СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ ЦИРКУЛИРУЮЩИХ В КРОВИ ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК МЕТОДОМ МНОГОПАРАМЕТРОВОЙ ПРОТОЧНОЙ ЦИТОМЕТРИИ Российский патент 2024 года по МПК G01N33/574 G01N33/49 G01N33/533 

Изобретение относится к медицине, а именно к методам лабораторной диагностики гематогенного распространения опухолей эпителиальной природы на основании циркулирующих в крови опухолевых клеток.

Отдаленное метастазирование до сих пор остается основной причиной гибели пациентов, несмотря на успехи диагностики и лечения солидных опухолей. Диагностическое оборудование устанавливает наличие опухолевого узла, когда его диаметр уже превышает 3-5 мм. Поэтому на сегодняшний день является актуальным изучение способов своевременной диагностики микрометастазов опухоли и роли опухолевых клеток, сохранившихся в периферической крови у онкологических больных до лечения, в процессе, а также после лечения. Единичные циркулирующие опухолевые клетки (ЦОК) по кровеносным и лимфатическим сосудам попадают в различные органы, где продолжительное время могут сохраняться в дремлющем состоянии, а при определенном стимуле, осевшие в органах-мишенях, клетки могут формировать метастаз. Считается, что ЦОК резистентны к химиолучевой терапии. Поэтому важна оценка ЦОК в динамике комплексного лечения. При выявлении ЦОК больной может быть условно отнесен в группу высокого риска метастазирования, также произведена оценка эффективности проводимой терапии, что может способствовать персонализации лечения.

Из анализа различных исследований ЦОК следует, что не существует единого маркера или определенного физического признака для универсальной идентификации и выделения ЦОК. Каждое исследование базируется на субпопуляции ЦОК, которая предварительно определена методикой конкретного эксперимента.

По правилам оценки малых клеточных популяций обязательно сочетание одного отрицательного и двух положительных антигенов для искомой популяции. Для опухолей эпителиальной природы как правило применяется сочетание пан-эпителиальных маркеров и комплексного маркера цитокератинов 7, 8, 18, 19 типов.

Для детального исследования ЦОК необходимо сочетать маркеры, которые характеризуют следующие компоненты клетки: мембрану, цитоплазму, ядро. Фенотипирование опухолевых клеток в предлагаемом способе осуществляется по экспрессии пан-эпителиального маркера EpCAM, цитоплазматического маркера к цитокератинам САМ5.2, маркера опухолевых стволовых клеток CD133, отсутствию экспрессии к общему панлейкоцитарному маркеру CD45.

Антитело к САМ5.2 реагирует с большинством эпителиальных опухолей, включая опухоли легких, печени, поджелудочной железы, желудочно-кишечного тракта, молочной железы, мочеполовой системы, женских репродуктивных органов и некоторых эндокринных органов. Использование ядерного красителя SYTO16 позволяет исключить из анализа безъядерные и нежизнеспособные клетки крови (эритроциты, обломки клеток), что оптимизирует количественный подсчет ЦОК относительно единого знаменателя - ядросодержащих жизнеспособных клеток. За счет того, что из анализа исключаются обломки клеток, эритроциты и лейкоциты повышается чувствительность и специфичность метода.

Существуют данные подтверждающие, что часть популяции ЦОК имеют характеристики стволовых опухолевых клеток и предположения, что именно они обладают специфическими особенностями и метастатическим потенциалом. Поэтому важно учитывать признаки стволовости ЦОК. Важной составляющей будущих исследований, учитывая гетерогенность клеток, является определение прогностического потенциала конкретной субпопуляции ЦОК.

Методы определения ЦОК представляют собой обширную панель технологий, способных определять различия в свойствах опухолевых и гемопоэтических клеток: физических (размер, плотность, деформируемость) и биологических (экспрессия белков на поверхности клеток, жизнеспособность). В настоящее время активно используются и разрабатываются иммуномагнитные, микропроточные, фильтрационные технологии.

Первой методикой определения ЦОК для клинического применения, которая получила одобрение «Управления по контролю пищевых продуктов и лекарств» (FDA), стала технология CellSearch (Veridex LLC). Методика полуавтоматическая и включает в себя иммунофлуоресценцию, иммуномагнитное разделение и проточную цитометрию. Определены референсные значения в 7,5 мл периферической крови для рака молочной железы, РМЖ и рака простаты (<5 ЦОК), колоректального рака, КРР (<3 ЦОК), если уровень ЦОК выше, то исследуемый образец положителен на наличие ЦОК.

