Конъюгат дексаметазона с синтетическим статистическим полипептидом Российский патент 2023 года по МПК A61K47/64 A61P27/14 A61P29/00 

Область, к которой относится изобретение

Заявляемое изобретение относится к области химии высокомолекулярных соединений, фармацевтики и медицины, а именно, к конъюгатам дексаметазона с синтетическими амфифильными полипептидами и полимерным частицам на их основе, которые обеспечивают контролируемое пролонгированное высвобождение дексаметазона в витреальной жидкости глаза, а также способам их получения.

Предшествующий уровень техники.

Дексаметазон представляет собой синтетический глюкокортикостероид, оказывающий противовоспалительное и иммунодепрессивное действие. Он широко используется для лечения широкого спектра глазных заболеваний, включая заболевания переднего отрезка (кератит, блефарит, аллергический конъюнктивит, передний увеит и сухость глаз), так воспаления заднего отрезка глаза (промежуточный увеит, хориоидит, панувеит и макулярный отек), а также применяется для уменьшения воспаления после различных офтальмологических операций [1].

Существует ряд лекарственных форм дексаметазона для лечения глаз, включая глазные капли, мази, пероральные таблетки, внутриглазные инъекции и интравитреальные имплантаты.

Эффективное лечение дексаметазоном требует поддержания терапевтической концентрации в необходимой области.

При местном применении препаратов (например, глазные капли), лекарственное вещество может достичь переднего отрезка глаза, однако, оно быстро удаляется из глаза, а его биодоступность очень низка - менее 3% введенной дозы достигает внутриглазной жидкости [2], что обусловлено низкой проницаемостью препарата через эпителий роговицы [3]. Кроме того, короткий период полу выведения дексаметазона (около 3-6 часов) [4] затрудняет поддержание эффективной концентрации и требует частого введения препарата. Ожидается, что только 0.001% лекарственной дозы вещества, используемого в виде глазных каплей, достигнет заднего сегмента глаза [1].

Для лечения заднего сегмента глаза могут быть использованы пероральное или внутривенное введение дексаметазона, но биодоступность препарата низка (1-2%) вследствие наличия гематоофтальмического и гематоретинального барьеров. Использование таких форм требует применения высоких доз, что приводит к серьезным системным побочным эффектам, связанных с накоплением лекарственного вещества в других органах [5].

Интравитреальные инъекции эффективны для лечения заднего сегмента глаза, однако, вследствие короткого периода его полужизни в стекловидном теле, инъекции необходимо повторять часто для поддержания терапевтического уровня лекарственного средства. В свою очередь, необходимость многочисленных инъекций в глаз оказывается травмирующим фактором для пациента [1].

Использование систем доставки лекарственных веществ дает множество преимуществ, таких как повышение растворимости и биодоступности, увеличение концентрации в целевом органе [6], повышение стабильности к химический или ферментативной деградации, увеличение эффективности вещества и снижение побочных эффектов и системной токсичности [7, 8]. Кроме того, за счет контролируемого высвобождения лекарства системы доставки позволяют обеспечить поддержание желаемой концентрации для достижения необходимого терапевтического эффекта.

Интравитреальные имплантаты Ozurdex® для доставки десаметазона, состоящие из биодеградируемого сополимера молочной и гликолевой кислот (50:50), эффективны, но их применение ограничивается высокой стоимостью, а также включают ряд потенциальных побочных эффектов, таких как повышенное внутриглазное давление, кератит и катарактогенез [9, 10].

Неотъемлемое преимущество использования нано- и микрочастиц по сравнению с имплантатами является меньший размер иглы, необходимой для интравитреального введения частиц, что снизит травматичность операции. Ozurdex® требует использования аппликаторного устройства с диаметром иглы 0.7 мм, что значительно больше, чем требуется для инъекций растворов. Кроме того, при использовании частиц можно вводить точное количество дексаметазона, необходимое каждому пациенту, регулируя концентрацию вводимых частиц.

В заявке RU 2660585 C2 описан липосомальный дексаметазон для лечения офтальмологических заболеваний и способ его получения. Он состоит из смеси липидной массы, включающей фосфолипид или смесь фосфолипидов (с холестерином или без него) и раствора дексаметазона натрия фосфата или дексаметазона. В известном изобретении фармацевтическая композиция по данному изобретению содержит от около 50% до около 90% дексаметазона натрия фосфата, не ассоциированного с липидами [11]. Не ассоциированный с липидами дексаметазона натрия фосфат хорошо растворим в водных средах и легко выводится из жидкой части стекловидного тела (время полужизни - около 3,5 ч). Таким образом, 50-90% вводимой дозы дексаметазона сразу попадет в глазную жидкость.

Из уровня техники известны способы получения также других систем доставки дексаметазона для лечения офтальмологических заболеваний, содержащих инкапсулированный дексаметазон [12, 13]. Авторы предлагают использовать разработанные системы доставки для местного применения. Вследствие того, что лекарственное вещество инкапсулировано в частицу за счет физических взаимодействий, профиль высвобождения дексаметазона в таких системах характеризуется быстрым начальным высвобождением вещества («burst release»). В приведенных работах доля высвободившегося дексаметазона за 6 часов составила более 40%, что не позволит обеспечить поддержание необходимой контролируемой терапевтической концентрации в течение продолжительного времени.

Для контролирования скорости высвобождения дексаметазона используют подход, основанный на ковалентном связывании дексаметазона с полимером [14, 15]. В работе [16] описан конъюгат дексаметазона с полипептидом, который является наиболее близким к заявленному изобретению и принят в качестве прототипа. Конъюгат полипептид-дексаметазон состоит из проникающего в клетку пептида и дексаметазона, связанных энзим-чувствительным пептидным линкером. В свою очередь, дексаметазон связан с энзим-чувствительным линкером гидразоновой связью. Высвобождение лекарственного вещества происходило в виде дексаметазона, связанного с аргинином, однако, скорость данного процесса не изучена. Кроме того, синтез самого пептида является дорогостоящим и достаточно трудоемким.

