Способ получения продуктов с антибактериальной активностью из мицелия базидиомицетов Российский патент 2023 года по МПК C12N1/14 C01B32/156 B82B1/00 

Изобретение относится к области биотехнологий, а именно к технологиям выращивания грибов в искусственных условиях, и может быть использовано для получения биологически активных препаратов, обладающих антибактериальной активностью.

Ксилотрофные базидиомицеты известны как продуценты веществ, характеризующиеся широким спектром биологической активности. Продукты метаболизма базидиомицетов обладают антимикробными, адаптогенными, иммуностимулирующими, седативными свойствами, используются для получения гипотензивных, капилляроукрепляющих, противоязвенных, противораковых средств [Г.В. Ильина, Д.Ю. Ильин «Ксилотрофные базидиомицеты в чистой культуре: монография», Пенза: РИО ПГСХА, 2013, 222 с.]. Некоторые представители базидиальных грибов имеют в своем составе антибиотические вещества, которые обладают высокой активностью против различных микроорганизмов, однако, как отмечается в работе [Сакович В.В. Жерносеков Д.Д. «Базидиомицеты как источники биологически активных веществ» Вестник Полесского государственного университета. Серия природоведческих наук. 2018, №1, с. 3-13], во многих случаях биохимические механизмы этой терапевтической активности все еще остаются в значительной степени неизвестными.

Многие представители этого класса пригодны к культивированию в искусственных условиях, поэтому поиск агентов, стимулирующих биосинтез биологически активных веществ, привлекает все большее внимание исследователей. Предложено большое количество стимуляторов роста грибов базидиомицетов, среди которых препараты химического, микробиологического и природного происхождения: гуматы натрия и калия [RU 2007111594 А, опубл. 10.10.2008], водные экстракты торфа, содержащие гуматы [RU 2679716 С1, опубл. 12.02.2019], пиролиновая кислота - отход производства древесного угля [JPH 04134010 (А), опубл. 07.05.1992], водные экстракты соевых бобов [JPH 06178616 (А), опубл. 28.06.1994], селенсодержащие препараты, такие, как селенат натрия [RU 2136141 С1, опубл. 10.09.1999] и диацетофенонилселенид [RU 2263441 С1, опубл. 10.11.2005], пробиотик Bacillus subtilis [RU 2555145 С1, опубл. 10.01.2015], суспензия бактерий Azospirillum [RU 2249614 С2, опубл. 10.04.2005], смесь продуктов ферментации мицелия Stropharia rugosoannulata, Aspergillus oryzae, Bacillus cereus, Clostridium butyricum [CN 112021076 (А), опубл. 04.12.2020], эпибрассинолид (эпин), [RU 2160000 C1, опубл. 10.12.2000], арахидоновая кислота [RU 2430155 С1 опубл. 27.09.2011], иммуноцитофит - препарат на основе этилового эфира арахидоновой кислоты [RU 2183056 С2 опубл. 10.06.2002] и др. Однако нет сведений о том, что эти препараты стимулируют образование продуктов метаболизма, обладающих антибактериальными свойствами.

В последнее время внимание исследователей привлекает применение в биотехнологических процессах наноструктурированных агентов, которые могут проявлять неожиданные эффекты в отношении биологических объектов. В работе [Tsivileva О.М., Perfileva A.I., Ivanova А.А., Pozdnyakov A.S., Prozorova G.F. "The effect of selenium- or metal-nanoparticles incorporated nanocomposites of vinyl triazole based polymers on fungal growth and bactericidal properties" Journal of Polymers and the Environment. 2021. V. 29. No. 4. P. 1287-1297] описан взятый нами за прототип способ получения продукта, проявляющего антибактериальную активность. Способ включает выращивание погруженным методом мицелиальной биомассы на жидкой питательной среде с глюкозой и дрожжевым экстрактом в присутствии полимерного нанокомпозитного стимулятора, содержащего наночастицы селена, серебра или золота, включенные в матрицу 1-винил-1,2,4-триазола или его сополимера с N-винилпирролидоном. Продукт, обладающий антибактериальными свойствами, получают путем упаривания фильтрата культуральной жидкости. Недостатком способа является трудоемкость получения стимулятора, представляющего собой селен-, серебро-, или золото-содержащие нанокомпозиты в матрице гомо- и сополимера винилтриазола.

