Лекарственный препарат для лечения нарушений мозгового кровообращения и восстановления утраченных функций мозга Российский патент 2021 года по МПК A61K35/30 C07K14/435 A61P9/10 

Изобретение относится к области фармакологии, неврологии, в том числе детской.

Проблема цереброваскулярных болезней имеет высокую значимость во многих странах мира. Инсульт является ведущей причиной инвалидизации населения, вероятность его развития у больных артериальной гипертензией повышается в 3-4 раза. Ежегодно в мире диагностируется около 10 миллионов случаев инсульта, из которых на долю России приходится более 450 тысяч. Смертность от инсульта в России составляет 1,23 на 1000 населения, в течение года после перенесенного инсульта умирает около 50% больных. Ишемические инсульты составляют 70-85% от общего числа инсультов, внутримозговые кровоизлияния - 20-25%, нетравматические субарахноидальные кровоизлияния - 5%. Достоверных данных о числе больных с хроническими нарушениями мозгового кровообращения в России нет, однако, по оценкам, заболеваемость хронической ишемией головного мозга превышает 700 на 100000 населения (https://ru.wikipedia.org/wiki/Цереброваскулярные_болезни). Разработка новых эффективных препаратов для лечения цереброваскулярных болезней является важной научно - технической задачей.

Из уровня техники известно лекарственное средство "Церебрал" для лечения инсульта (Патент РФ 2151605), представляющий собой аминокислотно - пептидный комплекс, содержащий пептиды с молекулярным весом до 1500 Да и свободные аминокислоты. Недостатком данного изобретения является низкая эффективность при лечении ишемического инсульта (патент РФ 2470650).

Ближайшим аналогом заявленного изобретения является препарат для лечения ишемического и геморрагического инсульта, выделенный из мозга свиней, подвергшихся моделированию геморрагического инсульта (патент RU 2470650). Однако данный препарат является недостаточно эффективным и, при этом, сложным в получении. В частности, для получения указанного препарата необходимо моделирование геморрагического полушарного инсульта после окклюзии общей сонной артерии на этой же стороне (ишемического инсульта)

Таким образом, задачей заявленного изобретения является создание лекарственного препарата для лечения нарушений мозгового кровообращения и восстановления утраченных функций мозга, обладающего эффективностью при лечении как ишемического, так и геморрагического инсульта и, при этом, технически простого в получении.

Решение поставленной задачи обеспечивает белково-пептидный комплекс, обладающий нейропроекторными и нейрорегенеративными свойствами, отличающийся тем, что содержит смесь белковых молекул и пептидов с молекулярной массой 2500-200000 Дальтон, выделенную из головного мозга животного, подвергнутого прижизненному повреждению головного мозга путем механического воздействия.

Авторами было показано, что после повреждения ткани мозга в ней избирательно возрастает содержание таких белков/пептидов, как, например, Complexin-1, Heat shock 70 kDa protein, Peroxiredoxin-6, Actin, Prothymosin alpha, S100-A6, Parathymosin, S-phase kinase-associated protein 1, Transaldolase, Carbonic anhydrase 2, Neurofilament light polypeptide, Tubulin alpha-4A chain, Tubulin alpha-1D chain, Tubulin beta-2B chain, Microtubule-associated proteins 1A/1B light chain 3А, ADP-ribosylation factor 1, Tubulin beta-3 chain, Alpha-synuclein, Beta-synuclein, S100-A1, Cystatin-B, Macrophage migration inhibitory factor, Heat shock 90-alpha protein, Phosphatidylethanolamine-binding protein 1 (предшественник Hippocampal cholinergic neurostimulating peptide), Rab GDP dissociation inhibitor alpha, Alpha-enolase, Fatty acid-binding protein (brain), Thioredoxin, 14-3-3, Calmodulin, L-lactate dehydrogenase В chain, Phosphoglycerate kinase 1, Triosephosphate isomerase, Dihydropyrimidinase-related protein 2, Purine nucleoside phosphorylase, Ras-related proteins Rab-11A, 1А, 3А, 3С, 7a. Однако, есть основания полагать, что не все белки, содержание которых повышается в мозге после его повреждения, участвуют в механизмах нейропротекции и нейрорегенерации.

