяли на 4группы в соответствии с массой тела: группу обработки растворителем, группу FGF-21, группу с низкой дозой FG, группу с высокой дозой FG. В каждую группу входило по 10 мышей, и им ежедневно в течение двух недель вводили подкожную инъекцию.

Подробные сведения о распределении животных по группам и введении приведены в таблице 1.

Таблица 1. Распределение животных по группам и введение

Группа n Доза Период введения (дни) Группа обработки растворителем 10 Растворитель в том же объеме 14 дней Группа FGF-21 10 0,4 мг/кг/день 14 дней Группа с низкой дозой FG 10 0,125 мг/кг/день 14 дней Группа с высокой дозой FG 10 2 мг/кг/день 14 дней

После окончания введения мышей умерщвляли и их соответствующие ткани извлекали для дальнейших анализов.

2. Определение индексов

2.1. Сыворотку крови отделяли и в ней определяли различные биохимические индексы: уровни ALT и AST в сыворотке определяли с помощью набора для общего клинического анализа (предоставлен Shanghai Shensuo-UNF Medical. Diagnostic Articles Co., Ltd).

2.2. Гистоморфологическое исследование ткани печени мыши

Морфологические изменения в печени мыши наблюдали за счет окрашивания гематоксилин-эозином. Специфические стадии были следующими. Свежеизвлеченный небольшой фрагмент печени фиксировали в растворе формалина в течении ночи и после постепенного обезвоживания заливали в парафин, а затем получали срезы толщиной 5мкм. Срезы печени окрашивали гематоксилин-эозином и, в заключение, морфологию ткани печени каждой мыши исследовали под микроскопом.

2.3. Обнаружение волокон коллагена в ткани печени мыши

Отложение коллагена в печени мыши исследовали с помощью способа окрашивания Сириусом красным (SR). Специфические стадии были следующими. Срезы печени из парафиновых блоков окрашивали с помощью набора для окрашивания Сириусом красным и, в заключение, фиброз ткани печени каждой мыши исследовали под микроскопом.

В клинической практике существует система количественных показателей для определения тяжести NASH, т.е. показатели Сети центров исследования NASH, в основном охватывающая три параметра: стеатоз, лобулярное воспаление и баллонирующую дистрофию. В данном эксперименте из каждой группы случайным образом отбирали по пять мышей и в пределах окрашенных гематоксилин-эозином срезов ткани печени соответствующей мыши случайным образом выбирали по пять полей зрения микроскопа, на основании которых оценивали показатели по трем вышеприведенным параметрам, чтобы объективно оценить степень гепатита у мышей в каждой группе.

3. Для определения статистических показателей и анализа данных использовали статистическое программное обеспечение SPSS16.0. Для сравнения разницы между двумя группами данных использовали t-критерий. Для сравнения различий между множественными группами данных использовали однофакторный дисперсионный анализ и анализ множественной линейной регрессии. Разница была статистически значимой с P<0,05.

4. Результаты экспериментов

4.1. Влияние FG на уровень ALT в сыворотке крови показано в таблице 2.

Таблица 2. Влияние FG на уровень ALT в сыворотке крови

Группа обработки растворителем Группа FGF-21 Группа с низкой дозой FG Группа с высокой дозой FG ALT в сыворотке крови (Ед/л) 199,8±30,8 100,2±20,6* 51,1±7,7***Δ 39,9±4,1***Δ

Данные, приведенные в таблице, представляют собой среднее значение ± стандартная ошибка; (2) * в сравнении с группой обработки растворителем P<0,05; *** в сравнении с группой обработки растворителем P<0,001; Δ в сравнении с группой FGF 21 P<0,05.

Как показано в таблице 2, после двух недель обработки уровень ALT у мышей с NASH в группе FGF 21 понизился до 1 00,2±20,6 Ед/л, и наблюдалась значимая разница в сравнении с уровнем ALT в группе обработки растворителем, составляющим 199,8±30,8 Ед/л (P<0,05). Уровни ALT в группе с низкой дозой FG и группе с высокой дозой FG понизились до 51,1±7,7 Ед/л и 39,9±4,1 Ед/л соответственно, и обнаружили значимую разницу в сравнении с группой обработки растворителем (P<0,001), а также группой FGF 21 (P<0,05).

Эти результаты означают, что FG не только является эффективным в снижении уровней ALT, но, в данном случае, также является более эффективным, чем FGF 21.

4.2. Влияние FG на уровень AST в сыворотки крови показано в таблице 3.

Таблица 3. Влияние FG на уровень AST в сыворотке крови

Группа обработки растворителем Группа FGF-21 Группа с низкой дозой FG Группа с высокой дозой FG ALT в сыворотке крови (Ед/л) 196,9±29,3 115,7±15,9* 74,4±7,9**Δ 73,7±7,8**Δ

(1) Данные, приведенные в таблице, представляют собой среднее значение ± стандартная ошибка; (2) * в сравнении с группой обработки растворителем P<0,05; ** в сравнении с группой обработки растворителем P<0,01; Δв сравнении с группой FGF-21 P<0,05.

Как показано в таблице 3, после двух недель обработки уровень AST у мышей с NASH в группе FGF-21 понизился до 115,7±15,9 Ед/л, и наблюдалась значимая разница в сравнении с уровнем AST в группе обработки растворителем, составляющим 196,9±29,3 Ед/л (P<0,05). Уровни AST в группе с низкой дозой FG и группе с высокой дозой FG понизились до 74,4±7,9 Ед/л и 73,7±7,8 Ед/л соответственно, и обнаружили значимую разницу в сравнении с группой обработки растворителем (P<0,01), а также группой FGF-21 (P<0,05). Эти результаты означают, что FG не только является эффективным в снижении уровней ALT, но, в данном случае, также является более эффективным, чем FGF-21.