Альтернативный подход к применению наноструктурированных биостимуляторов при выращивании грибов базидиомицетов связан с использованием соединений, содержащих фуллереновую структуру. Фуллерены - углеродные наноматериалы со сферической псевдоароматической структурой - находят применение в различных областях, в том числе в биологии и медицине. Хорошо известны антиоксидантные свойства фуллеренов и их производных, их способность взаимодействовать с белками и нуклеиновыми кислотами, проявлять антибактериальное и противовирусное действие [Думпис М.А., Николаев Д.Н., Литасова Е.В., и др. «Биологическая активность фуллеренов - реалии и перспективы // Обзоры по клинической фармакологии и лекарственной терапии» 2018. Т. 16. №1. с. с. 4-20. doi: 10.17816/RCF1614-2]. Наличие фуллеренового остова в молекулярной структуре компонентов в составе биологически активных препаратов может влиять на физико-химические свойства биологических мембран, повышая устойчивость организмов к окислительному стрессу, и способствовать повышению их биопродуктивности, а также биосинтезу продуктов с антибактериальной активностью, аналогично эффекту, описанному в способе, принятом за прототип.

Применение фуллеренсодержащих соединений в биохимических процессах затруднено их чрезвычайно низкой растворимостью в воде. Решение этой проблемы связано с получением водорастворимых (гидратированных) форм, в частности, функционализированных фуллеренов, характеризующихся приемлемой растворимостью в воде.

Проблема, решаемая настоящим изобретением, состоит в разработке способа получения из мицелия базидиальных грибов продуктов, обладающих антибактериальными свойствами, основанного на использовании в качестве биостимуляторов гидратированных наноструктурированных фуллерен С₆₀-содержащих соединений.

Проблема решена предлагаемым способом получения продуктов с антибактериальной активностью из мицелия базидиомицетов, включающим погруженное выращивание мицелия грибов базидиомицетов на питательной среде, содержащей источники углерода и азота и наноструктурированный биостимулятор, отличающимся тем, что в качестве наноструктурированного биостимулятора используют водный коллоидный раствор аминокислотного производного фуллерена С₆₀.

Технический результат состоит в накоплении в культуральной среде продуктов, обладающих антибактериальными свойствами.

В основе настоящего изобретения лежат результаты проведенных авторами исследований, целью которых являлось изучение влияния гидратированных форм производных фуллерена С₆₀ на рост и развитие лекарственных грибов базидиомицетов. На нескольких видах съедобных лекарственных ксилотрофных базидиомицетов было показано, что водные коллоидные растворы (водные дисперсии) некоторых аминокислотных производных фуллерена С₆₀ при добавлении в питательную среду в концентрации от 1×10^-6 до 1×10^-14 моль/л проявляют ростостимулирующую активность в отношении биомассы мицелия грибов базидиомицетов. При этом неожиданно было обнаружено, что в присутствии в питательной среде добавок водорастворимых калиевых солей аминокислотных производных фуллерена в культуральной жидкости накапливаются проявляющие антибактериальную активность продукты, отсутствующие в ней при культивировании грибов без использования фуллерен-содержащих добавок.

В качестве водорастворимых аминокислотных производных фуллерена взяты калиевые соли N-(моногидрофуллеренил)-D-аланина (Н-С₆₀-D-Ala-OK), N-(моногидрофуллеренил)-D-валина (Н-С₆₀-D-Val-OK) и N-(моногидрофуллеренил)-ε-аминокапроновой кислоты (Н-С₆₀-ε-АСА-OK) при их содержании в питательной среде в количестве 1×10^-6 до 1×10^-5 моль/л. Однако очевидно, что аналогичный эффект могут проявлять и другие водорастворимые аминокислотные производные фуллерена в более широком диапазоне концентраций, стимулируя биосинтез продуктов с антибактериальной активностью в качестве реакции на появление в среде выращивания агента с фуллереновой структурой.

