КОНЪЮГАТЫ ПОЛИГЛУТАМАТ-АМИНОКИСЛОТА И СПОСОБЫ Российский патент 2013 года по МПК C08G69/10 A61K31/198 A61P35/00 

По настоящей заявке испрашивается приоритет согласно заявке США №60/742291 под названием "Полиглутамат-аминокислота и способы", поданной 5 декабря 2005; заявке США №60/757917 под названием "Полиглутамат-аспартат-таксаны", поданной 10 января 2006; и заявке США №60/790735 под названием "Хелаты полиглутамат-аспартат-MRI", поданной 10 апреля 2006, которые все включены в настоящую заявку в качестве ссылки.

ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Область изобретения

Изобретение относится в основном к биологически совместимым водорастворимым полимерам с боковыми функциональными группами и способам их получения, предпочтительно конъюгатам полиглутамат-аминокислота, полезным для различных лекарств, биомолекул и для доставки агентов визуализации.

Описание предшествующуго уровня техники

Для доставки лекарств, биомолекул и агентов визуализации используются различные системы. Например, такие системы включают капсулы, липосомы, микрочастицы, наночастицы и полимеры.

Были изучены и охарактеризованы разнообразные биодеградируемые системы на основе полиэфиров. Полимолочная кислота (PLA), полигликолевая кислота (PGA) и сополимеры полимолочной и гликолевой кислот (PLGA) являются одними из наиболее хорошо охарактеризованных биоматериалов, применяемых для доставки лекарственных веществ. См. Uhrich, K.E.; Cannizzaro, S.М.; Langer, R.S. and Shakeshelf, K.M. "Polymeric Systems for Controlled Drug Release." Chem. Rev. 1999, 99, 3181-3198 и Panyam J, Labhasetwar V. "Biodegradable nanoparticles for drug and gen delivery to cell and tissue." Adv Drug Deliv Rev. 2003, 55, 329-47. Кроме того, при создании полимеров для доставки лекарственных веществ широко использовался 2-гидро-ксипропил-метакрилат (ГПМА). Также были исследованы биодеградируемые системы на основе полиортоэфиров. См. Heller, J.; Barr, Дж.; Ng, S.Y.; Abdellauoi, K.S. and Gurny, R. "Poly (ortho esters): Synthesis, Characterization, properties and uses." Adv. Drug Del. Rev. 2002, 54, 1015-1039. Исследовались полиангидридные системы. Такие полиангидриды являются биологически совместимыми и могут расщепляться или распадаться in vivo на относительно нетоксичные вещества, которые выводятся из организма как метаболиты. См. Kumar, N.; Langer, R.S. and Domb, AJ. "Polyanhydrides: an overview." Adv. Drug Del. Rev. 2002, 54, 889-91.

В качестве потенциальных источников новых биоматериалов рассматривались также полимеры на основе аминокислот. Для доставки соединений с низкой молекулярной массой исследовались полиаминокислоты, имеющие хорошую биологическую совместимость. В качестве кандидатов для доставки лекарств было идентифицировано относительно небольшое число полиглутаминовых кислот и сополимеров. См. Bourke, SX. и Kohn, J. "Polimers derived from the amino acid L-tyrosine: polycarbonates, polyarylates and copolymers poly(ethylene glycol)." Adv. Drug Del. Rev., 2003, 55, 447-466.

Введение гидрофобных противораковых средств и терапевтических белков и полипептидов зачастую имеет недостаток, заключающийся в их низкой биологической доступности. Такая низкая биодоступность может иметь место из-за несовместимости двухфазных растворов гидрофобных лекарственных средств и водных растворов и/или быстрого выведения этих молекул из системы кровообращения за счет ферментативного расщепления. Одним техническим приемом увеличения эффективности вводимых белков и других агентов с маленькими молекулами является конъюгирование вводимого агента с полимером, типа полиэтиленгликоля ("ПЭГ") молекула которого может обеспечить защиту от ферментативного расщепления in vivo. Такое "ПЭГилирование" часто улучшает время кругооброта крови и, следовательно, биодоступность вводимого агента.

Однако ПЭГ в некоторых отношениях имеет определенные недостатки. Например, так как ПЭГ является линейным полимером, предоставляемая им стерическая защита ограничена по сравнению с разветвленными полимерами. Другой недостаток ПЭГ заключается в том, что он способен образовывать производные по двум концевым группам. Это ограничивает ряд других функциональных молекул (например, полезных для доставки к определенным тканям белка или лекарственного средства), которые могут конъюгировать с ПЭГ.

Полигутаминовая кислота (PGA) представляет собой другой полимер для солюбилизации гидрофобных противораковых средств. Сообщалось о многих конъюгированных с ПЭГ лекарственных средствах. См. Chun Li. "Poly(L-glutamic acid)-anticancer drug conjugates." Adv. Drug Del. Rev., 2002, 54, 695-713. Однако в настоящее время ни один не одобрен FDA (Комиссия по контролю за лекарствами и питательными веществами).

Паклитаксел, извлеченный из коры Тихоокеанского Тисового дерева (Wani et al. "Plant antitumor agents. VI. The isolation and structure of taxol, a novel antileukemic and antitumor agent from Taxus brevifolia." J. Am. Chem. Soc. 1971, 93, 2325-7), является одобренным FDA лекарственным средством для лечения рака яичника и рака молочной железы. Однако, подобно другим лекарствам против рака, паклитасел имеет низкую биодоступность из-за его гидрофобности и нерастворимости в водном растворе. Один из способов солюбилизации паклитаксела состоит в том, чтобы приготовить его состав в смеси с Cremophor-EL и обезвоженным этанолом (1:1, вес/вес) (Sparreboom et al. "Cremophor EL-mediated Alteration of Paclitaxel Distribution in Human Blood: Clinical Pharmacokinetic Implication." Cancer reseatch 1999, 59, 1454-1457). Этот состав в настоящее время производится под коммерческим названием Taxol^® (Bristol-Myers Squibb). Другим способом солюбилизации паклитаксела является эмульгирование путем гомогенизации с высоким усилием сдвига (Constantinides et al. "Formulation Development and Antitumor Activity of a Filter-Sterilizable Emulsion Paclitaxel. "Pharmaceutical Research 2000, 17, 175-182). Недавно в нескольких клинических исследованиях были опробованы конъюгаты полимер-паклитаксел (Ruth Duncan "The Dawning era of polymer therapeutics." Nature Reviews Drug Discovery 2003, 2, 347-360). Позже были изготовлены и клинически исследованы составы паклитаксела в виде нано-частиц с человеческим белком альбумином (Damascelli et al. "Intraarterial chemotherapy with polyoxyethylated castor oil free paclitaxel, incorporated in albumin nanoparticles (ABI-007): Phase II study of patients with squamous cell carcinoma of the head and neck and anal canal: preliminary evidence of clinical activity "Cancer. 2001, 92, 2592-602, и (Ibrahim et al. "Phase I and pharmacokinetic study of ABI-007, a Cremophor-free, protein-stabilized, nanoparticle formilation of paclitaxel." Clin Cancer Res. 2002, 8, 1038-44). Этот состав в настоящее время производится под коммерческим названием Abraxane^® (American Pharmaceutical Partners, Inc).

Магнитно-резонансная визуализация (MRI) представляет собой важный инструмент в диагнозе и определении стадии болезни, потому что является неинвазивным и необлучающим методом исследования (см. Bulte et al. "Magnetic resonance microscopy and histology of the CNS. "Trends in Biotechnology 2002, 20, S24-S28). Хотя с помощью этого метода могут быть получены изображения тканей, MRI с контрастными агентами значительно улучшает его разрешающую способность. Однако ионы парамагнитных металлов, подходящие в качестве контрастных агентов для MRI, зачастую ядовиты. Одним из методов снижения токсичности является заключение ионов этих металлов в хелатные комплексы с полидентатными молекулами, типа молекул диэтилентриаминпентаацетата (DTPА). В 1988 году Gd-DTPA был одобрен FDA для клинического использования и в настоящее время производится под коммерческим названием Magnevist^®. FDA были одобрены и производятся в настоящее время другие хелатные комплексы гадолиния (Gd), многие другие находятся в состоянии разработок (см. Caravan et al. "Gadolinium (III) Chelates as MRI Contrast Agents: Structure, Dinamics, and Applications." Chem. Rev 1999, 99, 2293-2352).

Однако Gd-DTPA не идеален для опухолевых тканей мишеней, потому что недостаточно специфичен. Когда Gd-DTPA вводят посредством IV инъекций, он спонтанно и быстро диффундирует во внесосудистую область тканей. Поэтому для получения достаточно контрастного изображения обычно требуются большие количества контрастных агентов. Кроме того, он быстро выводится через почечную фильтрацию. Для того чтобы избежать диффузии и фильтрации, были разработаны макромолекулярные контрастные агенты для MRI (см. Caravan et al. "Gadolinium (III) Chelates as MRI Contrast Agents: Structure, Dinamics, and Applications." Chem. Rev 1999, 99, 2293-2352).

Эти макромолекулярные контрастные агенты для MRI включают бековые хелаты для MRI (см. Lauffer et al. "Preparation and Water Relaxation Properties of Proteins with Paramagnetic Metal Chelates. "Magn. Reson Imaging 1985, 3, 11-16), полисахаридные хелаты для MRI (см. Sirlin et al. "Gadolinium-DTPA-Dextran: A Macromolecular MR Blood Pool Contrast Agent. "Acad Radiol. 2004, 11, 1361-1369) и полимерные хелаты для MRI (см. Lu et al. "Poly(L-glutamic acid) Gd(III)-DOTA Conjugate with a Degradable Spacer for Magnetic Resonance Imaging." Bioconjugate Chem. 2003, 14, 715-719, и Went et al. "Synthesis and Characterization of Poly(L-glutamic acid) Gadolinium Chelate: A New Biodegradable MRI Contrast Agent." Bioconjugate Chem. 2004, 15, 1408-1415.

Недавно были разработаны тканеспецифичные контрастные агенты для MRI (см. Weinmann et al. "Tissue-specific MR contrast agents." Eur. J. Radiol. 2003, 46, 33-44). Однако нет сообщений о клиническом применении опухолеспецифичных контрастных агентах для MRI. Есть сообщения о наночастицах, предназначенных для опухолевых тканей-мишеней за счет эффекта усиленного проникновения и удерживания (EPR) (см. Brannon-Peppas et al. "Nanoparticle and targeted systems for cancer therapy." ADDR 2004, 56, 1649-1659).