Разработка эффективной системы доставки дексаметазона остается актуальной задачей. Такая система доставки дексаметазона должна быть биосовместимой и биодеградируемой, способствовать увеличению времени жизни лекарственного вещества за счет контролируемого высвобождения лекарственного вещества с поддержанием необходимой концентрации в течение продолжительного периода времени.

Заявляемое изобретение описывает конъюгат дексаметазона с амфифильным полипетидом, обеспечивающим контролируемый профиль высвобождения дексаметазона по сравнению с уже известными системами доставки дексаметазона. Контролируемое высвобождение лекарственное вещества достигается за счет его ковалентного связывания с полипептидом. Полипептиды, используемые в качестве системы доставки дексаметазона согласно изобретению, являются нетоксичными и деградируют до аминокислот в ферментативных условиях. В заявляемом изобретении было показано, что конъюгирование дексаметазона с полипептидом позволяет обеспечить контролируемое постепенное высвобождение дексаметазона в витреальной жидкости глаза.

Раскрытие изобретения

Технической задачей заявляемого изобретения является получение нетоксичных и способных к биодеградации конъюгатов лекарственного вещества дексаметазона, а также наноразмерных систем доставки противовоспалительного вещества дексаметазона на их основе, способствующих контролируемому продолжительному высвобождению дексаметазона в витреальной жидкости глаза и повышению эффективности его действия при интравитреальном введении.

Технический результат заявляемого изобретения заключается в создании новых конъюгатов дексаметазона с синтетическими амфифильными полипептидами, образующих в водной среде полимерные наночастицы, которые способны обеспечить пролонгируемое действие дексаметазона за счет контролируемого высвобождения лекарственного вещества в витреальной жидкости с поддержанием необходимой концентрации в течение продолжительного периода времени.

Указанный технический результат достигается тем, что в конъюгате дексаметазона с амфифильным синтетическим статистическим полипептидом со среднечисловой молекулярной массой от 5000 до 50000 в соответствии с заявленным изобретением синтетический амфифильный полипептид имеет общую формулу поли(X_n-co-Y_m), где

X - заряженная полярная аминокислота,

Y - гидрофобная аминокислота,

n - число повторяющихся звеньев X,

m - число повторяющихся звеньев Y,

дексаметазон связан с полипептидом через линкер, с массовой долей конъюгированного дексаметазона 0.5-30%, и конъюгат образует в водной среде полимерные частицы.

Кроме того, указанный технический результат достигается тем, что в конъюгате дексаметазона с синтетическим амфифильным полипептидом в качестве заряженной полярной аминокислоты X использована L-глутаминовая кислота, в качестве гидрофобной аминокислоты Y использован L-фенилаланин, DL-фенилаланин или D-фенилаланин, и мольное соотношение [L-глутаминовая кислота]/[L/DL/D-фенилаланин] в полипептиде составляет 0.8-6.

Помимо этого, указанный технический результат достигается тем, что в конъюгате дексаметазона с синтетическим амфифильным полипептидом в качестве заряженной полярной аминокислоты X использован L-лизин, в качестве гидрофобной аминокислоты Y использован L-фенилаланин, DL-фенилаланин или D-фенилаланин, и мольное соотношение [L-лизин]/[L/DL/D-фенилаланин] в полипептиде составляет 0.7-10.

Вместе с тем, указанный технический результат достигается тем, что конъюгат дексаметазона с синтетическим амфифильным полипептидом, в котором в качестве заряженной полярной аминокислоты X использован L-лизин, в качестве гидрофобной аминокислоты Y использован L-фенилаланин, DL-фенилаланин или D-фенилаланин, образующий в водной среде полимерные частицы, связан с полисахаридом, выбранном из группы гепарин, каррагинан и хондроитинсульфат, за счет электростатических взаимодействий между аминогруппами конъюгата и карбоксильными и сульфогруппами полисахарида, с массовым соотношением полисахарида к конъюгату, равным 1-2.

Заявленное изобретение поясняется Фиг. 1 - Фиг. 12, на которых представлены:

Фиг. 1: Структура полипептидов поли((L-лизин)_n-со-(L-фенилалинин)_m) (А) и поли((L-глутаминовая кислота)_n-со-(L-фенилалинин)_m) (В).

Фиг. 2: Структура полипептидов поли((L-лизин)_n-со-(DL-фенилалинин)_m) (А) и поли((L-глутаминовая кислота)_n-со-(D-фенилалинин)_m) (В).

Фиг. 3: Структура конъюгата дексаметазона с полипептидом поли((L-лизин)_n-со-(DL-фенилалинин)_m).

Фиг. 4: Структура конъюгата дексаметазона с полипептидом поли((L-глутаминовая кислота)_n-со-(D-фенилалинин)_m).

Фиг. 5: Структура полимерной частицы на основе конъюгата дексаметазона с полипептидом поли(L-лизин-со-L/DL/D-фенилаланин).

Фиг. 6: Структура полимерной частицы на основе конъюгата дексаметазона с полипептидом поли(L-глутаминовая кислота-со-L/DL/D-фенилаланин).

Фиг. 7: Структура полимерной частицы на основе конъюгата дексаметазона с полипептидом поли(L-лизин-со-L/DL/D-фенилаланин), поверхность которой покрыта гепарином.

Фиг. 8: Зависимость гидродинамического размера частиц на основе статистических сополимеров поли(L-лизин-со-L/DL/D-фенилаланин) от времени инкубирования в среде, содержащей папаин (с_{папаина}=0.5 мг/мл).