Также существуют методы с использованием прямой визуализации клеток (иммуноцитохимия, иммуномагнитная сепарация CellSearch и Ariol, цифровая микроскопия ADM, оптоволоконное сканирование FAST и сканирующая лазерная цитометрия MAINTRAC). Микропроточная система CTC-chip обладает высокой чувствительностью по улавливанию ЦОК из ламинарного потока крови, проходящей через чип с антителами к молекуле EpCAM. Метод применим для небольших объемов крови (2-3 мл) и считается высокочувствительным. С помощью фильтрационной методики ISET (Isolation by Size of Epithelial Tumor cells), ЦОК можно выделить при вакуумной фильтрации периферической крови через мембрану с известными размерами пор.

Большинство этих методик недоступны для рутинного применения в российских медицинских учреждениях.

Перспективным в отношении выявления ЦОК представляется использование проточной цитометрии, которая позволяет не только проводить оценку количества ЦОК, но и оценивать их качественный состав, выявляя дополнительные мишени для молекулярно-прицельной терапии.

В патентах US 6136182 А опубл. 24.10.2004 г., US 6890426 В2 опубл. 10.05.2005 г., описывается устройство, которое можно использовать для реализации системы CellSearch. Технология CellSearch представляет собой комбинацию иммуномагнитной детекции эпителиальной молекулы ЕрСАМ и автоматизированной цифровой микроскопии, детектирующей клетки, с фенотипом (DAPI⁺цитокератин,CK⁺CD45^-) при РМЖ, КРР и раке простаты. Результаты исследований применяют для оценки прогноза онкологического процесса, а также выживаемости без прогрессирования и общей выживаемости. В работах не учитывается, что опухолевые клетки, могут иметь вариабельный фенотип, т. е. их гетерогенность. Например, терять эпителиальную молекулу ЕрСАМ при эпителиально-мезенхимальном переходе. Отсутствует возможность оценки признаков стволовости клеток. Также необходимо исключать из анализа клетки, которые не являются ядросодержащими.

В патенте RU 2522923 С1 опубл. 20.07.2014г. для выделения циркулирующих опухолевых клеток к образцу крови добавляют коктейль конъюгированных с магнитными частицами антител к опухолевым антигенам: GA733-2, Muc-1, Her-2 специфичным для циркулирующих опухолевых клеток при РМЖ. Но вышеперечисленные антигены не всегда экспрессируются опухолевыми клетками. Другой недостаток метода - отсутствие в панели исследования антитела к внутриклеточным цитокератинам, которые экспрессируются эпителиальными клетками, а также отсутствие ядерных красителей и общего лейкоцитарного маркера CD45. Таким образом, с учетом гетерогенности популяции, часть опухолевых клеток не детектируется.

В патенте RU 2425385 С1 опубл. 27.07.2011 используется гемофильтроцитологический метод исследования ЦОК. Исследуемая венозная кровь пропускается через калиброванный фильтр диаметр пор - 6 мкм. Опухолевые клетки осаждаются на фильтре. Далее мазки-отпечатки фильтрата венозной крови исследуются иммунофлуоресцентным методом. Результат считался положительным при наличии клеток, имеющих ядерное красное окрашивание (PI) и положительных по экспрессии (EpCAM, CD326). В данном способе также отсутствует цитоплазматическое окрашивание цитокератинами и возможность оценить гетерогенность ЦОК.

Известные аналоги имеют ряд недостатков, которые связаны со специфичной детекцией ЦОК, как гетерогенной популяции и как следствие, недостаточно информативными методами их определения.

Наиболее близким к предлагаемому (прототипом) является способ определения циркулирующих опухолевых клеток у больных раком молочной железы (RU 2770284 С1, опубл. 15.04.2022). Изобретение относится к диагностическим методам в медицине. Может быть использовано для определения чувствительности ЦОК к химиотерапии и прогнозирования вероятности возникновения гематогенных метастазов при РМЖ. Для выделения и обогащения ЦОК оценивается экспрессия на ядросодержащих клетках общего лейкоцитарного маркера CD45, эпителиальных маркеров CD326 и пан-цитокератина АЕ1/АЕ3, маркера эритроцитов CD235a методом проточной цитометрии.

