ПРОТИВОРАКОВАЯ КОМПОЗИЦИЯ Российский патент 2023 года по МПК A61K31/155 A61K31/683 A61K31/7004 A61P35/00 

Область техники, к которой относится изобретение

[1] Настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции для предотвращения или лечения рака, и пищевой композиции для предотвращения рака или улучшения состояния при раке, содержащим в качестве активных ингредиентов: (1) соединение на основе бигуанида или его фармацевтически приемлемую соль; (2) 2-дезокси-D-глюкозу; и (3) гексафосфат инозитола или его фармацевтически приемлемую соль, инозитол или их смесь.

Уровень техники

[2] Химиотерапия представляет собой способ лечения, при котором используются противораковые лекарственные средства для подавления и модификации роста злокачественных опухолей, и ее применяли у 60-75% раковых пациентов в качестве терапии первого выбора или адъювантной терапии до и после хирургического лечения и лучевой терапии, в зависимости от опухоли.

[3] Сегодня при возникновении онкологического заболевания фундаментальным элементом в лечении рака является комбинация двух или более видов лечения. Хотя монотерапия по-прежнему широко применяется в качестве способа лечения при различных видах рака, такие традиционные способы, как правило, менее эффективны, чем комбинированная терапия. Традиционные способы монотерапии избирательно воздействуют на активно пролиферирующие клетки, в конечном итоге приводя к уничтожению как здоровых, так и раковых клеток (Mokhtari et al., Oncotarget. 2017; 8: 38022-38043).

[4] Химиотерапия сама по себе обладает токсичностью для клеток за счет включения в метаболические пути раковых клеток и вмешательства в процессы репликации, транскрипции и трансляции ДНК путем прямого взаимодействия с ДНК, с нарушением синтеза предшественников нуклеиновых кислот и ингибированием деления клеток. Соответственно, противораковый агент необратимо повреждает нормальные клетки, вызывая различные побочные эффекты, такие как снижение гематокритного числа лейкоцитов, тромбоцитов и эритроцитов и т.п., что вызвано разрушением костного мозга; потеря волос вследствие разрушения волосяных фолликул; нарушения менструального цикла и мужское бесплодие как результат побочных эффектов в яичниках и семенниках; стоматит, тошнота, рвота и затрудненность глотания, а также расстройства пищеварения в результате побочных эффектов вследствие разрушения клеток слизистой оболочки пищеварительной системы; симптомы диареи; нефротоксичность вследствие тубулярного некроза; периферический неврит и слабость, вызванные расстройствами нервной системы; сосудистые расстройства, такие как сосудистая боль, сыпь и т.п.; а также изменение окраски кожных покровов и ногтей, и т.п. Таким образом, существует безотлагательная потребность в исследованиях, целью которых является усиление терапевтических эффектов наряду с минимизацией побочных эффектов, вызываемых противораковыми лекарственными средствами.

[5] Кроме того, при неэффективности химиотерапии основная причина заключается в том, что противораковое лекарственное средство изначально эффективно, но постепенно появляется устойчивость к лекарственному средству и значительно ухудшается иммунитет. Таким образом, существует потребность в способе повышения эффективности противоракового лечения без повышения токсичности лекарственного средства. Одним из способов повышения эффективности противораковых лекарственных средств является применение комбинации указанных противораковых лекарственных средств, но, к сожалению, при комбинировании противораковых лекарственных средств не всегда можно ожидать синергического эффекта, и обнаружить комбинацию препаратов, обладающих синергическим эффектом, очень трудно. Таким образом, крайне насущной является разработка комплексных противораковых составов, способных максимизировать противораковый эффект и одновременно минимизировать побочные эффекты противораковых лекарственных средств.

[6] В последнее время отмечается значительный интерес к разработке способов противораковой терапии, нацеленной на клеточные пути передачи сигналов, которые играют важную роль в метаболизме и росте опухолевых клеток; репрезентативные лекарственные средства, которые вовлекаются в метаболизм опухолевых клеток, включают метформин и 2-дезокси-D-глюкозу, которые представляют собой соединения на основе бигуанида (Wokoun et al., Oncol Rep.2017;37:2418-2424).

[7] На протяжении десятилетий метформин как гипогликемический агент использовали в качестве первого терапевтического агента для терапии диабета II типа. Несмотря на широкое применение метформина в качестве противодиабетического агента, впервые его потенциальные противораковые эффекты у млекопитающих были зарегистрированы в 2001 году. Кроме того, первые данные о снижении риска возникновения рака у пациентов с диабетом второго типа, получавших лечение метформином, были опубликованы всего 10 лет назад. С тех пор во многих работах была продемонстрирована стабильная антипролиферативная активность метформина на нескольких линиях опухолевых клеток, включая клетки рака яичника, у животных с ксенотрансплантатами или у трансгенных мышей. Что касается метаболизма, выяснилось, что метформин представляет новый класс ингибиторов АТФ-синтазы и комплекса I, воздействует непосредственно на митохондрии, ограничивая дыхательную функцию и приводя к энергетической неэффективности, а также снижает метаболизм глюкозы через воздействие на цикл лимонной кислоты (Andrzejewski et al., 2014; 2: 12-25).

[8] 2-дезокси-D-глюкоза рассматривалась в качестве потенциального противоракового средства из-за ее связи с опухолевыми клетками в отношении гликолиза. 2-дезокси-D-глюкоза представляет собой аналог глюкозы, который легко абсорбируется переносчиками глюкозы и действует как конкурентный ингибитор гликолиза, таким образом снижая продуцирование АТФ, что вызывает гибель клеток за счет активации каспазы-3 в солидных опухолях (Zhang et al., Cancer Lett. 2014;355:176-183).

[9] Исследования показали, что комбинация двух лекарственных средств, метформина и 2-дезокси-D-глюкозы, воздействующих на два основных источника энергии в клетках, может обладать значительным преимуществом по сравнению с отдельной традиционной химиотерапией. Конкретнее, метформин не только снижает уровень сахара в крови, но также блокирует дыхательную цепь в митохондриях, которая производит энергию, необходимую для клеточной активности, а 2-дезокси-D-глюкоза ингибирует распад глюкозы, таким образом комбинация двух указанных лекарственных средств в конечном итоге препятствует процессу переноса энергии в клетках. Когда указанные метаболические процессы активированы, раковые клетки уязвимы для внешних атак, поскольку количество поступающей энергии снижается, даже если ее потребление возрастает.

[10] В соответствии с данными для нескольких типов опухолей, стало известно, что комбинация метформина и 2-дезокси-D-глюкозы ингибирует метаболизм клеток и приводит к гибели опухолевых клеток, а также значительному дозозависимому снижению выживаемости клеток рака молочной железы человека, вызываемому одновременным нарушением метаболизма гликозилирования (с помощью 2-дезокси-D-глюкозы) и окислительного фосфорилирования (с помощью метформина) (Bizjak et al., Sci Rep.2017;7:1761-1774).

[11] Тем не менее, обычно используемые дозы метформина и 2-дезокси-D-глюкозы недостаточны для излечения рака в достаточной степени и ограничены возможным возникновением нежелательных реакций при лечении высокими дозами (Raez et al., Cancer Chemother Pharmacol. 2013; 71: 523-530). Комбинированная терапия метформином и 2-дезокси-D-глюкозой, исследованная Cheong с соавторами, была эффективна для линий клеток рака молочной железы, но концентрация превышала приемлемую концентрацию для организма человека или допустимую концентрацию в плазме крови (Cheong et al., Mol Cancer Ther. 2011;10:2350-2362). В другой работе была успешно протестирована комбинация метформина и 2-дезокси-D-глюкозы на клетках рака предстательной железы при использовании концентрации метформина, превышающей доступную концентрацию в плазме человека (Ben Sahra et al., Cancer Res. 2010;70:2465-2475).

Это указывает на то, что для клинически эффективных противораковых агентов, метформина и 2-дезокси-D-глюкозы, предпочтительны более низкие терапевтические концентрациях в диапазоне, который может быть целесообразно использован in vivo.

[13] В то же время гексафосфат инозитола и инозитол представляют собой органические фосфорные соединения природного происхождения, которые содержатся в большом количестве во многих зерновых, семенах и в бобовых, встречаются даже в клетках млекопитающих, и присутствуют вместе с фосфатной формой (IP1-5) и фосфатами с низким содержанием фосфора. Гексафосфат инозитола играет важную роль в регулировании важных клеточных функций, таких как передача сигнала, пролиферация клеток и дифференцировка различных клеток, и считается природным антиоксидантом (Shamsuddin et al., J Nutr. 2003;133:3778S-3784S).

[14] Недавно появились сообщения о том, что гексафосфат инозитола оказывает некоторые эффекты в отношении предотвращения рака и ингибирования роста, прогрессирования и метастазирования экспериментальных опухолей (Vucenik et al., Nutr Cancer. 2006;55:109-125).

[15] Как сообщалось, в ходе предварительных клинических исследований гексафосфат инозитола и инозитол вводят в комбинации с химиотерапией для снижения побочных эффектов химиотерапии и улучшения качества жизни пациентов, страдающих раком молочной железы или раком ободочной и прямой кишки с метастазами в печень. Однако эффективно подавлять рост раковых клеток за счет применения только гексафосфата инозитола или комбинированного состава гексафосфата инозитола с инозитолом по-прежнему остается затруднительным.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Техническая задача

[16] Таким образом, авторы настоящего изобретения подтвердили, что при применении гексафосфата инозитола, инозитола или их смеси в виде комплексного состава, при снижении концентраций соединений на основе бигуанида, метформина и 2-дезокси-D-глюкозы до терапевтических, целесообразно достигаемых in vivo, эффект ингибирования роста раковых клеток был значительно выше, что представляет собой реализацию настоящего изобретения. Поскольку авторы настоящего изобретения подтвердили, что указанный комплексный состав может эффективно убивать раковые клетки даже при применении комбинации низких концентраций указанных соединений, ожидается, что он найдет широкое применение в области лечения рака в будущем, а также в обеспечении безопасности организма человека.

[17] Таким образом, задачей настоящего изобретения является предоставление фармацевтической композиции для предотвращения и лечения рака, которая может эффективно лечить рак даже при применении малых количеств лекарственных средств и оказывает токсические эффекты на конкретные раковые клетки, со снижением таким образом побочных эффектов.

[18] Далее, еще одной задачей данного изобретения является предоставление пищевой композиции для предотвращения рака или улучшения состояния при раке.

Техническое решение

[19] В одном из аспектов для решения указанных задач согласно настоящему изобретению предложена фармацевтическая композиция для предотвращения или лечения рака, содержащая в качестве активных ингредиентов: (1) соединение на основе бигуанида или его фармацевтически приемлемую соль; (2) 2-дезокси-D-глюкозу; и (3) гексафосфат инозитола или его фармацевтически приемлемую соль, инозитол, или их смесь.

[20] В другом аспекте согласно настоящему изобретению предложена фармацевтическая композиция для предотвращения или лечения рака, содержащая: (1) соединение на основе бигуанида или его фармацевтически приемлемую соль; (2) 2-дезокси-D-глюкозу; и (3) гексафосфат инозитола, или его фармацевтически приемлемую соль, инозитол или их смесь.

[21] В другом аспекте согласно настоящему изобретению предложена пищевая композиция для предотвращения рака или улучшения состояния при раке, содержащая в качестве активных ингредиентов: (1) соединение на основе бигуанида или его фармацевтически приемлемую соль; (2) 2-дезокси-D-глюкозу; и (3) гексафосфат инозитола или его фармацевтически приемлемую соль или их смесь.

[22] Настоящее изобретение далее будет описано подробно.

[23] В одном аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции для предотвращения или лечения рака, содержащей в качестве активных ингредиентов: (1) соединение на основе бигуанида или его фармацевтически приемлемую соль; (2) 2-дезокси-D-глюкозу; и (3) гексафосфат инозитола или его фармацевтически приемлемую соль, инозитол или их смесь.