Фиг. 9: Высвобождение дексаметазона из частиц на основе конъюгатов дексаметазона с полипептидами поли(L-лизин-со-L/DL-фенилаланин) различного состава в 0.01 М натрий-фосфатном буферном растворе (рН 7.4), содержащем 0.9% NaCl.

Фиг. 10: Высвобождение дексаметазона из частиц на основе конъюгата дексаметазона с полипептидом поли(L-лизин-со-DL-фенилаланин), и этих частиц, поверхность которых покрыта гепарином, в 0.01 М натрий-фосфатном буферном растворе (рН 7.4), содержащем 0.9% NaCl.

Фиг. 11: Высвобождение дексаметазона из частиц на основе конъюгата дексаметазона с полипептидом поли(L-лизин-со-DL-фенилаланин) в смеси витреальная жидкость: 0.01 М натрий-фосфатный буферный раствор (рН 7.4), содержащий 0.9% NaCl (50:50 об.%).

Фиг. 12: Часть ¹Н ЯМР спектра конъюгата дексаметазона с полипептидом поли(L-лизин-co-DL-фенилаланин), используемая для расчета степени конъюгирования.

Описание изобретения

Определения

Неприродные аминокислоты - некодируемые генетическим кодом аминокислоты.

Полипептиды - молекулы, образованные последовательностью аминокислот, соединенных пептидной связью.

Амфифильные полимеры - полимеры, имеющие в своей структуре как гидрофильные, так и гидрофобные фрагменты (мономеры, звенья, радикалы).

Конъюгат - синтезированная молекула, в которой ковалентно связаны разные по свойствам вещества.

Получение амфифильных полипептидов.

Для получения конъюгатов дексаметазона на первом этапе получали амфифильные сополимеры общей формулы поли(X_n-со-Y_m), где

X - заряженная полярная аминокислота, выбранная из группы L-лизин и L-глутаминовая кислота;

Y - гидрофобная аминокислота, выбранная из группы L-фенилаланин, DL-фенилаланин или D-фенилаланин,

n - число повторяющихся звеньев X,

m - число повторяющихся звеньев Y.

Так, были получены полипептиды, структура которых может быть отображена как поли((L-лизин)_n-со-(L/DL/D-фенилаланин)_m) (поли(L-лизин-со-L/DL/D-фенилаланин), P(L-Lys-co-L/DL/D-Phe)), с мольным соотношением [L-лизин]/[L/DL/D-фенилаланин] = 0.7-10, где n - число повторяющихся звеньев L-лизина и m - число повторяющихся звеньев L-фенилаланина, DL-фенилаланина или D-фенилаланина.

Кроме того, были получены полипептиды, структура которых может быть отображена как поли((L-глутаминовая кислота)_n-со-(L/DL/D-фенилаланин_m) (поли((L-глутаминовая кислота)-со-L/DL/D-фенилаланин), P(L-Glu-co-L/DL/D-Phe), с мольным соотношением [L-глутаминовая кислота]/[L/DL/D-фенилаланин], равным 0.8-6, где n - число повторяющихся звеньев L-глутаминовой кислоты и m - число повторяющихся звеньев L/DL/D-фенилаланина.

Гидрофильные и гидрофобные звенья (аминокислоты) амфифильных полипептидов связаны между собой пептидной связью. Среднечисловая молекулярная масса (M_n) полимеров составляет 5-50 кДа, при этом дисперсность D образцов не превышает значения 1.4.

Синтез полипептидов проводили методом полимеризации с раскрытием цикла N-карбоксиангидридов α-аминокислот, который обеспечивает возможность регулировать длину цепи полимеров и гидрофобность сополимера в процессе синтеза, а также позволяет получать узкодисперсные сополимеры. На первой стадии были синтезированы защищенные полимеры поли((ε-карбоксибензил-L-лизин)-со-L/DL/D-фенилаланин) и поли((γ-бензил-L-глутамат)-со-L/DL/D-фенилаланин). В качестве инициатора полимеризации использовали н-гексиламин, полимеризацию проводили при мольном соотношении [мономеры]/[инициатор], равном 10-100. На второй стадии гидрофобный полипептид гидролизовали при температуре 22°С в смеси трифторуксусной кислоты и трифторметансульфокислоты.

Синтезированные полипептиды могут содержать статистическую последовательность природных аминокислот, и их структура может быть отображена как поли((L-лизин)_n-со-(L-фенилаланин)_m) (Фиг. 1А) и поли((L-глутаминовая кислота)_n-со-(L-фенилаланин)_m) (Фиг. 1В).

Полипептид, кроме природных α-аминокислот, может также содержать неприродную D-аминокислоту, которая может повысить устойчивость полипептида к ферментативному гидролизу, предпочтительно, DL-фенилаланин или D-фенилаланин. Структура таких полипептидов может быть отображена как поли(L-лизин)_n-со-(DL-фенилаланин)_m), (Фиг. 2А) и поли(L-лизин)_n-со-(D-фенилаланин)_m), а также поли(L-глутаминовая кислота)_n-со-(DL-фенилаланин)_m) и поли(L-глутаминовая кислота)_n-co-(D-фенилаланин)_m) (Фиг. 2В).

Получение конъюгатов дексаметазона с полипептидами.

Ковалентное присоединение дексаметазона к полипептидам общей формулы поли((L-лизин)_n-со-(L/DL/D-фенилаланин)_m), содержащих первичные аминогруппы в своей структуре, проводили методом активированнных эфиров. Для этого получали активированный эфир дексаметазона гемисукцината реакцией дексаметазона гемисукцината с N-гидроксисукцинимидом и карбодиимидом, который затем вводили в реакцию с полимером, после чего полученный конъюгат очищали диализом. Степень модификации полимера дексаметазоном возрастала при увеличении доли L-лизина в полимере, что связано с увеличением количества доступных для связывания аминогрупп.

