Изобретение относится к биотехнологии и медицине, касается фармакологического набора, содержащего биологически-активные субстанции, представляющие собой биорегуляторы в виде белково-пептидных комплексов, выделенные из сыворотки крови и ткани головного мозга различных животных, которые могут быть использованы совместно в качестве основных действующих активных веществ при разработке лекарственных препаратов для восстановления функционального состояния головного мозга, двигательных и когнитивных его функций заболеваний нервной системы, при нейродегенеративных заболеваний, связанных с нарушением мозгового кровообращения и/или повреждением нейронов головного мозга, в том числе при геморрагическом инсульте и болезни Паркинсона.
Инсульт - это острое нарушение кровообращения, приводящее к повреждению тканей головного мозга вследствие закупорки мозгового сосуда или его разрыва. Геморрагический инсульт характеризуется разрывом сосуда и кровоизлиянием в мозг; ишемический инсульт (инфаркт мозга) обусловлен также нарушением кровообращения участка мозга из-за закупорки или сужения артерии мозга. В результате страдает нервная ткань, в которой происходит гибель нейронов, нарушение проведения нервных импульсов, результатом чего является значительное изменение двигательных и когнитивных функций нервной системы. Основное лечение сводится к приему гипотензивных, мочегонных средств, а также кардиологических лекарственных препаратов, в общем поддерживающих работу миокарда и сосудов и препятствующих возникновению повторной ишемии сердечно-сосудистой системы.
В реабилитационный период назначаются также ЛФК, физиотерапевтические методы, призванные восстановить проведение нервных сигналов в нервной системе. Практически все указанные препараты являются синтетическими и характеризуются способностью инициировать в организме пациентов большое количество побочных неблагоприятных реакций и процессов.
Тем не менее, прием данных фармакологических средств не гарантирует развития повторных рецидивов болезни. Инсульты являются одними из наиболее распространенных заболеваний в мире. Известно, что многие больные после перенесенного инсульта навсегда остаются инвалидами, испытывающими значительные последствия в нарушении двигательных и когнитивных функций мозга всю оставшуюся жизнь.
Нарушение кровообращения в мозге является одной из распространенных причин возникновения нейродегенеративных изменений в ткани мозга, при которых происходит прогрессирующая гибель нервных клеток. Возникающая нейродегенерация всегда приводит к деменции и нарушению двигательных функций у некоторых больных. Нейродегенеративные заболевания различаются между собой локализацией, симптоматикой, продолжительностью развития патологического процесса, но все они всегда заканчиваются слабоумием и потерей личности. Кроме нарушения кровотока и работы сосудов, нейродегенерацию могут также вызывать генетическая предрасположенность, в основе которой лежит нарушение функции определенных генов, онкологические заболевания мозга, черепно-мозговые травмы, инфекционные болезни, длительная интоксикация организма. Нейродегенерация может возникнуть в любом возрасте, этот процесс необратим и основной задачей терапии в данном случае считается возможность замедлить развитие этого патологического процесса.
Болезнь Паркинсона (БП) относится к нейродегенеративным заболеваниям и является достаточно распространенной патологией: ежегодно в мире болеет около 6 миллионов человек. Патогенез БП остается мало изученным.
Однако в последнее время показано, что БП связана с дегенерацией нигростриарных дофаминергических нейронов и/или с уменьшением содержания дофамина в стриопаллидарной системе.
Развивающаяся активность холинергических интернейронов приводит к образованию дисбаланса нейромедиаторных систем, что выражается в появлении скованности движений, гипертонуса скелетных мышц, тремора покоя. У больных БП появляются также постуральные расстройства, усиливается саливация, потоотделение и секреция сальных желез, изменяется поведение- появляются плаксивость, раздражительность и др.
Основой современной химиотерапии БП является восстановление нарушенного баланса между дофаминергической и холинергической нейротрансмиссией, а именно: усиление дофаминергических функций или подавление холинергической гиперактивности.
Одним из широко применяемых при БП препаратов является препарат Леводопа, который способен устранять дефицит эндогенного дофамина в нейронах стриопаллидарной системы. Однако прием Леводопы характеризуется развитием таких негативных процессов в организме как тахикардия, аритмия, гипотензия, рвота и др.
Следует также отметить, что значительное повышение уровня дофамина в головном мозге может приводить к появлению у больных БП непроизвольных движений и психических расстройств. Для того, чтобы избежать развитие негативных побочных реакций в организме при приеме леводопы, назначается прием других препаратов, имеющих свои специфические побочные эффекты. Таким образом, пациентам с БП приходится принимать большое количество сильнодействующих лекарственных препаратов, характеризующихся наличием значительного числа побочных негативных эффектов для организма. Поэтому поиск и исследование эндогенных биологически активных веществ, осуществляющих регуляцию регенеративных процессов в нервной ткани, которые не вызывают развитие негативных побочных процессов в организме, продолжает оставаться актуальной проблемой современной биотехнологии в медицине.
Данные биологически активные вещества должны обладать способностью инициировать процессы регенерации в патологически измененных тканях, в том числе, в нервной и кровеносных сосудов, и управлять их ходом и направленностью таким образом, чтобы происходило наиболее полное восстановление и репарация структуры и функции поврежденных тканей.
Изобретение позволяет расширить область применения препаратов, рекомендуемых при нервных заболеваниях, причем природного происхождения в виде пептидно-белковых композиций, усилить биологические эффекты их действия за счет разработки комбинированного совместного способа их применения, получить вещества, функционирующие в организме длительное время без потери способности активировать процессы регенерации в тканях сосудов и головного мозга при различных патологических нарушениях в функционировании нервной системы, и, в частности, при геморрагическом
Из патента RU 2315606, 27.01.2008, известен способ получения лекарственного средства для лечения миопии и заболеваний склеральной оболочки глаза, характеризующийся тем, что выделяют из свежеэнуклеированных глаз позвоночных животных ткань центральной области склеральной оболочки, включающей решетчатую пластинку, промывают ее в водно-солевом физиологическом растворе, выдерживают ткань склеры в водно-солевом растворе при 4-7°С в течение 2-4 ч, центрифугируют тканевой экстракт, собирают надосадочную жидкость, разделяют ее растворением в 100%-ном растворе сульфата аммония при 4-6°С в течение 5-7 дней, фильтруют раствор, диализуют его в диализных мешках при 4-7°С до полного удаления ионов сульфата аммония, разделяют его методом изоэлектрофокусирования в градиенте плотности сахарозы при рН 3,5-10,0 температуре 4-6°С и напряжении 500-2000 В в течение 72-96 ч, после чего собирают фракции кислых белков, объединяют их, диализуют до полного удаления сахарозы и амфолинов в диализных мешках при 4-7°С в течение 10-14 дней, полученный при этом водный раствор белка высушивают до получения сухого вещества, которое очищают методом электрофореза в 7,5-15%-ном полиакриламидном геле, собирают низкомолекулярную фракцию Rf=0,9-0,95, содержащую регуляторный пептид, путем элюирования деионизованной водой из геля в течение 2-5 дней при 4-7°С, полученную фракцию диализуют в диализных мешках с пределом пропускания пор 2-8 кДа при 4-7°С в течение 7-10 дней деионизированной водой, отдиализованный раствор регуляторного пептида далее повторно высушивают до получения белого хлопьевидного мелкодисперсного порошка, который затем растворяют в физиологическом водно-солевом растворе
Из монографии А.А. Константиновский, М.С. Краснов и др. «Исследование ранозаживляющего действия биорегуляторов, выделенных из тканей глаза и сыворотки крови быка на модели экспериментальной травмы роговицы у кроликов «in vivo», Биохимия. 2009, том 74, вып. 9, с. 1195-1203, известны новые биорегулятоы, выделенные из тканей глаза и сыворотки крови быка.. Биорегуляторы принадлежат к новой группе биологически активных веществ, обнаруженных ранее в разных тканях животных. Биорегуляторы данной группы локализованы внеклеточно, имеют сложное строение - они содержат белки, углеводы, липиды. Биорегуляторы данной группы влияют на адгезию, миграцию, дифференцировку, пролиферацию клеток в тканях, которые являлись источником их выделения. В низких дозах биорегуляторы стимулируют процессы восстановления и репарации в тканях. Показано, что биорегулятор, выделенный из роговицы глаза быка, оказывал выраженное протективное действие на состояние ткани при культивировании роговицы глаза позвоночных животных in vitro за счет способности дополнительно активировать клеточные источники регенерации. Биорегулятор, выделенный из сыворотки крови, стимулировал ранозаживление роговицы у кролика в эксперименте in vivo, а также у человека при посттравматической рецидивирующей эрозии и ожоге роговицы. Биорегулятор, выделенный из пигментного эпителия глаза быка, способствовал стабилизации дифференцировки клеток пигментного эпителия и поддержанию жизнеспособности биполярных и мюллеровских клеток в условиях органотипического культивирования тканей глаза in vitro.
Все биорегуляторы получали по ранее разработанной схеме выделения и очистки, состоящей из получения тканевого экстракта, высаливания примесных белков в насыщенном растворе сернокислого аммония, получения фракции супернатанта и последующего разделения ее методом изоэлектрофокусирования в градиенте сахарозы в интервале рН 3.5-10.0. Изучали фракции кислых белков сыворотки крови и роговицы, которые собирали в интервале рН 1.5-3.0, а также основную фракцию пигментного эпителия, собранную в интервале рН 8.5-9.5. В процессе очистки присутствие биорегуляторов во фракциях определяли адгезиометрическим методом, в основе которого лежит оценка их мембранотропной активности. Биорегуляторы исследовали в концентрации, соответствующей 10-12 мг белка/мл, которую получали путем последовательного 10-ти кратного разбавления исходного раствора. Концентрацию белка в исходных фракциях биорегуляторов определяли колориметрическим методом.
Описанные выше биорегуляторы в основном нашли применение в офтальматологии при лечении различных глазных заболеваний.
В частности, из RU 2701566, 30.09.2019, известна фармакологическая композиция, обладающая протекторным действием на состояние тканей заднего отдела глаза - склеральную оболочку, сетчатку, пигментный эпителий, хороид. Данная композиция представляет собой водный раствор белково-пептидного комплекса в концентрации 10-7-10-17 мг/мл и содержит пептиды с молекулярными массами от 1000 до 6000 Да и белок с молекулярной массой 66000-68000 Да, относящийся к семейству альбуминов сыворотки крови, а также липиды и углеводы. Комплекс получен выделением из склеральной оболочки глаза позвоночных животных ИЭФ-фракций, разделенных и собранных методом изоэлектрофокусирования (ИЭФ) в интервале рН<3,0, смешанных в эквимолекулярных соотношениях. Комплекс получен в результате последовательной экстракции склеральной оболочки глаза позвоночных животных, фракционирования и разделения полученных фракций с использованием метода обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии ВЭЖХ. Данное изобретение обеспечивает сохранение в ткани глаза адгезионных межклеточных взаимодействий, целостность коллагеновых волокон и увеличение жизнеспособности фибробластов, а также поддержание адгезии между тканями заднего отдела глаза, увеличение жизнеспособности клеток, сохранение статуса клеточной адгезии, пролиферации и дифференцировки. Изобретение позволяет получить высокоочищенный препарат, предназначенный для профилактики и лечения глазных заболеваний, связанных с заявленными нарушениями. Недостатком данного изобретения является изучение только одного представителя группы МГТБ, выделенного из ткани склеры. Для полной характеристики данной группы биорегуляторов требовалось исследовать биорегуляторы МГТБ, выделенные из других тканей животных, а также получить результаты исследования их состава, структуры и биологического (фармакологического) действия.
Известен также способ получения биологически активного комплекса и биологического активного белково-пептидного комплекса (патент RU2428196, 02.07.2020), обладающего нейрорегенеративным и нейропротективным действием и стимулирующим физиологическую и репаративную регенерацию нервной ткани, для применения в производстве лекарственных препаратов при заболеваниях и периферической нервной системе. Данный способ позволяет получить смесь белков и полипептидов из головного мозга эмбрионов копытных животных. Недостатками данного изобретения являются незавершенная очистка конечной субстанции, представляющая собой белково-пептидный комплекс, а также использование эмбрионального материала, который может содержать другие биологически активные вещества, вызывающие побочные вредные реакции в тканях взрослого организма.