[24] Согласно настоящему изобретению был разработан прекрасный противораковый агент, способный даже в малых количествах эффективно лечить рак и обладающий меньшими побочными эффектами, путем приготовления комплексного состава, содержащего в качестве активных ингредиентов: (1) соединение на основе бигуанида или его фармацевтически приемлемую соль; (2) 2-дезокси-D-глюкозу; и (3) гексафосфат инозитола или его фармацевтически приемлемую соль, инозитол, или их смесь.

[25] Комплексный состав в соответствии с настоящим изобретением может содержать меньшее количество отдельного соединения, включенного в указанный комплексный состав, чем используемое при лечении единственным лекарственным средством, со значительным снижением таким образом риска и/или тяжести побочных эффектов и значительном повышении общего эффекта лечения.

[26] Согласно настоящему изобретению соединение на основе бигуанида представлено, например, метформином или фенформином. В частности, структурная формула метформина соответствует химической формуле 1.

[27] [Химическая формула 1]

[28]

[29]

[30] В частности, структурная формула фенформина имеет структурную формулу химической формулы 2.

[31] [Химическая формула 2]

[33]

[34] Согласно настоящему изобретению, если (1) соединение на основе бигуанида или его фармацевтически приемлемую соль; (2) 2-дезокси-D-глюкозу; и (3) гексафосфат инозитола или его фармацевтически приемлемую соль, инозитол или их смесь применяют в виде комплексного состава, указанные соединения демонстрируют высокий противораковый эффект даже при низких концентрациях.

[35] Лекарственные средства на основе бигуанида обладают противоопухолевым эффектом в том числе, но без ограничения, благодаря механизму действия, который активирует фермент, называемый АМФ-активируемой киназой (АМФК), которая играет ключевую роль в энергетическом балансе в клетках и в регуляции метаболизма питательных веществ.

[36] Отмечено, что при введении метформина крысам перорально метформин, имеющий значение LD50, равное 1450 мг/кг, представляет собой достаточно безопасное соединение; однако по-прежнему существует проблема, заключающаяся в необходимости использования метформина в высоких дозах. При этом в конце 1950-х годов в качестве перорального средства для лечения диабета был разработан фенформин, и он предназначался для лечения инсулин-зависимого диабета (диабета II типа), но вследствие серьезного побочного эффекта, называемого молочнокислым ацидозом, применение фенформина было полностью запрещено в конце 1970-х годов.

[37] Согласно настоящему изобретению была получена композиция, состоящая как минимум из трех типов соединений, с использованием (1) соединения на основе бигуанида или его фармацевтически приемлемой соли; (2) 2-дезокси-D-глюкозы; и (3) гексафосфата инозитола или его фармацевтически приемлемой соли, инозитола, или их смеси в виде комплексного состава. Было подтверждено, что указанная композиция демонстрировала высокий противораковый эффект даже при значительно более низкой концентрации, чем концентрация каждого из агентов по отдельности или в композиции из комбинации двух соединений, с решением таким образом проблемы введения в высоких дозах или проблемы побочных эффектов метформина или фенформина (см. фиг.1-4 и фиг.6-9).

[38] Согласно настоящему изобретению 2-дезокси-D-глюкоза имеет структуру, представленную химической формулой 3.

[39] [Химическая формула 3]

[40]

[41]

[42] Соединение химической формулы 3 обладает эффектом ингибитора гликолиза.

[43] Согласно настоящему изобретению, было подтверждено, что при применении 2-дезокси-D-глюкозы и соединения на основе бигуанида или его фармацевтически приемлемой соли и гексафосфата инозитола или его фармацевтически приемлемой соли, инозитола, или их смеси в виде комплексного состава, указанный состав обладал высоким противораковым эффектом даже при низких концентрациях. 2-дезокси-D-глюкоза, производное глюкозы, оказывает эффект, заключающийся в ингибировании гликолиза в метаболизме глюкозы и ингибировании гликозилирования белков в эндоплазматическом ретикулуме, индуцирующем везикулярный стресс. Не было доказано, что 2-дезокси-D-глюкоза сама по себе убивает раковые клетки, но она формирует комплексный состав согласно настоящему изобретению, который оказывает превосходные противораковые эффекты.

[44] Согласно настоящему изобретению гексафосфат инозитола и/или инозитол могут регулировать несколько важных метаболических путей в раковых клетках. Согласно настоящему изобретению гексафосфат инозитола, в частности, имеет структуру химической формулы 4.

[45] [Химическая формула 4]

[46]

[47]

[48] Согласно настоящему изобретению инозитол в частности, имеет структуру химической формулы 5.

[49] [Химическая формула 5]

[50]

[51]

[52] Согласно настоящему изобретению было подтверждено, что гексафосфат инозитола или его фармацевтически приемлемая соль, инозитол или их смесь при применении в комбинации с соединением на основе бигуанида или его фармацевтически приемлемой солью и с 2-дезокси-D-глюкозой обеспечивают высокий противораковый эффект даже в низкой концентрации.

[53] Согласно настоящему изобретению соединение на основе бигуанида и гексафосфат инозитола могут присутствовать в форме фармацевтически приемлемой соли. В качестве соли могут быть использованы соли присоединения кислоты, образованные фармацевтически приемлемыми свободными кислотами. Термин «фармацевтически приемлемая соль» согласно настоящему изобретению относится к любой органической или неорганической соли присоединения, которая, при применении в относительно нетоксичной и безвредной для пациента концентрации, не вызывает побочных эффектов, значительно снижающих благоприятный эффект соединения на основе бигуанида и гексафосфата инозитола.

[54] На данный момент для соли присоединения можно использовать, не ограничиваясь перечисленными, соляную кислоту, фосфорную кислоту, серную кислоту, азотную кислоту, винную кислоту и т.п.в качестве неорганической кислоты, метансульфоновую кислоту, п-толуолсульфоновую кислоту, уксусную кислоту, трифторуксусную кислоту, малеиновую кислоту, янтарную кислоту, щавелевую кислоту, бензойную кислоту, винную кислоту, фумаровую кислоту, миндальную кислоту, пропионовую кислоту, лимонную кислоту, молочную кислоту, гликолевую кислоту, глюконовую кислоту, галактуроновую кислоту, глутаминовую кислоту, глутаровую кислоту, глюкуроновую кислоту, аспаргиновую кислоту, аскориновую кислоту, угольную кислоту, ванилиновую кислоту, йодисто-водородную кислоту и т.п.- в качестве органической кислоты.

[55] Кроме того, для приготовления фармацевтически приемлемых солей металлов можно также использовать основания. Соль щелочного металла или соль щелочноземельного металла может быть получена, например, посредством растворения соединения в большом количестве раствора гидроксида щелочного металла или гидроксида щелочноземельного металла, отфильтровывания нерастворенной соли соединения, выпаривания и высушивания фильтрата. В указанном случае соль металла является фармацевтически приемлемой для приготовления, включая, в частности, но не ограничиваясь перечисленными, соли натрия, калия, кальция и магния или смеси указанных солей.

[56] Фармацевтически приемлемой солью каждого из соединений на основе бигуанида (метформина или фенформина) и гексафосфата инозитола может быть соль кислотной или основной группы, которая может присутствовать в каждом из соединений на основе бигуанида (метформин или фенформин) и гексафосфате инозитола, если не указано иное. К примеру, фармацевтически приемлемая соль может включать натриевую, калиевую, кальциевую, магниевую и т.п. соль гидроксильной группы; другие фармацевтически приемлемые соли аминогруппы включают бромистоводородную соль, соль серной кислоты, гидросульфатную, фосфатную, фосфорнокислую соль, дигидрофосфаты, ацетаты, сукцинаты, цитраты, соль винной кислоты, лактаты, соль миндальной кислоты, метансульфонаты (мезилаты) и п-толуолсульфонаты (тозилаты) и т.п., которые могут быть приготовлены общепринятым способом приготовления соли.

[57] В качестве фармацевтически приемлемой соли соединения на основе бигуанида (метформина или фенформина) согласно настоящему изобретению могут применяться любые соли метформина и фенформина, обладающие противораковыми эффектами, эквивалентными эффектам метформина и фенформина. Предпочтительно, но не ограничиваясь перечисленными, могут применяться гидрохлорид метформина, сукцинат метформина, цитрат метформина или гидрохлорид метформина, гидрохлорид фенформина, сукцинат фенформина, цитрат фенформина и т.п.

[58] Согласно настоящему изобретению в качестве фармацевтически приемлемой соли гексафосфата инозитола может применяться любая соль гексафосфата инозитола, обладающая противораковым эффектом, эквивалентным эффекту гексафосфата инозитола. Предпочтительно, но не ограничиваясь перечисленными, могут применяться инозитолгексафосфат (фитат) натрия, фитат калия, фитат кальция, фитат аммония, фитат магния, фитат кальция, фитат магния и кальция и т.п.

[59] Соединение на основе бигуанида, 2-дезокси-D-глюкоза и гексафосфат инозитола согласно настоящему изобретению также включают их производные. Термин «производное» относится к соединению, полученному путем химического изменения части соединения, например, добавления, замещения или удаления функциональной группы, при условии, что противораковый эффект соединения не изменяется и оно может быть включено в настоящее изобретение без ограничений.

[60] Согласно настоящему изобретению инозитол может существовать в форме различных изомеров. К изомерам относятся как энантиомеры, так и диастереомеры. Можно использовать любой инозитол, обладающий фармакологическим противораковым эффектом, предпочтительно, по меньшей мере один из группы, включающей D-хиро-инозитол, L-хиро-инозитол, мио-инозитол и сцилло-инозитол, но не ограничиваясь перечисленными.

[61] Даже при комбинировании двух или более лекарственных средств, каждое из которых известное как обладающее противораковым эффектом, от комбинированного лекарственного средства нельзя ожидать синергического эффекта, скорее, функция лекарственного средства в комбинации будет частично нейтрализована, так что найти комбинацию лекарственных средств с синергическим эффектом крайне сложно. Согласно настоящему изобретению был разработан комплексный противораковый комплексный состав, способный максимизировать противораковый эффект при минимизации побочных эффектов за счет использования минимальной концентрации противораковых лекарственных средств.

[62] Согласно настоящему изобретению предпочтительный аспект фармацевтической композиции для предотвращения или лечения рака может быть представлен композицией, содержащей соединение на основе бигуанида или его фармацевтически приемлемую соль, 2-дезокси-D-глюкозу и гексафосфат инозитола или его фармацевтически приемлемую соль; композицией, содержащей соединение на основе бигуанида или его фармацевтически приемлемую соль, 2-дезокси-D-глюкозу и инозитол; или композицией, содержащей соединение на основе бигуанида или его фармацевтически приемлемую соль, 2-дезокси-D-глюкозу и гексафосфат инозитола или его фармацевтически приемлемую соль, и инозитол.

[63] Согласно настоящему изобретению соединением на основе бигуанида может быть метформин или его фармацевтически приемлемая соль или фенформин или его фармацевтически приемлемая соль.

[64] При описании композиции на основе метформина в качестве соединения на основе бигуанида, фармацевтической композицией для предотвращения или лечения рака может быть композиция, содержащая метформин или его фармацевтически приемлемую соль, 2-дезокси-D-глюкозу и гексафосфат инозитола или его фармацевтически приемлемую соль; композиция, содержащая метформин или его фармацевтически приемлемую соль, 2-дезокси-D-глюкозу и инозитол; или композиция, содержащая метформин или его фармацевтически приемлемую соль, 2-дезокси-D-глюкозу и гексафосфат инозитола или его фармацевтически приемлемую соль, и инозитол.

[65] При описании композиции на основе фенформина в качестве другого соединения на основе бигуанида, композицией для предотвращения или лечения рака может быть композиция, содержащая фенформин или его фармацевтически приемлемую соль, 2-дезокси-D-глюкозу и гексафосфат инозитола или его фармацевтически приемлемую соль; композиция, содержащая фенформин или его фармацевтически приемлемую соль, 2-дезокси-D-глюкозу и инозитол, или композиция, содержащая фенформин или его фармацевтически приемлемую соль, 2-дезокси-D-глюкозу и гексафосфат инозитола или его фармацевтически приемлемую соль, и инозитол.