Предположительно, белковые молекулы и пептиды, синтез которых избирательно возрастает после повреждения ткани головного мозга животного, и при этом, принимающих участие в механизмах нейропротекции и нейрорегенерации (и, следовательно, эффективных при лечении цереброваскулярных заболеваний) имеют молекулярную массу не менее 2500 и не более 200000 Дальтон.

Одной из оптимальных комбинаций указанных белков и пептидов, представляющих собой заявляемый препарат, может быть следующая: Complexin-1; Heat shock 70 kDa protein; 14-3-3; Alpha-synuclein, Beta-synuclein; Fatty acid-binding protein, brain; Phosphatidylethanolamine-binding protein 1 (или Hippocampal cholinergic neurostimulating peptide, предшественником которого он является), Dihydropyrimidinase-related protein 2, Cystatin-B, Tenascin, Cell division cycle 5-like protein, Macrophage migration inhibitory factor.

Указанный в таблице 1 состав белково-пептидного комплекса, определяет его специфичность и активность.

Дополнительно в препарат могут быть добавлены белки и пептиды с нейропротекторными свойствами, такие как Aspartate aminotransferase, cytoplasmic; Glucose-6-phosphate isomerase, Protein DJ-1 (таблица 2).

При этом повреждение ткани головного мозга животного может осуществляться как путем механического воздействия.

В качестве животных предпочтительно могут быть использованы млекопитающие, например, свиньи.

В немалой степени решение поставленной задачи обеспечивает способ получения указанного выше белково-пептидного комплекса, включающий в себя:

- повреждающее механическое воздействие на ткани головного мозга животного;

- дробление тканей головного мозга животного с получением раздробленных частей тканей мозга животного;

- гомогенизацию раздробленных частей тканей головного мозга животного при рН 7,3-7,6 с получением гомогената мозга животного;

- центрифугирование полученного гомогената головного мозга животного;

- очистку гомогената головного мозга животного от твердых компонентов с получением супернананта;

- очистку полученного супернатанта от липидных компонентов путем экстракции с получением неосветленного белково-пептидного комплекса;

- удаление из полученного неосветленного белково-пептидного комплекса молекул массой более 200000 Дальтон с получением заявленного белково-пептидного комплекса.

На этапе очистки полученного супернатанта от липидных компонентов экстракция может осуществляться с использованием любого приемлемого экстрагента, применяемого для выделения липидов из животного сырья, в соответствии с методиками, указанными в [Вострикова Н.Л., Кузнецова О.А., Куликовский А.В. Методические аспекты извлечения липидов из биологических матриц // Теория и практика переработки мяса. 2018. №2].

При этом дробление тканей головного мозга животного с получением раздробленных частей тканей мозга животного осуществляется по прошествии 1-70 суток после повреждающего воздействия на ткани головного мозга животного, а в качестве повреждающего воздействия на ткани головного мозга животного может быть оказано как химическое, так и физическое воздействие.

В качестве животных предпочтительно могут быть использованы млекопитающие, например, свиньи.

Как вариант, полученный белково-пептидный комплекс дополнительно подвергается заморозке и последующей лиофилизации.

Заявленный белково-пептидный комплекс может быть получен, например, следующим образом:

На первом этапе, на ткани головного мозга животного (свиньи) оказывается повреждающее механическое воздействие. Через 24 часа после повреждающего воздействия производится дробление тканей головного мозга животного с получением раздробленных частей тканей мозга животного, гомогенизацию раздробленных частей тканей головного мозга животного при рН 7,3-7,6 с получением гомогената мозга животного. Полученный гомогенат центрифугируется в течение в течение 25 минут (10000 g) и очищается от твердых компонентов путем декантации. Полученный супернатант очищается от липидных компонентов путем экстракции. Используют гексан (в смеси с супернатантом 1 к 3 по объему), экстракцию проводят двукратно. Из полученного неосветленного белково-пептидного комплекса производится удаление молекул массой более 200000 Дальтон (посредством пропускания комплекса через фильтр с размером пор 0,48 мкм в течение 2 ч). Полученный препарат замораживают при температуре ниже -30°C, а затем подвергают лиофилизации.