Аминокислотные производные фуллерена С₆₀ в виде водных коллоидных растворов калиевых солей получают, как описано в работе [V.S. Romanova, V.A. Tsyryapkin, Yu.I. Lyakhovetsky, Z.N. Parnes, M.E. Vol'pin. "Addition of amino acids and dipeptides to fullerene C60 giving rise to monoadducts". Russian Chemical Bulletin, 1994, No. 6, pp. 1090-1091] путем одностадийного синтеза смешением толуольного раствора фуллерена С₆₀ с водными растворами аминокислот с последующей обработкой ультразвуком при температуре 60°С в течение 6-8 часов при постоянном перемешивании, после чего растворители отгоняют, полученный остаток обрабатывают насыщенным раствором хлористого калия и производят диализ. Получаемые таким способом коллоидные растворы содержат аминокислотные производные фуллерена С₆₀ в концентрации от 10^-4 до 10^-2 М. Содержание активного вещества в водном коллоидном растворе определяют гравиметрическим методом путем испарения воды до постоянной массы сухого остатка.

Антиоксидантные свойства и наноразмерная структура частиц получаемых коллоидных растворов показаны в работе [V.A. Volkov, М.V. Voronkov, N.N. Sazhina, D.V. Kurilov, D.V. Vokhmyanina, О.V. Yamskova, Yu. Ts. Martirosyan, D.L. Atroshenko, L. Yu. Martirosyan & V.S. Romanova "Mechanism of the Antioxidant Activity and Structure-Activity Relationship of N-Monosubstituted Amino Acid Derivatives of Fullerene C60" Kinetics and Catalysis, 2021, V. 62, pp. 395-403. DOI: 10.1134/S0023158421030095]. Их растворимость в воде, по-видимому, достигается путем самосборки молекул в наноагрегаты с расположением гидрофильных аминокислотных остатков на поверхности и гидрофобного кора фуллерена С₆₀ внутри наночастиц. Методом люминесцентных зондов показано, что N-монозамещенные аминокислотные прозводные фуллерена С₆₀ способны проникать через липидный бислой клеточных мембран [R.A. Kotelnikova, A.I. Kotelnikov, G.N. Bogdanov, V.S. Romanova, E.F. Kuleshova, Z.N. Parnes, M.E. Vol'pin "Membranotropic properties of water soluble amino acid and peptide derivatives of fullerene[60]" FEBS Letters, 1996, v. 389, pp. 111-114].

Возможность осуществления изобретения продемонстрирована на примерах выращивания мицелия базидиальных грибов трутовик серно-желтый (штамм Laetiporus sulphureus 120707 из коллекции кафедры ботаники Иркутского государственного университета), а также опенок зимний (штамм Flammulina velutipes 0535) и трутовик плоский (штамм 0154 Ganoderma applanatum) из коллекции кафедры микологии и альгологии Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова. Культуры грибов выращивают на чашках Петри с агаризованным пивным суслом (3-4 градуса по Баллингу), рН 6-6,5, температура 26°С. После полного зарастания чашек Петри блоки агаризованной среды с культурой используют в качестве инокулята жидкой питательной среды. Погруженное культивирование мицелия выполняют в соответствии с рекомендациями [Методы экспериментальной микологии / Под ред. В.И. Билай. - Киев: Наукова думка, 1982. - 550 с.]. Культивирование грибов проводят на водной питательной среде, содержащей источник углерода, например, D-глюкозу, или L-арабинозу, или D-галактозу, или D-лактозу в концентрации 10 - 22 г/л и источник азота, например, дрожжевой экстракт, или глицин, или аспарагин в концентрации 1,0 - 1,7 г/л. В качестве наноструктурированного биостимулятора в питательную среду вводят фуллерен-содержащую добавку в требуемой концентрации.