[66] Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения было подтверждено, что комплексный состав, состоящий из соединения на основе бигуанида или его фармацевтически приемлемой соли, 2-дезокси-D-глюкозы и гексафосфата инозитола или его фармацевтически приемлемой соли, способен ингибировать пролиферацию линий раковых клеток in vitro (пример 1).

[67] Далее, было подтверждено, что в случае применения комплексного состава, состоящего из трех или более соединений, имеющего в составе композицию, содержащую соединение на основе бигуанида или его фармацевтически приемлемую соль, 2-дезокси-D-глюкозу и гексафосфат инозитола или его фармацевтически приемлемую соль; композицию, содержащую соединение на основе бигуанида или его фармацевтически приемлемую соль, 2-дезокси-D-глюкозу и инозитол; или композицию, содержащую соединение на основе бигуанида или его фармацевтически приемлемую соль, 2-дезокси-D-глюкозу, гексафосфат инозитола или его фармацевтически приемлемую соль и инозитол, благодаря сочетанию данных соединений наблюдается синергический эффект предупреждения или лечения рака in vivo, а концентрация, необходимая для подавления опухолевого процесса, была значительно ниже (примеры 5-9).

[68] Таким образом, согласно данному изобретению, в случае применения по отдельности каждого из соединения на основе бигуанида, 2-дезокси-D-глюкозы, гексафосфата инозитола и инозитола вследствие недостаточности противоракового эффекта требуется применять их в большом количестве, однако при применении комплексного состава, содержащего комбинацию указанных соединений, как было подтверждено, даже небольшое его количество может эффективно убивать раковые клетки.

[69] В частности, комплексный состав метформина/2-дезокси-D-глюкозы/гексафосфата инозитола, комплексный состав метформина/2-дезокси-D-глюкозы/инозитола и комплексный состав метформина/2-дезокси-D-глюкозы/гексафосфата инозитола/инозитола, демонстрировал значительно более высокий эффект снижения концентрации, необходимой для подавления рака, по сравнению с составами отдельных соединений или комплексным составом двух соединений, таких как метформин/2-дезокси-D-глюкоза.

[70] В каждом комплексном составе согласно настоящему изобретению массовое отношение всех соединений в комбинации не имеет конкретных ограничений.

[71] Например, массовое отношение метформин или его фармацевтически приемлемая соль: 2-дезокси-D-глюкоза: гексафосфат инозитола или его фармацевтически приемлемая соль может находиться в диапазоне от 1: 0,2: 0,5 до 1: 5: 20, а относительное количество комбинации может варьировать в зависимости от типа рака, подлежащего лечению.

[72] В другом примере массовое отношение фенформин или его фармацевтически приемлемая соль: 2-дезокси-D-глюкоза: гексафосфат инозитола или его фармацевтически приемлемая соль может находиться в диапазоне от 1: 1: 1 до 1: 50: 200, а относительное количество комбинации может варьировать в зависимости от типа рака, подлежащего лечению.

[73] В еще одном примере массовое отношение метформин или его фармацевтически приемлемая соль: 2-дезокси-D-глюкоза: инозитола может быть в диапазоне от 1: 0,2: 0,5 to 1: 5: 20, а относительное количество комбинации может варьировать в зависимости от типа рака, подлежащего лечению.

[74] В еще одном примере массовое отношение фенформин или его фармацевтически приемлемая соль: 2-дезокси-D-глюкоза: инозитола может находиться в диапазоне от 1: 1: 1 до 1: 50: 200, а относительное количество комбинации может варьировать в зависимости от типа рака, подлежащего лечению.

[75] В еще одном примере массовое отношение метформин или его фармацевтически приемлемая соль: 2-дезокси-D-глюкоза: гексафосфат инозитола или его фармацевтически приемлемая соль: инозитола может находиться в диапазоне от 1: 0,2: 0,5: 0,5 до 1: 5: 20: 20, а относительное количество комбинации может варьировать в зависимости от типа рака, подлежащего лечению.

[76] В еще одном примере, массовое отношение фенформин или его фармацевтически приемлемая соль: 2-дезокси-D-глюкоза: гексафосфат инозитола или его фармацевтически приемлемая соль: инозитола может находиться в диапазоне от 1: 1: 1: 1 до 1: 50: 200: 200, а относительное количество комбинации может варьировать в зависимости от типа рака, подлежащего лечению. Согласно настоящему изобретению термин «рак» относится к заболеванию, связанному с контролем смерти клеток, а также относится к заболеванию, вызванному чрезмерной пролиферацией клеток, при которой нарушен нормальный баланс апоптоза. Указанные аномально и чрезмерно пролиферирующие клетки вторгаются в окружающие их ткани и органы, в некоторых случаях формируя образования, и разрушают или изменяют нормальную структуру организма, что обозначается термином «рак». Как правило, термин «опухоль» относится к аномальному образованию, которое появляется в результате автономного избыточного разрастания тканей организма, и может быть классифицировано как доброкачественная или злокачественная опухоль. Злокачественная опухоль растет значительно быстрее, чем доброкачественная, и внедряется в окружающие ткани, как результат, возникают метастазы, угрожающие жизни. Обычно злокачественную опухоль называют «раком», и типы рака включают в себя опухоли спинного мозга, рак головного мозга, рак головы и шеи, рак легких, рак молочной железы, опухоль щитовидной железы, рак пищевода, рак желудка, рак толстой кишки, рак печени, рак поджелудочной железы, рак желчевыводящих путей, рак почки, рак мочевого пузыря, рак предстательной железы, рак яичек, герминогенную опухоль, рак яичника, рак шейки матки, рак эндометрия, лимфому, острый лейкоз, хронический лейкоз, множественную миелому, саркому, злокачественную меланому, рак кожи и т.п.Противораковая композиция согласно настоящему изобретению может применяться без ограничений относительно типа рака, но может применяться для предотвращения или лечения по меньшей мере одного типа рака из группы, состоящей из рака печени, рака легкого, рака желудка, рака поджелудочной железы, рака толстой кишки, рака шейки матки, рака молочной железы, рака предстательной железы, рака яичника, рака головного мозга, остеосаркомы и рака мочевого пузыря.

[77] Термин «предотвращение или лечение» согласно настоящему изобретению относится ко всем действиям, которые ингибируют или задерживают развитие рака, с применением композиции, содержащей в качестве активных ингредиентов: (1) соединение на основе бигуанида или его фармацевтически приемлемую соль; (2) 2-дезокси-D-глюкозу; и (3) гексафосфат инозитола или его фармацевтически приемлемую соль, инозитол или их смеси, и, в частности, «лечение» («обработка») относится ко всем действиям с применением данной композиции, направленным на улучшение состояния при раке или благоприятную модификацию рака.

[78] Таким образом, согласно настоящему изобретению предложен способ лечения рака, включающий введение терапевтически эффективного количества (1) соединения на основе бигуанида или его фармацевтически приемлемой соли; (2) 2-дезокси-D-глюкозы; и (3) гексафосфата инозитола или его фармацевтически приемлемой соли, инозитола или их смеси пациенту, нуждающемуся в таком лечении.

[79] Термин «введение» согласно настоящему изобретению обозначает предоставление композиции субъекту в соответствии с настоящим изобретением любым подходящим способом. В данном случае термин «субъект» относится к животному, и может обозначать млекопитающее, у которого может наблюдаться благоприятный эффект, как правило, при лечении композицией в соответствии с настоящим изобретением. Предпочтительные примеры таких индивидуумов могут включать приматов, таких как человек.

[80] Композиция для предотвращения или лечения рака согласно настоящему изобретению дополнительно, если потребуется, в дополнение к ранее упомянутым активным ингредиентам может включать химиотерапевтический агент.

[81] Кроме того, композиция для предотвращения или лечения рака согласно настоящему изобретению дополнительно может включать фармацевтически приемлемый носитель. Композиция согласно настоящему изобретению, в соответствии с целью ее применения может быть приготовлена и использована в форме перорального состава, такого как порошки, гранулы, таблетки, капсулы, суспензии, эмульсии, сиропы, аэрозоли и т.п., стерильных растворов для инъекций, форм для наружного применения, таких как мази и т.п., а также суппозиториев и т.п., в соответствии с общими способами. Носитель, вспомогательное вещество и разбавитель, которые могут быть включены в указанную композицию, могут включать лактозу, декстрозу, сахарозу, сорбит, маннит, ксилит, эритрит, мальтит, крахмал, гуммиарабик, альгинат, желатин, фосфат кальция, силикат кальция, целлюлозу, метилцеллюлозу, микрокристаллическую целлюлозу, поливинилпирролидон, воду, метилгидроксибензоат, пропилгидроксибензоат, тальк, стеарат магния, минеральное масло и т.п.

[82] Твердый состав для перорального применения включает таблетки, пилюли, порошок, гранулы, капсулы и т.п., и подобный твердый состав может быть приготовлен путем смешивания с указанной композицией по меньшей мере одного вспомогательного вещества, например, крахмала, карбоната кальция, сахарозы, лактозы, желатина и т.п. Кроме того, помимо простых вспомогательных веществ могут быть добавлены смазывающие вещества, такие как стеарат магния и тальк. Жидкий состав для перорального применения может относиться к суспензии, раствору для приема внутрь, эмульсии, сиропу и т.п. В дополнение в воде они могут включать в себя различные вспомогательные вещества, например, смачивающий агент, подсластитель, ароматизатор, консервант и т.п., а также жидкий парафин, которые обычно применяют в качестве простых растворителей.

[83] Состав для парентерального введения включает стерильный водный раствор, неводный раствор, суспензию, эмульсию, лиофилизирующий агент, а также суппозитории. В качестве неводного раствора и суспензии могут быть использованы пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, растительное масло, например, оливковое, подходящий для инъекций сложный эфир, например, этилолеат и т.п. Основы для инъецируемого агента могут включать стандартные добавки, такие как солюбилизаторы, изотонические агенты, суспендирующие агенты, эмульгаторы, стабилизаторы и консерванты.

[84] Композиция согласно настоящему изобретению может быть введена различными способами, такими как пероральный, внутривенный, подкожный, внутрикожный, интраназальный, интраперитонеальный, внутримышечный, чрескожный способ введения и т.п., а дозировка может варьировать в зависимости от возраста, пола и веса пациента, и может легко быть установлена специалистами в данной области техники. Дозировка композиции согласно настоящему изобретению может быть повышена или понижена в зависимости от пути введения, тяжести заболевания, пола, веса, возраста и т.п. Предпочтительно, при применении комплексного состава, включающего четыре соединения, метформин в качестве соединения на основе бигуанида может применяться в количестве от 5 до 80 мг/кг (массы тела) в сутки, фенформин может применяться в количестве от 0,1 до 10 мг/кг (массы тела) в сутки, 2-дезокси-D-глюкоза может применяться в количестве от 0,1 до 160 мг/кг (массы тела) в сутки, гексафосфат инозитола может применяться использован в количестве от 2 до 600 мг/кг (массы тела) в сутки, а инозитол может применяться в количестве от 2 до 600 мг/кг (массы тела) в сутки. Тем не менее, объем настоящего изобретения не ограничен указанными дозировками.

[85] Согласно еще одному аспекту настоящее изобретение относится к способу лечения рака, который включает введение субъекту (1) соединения на основе бигуанида или его фармацевтически приемлемой соли; (2) 2-дезокси-D-глюкозы; и (3) гексафосфата инозитола или его фармацевтически приемлемой соли, инозитола, или их смеси.

[86] Согласно еще одному аспекту настоящее изобретение относится к композиции для применения в лечении рака, которая содержит: (1) соединение на основе бигуанида или его фармацевтически приемлемую соль; (2) 2-дезокси-D-глюкозу; и (3) гексафосфат инозитола или его фармацевтически приемлемую соль, инозитол, или их смесь.

[87] Согласно еще одному аспекту настоящее изобретение относится к применению композиции, которая содержит: (1) соединение на основе бигуанида или его фармацевтически приемлемую соль; (2) 2-дезокси-D-глюкозу; и (3) гексафосфат инозитола или его фармацевтически приемлемую соль, инозитол или их смесь, для приготовления лекарственного средства для предотвращения или лечения рака.

