Способ стимуляции роста мицелия грибов базидиомицетов Российский патент 2023 года по МПК C12N1/14 A01G18/00 C01B32/156 B82Y5/00 

Изобретение относится к микологии, биотехнологии и грибоводству, а именно - к технологиям выращивания грибов в искусственных условиях, и может быть использовано при проведении исследований в области биохимии, медицины и пищевой промышленности, а также в технологиях производства пищевых и кормовых продуктов, лечебных препаратов и биологически активных добавок на основе биомассы грибов базидиомицетов.

Ксилотрофные базидиомицеты - дереворазрушающие грибы с макроскопическими размерами плодовых тел - известны как продуценты веществ, обладающих широким спектром биологической активности. Продукты метаболизма базидиомицетов обладают антимикробными, адаптогенными, иммуностимулирующими, седативными свойствами, используются для получения гипотензивных, капилляроукрепляющих, противоязвенных, противораковых средств [Г.В. Ильина, Д.Ю. Ильин «Ксилотрофные базидиомицеты в чистой культуре: монография», Пенза: РИО ПГСХА, 2013 - 222 с.]. Ксилотрофные базидиомицеты являются источником пищевых белков, ферментов и других биологически активных соединений, которые служат основой для разработки лекарственных препаратов и биологически активных профилактических добавок. Многие представители этой группы пригодны к культивированию в искусственных условиях, поэтому поиск агентов, стимулирующих рост мицелия базидиомицетов, привлекает внимание исследователей.

В качестве стимуляторов роста грибов, относящихся к базидиомицетам, предложено большое количество препаратов химического, микробиологического и природного происхождения: гуматы натрия и калия [RU 2007111594 А, опубл. 10.10.2008], водные экстракты торфа, содержащие гуматы [RU 2679716 С1, опубл. 12.02.2019], пиролиновая кислота - отход производства древесного угля [JPH 04134010 (А), опубл. 07.05.1992], водные экстракты соевых бобов [JPH 06178616 (А), опубл. 28.06.1994], селен-содержащие препараты, такие, как селенат натрия [RU 2136141 С1, опубл. 10.09.1999] и диацетофенонилселенид [RU 2263441 С1, опубл. 10.11.2005], пробиотик Bacillus subtilis [RU 2555145 С1, опубл. 10.01.2015], суспензия бактерий Azospirillum [RU 2249614 С2, опубл. 10.04.2005], смесь продуктов ферментации мицелия Stropharia rugosoannulata, Aspergillus oryzae, Bacillus cereus, Clostridium butyricum [CN 112021076 (А), опубл. 04.12.2020], эпибрассинолид (эпин), [RU 2160000 C1, опубл. 10.12.2000], арахидоновая кислота [RU 2430155 С1 опубл. 27.09.2011], иммуноцитофит - препарат на основе этилового эфира арахидоновой кислоты [RU 2183056 С2 опубл. 10.06.2002] и др.

В последнее время внимание исследователей привлекает применение в биотехнологических процессах наноструктурированных агентов, которые могут проявлять неожиданные эффекты в отношении биологических объектов. В работе [Tsivileva О.М., Perfileva АЛ., Ivanova А.А., Pozdnyakov A.S., Prozorova G.F. "The effect of selenium- or metal-nanoparticles incorporated nanocomposites of vinyl triazole based polymers on fungal growth and bactericidal properties" // Journal of Polymers and the Environment. 2021. V. 29. No. 4. P. 1287-1297] описан взятый нами за прототип, способ получения мицелия грибов-базидиомицетов, включающий приготовление мицелиальной биомассы на жидкой питательной среде с глюкозой и дрожжевым экстрактом в присутствии стимулятора роста, в качестве которого используют полимерные нанокомпозитные материалы, содержащие наночастицы селена, серебра или золота, включенные в матрицу 1-винил-1,2,4-триазола или его сополимера с N-винилпирролидоном. На девяти культурах базидиомицетов показано, что нанокомпозитные элементосодержащие добавки в концентрации в питательной среде 1×10^-4 М (в пересчете на селен или металл) в большей или меньшей степени оказывают стимулирующее действие на скорость накопления мицелиальной биомассы, при этом наибольшую активность проявляют селен-содержащие соединения. Однако учитывая сравнительно высокое содержание в питательной среде полимерного нанокомпозитного элементосодержащего биостимулятора, включенного в матрицу полимера химического происхождения, вопрос о пищевой безопасности получаемого таким способом продукта, остается открытым.