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Относительно гидрофобные агенты визуализации и лекарства (типа определенных гидрофобных противораковых лекарственных средств, терапевтических белков и полипептидов) часто обладают низкой биодоступностью. Полагают, что эта проблема возникает по крайней мере частично благодаря плохой растворимости этих агентов визуализации и лекарств в водных системах. Некоторые расщепляющиеся под действием фермента лекарства также обладают низкой биодоступностью, потому что они достаточно быстро расщепляются в системе кровообращения и в результате быстро выводятся из организма

Изобретатели обнаружили ряд новых полиглутамат-аминокислот, которые способны конъюгировать с множеством агентов, таких как агенты визуализации и/или лекарственные средства. В некоторых воплощениях изобретения полимеры и полученные конъюгаты предпочтительно накапливаются в определенных тканях (например, в опухолевых тканях) и поэтому полезны для доставки лекарственных средств (например, противораковых лекарственных средств) и/или агентов визуализации к определенным частям тела (например, к опухоли). В определенных воплощениях изобретения полимеры и полученные полимерные конъюгаты образуют наночастицы, которые эффективно солюбилизируют агент визуализации и/или лекарственное вещество в водных системах, диспергируя их на молекулярном уровне, увеличивая таким образом функциональные возможности и/или биодоступность.

В одном воплощении изобретения описывается полимерный конъюгат, включающий повторяющиеся звенья формулы (I) и повторяющиеся звенья формулы (II) как показано ниже, где: каждый n-независимо представляет 1 или 2; каждый А¹ представляет кислород или NR⁵; каждый А² представляет кислород; R¹ и R² каждый независимо выбирают из группы, состоящей из С_1-10 алкила, С₆-₂₀ арила, аммония, щелочного металла, полидентатного лиганда, предшественника полидентатного лиганда с защищенными атомами кислорода и соединения, которое включает агент; где агент выбирают из группы, состоящей из противоракового лекарственного средства, нацеливающего агента, агента оптической визуализации и агента магнитно-резонансной визуализации; где по крайней мере один из R¹ и R ² представляет собой группу, которая включает агент; R³ и R⁴ каждый независимо выбирают из группы, состоящей из водорода, аммония и щелочного металла; где полимерный конъюгат включает агент в количестве от приблизительно 1 до приблизительно 50% (вес/вес), считая на массовое соотношение агента к полимерному конъюгату; R⁵ представляет водород или С_1-4 алкил; и где количество агента, процент повторяющихся звеньев формулы (I) и процент повторяющихся звеньев формулы (II) выбирают таким образом, чтобы обеспечить полимерному конъюгату растворимость, которая больше растворимости сопоставимого конъюгата полиглутаминовой кислоты, включающего по существу то же самое количество агента, при этом растворимость полимерного конъюгата больше, хотя раствор тестируемого полимерного конъюгата, включающий по крайней мере 5 мг/мл полимерного конъюгата в 0,9 вес.%, водном NaCl, при приблизительно 22°C имеет большую оптическую прозрачность по более широкому диапазону pH, чем оптическая прозрачность сопоставимого раствора теститруемого конъюгата полиглутаминовой кислоты.

Другое воплощение изобретения касается способа получения описанного выше полимерного конъюгата, включающего растворение или частичное растворение полимерного реагента в растворителе с образованием растворенного или частично растворенного полимерного реагента; и взаимодействие растворенного или частично растворенного полимерного реагента со вторым реагентом, где второй реагент включает, по крайней мере, один реагент, выбранный из группы, состоящей из полидентатного лиганда, предшественника полидентатного лиганда с защищенными атомами кислорода, и соединения, которое включает агент.

Другое воплощение изобретения касается фармацевтической композиции, включающей описываемый здесь полимерный конъюгат и далее включающей, по крайней мере один, фармацевтически приемлемый эксципиент, носитель и разбавитель.

Другое воплощение изобретения касается способа лечения или уменьшения симптомов заболевания или состояния, включающего введение эффективного количества описываемого здесь полимерного конъюгата нуждающемуся в этом млекопитающему.

Другое воплощение изобретения касается способа диагностирования заболевания или состояния, включающего введение эффективного количества описываемого здесь полимерного конъюгата млекопитающему.

Другое воплощение изобретения касается применения описываемого здесь полимерного конъюгата для изготовления медикамента для лечения или уменьшения симптомов заболевания или состояния.

Другое воплощение изобретения касается применения описываемого здесь полимерного конъюгата для изготовления медикамента для диагностирования заболевания или состояния.

Эти и другие воплощения изобретения более детально описаны ниже.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР

Фигура 1 иллюстрирует реакционную схему получения поли-(γ-L-аспартил глутамина).

Фигура 2 иллюстрирует реакционную схему получения поли-(γ-L-аспартил глутамин)-поли-L-глутаминовой кислоты.

Фигура 3 иллюстрирует другую реакционную схему получения поли-(γ-L-аспартил глутамина).

Фигура 4 иллюстрирует реакционную схему получения поли-(γ-L-глутамил глутамина).

Фигура 5 иллюстрирует реакционную схему получения поли-(γ-L-аспартил глутамил глутамин)-поли-L-глутаминовой кислоты.

Фигура 6 иллюстрирует реакционную схему получения PGA-97-A-Texas Red.

Фигура 7 иллюстрирует реакционную схему получения PGA-97-A-DTPA.

Фигура 8 иллюстрирует реакционную схему получения PGA-97-A-DTPA-Gd (III).

Фигура 9 иллюстрирует общую реакционную схему получения PGA-А-РТХ.

Фигура 10 иллюстрирует общую реакционную схему получения PGA-G-PTX.

Фигура 11 иллюстрирует химические структуры С2'-паклитаксел-глутаминовой кислоты и С7-паклитаксел-глутаминовой кислоты и времена их ВЭЖХ и LC-MS.

Фигура 15 показывает график, который иллюстрирует концентрации в плазме паклитаксела PGA-44-A-19 и Таксола на опухолях B16F0 меланомы у голых (бестимусных) мышей (nu/nu) в течение долгого времени.

Фигура 16 показывает график, который иллюстрирует концентрации в опухоли паклитаксела PGA-44-A-19 и Таксола на опухолях B16F0 меланомы у голых (бестимусных) мышей (nu/nu) во времени.

Фигура 17 показывает график, который иллюстрирует изменение массы тела (%) после лечения PGA-21-G-20, PGA-32-G-20, Амбраксаном и физиологическим раствором при их соответствующих максимально допустимых дозах на голых (бестимусных) мышах (nu/nu) во времени.

Фигура 18 показывает график, который иллюстрирует противоопухолевое действие PGA-21-G-20, PGA-32-G-20, Амбраксана и физиологического раствора при их соответствующих максимально допустимых дозах на опухоли транформированной EGF меланомы B16F0 на голых (бестимусных) мышах (nu/nu) во времени.

Фигура 19 показывает график, который иллюстрирует изменение массы тела (%) после лечения PGA-97-G-20, Таксолом, Амбраксаном и физиологическим раствором при их соответствующих максимально допустимых дозах на голых мышах (nu/nu) во времени.

Фигура 20 показывает график, который иллюстрирует противоопухолевое действие PGA-97-G-20, Таксола, Амбраксана и физиологического раствора при их соответствующих максимально допустимых дозах на опухоли транформированной EGF меланомы B16F0 на голых мышах (nu/nu) во времени.

Фигура 21 показывает график, который иллюстрирует изменение массы тела (%) после лечения PGA-32-G-20, PGA (32k)-РТХ-20 и физиологическим раствором при их соответствующих максимально допустимых дозах на голых мышах (nu/nu) во времени.

Фигура 22 показывает график, который иллюстрирует противоопухолевое действие PGA-32-G-20, PGA(32k)-PTX-20 и физиологического раствора при их соответствующих максимально допустимых дозах на опухоли транформированной EGF меланомы B16F0 на голых мышах (nu/nu) во времени.

Фигура 23 показывает график, который иллюстрирует высвобождение паклитаксела во времени при концентрации 2 мг на мл конъюгатов полимер-паклитаксел в фосфатных буферах.

Фигура 24 показывает график, который иллюстрирует концентрацию в плазме паклитаксела PGA-21-G-19, PGA-32-G-19, PGA-97-G-24 и Таксола во времени.

Фигура 25 показывает график, который иллюстрирует концентрацию в опухоли паклитаксела PGA-21-G-19, PGA-32-G-19, PGA-97-G-24 и Таксола во времени.

Фигура 26 показывает график, который иллюстрирует эффект накопления в опухоли PGA-97-A-DTPA-Gd (III) и Омнискана™ (гадодимид) на опухоли B16F0 меланомы у голых мышей ню/ню во времени.

Фигура 27 иллюстрирует копию рентгенограммы электронно-микроскопического изображения поверхности излома образа PGA-44-A-20.

Фигура 28 показывает график, который иллюстрирует статическое светорассеивание (степень дисперсности) сравнимых концентраций PGA-44-A-20 и PGA-97-A-20.

Фигура 29 показывает график, который иллюстрирует статическое светорассеивание (степень дисперсности) сравнимых концентраций PGA-21-G-20 и PGA-32-G-20.

ДЕТАЛЬНОЕ ОПИСАНИЕ ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНЫХ ВОПЛОЩЕНИЙ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Термин "сложный эфир" используется здесь в его обычном смысле и таким образом включает химический остаток формулы -(R)_n-COOR', где R и R' независимо выбраны из группы, состоящей из алкила, циклоалкила, арила, гетероарила (связанного через кольцевой атом углерода) и гетероалициклила (связанного через кольцевой атом углерода) и где n равно 0 или 1.

Термин "амид" используется здесь в его обычном смысле и таким образом включает химический остаток формулы -(R)_n-C(O)NHR' или -(R)_n-NHC(O)R', где R и R' независимо выбраны из группы, состоящей из алкила, циклоалкила, арила, гетероарила (связанного через кольцевой атом углерода) и гетероалициклила (связанного через кольцевой атом углерода) и где n равно 0 или 1. Амид может быть включен в аминокислотную или пептидную молекулу, связанную с молекулой лекарства как здесь описано, образуя, таким образом, пролекарство.