[88] Согласно еще одному аспекту настоящее изобретение относится к пищевой композиции для предотвращения рака или улучшения состояния при раке, содержащая в качестве активных ингредиентов: (1) соединение на основе бигуанида или его фармацевтически приемлемую соль; (2) 2-дезокси-D-глюкозу; и (3) гексафосфат инозитола или его фармацевтически приемлемую соль, инозитол, или их смеси.

[89] Указанным соединением на основе бигуанида может быть метформин или фенформин.

[90] Указанная композиция помимо активных ингредиентов может включать дополнительные пищевые добавки, пригодные для приема внутрь.

[91] Термин «дополнительная пищевая добавка» согласно настоящему изобретению означает компонент, который может быть добавлен в пищу в качестве дополнения и может быть надлежащим образом выбран и применен специалистами в данной области техники путем добавления в каждый из составов для приготовлении функциональных оздоровительных продуктов питания. Примеры дополнительных пищевых добавок включают различные питательные вещества, витамины, минеральные вещества (электролиты), вкусоароматические вещества, такие как синтетические, натуральные и т.п., подкрашивающие вещества и наполнители, пектиновую кислоту и ее соли, альгиновую кислоту и ее соли, органические кислоты, защитные коллоидные загустители, регуляторы pH, стабилизаторы, консерванты, глицерин, спирты и агенты для газирования в газированных напитках и т.п., но типы биологически активных пищевых добавок согласно настоящему изобретению не ограничиваются приведенными выше примерами.

[92] Пищевая композиция согласно настоящему изобретению включает в себя функциональные оздоровительные продукты питания. Термин «функциональные оздоровительные продукты питания» согласно настоящему изобретению относится к приготовленной и обработанной пище в форме таблеток, капсул, порошков, гранул, жидких форм, пилюль и т.п.с использованием сырья и ингредиентов, обладающих полезной для человеческого организма функциональностью. В данном контексте «функциональность» относится к адаптации питательных веществ к структуре и функциям человеческого организма или к получению эффектов, полезных для применения в области здравоохранения, таких как физиологическое действие и т.п. Функциональные оздоровительные продукты питания согласно настоящему изобретению могут быть приготовлены обычными для данной области техники способами, и могут быть приготовлены путем добавления сырья и ингредиентов, которые обычно используются для приготовления в данной области техники. Кроме того, состав функционального оздоровительного продукта питания может быть получен любым способом без ограничений, при условии, что указанный состав признан функциональным оздоровительным продуктом питания. Пищевая композиция согласно настоящему изобретению может быть введена в составы различных типов и, в отличие от обычных лекарственных средств, пищевая композиция, изготовленная из пищевых продуктов в качестве сырья, обладает преимуществом в виде отсутствия побочных эффектов, которые могут возникать при длительном приеме лекарственных средств, и обладает отличной портативностью; также функциональные оздоровительные продукты питания согласно настоящему изобретению могут приниматься в качестве добавки с целью усиления эффектов противораковых лекарственных средств.

Полезные эффекты изобретения

[93] Композиция согласно настоящему изобретению оказывает синергический противораковый эффект в результате комбинирования надлежащим образом конкретных лекарственных средств, проблема при применении которых состоит в необходимости использования высоких доз, обеспечивая таким образом возможность убивать раковые клетки при применении в малых количествах и эффективно лечить рак. Более того, композиция согласно настоящему изобретению способна убивать только раковые клетки без побочных эффектов, оказывая специфический токсический эффект на раковые клетки при отсутствии наблюдаемого токсического эффекта на нормальные клетки, и, таким образом, подходит для применения в качестве противоракового агента, и для предотвращения рака и улучшения состояния при раке.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

[94] На фиг.1 и 2 приведены графики выживаемости клеток по результатам МТТ-теста в процентах через 48 часов при обработке отдельными или комплексными составами метформина (МЕТ), 2-дезокси-D-глюкозы (2DG) и гексафосфата инозитола (IP6) линий клеток рака, происходящих от человека, в низких концентрациях, допустимых для использования в плазме человека. Вертикальная черта на каждом столбце отражает стандартное отклонение. Статистический анализ проводили с использованием однофакторного дисперсионного анализа с апостериорным критерием множественных сравнений Тьюки в программном обеспечении GraphPad Prism 6.0.

[95] На фиг.1A представлен график исследования клеточной линии HepG2, раковых клеток, происходящих из печени человека. Фиг.1B представляет собой график исследования клеточной линии A549, раковых клеток, происходящих из человеческого легкого. Фиг.1C представляет собой график исследования клеточной линии AGS, раковых клеток, происходящих из желудка человека. Фиг.1D представляет собой график исследования клеточной линии PANC-1, раковых клеток, происходящих из поджелудочной железы человека. Фиг.1E представляет собой график исследования клеточной линии DLD-1, раковых клеток, происходящих из толстой кишки человека. Фиг.1F представляет собой график исследования клеточной линии HeFa, раковых клеток, происходящих из шейки матки человека. Фиг.2A представляет собой график исследования клеточной линии MDA-MB-231, раковых клеток, происходящих из молочной железы человека. Фиг.2B представляет собой график исследования клеточной линии PC-3, раковых клеток, происходящих из предстательной железы человека. Фиг.2C представляет собой график исследования клеточной линии SK-OV-3, раковых клеток, происходящих из яичника человека. Фиг.2D представляет собой график исследования клеточной линии T24, раковых клеток, происходящих из мочевого пузыря человека. Фиг.2E представляет собой график исследования клеточной линии U-87 MG, раковых клеток, происходящих из головного мозга человека. Фиг.2F представляет собой график исследования клеточной линии Saos-2, раковых клеток, происходящих из костей человека. **** p<0,0001.

[96] Фиг.3 и 4 представляют собой графики выживаемости клеток, полученные в результате МТТ-теста, в процентах, после 48-часовой обработки отдельными или комплексными составами фенформина (PHE), 2DG, и IP6, линий раковых клеток, происходящих от человека, в низких концентрациях, допустимых для использования в плазме человека. Вертикальная черта на каждом столбце отражает стандартное отклонение. Статистический анализ проводили с использованием однофакторного дисперсионного анализа с апостериорным критерием множественных сравнений Тьюки в программном обеспечении GraphPad Prism 6.0.

[97] Фиг.3A представляет собой график исследования клеточной линии HepG2, раковых клеток, происходящих из печени человека. Фиг.3B представляет собой график исследования клеточной линии A549, раковых клеток, происходящих из человеческого легкого. Фиг.3C представляет собой график исследования клеточной линии AGS, раковых клеток, происходящих из желудка человека. Фиг.3D представляет собой график исследования клеточной линии PANC-1, раковых клеток, происходящих из поджелудочной железы человека. Фиг.3E представляет собой график исследования клеточной линии DLD-1, раковых клеток, происходящих из толстой кишки человека. Фиг.3F представляет собой график исследования клеточной линии HeLa, раковых клеток, происходящих из шейки матки человека. Фиг.4A представляет собой график исследования клеточной линии MDA-MB-231, раковых клеток, происходящих из молочной железы человека. Фиг.4B представляет собой график исследования клеточной линии PC-3, раковых клеток, происходящих из предстательной железы человека. Фиг.4C представляет собой график исследования клеточной линии SK-OV-3, раковых клеток, происходящих из яичника человека. Фиг.4D представляет собой график исследования клеточной линии T24, раковых клеток, происходящих из мочевого пузыря человека. Фиг.4E представляет собой график исследования клеточной линии U-87 MG, раковых клеток, происходящих из головного мозга человека. Фиг.4F представляет собой график исследования клеточной линии Saos-2, раковых клеток, происходящих из костей человека. **** p<0,0001.

[98] Фиг.5 представляет собой график выживаемости клеток по результатам МТТ-теста в процентах через 48 часов при обработке комплексным составом MET, 2DG и IP6, нормальных клеточных линий, происходящих от человека, в низких концентрациях, допустимых для использования в плазме человека. **** p<0,0001.

[99] Фиг.6 представляют собой график выживаемости клеток и экспрессии белка в клетках 4T1 при применении отдельных и комплексных составов MET, 2DG и IP6. * p<0,05. **** p<0,0001.

[100] Фиг.7 представляет собой график ингибирования синтеза АТФ отдельными и комплексными составами MET, 2DG и IP6 в клетках 4T1. * p<0,05. **** p<0,0001.

[101] Фиг.8 представляет собой график объемов опухоли, измеряемых с интервалом 3 дня, соответствующих введению отдельных и комплексных составов MET, 2DG, IP6 и Ins, у подопытного животного. * p<0,05, **** p<0,0001.

[102] Фиг.9 представляет собой график массы опухолей, измеряемой на 19-й день после введения отдельных и комплексных составов MET, 2DG, IP6 и Ins, у подопытного животного. * p<0,05, ** p<0,01, **** p<0,0001.

[103] Фиг.10 представляет собой график массы, измеряемой на 18-й день введения отдельных и комплексных составов MET, 2DG, IP6, Ins, у подопытного животного. НЗ (нет значимого различия).

[104] Фиг.11 представляет собой график исследования частоты встречаемости метастазов в легких при применении отдельных и комплексных составов MET, 2DG, IP6 и Ins.

[105] Фиг.12 представляет собой диаграмму окрашивания гематоксилином и эозином для исследования эффектов отдельных и комплексных составов MET, 2DG, IP6 и Ins, на гистоморфологические изменения в тканях опухолей.

Осуществление изобретения

[106] Преимущества и признаки настоящего изобретения и способы его осуществления будут понятны при обращении к подробно описанным ниже вариантам реализации. Однако настоящее изобретение не ограничивается приведенными примерами вариантов его реализации, и может быть осуществлено в разнообразных формах. Примеры вариантов реализации изобретения представлены исключительно для дополнения раскрытия настоящего изобретения и предоставления специалисту в области техники, к которой относится настоящее изобретение, полной информации о категории изобретения; настоящее изобретение определено исключительно прилагаемой формулой изобретения.

[107] В примерах, представленных ниже, в качестве соединения на основе бигуанида среди прочих фармацевтически приемлемых солей метформина или фенформина были использованы метформина гидрохлорид (Метформин HCl) и фенформина гидрохлорид (Фенформин HCl). Форма указанных солей не ограничена представленными примерами.

[108] В примерах ниже среди нескольких фармацевтически приемлемых форм соли гексафосфата инозитола был использован гексафосфат инозитола (фитиновая кислота). Форма указанных солей не ограничена представленными примерами.

[109] В примерах ниже в качестве изомера инозитола был использован мио-инозитол. Указанные изомеры не ограничены представленными примерами.

[110] Клеточная культура

[111] Для тестирования использовали клетки рака печени (HepG2), легкого (A549), желудка (AGS), поджелудочной железы (PANC-1), толстого кишечника (DLD-1), шейки матки (HeLa), молочной железы (MDA-MB-231), предстательной железы (PC-3), яичника (SK-OV-3), мочевого пузыря (T24), глиобластомы (U-87 MG), остеосаркомы (Saos-2) и клетки рака молочной железы, происходящие от мыши (4T1) в качестве опухолевых клеток, а также линии клеток: предстательной железы (PZ-HPV-7), толстой кишки (CCD-18Co) и легкого (MRC5) в качестве неопухолевых клеток. Все приобретенные и использованные клеточные линии были получены из Корейского банка клеточных линий (Korean Cell Line Bank) или Американской коллекции типовых культур (ATCC) (Роквилл, Мэриленд).

[112] Клетки культивировали и хранили в инкубаторе (5% CO₂/95% воздуха) при температуре 37 с использованием раствора для культивирования клеток, полученного путем добавления 10% фетальной бычьей сыворотки (ФБС, Hyclone) и 1% пенициллина/стрептомицина (П/С, Hyclone) в среду Института онкологии Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI1640, Hyclone, Логан, Юта, США). Когда клетки заполняли примерно 80% чашки для культивирования, монослой клеток смывали натрий-фосфатным буфером (ФСБ, Hyclone) и субкультивировали, используя 0,25% трипсина/2,65 мМ ЭДТК (Hyclone); среду заменяли каждые два дня.

