Способ прогнозирования длительности безметастатического периода у больных инвазивной карциномой молочной железы неспецифического типа Российский патент 2025 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к области медицины, конкретно к онкологии, и касается способов прогнозирования длительности безметастатического периода у больных инвазивной карциномой молочной железы неспецифического типа.

Рак молочной железы является ведущей локализацией в структуре онкологической заболеваемости у женщин различных возрастных групп [3], а метастазирование является ведущей причиной смертности при данной патологии [1]. Известно, что опухолевые клетки, наряду с клетками иммунной системы, могут экспрессировать на своей поверхности PD-L1. Более того, установлено наличие положительной корреляционной связи экспрессии PD-L1 с экспрессией маркеров эпителиально-мезенхимального перехода, стволовости и EGFR [2], что может косвенно свидетельствовать о значимом вкладе PD-L1+опухолевых клеток в прогрессию опухоли. Определение длительности безметастатического периода критически важно для подбора наиболее эффективной, способствующей повышению выживаемости, тактики ведения больных РМЖ.

Существующие на сегодняшний день маркеры для прогнозирования длительности безметастатического периода не являются универсальными для всего контингента больных РМЖ, либо труднодоступны для внедрения в клиническую практику, в связи с чем решение данной проблемы до сих пор остается актуальным.

Известен «Способ прогнозирования длительности безрецидивного периода у больных резектабельным трижды негативным раком молочной железы» (патент RU №2780922, опубл. 04.10.2022 г.), основанный на определении уровня спонтанной продукции IL-4,6;8; индуцированной продукции TNF-α, а также концентрации гамма/дельта Т-лимфоцитов, с последующим расчетом дискриминантных функций по полученным значениям [6]. Однако область применения способа ограничена - способ применим только для группы пациенток с резектабельным трижды негативным раком молочной железы, составляющей не более 20% от всех больных раком молочной железы.

Известен «Способ прогнозирования безрецидивной выживаемости у больных раком молочной железы» (патент RU №2623869, опубл. 29.06.2017 г.), основанный на определении уровня экспрессии YKL-39 с помощью метода Pfaffl относительно гена рефери GAPDH [5]. Однако, как и предыдущий, данный способ требует наличия высокотехнологического оборудования, высококвалифицированных в области генетики специалистов и значительных финансовых вложений, что затрудняет его повсеместное внедрение в практическую медицину. Кроме того, данный способ базируется на оценке уровня мРНК различных генов. Недостаток подобного подхода связан с тем, что этот показатель далеко не всегда коррелирует со спектром и количеством белков, структура которых закодирована в мРНК.

В целом выявленные способы являются трудоемкими и сложными в проведении способами, либо могут быть применены у ограниченного контингента больных РМЖ.

Наиболее близким к предлагаемому является «Способ прогнозирования безметастатической выживаемости у больных раком молочной железы на основе экспрессии генов сомато-стволового перехода в резидуальной опухоли после предоперационной терапии» патент RU №2682879, опубл. 04.10.2022 г., в котором выполняют оценку маркерных генов в ткани рака молочной железы, для чего методом количественной ПЦР в режиме реального времени, определяют уровень экспрессии генов ОСТЗ, LAT и LMNB2 по технологии TaqMan с помощью специфических праймеров и проб. Оценку экспрессии генов ОСТЗ, LAT и LMNB2 проводят с помощью метода Pfaffl относительно гена рефери GAPDH. И определяют гипоэкспрессию при уровне экспрессии ОСТЗ ниже 1,3 УЕ, LAT и LMNB2 ниже 1 УЕ. При значениях выше указанных показателей определяют гиперэкспрессию. Одновременную гиперэкспрессия генов ОСТЗ, LAT, LMNB2 в остаточной резидуальной опухоли ассоциируют с неблагоприятным исходом с вероятностью 69%. Гипоэкспрессию хотя бы одного из генов ассоциируют с благоприятным исходом с вероятностью 94%. Способ позволяет увеличить точность определения исхода заболевания за счет оценки экспрессии генов сомато-стволового перехода в остаточной резидуальной опухоли больных после неоадъювантной химиотерапии.

Среди недостатков данного способа можно отметить высокие требования к квалификации персонала, выполняющего генетическое исследование, оценка уровня мРНК генов, что не всегда коррелирует с количеством белков, структура которых закодирована в мРНК, необходимость наличия специального оборудования, а также применимость к ограниченному контингенту больных, прошедших курсы неоадъювантной химиотерапии. Способ обладает недостаточной точностью и информативностью. Еще одним недостатком способа является оценка маркеров в общей смеси клеток опухоли и опухолевого микроокружения (иммунных клеток и клеток стромы). Это может давать существенные искажения относительно уровня оцениваемых маркеров в опухолевых клетках.