К недостаткам метода можно отнести то, что стратегия гейтирования в данном методе исключает дуплеты из анализа, но циркулирующие опухолевые клетки могут быть крупнее лейкоцитов и оказаться в гейте с дуплетами. Цитограмму, отображающую распределение синглетов и дуплетов целесообразнее использовать не для исключения, а для изучения особенностей ЦОК. При использовании маркера эритроцитов гликофорина А в исследуемой популяции остаются нежизнеспособные и частично разрушенные клетки, что может явиться причиной неспецифического связывания антигена и ложноположительного результата, также нет специфических показателей, позволяющих исключить из анализа тромбоциты.

Техническим решением является определение опухолевых клеток, циркулирующих в кровотоке, в качестве дополнительных биомаркеров, с целью прогнозирования течения заболевания и оценки эффективности терапии злокачественных опухолей эпителиальной природы.

Особенностью заявляемого способа заключается в том, что детекцию клеток осуществляют следующим образом:

- на первом этапе к образцу добавляют блокаторы Fc рецепторов - инактивированную 10% сыворотку крови AB, IV группы;

- в выделенные клетки добавляют коктейль моноклональных антител к пан-эпителиальным антигенам - EpCAM CD326, общелейкоцитарному антигену CD45 и маркеру CD133, инкубируют 20 мин при температуре +4°С, далее клетки отмывают в 5 мл фосфатно-солевого буфера при 1000 оборотах в течение 5 минут;

- проводят этап пермеабилизации клеточной мембраны и добавляют антитела к цитокератинам, САМ5.2 инкубируют 20 мин при температуре +4°С, далее клетки отмывают в 5 мл фосфатно-солевого буфера при 1000 оборотах в течение 5 минут;

- затем добавляют ядерный краситель SYTO16 - 2 мкл и инкубируют в темноте при комнатной температуре 5 минут;

- затем добавляют 300 мкл фосфатно-солевого буфера и весь полученный объем образца анализируют на двухлазерном проточном цитометре, после чего данные проточной цитометрии обрабатывают с помощью программы для обработки на персональном компьютере нативных файлов проточной цитометрии;

- дополнительно используют fluorescence-minus-one контроль, последовательно исключая по одному антителу из окрашенной пробы исследуемого образца;

и выявляют наличие в пробе живых САМ5.2⁺CD326⁺CD133⁺CD45^-, САМ5.2^-CD326⁺CD133⁺CD45^-, САМ5.2⁺CD326^-CD133^-CD45^- и САМ5.2⁺CD326⁺CD133^-CD45^- опухолевых клеток и подсчитывают их количество.

Изобретение поясняется подробным описанием, примерами и иллюстрациями, на которых изображено:

Фиг. 1 - Цитограммы исследования периферической крови методом проточной цитометрии (пример 1):

а) Выделение популяции жизнеспособных клеток (область «cell»);

б) Выделение популяции CD45-негативных клеток (область «CD45^-»);

в) Выделение ядросодержащих клеток образца (область «SYTO16⁺»);

г) Выделение в пределах жизнеспособой ядросодержащей CD45-негативной клеточной популяции циркулирующих клеток с экспрессией эпителиальных антигенов САМ5.2 (область «САМ5.2⁺»);

д) Выделение клеток с экспрессией пан-эпителиальных антигенов CD326 (область «CD326⁺»);

е) Выделение субпопуляции с экспрессией стволовых клеток CD133 (нижний правый квадрант);

ж, з) Цитограммы демонстрируют опухолевые клетки в параметрах эпителиальные антигены (САМ5.2/CD326) против CD45;

и) Цитограмма характеризует размер и характер клеточных включений искомой популяции клеток;

к, л, м, н) Цитограммы являются негативным контролем к цитограммам в),г),д),е).

Фиг. 2 - Цитограммы исследования периферической крови методом проточной цитометрии (пример 2):

а, б, в) Выделение популяции жизнеспособных (область «cell»), CD45-негативных (область «CD45^-»), ядросодержащих клеток образца (область «SYTO16⁺»);

г, д, е) Цитограммы демонстрируют гетерогенность опухолевых клеток они отличаются у отдельных пациентов по экспрессии антигенов САМ5.2 и CD326;

ж, з) Все опухолевые клетки независимо от экспрессии эпителиальных антигенов являются CD45 негативными;

и) Только часть опухолевых клеток экспрессирует антиген CD133 (нижний правый квадрант);

к, л, м) Цитограммы являются негативным контролем к цитограммам г), д), и).