Из RU 2725491, 02.07.2020 известна субстанция для получения средств, увеличивающая рост сперматозоидов, млекопитающих и проявляющая биологическую активность при разведении в водном фармацевтически приемлемом, носителе и/или разбавителе до концентрации общей белка от 10-8 до 10-15 мг/мл, включающая пептиды с молекулярными массами 1000-10000 Да и белок семейства альбуминов млекопитающих, бычий сывороточный альбумин, с молекулярной массой 65712 Да с аминокислотной последовательностью, которая имеет 100%-ную гомологию с N-концевой последовательностью зрелой молекулы бычьего сывороточного альбумина, при массовом использовании пептиды:белок 1:1-7, выделенная из семенников быков ИЭФ-фракций, разделенных и собранных методом изоэлектрофокусирования в интервале рН<3,0 с использованием метода обращено-фазовой хроматографии ВЭЖХ.
Наиболее близким к заявленному изобретению является техническое решение по патенту RU2290936 С1, 10.01.2007 г., описывающий средство для поддерживающей терапии и тканеспецифической терапии», представляющее собой очищенный от белковых, нуклеиновых и липидных примесей низкомолекулярного комплекса, пептидный компонент которого не денатурирует и сохраняет свои регуляторные свойства. Пептидный комплекс содержит пептидные компоненты с молекулярной массой от 1000 до 12000 Да, аминокислоты, минеральные вещества, микроэлементы и витамины в биологически связанной форме, проявляющий выраженную тканеспецифическую активность. Способ получения этого средства включает измельчение сырья животного происхождения, экстракцию, которую проводят 3%-ным раствором уксусной кислоты с добавлением хлористого цинка, охлаждение до температуры плюс 7-16°С при постоянном перемешивании в течение 48 ч, отделение экстракта от балластных веществ сепарированием, осаждение, которое проводят ацетоном в объемном соотношении 1:5 при температуре плюс 3-5°С в течение 4 ч, отстаивание до образования сформировавшегося осадка. Осадок затем промывают двукратными объемами ацетона, протирают через металлическое сито. Полученный целевой продукт высушивают при температуре 18±2°С до полного удаления следов ацетона. При этом максимум поглощения целевого продукта в ультрафиолетовом спектре составляет (270±5) нм. Используемая технология позволяет получить очищенный от нуклеиновых, белковых и липидных примесей пептидный комплекс с молекулярной массой входящих в него пептидных компонентов от 1000 до 12000 Да, содержащий в биологически связанной форме микроэлементы, минеральные вещества и витамины, обладающий выраженной тканеспецифической активностью.
Однако указанное средство имеет ряд недостатков: во-первых, содержит смесь пептидов неясной природы, недостаточная степень очистки их индивидуального состояния, во-вторых, использование целевого продукта в высоких дозах может приводить к неблагоприятным последствиям на организм, поскольку пептиды в высоких дозах могут влиять существенно на метаболизм.
Технической задачей заявленного изобретения является создание фармакологического набора, состоящего из двух биологически активных субстанций в виде биорегуляторов, принадлежащих к группе мембранотропных гомеостатических тканеспецифических биорегуляторов МГТБ, представляющих собой белков-пептидные комплексы, выделенные из сыворотки крови и из ткани головного мозга быка, которые обеспечивают регенерацию патологически измененной нервной ткани и восстановление нарушенных двигательных и когнитивных функций головного мозга при нервных патологиях, различных нейродегенеративных заболеваний.
В соответствии с поставленной технической задачей техническим результатом заявленного изобретения является расширение арсенала средств, относящихся к эндогенным биологически активным веществам, в виде белково-пептидных комплексов (биорегулятора), полученных из сыворотки крови и из ткани головного мозга быка, способствующих восстановлению двигательных и когнитивных функций организма в реабилитационный период после нервных заболеваний за счет восстановления кровотока головного мозга и регенерации нервной ткани в области поражения.
Поставленная техническая задача и технический результат достигаются набором фармакологического средства, предназначенного для улучшения кровотока коры головного мозга и восстановления двигательных и когнитивных функций организма, содержащий размещенные в разных флаконах биологически-активные субстанции в качестве биорегуляторов, представляющих собой выделенные из сыворотки крови и из ткани головного мозга быка белок-пептидные комплексы, содержащие пептиды с молекулярными массами 1000-6000 Да и белок, который является членом семейства альбуминов млекопитающих под номером gi|1351907 в базе данных SwissProt, и проявляющих биологическую активность в диапазоне концентраций их от 10-15 до 10-8 мг/мл при разведении их в фармацевтически приемлемом носителе и/или разбавителе.
При этом, набор фармакологического средства по изобретению для улучшения кровотока в коре головного мозга и восстановления двигательных и когнитивных функций организма предназначен для комбинированного совместного приема двух биологически-активных субстанций в качестве биорегуляторов, размещенных в разных флаконах.
Входящий в состав белково-пептидного комплекса набора белок семейства альбумино под номером gi|1351907 в базе данных SwissProt, имеет молекулярную массу 66367 Да или 66667 Да. Кроме того, что входящие в его состав белок-пептидные комплексы, выделенные, соответственно, из сыворотки крови и из ткани головного мозга быка, вводят раздельно интраназально, перорально или внутримышечно, или внутривенно.
При использовании набора фармакологического средства, предназначенного для улучшения кровотока и восстановления двигательных и когнитивных функций организма входящие в его состав белок-пептидные комплексы вводят в водно-солевом физиологическом растворе интраназально, внутримышечно, парантерально или вводят в дистиллированной воде для перорального приема. Набор фармакологического средства по изобретению предназначен для улучшения кровотока в коре головного мозга и восстановления двигательных и когнитивных функций организма, причем белок-пептидный комплекс из сыворотки крови быка, входящий в набор, вводят интраназально, а белок-пептидный комплекс, выделенный из ткани головного мозга быка, вводят внутримышечно.
В качестве фармацевтически приемлемых носителей и/или разбавителей используют физиологический раствор, дистиллированную воду (воду для инъекций), а также возможно вспомогательные добавки, традиционно используемые при приготовлении фармакологических средств, например аскорбиновую кислоту, ингибиторы окисления.
Входящие в фармакологический набор две субстанции в виде белково-пептидных комплексов, выделенные из сыворотки крови и ткани головного мозга быка, вводят раздельно в фармацевтически приемлемом носителе, в частности, вводят в водно-солевом физиологическом растворе интраназально, внутримышечно, парантерально или вводят в дистиллированной воде для перорального приема.
Биологически-активные субстанции, выделенные из сыворотки крови и ткани головного мозга быка, представляют собой высокоочищенные белково-пептидные комплексы, полученные с применением современных методов биохимии и биоорганической химии изоэлектрофокусирования в градиенте сахарозы, обращеннно-фазовой ВЭЖХ-хроматографии, степень гомогенности которых оценена методами электрофореза,
Ниже представлены фиг. 1-5 и примеры, иллюстрирующие изобретение, но не ограничивающие его.
Фиг. 1. Изменения локального мозгового кровотока (ЛМК) в теменной области коры головного мозга и артериального давления (АД) у крысы №1 в условиях геморрагического инсульта (контрольная группа 2). Обозначения сверху вниз: локальный мозговой кровоток (ЛМК) в у.ед.; артериальное давление (АД) в мм рт.ст.; отметка времени в минутах.
Фиг. 2. Влияние МГТБ-С (0,6 мл, в/в) на локальный мозговой кровоток (ЛМК) и АД у крысы №3 в условиях модели геморрагического инсульта (ГИ).
Обозначения сверху вниз: локальный мозговой кровоток (ЛМК) в у.ед., артериальное давление (АД) в мм рт.ст., отметка времени в мин.
Фиг 3. Влияние МГТБ-М на локальный мозговой кровоток (ЛМК) в теменной области коры головного мозга и артериальное давление (АД) у крысы №5 в условиях геморрагического инсульта. Обозначения сверху вниз: локальный мозговой кровоток (ЛМК) в у.ед., артериальное давление (АД) в мм рт.ст., отметка времени в мин.
Фиг. 4. Влияние МГТБ-С (0,6 мл, в/в) и МГТБ-М (40 мкл интраназально) на локальный мозговой кровоток (ЛМК) в теменной области коры головного мозга и артериальное давление (АД) у крысы №7 в условиях геморрагического инсульта.
Обозначения сверху вниз: локальный мозговой кровоток (ЛМК) в у.ед.; артериальное давление (АД) в мм рт.ст.; отметка времени в мин.
Фиг. 5 Влияние мексидола (0,6 мл, в/в) на локальный мозговой кровоток (ЛМК) в теменной области коры головного мозга и артериальное давление (АД) у крысы №10 в условиях геморрагического инсульта.
Обозначения сверху вниз: локальный мозговой кровоток (ЛМК) в у.ед.; артериальное давление (АД) в мм рт.ст.; отметка времени в мин.
Пример. 1. Способ получения БПК из сыворотки крови быка.
К охлажденному раствору сыворотки крови быка, постепенно добавляют сернокислый аммоний при постоянном перемешивании до образования насыщенного раствора соли (на 1000 мл сыворотки добавляли 780 гсоли). Суспензию белков оставляют на 7 суток при температуре +4°С, после чего центрифугируют при 12000g в течение 30 минут. Собирают фракцию супернатанта и осадка. Фракцию супернатанта диализуют против дистиллированной воды до удаления сульфата аммония в соотношении объемов 1:100 с пятикратной сменой воды. Присутствие в растворе ионов аммония определяют реакцией с реактивом Несслера. Полученные фракции супернатантов концентрируют, используя роторный вакуумный испаритель, при температуре ниже 40°С. Фракцию супернатанта сыворотки крови разделяют с помощью метода изоэлектрофокусирования (ИЭФ) в градиенте плотности сахарозы на колонке LKB-440 («LKB», Швеция), используя амфолины диапазона рН 3,5 - 10,0 (Serva, Германия) (Остерман, 1983). Для разделения готовят следующие растворы: тяжелый электродный раствор - 60% сахарозы в 1%-ный р-р H3PO4; легкий электродный раствор - 0,1%-ный NaOH; тяжелый градиентный раствор - 75 г. сахарозы, 100 мл супернатанта, доводят до 200 мл дистиллированной водой; легкий градиентный раствор - 15 г. сахарозы, до 200 мл дистиллированной воды. В колонку наслаивают растворы в следующем порядке: тяжелый электродный раствор, тяжелый и легкий градиентные растворы, которые подают из градиентного смесителя, и затем легкий электродный раствор. ИЭФ проводят при +4°С в течение 96 часов при напряжении 500-1500 В. Собирают фракции объемом 10 мл. Детекцию белков осуществляют на любом спектрофотометре при 280 нм, для каждой фракции определяют значение рН с помощью рН-метра. Согласно полученной картине разделения собирают фракцию в интервале значений рН<3,0, которую далее диализуют против дистиллированной воды до удаления сахарозы в соотношении объемов 1:100 с пятикратной сменой воды. Данную фракцию анализируют методом масс-спектрометрии на время пролетном масс-анализаторе UltraFlex 2 (Bruker Daltonic, Германия) с использованием в качестве матрицы α-циано-4-гидроксикоричной кислоты, обнаруживают ряд пептидов с молекулярными массами в диапазоне 1000 Да - 6000 Да, в том числе, пептиды с молекулярными массами 1151, 1338, 1448, 1666, 1812, 1915, 2016 Да. Определение первичной последовательности с помощью С-карбоксипептидазы показывает, что они представляют собой продукты протеолиза, соответственно, для пептида с молекулярной массой 1448 Да -MGLRGGPLASLLLR - отмеченаполная гомология с N-концевой последовательностью Р-кадгерина, идентифицированного в эндотелии бычьей аорты. Для пептида с молекулярной массой 1151Да -(dkhgc)n-5-PAYVSP-гомология с аминокислотной последовательностью фрагмента киназного домена регуляторного белка tribble-2 (TRB-2), полученного из гранулоцитов (granulosacells) Bostaurus. Для пептида с молекулярной массой 1338 Да была обнаружена гомология с адреномодулинами - белками, продуцируемыми эндотелием сосудов Bostaurus.