Альтернативный подход к применению наноструктурированных биостимуляторов роста мицелиальной биомассы грибов базидиомицетов связан с использованием соединений, содержащих фуллереновую структуру. Фуллерены - углеродные наноматериалы со сферической псевдоароматической структурой, находят применение в различных областях, в том числе, в биологии и медицине. Хорошо известны антиоксидантные свойства фуллеренов и их производных, их способность взаимодействовать с белками и нуклеиновыми кислотами, проявлять антибактериальное и противовирусное действие [Думпис М.А., Николаев Д.Н., Литасова Е.В., и др. «Биологическая активность фуллеренов - реалии и перспективы // Обзоры по клинической фармакологии и лекарственной терапии» 2018. Т. 16. №1. С. 4-20. doi: 10.17816/RCF1614-2]. Наличие фуллеренового остова в молекулярной структуре компонентов в составе биологически активных препаратов может влиять на физико-химические свойства биологических мембран, повышая устойчивость организмов к окислительному стрессу и, в конечном итоге, способствуя повышению их биопродуктивности.

Создание биопрепаратов на основе фуллеренов затруднено чрезвычайно низкой растворимостью фуллеренсодержащих соединений в воде. Решение этой проблемы связано с получением водорастворимых форм, в частности, функционализированных фуллеренов, характеризующихся приемлемой растворимостью в воде. Например, в работе [Панова Г.Г., Канаш Е.В. и др. Производные фуллерена стимулируют продукционный процесс, рост и устойчивость к окислительному стрессу у растений пшеницы и ячменя // Сельскохозяйственная биология. 2018. Т. 53, №1. С. 38-49] показано, что добавление в питательный раствор водорастворимых аминокислотных производных фуллерена-С₆₀, включающих L-лизин, L-треонин, L-аргинин и L-гидроксипролин, способствует увеличению сухой растительной массы яровой пшеницы. В изобретении [US 9399756 В2, опубл. 26.07.2016] описано применение водорастворимого полигидроксифуллерена (ПГФ, фуллеренол) в качестве добавки в питательную среду для стимулирования роста биомассы микроводоросли Pseudokirchneriella subcapitata и плесневого гриба Aspergillus niger, а также в качестве стимулятора скорости размножения дафнии Ceriodaphnia dubia. Однако, как отмечается в упомянутом обзоре [Думпис М.А. и др., 2018], при получении фуллеренолов различными методами образуются сложные смеси продуктов с нечетко определенной структурой, отличающихся по растворимости и биологическим эффектам, что является причиной плохой воспроизводимости данных, полученных с использованием ПГФ.

Проблема, решаемая настоящим изобретением, состоит в разработке способа стимуляции роста мицелия базидиальных грибов, основанного на использовании водорастворимых форм наноструктурированных фуллерен С₆₀-содержащих соединений.

Проблема решена предлагаемым способом стимуляции роста мицелия грибов-базидиомицетов на питательной среде, содержащей наноструктурированный стимулятор роста, отличающимся тем, что в качестве наноструктурированного стимулятора роста используют фуллерен С₆₀ или его аминокислотные производные в форме водных коллоидных растворов.

В качестве аминокислотных производных фуллерена С₆₀ могут быть использованы калиевые соли N-(моногидрофуллеренил)-D-аланина, или N-(моногидрофуллеренил)-D-валина, или N-(моногидрофуллеренил)-ε-аминокапроновой кислоты.

Технический результат состоит в ускорении процесса наращивания биомассы мицелия грибов базидиомицетов в присутствии в питательной среде добавок фуллерен С₆₀-содержащих соединений.

В основе настоящего изобретения лежат результаты проведенных авторами исследований, которые показали, что водные коллоидные растворы (водные дисперсии) фуллерена С₆₀ и его производных при добавлении в питательную среду проявляют ростостимулирующую активность в отношении мицелия грибов базидиомицетов. Было показано, что водные дисперсии фуллерена С₆₀ и калиевые соли аминокислотных производных фуллерена С₆₀, таких, как N-(моногидрофуллеренил)-D-аланин (Н-С₆₀-NH-СН(СН₃)-COOK), N-(моногидрофуллеренил)-D-валин (H-C₆₀-NH-CH(CH(CH₃)₂)-COOK), N-(моногидрофуллеренил)-ε-аминокапроновая кислота (H-C₆₀-NH-(CH₂)₅-COOK), проявляют ростостимулирующую активность в отношении грибов базидиомицетов при концентрации фуллеренсодержащего соединения в питательной среде в диапазоне от 1×10^-6 до 1×10^-14 моль/л. Очевидно, что аналогичную биологическую активность будут проявлять и другие водорастворимые аминокислотные производные фуллерена С₆₀, поскольку, как было показано авторами, эффект стимуляции роста связан с антиоксидантными свойствами фуллеренов и, возможно, с их способностью модифицировать физико-химические свойства биомембран.