Определение белкового/пептидного состава полученного белково-пептидного комплекса осуществляется методом масс-спектрометрии во фронтальном зависимом тандемном режиме сканирования на времяпролетном квадрупольном масс-спектрометре с использованием разделения пептидов, полученных после ферментативного расщепления белковых молекул, на системе высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Поиск и идентификацию белков/пептидов в полученных данных проводили с использованием алгоритма MASCOT / Andromeda против базы данных Uniprot 2.2014, валидацию данных против базы декойных произвольных последовательностей с макисмально допустимым пороговым значением ложных позитивных значений посика не более FDR=1% при вероятности р=0.05.

Относительный количественный анализ проводили по алгоритму iBRQ (intensity-based relative quantification) с измерением коэффициента emPAI, отражающего повторяемость и вырожденность идентифицированных и зарегистрированных протеотипических пептидов для каждого белка, идентифицированного в анализе.

Данные по количественному содержанию белков/пептидов в полученном образце представлены в таблице 3:

Решение поставленной задачи также обеспечивает лекарственное средство для лечения цереброваскулярных заболеваний, содержащее заявленный белково-пептидный комплекс и фармацевтически приемлемые добавки, а также способ лечения цереброваскулярных заболеваний, включающий в себя введение больному указанного лекарственного средства.

Эффективность заявленного белково-пептидного комплекса иллюстрируется нижеследующими примерами.

Пример 1. Эффективность заявленного белково-пептидного комплекса.

Материалы и методы

Для определения эффективности заявленного белково-пептидного комплекса проводили эксперименты на крысах-самцах линии Вистар массой 200-300 г. У животных моделировали геморрагический инсульт по методу А.Н. Макаренко (2001) и ишемический инсульт - методом фототромбоза.

Исследуемые животные были разделены на 6 групп. Из них 2 контрольные группы (с модельным геморрагическим и ишемическим инсультом) и 4 опытные (2 с геморрагическим и 2 с ишемическим инсультом). Заявленный белково-пептидный комплекс (далее - препарат) получала 1 группа с геморрагическим и 1 группа с ишемическим инсультом. Группы сравнения получали препарат для лечения ишемического и геморрагического инсульта, выделенный из мозга свиней, подвергшихся моделированию геморрагического инсульта, и представляющий собой аминокислотно-пептидный комплекс, отличающийся тем, что он выделен из мозга свиней, подвергшихся моделированию геморрагического полушарного инсульта после окклюзии общей сонной артерии на этой же стороне (ишемического инсульта), полученный в соответствии с текстом патента RU 2470650 (далее - аналог). Оценивалась летальность животных во всех группах.

Через 3 дня после воспроизведения модельного инсульта выжившим животным вводили образцы в течение 5 дней. Контрольные группы получали интраназально в каждую ноздрю по 2 капли 0,9% раствора NaCl. Опытные группы получали по 2 капли в каждую ноздрю заявленный препарат, содержащий 0,2 мг препарата, а группы сравнения - аналог в одинаковой дозировке. По шкале Stroke-index McGrow в модификации И.В. Ганнушкиной проводилось неврологическое тестирование функций выживших животных.

Статистические расчеты выполнялись методом дисперсионного анализа с повторными измерениями в программе R v.3.4.2. Отличия считались статистически значимыми при р<0,05

Результаты исследования

Далее приведены результаты указанного исследования (таблицы 4, 5):

Обсуждение результатов

Изучение выживаемости животных после модельного инсульта показало, что применение заявленного белково-пептидного комплекса достоверно (р<0,05) повышает выживаемость по сравнению с препаратами сравнения. На каждый представленный в таблице 5 день тестирования при применении заявленного белково-пептидного комплекса неврологический дефицит был менее выражен по сравнению с группами, где применяли препарат-аналог (р<0,05). Неврологический дефицит, возникавший у крыс после моделирования геморрагического и ишемического инсульта, снижался достоверно (р<0,05) быстрее у животных, получавших заявленный белково-пептидный комплекс, по сравнению с группами сравнения.

На основании вышеуказанного можно сделать вывод об эффективности заявленного белково-пептидного комплекса для лечения нарушений мозгового кровообращения и восстановления утраченных функций мозга, а также вывод о том, что заявленный препарат обладает высокой эффективностью при лечении как ишемического, так и геморрагического инсульта.

Пример 2. Исследование эффективности заявленного белково-пептидного комплекса.

Цель исследования

Целью исследования является сравнительная оценка эффективности заявленного белково-пептидного комплекса, полученного в соответствии с двумя различными вариантами способа его получения, на моделях геморрагического и ишемического инсульта in vivo.