Проводят электрофорез в 15%-ном полиакриламидном геле в денатурирующих условиях ИЭФ-фракции, собранной в интервале значений рН<3,0. Из геля вырезают полосу, соответствующую молекулярной массе приблизительно в 66000 Да. Проведенный триптический гидролиз белка в геле с последующим масс-спектрометрическим исследованием продуктов гидролиза показывает, что выделенный белок с молекулярной массой 66367 Да представляет собой белок семейства альбуминов млекопитающих под номером gi|1351907 в базе данных SwissProt. Методом Эдмана была установлена частичная N-концевая аминокислотная последовательность данного белка DTHKSEIAHRFKDLGE, которая имеет 100%-ую гомологию с N-концевой последовательностью зрелой молекулы БСА быка.
Таким образом, ИЭФ-фракция, собранная в интервале значений рН<3,0, содержит белок gi|1351907 - представитель мультисемейства альбуминов сыворотки крови быка, со значением pI в области рН 3,90-4,00, и смесь небольших пептидов с молекулярной массой 1000-6000 Да. Идентификация трех пептидов, входящих в состав ВПК показала, что они представляют собой продукты протеолиза адгезивного белка Р-кадгерина, регуляторного белка tribble-2 (TRB-2), выделенного из гранулоцитов, и адреномолулина.
Пример 2. Способ получения БПК из ткани головного мозга быка
Получение тканевого экстракта мозга быка Свежевыделенный головной мозг быка промывали несколько раз в холодном физрастворе до полного удаления крови, нарезали на небольшие фрагменты массой 1-2 г, еще раз промывали физраствором и помещали на 2-3 ч в физраствор при 0°С-+4°С. Затем образовавшийся экстракт сливали, центрифугировали при 2500g в течение 30 мин. Полученный экстракт ткани далее фракционировали для получения БПК или же замораживали и сохраняли при -90°С.
Получение БПК из экстракта ткани мозга быка
К охлажденному раствору экстракта тканилегкого постепенно добавляют сернокислый аммоний при постоянном перемешивании до образования насыщенного раствора соли (на 1000 мл добавляли 780 г соли). Суспензию белков оставляют на 7 суток при температуре +4°С, после чего центрифугируют при 12000g в течение 30 минут. Собирают фракцию супернатанта и осадка. Фракцию супернатанта диализуют против дистиллированной воды до удаления сульфата аммония в соотношении объемов 1:100 с пятикратной сменой воды. Присутствие в растворе ионов аммония определяют реакцией с реактивом Несслера. Фракцию супернатанта концентрируют в роторном вакуумном испарителе при температуре ниже 40°С. Фракцию супернатанта диализовали против дистиллированной воды до удаления сульфата аммония и разделяют с помощью метода изоэлектрофокусирования (ИЭФ) в градиенте плотности сахарозы на колонке LKB-440 («LKB», Швеция), используя амфолины диапазона рН 3,5 - 10,0 (Serva, Германия) (Остерман, 1983).Для разделения готовят следующие растворы: тяжелый электродный раствор - 60% сахарозы в 1%-ный р-р H3PO4; легкий электродный раствор - 0,1%-ный NaOH; тяжелый градиентный раствор - 75 г. сахарозы, 100 мл супернатанта, доводят до 200 мл дистиллированной водой; легкий градиентный раствор - 15 г. сахарозы, до 200 мл дистиллированной воды. В колонку наслаивают растворы в следующем порядке: тяжелый электродный раствор, тяжелый и легкий градиентные растворы, которые подают из градиентного смесителя, и затем легкий электродный раствор. Изолектрофокусирование (ИЭФ) проводят при +4°С в течение 96 часов при напряжении 500-1500 В. Собирают фракции объемом 10 мл. Детекцию белков осуществляют на спектрофотометре при 280 нм, для каждой фракции определяют значение рН с помощью рН-метра. Согласно полученной картине разделения собирают фракцию в интервале значений рН<3,0, которую далее диализуют против дистиллированной воды до удаления сахарозы в соотношении объемов 1:100 с пятикратной сменой воды. Данную фракцию анализируют методом масс-спектрометрии на время пролетном масс-анализаторе UltraFlex 2 (Bruker Daltonic, Германия) с использованием в качестве матрицы α-циано-4-гидроксикоричной кислоты, обнаруживают ряд пептидов с молекулярными массами в диапазоне 1000 Да - 6000 Да. Данную фракцию анализируют методом масс-спектрометрии на время пролетном масс-анализаторе UltraFlex 2 (Bruker Daltonic, Германия) с использованием в качестве матрицы α-циано-4-гидроксикоричной кислоты, обнаруживают ряд пептидов с молекулярными массами в диапазоне 1000 Да - 6000 Да, в том числе, пептиды с молекулярными массами 967, 1241, 1437, 1665, 2694, 2874, 2932, 3306, 3695, 4283, 4747, 4963, 6023Да. Определение первичной последовательности пептида 474Да -N-миристоил-G-пальмитоил-S-CTLSAEERAALERSKAIEKNLKEDGISAAKDVKLLLLGAG - с помощью триптического гидролиза пептидов и идентификации их в программном пакете Mascot показывает, что этот пептид представляет собой N-концевой фрагмент гуанин-нуклеотидсвязывающего Go-белка, преобладающего в головном мозге млекопитающих.
Проводят электрофорез в 15%-ном полиакриламидном геле в денатурирующих условиях ИЭФ-фракции, собранной в интервале значений рН<3,0. Из геля вырезали полосу, соответствующую молекулярной массе приблизительно 66000 Да. Проведенный триптический гидролиз белка в геле с последующим масс-спектрометрическим исследованием продуктов гидролиза показал, что выделенный белок с молекулярной массой 66667 Да представляет собой белок семейства альбуминов млекопитающих под номером gi|1351907 в базе данных SwissProt. Методом Эдмана была установлена частичная N-концевая аминокислотная последовательность данного белка DTHKSEIAHRFKDLGE, которая имеет 100%-ную гомологию с N-концевой последовательностью зрелой молекулы БСА Bostaurus. Таким образом, ИЭФ-фракция, собранная в интервале значений рН<3,0 содержал белок gi|1351907 - представитель мультисемейства альбуминов сыворотки крови быка со значением pI в области рН 3,90-4,00 и смеси пептидов с молекулярными массами от 1000 до 6000 Да. Пример 3. Получение препаратов МГТБ-С и МГТБ-М на основе белково-пептидных комплексов, выделенных из сыворотки крови и ткани головного мозга быка, соответственно.
В качестве растворов БПК используют ИЭФ-фракции, собранные в области рН<3,0, выделенные из сыворотки крови и ткани мозга быка, соответственно, как это описано в Примерах 1 и 2. Во флакон, содержащий 0,1 мл водного раствора соответствующего БПК с концентрацией по белку 100±10 мкг/мл, добавляют 0,9 мл физраствора или дистиллированной воды и интенсивно встряхивают 25 раз. Отбирают 0,1 мл образовавшегося раствора в следующий флакон и добавляют 0,9 мл физраствора или дистиллированной воды, встряхивают 25 раз. Данную процедуру повторяют 17 раз, получая таким образом растворы БПК с 10-кратным последовательным разбавлением от 1 до 19 степени. Таким образом получают растворы соответствующего БПК с 10-1 по 10-19 мг/мл, приготовленные на физрастворе (для интраназального, внутримышечного введения), а также растворы БПК в таком же диапазоне концентраций, приготовленные на воде (для перорального приема). В экспериментах по изучению безопасности раствора БПК, выделенного из сыворотки крови быка, были исследованы растворы в концентрациях 10-5, 10-12, 10-19 мг/мл. Все растворы стерилизуют путем пропускания через стерильные мембранные фильтры GV с диаметром пор 0,22 мкм («Millipore», США). В качестве препарата МГТБ-С исследуют раствор БПК, выделенный из сыворотки крови быка, в концентрации 10-12 мг белка/мл; в качестве МГТБ-М исследуют раствор БПК, выделенный из ткани мозга быка, в концентрации 10-12 мг белка/мл.
Пример 4. Исследование влияния МГТБ, выделенных из сыворотки крови и мозга быка, на восстановление двигательных функций, а также состояние мозга, при экспериментальном геморрагическом инсульте у крыс Wistar in vivo.
4.1. Модель геморрагического инсульта у крыс in vivo
Описание экспериментальных животных и исследуемых препаратов.
Исследование действия препаратов МГТБ-С и МГТБ-М при хроническом введении проводили на 60 животных (крысы Wi, самцы, 2,5 мес, около 190 г) на модели экспериментального геморрагического инсульта (ГИ). Всего было сформировано 6 групп по 10 животных.
1. контрольная группа №1 - ложнооперированных животных
2. контрольная группа №2 - с моделью экспериментального ГИ
3. опытная группа №3 - с моделью экспериментального ГИ и внутримышечным (в/м) введением препарата МГТБ-С
4. опытная группа№4 - с модельюэкспериментального ГИ и интраназальным введением препарата МГТБ-М
5. опытная группа №5 - с моделью экспериментального ГИ и комбинированным совместным введением препаратов МГТБ-С (в/м) и МГТБ-М (и/н), вводимых через день (один день - один препарат, следующий день - другой препарат).
6. опытная группа №6 - с моделью экспериментального ГИ и введением препарата сравнения мексидол.
Для введения препарата МГТБ-М был выбран интраназальный путь введения, как эффективный способ доставки лекарственного средства в мозг. Доставка лекарств этим путем рассматривается как современная альтернатива пероральному приему, поскольку назальная полость легкодоступна, обильно васкуляризирована, хорошо проницаема и имеет большую площадь поверхности, что способствует хорошей всасываемости и увеличению биодоступности. Кроме того, препараты попадают в кровоток, избегая эффекта «первого прохождения» через печень.
Для препарата МГТБ-С был выбран внутримышечный путь введения, соответствующий пути введения препарата сравнения мексидол.
В качестве препарата сравнения был выбран отечественный синтетический препарат мексидол, препарат, для которого ранее были представлено его антиоксидантное и мембранопротективное действия. Эффективность мексидола была выявлена на нейрональном и сосудистом уровнях. Эффективная доза составляет 100 мг/кг.
В данном эксперименте животным вводили максимально возможный объем препарата МГТБ-М, применимый для и/н введения (объем отдельного однократного введения составлял до 40,0 мкл, по 20 мкл в носовой проход, при каждом введении). Для препарата МГТБ-С объем ежедневного введения составил 50 мкл, что соответствует объему введения препарата сравнения.
Исследуемые препараты МГТБ были получены, как указано в примере 1 и 2, далее были приготовлены стерильные растворы с концентрациями: МГТБ-С - 10-12 мг белка /мл и МГТБ-М - 10-12 мг белка /мл (пример 3).
Препарат сравнения мексидол применяли готовый (ООО «НПК» ФАРМАСОФТ», 50 мг/мл) по 50 мкл на крысу.
Контрольным животным вводили физиологический раствор путем интраназального введения.
Интраназальное введение препаратов осуществлялось автоматической пипеткой назально по 40 мкл в одно и то же время дня, внутримышечное, в объеме 0,5 мл осуществляли поочередно в правую и левую заднюю конечность.
Получение модели геморрагического инсульта у крыс
Несмотря на существенные различия в этиологии и патогенезе ишемического и геморрагического инсультов (ГИ), их объединяет ухудшение кровоснабжения мозга. Так, геморрагический инсульт сопровождается генерализованным повышением тонуса сосудов мозга и как следствие - значительным снижением уровня кровоснабжения мозга. Этим определяется необходимость фармакологического воздействия на мозговые сосуды в этих условиях с целью восстановления исходного уровня мозгового кровообращения.