Способ осуществляют следующим образом.

Способ включает в себя выделение ЦОК и детекцию на проточном цитометре по экспрессии пан-эпителиального маркера EpCAM (CD326), маркера к цитокератинам САМ5.2, общего лейкоцитарного антигена CD45, с использованием флуоресцентного ядерного красителя SYTO16, а также маркера опухолевых стволовых клеток CD133. Для этого образец периферической венозной крови в объеме 9 мл забирают в пробирки К2ЭДТА. Выделение мононуклеаров осуществляется из 7,5 мл ЭДТА-стабилизированной венозной крови. Кровь делят на 12 фальконовских пробирок по 625 мкл, добавляют фосфатно-солевой буфер (PBS) до полной пробирки. Далее образцы центрифугируют при 2200 об/мин 7 мин, аккуратно сливают супернатант, не повредив осадок с клетками. Далее добавляют готовый лизирующий раствор или аналог собственного приготовления (дистиллированная вода 500 мл, хлористый аммоний 4,15 гр, калий углекислый кислый 0,5 гр, динатриевая соль 15 мг) по 3-4 мл на пробирку, аккуратно перемешивают и инкубируют 10 мин при комнатной температуре. Затем отмывают в фосфатно-солевом буфере (буфер добавляют до полной пробирки) центрифугированием при 2000 об/мин 10 мин, аккуратно сливают супернатант. Далее вторая отмывка в 10 мл фосфатно-солевого буфера центрифугированием при 2000 об/мин 5 мин, сливают супернатант. Объединяют выделенные клетки из всех пробирок. Осаждают центрифугированием при 2000 об/мин 5 мин, снимают супернатант. К клеточному осадку добавляют 300 мкл фосфатно-солевого буфера и 100 мкл блокирующего раствора (сыворотку IV группы крови инактивируют на водяной бане при 58°С в течение 30 минут, далее разводят PBS 1:10) инкубируют 30 мин при температуре +4°С. Далее клетки отмываются в 5 мл фосфатно-солевого буфера при 1000 об/мин 5 мин, снимают супернатант, добавляют 200 мкл буфера. Образец делят на две пробы: контрольную и окрашенную. В окрашенную пробу добавляют антитела CD45-APC-Cy7 (1,2 мкл), CD133-APC (1,5 мкл), CD326 (EpCam)-PerCP-Cy5.5 (1,2 мкл). В неокрашенную CD45-APC-Cy7 (1,2 мкл). Инкубируют 20 мин при температуре +4°С. Далее клетки отмываются в 5 мл фосфатно-солевого буфера при 1000 об/мин 5 мин. Затем в обе пробы добавляют 250 мкл пермеабилизирующего буфера и инкубируют 10 минут при комнатной температуре. Далее клетки отмывают в 5 мл фосфатно-солевом буфере при 1000 об/мин 5 мин.

Затем в окрашенную пробу добавляют моноклональные антитела к цитокератинам САМ5.2 (2 мкл) и инкубируют 20 мин при температуре +4°С. Далее клетки отмываются в 5 мл фосфатно-солевого буфера при 1000 оборотах в течение 5 минут.

Затем добавляют ядерный краситель SYTO16 (2 мкл), инкубируют в темноте при комнатной температуре 5-7 минут. Затем добавляют 300 мкл фосфатно-солевого буфера и весь полученный объем образца анализируют на проточном цитометре, одновременно детектируя следующие метки: FITC, PE, PerCP-Cy5.5, APC, APC-Cy7. Результаты проточной цитометрии обрабатываются с помощью специальных программ, адоптированных для анализа файлов проточной цитометрии, способной проанализировать до 20 миллионов событий одновременно.

Кроме специфического связывания с антигеном, антитела могут неспецифически связываться с другими рецепторами на клетках, например, с Fc рецепторами на моноцитах, В-лимфоцитах, чтобы этого избежать используют блокаторы Fc рецепторов.

На этапе отработки метода для оценки чувствительности определенного детектора, более точного гейтирования при многоцветном окрашивания на этапе отработки метода использовали контроль FMO (fluorescence-minus-one) контроль. Для проведения FMO-контроля при проведении пробоподготовки исследуемого образца исключается последовательно по одному антителу из пробы, окрашенной вышеописанным способом.

Сущность данного способа иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1.

Пациентка Д. 2002 г. р. ЗНО прямой кишки, аденокарцинома, pT2N0M0.