[113] Применяемое лекарственное средство

[114] Метформин HCl (здесь и далее MET), фенформин HCl (здесь и далее PHE), 2-дезокси-D-глюкоза (здесь и далее 2DG), гексафосфат инозитола (фитиновая кислота, здесь и далее IP6) и мио-инозитол (здесь и далее Ins) были приобретены в компании Сигма (Sigma) (Сент-Луис, США). Согласно настоящему изобретению наименования всех препаратов, упоминаемых в таблице и на чертежах с обзором результатов, полученных в результате тестирования, указаны в сокращенной форме.

[115] Эталонный пример 1: Исследование ингибирования роста клеток in vitro

[116] Цитотоксичность MET или PHE, 2DG и IP6 подтверждали в МТТ-тесте [тест с 3-(4,5-диметил-тиазолил-2)-2,5-дифенилтетразолия бромидом]. После распределения клеток (3-4 × 10⁵ клеток/лунку) в 96-луночный культуральный планшет и стабилизации в течение 12 часов или более, из каждой лунки извлекали среду, MET или PHE, 2DG и IP6 смешивали для всех клеток во всех концентрациях и дополняли средой без сыворотки. В среду для контрольных клеток добавляли ФСБ. После инкубации при 37°C с CO₂ в течение 48 часов среду с контролем и смесью полностью извлекали и культивировали при температуре 37°C в течение 4 часов с реагентом МТТ (0,5 мг/мл). Затем среду, содержащую реагент МТТ, полностью извлекали, и кристаллы фармазана (МТТ), образованные живыми клетками, оставляли и растворяли при комнатной температуре в течение 15 минут или дольше путем добавления диметилсульфоксида (Sigma). Оптическую плотность измеряли при длине волны 560 нм с использованием микропланшетного ридера (BioTek® Instruments, Inc., Винуски, Вирджиния, США).

[117] Эталонный пример 2: Способ тестирования для отдельных и комплексных составов

[118] Клетки (3-4× 10⁵ клеток/лунку) высевали в 96-луночный планшет и обрабатывали каждым из MET или PHE, 2DG и IP6, в виде отдельных составов в каждой из концентраций для подтверждения степени ингибирования пролиферации клеток.

[119] Комплексный лекарственный состав использовали в концентрации, соответствующей IC50 для комплексного состава, состоящего из двух или более соединений из группы, состоящей из MET или PHE, 2DG и IP6. Все клеточные линии культивировали в течение 48 при определенной концентрации отдельного или комплексного состава, и измеряли эффект ингибирования роста с помощью МТТ-теста.

[120] Эталонный пример 3: Анализ методом вестерн-блоттинга

[121] Для выделения белков из клеток добавляли буфер для тотального лизиса (50 мМ Трис, 150 мМ NaCl, 5 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТК), 1 мМ дитиотреитола (DTT), 0,5% нонидета P-40, 100 мМ фенилметилсульфонилфторида (PMSF), 20 мМ апротинина, 20 мМ лейпептина, pH 8,0) и растворяли при 4°C в течение 30 минут, а затем центрифугировали (12 ООО об/мин, 10 мин) для получения супернатанта.

[122] Также, для выделения белков цитоплазмы/ядра к клеткам добавляли буферный раствор А (10 мМ ГЭПЭС (pH 7,9), 1,5 мМ MgCl₂, 10 мМ KCl, 0,5 мМ DTT, 300 мМ сахароза, 0,1% NP-10, 0,5 мМ ФМСФ) и растворяли при 4°C в течение 5 минут, затем центрифугировали (1000 об/мин 1 мин) для выделения осадка (ядерного белка). Выделенный осадок растворяли в буферном растворе B (20 мМ ГЭПЭМ (pH 7,9), 20% глицерола, 100 мМ KCl, 100 мМ NaCl₂, 0,2 мМ ЭДТА, 0,5 мМ DTT, 0,5 мМ ФМСФ) в течение 15 минут при 4°C и центрифугировали (10 000 об/мин, 5 мин), чтобы выделить белок ядра.

[123] Белок, экстрагированный с помощью описанного выше способа, подвергали электрофорезу в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (ДСН) и электрофорезу на нитроцеллюлозной мембране (Whatman, GE Health Care Corp., Фэрфилд, Коннектикут, США). Для выявления специфического белка в течение 1 часа проводили реакцию с буфером TBS-T с 5% обезжиренным молоком (GIBCO-BRL, Invitrogen Co., Гранд-Айленд, Нью-Йорк, США) для блокировки неспецифического белка, и затем антитела к специфическому белку pAMPKa, ACCpS79 и бета-актину (Santa Cruz Biotechnology Inc., Даллас, Техас, США) разбавляли и проводили реакцию при соотношении 1:1000 в буфере TBS-T с 2,5% обезжиренным молоком.

[124] Прореагировавшую мембрану обрабатывали вторичным антителом к специфическому антителу, а затем фотосенсибилизировали на рентгеновской пленке с применением метода усиленной хемолюминисценции (ECL, Amersham Life Science Corp.Арлингтон-Хайтс, Иллинойс, США) для анализа экспрессии специфического белка.

[125] Эталонный пример 4: подопытные животные

[126] Использовали пятинедельных самок голых мышей BALB/c без специфических патогенов, приобретенных у Orient Bio Co., Ltd. После периода карантина и адаптации в течение 1 недели отбирали здоровых мышей без снижения массы тела и использовали для тестирования. Подопытных животных содержали в условиях для разведения с температурой 23±3°C, относительной влажностью 50±10%, интенсивностью вентиляции 10-15 объемов/час, световым периодом 12 часов (с 08:00 до 20:00) и освещенностью от 150 до 300 Лк. В период до проведения тестирования животные могли неограниченно есть твердый корм для подопытных животных (Cargill Agripurina Co., Ltd.) и пить воду.

[127] Эталонный пример 5: Пересадка опухолевых клеток и введение тестируемого вещества

[128] После недельного периода адаптации подопытным голым мышам BALB/c в жировую ткань левой молочной железы вводили раковые клетки молочной железы 4T1 (1 × 10⁵ клеток/мышь), после чего визуально наблюдали наличие опухолевых тканей. После того как размер опухолевой ткани у подопытных животных достигал 100 мм³, подопытных животных разделяли на 9 экспериментальных групп, используя дизайн с блочной рандомизацией. 9 экспериментальных групп классифицировали как: контрольную группу, группу MET (MET 250 мг/кг), группу 2DG (2DG 500 мг/кг), группу Ins (Ins 500 мг/кг), группу IP6 (IP6 500 мг/кг), группу MET+2DG (MET 250 мг/кг+2DG 500 мг/кг), группу MET+2DG+Ins (MET 250 мг/кг+2DG 500 мг/кг+Ins 500 мг/кг), группу MET+2DG+IP6 (MET 250 мг/кг+2DG 500 мг/кг+IP6 500 мг/кг), группу MET+2DG+IP6+Ins (MET 250 мг/кг+2DG 500 мг/кг+IP6 250 мг/кг+Ins 250 мг/кг), и в каждой экспериментальной группе использовали по 10 подопытных животных. Тестируемое вещество растворяли в дистиллированной воде и вводили внутрибрюшинно в фиксированные моменты времени в течение 18 дней.

[129] Эталонный пример 6: Измерение массы тела подопытных животных и объема опухолей

[130] В течение периода тестирования массу тела подопытного животного измеряли в фиксированные моменты времени один раз в неделю с даты введения тестируемого вещества. Измерение объема опухоли проводили с помощью цифрового штангенциркуля каждые три дня, измеряли длину и ширину опухоли, и рассчитывали объем опухоли, подставляя данные в следующее уравнение.

[131] Объем опухоли (мм³)=(ширина² × длина) / 2

[132] Эталонный пример 7: Измерение массы опухоли

[133] Через 14 дней после введения тестируемого вещества подопытным животным проводили анестезию с применением анестетика, полученного посредством разбавления трибромэтанола трет-амиловым спиртом, и собирали кровь из орбиты. Кровь помещали в пробирки для отделения сыворотки (Becton Dickinson) и оставляли при комнатной температуре на 30 минут, затем центрифугировали при 3000 об/мин в течение 20 минут, чтобы отделить сыворотку, и отделенную сыворотку хранили при -70°C до проведения анализа. После взятия крови у подопытных животных извлекали и взвешивали опухоль. Опухоли взвешивали и некоторые из них фиксировали в 10% забуференном нейтральном формалине (NBF, Sigma-Aldrich Co.) и заливали в парафин для проведения иммуноокрашивания тканей. Легкое фиксировали в растворе Боуина (Sigma-Aldrich Co.), осматривали опухолевый узел, метастазирующий в легкое, и проводили оценку степени метастазирования в легкие.

[134] Эталонный пример 8: Окрашивание опухолевой ткани гематоксилином и эозином

[135] Опухолевую ткань, иммобилизированную в 10% забуференном нейтральном формалине, заливали в парафин и готовили 5 мм срезы залитых в парафин тканей. После удаления парафина ткани гидратировали в растворах с последовательным снижением % спирта, начиная со 100% спирта и заканчивая 0% этанола (H₂O). Окрашивание тканей гематоксилином и эозином проводили в соответствии с общим методом гистоморфологического изучения опухолевых тканей, и изучали гистоморфологические изменения опухолевых тканей с помощью световой микроскопии (Carl Zeiss).

[136] Эталонный пример 9: Статистическая обработка

[137] Все полученные в анализе значения выражали в виде среднего±С.О. Для сравнения различий между контрольной группой и группой, получавшей тестируемое вещество, верифицировали значимость, используя однофакторный или двухфакторный дисперсионный анализ с применением апостериорного критерия множественных сравнений Тьюки в программном обеспечении GraphPad Prism 6.0. Было установлено, что статистическая значимость присутствовала только при p<0,05 или более.

[138]

[139] Пример 1. Тестирование ингибирования пролиферации клеток отдельными и комплексными составами MET или PHE, 2DG и IP6

[140] Сравнение эффектов ингибирования пролиферации клеток отдельными и комплексными составами MET (или PHE), 2DG и IP6 проводили с использованием 12 типов раковых клеток.

[141] Пример 1-1: Выживаемость клеток после введения MET, 2DG и IP6 отдельно и в комбинации

[142] Фиг.1 и 2 представляют собой диаграммы исследования выживаемости клеток после введения MET, 2DG и IP6, отдельно или в комбинации, с использованием таких линий раковых клеток человека, как рак печени (HepG2), рак легкого (A549), рак желудка (AGS), рак поджелудочной железы (PANC-1), рак толстой кишки (DLD-1), рак шейки матки (HeLa), рак молочной железы (MDA-MB- 231), рак предстательной железы (PC-3), рак яичника (SK-OV-3), рак мочевого пузыря (T24), глиобластома (U-87 MG) и остеосаркома (Saos-2).

[143] На фиг.1A приведены показатели выживаемости клеток линии рака печени (HepG2) при обработке отдельно или в комбинации 4 мМ MET, 1 мМ 2DG и 1 мМ IP6. При обработке комбинированным составом выживаемость клеток была значительно ниже по сравнению с обработкой отдельным составом, в том числе контролем (P<0,0001). При сравнении результатов в группах, обработанных комбинациями, показатель выживаемости клеток для комбинации MET+2DG+IP6 составил 17,44±4,8, что было значимо, в 2,6 раза, ниже показателя выживаемости клеток 45,40±4,2 для комбинации MET+2DG (P<0,0001).

[144] На фиг.1B приведены показатели выживаемости клеток линии рака легкого (A549) при обработке отдельно или в комбинации 4 мМ MET, 1 мМ 2DG и 1 мМ IP6. При обработке комбинированным составом выживаемость клеток была значительно ниже по сравнению с обработкой отдельным составом, в том числе контролем (P<0,0001). При сравнении результатов в группах, обработанных комбинациями, показатель выживаемости клеток для комбинации MET+2DG+IP6 составил 19,43±5,2, что было значимо, в 2,5 раза, ниже показателя выживаемости клеток 48,84±5,3 для комбинации MET+2DG (P<0,0001).