Любой амин, гидроксил или карбоксил в боковой цепи описываемых здесь соединений может быть этерифицирован или амидирован. Способы и используемые для их осуществления определенные группы известны специалистам и легко могут быть найдены в соответствующих литературных источниках, типа Greene and Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 3^rd Ed., John Wiley and Suns, New York, NY, 1999, который включен сюда полностью в качестве ссылки.

Используемый здесь термин "алкил" относится к прямой или разветвленной углеводородной цепи, которая включает полностью насыщенные (отсутствие двойных или тройных связей) углеводородные группы. Алкильная группа может иметь 1-20 атомов углерода (это означает, что числовой диапазон, типа "1-20" относится к каждому целому числу в данном диапазоне; например, "1-20 атомов углерода" означает, что алкильная группа может состоять из 1 атома углерода, 2 атомов углерода, 3 атомов углерода и т.д., до, включая 20 атомов углерода, хотя настоящее определение также охватывает и те случаи термина "алкил", где никакой числовой диапазон не определен). Алкильная группа может также быть среднего размера и иметь 1-10 атомов углерода. Алкильная группа может также быть низшим алкилом, имеющим 1-5 атомов углерода. Алкильная группа соединений может определяться как "C₁-C₄ алкил" или через подобные обозначения. Например, "С_1-С₄ алкил" означает, что в алкильной цепи имеется от одного до четырех атома углерода, то есть алкильную цепь выбирают из группы, состоящей из метила, этила, пропила, изопропила, н-бутила, изо-бутила, втор-бутила и трет-бутила. Типичные алкильные группы включают, но никоим образом не ограничиваются ими, метил, этил, пропил, изопропил, бутил, изобутил, третичный бутил, пентил, гексил и т.п.

Алкильная группа может быть замещенной или незамещенной. В случае, когда алкильная группа является замещенной, замещающая(щие) группа(ы) может(гут) быть одна или более групп, индивидуально и независимо выбранными из алкенила, алкинила, циклоалкила, циклоалкенила, циклоалкинила, арила, гетероарила, гетероалициклила, аралкила, гетероаралкила, (гетероалициклил)алкила, гидрокси, защищенного гидроксила, алкокси, арилокси, ацила, сложноэфирной группы, меркапто, алкилтио, арилтио, циано, галогена, карбонила, тиокарбонила, О-карбамила, N-карбамила, О-тиокарбамила, N-тиокарбамила, С-амидо, N-амидо, S-сульфонамидо, N-сульфонамидо, С-карбокси, защищенного С-карбокси, О-карбокси, изоцианато, тиоцианато, изотиоцианато, нитро, силила, сульфенила, сульфинила, сульфонила, галоидного алкила, галоидного алкоксила, тригалометилсульфонила, тригалометилсульфонамида и амина, включая моно- и ди-замещенные аминогруппы, и их защищенные производные. Везде, где заместитель описывается как "необязательно замещенный", это означает, что заместитель может быть замещен одним из вышеупомянутых заместителей.

"Хелатный комплекс парамагнитного металла" представляет собой комплекс, где лиганд связан с ионом парамагнитного металла. Примеры включают, но не ограничиваются ими, 1,4,7,10-тераазациклододекан-1,4,7,10-тетрауксусную кислоту (DOTA)-Gd (III), DOТА-иттрий-88, DOTA-индий-111, диэтилентриаминпентауксусная кислота (DTPA)-Gd (III), DTPA-иттрий-88, DTPA-индий-111.

"Полидентатный лиганд" является лигандом, который может связываться через две или больше точек присоединения с ионом металла посредством, например, координационно-ковалентных связей. Примеры полидентатных лигандов включают, но не ограничиваются ими, диэтилентриаминпентауксусную кислоту (DTPА), тераазациклододекан-1,4,7,10-тетрауксусную кислоту (DOTA), (1,2-этандиилдининитрил)тетраацетат (EDTA), этилендиамин, 2,2'-бипиридин (бипи), 1,10-фенантролин (фен), 1,2-бис(дифенилфосфино)этан (DPPE), 2,4-пентандион (асас) и этандиоат (ох).

"Предшественник полидентатного лиганда с защищенными атомами кислорода" является полидентатным лигандом, включающим атомы кислорода, типа атомов кислорода карбоксильных групп с одной связью, которые защищены подходящими защитными группами. Подходящие защитные группы включают, но не ограничиваются ими, низшие алкильные, бензильные и силильные группы.

Описывается полимерный конъюгат, включающий повторяющееся звено формулы (I) и повторяющееся звено формулы (II):

где каждый n - независимо равен 1 или 2, каждый А¹ представляет кислород или NR⁵, каждый А² представляет кислород; R¹ и R² каждый независимо выбирают из группы, состоящей из С_1-10алкила, С_6-20 арила, аммония, щелочного металла, полидентатного лиганда, предшественника полидентатного лиганда с защищенными атомами кислорода и соединения, которое включает агент. Примеры щелочного металла включают литий (Li), натрий (Na), калий (K), рубидий (Rb) и цезий (Cs). В воплощении изобретения щелочной металл представляет собой натрий.

Агент может включить любое число активных соединений. Например, агент может быть выбран из группы, состоящей из противоракового средства, нацеливающего агента, агента оптической визуализации и агента магнитно-резонансной визуализации. По крайней мере одна из групп R¹ и R² является группой, которая включает агент. Повторяющееся звено формулы (II) может включать или может не включать агент. В воплощении изобретения R³ и R⁴ каждый независимо выбирают из группы, состоящей из водорода, аммония и щелочного металла. В другом воплощении изобретения R⁵ представляет собой или водородный атом или С₁-₄алкильную группу.

Количество присутствующего в конъюгате агента может менятся в широком диапазоне. В воплощении изобретения полимерный конъюгат включает агент в количестве от приблизительно 1 до приблизительно 50% (вес/вес), считая на массовое соотношение агента к полимерному конъюгату. В другом воплощении изобретения полимерный конъюгат включает агент в количественном диапазоне от приблизительно 5 до приблизительно 40% (вес/вес), считая на массовое соотношение агента к полимерному конъюгату.

В другом воплощении изобретения полимерный конъюгат включает агента в количественном диапазоне от приблизительно 10 до приблизительно 30% (вес/вес), считая на массовое соотношение агента к полимерному конъюгату.

Найдено, что количество агента и процентные количества повторяющихся звеньев формулы (I) и формулы (II) могут выбираться таким образом, чтобы полезно регулировать растворимость полученного полимерного конъюгата. Например, в предпочтительных воплощениях изобретения количество агента и процентные количества повторяющихся звеньев формулы (I) и формулы (II) выбирают таким образом, чтобы полимерный конъюгат был растворим (или нерастворим) при особенном pH и/или интересующем pH. В некоторых воплощениях изобретения молекулярный вес полимера также выбирают таким образом, чтобы регулировать растворимость. Приведенные ниже примеры иллюстрируют контроль над растворимостью путем соответствующего выбора количества агента, процентного количества повторяющихся звеньев формулы (I) и формулы (II) и молекулярного веса. Квалифицированный в данной области специалист, на основании приведенных здесь сведений, может использовать обычный эксперимент, чтобы определить соответствующие количества агента и процентные количества повторяющихся звеньев формулы (I) и формулы (II), которые приводят к полимерному конъюгату с желаемой растворимостью. В зависимости от применения такой контроль над растворимостью может быть полезным. Например, в соответствии с изобретением описываемые здесь полимерные конъюгаты могут использоваться для того, чтобы обеспечить улучшенную доставку иначе плохо растворимых противораковых лекарственных средств к выбранным тканям, предпочтительно сокращая нежеланные побочные эффекты и/или возможно уменьшая частоту, с которой пациент должен принимать противораковый препарат.

Количество агента и процентные количества повторяющихся звеньев формулы (I) и формулы (II) предпочтительно выбирают таким образом, чтобы обеспечить полимерному конъюгату растворимость, которая больше, чем растворимость сопоставимого конъюгата полиглутаминовой кислоты, включающего по существу то же самое количество агента. В воплощении изобретения растворимость полимерного конъюгата больше, чем растворимость сопоставимого конъюгата полиглутаминовой кислоты. Растворимость измеряют путем формирования раствора полимерного конъюгата, включающего по крайней мере 5 мг/мл полимерного конъюгата в 0.9 вес.% водном NaCl, при приблизительно 22°C, и определения оптической прозрачности. Оптическая прозрачность может быть определена турбидиметрически, например, визуальным наблюдением или с помощью соответствующих известных специалистам в данной области приборов. Сравнение полученной растворимости с аналогичным образом приготовленным раствором полиглутаминового конъюгата показывает улучшенную растворимость, о чем свидетельствует большая оптическая прозрачность по более широкому диапазону pH. Таким образом, растворимость полимерного конъюгата больше, чем растворимость сопоставимого конъюгата полиглутаминовой кислоты, включающего по существу то же самое количество агента, хотя раствор тестируемого полимерного конъюгата, включающий по крайней мере 5 мг/мл полимерного конъюгата в 0,9 вес.% водном NaCl, при приблизительно 22°C имеет большую оптическую прозрачность по более широкому диапазону pH, чем прозрачность сопоставимого раствора тестируемого конъюгата полиглутаминовой кислоты. Квалифицированному специалисту ясно, что "сопоставимый" конъюгат полиглутаминовой кислоты представляет собой контрольный материал, в котором полимерная часть конъюгата имеет молекулярный вес, который является приблизительно таким же, что и молекулярный вес полимерного конъюгата настоящего изобретения (включающего повторяющиеся звенья формулы (I) и повторяющиеся звенья формулы (II)), с которым производится сравнение.

Полимерный конъюгат может содержать один или более хиральных атомов углерода. Хиральный атом углерода (который может быть обозначен символом*) может иметь правостороннюю (правовращающий) или левостороннюю (левовращающий) конфигурацию и таким образом повторяющееся звено может представлять собой рацемат, энантиомер или быть энантимерно обогащенным. Используемые здесь символы "n" и "*" (обозначение хирального углерода) имеют указанное выше значение, если не указано иначе.

Полимеры, включающие повторяющееся звено формулы (I) и повторяющееся звено формулы (II), представляют собой сополимеры, включающие два или более различных повторяющихся звеньев формулы (I) и формулы (II). Далее, полимеры, включающие повторяющееся звено формулы (I) и повторяющееся звено формулы (II), могут быть сополимерами, которые включают другие повторяющиеся звенья, которые не описываются ни формулой (I) ни формулой (II). Число повторяющихся звеньев формулы (I) и повторяющихся звеньев формулы (II) в полимере не ограничено, но находится предпочтительно в диапазоне от приблизительно 50 до приблизительно 5000, и более предпочтительно от приблизительно 100 до приблизительно 2000.