В данном примере проанализировано 21,4 миллиона клеток крови, согласно вышеописанному способу. Основная проба - 11,4 млн клеток, контрольная проба -10 млн клеток.

Выявление циркулирующих в крови опухолевых клеток осуществлялось следующим образом. На первом этапе (Фиг.1 а) определили популяцию морфологически сохранных, жизнеспособных клеток по параметрам прямого светорассеяния FSC-А (ось x) и бокового светорассеяния SSC-А (ось y). Далее в пределах популяции морфологически сохранных, жизнеспособных клеток выделили CD45-негативные клетки (Фиг. 1 б). На следующем этапе, ограничивали исследуемую область только ядросодержащими клетками SYTO16⁺ (Фиг.1в), затем оценивали пропорцию клеток с экспрессией панцитокератинов САМ5.2 (Фиг.1 г) и пан-эпителиального антигена CD326 (Фиг.1д), дополнительно оценивали количество эпителиальных клеток с экспрессией маркера стволовых опухолевых клеток CD133, (Фиг.1 е, нижний правый квадрант). За показатель ЦОК принимали суммарное количество САМ5.2 ⁺/ CD326⁺ клеток. В данном клиническом примере обнаружено 7 ЦОК, экспрессирующих цитокератины САМ5.2 и эпителиальный маркер CD326, при этом большинство из них (6 клеток из 7, 85,7%) характеризовались четкой экспрессией маркера стволовых клеток CD133 (Фиг.1 е). Дополнительно по характеристикам светорассеяния можно судить, что клетки довольно крупные (параметр FSC), и однородны по структуре цитоплазматических включений (параметр SSC) (Фиг.1 и). На цитограммах в контрольных пробах отсутствуют клетки, следовательно, фоновое свечение из соседних каналов флуоресценции и неспецифическое связывание антител с другими клетками не вносят ложноположительных событий в анализ (Фиг.1к, л, м, н).

Пример 2.

Пациентка М., 1982 г. р. ЗНО молочной железы T2N3M0, стадия IIIC (микропапиллярный рак, степень злокачественности G2). Суррогатный молекулярный подтип (люминарный В, HER2-позитивный). При цитологическом исследовании в подмышечном лимфатическом узле обнаружены единичные опухолевые клетки. В данном примере проанализировано 14,4 миллиона клеток, согласно вышеописанному способу. Основная проба - 7,4 млн клеток, контрольная проба - 7 млн клеток.

Выявление циркулирующих в крови опухолевых клеток осуществлялось следующим образом. На первом этапе (Фиг.2 а) определили популяцию морфологически сохранных, жизнеспособных клеток по параметрам прямого светорассеяния FSC-А (ось x) и бокового светорассеяния SSC-А (ось y). Далее в пределах этой популяции выделили CD45-негативные клетки (Фиг.2 б), затем ограничили исследуемую область только ядросодержащими клетками SYTO16⁺ (Фиг.2 в). Далее оценивали популяцию клеток с экспрессией панцитокератинов САМ5.2 (Фиг.2 г) и пан-эпителиального антигена CD326 (Фиг.2 д), затем продемонстрировали гетерогенность опухолевых клеток по экспрессии антигенов САМ5.2 и CD326 (Фиг.2 е) и выяснили, что 3 ЦОК экспрессируют оба антигена САМ5.2 и CD326 (область В++, верхний правый квадрант); 5 ЦОК ярко экспрессируют САМ5.2 (гейт В+-, нижний правый квадрант); 2 ЦОК ярко экспрессируют CD326 (гейт В-+, верхний левый квадрант). В данном клиническом примере обнаружили 10 ЦОК, дополнительно оценив экспрессию маркера стволовых опухолевых клеток CD133 (Фиг.2 и, нижний правый квадрант), 4 клетки из 10 (40%) экспрессируют маркер стволовых клеток CD133, т.е. 2 имеют фенотип (САМ5.2⁺CD326⁺CD133⁺CD45^-), 2 другие (САМ5.2^-CD326⁺CD133⁺CD45^-). Остальные 5 клеток (САМ5.2⁺CD326^-CD133^-CD45^-) и 1 клетка (САМ5.2⁺CD326⁺CD133^-CD45^-). На цитограммах в контрольных пробах отсутствуют клетки, следовательно, фоновое свечение из соседних каналов флуоресценции и неспецифическое связывание антител с другими клетками не вносят ложноположительных событий в анализ (Фиг.2 к, л, м).