Для приготовления питательной среды с требуемым содержанием биостимулятора исходный коллоидный раствор с известной концентрацией аминокислотного производного фуллерена С₆₀ разбавляют смесью воды и этанола до концентрации, в сто раз превышающей требуемую концентрацию биостимулятора в питательной среде для выращивания мицелия. Количественное соотношение воды и этанола подбирают таким образом, чтобы в конечном растворе объемное соотношение воды и этанола составляло примерно 1:1. Полученный таким образом водно-этанольный коллоидный раствор калиевой соли N-монозамещенного аминокислотного производного фуллерена С₆₀ добавляют в питательную среду в количестве 1% от ее объема. В контрольных опытах (отсутствие фуллерен-содержащей добавки в среде выращивания) в среду вводят 1% (v/v) 50%-ного водного этанола. Культивирование мицелия проводят при температуре 24-28°С в течение 14-21 суток. Культуральную жидкость отделяют от погруженного мицелия фильтрованием. Фильтрат упаривают при температуре 35-37°С до объема 0,03-0,10 от первоначального объема, к остатку добавляют трехкратный объем этилового спирта и выдерживают при комнатной температуре в течение нескольких часов до выпадения коричневого осадка. Осадок отфильтровывают, промывают этанолом и хранят под слоем этанола для соблюдения асептических условий, необходимых для дальнейшего тестирования на антибактериальную активность. В расчете на 1 г мицелиальной биомассы получают около 0,2 г осадка. Осадок содержит смесь полисахаридов бета-глюканов различной структуры, доминирующих в составе внеклеточных метаболитов из жидких сред культивирования лекарственных грибов базидиомицетов [Ruthes А.С., Smiderle F.R., Iacomini М. "D-Glucans from edible mushrooms: A review on the extraction, purification and chemical characterization approaches" Carbohydrate Polymers. 2015. V. 117. pp. 753-761].

Для проведения испытаний на антибактериальную активность готовят водный раствор препарата, для чего осадок отделяют от надосадочной жидкости (супернатанта) и растворяют в дистиллированной воде. Для корректного сравнения антибактериальной активности препаратов, полученных в различных экспериментах, объем раствора нормируют по массе сырого мицелия, отделенного при фильтрации, из расчета 5 мл воды на 1 г мицелиальной биомассы.

Для проверки антибактериальной активности полученных препаратов использована тест-система, включающая штаммы фитопатогенных бактерий, выбранные на основе Специализированной научной коллекции ИБФРМ РАН (WFCC номер 975, WDCM номер 1021): Micrococcus luteus В-109, Pectobacterium carotovorum subsp.carotovorum 603, Pectobacterium carotovorum subsp.carotovorum MI, Pectobacterium atrosepticum 1043, Pseudomonas fluorescens EL-2.1, Xanthomonas campestris B-610. Определение чувствительности фитопатогенов к полученным препаратам проводят методом диффузии в агар [Sagdic О., Aksoy A., Ozkan G. "Evaluation of the antibacterial and antioxidant potentials of gilaburu (Viburnum opulus L.) fruit extract" Acta Alimentaria. 2006. Vol. 35. №4. pp. 487-492]. Результаты испытаний в форме примеров, не исчерпывающих всех возможных форм осуществления изобретения, описываемых формулой, представлены в таблице.

Необходимо отметить, что исследование собственной антибактериальной активности взятых гидратированных аминокислотных производных фуллерена С₆₀ показало, что в указанной концентрации эти соединения антибактериальной активности в отношении штаммов фитопатогенных бактерий, входящих в тест-систему, не проявляют.

Как видно из приведенных примеров, введение в питательную среду для глубинного культивирования мицелия грибов базидиомицетов водорастворимых аминокислотных производных фуллерена С₆₀ в концентрациях 1×10^-5 - 1×10^-6 моль/л приводит к накоплению в культуральной жидкости продуктов метаболизма, проявляющих бактерицидную активность в отношении бактериальных фитопатогенов. Наибольшую чувствительность к добавкам испытанных фуллерен-содержащих соединений проявляет гриб Laetiporus sulphureus (трутовик серно-желтый). Штаммы грибов Flammulina velutipes 0535 и Ganoderma applanatum 0154 также откликаются, хотя и в меньшей степени, на введение в культуральную среду фуллерен-содержащих соединений выработкой метаболитов, проявляющих бактерицидные свойства.