Новый технический результат - повышение точности, информативности, доступности и универсальности способа.

Для достижения нового технического результата в способе прогнозирования длительности безметастатического периода у больных инвазивной карциномой молочной железы неспецифического типа, включающем исследование ткани опухоли с оценкой маркеров стволовости, независимо от проведения лекарственной терапии методом проточной цитофлуориметрии исследуют клеточную суспензию, полученную из свежезамороженной гомогенизированной ткани опухоли, в которой по белковым маркерам определяют исключительно опухолевые стволовые клетки по фенотипу CD45^-pan-Cytokeratin⁺EpCAM⁺CD44⁺CD24^-N^-cadherin^-, а среди них - долю PD-L1-положительных клеток, при доле PD-Ll⁺CD45^-pan-Cytokeratin⁺EpCAM⁺CD44⁺CD24^-N-cadherin^- выше 94,44% прогнозируют высокий риск короткой безметастатической выживаемости.

Способ осуществляют следующим образом.

Материалом для исследования служит опухолевая ткань, полученная в ходе оперативного вмешательства у больных инвазивной карциномой молочной железы независимо от проведения предоперационной химиотерапии. Путем дезагрегации из образцов свежезамороженного опухолевого материала изготавливают клеточные суспензии. Для этого фрагмент опухоли помещают в Medicon (в количестве 50 мкм, BD Biosciences) и гомогенизируют в фосфатно-солевом буфере (BD Biosciences) в течение 1 мин, дважды. Полученную клеточную суспензию пропускают через клеточный фильтр (70 мкм, Falcon) и дважды отмывают в 2 мл Cell Wash buffer (BD Biosciences) в течение 10 мин при 300 g, с последующим удалением надосадка. К осадку добавляют 100 мкл Stain Buffer (Sony Biotechnology, США) и ресуспензируют в течение нескольких секунд на мини-центрифуге-вортексе Микроспин FV-2400 (Biosan, Латвия). К полученной суспензии добавляют коктейль моноклональных антител против CD45, CD44, CD24, N-cadherin, PD-L1, pan-Cytokeratin и ЕрСАМ. Окрашивание клеток проводят в два этапа. На первом этапе окрашивают поверхностные маркеры CD45, CD44, CD24, N-cadherin, PD-L1 и ЕрСАМ, используя следующие антитела: BV570-anti-CD45 (clone HI30, Mouse IgGl, Sony Biotechnology), BV510-anti-CD44 (clone IM7, Rat IgG2b, Sony Biotechnology), PerCP/Cy5 5-anti-CD24 (clone ML5, Mouse IgG2a, Sony Biotechnology), PE/Cy7-anti-N-cadherin (clone 8C11, Mouse IgGl, Sony Biotechnology), BV421-anti-CD274 (PD-L1) (clone MIH3, Mouse IgGl, Sony Biotechnology) and AF647-anti-CD326 (EpCAM) (clone 9C4, Mouse IgG2b, Sony Biotechnology). Для контроля проведения методики выполняют неокрашенный и изотопический контроли. Изотипические антитела добавляют к соответствующему изотопическому контролю в аналогичной концентрации. Инкубируют в темноте 20 мин при комнатной температуре. По окончанию инкубации каждый образец отмывают в 1 мл Cell Wash buffer (BD Bioscience) 10 мин при 300 g, надосадок удаляют.На втором этапе окрашивают внутриклеточный маркер - pan-Cytokeratin. К неокрашенному, окрашенному и контрольному образцам добавляют по 250 мкл раствора BD Cytofix/Cytopermpermeabilizing и инкубируют в темноте, 30 минут при 4°С. Затем дважды отмывают в 1 мл BD Perm/Wash buffer (BD Biosciences) 6 мин при 300 g., с последующим удалением надосадка. К полученному осадку добавляют 50 мкл BD Perm/Wash buffer (BD Biosciences). Далее к окрашенному образцу добавляют 2,5 мкл AF647-anti-pan-Cytokeratin antibody (clone AE-1/AE-3, Mouse IgGl, Novus), к образцу изотипического контроля 2,5 мкл контрольного антитела. Инкубируют 20 мин при 4°С и отмывают каждый образец в 1 мл Cell Wash buffer (BD Bioscience) 6 мин при 300 g. Затем добавляют 200 мкл Stain buffer (Sony Biotechnology), ресуспензируют в течение нескольких секунд на мини-центрифуге-вортексе Микроспин FV-2400 (Biosan, Latvia) и анализируют на проточном цитометре Novocyte (ACEA Biosciences, США) в соответствующем протоколе. Клеточные популяции анализируют, учитывая параметры прямого и бокового светорассеяния. Флуоресценцию клеток анализируют в режимах Density Plot и Dot Plot. Определяют долю PD-L1-положительных клеток среди опухолевых клеток с фенотипом CD45^-pan-Cytokeratin⁺EpCAM⁺CD44⁺CD24^-N-cadherin^-. При обнаружении доли PD-L1-положительных CD45^-pan-Cytokeratin⁺EpCAM⁺CD44⁺CD24^-N-cadherin^- клеток, превышающей 94,44%, говорят о высоком (в 14,5 раз) относительном риске короткой безметастатической выживаемости.