Коллоидные растворы фуллерена С₆₀ получают ультразвуковой обработкой (42 кГц, 50 Вт) насыщенного раствора фуллерена С₆₀ (99,9%, фирма-производитель "Acros Organics") в толуоле в присутствии воды по методике, описанной в работе [Andrievsky G.V., Kosevich M.V., Vovk О.М., Shelkovsky V.S., Vashcenko L.A. "On the production of an aqueous colloidal solution of fullerenes". J. Chem. Soc. Chem. Commun, 1995; 12, p.p. 1281-1282]. Аминокислотные производные фуллерена С₆₀ в виде водных коллоидных растворов получают, как описано в работе [V.S. Romanova, V.A. Tsyryapkin, Yu.I. Lyakhovetsky, Z.N. Parnes, M.E. Vol'pin. "Addition of amino acids and dipeptides to fullerene C60 giving rise to monoadducts". Russian Chemical Bulletin, 1994, No. 6, p.p. 1090-1091] путем одностадийного синтеза смешением толуольного раствора фуллерена С₆₀ с водными растворами аминокислот с последующей обработкой ультразвуком при температуре 60°С в течение 6-8 часов при постоянном перемешивании. Затем растворители отгоняют, полученный остаток обрабатывают насыщенным раствором KCl, после чего производят диализ.

Полученные коллоидные растворы содержат фуллерен С₆₀ и его аминокислотные производные в концентрации от 10^-4 до 10^-2 М. Перед приготовлением питательных сред, содержащих добавки фуллеренсодержащего ростостимулятора, содержание активного вещества в водном коллоидном растворе определяют гравиметрическим методом путем испарения воды до постоянной массы сухого остатка.

Антиоксидантные свойства и наноразмерная структура частиц получаемых коллоидных растворов показаны в работе [V.A. Volkov, М.V. Voronkov, N.N. Sazhina, D.V. Kurilov, D.V. Vokhmyanina, О.V. Yamskova, Yu.Ts. Martirosyan, D.L. Atroshenko, L.Yu. Martirosyan & V.S. Romanova "Mechanism of the Antioxidant Activity and Structure-Activity Relationship of N-Monosubstituted Amino Acid Derivatives of Fullerene C60" //Kinetics and Catalysis, 2021, V. 62, p.395-403. DOI: 10.1134/S0023158421030095]. Их растворимость в воде, по-видимому, достигается путем самосборки молекул в наноагрегаты с расположением гидрофильных аминокислотных остатков на поверхности и гидрофобного кора фуллерена С₆₀ внутри наночастиц. Методом люминесцентных зондов было показано, что N-монозамещенные аминокислотные прозводные фуллерена С₆₀ способны проникать через липидный бислой клеточных мембран [R.A. Kotelnikova, A.I. Kotelnikov, G.N. Bogdanov, V.S. Romanova, E.F. Kuleshova, Z.N. Parnes, M.E. Vol'pin "Membranotropic properties of water soluble amino acid and peptide derivatives of fullerene[60]" // FEBS Letters, 1996, 389, 111-114]. В отношении гидратированного фуллерена С₆₀, полученного, как описано выше, путем замещения растворителя, показано, что он способен обратимо связываться с модельными фосфатидилхолиновыми мембранами, повышая их проводимость [Prylutska S. V., Matyshevska О.P., Grynyuk I.I., Prylutskyy Y.I., Ritter U., Scharff P. "Biological Effects of C60 Fullerenesin vitroand in a Model System" // Molecular Crystals and Liquid Crystals. 2007., V. 468, №1, pp. 265/[617]-274/[626]].

Возможность осуществления изобретения продемонстрирована на примерах выращивания грибов базидиомецитов Flammulina velutipes (опенок зимний), Laetiporus sulphureus (трутовик серно-желтый) и Ganoderma applanatum (трутовик плоский). Культуры грибов выращивают на чашках Петри с агаризованным пивным суслом (3-4 градуса по Баллингу), рН 6-6,5, температура 26°С. После полного зарастания чашек Петри блоки агаризованной среды с культурой используют в качестве инокулята жидкой питательной среды.