Материалы и методы

Образцы белково-пептидного комплекса были получены следующим образом:

Для первого образца белково-пептидного комплекса (образец 1): На первом этапе, на головной мозг свиньи оказывалось прижизненное физическое повреждающее воздействие (нанесение черепно-мозговой травмы с использованием пистолета для оглушения скота Efa cash magnum 9000 s). Через 48 часов после повреждающего воздействия производилось дробление головного мозга животного, гомогенизация раздробленных частей головного мозга при рН 7,4. Полученный гомогенат центрифугировался в течение в течение 25 минут (10000 g) и очищался от твердых компонентов путем декантации. Полученный супернатант был очищен от липидных компонентов путем экстракции. В качестве экстрагента использовался хлороформ (в смеси с супернатантом 1 к 4 по объему), экстракция проводилась трехкратно. Из полученного неосветленного белково-пептидного комплекса производилось удаление молекул массой более 200000 Дальтон (посредством пропускания комплекса через фильтр с размером пор 0,48 мкм в течение 2 ч). Полученный препарат подвергался заморозке при температуре -35°C, а затем лиофилизации.

Для второго образца белково-пептидного комплекса (образец 2): На первом этапе, на головной мозг свиньи оказывалось прижизненное химическое повреждающее воздействие (путем индукции кислородного голодания клеток мозга, вызванного путем окклюзии сосудов). Через 45 суток после повреждающего воздействия производилось дробление головного мозга животного, гомогенизация раздробленных частей головного мозга при рН 7,2. Полученный гомогенат центрифугировался в течение в течение 25 минут (10000 g) и очищался от твердых компонентов путем декантации. Полученный супернатант очищался от липидных компонентов путем экстракции. В качестве экстрагента использовался ацетон (в смеси с супернатантом 1 к 2 по объему), экстракция проводилась двукратно. Из полученного неосветленного белково-пептидного комплекса производилось удаление молекул массой более 200000 Дальтон (посредством пропускания комплекса через фильтр с размером пор 0,48 мкм в течение 2 ч). Полученный препарат подвергался заморозке при температуре -35°C, а затем лиофилизации.

Определение белкового/пептидного состава полученных образцов белково-пептидного комплекса осуществлялось методом масс-спектрометрии во фронтальном зависимом тандемном режиме сканирования на времяпролетном квадрупольном масс-спектрометре с использованием разделения пептидов, полученных после ферментативного расщепления белковых молекул, на системе высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Поиск и идентификацию белков/пептидов в полученных данных проводили с использованием алгоритма MASCOT / Andromeda против базы данных Uniprot 2.2014.

Относительный количественный анализ проводился по алгоритму iBRQ (intensity-based relative quantification) с измерением коэффициента emPAI, отражающего повторяемость и вырожденность идентифицированных и зарегистрированных протеотипических пептидов для каждого белка, идентифицированного в анализе.

Данные по количественному содержанию белков/пептидов в полученном образце представлены в таблице 6:

Для определения эффективности исследуемых образцов заявленного белково-пептидного комплекса были проведены эксперименты на крысах-самцах линии Wistar массой 200-300 г. У животных моделировался геморрагический инсульт по методу А.Н. Макаренко (2001) и ишемический инсульт методом фототромбоза.

Исследуемые животные были разделены на 8 групп. Из них 2 контрольные группы (с модельным геморрагическим и ишемическим инсультом) и 6 опытных (3 с геморрагическим и 3 с ишемическим инсультом). Образец 1 получала 1 группа с геморрагическим и 1 группа с ишемическим инсультом. Образец 2 получала 2 группа с геморрагическим и 2 группа с ишемическим инсультом. Группы сравнения получали препарат для лечения ишемического и геморрагического инсульта, выделенный из мозга свиней, подвергшихся моделированию геморрагического инсульта, и представляющий собой аминокислотно-пептидный комплекс, отличающийся тем, что он выделен из мозга свиней, подвергшихся моделированию геморрагического полушарного инсульта после окклюзии общей сонной артерии на этой же стороне (ишемического инсульта), полученный в соответствии с текстом патента RU 2470650 (далее - аналог). Оценивалась летальность животных во всех группах.