Сущность предлагаемого способа иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Больная Т., 48 лет, диагноз инвазивная карцинома молочной железы неспецифического типа. Предоперационную химиотерапию не проводили. С целью определения прогноза риска короткого безметататического периода проведено исследование согласно предлагаемому способу. Доля PD-L1 -положительных клеток среди опухолевых клеток с фенотипом CD45^-pan-Cytokeratin⁺EpCAM⁺CD44⁺CD24^-N-cadherin^- равна 35,7%, что свидетельствовало о низком риске короткой безметастатической выживаемости. При двухлетнем сроке наблюдения отмечалось отсутствие гематогенных метастазов.

Пример 2. Больная С, 50 лет, диагноз инвазивная карцинома неспецифического типа молочной железы. Предоперационную химиотерапию не проводили. С целью определения прогноза риска короткого безметататического периода проведено исследование согласно предлагаемому способу. Доля PD-L1-положительных клеток среди опухолевых клеток с фенотипом CD45^-pan-Cytokeratin⁺EpCAM⁺CD44⁺CD24^-N-cadherin^- была равна 100%, что свидетельствовало о высоком риске короткой безметастатической выживаемости. Через 6 месяцев у больной были выявлены гематогенные метастазы в кости.

Пример 3. Больная П., 55 лет, диагноз инвазивная карцинома неспецифического типа молочной железы. Предоперационную химиотерапию проводили. С целью определения прогноза риска короткого безметататического периода проведено исследование согласно предлагаемому способу. Доля PD-L1-положительных клеток среди опухолевых клеток с фенотипом CD45^-pan-Cytokeratin⁺EpCAM⁺CD44⁺CD24^-N-cadherin^- была равна 100%, что свидетельствовало о высоком риске короткой безметастатической выживаемости. Через 3 месяца у больной были выявлены гематогенные метастазы в легкие.

Предлагаемый способ основан на анализе данных цитофлуориметрического исследования, анализе амбулаторных карт и медицинских карт стационарного больного.

Изучался операционный материал от 52 больных с морфологически верифицированным диагнозом инвазивной карциномы неспецифического типа молочной железы, проходивших лечение в НИИ онкологии Томского НИМЦ. Средний возраст больных составил 50,2±9,1 лет, стадии T1-2N0-3M0. Пациенты получали терапию в полном объеме в соответствие с Клиническими рекомендациями. Операция выполнялась в объеме радикальной мастэктомии или радикальной резекции молочной железы.