Предложенный способ позволяет выявить ЦОК в крови, определенное количество которых, может быть использовано в качестве дополнительных биомаркеров при прогнозировании течения заболевания и оценке эффективности терапии злокачественных опухолей эпителиальной природы.

Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике, и может быть использовано для выявления циркулирующих в крови опухолевых клеток методом многопараметровой проточной цитометрии. Проводят выделение опухолевых клеток из 7,5 мл ЭДТА-стабилизированной периферической венозной крови и окрашивание флуорохромными антителами. Детекцию клеток осуществляют следующим образом: на первом этапе к образцу добавляют блокаторы Fc рецепторов - инактивированную 10% сыворотку крови AВ, IV группы; в выделенные клетки добавляют коктейль моноклональных антител к панэпителиальным антигенам - EpCAM CD326, общелейкоцитарному антигену CD45 и маркеру CD133, инкубируют 20 мин при температуре +4°С, далее клетки отмывают в 5 мл фосфатносолевого буфера при 1000 оборотах в течение 5 минут; проводят этап пермеабилизации клеточной мембраны и добавляют антитела к цитокератинам, СAM5.2 инкубируют 20 мин при температуре +4°С, далее клетки отмывают в 5 мл фосфатно-солевого буфера при 1000 оборотах в течение 5 минут; затем добавляют ядерный краситель SYTO16 - 2 мкл и инкубируют в темноте при комнатной температуре 5 минут; затем добавляют 300 мкл фосфатно-солевого буфера и весь полученный объем образца анализируют на двухлазерном проточном цитометре, после чего данные проточной цитометрии обрабатывают с помощью программы для обработки на персональном компьютере нативных файлов проточной цитометрии; дополнительно используют fluorescence-minus-one контроль, последовательно исключая по одному антителу из окрашенной пробы исследуемого образца. Выявляют наличие в пробе живых САМ5.2+CD326+CD133+CD45-, САМ5.2-CD326+CD133+CD45-, САМ5.2+CD326-CD133-CD45- и САМ5.2+CD326+CD133-CD45- опухолевых клеток и подсчитывают их количество. Способ обеспечивает возможность определения опухолевых клеток, циркулирующих в кровотоке, в качестве дополнительных биомаркеров, с целью прогнозирования течения заболевания и оценки эффективности терапии злокачественных опухолей эпителиальной природы, за счет выявления циркулирующих в крови опухолевых клеток методом многопараметровой проточной цитометрии. 2 ил., 2 пр.

Способ выявления циркулирующих в крови опухолевых клеток методом многопараметровой проточной цитометрии, включающий выделение опухолевых клеток из 7,5 мл ЭДТА-стабилизированной периферической венозной крови и окрашивание флуорохромными антителами, отличающийся тем, что детекцию клеток осуществляют следующим образом:

- на первом этапе к образцу добавляют блокаторы Fc рецепторов - инактивированную 10% сыворотку крови AВ, IV группы;

- в выделенные клетки добавляют коктейль моноклональных антител к панэпителиальным антигенам - EpCAM CD326, общелейкоцитарному антигену CD45 и маркеру CD133, инкубируют 20 мин при температуре +4°С, далее клетки отмывают в 5 мл фосфатносолевого буфера при 1000 оборотах в течение 5 минут;

- проводят этап пермеабилизации клеточной мембраны и добавляют антитела к цитокератинам, СAM5.2 инкубируют 20 мин при температуре +4°С, далее клетки отмывают в 5 мл фосфатно-солевого буфера при 1000 оборотах в течение 5 минут;

- затем добавляют ядерный краситель SYTO16 - 2 мкл и инкубируют в темноте при комнатной температуре 5 минут;

- затем добавляют 300 мкл фосфатно-солевого буфера и весь полученный объем образца анализируют на двухлазерном проточном цитометре, после чего данные проточной цитометрии обрабатывают с помощью программы для обработки на персональном компьютере нативных файлов проточной цитометрии;

- дополнительно используют fluorescence-minus-one контроль, последовательно исключая по одному антителу из окрашенной пробы исследуемого образца;

и выявляют наличие в пробе живых САМ5.2+CD326+CD133+CD45-, САМ5.2- CD326+CD133+CD45-, САМ5.2+CD326-CD133-CD45- и САМ5.2+CD326+CD133-CD45- опухолевых клеток и подсчитывают их количество.