Интрацеребральную геморрагию воспроизводили у наркотизированных крыс по А.Н. Макаренко и соавторов (2002). В качестве общей анестезии использовали уретан (1,3 г/кг, внутрибрюшинно). Зубным бором высверливали симметричные отверстия слева и справа в проекции внутренней капсулы: Н=4 мм, L=3 мм, А=-1,5 мм от брегмы). Потом прокалывали твердую мозговую оболочку с помощью заточенной иглы-канюли и погружали ее с помощью стереотаксического прибора до требуемой глубины (4 мм). Затем мандрен - нож выдвигаели до упора, который обеспечивается верхним фиксатором, и производили три поворота влево и вправо, тем самым подсекая сосуды. Следующий этап: мандрен - нож извлекается, а в иглу-канюлю через 2-3 мин гамильтоновским шприцем вводят аутокровь 0,15 мл в область механической деструкции мозговой ткани. В большинстве случаев кровь распределяется в виде хорошо очерченной гематомы у конца инъекционной иглы с деформацией и разрушением подкорковых структур в области ядер таламуса, реже - в подкорковом белом веществе. Кровоток определяли в ипсилатеральном полушарии в 3 мм от повреждения и в контралатеральном полушарии - в точке, симметричной повреждению. После операции рану обеззараживали и зашивали, крыс помещали в клетки и наблюдали их состояние и процесс заживления в течение 2 недель [1].
4.2. Исследование влияния препаратов МГТБ-С, МГТБ-М и мексидола на кровоток и артериальное давление у крыс in vivo
Проведенные опыты показали, что геморрагическое поражение мозга вызывает значительное понижение уровня мозгового кровотока в коре большого мозга крыс в зоне повреждения в ипсилатеральном полушарии и в контралатеральном полушария в зоне, симметричной повреждению. Исходный уровень локального мозгового кровотока снижался сразу же после геморрагического повреждения мозга и через 30 минут был ниже исходного на 47% и 60%. Следует отметить, что при геморрагическом поражении мозга снижение локального мозгового кровотока в большинстве опытов наблюдалось в течение 1,5 - 2 часов наблюдения и к концу эксперимента составляло -50% и -70%. Геморрагическое поражение мозга сопровождалось понижением уровня артериального давления на 16 и 22% к концу эксперимента (фиг. 1).
Изменения локального мозгового кровотока в коре головного мозга крыс в условиях модели геморрагического инсульта при введении МГТБ-С.
Проведенные опыты показали, что МГТБ-С при внутривенном введении 0,6 мл наркотизированным крысам в условиях модели геморрагического инсульта усиливает кровоснабжение пораженного головного мозга. Цереброваскулярный эффект препарата начинает развиваться сразу же после введения (7% и 17% на 10 мин) и постепенно возрастает до конца эксперимента (60% и 50% на 90 мин). В этих условиях введение МГТБ-С вызывает повышение артериального давления в первом эксперименте в течение 90 минут после введения, во втором - увеличение начиналось с сороковой минуты.
Изменения локального мозгового кровотока в коре головного мозга крыс в условиях модели геморрагического инсульта при введении МГТБ-М.
Проведенные опыты показали, что МГТБ-М при интраназальном введении 40 мкл наркотизированным крысам в условиях модели геморрагического инсульта вызывал небольшое снижение кровообращения головного мозга (-7% и -10%) к 40 минуте после введения препарата, на 80-й и 90-й минутах этого эффекта не было. В проведенных экспериментах МГТБ-М оказывал разнонаправленное действие на артериальное давление в зависимости от фона, в эксперименте с более высоким значением артериального давления в точке «фон 2» оно снижалось, а в эксперименте с низким значением повышалось.
Изменения локального мозгового кровотока в коре головного мозга крыс в условиях модели геморрагического инсульта при комбинированном совместном введении МГТБ-С и МГТБ-М
Сразу после совместного введения МГТБ-С (0,6 мл в/в) и МГТБ-М (40 мкл интраназально) наркотизированным крысам в условиях модели геморрагического инсульта локальный мозговой кровоток (ЛМК) увеличивался на 47% в первом опыте и на 14% во втором. У первого животного ЛМК максимально возрастал до 90% на 40 минуте и постепенно снижался к концу эксперимента до уровня «фон 2». У второго животного уровень ЛМК постепенно возрастал до 60-й минуты эксперимента (увеличение на 64%), а затем снижался до 36% на 90-й минуте.
Артериальное давление в первом случае возрастало сразу на 11%, к середине опыта (40 минута) увеличение составляло 21%, а в конце эксперимента 9%. Во втором случае артериальное давление первоначально снижалось на 6%, к 40 минуте восстанавливалось до значения «фона 2» и на 70-й, 80-й минуте превышало его на 6% и 5%, соответственно.
Изменения локального мозгового кровотока в коре головного мозга крыс в условиях модели геморрагического инсульта при введении Мексидола
Уже на 10 минуте после введения мексидола (0,6 мл в/в) увеличение ЛМК составляло 10% и 7% для первого и второго экспериментов соответственно. Уровень кровотока под влиянием мексидола нарастает на протяжении эксперимента до 70,0% и 29% к 90 минуте (фиг. 5).
В этой серии опытов артериальное давление под влиянием мексидола снижалось после введения препарата и оставалось ниже значений «Фон 2» до 90-й минуты (до -17% и -25% для первого и второго экспериментов).
Полученные результаты позволяют сделать следующие выводы:
1. МГТБ-С в дозе 0,6 мл в/в увеличивал кровоток в коре головного мозга наркотизированных крыс в условиях модели геморрагического инсульта, вызывая при этом снижение уровня артериального давления.
2. МГТБ-М при интраназальном введении понижал локальный мозговой кровоток в теменной области мозга крыс на фоне разнонапраленного влияния на артериальное давление.
3. При комбинированном совместном применении МГТБ-С и МГТБ-М наблюдалось увеличение кровотока в коре мозга крыс в условиях
4. модели геморрагического инсульта без существенных изменений артериального давления.
5. Препарат мексидол у крыс в условиях геморрагического поражения мозга увеличивал кровоток в коре мозга крыс на фоне развивающейся гипотензии.
4.3. Результаты исследования эффективности действия МГТБ, выделенных из сыворотки крови и мозга крупного рогатого скота в поведенческих тестах
Для оценки терапевтических эффектов мембранотропных гомеостатических тканеспецифических биорегуляторов (МГТБ), выделенных из сыворотки крови и мозга млекопитающих (быка), которые в растворах низких концентраций могут оказывать влияние на основные биологические процессы истимулировать восстановительные и репаративные процессы в поврежденных тканях, было проведено исследование противоинсультного действия МГТБ на модели ГИ у крыс в сравнении с препаратом мексидол. Введение препаратов было начато в день операции, через 1 час.
Наблюдения за животными
Наблюдения за животными проводили в течение 28 дней после операции. Регистрировали вес, особенности поведения и состояния животных на 1, 3, 7, 14, 28 сутки. Выживаемость животных: во время операции и сразу после нее погибло 5 крыс - 2 из контрольной группы ложнооперированных животных, 3 из группы контроля ГИ. В ходе эксперимента была зафиксирована гибель крысы из группы препарата сравнения на 3 сутки после операции.
Динамика изменения веса животных
Вес животных опытных групп практически не отличался от веса животных контрольной группы в течение всего эксперимента. Максимальное снижение веса в течение всего эксперимента, наблюдаемое в группе животных получающих МГТБ-М, не превышало 7±% от значения контрольной группы л/о животных. Данные представлены в таблице 13.
Неврологическая оценка по шкале Stroke-index McGrow
В первые сутки после операции сильно выраженных неврологических нарушений (парез, паралич конечностей и пр.) не наблюдалось. Были отмечены такие нарушения как слабость, вялость и замедленность движений, а также в группе контроля ГИ у одной крысы отмечен параметр полуптоз первой степени - 1 балл; в группе с мексидолом у одной крысы - вялость, тремор, птоз 2 ст, парез 2 конечностей. Всего - 0,5+1,0+1,5+4=7 баллов. У остальных животных явно выраженные нарушения не были обнаружены.
4.4. Результаты еженедельных тестов для выявления влияния исследуемых препаратов на течение болезни ГИ в динамике
Схема периодичности выполнения тестов во время эксперимента
День операции - 0 сутки
Оценка по неврологической шкале - 1, 3 сутки
Тест «Открытое поле» -3, 2, 9, 16, 23 сутки
Тест «Вертикальная сетка» - 2, 3, 10, 17, 24 сутки.
Тест «Горизонтальная перекладина» - 2, 4, 11, 18, 25 сутки.
Тест «Экстраполяционное избавление) - 1, 2, 7, 14, 21, 27 сутки.
Взвешивание - -2, 3, 10, 17, 24 сутки.
Забор материала на гистологию на 7, 14, 28 сутки.
Результаты теста "Удержание на горизонтальной перекладине" для оценки тяжести угнетения моторных функций, координации движения и терапевтических эффектов препаратов МГТБ-С и МГТБ-М.
Тест проводили для регистрации неврологического дефицита, выражающегося в нарушении координации движений, до введения препаратов (фоновое значение) и 1 раз в неделю на протяжении всего периода введения - 4-х недель. Неспособность животных удерживать равновесие на стержне в течение 2 минут рассматривалось как проявление нарушения координации движений.
Оценивали время удержания на перекладине в секундах. Тестирование животных проводили непосредственно до введения, чтобы исключить влияние инъекционного введения на выполнение теста. Тестирование животных в таком режиме при хроническом введении позволило выявить терапевтические эффекты МГТБ-С и МГТБ-М, а также изучить изменение действия препаратов в динамике.
Необходимо отметить, что в первую неделю после операции у контрольных групп как ложнооперированных животных, так и с моделью ГИ, координация движений была нарушена значительно больше по сравнению с фоновым значением для этих животных - на 35-50%, соответственно, что, вероятно, можно объяснить стрессовым состоянием животных в результате операций и каждодневных манипуляций. В то же время, через две и три недели после операции показатели выполнения теста у группы №2 - животных с моделью ГИ (негативный контроль) оставались наиболее (достоверно) низкими, что может служить косвенным подтверждением развития ГИ. К концу четвертой недели различие в способности выполнять тест у животных контрольных групп (№1 и №2) исчезла, что может свидетельствовать о восстановлении функций ЦНС после оперативного вмешательства.
Наибольшая эффективность при хроническом введении исследуемых препаратов была выявлена у МГТБ-С в течение всего периода введения. Значимые отличия средних результатов выполнения теста для группы животных, получавших МГТБ-С, от контрольной группы животных с геморрагическим инсультом были выявлены на первой неделе введения препарата, при этом значение среднего времени удержания на перекладине вдвое превысило значение негативного контроля и достигло фонового значения. Эффект сохранялся до конца периода введения - в течение 4-х недель. Важно отметить, что действие МГТБ-С приводило к большему или сопоставимому эффекту в данном тесте по сравнению с мексидолом в течение всего периода исследования, приблизительно в 2-4 раза для групп №3 и №6.
Эффективность применения второго исследуемого препарата МГТБ-М также была обнаружена, но в значительно меньшей степени. Наиболее значимое отличие от негативного контроля ГИ (45%) было выявлено к концу второй недели введения, с последующим снижением эффективности.
При комбинированном введении двух исследуемых препаратов-в/м МГТБ-Си и/н - МГТБ-М, также было обнаружено улучшение способности животных выполнять тест на второй и третьей неделе исследования, по сравнению с негативным контролем, при этом значимое отличие результатов этой группы животных было выявлено через две недели применения препаратов.
Результаты проведения теста «Удержание на вертикальной сетке»
Данный тест использовали для регистрации мышечного тонуса и оценки влияния на физическую работоспособность крыс в условиях статической нагрузки.
В условиях эксперимента использовали жестко закрепленную вертикально-ориентированную сетку шириной 40 см и высотой 100 см, ограниченную со всех сторон деревянными бортами. В экспериментальных условиях данная процедура обеспечивает равномерное распределение нагрузки на все группы мышц, в особенности на мускулатуру конечностей. Преимущества данного метода состоит в том, что достаточно большая высота установки способствует тому, что животное самостоятельно контролирует уровень физической нагрузки и перестает удерживать тело только при появлении усталости (перемещается на нижнюю горизонтальную поверхность).
Разовое тестирование состоит из 5-ти предъявлений (цикл): экспериментатор возвращает животное на вертикальную сетку сразу после того, как оно перемещается на горизонтальную поверхность 4 раза. Фиксировалось суммарное время «висения» на сетке. Критерием эффективности препаратов является достоверное увеличение суммарного времени выполнения теста в условиях статической физической нагрузки после введения препарата по сравнению с контролем и эталонным препаратом.