Сроки наблюдения за больными составили 3 года (36 месяцев). У 7 пациенток были диагностированы гематогенные метастазы. Наличие гематогенных метастазов у пациенток регистрировалось на основании результатов анализа амбулаторных карт и медицинских карт стационарного больного, а также анализа канцер-регистра. Были взяты образцы свежего операционного материала, а затем путем дезагрегации изготовлены клеточные суспензии. Для этого фрагмент опухоли помещали в Medicon (50 мкм, BD Biosciences) и гомогенизировали в фосфатно-солевом буфере (BD Biosciences) в течение 1 мин, дважды. Полученную клеточную суспензию пропускали через клеточный фильтр (70 мкм, Falcon) и дважды отмывали в 2 мл Cell Wash buffer (BD Biosciences) в течение 10 мин при 300 g, с последующим удалением надосадка. К осадку добавляли 100 мкл Stain Buffer (Sony Biotechnology, США) и ресуспензировали в течение нескольких секунд на мини-центрифуге-вортексе Микроспин FV-2400 (Biosan, Латвия). К полученной суспензии добавляли коктейль моноклональных антител против CD45, CD44, CD24, N-cadherin, PD-L1, pan-Cytokeratin и ЕрСАМ. Окрашивание клеток проводилось в два этапа. На первом этапе окрашивали поверхностные маркеры CD45, CD44, CD24, N-cadherin, PD-L1 и ЕрСАМ, используя следующие антитела: BV570-anti-CD45 (clone HI30, Mouse IgGl, Sony Biotechnology), BV510-anti-CD44 (clone IM7, Rat IgG2b, Sony Biotechnology), PerCP/Cy5 5-anti-CD24 (clone ML5, Mouse IgG2a, Sony Biotechnology), PE/Cy7-anti-N-cadherin (clone 8C11, Mouse IgGl, Sony Biotechnology), BV421-anti-CD274 (PD-L1) (clone MIH3, Mouse IgGl, Sony Biotechnology) and AF647-anti-CD326 (EpCAM) (clone 9C4, Mouse IgG2b, Sony Biotechnology). Для контроля проведения методики выполняли неокрашенный и изотопический контроли. Изотипические антитела добавляли к соответствующему изотипическому контролю в аналогичной концентрации. Инкубировали в темноте 20 мин при комнатной температуре. По окончанию инкубации каждый образец отмывали в 1 мл Cell Wash buffer (BD Bioscience) 10 мин при 300 g, надосадок удаляли. На втором этапе окрашивали внутриклеточный маркер - pan-Cytokeratin. К неокрашенному, окрашенному и контрольному образцам добавляли по 250 мкл раствора BD Cytofix/Cytopermpermeabilizing и инкубировали в темноте, 30 минут при 4°С. Затем дважды отмывали в 1 мл BD Perm/Wash buffer (BD Biosciences) 6 мин при 300 g., с последующим удалением надосадка. К полученному осадку добавляли 50 мкл BD Perm/Wash buffer (BD Biosciences). Далее к окрашенному образцу добавляли 2,5 мкл AF647-anti-pan-Cytokeratin antibody (clone AE-l/AE-3, Mouse IgGl, Novus), к образцу изотипического контроля 2,5 мкл контрольного антитела. Инкубировали 20 мин при 4°С и отмывали каждый образец в 1 мл Cell Wash buffer (BD Bioscience) 6 мин при 300 g. Затем добавляли 200 мкл Stain buffer (Sony Biotechnology), ресуспензировали в течение нескольких секунд на мини-центрифуге-вортексе Микроспин FV-2400 (Biosan, Latvia) и анализировали на проточном цитометре Novocyte (ACEA Biosciences, США) в соответствующем протоколе. Клеточные популяции анализировали, учитывая параметры прямого и бокового светорассеяния. Флуоресценцию клеток анализировали в режимах Density Plot и Dot Plot. Определяли долю PD-L1 -положительных клеток среди опухолевых клеток с фенотипом CD45^-pan-Cytokeratin⁺EpCAM⁺CD44⁺CD24^-N-cadherin^-. Доля PD-Ll⁺CD45^-pan-Cytokeratin⁺EpCAM⁺CD44⁺CD24^-N-cadherin^- клеток была значимо большей в группе больных с наличием гематогенных метастазов. Методом ROC-анализа было определено пороговое значение PD-L1⁺CD45^-pan-Cytokeratin⁺ЕрСАМ⁺CD44⁺ CD24^-N-cadherir^- клеток, на уровне 94,44%, имеющее прогностическую значимость (AUC=0,81 95%CI (0,61-0,99), р=0,03, чувствительность 80%, специфичность 83%). Для оценки длительности безметастатического периода больные были разделены на две группы в зависимости от доли PD-L1⁺CD45 pan-Cytokeratin⁺EpCAM⁺CD44⁺CD24^-N-cadherin^- клеток. В группе больных, где доля PD-L1 -позитивных CD45^-pan-Cytokeratin⁺EpCAM⁺CD44⁺CD24^-N-cadherin^- клеток была ниже 94,44%, период безметастатической выживаемости составил 75%, в то время как для группы больных, где доля PD-L1-позитивных CD45^-pan-Cytokeratin⁺EpCAM⁺CD44⁺CD24^-N-cadherin^- клеток была выше 94,44%, он составил 23,3% (HR (95%CI) 14,5 (1,77-122,90), р=0,006).