[145] На фиг.1C приведены показатели выживаемости клеток линии рака желудка (AGS) при обработке отдельно или в комбинации 2 мМ MET, 0,7 мМ 2DG и 1 мМ IP6. При обработке комбинированным составом выживаемость клеток была значительно ниже по сравнению с обработкой отдельным составом, в том числе контролем (P<0,0001). При сравнении результатов в группах, обработанных комбинациями, показатель выживаемости клеток для комбинации MET+2DG+IP6 составил 15,20±4,2, что было значимо, в 3,5 раза, ниже показателя выживаемости клеток 53,00±3,8 для комбинации MET+2DG (P<0,0001).

[146] На фиг.1D приведены показатели выживаемости клеток линии поджелудочной железы (PANC-1) при обработке отдельно или в комбинации 5 мМ MET, 0,7 мМ 2DG и 1 мМ IP6. При обработке комбинированным составом выживаемость клеток была значительно ниже по сравнению с обработкой отдельным составом, в том числе контролем (P<0,0001). При сравнении результатов в группах, обработанных комбинациями, показатель выживаемости клеток для комбинации MET+2DG+IP6 составил 25,27±5,2, что было значимо, в 2,6 раза, ниже показателя выживаемости клеток 65,40±4,3 для комбинации MET+2DG (P<0,0001).

[147] На фиг.1E приведены показатели выживаемости клеток линии рака толстой кишки (DLD-1) при обработке отдельно или в комбинации 5 мМ MET, 0,4 мМ 2DG и 1 мМ IP6. При обработке комбинированным составом выживаемость клеток была значительно ниже по сравнению с обработкой отдельным составом, в том числе контролем (P<0,0001). При сравнении результатов в группах, обработанных комбинациями, показатель выживаемости для комбинации MET+2DG+IP6 составил 26,70±4,7, что было значимо, в 2,4 раза, ниже показателя выживаемости клеток 65,40±4,6 для комбинации MET+2DG (P<0,0001).

[148] На фиг.1F приведены показатели выживаемости клеток линии рака шейки матки (HeLa) при обработке отдельно или в комбинации 6 мМ MET, 0,5 мМ 2DG и 1 мМ IP6. При обработке комбинированным составом выживаемость клеток была значительно ниже по сравнению с обработкой отдельным составом, в том числе контролем (P<0,0001). При сравнении результатов в группах, обработанных комбинациями, показатель выживаемости для комбинации MET+2DG+IP6 составил 24,67±3,6, что было значимо, в 2,1 раза, было ниже, чем 52,89±4,6 для комбинации MET+2DG (P<0,0001).

[149] На фиг.2A приведены показатели выживаемости клеток линии рака молочной железы (MDA-MB-231) при обработке отдельно или в комбинации 6 мМ MET, 1 мМ 2DG и 1 мМ IP6. При обработке комбинированным составом выживаемость клеток была значительно ниже по сравнению с обработкой отдельным составом, в том числе контролем (P<0,0001). При сравнении результатов в группах, обработанных комбинациями, показатель выживаемости для комбинации MET+2DG+IP6 составил 26,37±5,3, что было значимо, в 2,1 раза, ниже показателя выживаемости клеток 55,15±4,5 для комбинации MET+2DG (P<0,0001).

[150] На фиг.2B приведены показатели выживаемости клеток линии рака предстательной железы (PC-3) при обработке отдельно или в комбинации 5 мМ MET, 1 мМ 2DG и 1 мМ IP6. При обработке комбинированным составом выживаемость клеток была значительно ниже по сравнению с обработкой отдельным составом, в том числе контролем (P<0,0001). При сравнении результатов в группах, обработанных комбинациями, показатель выживаемости для комбинации MET+2DG+IP6 составил 19,51±5,6, что было значимо, в 3,4 раза ниже показателя выживаемости клеток 66,70±4,6 для комбинации MET+2DG (P<0,0001).

[151] На фиг.2C приведены показатели выживаемости клеток линии рака яичника (SK-OV-3) при обработке отдельно или в комбинации 5 мМ MET, 0,5 мМ 2DG и 1 мМ IP6. При обработке комбинированным составом выживаемость клеток была значительно ниже по сравнению с обработкой отдельным составом, в том числе контролем (P<0,0001). При сравнении результатов в группах, обработанных комбинациями, показатель выживаемости для комбинации MET+2DG+IP6 составил 22,80±5,2, что было значимо, в 2,9 раза, ниже показателя выживаемости клеток 66,80±3,6 для комбинации MET+2DG (P<0,0001).

[152] На фиг.2D приведены показатели выживаемости клеток линии рака мочевого пузыря (T24) при обработке отдельно или в комбинации 4 мМ MET, 1 мМ 2DG и 1 мМ IP6. При обработке комбинированным составом выживаемость клеток была значительно ниже по сравнению с обработкой отдельным составом, в том числе контролем (P<0,0001). При сравнении результатов в группах, обработанных комбинациями, показатель выживаемости для комбинации MET+2DG+IP6 составил 26,42±4,8, что было значимо, в 2,4 раза, ниже показателя выживаемости клеток 63,30±4,2 для комбинации MET+2DG (P<0,0001).

[153] На фиг.2E приведены показатели выживаемости клеток линии глиобластомы (U-87 MG) при обработке отдельно или в комбинации 5 мМ MET, 0,4 мМ 2DG и 1 мМ IP6. При обработке комбинированным составом выживаемость клеток была значительно ниже по сравнению с обработкой отдельным составом, в том числе контролем (P<0,0001). При сравнении результатов в группах, обработанных комбинациями, показатель выживаемости для комбинации MET+2DG+IP6 составил 20,80±5,7, что было значимо, в 2,9 раза, ниже показателя выживаемости клеток 61,32±4,8 для комбинации MET+2DG (P<0,0001).

[154] На фиг.2F приведены показатели выживаемости клеток линии остеосаркомы (Saos-2) при обработке отдельно или в комбинации 5 мМ MET, 0,7 мМ 2DG и 1 мМ IP6. При обработке комбинированным составом выживаемость клеток была значительно ниже по сравнению с обработкой отдельным составом, в том числе контролем (P<0,0001). При сравнении результатов в группах, обработанных комбинациями, показатель выживаемости для комбинации MET+2DG+IP6 составил 24,52±5,7, что было значимо, в 2,6 раза, ниже показателя выживаемости клеток 64,33±4,9 для комбинации MET+2DG (P<0,0001).

[155] На основании указанных результатов было подтверждено, что тройной комплексный состав MET, 2DG и IP6 оказывал лучший эффект ингибирования пролиферации раковых клеток по сравнению с отдельными или двойными комплексными составами.

[156] Пример 1-2: Выживаемость клеток после введения PHE, 2DG и IP6 отдельно и в комбинации

[157] На фиг.3 и 4 приведены диаграммы исследования выживаемости клеток после введения PHE, 2DG и IP6, отдельно и в комбинации, на линиях раковых клеток человека, таких как рак печени (HepG2), рак легкого (A549), рак желудка (AGS), рак поджелудочной железы (PANC-1), рак толстой кишки (DLD-1), рак шейки матки (HeLa), рак молочной железы (MDA-MB- 231), рак предстательной железы (PC-3), рак яичника (SK-OV-3), рак мочевого пузыря (T24), глиобластома (U-87 MG) и остеосаркома (Saos-2).

[158] На фиг.3A приведены показатели выживаемости клеток линии рака печени (HepG2) при обработке отдельно или в комбинации 0,3 мМ PHE, 1 мМ 2DG и 1 мМ IP6. При обработке комбинированным составом выживаемость клеток была значительно ниже по сравнению с обработкой отдельным составом, в том числе контролем (P<0,0001). При сравнении результатов в группах, обработанных комбинациями, показатель выживаемости для комбинации PHE+2DG+IP6 составил 20,21±4,1, что было значимо, в 2,5 раза, ниже показателя выживаемости клеток 49,55±4,8 для комбинации PHE+2DG (P<0,0001).

[159] На фиг.3B приведены показатели выживаемости клеток линии рака легкого (A549) при обработке отдельно или в комбинации 0,3 мМ PHE, 1 мМ 2DG и 1 мМ IP6. При обработке комбинированным составом выживаемость клеток была значительно ниже по сравнению с обработкой отдельным составом, в том числе контролем (P<0,0001). При сравнении результатов в группах, обработанных комбинациями, показатель выживаемости для комбинации PHE+2DG+IP6 составил 22,41±5,2, что было значимо, в 2,4 раза, ниже показателя выживаемости клеток 54,77±5,8 для комбинации PHE+2DG (P<0,0001).

[160] На фиг.3C приведены показатели выживаемости клеток линии рака желудка (AGS) при обработке отдельно или в комбинации 0,3 мМ PHE, 0,7 мМ 2DG и 1 мМ IP6. При обработке комбинированным составом выживаемость клеток была значительно ниже по сравнению с обработкой отдельным составом, в том числе контролем (P<0,0001). При сравнении результатов в группах, обработанных комбинациями, показатель выживаемости для комбинации PHE+2DG+IP6 составил 17,38±3,8, что было значимо, в 2,9 раза, ниже показателя выживаемости клеток 50,45±3,9 для комбинации PHE+2DG (P<0,0001).

[161] На фиг.3D приведены показатели выживаемости клеток линии рака поджелудочной железы (PANC-1) при обработке отдельно или в комбинации 0,2 мМ PHE, 0,7 мМ 2DG и 1 мМ IP6. При обработке комбинированным составом выживаемость клеток была значительно ниже по сравнению с обработкой отдельным составом, в том числе контролем (P<0,0001). При сравнении результатов в группах, обработанных комбинациями, показатель выживаемости для комбинации PHE+2DG+IP6 составил 25,27±5,2, что было значимо, в 2,6 раза, ниже показателя выживаемости клеток 65,40±4,3 для комбинации PHE+2DG (P<0,0001).

[162] На фиг.3E приведены показатели выживаемости клеток линии рака толстой кишки (DLD-1) при обработке отдельно или в комбинации 0,3 мМ PHE, 0,4 мМ 2DG и 1 мМ IP6. При обработке комбинированным составом выживаемость клеток была значительно ниже по сравнению с обработкой отдельным составом, в том числе контролем (P<0,0001). При сравнении результатов в группах, обработанных комбинациями, показатель выживаемости для комбинации PHE+2DG+IP6 составил 22,21±4,8, что было значимо, в 2,7 раза, ниже показателя выживаемости клеток 60,98±4,7 для комбинации PHE+2DG (P<0,0001).

[163] На фиг.3F приведены показатели выживаемости клеток линии рака шейки матки (HeLa) при обработке отдельно или в комбинации 0,2 мМ PHE, 0,5 мМ 2DG и 1 мМ IP6. При обработке комбинированным составом выживаемость клеток была значительно ниже по сравнению с обработкой отдельным составом, в том числе контролем (P<0,0001). При сравнении результатов в группах, обработанных комбинациями, показатель выживаемости для комбинации PHE+2DG+IP6 составил 25,65±3,9, что было значимо, в 2,1 раза, ниже показателя выживаемости клеток 54,67±4,6 для комбинации PHE+2DG (P<0,0001).

[164] На фиг.4A приведены показатели выживаемости клеток линии рака молочной железы (MDA-MB-231) при обработке отдельно или в комбинации 0,2 мМ PHE, 1 мМ 2DG и 1 мМ IP6. При обработке комбинированным составом выживаемость клеток была значительно ниже по сравнению с обработкой отдельным составом, в том числе контролем (P<0,0001). При сравнении результатов в группах, обработанных комбинациями, показатель выживаемости для комбинации PHE+2DG+IP6 составил 20,76±4,2, что было значимо, в 2,3 раза, ниже показателя выживаемости клеток 48,54±4,5 для комбинации PHE+2DG (P<0,0001).