Необходимо отметить, что в связи с тем, что результаты в группе негативного контроля, полученные при выполнении теста как через неделю, так и в следующие периоды исследования практически не отличались от значений группы ложнооперированных животных, можно сделать вывод, что данный тест не может полностью отражать действие препаратов на модели ГИ. Тем не менее важно отметить, что интраназальное введение МГТБ-М в группе животных №4 привело к достоверному увеличению как среднего времени удержания за 5 подходов, так и максимального времени за подход на 53±23% и 100±36%, соответственно, в течение всего периода введения препарата, что свидетельствует о повышении выносливости и улучшении мышечного тонуса животных при интраназальном введении МГТБ-М.
Введение МГТБ-С в условиях данного теста приводило к противоположному эффекту - снижению суммарного и максимального времени выполнения теста, но без достижения уровня достоверности. В то же время, совместное использование препаратов в течение одной недели способствовало увеличению значений исследуемых параметров (суммарного и максимального времени выполнения теста на 40 и 60%, соответственно) по сравнению с контрольной группой животных с геморрагическим инсультом - группа №2. Применение препарата сравнения мексидол практически не оказывало никакого влияния на способность животных выполнять тест.
Результаты проведения теста «Открытое поле» (представлены на фиг. 1-5)
Неврологическая оценка по шкале Stroke-index McGrow
В первые сутки после операции сильно выраженных неврологических нарушений (парез, паралич конечностей и пр.) не наблюдалось. Были отмечены такие нарушения как слабость, вялость и замедленность движений, а также в группе контроля ГИ у одной крысы отмечен параметр полуптоз первой степени - 1 балл; в группе с мексидолом у одной крысы - вялость, тремор, птоз 2 ст, парез 2 конечностей. Всего - 0,5+1,0+1,5+4=7 баллов. У остальных животных явно выраженные нарушения не были обнаружены.
4.5. Результаты еженедельных тестов для выявления влияния исследуемых препаратов на течение болезни ГИ в динамике
Схема периодичности выполнения тестов во время эксперимента
День операции - 0 сутки
Оценка по неврологической шкале - 1, 3 сутки
Тест «Открытое поле» - 3, 2, 9, 16, 23 сутки
Тест «Вертикальная сетка» - 2, 3, 10, 17, 24 сутки.
Тест «Горизонтальная перекладина» - 2, 4, 11, 18, 25 сутки.
Тест «Экстраполяционное избавление) - 1, 2, 7, 14, 21, 27 сутки.
Взвешивание - -2, 3, 10, 17, 24 сутки.
Забор материала на гистологию на 7, 14, 28 сутки.
Результаты теста "Удержание на горизонтальной перекладине" для оценки тяжести угнетения моторных функций, координации движения и терапевтических эффектов препаратов МГТБ-С и МГТБ-М
Тест проводили для регистрации неврологического дефицита, выражающегося в нарушении координации движений, до введения препаратов (фоновое значение) и 1 раз в неделю на протяжении всего периода введения - 4-х недель. Неспособность животных удерживать равновесие на стержне в течение 2 минут рассматривалось как проявление нарушения координации движений. Оценивали время удержания на перекладине в секундах. Тестирование животных проводили непосредственно до введения, чтобы исключить влияние инъекционного введения на выполнение теста. Тестирование животных в таком режиме при хроническом введении позволило выявить терапевтические эффекты МГТБ-С и МГТБ-М, а также изучить изменение действия препаратов в динамике.
Необходимо отметить, что в первую неделю после операции у контрольных групп как ложнооперированных животных, так и с моделью ГИ, координация движений была нарушена значительно больше по сравнению с фоновым значением для этих животных - на 35-50%, соответственно, что, вероятно, можно объяснить стрессовым состоянием животных в результате операций и каждодневных манипуляций. В то же время, через две и три недели после операции показатели выполнения теста у группы №2 - животных с моделью ГИ (негативный контроль) оставались наиболее (достоверно) низкими, что может служить косвенным подтверждением развития ГИ. К концу четвертой недели различие в способности выполнять тест у животных контрольных групп (№1 и №2) исчезла, что может свидетельствовать о восстановлении функций ЦНС после оперативного вмешательства.
Наибольшая эффективность при хроническом введении исследуемых препаратов была выявлена у МГТБ-С в течение всего периода введения. Значимые отличия средних результатов выполнения теста для группы животных, получавших МГТБ-С, от контрольной группы животных с геморрагическим инсультом были выявлены на первой неделе введения препарата, при этом значение среднего времени удержания на перекладине вдвое превысило значение негативного контроля и достигло фонового значения. Эффект сохранялся до конца периода введения - в течение 4-х недель. Важно отметить, что действие МГТБ-С приводило к большему или сопоставимому эффекту в данном тесте по сравнению с мексидолом в течение всего периода исследования, приблизительно в 2-4 раза для групп №3 и №6.
Эффективность применения второго исследуемого препарата МГТБ-М также была обнаружена, но в значительно меньшей степени. Наиболее значимое отличие от негативного контроля ГИ (45%) было выявлено к концу второй недели введения, с последующим снижением эффективности.
При комбинированном введении двух исследуемых препаратов, в/м МГТБ-С и и/н - МГТБ-М, также было обнаружено улучшение способности животных выполнять тест на второй и третьей неделе исследования, по сравнению с негативным контролем, при этом значимое отличие результатов этой группы животных было выявлено через две недели применения препаратов.
Результаты проведения теста «Удержание на вертикальной сетке»
Данный тест использовали для регистрации мышечного тонуса и оценки влияния на физическую работоспособность крыс в условиях статической нагрузки.
В условиях эксперимента использовали жестко закрепленную вертикально-ориентированную сетку шириной 40 см и высотой 100 см, ограниченную со всех сторон деревянными бортами. В экспериментальных условиях данная процедура обеспечивает равномерное распределение нагрузки на все группы мышц, в особенности на мускулатуру конечностей. Преимущества данного метода состоит в том, что достаточно большая высота установки способствует тому, что животное самостоятельно контролирует уровень физической нагрузки и перестает удерживать тело только при появлении усталости (перемещается на нижнюю горизонтальную поверхность).
Разовое тестирование состоит из 5-ти предъявлений (цикл):
экспериментатор возвращает животное на вертикальную сетку сразу после того, как оно перемещается на горизонтальную поверхность 4 раза. Фиксировалось суммарное время «висения» на сетке. Критерием эффективности препаратов является достоверное увеличение суммарного времени выполнения теста в условиях статической физической нагрузки после введения препарата по сравнению с контролем и эталонным препаратом.
Необходимо отметить, что в связи с тем, что результаты в группе негативного контроля, полученные при выполнении теста как через неделю, так и в следующие периоды исследования практически не отличались от значений группы ложнооперированных животных, можно сделать вывод, что данный тест не может полностью отражать действие препаратов на модели ГИ. Тем не менее важно отметить, что интраназальное введение МГТБ-М в группе животных №4 привело к достоверному увеличению как среднего времени удержания за 5 подходов, так и максимального времени за подход на 53±23% и 100±36%, соответственно, в течение всего периода введения препарата, что свидетельствует о повышении выносливости и улучшении мышечного тонуса животных при интраназальном введении МГТБ-М.
Введение МГТБ-С в условиях данного теста приводило к противоположному эффекту - снижению суммарного и максимального времени выполнения теста, но без достижения уровня достоверности. В то же время, совместное использование препаратов в течение одной недели способствовало увеличению значений исследуемых параметров (суммарного и максимального времени выполнения теста на 40 и 60%, соответственно) по сравнению с контрольной группой животных с геморрагическим инсультом - группа №2. Применение препарата сравнения мексидол практически не оказывало никакого влияния на способность животных выполнять тест.
Результаты проведения теста «Открытое поле»
Тест «Открытое поле» также проводился перед началом введения препаратов и еженедельно, в течение 4 недель введения препаратов. Определяли такие показатели как количество изменения положения животного - вертикальная стойка, груминг, выход в центр, которые позволяют оценить двигательную и исследовательскую функции животных
Анализ данных, полученных при проведении теста «Открытое поле» не выявил достоверного уровня различий между группами животных ни по одному из измеряемых параметров во все дни исследования, что связано с достаточно высоким индивидуальным разбросом результатов и вследствие этого большим стандартным отклонением.
В то же время, наблюдается устойчивая тенденция к увеличению горизонтальной активности у животных группы №5 (МГТБ-С/МГТБ-М) на первой, третьей и четвертой неделе по сравнению с контрольной группой ГИ №2, а также у крыс группы №3 и №4 - к концу введения препаратов. Отмечено увеличение вертикальной активности у группы, получающей комплекс препаратов МГТБ (МГТБ-С/МГТБ-М) - в течение всего периода исследования.
В группе животных, получающих препарат сравнения мексидол, начиная со второй недели можно наблюдать снижение горизонтальной и вертикальной активности, что может свидетельствовать о снижении исследовательской активности (и, возможно, увеличении чувства страха).
Таким образом, полученные результаты позволяют сказать о выявлении эффекта препаратов МГТБ на исследовательскую и двигательную активность животных, но без достоверного уровня значимости, на уровне тенденции.
Результаты проведения теста «Экстраполяционное избавление»
Тест «Экстраполяционное избавление» (ТЭИ) предложен в 1982 г. Н.А Бондаренко (лаборатория «Фармакологии эмоционального стресса» НИИ Фармакологии АМН, Москва) - сотрудником академика А.В. Вальдмана. В этой установке крыса, помещенная в воду внутри узкого прозрачного цилиндра, совершает либо прыжки вверх, либо пытается поднырнуть под нижним краем цилиндра. Ранее было показано, что поведение подныривания в ТЭИ является целенаправленным (поиск места, позволяющего спастись из воды), и при подкреплении быстро выучивается животным [7] (Бондаренко Н.А. 2013). Прыжковое поведение крыс, напротив, усиливается при снижении когнитивных функций животных, в том числе и при введении высоких (нарушающих внимание) доз бензодиазепиновых транквилизаторов.
Неадаптивное прыжковое поведение крыс при помещении в является следствием повышенной тревожности этих животных.
Следовательно, чем меньше прыжков и быстрее подныривание, тем меньше тревожность и выше когнитивная функция животных.
При выполнении теста регистрировали время замирания, количество прыжков, а также время до подныривания животных.
В ТЭИ в контрольных группах №1 и 2 - л/о и ГИ, наблюдалось отличие значений от фонового уровня с разнонаправленным характером. В первую неделю в группе ложнооперированных животных происходило достоверное увеличение количества прыжков и латентного периода подныривания по отношению к фоновому значению, что может свидетельствовать об увеличении стрессового состояния животных. На этом фоне, снижение значений таких параметров как прыжки и подныривание (приблизительно на 25-60)%) в группах, получающих мексидол - №6, а также при совместном применении МГТБ-С и МГТБ-М - №5 на первой неделе (приблизительно на 25-50%), может свидетельствовать о положительном эффекте данных препаратов на уменьшение тревожности у животных.
Наблюдалось также значимое снижение латентного периода подныривания в группе №5 с комбинированным применением МГТБ-С и МГТБ-М в течение всего периода проведения эксперимента, а также в группе №4 с применением МГТБ-М на третьей-четвертой неделе. Возможно, что эти данные свидетельствуют не только об уменьшении тревожности, но и увеличении важной когнитивной способности -способности к запоминанию. Однако различия оказались малодостоверными из-за разброса индивидуальных данных.
Выводы по действию набора фармакологического средства при использовании его при гемморрагическом инсульте
Полученные результаты позволяют сделать следующие выводы. Лучшее действие на восстановление кровотока оказывает комбинированное применение препаратов МГТБ-С и МГТБ-М, которое приводит к увеличению кровотока в коре головного мозга при сохранении постоянными параметров артериального давления. Применяемый препарат сравнения мексидол вызывал понижение артериального давления, также увеличивая локальный кровоток в головном мозге, полное зарастание раневого пространства нервными клетками, образовавшими отростки.
Исходя из динамики зарастания и восстановления раневого канала на протяжении 4 недель после образования геморрагического инсульта, можно сделать вывод о наиболее эффективном воздействии на восстановление нервной ткани в группе животных №5 с совместным воздействием МГТБ-С и МГТБ-М. Именно в этом случае наблюдали быстрое восстановление как клеток нейроэпителия, так и клеток сосудистых сплетений. Это обеспечило наиболее быстрое и полное восстановление кровотока в области повреждения, а также проведение межклеточных сигналов связей в нервной ткани, что выразилось в восстановлении двигательных и когнитивных способностей у крыс с экспериментальным геморрагическим инсультом.