Таким образом, предлагаемый способ позволяет с большей точностью и информативностью прогнозировать длительность безметастатического периода у больных инвазивной карциномой молочной железы неспецифического типа. Вероятность прогнозирования неблагоприятного исхода в прототипе составляет 69%, что по утверждению авторов немногим выше событий с 50% вероятностью. Предлагаемый способ обладает более высокой точностью и с 84% вероятностью прогнозирует длительность безметастатического периода у больных инвазивной карциномой молочной железы неспецифического типа. Также в способе-прототипе осуществляют оценку маркеров в общей смеси клеток опухоли и опухолевого микроокружения (иммунных клеток и клеток стромы). Это может давать существенные искажения относительно уровня оцениваемых маркеров в опухолевых клетках. В предлагаемом способе используют технологический подход, обеспечивающий оценку стволовых свойств исключительно в опухолевых клетках.

Предлагаемый способ позволит формировать группы пациентов с высоким и низким риском и определять соответствующую тактику ведения пациентов.

Источники информации

1. Afifi A.M. et al. Causes of death after breast cancer diagnosis: A US population-based analysis. Cancer. 2020; 126 (7): 1559-1567. doi: 10.1002/cncr.32648

2. Azadi S. et al. Upregulation of PD-L1 expression in breast cancer cells through the formation of 3D multicellular cancer aggregates under different chemical and mechanical conditions. Biochim Biophys Acta Mol Cell Res. 2019; 1866 (12): 118526. doi: 10.1016/j.bbamcr.2019.118526

3. Злокачественные новообразования в России в 2021 году (заболеваемость и смертность). Под ред. А.Д. Каприна, В.В. Старинского, О.А. Шахзадовой М.: МНИОИ им. П.А. Герцена филиал ФГБУ «НМИЦ радиологии» Минздрава России, 2022. ил. 252 с.

4. Ибрагимова М.К., Цыганов М.М., Дерюшева И.В., Казанцева П.В., Дорошенко А.В., Вернадский Р.Ю., Литвяков Н.В. Способ прогнозирования безметастатической выживаемости у больных раком молочной железы на основе экспрессии генов сомато-стволового перехода в резидуальной опухоли после предоперационной терапии. Патент на изобретение RU №2682879, 22.03.2019. Заявка №2018109648 от 19.03.2018.

5. Кжышковска Ю.Г., Чердынцева Н.В., Литвяков Н.В., Завьялова М.В., Слонимская Е.М., Цыганов М.М., Крахмаль Н.В. Способ прогнозирования безрецидивной выживаемости у больных раком молочной железы. Патент на изобретение RU №2623869, 29.06.2017. Заявка №2016131233 от 29.07.2016.

6. Молчанов О.Е., Майстренко Д.Н., Гранов Д.А., Попова А.А., Семенов К.Н., Шаройко В.В. Способ прогнозирования длительности безрецидивного периода у больных резектабельным трижды негативным раком молочной железы. Патент на изобретение RU №2780922, 04.10.2022. Заявка №2021139294 от 28.12.2021.

Изобретение относится к области медицины, конкретно к онкологии, и касается способов прогнозирования длительности безметастатического периода у больных инвазивной карциномой молочной железы неспецифического типа. В способе методом проточной цитофлуориметрии исследуют клеточную суспензию, полученную из свежезамороженной гомогенизированной ткани опухоли, в которой по белковым маркерам определяют исключительно опухолевые стволовые клетки по фенотипу CD45^-pan-Cytokeratin⁺EpCAM⁺CD44⁺CD24^-N-cadherin^-, а среди них - долю PD-L1-положительных клеток. При доле PD-Ll⁺CD45^_pan-Cytokeratin⁺EpCAM⁺CD44⁺CD24^-N-cadherin^- выше 94,44% прогнозируют высокий риск короткой безметастатической выживаемости. Изобретение повышает точность, информативность, доступность и универсальность способа. Чувствительность способа 80%, специфичность 83%. 3 пр.

Способ прогнозирования длительности безметастатического периода у больных инвазивной карциномой молочной железы неспецифического типа, включающий исследование ткани опухоли с оценкой маркеров стволовости, характеризующийся тем, что независимо от проведения лекарственной терапии методом проточной цитофлуориметрии исследуют клеточную суспензию, полученную из свежезамороженной гомогенизированной ткани опухоли, в которой по белковым маркерам определяют исключительно опухолевые стволовые клетки по фенотипу CD45^-pan-Cytokeratin⁺EpCAM⁺CD44⁺CD24^-N-cadherin^-, а среди них - долю PD-L1-положительных клеток, при доле PD-Ll⁺CD45^-pan-Cytokeratin⁺EpCAM⁺CD44⁺CD24^-N-cadherin^- выше 94,44% прогнозируют высокий риск короткой безметастатической выживаемости.