В полимерный конъюгат с повторяющимся звеном формулы (I) и повторяющимся звеном формулы (II) может быть включено большое разнообразие других повторяющихся звеньев. В воплощении изобретения полимерный конъюгат далее включает повторяющееся звено формулы (III):

где группа R⁶ представляет собой водород, аммоний или щелочной металл. Когда R⁶ представляет собой водород, тогда повторяющееся звено формулы (III) представляет собой повторяющееся звено глутаминовой кислоты.

Соединение, которое включает агент, может быть конъюгировано с полимером множеством различных способов. В одном воплощении изобретения соединение, которое включает агент, может быть непосредственно присоединено к повторяющемуся звену. В другом воплощении изобретения соединение, которое включает агент, далее включает линкерную группу. Линкерная группа - это группа, которая присоединяет агент (или соединение, которое включает агент) к полимеру. Линкерная группа может быть относительно небольшой. Например, линкерная группа может включать амин, амид, простой эфир, сложный эфир, гидроксильную группу, карбонильную группу или тиольную группу. Кроме того, линкерная группа может быть сравнительно большой. Например, линкерная группа может включать алкильную группу, алкоксильную группу, арильную группу, арил(С_1-6 алкильную) группу, гетероарильную группу или гетероарил (C_1-6 алкильную) группу.

Агент может включать активное соединение любого типа. В воплощении изобретения агент может представлять собой агент оптической визуализации. В предпочтительном воплощении изобретения агент оптической визуализации может быть одним или более, выбранным из группы, состоящей из акридинового красителя, кумаринового красителя, родаминового красителя, ксантенового красителя, цианинового красителя и пиренового красителя. Например, определенные агенты оптической визуализации могут включать краситель Texas Red, краситель Alexa Fluor®, краситель BODIPY^®, Fluorescein, краситель Oregon Creen® и краситель Rhodamine Green™, которые являются коммерчески доступными или легко могут быть получены известными специалистам методами.

В другом воплощении изобретения агент включает противораковое средство. В воплощении изобретения противораковое средство может быть выбрано из группы, состоящей из таксана, камтотецина и доксорубицина. Когда агент включает таксан, предпочтительно, чтобы таксан представлял собой паклитаксел или доцетаксел. Паклитаксел может быть конъюгирован с повторяющимся звеном формулы (I) или повторяющимся звеном формулы (II) по атому кислорода через С2'-углерод паклитаксела. Кроме того, паклитаксел может конъюгировать с повторяющимся звеном формулы (I) или повторяющимся звеном формулы (II) по атому кислорода через С7-углерод паклитаксела.

В другом воплощении изобретения агент включает агент для магнитно-резонансной визуализации. В воплощении изобретения агент для магнитно-резонансной визуализации включает соединение парамагнитного металла. Например, агент для магнитно-резонансной визуализации может включать соединение Gd (III). В таком случае соединением Gd (III) может быть:

В другом воплощении изобретения агент включает полидентатный лиганд. В воплощении изобретения полидентатный лиганд может быть способным к реакции с парамагнитным металлом с образованием агента для магнитно-резонансной визуализации. Например, полидентатный лиганд может включать несколько карбоксильных и/или карбоксилатных групп. В воплощении изобретения полидентатный лиганд включает соединение следующей структуры:

где каждый R⁷ независимо представляет водород, аммоний или щелочной металл.

В другом воплощении изобретения агент включает предшественник полидентатного лиганда. В таком воплощении изобретения атомы кислорода полидентатного лиганда защищены подходящей защитной группой. Подходящие защитные группы включают, но не ограничиваются ими, низшие алкильные, бензильные и силильные группы. Одним примером предшественника полидентатного лиганда, имеющего защитные группы, является следующее соединение:

Процент повторяющихся звеньев формулы (I) в полимерном конъюгате, считая на общее количество повторяющихся звеньев, может меняться в широком диапазоне. В воплощении изобретения полимер может включить приблизительно от 1 мол.% до приблизительно 99 мол.% повторяющихся звеньев формулы (I), считая на общее число молей повторяющихся звеньев формул (I) и (II). В другом воплощении изобретения полимер может включать приблизительно от 1 мол.% до приблизительно 50 мол.% повторяющихся звеньев формулы (I), считая на общее число молей повторяющихся звеньев формул (I) и (II). В другом воплощении изобретения полимер может включать приблизительно от 1 мол.% до приблизительно 30 мол.% повторяющихся звеньев формулы (I), считая на общее число молей повторяющихся звеньев формул (I) и (II). В другом воплощении изобретения полимер может включать приблизительно от 1 мол.% до приблизительно 20 мол.% повторяющихся звеньев формулы (I), считая на общее число молей повторяющихся звеньев формул (I) и (II). В другом воплощении изобретения полимер может включать приблизительно от 1 мол.% до приблизительно 10 мол.% повторяющихся звеньев формулы (I), считая на общее число молей повторяющихся звеньев формул (I) и (II).

В дополнение к повторяющимся звеньям формул (I) и (II) полимерный конъюгат может включать разнообразные другие повторяющиеся звенья. Например, в воплощении изобретения полимерный конъюгат включает повторяющиеся звенья формулы (III). Процент повторяющихся звеньев формулы (I), считая на общее число молей повторяющихся звеньев в полимерном конъюгате, включающем повторяющиеся звенья (I), (II) и (III), может меняться по очень широкому диапазону. В воплощении изобретения полимерный конъюгат может включать приблизительно от 1 мол.% до приблизительно 99 мол.% повторяющихся звеньев формулы (I), считая на общее число молей повторяющихся звеньев формул (I), (II) и (III). В другом воплощении изобретения полимерный конъюгат может включать приблизительно от 1 мол.% до приблизительно 50 мол.% повторяющихся звеньев формулы (I), считая на общее число молей повторяющихся звеньев формул (I), (II) и (III). В другом воплощении изобретения полимерный конъюгат может включать приблизительно от 1 мол.% до приблизительно 30 мол.% повторяющихся звеньев формулы (I), считая на общее число молей повторяющихся звеньев формул (I), (II) и (III). В другом воплощении изобретения полимерный конъюгат может включать приблизительно от 1 мол.% до приблизительно 20 мол.% повторяющихся звеньев формулы (I), считая на общее число молей повторяющихся звеньев формул (I), (II) и (III). В другом воплощении изобретения полимерный конъюгат может включать приблизительно от 1 мол.% до приблизительно 10 мол.% повторяющихся звеньев формулы (I), считая на общее число молей повторяющихся звеньев формул (I), (II) и (III).

В воплощении изобретения по крайней мере одно «n» в повторяющемся звене формулы (I) и в повторяющемся звене формулы (II) равно 1.

В другом воплощении изобретения по крайней мере один «n» в повторяющемся звене формулы (I) и в повторяющемся звене формулы (II) равно 2.

В воплощении изобретения количество агента, процент повторяющихся звеньев формулы (I) и процент повторяющихся звеньев формулы (II) в полимерном конъюгате выбирают таким образом, чтобы обеспечить полимерному конъюгату растворимость, которая больше, чем растворимость сопоставимого конъюгата полиглутаминовой кислоты, включающего по существу то же самое количество агента. Диапазон pH, при котором полимерный конъюгат, включающий повторяющиеся звенья формулы (I) и формулы (II), имеет большую растворимость, чем растворимость сопоставимого конъюгата полиглутаминовой кислоты, может быть узким или широким. Как отмечено выше, растворимость измеряют путем формирования раствора полимерного конъюгата, включающего по крайней мере 5 мг/мл полимерного конъюгата в 0,9 вес.% водном NaCl, при приблизительно 22°C, и определения оптической прозрачности. В воплощении изобретения полимерный конъюгат растворим в диапазоне pH по крайней мере приблизительно 3. В другом воплощении изобретения полимерный конъюгат растворим в диапазоне pH по крайней мере приблизительно 8. В другом воплощении изобретения полимерный конъюгат растворим в диапазоне pH по крайней мере приблизительно 9. В другом воплощении изобретения диапазон pH, при котором полимерный конъюгат является растворимым, составляет, по крайней мере, одну величину pH в диапазоне от приблизительно 2 до приблизительно 5, например, при pH 2, pH 3, pH 4 и/или pH 5. Предпочтительно, диапазон pH, при котором полимерный конъюгат является растворимым, шире, чем диапазон pH, при котором растворим сопоставимый конъюгат полиглутаминовой кислоты. Например, в воплощении изобретения полимерный конъюгат растворим при более широком диапазоне pH по крайней мере приблизительно на одно значение pH, предпочтительно на два значения pH, чем диапазон pH, при котором растворим сопоставимый конъюгат полиглутаминовой кислоты.

Количество находящегося в растворе полимерного конъюгата для измерения растворимости также может очень меняться. В одном воплощении изобретения растворимость измеряют, когда раствор тестируемого полимерного конъюгата включает, по крайней мере, приблизительно 5 мг/мл полимерного конъюгата. В другом воплощении изобретения растворимость измеряют, когда раствор тестируемого полимерного конъюгата включает, по крайней мере, приблизительно 10 мг/мл полимерного конъюгата. В другом воплощении изобретения растворимость измеряют, когда раствор тестируемого полимерного конъюгата включает, по крайней мере, приблизительно 25 мг/мл полимерного конъюгата. В другом воплощении изобретения растворимость измеряют, когда раствор тестируемого полимерного конъюгата включает, по крайней мере, приблизительно 100 мг/мл полимерного конъюгата. В другом воплощении изобретения растворимость измеряют, когда раствор тестируемого полимерного конъюгата включает, по крайней мере, приблизительно 150 мг/мл полимерного конъюгата. Квалифицированный специалист понимает, что сопоставимый конъюгат полиглутаминовой кислоты тестируется при приблизительно той же концентрации, что и тестируемый полимерный конъюгат.

Полимеры, включающие повторяющееся звено формулы (I) и повторяющееся звено формулы (II), могут быть получены различными способами. В воплощении изобретения полимерный реагент растворяют или частично растворяют в растворителе до образования растворенного или частично растворенного полимерного реагента. Затем растворенный или частично растворенный полимерный реагент реагируется со вторым реагентом с образованием промежуточного продукта или, в некоторых воплощениях изобретения, полимера, включающего повторяющееся звено формулы (I) и повторяющееся звено формулы (II).