Конъюгат дексаметазона с синтетическим полипептидом, в соответствии с заявленным изобретением, представляет собой дексаметазон, ковалентно связанный с амфифильным полипептидом, имеющим общую формулу поли((L-лизин)_n-со-(L/DL/D-фенилаланин)_m), с мольным соотношением [L-лизин]/[L/DL/D-фенилаланин] = 0.7-10, где n - число повторяющихся звеньев L-лизина и m - число повторяющихся звеньев L-фенилаланина, DL-фенилаланина или D-фенилаланина, через линкер и соединенный с линкером сложноэфирной связью.

Структура полученных конъюгатов может быть отображена общей формулой поли((L-лизин)_n-k-со-Z_k-со-(L/DL/D)-фенилаланин)_m), где Z - L-лизин, ковалентно связанный с дексаметазоном через сукцинатный линкер, n-k - число повторяющихся звеньев L-лизина, k - число повторяющихся звеньев Z, m - число повторяющихся звеньев L-фенилаланина, DL-фенилаланина или D-фенилаланина (Фиг. 3).

Ковалентное присоединение дексаметазона к полипептидам общей формулы поли((L-глутаминовая кислота)_n-со-(L/DL/D-фенилаланин)_m), содержащих карбоксильные группы в своей структуре, проводили в три этапа. На первом этапе проводили активацию карбоксильных групп полимера с последующей реакцией активированного эфира с линкером, содержащим одну свободную аминогруппу и одну защищенную аминогруппу. В наиболее предпочтительных вариантах изобретения линкер представляет собой N-трет-бутилоксикарбонил-1,2-этилендиамин (N-Boc-этилендиамин). На втором этапе удаляли Boc-защитную группу, полимер очищали диализом и лиофильно высушивали. После этого, на последнем этапе, осуществляли ковалентное связывание образовавшегося полимера с дексаметазона гемисукцинатом методом активированных эфиров, после чего полученный конъюгат очищали диализом.

Конъюгат дексаметазона с синтетическим полипептидом, в соответствии с заявленным изобретением, представляет собой, кроме того, дексаметазон, ковалентно связанный с амфифильным полипептидом, имеющим общую формулу поли((L-глутаминовая кислота)_n-со-(L/DL/D-фенилаланин)_m), с мольным соотношением [L-глутаминовая кислота]/[L/DL/D-фенилаланин] = 0.8-6, где n - число повторяющихся звеньев L-глутаминовой кислоты и m - число повторяющихся звеньев L-фенилаланина, DL-фенилаланина или D-фенилаланина, через линкер и соединенный с линкером сложноэфирной связью.

Структура полученных конъюгатов может быть отображена общей формулой поли((L-глутаминовая кислота)_n-k-со-Z_k-со-(L/DL/D-фенилаланин)_m), где Z - глутаминовая кислота, ковалентно связанная с дексаметазоном через линкер, n-k - число повторяющихся звеньев L-глутаминовой кислоты, k - число повторяющихся звеньев Z, m - число повторяющихся звеньев L-фенилаланина, DL-фенилаланина или D-фенилаланина (Фиг. 4).

Расчет количества связавшегося дексаметазона проводили по данным хроматографического анализа образца после его щелочного гидролиза. В качестве альтернативного способа расчета степени модификации полимера дексаметазоном использовали данные, полученные методом ¹Н ЯМР-спектроскопии. Данные, полученные двумя методами, находятся в согласовании друг с другом.

Конъюгаты дексаметазона с амфифильными полипептидами по изобретению содержат 0.5-30% дексаметазона по массе.

Получение полимерных частиц.

Системы контролируемого высвобождения дексаметазона представляют собой полимерные наночастицы на основе конъюгата дексаметазона с амфифильными полипептидами сред нечисловой молекулярной массы от 5 до 50 кДа, формируемые путем самопроизвольной сборки амфифильных конъюгатов в водных средах с образованием сферических частиц, имеющих гидродинамический диаметр 100-400 нм. При этом гидрофобные фрагменты (фенилаланин, дексаметазон) амфифильных молекул полимера преимущественно обращены внутрь полимерной частицы, образуя ее внутреннее гидрофобное ядро, а гидрофильный фрагмент (аминогруппы L-лизина или карбоксильные группы L-глутаминовой кислоты) преимущественно окружает гидрофобную мембрану и направлен наружу в водную среду, стабилизируя внутреннее гидрофобное ядро.

Согласно изобретению структура частицы, образованной конъюгатами дексаметазона и амфифильными полипептидами на основе L-лизина, может быть представлена как это показано на Фиг. 5.

Кроме того, согласно изобретению структура частицы, образованной конъюгатами дексаметазона и амфифильными полипептидами на основе L-глутаминовой кислоты, может быть представлена как показано на Фиг. 6.

Основная сущность изобретения состоит в том, что конъюгаты дексаметазона с амфифильными статистическими полипептидами содержат гидрофобную часть, состоящую из звеньев гидрофобной аминокислоты, выбранной из группы из группы L-фенилаланин, DL-фенилаланин и D-фенилаланин и гидрофильную часть, состоящую из фрагментов L-лизина или L-глутаминовой кислоты. Такая структура сополимера обеспечивает его свойства и свойства образуемых амфифильными полимерами частиц:

- критическая концентрация агрегации зависит от состава и структуры полимера и лежит в пределах 4-18 мг/л;

- гидродинамический диаметр частиц зависит от состава и структуры сополимера и лежит в пределах 100-400 нм, при этом индекс полидисперсности частиц не превышает значения 0.35;

- амфифильные полимеры и частицы на их основе по изобретению являются нетоксичными и обладают способностью к биодеградации;

- скорость биодеградации частиц по изобретению зависит от состава сополимера, при этом введение D-аминокислоты увеличивает стабильность частиц к ферментативному расщеплению;

- структура частиц на основе амфифильных полимеров по изобретению обеспечивает возможность функционализации поверхности частиц различными лигандами за счет реакционноспособных аминогрупп или карбоксильных групп на поверхности частиц;

- структура частиц на основе амфифильных полимеров по изобретению, содержащих L-лизин в своей структуре, обеспечивает возможность покрытия частиц полисахаридами, несущими карбоксильные и сульфогруппы, за счет электростатического взаимодействия данных групп и аминогрупп на поверхности частиц;

- количество ковалентно связанного дексаметазона лежит в пределах 0.5-30 мас.%.