Результаты исследования терапевтических эффектов мембранотропных гомеостатических тканеспецифических биорегуляторов (МГТБ), выделенных из сыворотки крови и ткани мозга крупного рогатого скота (быка) в сравнении со стандартным препаратом мексидол, позволяют сделать следующие выводы:
- Препараты МГТБ-С и МГТБ-М оказывают влияние на все исследованные параметры, включая мозговое кровообращение, координацию движений, исследовательскую активность (когнитивные функции животных), но обладают неодинаковой значимостью и направленностью эффекта.
- МГТБ-С (в дозе 0,6 мл в/в) увеличивал кровоток в коре головного мозга наркотизированных крыс в условиях модели геморрагического инсульта, вызывая при этом снижение уровня артериального давления, а МГТБ-М при интраназальном введении понижал локальный мозговой кровоток в теменной области мозга крыс на фоне разнонапраленного влияния на артериальное давление.
- При комбинированном введении МГТБ-С и МГТБ-М наблюдается увеличение кровотока в коре мозга крыс в условиях модели геморрагического инсульта без существенных изменений артериального давления.
- Препарат мексидол у крыс в условиях геморрагического поражения мозга увеличивал кровоток в коре мозга крыс на фоне развивающейся гипотензии, возможно из-за низкой продукции цереброспинальной жидкости.
- В тесте «Удержание на горизонтальной перекладине» наибольшая эффективность при хроническом введении исследуемых препаратов была выявлена у МГТБ-С в течение всего периода введения. Эффект сохранялся до конца периода введения - 4 недели.
Улучшение двигательной активности можно объяснить восстановлением кровотока в области повреждения и поддержанием работы двигательных нейронов. Действие приводило к большему или сопоставимому эффекту в данном тесте по сравнению с мексидолом в течение всего периода исследования в сравнении с группой ложнооперированных животных. При комбинированном введении двух исследуемых препаратов, в/м введении МГТБ-С и и/н введении МГТБ-М, также было обнаружено улучшение способности животных выполнять тест на второй и третьей неделе исследования, по сравнению с негативным контролем, при этом значительное различие в результатах, полученных при исследовании животных этой группы и всех других, кроме группы №1 (ложнооперированные), было выявлено через две недели применения препаратов.
В тесте «Удержание на вертикальной сетке» применение МГТБ-М привело к значительному увеличению как среднего времени удержания за 5 подходов, так и максимального времени за подход на 53±23% и 100±36%, соответственно, в течение всего периода введения препарата, что свидетельствует о повышении выносливости и улучшении мышечного тонуса животных. Введение МГТБ-С в условиях данного теста приводило к противоположному эффекту - снижению суммарного и максимального времени выполнения теста. В то же время, совместное использование препаратов МГТБ-С и МГТБ-М в течение одной недели способствовало увеличению значений исследуемых параметров (суммарного и максимального времени выполнения теста на 40 и 60%, соответственно) по сравнению с животными контрольной группы с геморрагическим инсультом. Применение препарата сравнения мексидол практически не оказывало никакого влияния на способность животных выполнять тест.
Проведение теста «Открытое поле» не выявило достоверных различий между группами. Наблюдается устойчивая тенденция к увеличению горизонтальной и вертикальной активности (двигательная и исследовательская активность) у животных группы МГТБ-С/МГТБ-М в течение всего периода исследования, но без влияния на уровень их тревожности. В группе, получающей мексидол, начиная со второй недели, имеется тенденция к увеличению тревожности (или, возможно, увеличению заторможенности), что выражается в уменьшении актов груминга, горизонтальной и вертикальной активности.
В тесте «экстраполяционное избавление» на первой неделе в группе ложнооперированных животных происходит достоверное увеличение количества прыжков и латентного периода подныривания по отношению к группе экспериментального геморрагического инсульта. В группе, получавшей мексидол, на первой неделе достоверное снижение латентного периода подныривания, что свидетельствует о уменьшении тревожности.
Исследованные препараты, приготовленные на основе белок-пептидных комплексов, полученных из сыворотки (МГТБ-С) и из ткани мозга (МГТБ-М) быка, обладают эффективностью в используемых тестах на модели экспериментального геморрагического инсульта у крыс. Особенно высокую эффективность препараты МГТБ-С и МГТБ-М проявляют при совместном комбинированном применении: они улучшали координацию движений животных, двигательную и исследовательскую активность, восстанавливали кровоток. Таким образом, можно заключить, что исследуемые препараты МГТБ-С и МГТБ-М могут иметь клинический потенциал и перспективны для использования их в качестве средств для терапии различных патологий головного мозга и нервных заболеваний, например, геморрагического инсульта, особенно, в реабилитационный период после данного заболевания как препараты с потенциальным нейропротективным и психоактивирующим действием.
Пример 5. Исследование влияния препаратов МГТБ-С и МТГБ-М на развитие болезни Паркинсона в эксперименте у крыс in vivo.
5.1. Экспериментальная модель болезни Паркинсона у крыс in vivo
Описание экспериментальных животных, исследуемых препаратов и условий эксперимента.
Исследование действия препаратов МГТБ-С и МГТБ-М при хроническом введении проводили на 60 животных (крысы Wi, самцы, 2,5 мес, около 190 г) на экспериментальной и индуцированной модели болезни Паркинсона (БП). Всего было сформировано 6 групп по 10 животных.
- контрольная группа №1 - животным ничего не вводили - контрольная группа №2 - с моделью экспериментального БП
- контрольная группа №3 - с индуцированной БП и введением препарата сравнения L-DOPA/бенсеразид (1:4)
- опытная группа №4 - с индуцированной БП и интраназальным введением препарата МГТБ-М (из мозга)
- опытная группа с индуцированной БП и интраназальным введением препарата МГТБ-С (из сыворотки крови)
- опытная группа с индуцированной БП и комбинированным интраназальным введением препаратов МГТБ-М и МГТБ-С, вводимых через день (один день - один препарат, следующий день
- другой препарат).
Для введения препаратов МГТБ-М и МГТБ-С был выбран интраназальный путь введения, как эффективный способ доставки в мозг. Доставка лекарств этим путем рассматривается как современная альтернатива пероральному приему, поскольку назальная полость легкодоступна, обильно васкуляризирована, хорошо проницаема и имеет большую площадь поверхности, что способствует хорошей всасываемости и увеличению биодоступности. Кроме того, препараты попадают в кровоток, избегая эффекта «первого прохождения» через печень.
Известно, что высокая эффективность интраназального введения дофамина была подтверждена экспериментально на крысах линии Wistar с моделью, индуцированной 6-гидроксидофамином (6-OHDA). Обнаружено облегчение симптомов болезни, оцененных в тестах на вращение и постановку передней конечности [PumM. etal., 2009; OwenY.C. et2012].
Кроме того, интраназальное введение используется традиционно для доставки в мозг пептидных препаратов [Каменский А.А. с соавт., 1988; VeronikaG.D. etal., 2009].
В качестве препарата сравнения был выбран 3,4-дигидроксифенилаланин (L-DOPA, Sigma) в сочетании с ингибитором периферического декарбоксилирования, препятствующим превращению препарата в дофамин в периферических тканях (бенсеразид, Sigma) в соотношении 1:4, что воспроизводит стандартный препарат для лечения болезни Паркинсона, применяемый в терапии для снижения выраженных симптомов заболевания. Препарат устраняет гипокинезию, ригидность, тремор. Действие L-DOPA обусловлено превращением в дофамин непосредственно в ЦНС, что приводит к восполнению дефицита дофамина в
ЦНС. Терапевтический эффект у человека отмечается через 6-8 дней, а максимальный - через 25-30 сут.
В данном эксперименте животным вводили максимально возможную дозу, учитывая путь введения, минимальный объем введения и низкую растворимость субстанции L-DOPA.
Все препараты вводили животным в носовые проходы. Объем отдельного однократного введения составлял до 40,0 мкл (по 20 мкл в носовой проход, при каждом введении). Препарат сравнения L-DOPA в концентрации 3,0 мг/мл готовили еженедельно, непосредственно перед началом эксперимента. В качестве растворителя использовали физиологический раствор с добавлением аскорбиновой кислоты (1%, рН 2.6) для улучшения растворимости и предотвращения окисления препарата при растворении. Для оптимального растворения L-DOPA рН раствора снижали до 1.5 и после растворения препаратов значение рН повышали до значения не выше 7.0 (строго). Раствор хранили при +4°С в течение недели, прекращая использование при появлении желтоватого оттенка раствора, свидетельствующего об окислении действующего вещества. Концентрация ингибитора бенсеразида составила 0,75 мг/мл.
Контрольным животным вводили физиологический раствор путем интраназального введения.
Эксперимент проводили на 60 крысах Wistar, самцы, 4 месяца, весом около 400 г.
Животные содержались в контролируемых условиях окружающей среды (18-26°С и 30-70% относительная влажность). Температура и влажность постоянно контролировались в каждой экспериментальной комнате и вручную документировались раз в день. В комнатах содержания животных поддерживался 12 часовой цикл освещения и, по крайней мере, 10-ти кратная смена объема воздуха комнаты в час.
Животные были адаптированы/акклиматизированы в лаборатории в течение 14 дней до начала введения. Во время этого периода осуществлялся ежедневный осмотр внешнего состояния животных. Животные с обнаруженными в ходе осмотра отклонениями в экспериментальную группу не были включены.
В экспериментальную группу были отобраны животные без признаков отклонений внешнего вида, по результатам предварительных тестов, так, чтобы индивидуальное значение массы не отклонялось от среднего значения в пределах пола не более чем на 20%, а средние значения массы тела в группах достоверно не отличались.
Каждому животному был присвоен индивидуальный номер, помечаемый покрасом и фиксируемый на карточке клетки.
Выявление смертности, тяжелого состояния, общего состояния здоровья и признаков токсичности проводилось ежедневно.
Клинический осмотр проводился еженедельно.
Масса тела регистрировалась перед введением и еженедельно в течение периода введения препаратов.
Получение фармакологической модели болезни Паркинсона у крыс in vivo
В эксперименте была использована фармакологическая модель болезни Паркинсона (БП) с использованием нейротоксина 6-OHDA (6-гидроксидофамин, Sigma) для разрушения компактной части черной субстанции. Токсин вводили односторонне, в правую часть мозга, при помощи стереотаксической установки для крыс по стандартной методике, по координатам АР-4.4; L-1,2; Н 7,8, что соответствует правому медиальному переднемозговому пучку [CenciM. etal, 1998; HannaS.L. etal., 2007]. Операцию проводили под общим наркозом. Крысам внутрибрюшинно вводили раствор хлоралгидрата (Chloralhydrat, ALDRICH) в дозе 400 мг/кг, 100 мг/мл в физиологическом растворе (Нижфарм). Зафиксировав животное, сверлили отверстие в черепе по выбранным координатам, затем вводили иглу канюли, заполненной раствором 6-OHDA в дегазованном физрастворе (4 мкг/мкл), или, в случае животных из группы интактного контроля, дегазованным физраствором. При помощи мерного шприца на 10 мкл вводили 4,5 мкл раствора со скоростью 1 мкл/мин. После введения иглу оставляли в отверстии еще на 5 минут. После операции рану обеззараживали и зашивали, крыс помещали в клетки и наблюдали их состояние и процесс заживления в течение 2 недель.
Тесты для подтверждения развития модели болезни Паркинсона
а) "Вращение, вызванное введением апоморфина" для доказательства развития болезни Паркинсона
Развитие нейродегенерации подтверждали через 3 недели после операции регистрацией вращения в ответ на внутрибрюшинное введение раствора апоморфина (R-(-)-Apomorphine hydrochloride hemihydrate, Sigma) 1,6 мг/кг (0,8 мг/мл, в физрастворе). Через 10 минут после инъекции крысу помещали в стеклянный цилиндр радиусом 30 см и высотой 40 см. В течение последующих 10 минут регистрировали количество полных оборотов, совершенных крысой в каждую сторону. По количеству оборотов в минуту в сторону, противоположную стороне повреждения мозга судили о степени нейродегенерации у животных. Для участия в дальнейшем эксперименте отбирали животных, совершавших более 2 оборотов/мин.