Глубинное культивирование и подготовка проб для определения сухой массы мицелия выполняют в соответствии с рекомендациями [Методы экспериментальной микологии / Под ред. В.И. Билай. - Киев: Наукова думка, 1982. - 550 с.]. Глубинное культивирование грибов проводят на водной питательной среде, содержащей источник углерода, например, D-глюкозу, или L-арабинозу, или D-галактозу, или D-лактозу в концентрации 10-22 г/л, источник азота, например, дрожжевой экстракт, или глицин, или аспарагин в концентрации 1,0-1,7 г/л, и стимулятор роста - фуллеренсодержащее соединение в концентрации в диапазоне 1×10^-14-1×10^-6 моль/л. (7,2×10^-12-8,9×10^-4 г/л). В контрольных опытах в среду для культивирования вместо раствора фуллеренсодержащего соединения вводят соответствующий объем растворителя (водный 50%-ный этанол). Культивирование проводят при температуре 25-28°С в течение 15-18 суток. Культуральную жидкость отделяют от погруженного мицелия фильтрованием. Мицелий промывают дистиллированной водой и высушивают до постоянной массы при температуре 40°С. Накопление биомассы оценивают по воздушно-сухой массе отфильтрованного от культуральной жидкости мицелия.

Водные коллоидные растворы фуллерена С₆₀ или его N-монозамещенных аминокислотных производных добавляют в количестве 1% от объема питательной среды. Исходные коллоидные растворы фуллерена С₆₀, калиевой соли N-(моногидрофуллеренил)-D-аланина, калиевой соли N-(моногидрофуллеренил)-D-валина, калиевой соли N-(моногидрофуллеренил)-ε-аминокапроновой кислоты разбавляют до концентрации 1×10^-4 М смесью воды и этанола таким образом, чтобы объемное соотношение воды и этанола в растворе составляло 1:1. Последующие разведения получают добавлением 50%-ного водного этанола. В контрольных опытах (отсутствие ростостимулирующей добавки в среде выращивания) в среду вводят 1% (v/v) 50%-ного водного этанола.

Конкретные примеры осуществления изобретения, не исчерпывающие всех вариантов, подпадающих под формулу изобретения, показаны в Таблице.

Как видно из приведенных примеров, фуллерен С₆₀ в гидратированной форме и его водорастворимые аминокислотные производные в концентрациях в диапазоне от 1×10^-14 до 1×10^-6 моль/л проявляют ростостимулирующую активность в отношении роста мицелия грибов базидиомицетов. Наибольшую чувствительность к добавкам фуллеренсодержащих соединений проявляет гриб Laetiporus sulphureus (трутовик серно-желтый), для которого в присутствии в питательной среде добавки фуллерена или его аминокислотных производных в концентрации 1×10^-7-1×10^-14 моль/л увеличение мицелиальной биомассы в сравнении с контролем достигает 100 и более процентов.

Изобретение относится к микологии и биотехнологии. Предложен способ стимуляции роста мицелия грибов базидиомицетов, включающий использование наноструктурированного стимулятора роста, в качестве которого используют фуллерен С₆₀ или его аминокислотные производные в форме водных коллоидных растворов при концентрации в питательной среде 1×10^-14-1×10^-6 моль/л. Изобретение обеспечивает увеличение выхода мицелиальной биомассы при выращивании грибов базидиомицетов в искусственных условиях. 3 з.п. ф-лы, 1 табл.

1. Способ стимуляции роста мицелия грибов-базидиомицетов на питательной среде, содержащей наноструктурированный стимулятор роста, отличающийся тем, что в качестве наноструктурированного стимулятора роста используют фуллерен С₆₀ или его аминокислотные производные в форме водных коллоидных растворов при концентрации стимулятора в питательной среде от 1×10^-14 до 1×10^-6 моль/л.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве аминокислотного производного фуллерена С₆₀ используют калиевую соль N-(моногидрофуллеренил)-D-аланина.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве аминокислотного производного фуллерена С₆₀ используют калиевую соль N-(моногидрофуллеренил)-D-валина.

4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве аминокислотного производного фуллерена С₆₀ используют калиевую соль N-(моногидрофуллеренил)-ε-аминокапроновой кислоты.