- ковалентное связывание дексаметазона с полимерной частицей способствует солюбилизации гидрофобной молекулы, контролируемому высвобождению вещества за счет гидролиза сложноэфирной связи.

Полимерные наночастицы из амфифильных полипептидов и их конъюгатов с дексаметазоном по изобретению были получены диализом раствора полимера в органическом растворителе против воды. Амфифильный полимер берут в таких количествах, чтобы в конечном растворе его концентрация была выше критической концентрации агрегации.

Частицы на основе амфифильных полимеров по изобретению, содержащих лизин в своей структуре, содержат аминогруппы на поверхности частиц, что обеспечивает возможность присоединения различных отрицательно заряженных молекул на ее поверхности, включая полимеры. С целью экранирования положительного заряда частиц, обусловленного наличием L-лизина в их структуре, их поверхность дополнительно модифицировали полисахаридами, несущими карбоксильные и сульфогруппы, за счет электростатического взаимодействия данных групп и аминогрупп на поверхности частиц. Полисахариды предпочтительно выбирают из группы, включающей гепарин, каррагинан и хондроитинсульфат.

Таким образом, согласно изобретению, структура частицы, образованной конъюгатами дексаметазона с амфифильными полипептидами на основе L-лизина, поверхность которой дополнительно покрыта полисахаридом, содержащем сульфогруппы, может быть представлена как показано на Фиг. 7.

Исследование биологических свойств частиц in vitro.

Использование полимерных нано- и микрочастиц in vivo накладывает определенные ограничения на выбор полимеров. Особенно важно, чтобы полимеры, выбранные для получения частиц, были биосовместимыми и обладали способностью к биодеградации, т.е. разлагались в физиологических средах до низкомолекулярных фрагментов и, таким образом, выводились из организма.

Цитотоксичность полимерных частиц исследовали на эпителиальных клетках легких человека (BEAS-2B) и клетках почек эмбриона человека (НЕК 293). Полимерные наноразмерные частицы на основе поли((L-глутаминовой кислоты)-со-L/D/DL-фенилаланина), а также поли(L-лизина-со-L/D/DL-фенилаланина), покрытые отрицательно заряженным полисахаридом, являются нетоксичными в диапазоне концентраций 4-250 мкг/мл в исследуемой in vitro модели.

Процесс биодеградации полимерных частиц был изучен в модельной системе, содержащей фермент папаин. Процесс биодеградации исследовали методом динамического рассеяния света, определяя изменение гидродинамического размера частиц в течение времени (Фиг. 8). В таблице 1 представлены характеристики исследуемых частиц, используемых для изучения процесса деградации.

Введение в структуру частицы фрагмента с повышенной устойчивостью к биодеградации (D-Phe), увеличивает стабильность частиц к ферментативной деградации, по сравнению с пептидами, содержащими только природные аминокислоты. Деградация полимерной частицы в данном случае сопровождается резким увеличением гидродинамического размера (агрегацией) (Фиг. 8).

Исследование профиля высвобождения дексаметазона

Процесс высвобождения дексаметазона (DEX) из частиц различного состава на основе конъюгатов дексаметазона с полипептидом поли((L-глутаминовая кислота)-со-D-фенилаланин) (P(L-Glu-co-D-Phe)-DEX), а также поли(L-лизин-со-L/DL-фенилаланин) (P(L-Lys-co-DL/D-Phe)-DEX) и таких частиц, покрытых гепарином (P(Lys-co-DL-Phe)-DEX)-гепарин) (Таблица 2), исследовали в модельных физиологических условиях: натрий-фосфатном буферном растворе (Фиг. 9, 10) и его смеси с витреальной жидкостью (Фиг. 11).

Высвобождение дексаметазона из частиц на основе его конъюгатов с амфифильными полипептидами обусловлено гидролизом сложноэфирных связей в конъюгате, образованных между дексаметазоном и линкером, и последующей диффузией дексаметазона из частицы. Время полного высвобождения дексаметазона из частиц на основе конъюгатов по изобретению в натрий-фосфатном буферном растворе составляло 168-336 ч. Введение в структуру полимера, образующего частицу, D-аминокислоты, а также увеличение доли L-лизина позволило снизить скорость высвобождения дексаметазона (Фиг. 9). Связывание частиц с полисахаридом также снижает скорость данного процесса (Фиг. 10). Время полного высвобождения дексаметазона из частиц на основе конъюгатов по изобретению в смеси натрий-фосфатный буферный раствор: витреальная жидкость (50:50 об.%) составляло 96-192 ч (Фиг. 11).

В заявляемом изобретении лекарственное вещество высвобождается в виде свободного дексаметазона, в отличие от прототипа, в котором происходит высвобождение вещества в виде дексаметазона, связанного с аргинином.

Практически линейное высвобождение позволит точно контролировать количество высвобождаемого препарата и поддерживать его не заданном уровне, что не достигается в аналогах - липосомальных препаратах.

Частицы, полученные по изобретению, имеют размер, не превышающий 400 нм и могут быть введены в глаз в виде коллоидного раствора через тонкую иглу, в отличие коммерчески доступного имплантата Ozurdex®.

Используемые сокращения

Примеры

Ниже представлены примеры получения некоторых сополимеров, конъюгатов и частиц на их основе согласно изобретению. Все приведенные в материалах заявки примеры приведены для иллюстрации изобретения и не ограничивают формулу изобретения.