Как отмечалось выше, приведенные примеры иллюстрируют лишь частные формы реализации изобретения. Очевидно, что среди обширного класса грибов базидиомицетов есть немало представителей, которые также могут проявлять способность вырабатывать метаболиты с антибактериальными свойствами в присутствии в питательной среде водорастворимых соединений с фуллереновой структурой, в том числе, в более широком диапазоне концентраций.

Представления об общих механизмах воздействия антимикробных продуктов на бактерии разных экологических ниш [McKie S.J., Neuman K.С., Maxwell A. "DNA topoisomerases: Advances in understanding of cellular roles and multi-protein complexes via structure-function analysis" BioEssays. 2021. V. 43, No. 4. Article 2000286] позволяют полагать, что полученные препараты могут быть активны не только в отношении фитопатогенов, но и других микроорганизмов.

Известно, что базидиальные грибы являются обширным, не до конца изученным ресурсом для получения широкого спектра биологически активных соединений. Так, например, Ganoderma applanatum и Laetiporus sulphureus рассматриваются как перспективные виды для разработки противовирусных препаратов [https://cyberleninka.ru/article/n/protivovirusnaya-aktivnost-bazidialnyh-gribov-obzor-literatury]. Гриб Laetiporus sulphureus известен как источник большого количества биологически активных веществ: β-глюканы и каротиноподобные соединения, синтезируемые L. sulphureus, обладают иммуномодулирующими, противоопухолевыми и антиоксидантными свойствами [И.А. Гаврюшина и др. «Антимикробные свойства водорастворимых полисахаридов и спиртовых экстрактов мицелия Laetiporus Sulphureus (Bull.) Murrill и разработка биотехнологии его получения в иммобилизованной культуре на бактериальной целлюлозе» Антибиотики и химиотерапия, 2020, т. 65, с. 1-2], а спиртовые экстракты мицелия обладают противовирусной активностью в отношении вируса простого герпеса ВПГ-1, устойчивого к известным противовирусным препаратам, и противовирусной активностью в отношении вирусов растений. Для L. sulphureus известна антифунгальная активность в отношении ряда дереворазрушающих грибов. Представленные результаты расширяют возможности использования базидиальных грибов в качестве источника биологически активных препаратов с широким спектром действия.

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен способ получения продуктов с антибактериальной активностью из жидких сред культивирования базидиомицетов, включающий погруженное культивирование мицелия на питательной среде, содержащей источники углерода и азота и наноструктурированный биостимулятор - водный коллоидный раствор аминокислотного производного фуллерена С₆₀ в концентрации 1×10^-6 - 1×10^-5 моль/л. Изобретение обеспечивает накопление в культуральной жидкости продуктов метаболизма базидиомицетов, проявляющих бактерицидную активность в отношении бактериальных фитопатогенов. 5 з.п. ф-лы, 1 табл.

1. Способ получения продуктов с антибактериальной активностью из жидких сред культивирования базидиомицетов, включающий погруженное культивирование мицелия на питательной среде, содержащей источники углерода и азота и наноструктурированный биостимулятор, отличающийся тем, что в качестве наноструктурированного биостимулятора используют водный коллоидный раствор аминокислотного производного фуллерена С₆₀ в концентрации 1×10^-6 - 1×10^-5 моль/л.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что источник углерода представляет собой D-глюкозу, или L-арабинозу, или D-галактозу, или D-лактозу в концентрации 10-22 г/л.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что источник азота представляет собой дрожжевой экстракт, или глицин, или аспарагин в концентрации 1,0-1,7 г/л.

4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что аминокислотное производное фуллерена С₆₀ представляет собой калиевую соль N-(моногидрофуллеренил)-D-аланина.

5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что аминокислотное производное фуллерена С₆₀ представляет собой калиевую соль N-(моногидрофуллеренил)-D-валина.

6. Способ по п. 1, отличающийся тем, что аминокислотное производное фуллерена С₆₀ представляет собой калиевую соль N-(моногидрофуллеренил)-ε-аминокапроновой кислоты.