б) "Открытое поле" для получения предварительных данных о двигательной и исследовательской активности.
Тест «Открытое поле» применяли для оценки возможных последствий хронического введения препаратов на двигательную и исследовательскую активность экспериментальных животных в условиях свободного поведения. Тест проводили по стандартной методике [Титов С.А и др., 1980]. В течение 2 минут регистрировали следующие параметры: горизонтальная активность, количество выходов в центр "открытого поля", количество стоек, количество актов груминга.
в) "Постановка конечности" для оценки тяжести угнетения моторных функций.
Тест «Постановка конечности» использовали для оценки координации движений животных с односторонне разрушенной черной субстанцией. Животное держали одной рукой под живот, параллельно краю лабораторного стола, ниже его поверхности. Затем медленно поднимали таким образом, чтобы вибриссы касались края стола, а в конечной точке подъема передняя лапа соответствующей стороны тела была выше края столешницы. Критерием выполнения попытки считали постановку передней конечности ближней к столу стороны тела на поверхность стола. Испытание повторяли 10 раз для каждой стороны, занося в протокол количество успешных попыток.
5.2. Тесты для выявления влияния исследуемых препаратов на течение болезни Паркинсона в динамике.
Еженедельно:
Тест "Постановка конечности" для оценки тяжести угнетения моторных функций и эффективности лечения
Тест использовали для оценки координации движений животных с односторонне разрушенной черной субстанцией. Животное держали одной рукой под живот, параллельно краю лабораторного стола, ниже его поверхности. Затем медленно поднимали таким образом, чтобы вибриссы касались края стола, а в конечной точке подъема передняя лапа соответствующей стороны тела была выше края столешницы. Критерием выполнения попытки считали постановку передней конечности ближней к столу стороны тела на поверхность стола. Испытание повторяли 10 раз для каждой стороны, занося в протокол количество успешных попыток. Тест проводится дважды, за 30 мин до и через 30 мин после введения очередной дозы препарата для оценки длительности эффекта.
Разовые тесты (интервал между проведениями не менее месяца):
а) "Открытое поле" для получения данных по двигательной и исследовательской активности, общему состоянию животных, депрессивности.
Тест «Открытое поле» применяли для оценки возможных последствий хронического введения препаратов на двигательную и исследовательскую активность экспериментальных животных в условиях свободного поведения. Тест проводили по стандартной методике [Титов С.А. с соавт., 1980].
Поведение крыс исследовали в «открытом поле» в соответствии с общепринятыми стандартами. «Открытое поле» - квадратная равномерно освещенная площадка размером 80×80 см, огороженная непрозрачными стенками высотой 15 см. Пол «открытого поля» расчерчен на квадраты со стороной 20 см. Исходно животное помещается в центр поля, после чего экспериментатор фиксирует поведенческую активность в течение 5-ти минут.
В течение 2 минут регистрировали следующие параметры: горизонтальная активность, количество выходов в центр "открытого поля", количество стоек, количество актов груминга.
б) Передвижение по горизонтальной сетке с видеофиксацией, для оценки тяжести угнетения моторных функций и эффективности лечения.
Тест «Передвижение по горизонтальной сетке» использовали, чтобы выявить асимметрию в координации движений конечностей, вызванную односторонней деградацией черной субстанции. Установка представляла приподнятый над поверхностью стола на 40 см квадратный каркас 40×40 см с натянутой поверх металлической сеткой. Сторона ячейки составляла 2,5 см. Животное помещали на установку и регистрировали его передвижения на видеокамеру в течение 2-х минут. Последующий анализ видеозаписи включал в себя подсчет общего количества шагов каждой из передних конечностей за 2 минуты, а также общее количество «ошибок» - промахов в постановке, когда передняя конечность не находит опоры и проваливается ниже уровня сетки [Chaoetal., 2012].
Процент ошибок для конечности рассчитывали по формуле 1:
Коэффициент асимметрии (%) рассчитывали по формуле 2:
Анализ данных
Для всех данные применялась описательная статистика: подсчитаны среднее значение и стандартное отклонение, которые вместе со значением N представлены в итоговых таблицах
Статистический анализ проводился программой Statistica. Различия определялись при 0.05% уровне достоверности и отражены значком *.
5.3. Полученные результаты и их обсуждение
Тест «Постановка конечности», острое введение
Тест проводили через 30 минут после первого введения препаратов. За 100% результата принимали средний результат в группе здорового контроля. Результаты остальных групп составили:
в группе №2 (негативного контроля) - 63±19%;
в группе №3 (получавшей препарат сравнения L-DOPA/бенсеразид) - 85*±15%;
в группе №4 (получавшей МГТБ-М) - 68±19%;
в группе №5 (получавшей МГТБ-С) - 59±27%;
в группе (получавшей МГТБ-С/МГТБ-М) - 70±19%
Было зафиксировано достоверное отличие средних результатов теста для группы, получавшей L-DOPA/бенсеразид по сравнению с группой негативного контроля (р<0,05). Животные других групп, получавших лечение, не демонстрировали отличие средних результатов теста от группы животных с моделью БП, не получавших лечения (негативный контроль). Результаты всех групп животных с индуцированной моделью БП достоверно отличались от результатов животных группы здорового контроля.
Тест «Постановка конечности», субхроническое введение.
Тест проводили 1 раз в неделю, на протяжении всего периода введения - 4-х недель. Тестирование животных проводили непосредственно перед введением препаратов и через 30 минут после введения. Тестирование животных в таком режиме при хроническом введении позволило выявить эффективность действия препарата непосредственно после введения и изучить действие препаратов через сутки после введения.
Результаты теста были получены через 30 минут после введения препаратов в динамике. Важно отметить, что препарат сравнения L-DOPA обнаруживает эффективность действия через 30 мин после введения на протяжении всего периода исследования. В то же время, достоверно значимые отличия от группы негативного контроля были получены только лишь при остром применении (85±15%).
При субхроническом введении выявлена эффективность исследуемого препарата МГТБ-М в течение всего периода введения. Достоверные отличия средних результатов выполнения теста для группы животных №4, получавших МГТБ-М, от группы №2 негативного контроля БП были выявлены к концу третьей недели введения препарата, при этом значение среднего результата достигло 87±21%, с сохранением эффекта до конца периода введения - в течение 2-х недель.
Эффективность применения второго исследуемого препарата МГТБ-С также была обнаружена, но в меньшей степени, без достижения достоверно значимых результатов.
При комбинированном введении (совместное использование в наборе двух исследуемых препаратов МГТБ-С и МГТБ-М с интервалом времени в один день) также было обнаружено улучшение способности животных выполнять тест в течение всего периода исследования, по сравнению с негативным контролем, при этом достоверное отличие результатов этой группы животных было выявлено через неделю применения препаратов (90±13%).
Важно отметить, что к концу периода введения препаратов у всех групп животных получавших исследуемые препараты, при тестировании через 30 мин после введения, обнаружено улучшение способности выполнять тест в большей степени по сравнению с группой животных, получающих препарат сравнения. Средние значения составили 74±27%, *87±14%, 71±18% и 65±24%, соответственно, для групп получавших МГТБ-С, МГТБ-М, комбинацию препаратов МГТБ-С и МГТБ-М (набор из двух препаратов с интервалом времени в один день), а также препарата сравнения, в то время как такая способность выполнять тест у животных группы негативного контроля снизилась до 50%.
Результаты тестирования животных перед введением очередной дозы препарата или, соответственно, через 24 часа после введения предыдущей дозы показали, что достоверно значимые результаты были получены для препарата МГТБ-М через три недели введения (82±21%), с сохранением эффекта к концу четвертой недели (82±14%). Таким образом, выявлена способность препарата улучшать моторные функции животных, что отражается в увеличении эффективности выполнения теста «Постановка конечности» через 3 недели введения через 30 мин после введения с сохранением эффекта через 24 часа.
В то же время, для групп животных, получавших МГТБ-С или комбинацию препаратов МГТБ, к концу периода введения препаратов (4 недели) также было отмечено сохранение большей эффективности при выполнении теста до введения новой дозы по сравнению с группой животных, получавших препарат сравнения. Это, несомненно, свидетельствует о положительном действии исследуемых препаратов.
Исследование этой временной точки позволяет оценить длительность эффекта от введения препарата.
Таким образом, выявлена способность препарата МГТБ-М улучшать моторные функции животных, что отражается в увеличении эффективности выполнения теста «Постановка конечности» через 3 недели введения через 30 мин после введения с сохранением эффекта через 24 часа.
Результаты исследования эффективности препаратов в тесте «Постановка конечности» по неделям введения позволили также оценить эффективность изучаемых препаратов МГТБ.
1 неделя введения. Выявлена достоверная эффективность применения комбинации препаратов МГТБ (МГТБ-С+МГТБ-М) в виде набора фармакологического, размещенных в отдельных флаконах. Необходимо отметить, что результат был обнаружен только через 30 мин после очередного введения препарата и отсутствовал через 24 часа после введения. Эффект препарата сравнения, показанный при остром введении, не был выявлен через неделю после начала терапии, что можно объяснить «эффектом истощения дозы» для L-DOPA.
2 недели введения. При тестировании после двух недель введения не был выявлен достоверный эффект ни для одного из исследуемых препаратов.
3 недели введения. Тестирование животных с моделью БП после трех недель введения препаратов выявило достоверное улучшение результатов выполнения теста для группы, получавшей препарат МГТБ-М - результат группы через 30 после очередного введения препарата составили 87±21% от результата здорового контроля, в то время как результат группы негативного контроля выражался как 52±36%.
Важно отметить, что достоверные различия с результатами негативного контроля были зафиксированы также и при проведении теста непосредственно перед очередным введением препарата, то есть эффект терапии сохраняется не менее чем 24 часа после введения. Результат при тестировании до введения препарата составил для группы, получавшей МГТБ-М, 82±21% от результата группы здорового контроля.
4 недели введения. Проведение тестирования через четыре недели введения препаратов подтвердило достоверное улучшение результатов группы, получавшей препарат МГТБ-М - результат группы через 30 мин после очередного введения препарата составили 87±14% от результата здорового контроля и достоверно отличался от группы контроля БП.
Достоверные различия с результатами негативного контроля были также зафиксированы и непосредственно перед очередным введением препарата, что подтверждает наблюдение о пролонгировании эффекта терапии.
Важно отметить, что достоверные различия были зафиксированы не только относительно группы негативного контроля, но и относительно группы, получавшей препарат сравнения.
Результаты проведения теста «Открытое поле»
Тест «Открытое поле» проводился дважды, перед началом введения препаратов и через 3 недели введения препаратов. Не было выявлено достоверного изменения ни одного из исследуемых параметров. Такие исследуемые параметры как общий пробег и количество стоек не отличались между группами, а количество актов груминга и выходов в центр имели слишком высокий индивидуальный разброс для проведения качественного анализа.
В связи с тем, что моделирование БП практически не влияет на результаты теста (негативный контроль не имеет достоверных отличий от здорового контроля), то отсутствие изменений и различий между группами, получающих препараты и контролем, свидетельствует об отсутствии эффекта препаратов на исследовательскую и двигательную активность животных.
Результаты проведения теста «Передвижение по горизонтальной сетке»
Тест производился однократно, через три недели введения препаратов, через 30 мин после введения препаратов.
Регистрировалось количество шагов каждой передней конечностью и количество ошибок при их постановке. На основе этих данных рассчитывался коэффициент асимметрии: K(асимметрии)=K(ошибок левой) - K(ошибок правой)
Обнаружено, что животные с индуцированной односторонней моделью БП (повреждена черная субстанция в правой части мозга) хуже контролируют движения левой передней конечности. У животных группы здорового контроля коэффициент асимметрии практически равен нулю, в то время как у животных негативного контроля в среднем равен 5%.
Важно отметить, что по результатам данного теста, все исследуемые препараты эффективно устраняли симптомы БП. Результаты трех групп, животных, получавших исследуемые препараты МГТБ по отдельности и в сочетании, достоверно отличались как от результата группы негативного контроля, так и от результата группы получавшей препарат сравнения. При этом результаты, полученные при исследовании групп животных, получавших препараты МГТБ, не имели достоверных различий с результатами группы здорового контроля.