Получение амфифильных полипептидов.

Гидрофобный статистический сополимер, мономерами которого являются ε-карбоксибензил-L-лизин и DL-фенилаланин, получали следующим образом. В реакционный бюкс для полимеризации загружали расчетное количество N-карбоксиангидридов ε-карбоксибензил-L-лизина (M₁) и DL-фенилаланина (М₂) и органический растворитель (диоксан). После этого в бюкс, содержащий 4 мас.%, раствор мономеров, вносили инициатор н-гексиламин для достижения мольного соотношения [мономеры]/[инициатор], равного 10-100. После приготовления полимеризационную смесь продували аргоном в течение 1 ч. Затем реактор помещали в термостат, где поддерживали температуру 30°С. По истечении 48 ч полученный продукт осаждали пятикратным избытком диэтилового эфира. Осадок отделяли центрифугированием. После декантации осадок промывали избытком диэтилового эфира. Полученный полимер сушили на воздухе при комнатной температуре в течение 24 ч.

Амфифильный статистический сополимер, мономерными звеньями которого являются L-лизин и DL-фенилаланин, получали следующим образом. В круглодонную колбу помещали навеску сополимера поли(ε-карбоксибензил-L-лизин)-со-(DL-фенилаланин) и добавляли трифторуксусную кислоту в количестве 2 мл / 100 мг сополимера. Полученную смесь оставляли перемешиваться в течение 30-60 мин при охлаждении с помощью ледяной бани до растворения полимера. После этого к полученному раствору добавляли трифторметансульфокислоту в количестве 100 мкл / 100 мг полимера и оставляли при перемешивании в течение 4-6 ч, после чего в реакционную смесь добавляли диметилформамид. Очистку сополимеров от низкомолекулярных примесей проводили диализом через мембрану с отсекаемой молекулярной массой 1000 против воды в течение 48-96 ч. Полученный полимер лиофильно высушивали.

Получение конъюгатов дексаметазона с синтетическими полипептидами.

Пример 1

К раствору дексаметазона гемисукцината в диметилсульфоксиде добавляли 1.05 мольный избыток N-гидроксисукцинимида (NHS) и 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида (EDC). Реакцию проводили при перемешивании в течение 4 ч при комнатной температуре. Полученный раствор прикапывали к раствору полимера поли(L-лизин-со-DL-фенилаланин) в диметилсульфоксиде (ДМСО) при перемешивании, в объеме, необходимом для достижения соотношения реагентов 50-1000 мкг дексаметазона гемисукцината/ 1 мг полимера и оставляли при перемешивании еще на 16 ч. Непрореагировавшие вещества удаляли диализом, после этого полимер лиофильно высушивали.

Пример 2

К раствору полимера поли((L-глутаминовая кислота)-со-D-фенилаланин) в диметилсульфоксиде добавляли 0.4 эквивалента по отношению к количеству γ-карбоксильных групп полимера NHS и 0.2 эквивалента EDC. Реакцию активации проводили при комнатной температуре в течение 60 мин при перемешивании. После этого к раствору добавляли 0.12 эквивалентов N-Boc-этилендиамина и перемешивали при комнатной температуре в течение 24 ч. К полученному раствору при перемешивании добавляли трифторуксусную кислоту в объеме, необходимом для получения 50% раствора, и смесь оставляли на 4 часа при перемешивании. Непрореагировавшие вещества удаляли диализом, полимер лиофильно высушивали. После этого к раствору полученного полимера прикапывали активированный эфир дексамеазона сукцината, полученного как описано в примере 1, в объеме, необходимом для достижения соотношения реагентов 50-1000 мкг дексаметазона гемисукцината / 1 мг полимера и оставляли при перемешивании еще на 16 ч. Непрореагировавшие вещества удаляли диализом, после этого полимер лиофильно высушивали.

Расчет степени модификации полимера дексаметазоном проводили по данным хроматографического анализа образца после его щелочного гидролиза. Реакцию гидролиза проводили при температуре 40°С в течение 24 часов при перемешивании. Количественное определение дексаметазона проводили методом обращенно-фазовой ВЭЖХ на приборе Shimadzu LC-20AD с УФ-детектированием при 237 нм, используя колонку Grace Smart C18 (размер частиц 5 мкм, размер колонки 4.6⋅150 мм). В качестве подвижной фазы использовали смесь вода:ацетонитрил в соотношении 70:30 по объему. Скорость потока подвижной фазы составляла 0.5 мл/мин.

В качестве альтернативного способа расчета степени модификации полимера дексаметазоном использовали данные, полученные методом ¹Н ЯМР-спектроскопии. Спектры ЯМР регистрировали на приборе Bruker АС-400 на частоте 400.1 МГц при 25°С. Использовали растворы 5-15 мг образцов в 0.6 мл ДМСО-d6. Пик растворителя ДМСО-d6 при 2.52 м.д. в спектре ¹Н-ЯМР использовался для калибровки химических сдвигов спектра.

На Фиг. 12 представлена область ¹Н ЯМР спектра конъюгата дексаметазона с полимером P(Lys-co-DL-Phe)-2, используемая для расчета степени конъюгирования. Соотношение интегральных интенсивностей характеристических сигналов дексаметазона при δ=6.24 м.д. (д., J=11.6 Гц, 1Н), 5.05 (д, J=15.5 Гц, 1Н) и 4.80 (д, J=18.8 Гц, 1Н) и ароматических протонов Phe (δ=6.5-7.3 м.д.) использовались для расчета числа конъюгированных молекул дексаметазона.

Получение полимерных частиц.

Формирование наночастиц проводили диализом раствора амфифильного сополимера в органическом растворителе (диметилсульфоксид) через мембрану с отсекаемой молекулярной массой 1000 против воды в течение 48-96 ч. Затем образцы лиофильно высушивали и хранили при 4°С.

