Способ прогнозирования гематогенного метастазирования при инвазивной карциноме молочной железы Российский патент 2022 года по МПК G01N33/50 G01N33/53 G01N33/574 C12N5/09 

Изобретение относится к медицине, в частности к онкологии, а именно к прогнозированию развития отдаленных метастазов у больных карциномой молочной железы.

Известен способ прогнозирования отдаленного метастазирования при раке молочной железы на основании определения клеток иммунной системы крови как до лечения, так и во время его проведения, и после завершения (Патент РФ 2436099, МПК G01N 33/53, опубл. 2011).

Недостатком способа является невысокая точность, поскольку исследуемые циркулирующие в крови опухолевые клетки могут не вызывать иммунный ответ, кроме того, способ трудоемкий, требующий выявления большого числа показателей, что не позволяет использовать данный способ прогнозирования в широкой клинической практике.

Известен способ прогнозирования отдаленного метастазирования (безрецидивной и общей выживаемости) на основании исследования количества CD45 негативных циркулирующих опухолевых клеток (ЦОК) в крови до выполнения хирургической резекции опухоли молочной железы (Hall CS, Karhade MG, Bowman Bauldry JB, Valad LM, Kuerer HM, Desnyder SM, Lucci A. Prognostic value of circulating tumor cells identified before surgical resection in nonmetastatic breast cancer patients. J am coll surg. 2016 jul; 223(1):20-29).

Недостатками метода является вероятность учета недостаточно информативных показателей, поскольку изучение лишь CD 45 негативных ЦОК критично снижает прогностическую ценность метода.

Наиболее близким является способ прогнозирования гематогенного метастазирования при карциноме молочной железы, включающий выявление и подсчет циркулирующих опухолевых клеток в крови до лечения с помощью эпителиального молекулярного маркера ЕрСАМ, кроме этого методом многоцветной проточной цитометрии определяют уровень популяций ЦОК с помощью молекулярной панели маркеров, включающей ЕрСАМ, CD45, CD44, CD24 и N-Cadherin, и меченных разными флюорохромами моноклональных антител против данных маркеров. Оценивают в баллах следующие показатели: наличие порогового уровня ЦОК с признаком стволовости и ЕМТ до биопсии; наличие порогового уровня EpCam-отрицательных ЦОК с признаками стволовости в состоянии ЕМТ до биопсии; наличие порогового уровня ЦОК без признаков стволовости в состоянии ЕМТ до биопсии, а также определяют размер первичной опухоли. Полученные данные обрабатывают методом математического анализа с использованием уравнения регрессии, разработанного заявителем.

Недостатком способа является его сложность осуществления, вероятность получения ложного прогноза, т.к. способ предполагает выявления большого числа показателей, некоторые из которых обладают низкой прогностической ценностью.

Задачей предлагаемого изобретения является повышение точности прогноза, снижение его трудоемкости, возможность широкого использование в клинической практике, за счет анализа показателей, свидетельствующих о наивысшем метастатическом потенциале.

Для решения поставленной задачи, при прогнозировании гематогенного метастазирования при инвазивной карциноме молочной железы, включающем выявление и подсчет циркулирующих опухолевых клеток в крови до лечения с помощью эпителиального молекулярного маркера ЕрСАМ, предложено исследовать с помощью интерференционного микроскопа только ЕрСАМ позитивные (ЕрСАМ+) опухолевые клетки неправильной формы. Если выявлено три и более таких клеток, при этом диаметр такой клетки превышает 20 мкм, а наибольшая фазовая высота равна или превышает 220 нм, прогнозируют высокий риск развития гематогенных метастазов.

Применение способа позволяет диагностировать высокий риск гематогенного метастазирования на самых ранних этапах выявления карциномы молочной железы, что представляет возможность интенсифицировать объем лечебных мероприятий, их очередность и длительность, осуществлять выбор лекарственных препаратов из доступного перечня с наивысшим лечебным эффектом, а так же оптимизировать временные интервалы контрольного обследования с целью диагностики прогрессирования на самом раннем этапе.

Способ осуществляется следующим способом.

У онкологического пациента из локтевой вены выполняется забор крови в количестве 6-7,5 мл, и по стандартной методике выделяют из нее эпителиальные клетки, на поверхности которых присутствует ЕрСАМ (протеин CD326), посредством загрузки клеточной суспензии из образца крови в магнитное поле сепаратора MACS.

Магнитно-позитивные клетки ЕрСАМ + остаются в колонке, а немеченые клетки удаляются. Далее ЕрСАМ + клетки, выделенные методом магнитной сепарации, концентрируют центрифугированием при 400G с добавление 100 мкл PBS с 0.1% телячьей сыворотки. Полученную смесь помещают в камеру Горяева, которая в свою очередь размещается в интерференционном микроскопе, где осуществляются определение фазовых параметров ЕрСАМ + клеток при увеличении x200.

С помощью программы MimSoft осуществляют выявление клеток неправильной формы с диаметром, превышающим 20 мкм и их подсчет. Затем определяют у этих клеток наибольшую фазовую высоту. Для постановки прогноза учитывают только те клетки, фазовая высота которых равна или превышает 200 нм. В случае если обнаружено не больше 2 таких клеток прогнозируется низкий метастатический потенциал, если выявляются 3 и более таких клеток прогнозируется высокий риск развития гематогенных метастазов.

Пример 1

У пациентки Ш., 66 лет, диагностирована люминальная «В» карцинома молочной железы Т3НоМо. При исследовании образцов крови у пациентки обнаружена 1 ЦОК неправильной формы, диаметр которой равен 24 мкм, а фазовая высота - 254 нм. На основании полученных данных сделан прогноз о низком риске гематогенного метастазирования.