[165] На фиг.4B приведены показатели выживаемости клеток линии рака предстательной железы (PC-3) при обработке отдельно или в комбинации 0,3 мМ PHE, 1 мМ 2DG и 1 мМ IP6. При обработке комбинированным составом выживаемость клеток была значительно ниже по сравнению с обработкой отдельным составом, в том числе контролем (P<0,0001). При сравнении результатов в группах, обработанных комбинациями, показатель выживаемости для комбинации PHE+2DG+IP6 составил 20,77±4,3, что было значимо, в 2,9 раза, ниже показателя выживаемости клеток 59,66±4,6 для комбинации PHE+2DG (P<0,0001).

[166] На фиг.4C приведены показатели выживаемости клеток линии рака яичника (SK-OV-3) при обработке отдельно или в комбинации 0,4 мМ PHE, 0,5 мМ 2DG и 1 мМ IP6. При обработке комбинированным составом выживаемость клеток была значительно ниже по сравнению с обработкой отдельным составом, в том числе контролем (P<0,0001). При сравнении результатов в группах, обработанных комбинациями, показатель выживаемости для комбинации PHE+2DG+IP6 составил 20,44±4,2, что было значимо, в 3,0 раза, ниже показателя выживаемости клеток 60,54±5,1 для комбинации PHE+2DG (P<0,0001).

[167] На фиг.4D приведены показатели выживаемости клеток линии рака мочевого пузыря (T24) при обработке отдельно или в комбинации 0,4 мМ PHE, 1 мМ 2DG и 1 мМ IP6. При обработке комбинированным составом выживаемость клеток была значительно ниже по сравнению с обработкой отдельным составом, в том числе контролем (P<0,0001). При сравнении результатов в группах, обработанных комбинациями, показатель выживаемости для комбинации PHE+2DG+IP6 составил 21,45±4,2, что было значимо, в 2,7 раза, ниже показателя выживаемости клеток 58,70±4,5 для комбинации PHE+2DG (P<0,0001).

[168] На фиг.4E показана выживаемость линии клеток глиобластомы (U-87 MG) при обработке отдельно или в комбинации 0,2 мМ PHE, 0,4 мМ 2DG и 1 мМ IP6. При обработке комбинированным составом выживаемость клеток была значительно ниже по сравнению с обработкой отдельным составом, в том числе контролем (P<0,0001). При сравнении результатов в группах, обработанных комбинациями, показатель выживаемости для комбинации PHE+2DG+IP6 составил 15,76±4,2, что было значимо, в 3,4 раза, ниже показателя выживаемости клеток 54,32±4,8 для комбинации PHE+2DG (P<0,0001).

[169] На фиг.4F показана выживаемость линии клеток остеосаркомы (Saos-2) при обработке отдельно или в комбинации 0,2 мМ PHE, 0,7 мМ 2DG и 1 мМ IP6. При обработке комбинированным составом выживаемость клеток была значительно ниже по сравнению с обработкой отдельным составом, в том числе контролем (P<0,0001). При сравнении результатов в группах, обработанных комбинациями, показатель выживаемости для комбинации PHE+2DG+IP6 составил 22,76±4,2, что было значимо, в 2,7 раза, ниже показателя выживаемости клеток 61,93±4,7 для комбинации PHE+2DG (P<0,0001).

[170] На основании указанных результатов было подтверждено, что тройной комплексный состав PHE, 2DG и IP6, оказывал лучший эффект ингибирования клеточной пролиферации по сравнению с отдельным составом или двойным комплексным составом.

[171] Пример 2: Эффект комплексного состава MET, 2DG и IP6 на нормальные клетки

[172] Фиг.5 представляет собой диаграмму исследования цитотоксичности с помощью МТТ-теста через 48 часов после обработки тройным комбинированным составом клеток линий рака предстательной железы (PC-3), толстой кишки (DLD-1) и легкого (A549) в качестве опухолевых клеток, и клеток линий предстательной железы (PZ-HPV-7), толстой кишки (CCD-18Co) и легкого (MRC5) в качестве неопухолевых клеток, с целью изучения эффекта комплексного состава MET, 2DG и IP6 на нормальные клетки.

[173] В результате в клетках линий PC-3 и PZ-HPV-7, обработанных комплексным составом 5 мМ MET, 1 мМ 2DG и 1 мМ IP6, показатель выживаемости был значительно снижен у клеток линии PC-3, использованных в качестве опухолевых клеток, в то время как показатель выживаемости клеток PZ-HPV-7, использованных в качестве неопухолевых клеток, не изменялся (P<0,0001).

[174] В результате в клетках линий DLD-1 и CCD-18Co, обработанных комплексным составом 5 мМ MET, 0,4 мМ 2DG и 1 мМ IP6, показатель выживаемости был значительно снижен у клеток линии DLD-1, использованных в качестве опухолевых клеток, в то время как показатель выживаемости клеточной линии CCD-18Co, использованных в качестве неопухолевых клеток, не изменялся (P<0,0001).

[175] В результате в клетках линий A549 и MRC5, обработанных комплексным составом 4 мМ MET, 1 мМ 2DG и 1 мМ IP6, показатель выживаемости был значительно снижен у клеток линии A549, использованных в качестве опухолевых клеток, в то время как показатель выживаемости клеток линии MRC5, использованных в качестве неопухолевых клеток, не изменялся (P<0,0001).

[176] Паттерн апоптоза у неопухолевых клеток всех типов при обработке тройным комбинированным составом отличался от паттерна у опухолевых клеток, и было подтверждено, что указанный тройной комбинированный состав представляет собой безопасное лекарственное средство in vivo.

[177] Пример 3: Выживаемость клеток и экспрессия белка в клетках линии 4T1 при обработке отдельными и комплексными составами MET, 2DG и IP6

[178] В метаболизме живых клеток АТФ и АДФ используются в качестве источников энергии, и продуцируется АМФ. АМФ-активированная протеинкиназа (АМФК) - это серин-треониновая киназа, известная как регулятор обмена липидов и глюкозы и играющая важную регуляторную роль в развитии офтальмологических нарушений при диабете. АМФК активируется АМФ, ингибируя использование АТФ, при этом уровень АМФ возрастает при потреблении клеточной энергии и он играет ключевую роль в поддержании гомеостаза, индуцируя катаболизм. Активация АМФК ингибирует пролиферацию раковых клеток и ингибирует ацетил-CoA-карбоксилазу (ACC), фермент, который индуцирует синтез жирных кислот в контексте жирового обмена.

[179] На фиг.6A приведены показатели выживаемости клеток линии рака молочной железы, происходящих от мыши (4T1), при обработке отдельно или в комбинации 5 мМ MET, 2 мМ 2DG и 1 мМ IP6. При обработке комбинированным составом выживаемость клеток была значительно ниже по сравнению с обработкой отдельным составом, в том числе контролем (P<0,0001). При сравнении результатов в группах, обработанных комбинацией, выживаемость клеток в группе (MET+2DG+IP6) составила 23,04±4,0, что было значимо, в 2,2 раза, ниже показателя выживаемости клеток 50,03±4,0 в группе (MET+2DG) (P<0,0001).

[180] На фиг.6B и 6C показан значительный уровень активации АМФК (P<0,0001) и снижение фосфорилирования ACC (P<0,05) в группе (MET+2DG+IP6) по сравнению с группой (MET+2DG).

[181] Пример 4. Ингибирование синтеза АТФ отдельными и комплексными составами MET, 2DG и IP6 в клетках 4T1

[182] АТФ (аденозинтрифосфат) является источником энергии для живых организмов, и при ингибировании синтеза внутриклеточного АТФ наступает снижение активности метаболизма энергии. Ингибиторный эффект MET, 2DG и IP6 на синтез АТФ был подтвержден на линии клеток рака молочной железы 4Т1, происходящих от мыши, в примере 3.

[183] Каждую клетку (10³-10⁴ клеток) 4T1 инкубировали в течение 24 часов в чашке для культивирования размером 60 мм и обрабатывали отдельно или в комбинации 4 мМ MET, 1 мМ 2DG и 1 мМ IP6, и дополнительно инкубировали в течение 48 часов. Затем клетки собирали, подсчитывали, разводили в 100 мл культурального раствора RPMI, содержащего 10% ФБС по объему, и переносили во все лунки 96-луночного планшета. Добавляли по 100 мл аналитического буфера (реагент rL/L+восстанавливающий буфер) из набора для анализа АТФ Promega (G7572, Promega, Дарем, Северная Каролина, США) в лунки, содержащие клетки, и измеряли флуоресцентное излучение при длине волны 560 нм. Результаты представлены на фиг.7.

[184] Как показано на фиг.7, результаты тестирования показали, что при комбинированной обработке происходит ингибирование синтеза АТФ, в отличие от отдельной отдельным составом в клетках линии 4Т1, использованных для тестирования отдельной и комбинированной обработки (P<0,0001). Было обнаружено, что в группе MET+2DG+IP6 происходит значимое ингибирование синтеза АТФ по сравнению с группой MET+2DG (P<0,05). В результате, как можно видеть, комплексный состав MET+2DG+IP6 снижает уровень энергии наиболее эффективно в раковых клетках.

[185] Пример 5. Эффект отдельных и комплексных составов MET, 2DG и IP6 на изменение объема опухоли

[186] После того, как размер опухолевой ткани достигал примерно 100 мм³, проводили разделение на экспериментальные группы и начинали введение тестируемого вещества. Измерение объема опухолей проводили с трехдневными интервалами с даты начала введения тестируемого вещества. В результате тестирования, как показано на фиг.8, объемы опухолей в группах лечения отдельными и комбинированными составами были снижены по сравнению с контрольной группой, начиная с третьего дня введения тестируемого вещества. На 18-й день введения тестируемого вещества по сравнению с контрольной группой, объем опухолей в которой составлял 1486,8±67,0 мм³, объем опухолей в группах лечения отдельными составами был незначительно снижен, но значимых различий не наблюдалось: 1400,5±58,6 мм³ в группе MET, 1350,3±55,2 мм³ в группе 2DG, 1108,5±66,3 мм³ в группе IP6 и 1190,1±67,3 мм³ в группе Ins. Однако группа MET+2DG с объемом опухолей 820,1±67,0 мм³ продемонстрировала значимые различия, более высокие, чем в контрольной группе и группе, получавшей отдельный состав (P<0,0001). Для объема опухолей при лечении комплексным составом, 515,02±54,9 мм³ в группе MET+2DG+IP6 и 350,03±33,0 мм³ в группе MET+2DG+IP6+Ins, наблюдались значимые различия, более высокие, чем в группе MET+2DG (P<0,0001). Группа MET+2DG+IP6 и группа MET+2DG+Ins продемонстрировали значимое отличие от группы MET+2DG+IP6+Ins (P<0,05), а в группе MET+2DG+IP6+Ins наблюдалось наибольшее снижение размера опухолей и значительный ингибиторный эффект на рост опухоли (фиг.8).

[187] Пример 6. Эффект отдельных и комплексных составов MET, 2DG и IP6 на массу опухоли

[188] На 19 день введения тестируемого вещества опухоли извлекали, умерщвляя подопытных животных, и измеряли массу опухолей; результаты приведены на фиг.9. Масса опухоли в контрольной группе составляла 1,244±0,22 г, масса опухоли в группе МЕТ составляла 1,134±0,15 г, в группе 2DG - 1,092±0,18 г, в группе IP6 - 0,874±0,18 г, в группе Ins - 0,904±0,20 г, однако комплексный состав значительно снижал массу опухоли: 0,621±0,14 г в группе MET+2DG и 0,599±0,12 г в группе IP6+Ins (P<0,0001). Кроме того, масса опухоли 0,342±0,11 г в группе MET+2DG+IP6 и 0,203±0,06 г в группе MET+2DG+IP6+Ins указывает на значимые различия, более высокие, чем в контрольной группе и группе лечения отдельными составами (P<0,0001), а также значимые различия относительно группы MET+2DG, где лечение проводили двойным комплексным составом (P<0,01). Наблюдалось также значимое отличие от группы MET+2DG+IP6 и группы MET+2DG+IP6+Ins (P<0,05), и в целом в группе MET+2DG+IP6+Ins наблюдалось наибольшее снижение размеров опухолей (фиг.9).