Полученные результаты теста «Передвижение по горизонтальной сетке» полностью согласуются с результатами, полученными в тесте «Постановка конечности» и подтверждают, как наличие моторных дисфункций у животных с индуцированной болезнью Паркинсона, так и значимо более высокую эффективность назальной терапии препаратами МГТБ по сравнению со стандартными препаратами при лечении болезни Паркинсона.
Выводы
1. Подтверждено развитие модели БП у крыс через три недели после введения нейротоксина 6-ОНДА (стандартная методика).
2. Проведено исследование влияния на моторные функции животных с моделью БП препаратов-биорегуляторов группы МГТБ, выделенных из сыворотки крупного рогатого скота (МГТБ-С) и из мозга крупного рогатого скота (МГТБ-М), а также их сочетанного применения путем введения через день в сравнении с воспроизведенным стандартным противопаркинсоническим средством L-DOPA/бенсеразид (1:4)
3. Были обнаружены следующие эффекты: препарат сравнения достоверно улучшал моторные функции животных только при однократном применении. В то же время, эффект от ежедневного назального введения, выявляемый в тесте «постановка конечности» через 30 мин после введения, был заметен в течение всего периода введения и отличался на 10-20% от соответствующих значений группы контроля БП. Важно отметить, что действие препарата сравнения не сохранялось при тестировании животных через 24 часа после введения. Полученные результаты согласуются с литературными данными, а также известными характеристиками препарата L-DOPA/бенсеразид (1:4), как быстро метаболизирующегося и проявляющего эффект в одной дозе короткое время, что приводит к необходимости постоянного увеличения дозы и кратности приема препарата у человека при БП.
4. Выявлена эффективность исследуемого препарата МГТБ-М при субхроническом введении в тесте «Постановка конечности»
Достоверные отличия средних результатов выполнения теста через 30 мин после введения для группы животных, получавших МГТБ-М, от группы негативного контроля БП, были выявлены к концу третьей недели введения препарата, при этом значение среднего результата достигло 87±21% от группы здорового контроля, с сохранением эффекта до конца периода введения - в течение 2-х недель.
Важно отметить достоверное сохранение действия препарата и через 24 часа после введения, что свидетельствует о стабильном улучшении моторных функций у животных как минимум в течение недели, с конца третьей и до конца четвертой недели введения.
Кроме того, введение препарата МГТБ-М привело к полному восстановлению координации животных в тесте «Передвижение по горизонтальной сетке». Полученные результаты имели достоверное отличие от группы контроля БП и группы, получавшей препарат сравнения (р<0,01), и не имели достоверных отличий от результатов группы здорового контроля.
Эффективность применения второго исследуемого препарата МГТБ-С также была обнаружена, но в меньшей степени, без достижения достоверно значимых результатов в тесте «Постановка конечности». В то же время, к концу третьей недели ежедневного введения препарата результаты теста «Передвижение по горизонтальной сетке» имели достоверное отличие от группы контроля БП и группы, получавшей препарат сравнения (р<0,01), и не имели достоверных отличий от результатов группы здорового контроля.
При комбинированном введении двух исследуемых препаратов МГТБ-С и МГТБ-М (в виде набора согласно изобретения) также было обнаружено улучшение способности животных выполнять тест «Постановка конечности» в течение всего периода исследования по сравнению с негативным контролем, при этом достоверное отличие результатов этой группы животных было выявлено через 30 мин после недельного применения препаратов. Эффект не сохранялся через 24 часа после введения, но результаты группы были несколько выше относительно препарата сравнения. Тест «Передвижение по горизонтальной сетке» также выявил достоверное отличие этой группы от групп контроля БП и препарата сравнения (р<0,05) и отсутствие достоверных отличий от результатов группы здорового контроля.
Проведение теста «Открытое поле» не выявило различий между группами и, соответственно, какого-либо действия препаратов на исследовательскую деятельность животных и уровень их тревожности.
Вывод.
Исследуемые препараты МГТБ-С и МГТБ-М, приготовленные на основе биорегуляторов группы МГТБ, полученных из сыворотки и мозга крупного рогатого скота (быка), при назальном введении в виде раствора в концентрации 10-12 мг/мл обладают высокой эффективностью в двух из используемых тестов на фармакологической модели болезни Паркинсона у крыс линии Wistar. Наряду с эффективностью через 30 мин после введения было обнаружено увеличение длительности эффекта препарата МГТБ-М, продолжавшегося не менее суток между введениями уже через три недели введения препаратов, с подтверждением эффекта через неделю. Препараты достоверно улучшали координацию движений животных. Таким образом, можно заключить, что исследуемые препараты имеют высокий клинический потенциал и перспективны для использования их в качестве антипаркинсонических средств.
Пример. 6. Влияние препаратов МГТБ-С и МГТБ-М на ингибирование ДТТ-индуцированной агрегации БСА (шаперонная активность)
Изучали влияние препаратов МГТБ-С и МГТБ-М на индуцированную дитиотреитолом (ДТТ) агрегацию модельных белков (бычьего сывороточного альбумина-БСА) в широком диапазоне концентраций шаперона.
ДТТ-индуцированную агрегацию БСА изучали в воде при 50°С. Раствор БСА помещали в цилиндрическую виалу с внутренним диаметром 6.3 мм и предварительно инкубировали в течение 5 мин при 50°С. Виалы закрывали пробками для предотвращения испарения. Процесс агрегации инициировали добавлением аликвоты ДТТ к раствору белка до конечного объема 0.5 мл. Измерение проводили на анализаторе «PhotocorCompact-Z» (Россия), получая корреляционную функцию флуктуаций интенсивности рассеянного света и интегральной интенсивности рассеяния. Обработку корреляционной функции проводили при помощи программного обеспечения DynaLS фирмы «AlangoLtd» (Израиль). Диапазон допустимых измеряемых размеров наночастиц находится в пределах от долей нм до 5-10 мкм. Измерения проводили при величине угла рассеивания в 90°.
Для изучения влияния изучаемых препаратов МГТБ на ДТТ-индуцированную агрегацию БСА, добавляли раствор исследуемого МГТБ в широком диапазоне концентраций к предварительно прогретому раствору модельного белка перед внесением ДТТ.
По результатам исследования было установлено, что МГТБ-С в концентрации по белку, соответствующей 18 мкг/мл, проявляет шаперон-подобную активность, которая выражалась в блокировании межмолекулярной агрегации БСА (75-200 нМ), индуцированная дитиотреитолом. Препарат МГТБ-М в концентрации по белку, соответствующей 10 мкг/мл, проявлял также шаперонно-подобную активность, которая выражалась в полном подавлении межмолекулярной агрегация БСА (75-200 нМ), индуцированной дитиотреитолом.
Проявление МГТБ-С и МГТБ-М шаперонно-подобной активности позволяет предположить, что данные препараты могут быть эффективными при нейродегенеративных заболеваниях, в основе которых, лежит образование в ткани мозга межмолекулярных белковых ассоциатов, нарушающих передачу нервных сигналов (например, болезнь Альцгеймера, при которой происходит агрегация бета-амилоида и образование бляшек в ткани мозга).
| название | год | авторы | номер документа |
|---|---|---|---|
| СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ ОСТРОГО НАРУШЕНИЯ МОЗГОВОГО КРОВООБРАЩЕНИЯ ИШЕМИЧЕСКОГО И ГЕМОРРАГИЧЕСКОГО ХАРАКТЕРА | 2010 |
|
RU2477637C2 |
| Способ коррекции неврологического статуса 2-этил-6-метил-3- гидрокси пиридиния-N-ацетиламиноацетатом при повреждении головного мозга вследствие внутримозгового кровоизлияния в эксперименте | 2022 |
|
RU2786315C1 |
| Способ моделирования геморрагического инсульта у крыс | 2019 |
|
RU2721289C1 |
| СРЕДСТВО, ОБЛАДАЮЩЕЕ АНТИРАДИКАЛЬНЫМИ, ЦЕРЕБРОПРОТЕКТОРНЫМИ И ПРОТИВОИШЕМИЧЕСКИМИ СВОЙСТВАМИ | 2010 |
|
RU2445090C1 |
| Лекарственное средство для профилактики и лечения заболеваний головного мозга и способ лечения заболеваний головного мозга | 2015 |
|
RU2692063C2 |
| СРЕДСТВО, ОБЛАДАЮЩЕЕ ПРОТИВОИНСУЛИТНЫМ ДЕЙСТВИЕМ, И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ | 2013 |
|
RU2521404C1 |
| ТЕТРАПЕПТИД И СРЕДСТВО, ОБЛАДАЮЩЕЕ ЦЕРЕБРОПРОТЕКТОРНОЙ И АНТИАМНЕСТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЯМИ (ВАРИАНТЫ) | 2013 |
|
RU2537560C2 |
| ЦЕРЕБРОПРОТЕКТОР МЕТАБОЛИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ | 2020 |
|
RU2761549C1 |
| Лекарственный препарат для лечения нарушений мозгового кровообращения и восстановления утраченных функций мозга | 2020 |
|
RU2751331C1 |
| Лекарственный препарат для лечения нарушений мозгового кровообращения и восстановления утраченных функций мозга | 2018 |
|
RU2713655C2 |
Изобретение относится к медицине, в частности к набору для улучшения кровотока коры головного мозга и восстановления двигательных и когнитивных функций организма. Набор для улучшения кровотока коры головного мозга и восстановления двигательных и когнитивных функций организма включает две биологически активные субстанции, выделенные из сыворотки крови и из ткани головного мозга быка, белок-пептидные комплексы, содержащие пептиды с молекулярными массами 1000-6000 Да, и белок, который является членом семейства альбуминов млекопитающих под номером gi|1351907 с молекулярными массами 66267 Да и 66667 Да, выделенный из сыворотки крови и из ткани головного мозга быка, соответственно, размещенные в разных флаконах и вводимые раздельно в фармацевтически приемлемом носители интраназально, перорально или внутримышечно или внутривенно и проявляющие биологическую активность в диапазоне концентраций их от 10-15 до 10-8 мг/мл при разведении их в фармацевтически приемлемом носителе и/или разбавителе. Вышеописанный набор позволяет расширить ассортимент лекарственных средств для профилактики и лечения нервных заболеваний, связанных с патологией головного мозга, а также улучшить кровоток коры головного мозга и восстановить двигательные и когнитивные функций организма. 3 з.п. ф-лы, 5 ил., 6 пр.
1. Набор для улучшения кровотока коры головного мозга и восстановления двигательных и когнитивных функций организма, включающий две биологически активные субстанции, размещенные в разных флаконах и вводимые раздельно в фармацевтически приемлемом носители интраназально, перорально или внутримышечно или внутривенно, выделенные из сыворотки крови и из ткани головного мозга быка, белок-пептидные комплексы, содержащие пептиды с молекулярными массами 1000-6000 Да, и белок, который является членом семейства альбуминов млекопитающих под номером gi|1351907 с молекулярными массами 66267 Да и 66667 Да, выделенные из сыворотки крови и из ткани головного мозга быка, соответственно, и проявляющие биологическую активность в диапазоне концентраций их от 10-15 до 10-8 мг/мл при разведении их в фармацевтически приемлемом носителе и/или разбавителе.
2. Набор для улучшения кровотока в коре головного мозга и восстановления двигательных и когнитивных функций организма по п. 1, отличающийся тем, что предназначен для комбинированного совместного приема двух биологически активных субстанций в качестве биорегуляторов, размещенных в разных флаконах.
3. Набор для улучшения кровотока и восстановления двигательных и когнитивных функций организма по п. 1 или 2, отличающийся тем, что входящие в его состав белок-пептидные комплексы вводят в водно-солевом физиологическом растворе интраназально, внутримышечно, парентерально или вводят в дистиллированной воде для перорального приема.
4. Набор для улучшения кровотока в коре головного мозга и восстановления двигательных и когнитивных функций организма по п. 3, отличающийся тем, что белок-пептидный комплекс из сыворотки крови вводят интраназально, а белок-пептидный комплекс, выделенный из ткани головного мозга быка, вводят внутримышечно.