Пациентке выполнена секторальная резекция опухоли, проведено парциальное облучение ипсилатеральной молочной железы, после чего назначено лечение, включающее только прием тамоксифена.

Через 26 месяцев после назначения лечения в рамках проведения ПЭТ/КТ не обнаружено очагов гематогенного метастазирования.

Пример 2

Пациентка З., 56 лет. Диагностирована карцинома молочной железы Т2Н1Мо. Проведено исследование крови на присутствие в ней ЕрСАМ+ЦОК (с высоким метастатическим потенциалом) - обнаружено 5 клеток, диаметр которых был в пределах от 22 до 34 мкм и фазовая высота - от 256 до 322 нм, что стало основание для прогнозирования высокого риска гематогенного метастазирования.

В адьювантном режиме пациентке назначены химиотерапия (антрациклины), ингибиторы ароматазы в сочетании с блокаторами CD 4/6. Определение онкомаркеров крови и контрольное наблюдение с использованием компьютерной томографии осуществлялось каждые 3 месяца (вместо 1 раз в 6 месяцев).

Через 1,5 года удалось выявить 4 метастатических гематогенных очагов в паренхиме легких, размер которых не превышал 1-1,2 см, т.е. на самых ранних этапах их развития, что позволила назначить своевременное лечение.

Пример 3

Пациентка Н., 62 года. После выявления карциномы молочной железы T2N1M0.

При исследовании крови по предлагаемому способу обнаружено 3 ЕрСАМ+ЦОК, диаметр которых был от 22 до 25 мкм. При исследовании наибольшей фазовой высоты, этот показатель только у 2 ЦОК составил 220 и 276 нм.

Диагностирован низкий риск гематогенного метастазирования. После завершения комбинированного лечения в стандартном режиме (резекция карциномы, адьювантная лучевая терапия, адьювантная лекарственная терапия) контрольное наблюдение осуществляется в стандартном режиме.

Не отмечено развития метастазов в течение 2,5 лет наблюдения.

Пример 4

При исследовании крови у пациентки III., 76 лет, по поводу карциномы левой молочной железы T1cHoMo обнаружено 4 ЕрСАМ+ЦОК, диаметр которых составил 21 мкм, 28 мкм, 32 мкм и 35 мкм. При исследовании фазовой высоты ЦОК, оказалось у всех клеток этот показатель превышал 220 нм (находился в пределах 263-302 нм).

Диагностирован высокий риск гематогенного метастазирования. Несмотря на возраст, раннюю стадию и расположение карциномы в левой молочной железе, пациентке назначена и проведена адьювантная лекарственная терапия в полном объеме с использованием антрациклинов. Через 2,2 года признаков гематогенного метастазирование не обнаружено. Однако через 2,8 года были выявлены множественные отдаленные метастазы в легких.

Предлагаемый способ прогнозирования использовали у 20 пациентов с первично выявленной карциномой молочной железы. У 14 диагностирован люминальный А/В тип карциномы. Применение способа прогнозирования гематогенного метастазирования показало, что в условиях учреждения практического здравоохранения прогнозирование риска метастазирования при карциноме молочной железы, возможно, определить в течение 1 рабочего дня (4-8 часов), что представляет возможность оперативно определить объем специализированной высокотехнологичной медицинской помощи. Использование способа позволило оптимизировать проводимую или планируемую терапию, в том числе объем хирургического вмешательства или лучевой терапии и добиться существенного увеличения безрецидивной выживаемости.

Предлагаемый способ прогнозирования метастазирования дает возможность персонифицировать назначение медицинских мероприятий у пациентов карциномой молочной железы, что позволит в ряде случае отказаться от использования, например, кардиотоксичных медикаментов у пациентов с низким риском гематогенного метастазирования, и обеспечить высокую комфортность качества жизни данной категории пациентов.

Настоящее изобретение относится к клеточной биологии и медицине, а именно к способу прогнозирования гематогенного развития отдаленных метастазов у больных карциномой молочной железы. Для осуществления указанного способа выявляют и подсчитывают циркулирующие опухолевые клетки в крови до лечения с помощью эпителиального молекулярного маркера ЕрСАМ. При этом с помощью интерференционного микроскопа исследуют только ЕрСАМ позитивные опухолевые клетки неправильной формы. Если выявлено три и более таких клеток в 6-7,5 мл крови, при этом их диаметр превышает 20 мкм, а наибольшая фазовая высота равна или превышает 220 нм, прогнозируют высокий риск развития гематогенных метастазов. Настоящее изобретение позволяет диагностировать высокий риск гематогенного метастазирования на самых ранних этапах выявления карциномы молочной железы, что представляет возможность интенсифицировать объем лечебных мероприятий, их очередность и длительность, осуществлять выбор лекарственных препаратов из доступного перечня с наивысшим лечебным эффектом, а также оптимизировать временные интервалы контрольного обследования с целью диагностики прогрессирования на самом раннем этапе. 4 пр.

Способ прогнозирования гематогенного метастазирования при инвазивной карциноме молочной железы, включающий выявление и подсчет циркулирующих опухолевых клеток в крови до лечения с помощью эпителиального молекулярного маркера ЕрСАМ, отличающийся тем, что с помощью интерференционного микроскопа исследуют только ЕрСАМ позитивные опухолевые клетки неправильной формы и если выявлено три и более таких клеток в 6-7,5 мл крови, при этом их диаметр превышает 20 мкм, а наибольшая фазовая высота равна или превышает 220 нм, прогнозируют высокий риск развития гематогенных метастазов.