Определение гидродинамического диаметра, ζ-потенциала и индекса полидисперсности частиц проводили на приборе Zetasizer Nano-ZS (Malvern Instrument Ltd., Malvern, Великобритания), при рассеивающем угле 173° и температуре 25°С.

Критическую концентрацию агрегации (ККА) полипептидных частиц определяли методом кондуктометрии с использованием прибора SevenCompact Cond meter S230 (Mettler Toledo, США). Измерения электропроводности проводили при 25°С в воде в диапазоне концентраций полимера 2-62 мкг/мл. ККА определяли как пересечение двух линейных участков графика зависимости электрпроводности от конценрации полимера.

Получение частиц на основе конъюгата дексаметазона с амфифильным полипептидом, связанных с полисахаридом, проводили следующим образом. К раствору гепарина в воде при интенсивном перемешивании добавляли коллоидный раствор частиц в воде в количестве 1 мг частиц / 2 мг гепарина. Несвязавшийся гепарин удаляли ультрафильтрацией через мембрану с отсекаемой молекулярной массой 50000.

Исследование биологических свойств частиц in vitro.

Процесс биодеградации частиц изучали в 0.01 М натрий-фосфатном буферном растворе рН 7.4 (ФБР), содержащем папаин в концентрации 50 мкг/мл. Определяли изменение гидродинамического диаметра частиц в течение 30 дней на приборе Zetasizer Nano-ZS (Malvern Instrument Ltd., Malvern, Великобритания), при рассеивающем угле 173° и температуре 25°С.

Исследование цитотоксичности полимерных частиц проводили с помощью анализа с использованием реагента CellTiter-Blue, основанного на способности живых клеток восстанавливать резаурин во флуоресцентный продукт резоруфин. Образование продукта, количество которого пропорционально количеству жизнеспособных клеток, контролировали флуориметрически (λ_погл=544 нм, λ_фл=590 нм). Эксперимент проводили в 96-луночных планшетах. В каждую лунку высевали 8000 клеток в 100 мкл культуральной среды, содержащей следующие растворы: 79 об.% базальной среды DMEM (Sigma-Aldrich GmbH, Германия) 10 об.% эмбриональной бычьей сыворотки (Biochrom GmbH, Германия) и раствор антибиотиков пенициллина и стрептомицина (Biochrom GmbH, Германия) и культивировали в течение 24 ч. После этого культуральную среду удаляли и добавляли 200 мкл культуральной среды, содержащей частицы, концентрация которых составляла 4-1000 мкг/мл. Клетки инкубировали в течение 24 или 72 ч, после чего среду удаляли и вносили в каждую лунку 100 мкл раствора реагента СТВ в базальной среде (1:10 об.%). Клетки инкубировали в CO₂-инкубаторе в течение 1-3 ч при 37°С и проводили измерения флуоресценции раствора. Для коррекции фона из значений интенсивности флуоресценции растворов лунок, содержащих клетки, вычитали значения интенсивности флуоресценции растворов лунок, не содержащих клетки. Данные нормировали в процентах по отношению к контролю, т.е. интенсивности флуоресценции растворов лунок, содержащих клетки, инкубированных без тестируемых веществ. В пределах одного эксперимента анализ проводился на трех лунках.

Исследование профиля высвобождения дексаметазона.

Для исследования кинетики высвобождения дексаметазона коллоидный раствор частиц инкубировали при температуре 37°С в различных модельных средах: 0.01 М ФБР, рН 7.4, содержащий 0.9% NaCl; витреальная жидкость: 0.01 М ФБР, рН 7.4, содержащий 0.9% NaCl (50:50 об.%). Через определенные промежутки времени отбирали 40 мкл суспензии (1 мг/мл) и определяли количество высвободившегося дексаметазона методом ВЭЖХ как описано ранее.

Как показывают приведенные результаты апробации, заявленное изобретение позволяет получить конъюгаты дексаметазона различного состава, которые формируют в водной среде полимерные частицы с размером до 400 нм, которые просты в получении и имеют контролируемый пролонгированный профиль высвобождения дексаметазона с поддержанием необходимой концентрации в течение продолжительного периода времени, по сравнению с описанными родственными конъюгатами.

Системы доставки дексаметазона на основе конъюгатов дексаметазона с синтетическими амфифильными полипептидами по заявляемому изобретению позволяют улучшить дозирование вещества за счет его постепенного высвобождения без начального взрывного высвобождения, характерного для инкапсулированных форм. Полимерные частицы, полученные по изобретению, могут быть введены в глаз в виде коллоидного раствора через тонкую иглу, в отличие коммерчески доступного имплантата Ozurdex®. Заявляемый способ отличается от коммерчески доступных технологий использованием конъюгатов дексаметазона с синтетическими амфифильными полипептидами для получения системы доставки дексаметазона. Использование полипептидов в качестве полимеров для получения полимерных частиц позволяет получить нетоксичные и способные к биодеградации полимерные частицы, продуктами разложения которых являются нетоксичные аминокислоты.

Наличие в структуре полипептида D-аминокислоты, в свою очередь, существенно уменьшает чувствительность полимеров к ферментативному расщеплению, что позволяет варьировать скорость разложения таких систем варьированием состава исходных полимеров. Таким образом, предложенные соединения могут быть перспективны для получения новых противоспалительных препаратов для лечения глазных заболеваний, в частности, макулярного отека и увеита.

Список используемых источников информации

1. Villanueva, J.; Villanueva, L.; Navarro, M. Pharmaceutical technology can turn a traditional drug, dexamethasone into a first-line ocular medicine. A global perspective and future trends. Int. J. Pharm. 2017, 516, 342-351.

2. Hughes, P.M.; Olejnik, O.; Chang-Lin, J.E.; Wilson, C.G. Topical and systemic drug delivery to the posterior segments. Adv. Drug Deliv. Rev. 2005, 57, 2010-2032.