4.3. Эффект уменьшения клинических показателей NASH показан в таблице 4.

Таблица 4. Эффект уменьшения клинических показателей NASH

Стеатоз Лобулярное воспаление Баллонирующая дистрофия Суммарный показатель Группа обработки растворителем 2,2±0,2 2,6±0,1 1,3±0,1 6,0±0,21 Группа FGF-21 2,0±0,3 2,1±0,2 0,9±0,1** 4,7±0,5* Группа с низкой дозой FG 1,8±0,3 0,7±0,1***ΔΔΔ 0,7±0,1** 3,2±0,4***Δ Группа с высокой дозой FG 0,9±0,3**Δ 0,6±0,2***ΔΔΔ 0,4±0,1***ΔΔ 1,9±0,5***ΔΔ

(1) Данные, приведенные в таблице, представляют собой среднее значение ± стандартная ошибка; (2) * в сравнении с группой обработки растворителем P<0,05; ** в сравнении с группой обработки растворителем P<0,01; *** в сравнении с группой обработки растворителем P<0,001; Δ в сравнении с группой FGF-21 P<0,05; ΔΔ в сравнении с группой FGF-21 P<0,01; ΔΔΔ в сравнении с группой FGF-21 P<0,001.

Как показано в таблице 4, после двух недель обработки как показатель баллонирующей дистрофии, так и суммарный показатель NASH в группе FGF-21 значимо уменьшился (P<0,05) в сравнении с группой обработки растворителем, в то же время значимого уменьшения показателей лобулярного воспаления не наблюдали (P>0,05). В сравнении с группой обработки растворителем наблюдали значимое уменьшение как в группе с низкой дозой FG, так и в группе с высокой дозой FG с точки зрения показателей лобулярного воспаления, показателей баллонирующей дистрофии и суммарных показателей NASH. Показатели стеатоза в группе с высокой дозой FG значимо уменьшались в сравнении с группой обработки растворителем. В дополнение, в сравнении с группой FGF-21 все показатели стеатоза, лобулярного воспаления, баллонирующей дистрофии и их суммарный показатель значимо уменьшились в группе с низкой дозой FG и/или группе с высокой дозой FG. Эти результаты означают, что FG не только является эффективным в уменьшении лобулярного воспаления, баллонирующей дистрофии и суммарных показателей NASH, но, в данном случае, также является более эффективным, чем FGF-21.

5. Результаты экспериментов

Обнаружения после инъекции FG показывают, что в сравнении с группой обработки растворителем и группой FGF-21 у группы FG с низкой дозой и/или группы с высокой дозой FG могут значимо снижаться уровни ALT и AST в сыворотке крови, уменьшаться стеатоз и лобулярное воспаление, снижаться степень гепатоцеллюлярной баллонирующей дистрофиии уменьшаться патологический показатель поражения печени. Данные результаты означают, что FG является эффективным в лечении NASH.

6. Заключение. FG обладает потенциалом при клиническом применении в лечении NASH, превосходящим таковой из предшествующего уровня техники.

Настоящее изобретение относится к медицине, а именно к применению пегилированного рекомбинантного химерного фактора роста фибробластов-21 мыши. Применение пегилированного рекомбинантного химерного фактора роста фибробластов-21 мыши или его фармацевтически приемлемой соли в составе лекарственных средств для лечения неалкогольного стеатогепатита, где применение выбрано из уменьшения лобулярного воспаления. Вышеописанное применение позволяет эффективно уменьшать лобулярное воспаление. 7 з.п. ф-лы, 4 табл., 2 пр.

1. Применение пегилированного рекомбинантного химерного фактора роста фибробластов-21 мыши или его фармацевтически приемлемой соли в составе лекарственных средств для лечения неалкогольного стеатогепатита, где применение выбрано из уменьшения лобулярного воспаления.

2. Применение по п.1, где применение дополнительно выбрано из снижения уровней аланинаминотрансферазы и аспартатаминотрансферазы в сыворотке крови, уменьшения стеатоза, снижения степени гепатоцеллюлярной баллонирующей дистрофии и уменьшения поражения печени.

3. Применение по п.1, где неалкогольный стеатогепатит (NASH) выбран из индуцированного гепатитом NASH, индуцированного ожирением NASH, индуцированного диабетом NASH, индуцированного инсулинорезистентностью NASH, индуцированного гипертриглицеридемией NASH, индуцированного абеталипопротеинемией NASH, NASH, индуцированного болезнью накопления гликогена, NASH, индуцированного болезнью Уэйка, NASH, индуцированного болезнью Вольмана, или индуцированного липодистрофией NASH.

4. Применение по п.1, где лекарственные средства представляют собой фармацевтические композиции, содержащие пегилированный рекомбинантный химерный фактор роста фибробластов-21 мыши или его фармацевтически приемлемую соль в качестве активного фармацевтического ингредиента.

5. Применение по п.4, где фармацевтические композиции могут быть получены в виде любой фармацевтически приемлемой лекарственной формы.

6. Применение по п.5, где лекарственные формы выбраны из таблеток, капсул, гранул, пилюль, порошков, мази, препарата, полученного с помощью сублимационной сушки, пылеобразных порошков, растворов, инъекционных препаратов, суппозиториев, распыляемых растворов, каплей, пластырей и драже.

7. Применение по п.6, где лекарственные формы выбраны из порошков для приготовления инъекционного препарата или жидких инъекционных препаратов.

8. Применение по п.7, где жидкие инъекционные препараты выбраны из водных инъекционных препаратов, инъекционных препаратов, содержащих органический растворитель, и суспензионных инъекционных препаратов.