Полимерный реагент может включать любой подходящий материал, способный образовывать полимер, включающий повторяющееся звено формулы (I) и повторяющееся звено формулы (II). В воплощении изобретения полимерный реагент включает повторяющееся звено формулы (IV):

где каждый «n» - независимо составляет 1 или 2, каждый А³ представляет кислород и R⁷ и R⁸ каждый независимо выбирают из группы, состоящей из водорода, аммония, и щелочного металла.

В воплощении изобретения полимерный реагент может включать повторяющееся звено формулы (V):

где R⁹ - водород, аммоний или щелочной металл.

Второй реагент может представлять собой разные соединения. В воплощении изобретения второй реагент включает по крайней мере один, выбранный из группы, состоящей из полидентатного лиганда, предшественника полидентатного лиганда с защищенными атомами кислорода и соединения, которое включает агент. В воплощении изобретения второй реагент может включать заместитель. Заместитель может быть выбран из группы, состоящей из гидрокси и амина.

В воплощении изобретения второй реагент включает соединение, которое включает агент. Агент может быть любым активным соединением. Например, соединение, которое включает агент, может быть выбрано из группы, состоящей из противоракового средства, нацеливающего агента, агента оптической визуализации и агента магнитно-резонансной визуализации. В воплощении изобретения агент оптической визуализации может быть выбран из группы, состоящей из акридинового красителя, кумаринового красителя, родаминового красителя, ксантенового красителя, цианинового красителя и пиренового красителя. В другом воплощении изобретения противораковое средство может быть выбрано из группы, состоящей из таксана, камтотецина и доксорубицина. В предпочтительном воплощении изобретения противораковое средство может включать таксан и таксан может быть выбран из группы, состоящей из паклитаксела и доцетаксела.

Паклитаксел может быть конъюгирован с повторяющимся звеном формулы (I) или повторяющимся звеном формулы (II) по атому кислорода, связанному с С2'-углеродом паклитаксела. Кроме того, паклитаксел может конъюгировать с повторяющимся звеном формулы (I) или повторяющимся звеном формулы (II) по атому кислорода, связанному С7-углеродом паклитаксела.

В другом воплощении изобретения агент включает агент для магнитно-резонансной визуализации. В воплощении изобретения агент для магнитно-резонансной визуализации включает соединение парамагнитного металла. Преимущественно, соединение, которое включает агент, включает соединение Gd (III). В таком случае соединением Gd (III) может быть:

В другом воплощении изобретения полидентатный лиганд может быть конъюгирован с полимером. Можно использовать любой подходящий лиганд. В воплощении изобретения полидентатный лиганд может быть способным к реакции с парамагнитным металлом с образованием агента для магнитно-резонансной визуализации. Например, полидентатный лиганд может включать несколько карбоксильных и/или карбоксилатных групп. Например, полидентатный лиганд может включать несколько карбоксильных и/или карбоксилатных групп. Например, с полимером может быть конъюгирован полидентатный лиганд следующей структуры:

где каждый R⁷ независимо представляет водород, аммоний или щелочной металл.

В другом воплощении изобретения предшественник полидентатного лиганда, имеющий защитные группы, может быть конъюгирован с полимером. Такой предшественник имеет свой атом кислорода, который защищен соответствующей защитной группой. Соответствующие защитные группы включают, но не ограничиваются ими, низшие алкильные, бензильные и силильные группы. Одним примером предшественника полидентатного лиганда, имеющего защитные группы, является следующее соединение:

В воплощении изобретения способ получения полимерного конъюгата включает реакцию растворенного или частично растворенного полимерного реагента со вторым реагентом в присутствии агента сочетания. Может использоваться любой подходящий агент сочетания. В воплощении изобретения агент сочетания выбирают из группы, состоящей из 1-этил-3-(3-диметил-аминопропил)-карбодиимида (EDC), 1,3-дициклогексил карбодиимида (DCC), 1,1'-карбонил-диимидазола (CDI), N,N'-дисукцинимидил карбоната (DSC), N-[(диметиламино)-1Н-1,2,3-триазоло-[4,5-b]пиридин-1-ил-метилен]-N-метилметанаммоний гексафторфосфат N-оксида (HATU), 2-[(1Н-бензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметиламмоний гексафторфосфата (HBTU), 2-[(6-хлор-1Н-бензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметиламмоний гексафторфосфата (НСТ-U), бензотриазол-1-ил-окси-трис-пирролидин-фосфоний гексафторфосфата (РуВОР^®), бром-трис-пирролидин-фосфоний гексафторфосфата (РуВrоР^®), 2-[(1Н-бензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметиламмоний тетрафторбората (TBTU) и бензотриазол-1-ил-окси-трис-(диметиламино)фосфоний гексафторфосфата (ВОР).

Может использоваться любой подходящий растворитель, который позволяет осуществлять реакцию. В воплощении изобретения растворитель может быть полярным апротонным растворителем. Например, растворитель может быть выбран из группы, состоящей из N,N-диметилформамида (ДФА), диметилсульфоксида (ДМСО), N-метил-2-пиридон (NMP) и N,N-диметил-ацетамид (ДМА).

В другом воплощении изобретения реакция может далее включать взаимодействие растворенного или частично растворенного полимерного реагента в присутствии катализатора. Может использоваться любой катализатор, который стимулирует реакцию. В воплощении изобретения катализатор может включать 4-диметиламинопиридин (ДМАП).

В воплощении изобретения полимер, включающий повторяющееся звено формулы (I) и повторяющееся звено формулы (II), может быть получен исходя из полиглутаминовой кислоты и аминокислоты типа аспарагиной и/или глутаминовой кислоты. Альтернативно, в другом воплощении изобретения полимер может быть получен первым преобразованием исходной полиглутаминовой кислоты в ее солевую форму. Полиглутаминовая солевая форма может быть получена взаимодействием полиглутаминовой кислоты с подходящим основанием, например, бикарбонатом натрия. Аминокислотная часть может быть присоединена к боковой карбоксильной группе полиглутаминовой кислоты. Средний молекулярный вес полиглутаминовой кислоты не ограничен, но предпочтительно составляет от приблизительно 10000 до приблизительно до 500000 дальтон, более предпочтительно от приблизительно 25000 до приблизительно до 300000 дальтон. Эта реакция может использоваться для получения поли-(γ-L-аспартил-глутамина) или поли-(γ-L-глутамил-глутамина).

В воплощении изобретения аминокислоту перед присоединением к полиглутаминовой кислоте защищают защитной группой. Один пример подходящей для этой реакции защищенной части аминокислоты представлет собой гидрохлорид дитретбутилового эфира L-аспарагиновой кислоты, показанный ниже:

Гидрохлорид ди-трет-бутилового эфира L-аспарагиновой кислоты

Реакцию полиглутаминовой кислоты с аминокислотой можно проводить в присутствии любого подходящего растворителя. В воплощении изобретения растворитель может быть апротонным растворителем. В предпочтительном воплощении изобретения растворитель представляет собой N,N'-диметилформамид.

В воплощении изобретения может использоваться агент сочетания, такой как EDC, DCC, CDI, DSC, HATU, HBTU, HCTU, РуВОР^®, РуВrоР^®, TBTU и ВОР. В других воплощениях изобретения взаимодействие полиглутаминовой кислоты с аминокислотой можно осуществлять с использованием катализатора (например, ДМАП).

После завершения реакции, в случае если атомы кислорода аминокислоты были защищены, защитные группы могут быть удалены известными методами, например используя подходящую кислоту (например, трифторуксусную кислоту). В случае необходимости, солевая форма полимера, полученного реакцией полиглутаминовой кислоты с аминокислотой, может быть образована обработкой кислотной формы полимера подходящим раствором основания, например раствором бикарбоната натрия.

Полимер может быть регенерирован и/или очищен известными методами. Например, растворитель может быть удален подходящими методами, например, с помощью роторного испарителя. Дополнительно, для того, чтобы вызвать осаждение реакционную смесь можно профильтровать в кислый водный раствор. Полученный осадок можно отфильтровать и промыть водой.

В воплощении изобретения полимер, включающий повторяющееся звено формулы (I) и повторяющееся звено формулы (II), может также включать повторяющееся звено формулы (III), как указано выше. Один метод получения полимера, включающего повторяющиеся звенья формул (I), (II) и (III), заключается во взаимодействии полиглутаминовой кислоты с аминокислотой типа аспарагиновой и/или глутаминовой кислоты, в количестве менее 1,0 эквивалента аминокислоты по отношению к полиглутаминовой кислоте. Например, в одном воплощении изобретения, 0.7 эквивалентов аминокислоты, считая на полиглутаминовую кислоту, могут реагировать с полиглутаминовой кислотой, так, чтобы приблизительно 70% повторяющихся звеньев получающегося полимера включали аминокислоту. Как указывалось выше, атомы кислорода аминокислоты могут быть защищены, используя подходящую защитную группу. В воплощении изобретения аминокислота может быть L-аспарагиновой кислотой или L-глутаминовой кислотой. В другом воплощении изобретения атомы кислорода аминокислоты могут быть защищены трет-бутильной группой. Если атомы кислорода аминокислоты защищены, защитные группы могут быть удалены известными методами, типа подходящей кислоты (например, трифторуксуная кислота).

Конъюгирование группы, включающей агент, полидентатного лиганда и/или предшественника полидентатного лиганда с защищенными атомами кислорода с полимерной кислотой или ее солевой формой, может быть выполнено различными способами, например, путем ковалентного связывания группы, включающей агент, полидентатного лиганда и/или предшественника полидентатного лиганда с защищенными атомами кислорода с различными полимерам. Один метод конъюгирования вышеупомянутых групп с полимером, полученным из полиглутаминовой кислоты и/или соли, заключается в использовании нагревания (например, нагревание с помощью микроволнового метода). Конъюгирование также может иметь место при комнатной температуре. Для образования полимерного конъюгата могут использоваться общеизвестные в данной области соответствующие растворители, агенты сочетания, катализаторы и/или буферы и/или описанные здесь. Для формирования полимерного конъюгата в качестве исходного материала могут использоваться полиглутаминовая кислота и солевая или кислотная форма полимера, полученного из полиглутаминовой кислоты и/или ее соли и аминокислоты.