Через 3 дня после воспроизведения модельного инсульта выжившим животным вводились образцы в течение 5 дней. Контрольные группы получали интраназально в каждую ноздрю по 2 капли 0,9% раствора NaCl. Опытные группы получали по 2 капли в каждую ноздрю заявленный препарат, а группы сравнения - аналог в одинаковой дозировке (0,2 мг). Также в рамках исследования по шкале Stroke-index McGrow в модификации И.В. Ганнушкиной проводилось неврологическое тестирование функций выживших животных.

Статистические расчеты выполнялись методом дисперсионного анализа с повторными измерениями в программе R v.3.4.2. Отличия считались статистически значимыми при р<0,05.

Результаты исследования

Далее приведены результаты указанного исследования (таблицы 7, 8):

Обсуждение результатов

Изучение выживаемости животных после модельного инсульта показало, что заявленный белково-пептидный комплекс (образцы 1 и 2) достоверно (р<0,05) эффективнее повышает выживаемость животных по сравнению как с контролем, так и с препаратом сравнения. Выраженность неврологического дефицита, возникавшего у крыс после моделирования геморрагического и ишемического инсульта, в подавляющем большинстве случаев (а начиная с 10 дня исследования - в каждом случае) снижалась достоверно (р<0,05) быстрее у животных, получавших образцы заявленного белково-пептидного комплекса, по сравнению как с контролем, так и с препаратом сравнения.

На основании вышеуказанного можно сделать вывод об эффективности заявленного белково-пептидного комплекса для лечения нарушений мозгового кровообращения и восстановления утраченных функций мозга, а также вывод о том, что заявленный препарат обладает высокой эффективностью при лечении как ишемического, так и геморрагического инсульта. Также стоит отметить, что значимой разницы в составе, а, следовательно, и в эффективности исследованных образцов заявленного белково-пептидного комплекса, полученных в соответствии с двумя различными вариантами реализации способа его получения, в рамках проведенного исследования не обнаружено.

Изобретение относится к области фармакологии, а именно к белково-пептидному комплексу, обладающему нейропротекторными и нейрорегенеративными свойствами. Белково-пептидный комплекс, обладающий нейропротекторными и нейрорегенеративными свойствами, включающий смесь белковых молекул и пептидов с молекулярной массой 2500-200000 Дальтон, полученную из головного мозга свиньи, подвергнутой прижизненному повреждению тканей головного мозга посредством механического воздействия и выделенную путем гомогенизации тканей головного мозга животного, очистки гомогената от твердых компонентов с получением супернатанта, очистки полученного супернатанта от липидных компонентов с получением неосветленного белково-пептидного комплекса, выделения из полученного неосветленного белково-пептидного комплекса смеси белковых молекул и пептидов с молекулярной массой 2500-200000 Дальтон с получением белково-пептидного комплекса. Вышеописанный комплекс обладает повышенной эффективностью при лечении как ишемического, так и геморрагического инсульта и при этом технически более простой в получении. 2 з.п. ф-лы, 8 табл., 2 пр.

1. Белково-пептидный комплекс, обладающий нейропротекторными и нейрорегенеративными свойствами, включающий смесь белковых молекул и пептидов с молекулярной массой 2500-200000 Дальтон, полученную из головного мозга свиньи, подвергнутой прижизненному повреждению тканей головного мозга посредством механического воздействия и выделенную путем гомогенизации тканей головного мозга животного, очистки гомогената от твердых компонентов с получением супернатанта, очистки полученного супернатанта от липидных компонентов с получением неосветленного белково-пептидного комплекса, выделения из полученного неосветленного белково-пептидного комплекса смеси белковых молекул и пептидов с молекулярной массой 2500-200000 Дальтон с получением белково-пептидного комплекса.

2. Белково-пептидный комплекс по п. 1, отличающийся тем, что содержит Complexin-1; Heal shock 70 kDa protein; 14-3-3; Alpha-synuclein, Beta-synuclein; Fatty acid-binding protein, brain; Phosphatidylethanolamine-binding protein 1; Hippocampal cholinergic neurostimulating peptide, Dihydropyrimidinase-related protein 2; Cystatin-B, Tenascin, Cell division cycle 5-like protein, Macrophage migration inhibitory factor.

3. Белково-пептидный комплекс по п. 1, отличающийся тем, что дополнительно содержит Aspartate aminotransferase, cytoplasmic; Glucoses-phosphate isomerase, Protein DJ-1.