3. Behl, G.; Iqbal, J.; O'Reilly, N.J.; McLoughlin, P.; Fitzhenry, L. Synthesis and Characterization of Poly(2-hydroxyethylmethacrylate) Contact Lenses Containing Chitosan Nanoparticles as an Ocular Delivery System for Dexamethasone Sodium Phosphate. Pharm. Res. 2016, 33, 1638-1648.

4. Bhagat, R.; Zhang, J.; Farooq, S.; Li, X.Y. Comparison of the release profile and pharmacokinetics of intact and fragmented dexamethasone intravitreal implants in rabbit eyes. J. Ocul. Pharmacol. Ther. 2014, 30, 854-858.

5. Kaur, I.P.; Kakkar, S. Nanotherapy for posterior eye diseases. J. Control. Release 2014, 193, 100-112.

6. Petros, R.A.; DeSimone, J.M. Strategies in the design of nanoparticles for therapeutic applications. Nat. Rev. Drug Discov. 2010, 9, 615-627.

7. Alexis, F.; Pridgen, E.; Molnar, L.K.; Farokhzad, O.C. Factors Affecting the Clearance and Biodistribution of Polymeric Nanoparticles. Mol. Pharm. 2008, 5, 505-515.

8. Muller, P.Y.; Milton, M.N. The determination and interpretation of the therapeutic index in drug development. Nat. Rev. Drug Discov. 2012, 11, 751-761.

9. Shah, A.R.; Xi, M.; Abbey, A.M.; Yonekawa, Y.; Faia, L.J.; Hassan, T.S.; Ruby, A.J.; Wolfe, J.D. Short-term efficacy of intravitreal dexamethasone implant in vitrectomized eyes with recalcitrant diabetic macular edema and prior anti-VEGF therapy. J. Ophthalmic Vis. Res. 2016, 11, 183-187.

10. Jusufbegovic, D.; Schaal, S. Quiescent herpes simplex keratitis reactivation after intravitreal injection of dexamethasone implant. Retin. Cases Br. Reports 2017, 11, 296-297.

11. Патент РФ №2660585 C2. Фармацевтическая композиция для уменьшения осложнений применения стероидных препаратов при лечении офтальмологических заболеваний; 2013.

12. Xu, X.; Sun, L.; Zhou, L.; Cheng, Y.; Cao, F. Functional chitosan oligosaccharide nanomicelles for topical ocular drug delivery of dexamethasone. Carbohydr. Polym. 2020, 227, 115356.

13. Bongiovi, F.; Prima, G. Di; Palumbo, F.S.; Licciardi, M.; Pitarresi, G.; Giammona, G. Hyaluronic Acid-Based Micelles as Ocular Platform to Modutate the Loading, Release, and Corneal Permeation of Corticosteroids. 2017, 1700261, 1-13.

14. Zacchigna, M.; Cateni, F.; Di Luca, G.; Voinovich, D.; Perissutti, В.; Drioli, S.; Bonora, G.M. Synthesis of a new mPEG-dexamethasone conjugate and preliminary bioavailability studies in rabbits. J. Drug Deliv. Sci. Technol. 2008, 18, 155-159.

15. Pang, Y.N.; Zhang, Y.; Zhang, Z.R. Synthesis of an enzyme-dependent prodrug and evaluation of its potential for colon targeting. World J. Gastroenterol. 2002, 8, 913-917.

16. Bhattacharya, M.; Sadeghi, A.; Sarkhel, S.; Hagstrom, M.; Bahrpeyma, S.; Toropainen, E.; Auriola, S.; Urtti, A. Release of functional dexamethasone by intracellular enzymes: A modular peptide-based strategy for ocular drug delivery. J. Control. Release 2020, 327, 584-594 (прототип).

Изобретение относится к области химии высокомолекулярных соединений, фармацевтики и медицины, а именно, к конъюгатам дексаметазона с синтетическими амфифильными полипептидами и полимерным частицам на их основе, которые перспективны для создания новых противовоспалительных препаратов для лечения глазных заболеваний, в частности, макулярного отека и увеита. Конъюгат представляет собой дексаметазон, ковалентно связанный через линкер с синтетическим статистическим полипептидом, и формирует в водной среде полимерные частицы. В одном из вариантов изобретения проводят модификацию конъюгата полисахаридами. Конъюгирование дексаметазона с синтетическими полипептидами способствует его пролонгированному контролируемому высвобождению в витреальной жидкости глаза. 12 ил., 2 табл., 2 пр.

Конъюгат дексаметазона с синтетическим статистическим полипептидом со среднечисловой молекулярной массой от 5000 до 50000, в котором синтетический полипептид является амфифильным и имеет общую формулу поли(X_n-со-Y_m), где

X - заряженная полярная аминокислота, которую выбирают из L-лизина или L-глутаминовой кислоты,

Y - гидрофобная аминокислота, которую выбирают L-фенилаланина, DL-фенилаланина или D-фенилаланина,

n - число повторяющихся звеньев X,

m - число повторяющихся звеньев Y,

и когда X представляет собой L-глутаминовую кислоту мольное соотношение [L-глутаминовая кислота]/[L/DL/D-фенилаланин] равно 0.8-6,

когда X представляет собой L-лизин мольное соотношение [L-лизин]/[L/DL/D-фенилаланин] равно 0.7-10,

дексаметазон связан с полипептидом через линкер и соединен с линкером сложноэфирной связью, с массовой долей конъюгированного дексаметазона 0.5-30%, где конъюгат может быть связан с полисахаридом, выбранным из группы гепарин, каррагинан и хондроитинсульфат, за счет электростатических взаимодействий между аминогруппами конъюгата и карбоксильными и сульфогруппами полисахарида, с массовым соотношением полисахарида к конъюгату равным 1-2.