Подходящие агенты, которые могут быть конъюгированы с полимером, полученным из полиглутаминовой кислоты и/или ее соли и аминокислоты, включают, но не ограничиваются ими, оптические агенты, противораковые средства, нацеливающие агенты, агенты для магнитно-резонансной визуализации (например, соединения парамагнитных металлов), полидентатные лиганды и/или предшественники полидентатных лигандов с защищенными атомами кислорода.

В одном воплощении изобретения полимер, полученный из полиглутаминовой кислоты и/или ее соли и аминокислоты, может быть конъюгирован с оптическим агентом. В воплощении изобретения оптическим агентом может быть Техас Red-NH₂.

В одном специфическом воплощении изобретения полимер, включающий по крайней мере одно повторяющееся звено формулы (I) и по крайней мере одно повторяющееся звено формулы (II), может реагировать с DCC, красителем Техас Red-NH₂, пиридином и 4-диметиламинопиридином. Смесь нагревают, используя микроволновое излучение. В воплощении изобретения реакционную смесь нагревают до температуры в диапазоне приблизительно 100-150°C. В другом воплощении изобретения время нагревания составляет от 5 до 40 минут. Если желательно, реакционная может быть охлаждена до комнатной температуры. Для выделения и/или очистки полимерного конъюгата могут использоваться известные в данной области методы. Например, реакционную смесь можно профильтровать в кислый водный раствор. Любой полученный осадок можно отфильтровать и промыть водой. Необязательно, осадок может быть очищен любым подходящим методом. Например, осадок может быть перенесен в ацетон и растворен, полученный раствор может быть снова профильтрован в раствор бикарбоната натрия. В случае необходимости полученный реакционный раствор может быть подвергнут диализу в воде, используя целлюлозную мембрану, и полимер может быть лиофилизирован и выделен.

Конъюгаты, включающие краситель Техас Red, могут использоваться для доставки агента визуализации к выбранной ткани, как показано ниже. Описанные выше полимеры могут быть сформированы в наночастицы в водном растворе, например, как показано ниже.

В одном воплощении изобретения полимер, полученный из полиглутаминовой кислоты и/или ее соли и аминокислоты, может быть конъюгирован с противораковым лекарственным средством. В воплощении изобретения противораковым лекарственным средством может быть таксан, камптотецин и/или доксорубицин. В предпочтительном воплощении изобретения противораковым лекарственным средством является таксан, типа паклитаксела или доцетаксела.

В воплощении изобретения конъюгированным с полимером противоопухолевым лекарственным средством является паклитаксел. В воплощении изобретения паклитаксел может быть присоединен к полимеру по С2'-кислородному атому. В другом воплощении изобретения полимерная цепь включает паклитаксел, который связан с полимером только С2'-кислородным атомом. Еще в другом воплощении изобретения полимерная цепь включает паклитаксел, который соединен с полимером только С7-кислородны атомом.

В еще одном воплощении изобретения полимер включает как С2'-конъюгированные группы паклитаксела, так и С7-конъюгированные группы паклитаксела.

Противораковое лекарственное средство может быть конъюгировано с полимером, полученным из полиглутаминовой кислоты и/или ее соли и аминокислоты, с использованием описанных выше методов в отношении Texas-Red.

В воплощении изобретения паклитаксел, предпочтительно в присутствии агента сочетания (например, EDC и/или DCC) и катализатора (например, ДМАП), может реагировать с полимером, полученным от полиглутаминовой кислоты и/или ее соли и аминокислоты, в растворителе (например, апротонном растворителе, типа ДФА). Могут использоваться дополнительные агенты, такие как пиридин или гидроксибензотриазол. В одном воплощении изобретения реакция может протекать в течение 0,5-2 дней. Для выделения и/или очистки полимерного конъюгата могут использоваться соответствующие, известные квалифицированному специалисту методы. Например, раекционную смесь можно влить в кислый раствор с образованием осадка. Любой образующийся осадок можно отфильтровать и промыть водой. Необязательно, осадок может быть очищен любым подходящим методом. Например, осадок может быть перенесен в ацетон и растворен, полученный раствор может быть снова профильтрован в раствор бикарбоната натрия. В случае необходимости полученный реакционный раствор может быть подвергнут диализу в воде, используя целлюлозную мембрану, и полимер может быть лиофилизирован и выделен. Содержание паклитаксела в полученнм полимере может быть определено с помощью УФ-спектрометрии.

Альтернативно, включающее агент соединение может реагировать с аминокислотой, типа глутаминовой кислоты и/или аспарагиновой кислоты, где включающее агент соединение связано (например, ковалентной связью) с аминокислотой. Тогда соединение аминокислотного агента может реагировать с полиглутаминовой кислотой или ее солью с формированием полимерного конъюгата. В одном воплощении изобретения паклитаксел реагирует с глутаминовой кислотой с образованием соединения, в котором паклитаксел ковалентно связан с боковой карбоксильной группой глутаминовой кислоты. Тогда соединение глутаминовая кислота-паклитаксел может реагировать с полиглутаминовой кислотой или ее солью с образованием полимерного конъюгата. В одном воплощении изобретения паклитаксел реагирует с аспарагиновой кислотой с образованием соединения, в котором паклитаксел ковалентно связан с боковой карбоксильной группой аспарагиновой кислоты. Тогда соединение аспарагиновая кислота-паклитаксел может реагировать с полиглутаминовой кислотой или ее солью с образованием полимерного конъюгата. Если желательно, паклитаксел, соединенный с аминокислотой посредством С2'-кислород, может быть отделен от паклитаксела, соединенного с аминокислотой посредством С7-кислород, используя известные методы разделения (например, ВЭЖХ).

После образования полимерного конъюгата может быть измерено любое свободное количество агента, не связанного ковалентно с полимером. Например, для того, чтобы подтвердить существенное отсутствие свободного паклитаксела, остающегося в композициях полимеров, конъюгированных с паклитакселом, может использоваться тонкослойная хроматография (ТСХ).

В одном воплощении изобретения полимер, полученный из полиглутаминовой кислоты и/или ее соли и аминокислоты, может быть конъюгирован с полидентатным лигандом. Пригодные полидентатные лиганды включают, но не ограничиваются ими, диэтилентриаминпентауксусную кислоту (DTPА), тераазациклододекан-1,4,7,10-тетрауксусную кислоту (DOTA), (1,2-этандиилдининитрил)тетраацетат (EDTA), этилендиамин, 2,2'-бипиридин (бипи), 1,10-фенантролин (фен), 1,2-бис(дифенилфосфино)этан (DPPE), 2,4-пентандион (асас) и этандиоат (ох). Для формирования полимерного конъюгата могут использоваться широко известные и/или описанные здесь соответствующие растворители, агенты сочетания, катализаторы и/или буферы. В другом воплощении изобретения полимер, полученный из полиглутаминовой кислоты и/или ее соли и аминокислоты, может быть конъюгирован с предшественником полидентатного лиганда с защищенными атомами кислорода. Для формирования полимерного конъюгата в качестве исходного материала могут использоваться полиглутаминовая кислота и солевая или кислотная форма полимера, полученного из полиглутаминовой кислоты и/или ее соли и аминокислоты.

В воплощении изобретения полидентатный лиганд включает DTPА. В одном воплощении изобретения полидентатный лиганд, типа DTPA (с или без защищенных атомов кислорода), предпочтительно в присутствии агента сочетания (например, DCC) и катализатор (например, ДМАП), может реагироваться с полимером, полученным из полиглутаминовой кислоты и/или ее соли и аминокислоты в растворителе (например, апротонном растворителе, типа ДФА). Если присутствуют защитные группы, их удаление может осуществляться соответствующими подходящими методами. Например, полимер, конъюгированный с предшественником полидентатного лиганда с защищенными атомами кислорода, типа DTPA с атомами кислорода, защищенными трет-бутильными группами, может быть обработан кислотой, типа трифторуксусной кислоты. После удаления защитных групп кислота может быть удалена путем ротационного испарения. В одном воплощении изобретения DTPA может быть обработана подходящим основанием, чтобы удалить водородные атомы на карбоксильных - ОН группах. В некоторых воплощениях изобретения основанием является бикарбонат натрия.

В одном воплощении изобретения полимер, полученный из полиглутаминовой кислоты и/или ее соли и аминокислоты, может конъюгировать с агентом магнитно-резонансной визуализации. В воплощении изобретения агент магнитно-резонансной визуализации включает соединение Gd (III). Одним методом формирования агента магнитно-резонансной визуализации является взаимодействие парамагнитного металла с полимерным конъюгатом, включающим полидентатный лиганд. Подходящие парамагнитные металлы включают, но не ограничиваются ими, Gd (III), Индий-I11 и Иттрий-88. Например, с полимерный конъюгат, включающий DTPA, можно обработать Gd (III) в буферном растворе в течение нескольких часов. Для выделения и очистки полимерного конъюгата могут использоваться известные в данной области методы. Например, полученный реакционный раствор может быть подвергнут диализу в воде, используя целлюлозную мембрану, и полимер может быть лиофилизирован и выделен. Количество парамагнитного металла может быть измерено с помощью двойной плазменно-оптической эмиссионной спектроскопии (ICP-OES).

Полимерные конъюгаты могут использоваться для доставки агента визуализации и/или лекарственного средства к выбранной ткани, например, как иллюстрируется приведенными ниже примерами. Описанные выше полимеры могут быть сформированы в наночастицы в водном растворе, например, как иллюстрируется ниже. Конъюгаты, включающие полимер и лекарственное средство, могут быть сформированы в наночастицы подобным образом. Такие наночастицы могут использоваться для предпочтительной доставки лекарственного средства к выбранной ткани.

Фармацевтические композиции

В некоторых воплощениях изобретения описываются пролекарства, метаболиты, стереоизомеры, гидраты, сольваты, полиморфы и фармацевтически приемлемые соли описанных здесь соединений (например, полимерного конъюгата и/или агента, который он включает).