[189] Пример 7. Эффект на массу тела подопытных животных

[190] Массу тела подопытных животных измеряли каждые шесть дней на протяжении периода тестирования. Значительных отличий в показателях потери массы тела между группой лечения отдельными составами и комплексными составами на шестой день введения тестируемого вещества не наблюдалось. В конце тестирования, на 18 день от начала введения тестируемого вещества, не наблюдалось значимых различий в потере массы тела между группами: 22,90±0,41 г в группе MET+2DG, 22,90±0,47 г в группе MET+2DG+IP6 и 22,90±0,50 г в группе MET+2DG+IP6+Ins по сравнению с 23,34±0,52 г в контрольной группе (фиг.10).

[191] Пример 8. Эффект отдельных и комплексных составов MET, 2DG и IP6 на частоту встречаемости метастазов в легких

[192] В модели опухоли на животных наблюдалось метастазирование опухолевых клеток в легкие. Для изучения эффекта тестируемого вещества на метастазирование исследовали частоту встречаемости метастазов, показанную на фиг.11. Частота встречаемости метастазов в легкие составила 100% (10 из 10) в контрольной группе, группах MET и группах 2DG, но частота возникновения метастазов в легкие снижалась до 90% (9 из 10) в группе IP6, до 90% (9 из 10) в группе Ins, до 80% (8 из 10) в группе MET+2DG, до 80% (8 из 10) в группе IP6+Ins, до 30% (3 из 10) в группе MET+2DG+IP6, до 30% (3 из 10) в группе MET+2DG+Ins и до 20% (2 из 10) в группе MET+2DG+IP6+Ins. Частота встречаемости метастазов в легкие в группе лечения MET+2DG+IP6+Ins свидетельствует о наибольшем ингибировании из всех экспериментальных групп (фиг.11).

[193] Пример 9. Эффект на гистоморфологическое изменение опухолевой ткани

[194] На фиг.12 представлены результаты микроскопического исследования после окрашивания гематоксилином и эозином для исследования гистоморфологических изменений в опухолевой ткани, вызванных тестируемым веществом. Внешняя периферическая область контрольной опухолевой ткани состояла из плотного слоя клеток 4T1, в центре определялся коагуляционный некроз. В группе MET+2DG и в группе IP6+Ins область коагуляционного некроза в центре опухолевой ткани была больше по сравнению с контрольной группой, а в группе MET+2DG+IP6, группе MET+2DG+Ins и группе MET+2DG+IP6+Ins доля нормальных клеток 4T1 была значительно снижена (фиг.12).

Группа изобретений относится к лечению рака. Раскрыто применение комбинации, содержащей: метформин или фенформин или их фармацевтически приемлемую соль; 2-дезокси-D-глюкозу; гексафосфат инозитола или его фармацевтически приемлемую соль, инозитол или их смесь, для получения медикамента для лечения рака, при этом массовое отношение метформин или его фармацевтически приемлемая соль : 2-дезокси-D-глюкоза : гексафосфат инозитола или его фармацевтически приемлемая соль или инозитол составляет от 1:0,2:0,5 до 1:5:20, фенформин или его фармацевтически приемлемая соль : 2-дезокси-D-глюкоза : гексафосфат инозитола или его фармацевтически приемлемая соль или инозитол - от 1:1:1 до 1:50:200, метформин или его фармацевтически приемлемая соль : 2-дезокси-D-глюкоза : гексафосфат инозитола или его фармацевтически приемлемая соль : инозитол - от 1:0,2:0,5:0,5 до 1:5:20:20, или фенформин или его фармацевтически приемлемая соль : 2-дезокси-D-глюкоза : гексафосфат инозитола или его фармацевтически приемлемая соль : инозитол - от 1:1:1:1 до 1:50:200:200. Также раскрыты способ лечения рака, применение для лечения рака фармацевтической композиции, комбинация для лечения рака. Группа изобретений обеспечивает синергический противораковый эффект. 4 н. и 8 з.п. ф-лы, 12 ил., 9 пр.

1. Применение комбинации, содержащей: (1) соединение на основе бигуанида или его фармацевтически приемлемую соль;

(2) 2-дезокси-D-глюкозу; и

(3) гексафосфат инозитола или его фармацевтически приемлемую соль, инозитол или их смесь, для получения медикамента для лечения рака,

где указанное соединение на основе бигуанида представляет собой метформин или фенформин, и

при этом массовое отношение метформин или его фармацевтически приемлемая соль : 2-дезокси-D-глюкоза : гексафосфат инозитола или его фармацевтически приемлемая соль или инозитол находится в диапазоне от 1:0,2:0,5 до 1:5:20,

при этом массовое отношение фенформин или его фармацевтически приемлемая соль : 2-дезокси-D-глюкоза : гексафосфат инозитола или его фармацевтически приемлемая соль или инозитол находится в диапазоне от 1:1:1 до 1:50:200,

при этом массовое отношение метформин или его фармацевтически приемлемая соль : 2-дезокси-D-глюкоза : гексафосфат инозитола или его фармацевтически приемлемая соль : инозитол находится в диапазоне от 1:0,2:0,5:0,5 до 1:5:20:20, или

при этом массовое отношение фенформин или его фармацевтически приемлемая соль : 2-дезокси-D-глюкоза : гексафосфат инозитола или его фармацевтически приемлемая соль : инозитол находится в диапазоне от 1:1:1:1 до 1:50:200:200.

2. Применение по п. 1, отличающееся тем, что инозитол представляет собой по меньшей мере один, выбранный из группы, состоящей из D-хиро-инозитола, L-хиро-инозитола, мио-инозитола и сцилло-инозитола.

3. Применение по п. 1, отличающееся тем, что указанное соединение на основе бигуанида представляет собой метформин и массовое отношение метформин или его фармацевтически приемлемая соль : 2-дезокси-D-глюкоза : гексафосфат инозитола или его фармацевтически приемлемая соль находится в диапазоне от 1:0,2:0,5 до 1:5:20.

4. Применение по п. 1, отличающееся тем, что указанное соединение на основе бигуанида представляет собой фенформин и массовое отношение фенформин или его фармацевтически приемлемая соль : 2-дезокси-D-глюкоза : гексафосфат инозитола или его фармацевтически приемлемая соль находится в диапазоне от 1:1:1 до 1:50:200.

5. Применение по п. 1, отличающееся тем, что указанное соединение на основе бигуанида представляет собой метформин и массовое отношение метформин или его фармацевтически приемлемая соль : 2-дезокси-D-глюкоза : инозитол находится в диапазоне от 1:0,2:0,5 до 1:5:20.

6. Применение по п. 1, отличающееся тем, что указанное соединение на основе бигуанида представляет собой фенформин и массовое отношение фенформин или его фармацевтически приемлемая соль : 2-дезокси-D-глюкоза : инозитол находится в диапазоне от 1:1:1 до 1:50:200.

7. Применение по п. 1, отличающееся тем, что указанный рак представляет собой по меньшей мере один, выбранный из группы, состоящей из рака печени, рака легкого, рака желудка, рака поджелудочной железы, рака толстой кишки, рака шейки матки, рака молочной железы, рака предстательной железы, рака яичника, рака головного мозга, остеосаркомы и рака мочевого пузыря.

8. Способ лечения рака, включающий введение терапевтически эффективного количества: (1) соединения на основе бигуанида или его фармацевтически приемлемой соли; (2) 2-дезокси-D-глюкозы и (3) гексафосфата инозитола или его фармацевтически приемлемой соли, инозитола или их смеси нуждающемуся в указанном лечении субъекту,

где указанное соединение на основе бигуанида представляет собой метформин или фенформин, и

при этом массовое отношение метформин или его фармацевтически приемлемая соль : 2-дезокси-D-глюкоза : гексафосфат инозитола или его фармацевтически приемлемая соль или инозитол находится в диапазоне от 1:0,2:0,5 до 1:5:20,

при этом массовое отношение фенформин или его фармацевтически приемлемая соль : 2-дезокси-D-глюкоза : гексафосфат инозитола или его фармацевтически приемлемая соль или инозитол находится в диапазоне от 1:1:1 до 1:50:200,

при этом массовое отношение метформин или его фармацевтически приемлемая соль : 2-дезокси-D-глюкоза : гексафосфат инозитола или его фармацевтически приемлемая соль : инозитол находится в диапазоне от 1:0,2:0,5:0,5 до 1:5:20:20, или

при этом массовое отношение фенформин или его фармацевтически приемлемая соль : 2-дезокси-D-глюкоза : гексафосфат инозитола или его фармацевтически приемлемая соль : инозитол находится в диапазоне от 1:1:1:1 до 1:50:200:200.

9. Способ по п. 8, отличающийся тем, что указанный рак представляет собой по меньшей мере один, выбранный из группы, состоящей из рака печени, рака легкого, рака желудка, рака поджелудочной железы, рака толстой кишки, рака шейки матки, рака молочной железы, рака предстательной железы, рака яичника, рака головного мозга, остеосаркомы и рака мочевого пузыря.

10. Применение для лечения рака фармацевтической композиции, содержащей: (1) соединение на основе бигуанида или его фармацевтически приемлемую соль; (2) 2-дезокси-D-глюкозу; и (3) гексафосфат инозитола или его фармацевтически приемлемую соль, инозитол или их смесь,

где указанное соединение на основе бигуанида представляет собой метформин или фенформин, и

при этом массовое отношение метформин или его фармацевтически приемлемая соль : 2-дезокси-D- глюкоза : гексафосфат инозитола или его фармацевтически приемлемая соль или инозитол находится в диапазоне от 1:0,2:0,5 до 1:5:20,

при этом массовое отношение фенформин или его фармацевтически приемлемая соль : 2-дезокси-D-глюкоза : гексафосфат инозитола или его фармацевтически приемлемая соль или инозитол находится в диапазоне от 1:1:1 до 1:50:200,

при этом массовое отношение метформин или его фармацевтически приемлемая соль : 2-дезокси-D-глюкоза : гексафосфат инозитола или его фармацевтически приемлемая соль : инозитол находится в диапазоне от 1:0,2:0,5:0,5 до 1:5:20:20, или

при этом массовое отношение фенформин или его фармацевтически приемлемая соль : 2-дезокси-D-глюкоза : гексафосфат инозитола или его фармацевтически приемлемая соль : инозитол находится в диапазоне от 1:1:1:1 до 1:50:200:200.

11. Применение по п. 10, отличающееся тем, что указанный рак представляет собой по меньшей мере один, выбранный из группы, состоящей из рака печени, рака легкого, рака желудка, рака поджелудочной железы, рака толстой кишки, рака шейки матки, рака молочной железы, рака предстательной железы, рака яичника, рака головного мозга, остеосаркомы и рака мочевого пузыря.

12. Комбинация для лечения рака, содержащая (1) соединение на основе бигуанида или его фармацевтически приемлемую соль; (2) 2-дезокси-D-глюкозу; и (3) гексафосфат инозитола или его фармацевтически приемлемую соль, инозитол или их смесь,

где указанное соединение на основе бигуанида представляет собой метформин или фенформин, и

при этом массовое отношение метформин или его фармацевтически приемлемая соль : 2-дезокси-D- глюкоза : гексафосфат инозитола или его фармацевтически приемлемая соль или инозитол находится в диапазоне от 1:0,2:0,5 до 1:5:20,

при этом массовое отношение фенформин или его фармацевтически приемлемая соль : 2-дезокси-D-глюкоза : гексафосфат инозитола или его фармацевтически приемлемая соль или инозитол находится в диапазоне от 1:1:1 до 1:50:200,

при этом массовое отношение метформин или его фармацевтически приемлемая соль : 2-дезокси-D-глюкоза : гексафосфат инозитола или его фармацевтически приемлемая соль : инозитол находится в диапазоне от 1:0,2:0,5:0,5 до 1 5:20:20, или

при этом массовое отношение фенформин или его фармацевтически приемлемая соль : 2-дезокси-D-глюкоза : гексафосфат инозитола или его фармацевтически приемлемая соль : инозитол находится в диапазоне от 1:1:1:1 до 1:50:200:200.