Термин "пролекарство" относится к агенту, который преобразуется в родительское лекарство in vivo. Пролекарства часто полезны, так как в некоторых ситуациях они могут быть легче введены в организм, чем родительский препарат. Они могут, например, быть биодоступны при пероральном введении, в то время как родительский препарат нет. Пролекарство может также улучшать растворимость в фармацевтических составах по сравнению с родительским препаратом. Примером, без ограничения, пролекарства могло бы быть вещество, которое при введении представляет собой эфир ("пролекарство") и облегчает проникновение сквозь клеточную мембрану, где растворимость в воде вредна для подвижности, но которое затем единожды метаболически гидролизуется в клетке до карбоновой кислоты, являющейся активной формой, где растворимость в воде полезна. Дальнейшим примером пролекарства мог бы быть короткий пептид (полиаминокислота), связанный с кислотной группой, где пептид метаболизируется до активнй формы. Обычные процедуры для выбора и изготовления подходящих пролекарственных производных описаны, например, в Design of Prodrugs, (ed. H.Bundgaard, Elsevier, 1985), который тем самым включен сюда в качестве ссылки полностью.

Термин "пролекарственный эфир" относится к описываемым здесь соединениям, образованным присоединением нескольких любых эфирообразующих групп, которые гидролизируются в физиологических условиях. Примеры пролекарственных эфирных групп включают пивоилоксиметил, ацетоксиметил, фталидил, инданил и метоксиметил, а так же другие известные в данной области группы, включая (5-R-2-oкco-1,3-диоксолен-4-ил) метальную группу. Другие примеры пролекарственных эфирных групп можно найти в, например, T.Higuchi и V.Stella, в "Pro-drugs as Novel Delivery Systems ", Vol.14, A.C.S. Symposium Series, American Chemical Society (1975); и "Bioreversible Carriers in Drug Design: Theory and Application", edited by E.B.Roche, Pergamon Press: Нью-Йорк, 14-21 (1987) (описывающих примеры эфиров, полезных в качестве пролекарств для веществ, содержащих карбоксильные группы). Каждая из вышеупомянутых ссылок включена сюда в качестве ссылки в их полном объеме.

Термин "фармацевтически приемлемая соль" относится к соли соединения, которая не вызывает раздражение организма, которому она вводится, и не аннулирует биологическую активность и свойства соединения. В некоторых воплощениях изобретения соль представляет собой кислотно-аддитивную соль соединения. Фармацевтические соли могут быть получены путем взаимодействия соединения с неорганическими кислотами, типа галоидоводородной кислоты (например, хлористоводородная кислота или бромистоводородная кислота), серной кислоты, азотной кислоты, фосфорной кислоты и т.п. Фармацевтические соли могут также быть получены путем взаимодействия соединения с органической кислотой, типа алифатических или ароматических карбоновых или сульфоновых кислот, например уксусная, янтарная, молочная, яблочная, винная, лимонная, аскорбиновая, никотиновая, меансульфоновая, этансульфоновая, р-толуолсульфоновая, салициловая или нафталенсульфоновая кислота. Фармацевтические соли могут также быть получены взаимодействием соединения с основанием с получением соли, типа соли аммония, соли щелочного металла, типа натрия или калия, соли щелочноземельного металла, типа кальция или магния, соли органических оснований, типа солей дициклогексиламина, N-метил-D-глюкамина, трис(гидроксиметил)метиламина, С₁-С₇ алкиламина, циклогексиламина, триэтаноламина, этилендиамина, и соли с аминокислотами, типа аргинина, лизина и т.п.

Если изготовление фармацевтических состав включает тщательное смешивание фармацевтических эксципиентов и активного компонента в его солевой форме, то может быть желательным использовать фармацевтические эксципиенты, которые являются не основными, то есть или кислые или нейтральные эксципиенты.

В различных воплощениях изобретения раскрытые здесь соединения (например, полимерный конъюгат и/или агент, который он включает) могут использоваться одни, в комбинации с другими раскрытыми здесь соединениями или в комбинации с одним или более другими агентами, активными в описанных здесь терапевтических областях.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям, включающим один или более физиологически приемлемых поверхностно активных агентов, носителей, разбавителей, наполнителей, агентов скольжения, суспендирующих агентов, пленкообразующих и помощников покрывающих агентов или их комбинацию; и раскрытое здесь соединение (например, полимерный конъюгат и/или агент, который он включает). Приемлемые для терапевтического использования носители или разбавители известны в области фармацевтики и описаны, например, в Remington's Pharmsceutical Sciences, 18^th ed, Mack Publishing Co., Easton, PA (1990), который полностью включен сюда в качестве ссылки. В фармацевтическую композицию могут входить консерванты, стабилизаторы, красители, подсластители, ароматизаторы и т.п. Например, в качестве консервантов могут быть добавлены бензоат натрия, аскорбиновая кислота и эфир п-гидроксибензойной. Кроме того, могут использоваться антиоксиданты и суспендирующие агенты. В различных воплощениях изобретения в качестве поверхностно-активных агентов могут использоваться спирты, эфиры, сульфатированные алифатические спирты и т.п.; в качестве наполнителей могут использоваться сахароза, глюкоза, лактоза, крахмал, кристаллическая целлюлоза, маннит, светлый безводный силикат, алюминат магния, метаалюмосиликат магния, синтетический алюмосиликат, карбонат кальция, кислый карбонат натрия, гидрофосфат кальция, кальций карбоксиметилцеллюлоза и т.п.; в качестве агентов скольжения могут использоваться стеарат магния, тальк, гидрированное масло и т.п.; в качестве суспендирующего агента или лубриканта могут использоваться кокосовое масло, оливковое масло, кунжутное масло, арахисовое масло, соя; в качестве суспендирующего агента может использоваться фталат ацетата целлюлозы как углеводное производное, например целлюлозы или сахара, или метилацетат-метакрилатный сополимер как поливинильное производное; и в качестве суспендирующих агентов могут использоваться пластификаторы, типа сложных эфиров фталатов и т.п.

Термин "фармацевтическая композиция" относится к смеси описываемого здесь соединения (например, полимерный конъюгат и/или агент, который он включает) с другими химическими компонентами, типа разбавителей или носителей. Фармацевтическая композиция облегчает введение соединения в организм. В этой области существует множество способов введения соединения, включая, но не ограничиваясь ими, пероральное, инъекционное, аэрозольное, парентеральное и местное введение. Фармацевтические композиции могут также быть получены взаимодействием соединений с неорганическими или органическими кислотами, типа соляной кислоты, бромистоводородной кислоты, серной кислоты, азотной кислоты, фосфорной кислоты, метансульфоновой кислоты, этансульфоновой кислоты, п-толуолсульфокислоты, салициловой кислоты и т.п.

Термин"носитель" относится к химическому соединению, которое облегчает внедрение соединения в клетки или ткани. Например, диметилсульфоксид (ДМСО) является обычно используемым носителем, поскольку он облегчает проникновение многих органических соединений в клетки или ткани организма.

Термин "разбавитель" относится к растворимым в воде химическим соединениям, которые будут растворять интересующее соединение (например, полимерный конъюгат и/или агент, который он включает), а также стабилизировать биологически активную форму соединения. В данной области в качестве разбавителей используются растворенные в буферных растворах соли. Один обычно используемый буферный раствор представляет собой соляной фосфатный буфер, потому что он имитирует солевые условия человеческой крови. Так как соляные буферы могут регулировать pH растворов при низких концентрациях, буферные разбавители редко изменяют биологическую активность соединения. Термин "физиологически приемлемый" относится к носителю или разбавителю, который не аннулирует биологическую активность и свойства соединения.

Описываемые здесь фармацевтические композиции можно вводить человеческому пациенту per se или в фармацевтических композициях, где они смешаны с другими активными компонентами, как в комбинированной терапии, или подходящими носителями или наполнителями. Методы приготовления лекарственных форм и введения соединений настоящей заявки можно найти в Remington's Pharmsceutical Sciences, 18^th ed, Mack Publishing Co., Easton, PA (1990).

Подходящие пути введения могут, например, включать пероральное, ректальное, трансмукозальное, местное или кишечное введение; парентеральную доставку, включая внутримышечные, подкожные, внутривенные, интрамедуллярные, подоболочечные, прямые внутрижелудочковые, внутрибрюшинные, интраназальные или внутриглазные инъекции. Соединения (например, полимерный конъюгат и/или агент, который он включает) можно также вводить в виде лекарственных форм с отсроченным или контролируемым высвобождением, включая депо инъекции, осмотические насосы, пилюли, трансдермальные повязки и т.п., для пролонгированного и/или рассчитанного во времени, пульсирующего введения при определенной скорости введения.

Фармацевтические композиции настоящего изобретения могут быть изготовлены хорошо известными методами, например, посредством обычно смешивания, растворения, гранулирования, создания драже, растирания в порошок, эмульгирования, капсулирования, заключения в каплю или таблетирования.

Фармацевтические композиции для использования в соответствии с существующим изобретением могут быть сформированы обычным образом, используя один или более физиологически приемлемых носителей, включающих эксципиенты и вспомогательные средства, которые облегчают процесс переработки активных соединений в препаративные формы, которые могут использоваться в фармацевтике. Надлежащая форма зависит от выбранного пути введения. Могут использоваться любые из известных и принятых в данной области технологий, носителей и эксципиенто, например, указанных в приводимом выше Remington's Pharmsceutical Sciences.

Инъекцируемые формы могут быть приготовлены в обычных формах или в виде жидких растворов или суспензий, в виде твердых форм, пригодных для растворения или суспендирования в жидкости до инъекции, или в виде эмульсий. Подходящими эксципиентами являются, например, вода, физиологический раствор, декстроза, маннит, лактоза, лецитин, альбумин, глутамат натрия, гидрохлорид цистеина и т.п. Кроме того, если желательно, вводимые фармацевтические композиции могут содержать незначительные количества нетоксичных вспомогательных веществ, типа увлажнителей, буферных регуляторов pH и т.п. Физиологически совместимые буферы включают, но не ограничиваются ими, раствор Хенкса, раствор Ринга или физиологический солевой буфер. Если желательно, могут использоваться препараты, увеличивающее абсорбцию (например, липосомы).

Для трансмукозального введения в лекарственной форме могут использоваться соответствующие пенетранты для проникновения через барьер.

Фармацевтические формы для парентерального введения, например, болюсным вливанием или непрерывным вливанием, включают водные растворы активных веществ в растворимой в воде форме. Дополнительно могут быть приготовлены суспензии активных веществ в виде соответствующих масляных инъекционных суспензий. Подходящие липофильные растворители или носители включают жирные масла, типа кунжутного масла или другого органического масла, типа соевого, грейпфрутового или миндального масел, или эфиры синтетических жирных кислот, типа этилолеата или триглицеридов, или липосомы. Водные инъекционные суспензии могут содержать вещества, которые увеличивают вязкость суспензии, типа натрий карбоксиметилцеллюлозы, сорбитола или декстрана. Необязательно суспензия может также содержать подходящие стабилизаторы или агенты, которые увеличивают растворимость соединений для приготовления высококонцентрированных растворов. Формы для инъекций могут быть представлены единичной лекарственной формой, например, в ампулах или в многодозовых контейнерах, с добавлением консервантов. Композиции могут принимать такие формы как суспензии, растворы или эмульсии в масляных или водных носителях и могут содержать формообразующие агенты, типа суспендирующих, стабилизирующих и/или диспергирующих агентов. Альтернативно, активный компонент может быть в порошковой форме для совмещения с подходящим носителем, например стерильной апирогенной водой, перед использованием.

Для перорального введения соединения могут быть легко сформированы объединением активных соединений с хорошо известными фармацевтически приемлемыми носителями. Такие носители позволяют соединениям настоящего изобретения быть сформированными в таблетки, пилюли, драже, капсулы, жидкости, гели, сиропы, взвеси, суспензии и т.п. для проглатывания пациентом. Фармацевтические препараты для перорального применения могут быть получены путем объединения активных соединений с твердым эксципиентом, необязательного размалывания полученной смеси и изготовления из полученной гранулированной смеси, после добавления подходящих вспомогательных средств, если желательно, таблеток или ядер драже. Подходящими эксципиентами являются, в частности, наполнители, типа сахаров, включая лактозу, сахарозу, маннит или сорбитол; препараты целлюлозы, типа, например, кукурузного крахмала, пшеничного крахмала, рисового крахмала, картофельного крахмала, желатина, трагаканта, метилцеллюлозы, гидроксипропилметилцеллюлозы, натрийкарбоксиметилцеллюлозы и/или поливинилпирролидона (PVP). Если желательно, могут быть добавлены дезинтегрирующие агенты, типа поперечно-сшитого поливинилпирролидона, агара или альгининовой кислоты или ее соли, типа альгината натрия. Ядра драже покрывают соответствующими покрытиями. Для этой цели могут использоваться концентрированные сахарные растворы, которые могут необязательно содержать аравийскую камедь, тальк, поливинилпирролидон, карбополгель, полиэтиленгликоль и/или диоксид титана, лаковые растворы и подходящие органические растворители или смесь растворителей. К таблеткам или покрытиям для драже могут быть добавлены красители или пигменты для идентификации или характеристики различных комбинаций активных доз. Для этой цели могут использоваться концентрированные сахарные растворы, которые могут необязательно содержать аравийскую камедь, тальк, порливинилпирролидон, карбополгель, полиэтиленгликоль и/или диоксид титана, лаковый раствор и подходящие органические растворители или растворяющие смеси. К таблеткам или покрытиям для драже могут быть добавлены красители или пигменты для идентификации или характеристики различных комбинаций активных доз.

Фармацевтические препараты для перорального применения включают плотные капсулы, сделанные из желатина, а так же мягкие запечатанные капсулы, сделанные из желатина и пластификатора, типа глицерина или сорбитола. Плотные капсулы могут содержать активные компоненты в смеси с наполнителем, типа лактозы, связующим, типа крахмалов, и/или лубрикантами, типа талька или стеарата магния и, необязательно, стабилизаторами. В мягких капсулах активные соединения могут быть растворены или суспендированы в подходящих жидкостях, типа жирных масел, жидкого парафина или жидких полиэтиленгликолях. Кроме того, могут быть добавлены стабилизаторы. Все составы для перорального введения должны быть в дозировках, подходящих для такого введения.

Композиции для буккального введения могут иметь форму обычных таблеток или лепешек.

Составы для ингаляционного введения удобно поставлять в форме аэрозольного спрея из упаковок под давлением или небулайзеров с использованием подходящего пропеллента, например дихлордифторметана, тирхлорфторметана, дихлортетрафторэтана, углекислого газа или другого подходящего газа. В случае герметизируемого аэрозоля дозируемая единица может быть отмерена с помощью клапана, поставляющего измеренное количество вещества. Желатиновые капсулы и картриджи для использования в ингаляторе или инсуффлаторе могут быть сформированы содержащими порошковую смесь соединениями и подходящей порошковой основы, типа лактозы или крахмала.

Дальнейшие описываемые здесь различные фармацевтические композиции хорошо известны в фармацевтике и включают внутриглазную, интраназальную и внутриушную доставку. Подходящие для этих использований пенетранты являются общеизвестными в данной области. Фармацевтические композиции для внутриглазной доставки включают водные глазные растворы активных соединений в водорастворимой форме, типа глазных каплей или геля (Shedden et al., Clin. Ther., 23 (3):440-50 (2001)) или гидрогелей (Mayeret et al, Ophthalmologica, 210 (2): 101-3 (1996)); глазные мази; глазные суспензии, типа микрочастиц, содержащих лекарственное вещество маленьких полимерных частиц, которые суспендированы в среде жидкого носителя (Joshi, A., J. Ocul. Pharmacol, 10(1):29-45 (1994)), липидрастворимые составы (Alm et al., Prog. Clin. Biol. Res., 312:447-58 (1989)), микросферы (Mordenti, Toxicol. Sci., 52(1):101-6 (1999)); и глазные вставки. Все вышеупомянутые ссылки включены сюда в их полном объеме в качестве ссылок. Такие подходящие фармацевтические составы чаще всего и предпочтительно сформированы так, чтобы быть стерильными, изотоническими и буферными для стабильности и комфорта. Фармацевтические композиции для внутриносовой доставки могут также включать капли и спреи, часто приготовленные подобными во многих отношениях носовым секретам, чтобы гарантировать нормальную деятельность ресничек. Как раскрыто в Remington's Pharmsceutical Sciences, 18^th ed, Mack Publishing Co., Easton, PA (1990), который включен сюда полностью в качестве ссылки, и хорошо известно специалистам, подходящие формы чаще всего и предпочтительно являются изотоническими, слегка забуференными для поддержания pH от 5,5 до 6,5, и чаще всего и предпочтительно включают антибактериальные консерванты и соответствующие стабилизаторы лекарственного вещества. Фармацевтические составы для внутриушной доставки включают суспензии и мази для местного применения в ухе. Обычные растворители для таких ушных форм включают глицерин и воду.

Соединения могут также быть сформированы в ректальные композиции, типа суппозиториев или удерживающих клизм, например, содержащих обычную основу для суппозитория, типа масла какао или другого глицерида.

В дополнение к описанным составам соединения могут также быть сформированы как депо препараты. Такие долго действующие составы можно вводить в виде имплантатов (например, подкожных или внутримышечных) или путем внутримышечной инъекции. Так, например, соединения могут быть сформированы с подходящими полимерными или гидрофобными материалами (например, в виде эмульсии в приемлемом масле) или ионообменными смолами, или в виде умеренно растворимых производных, например, в виде умеренно растворимой соли.

Для гидрофобных соединений подходящий фармацевтический носитель может представлять собой сорастворяющую систему, включающую бензиловый спирт, неполярный сурфактант, смешивающийся с водой органический полимер и водную фазу. Обычно используемая сорастворяющая система представляет собой VPD сорастворяющую систему, которая представляет собой раствор 3% вес/об бензилового спирта, 8% вес/об неполярного сурфактанта Полисорбат 80™ и 65% вес/об полиэтиленгликоля 300, доведенного до объема в абсолютном этаноле. Естественно, пропорции сорастворяющей системы могут значительно различаться, не нарушая ее растворимость и токсичность. Кроме того, идентичность сорастворяющих компонентов может быть различна: например, вместо Полисорбата 80™ могут использоваться другие низкотоксичные неполярные сурфактанты; фракционный размер полиэтиленгликоля может быть различен; полиэтиленгликоль могут заменить другие биологически совместимые полимеры, например, поливинилпирролидон; декстрозу могут заменить другие сахара или полисахариды.

Для доставки гидрофобных фармацевтических соединений могут использоваться другие системы доставки. Липосомы и эмульсии представляют собой известные примеры транспортных средств или носителей для гидрофобных лекарств. Также могут использоваться определенные органические растворители, типа диметилсульфоксида, хотя обычно за счет большей токсичности. Дополнительно, соединения могут быть доставлены, используя систему отсроченного высвобождения, типа полупроницаемого матрикса твердых гидрофобных полимеров, содержащих терапевтический агент. Различные материалы для отсроченного высвобождения известны специалистам. Капсулы с отсроченным высвобождением, в зависимости от их химической природы, высвобождают соединение в течение нескольких часов или недель до более чем 100 дней. В зависимости от химической природы и биологической стабильности терапевтического реагента для стабилизации белка могут использоваться дополнительные стратегии.

Агенты, предназначенные для внутриклеточного введения, можно вводить, используя обычные известные методы. Например, такие агенты могут быть инкапсулированы в липосомы. Все молекулы, присутствующие в водном растворе во время формирования липосомы, включаются в ее внутреннюю водную часть. Содержание липосомы защищено от внешней микроокружающей среды и, потому что липосомы сливаются клеточными мембранами, эффективно поставляются в цитоплазму клетки. Липосома может быть покрыта тканеспецифичным антителом. Липосомы будут нацелены к и селективно поглощаться желаемым органом. Маленькие гидрофобные органические молекулы можно напрямую вводить внутриклеточно.

В фармацевтические композиции могут быть включены дополнительные терапевтические или диагностические агенты. Фармацевтические композиции могут быть комбинированы с другими композициями, которые содержат другие терапевтические или диагностические агенты.

Методы введения

Соединения или фармацевтические композиции можно вводить пациенту любыми подходящими средствами. Неограничивающие примеры методов введения включают, среди других, (а) пероральный путь введения, который включает введение капсулы, таблетки, гранул, спреев, сиропа или других подобных форм; (b) непероральный путь введения, типа ректального, вагинального, интрауретрального, внутриглазного, интраназального или внутриушного, который включает введение водной суспензии, масляного препарата или подобного, или введение капель, аэрозоля, суппозитория, бальзама, мази или подобного; (с) введение с помощью инъекций, подкожно, внутрибрюшинно, внутривенно, внутримышечно, внутрикожно, интраорбитально, интракапсулярно, интраспинально, внутригрудинно или подобно, включая вливание с помощью насоса; (d) локальное введение, типа инъекции непосредственно в почечную или сердечную области, например, путем имплантации депо; а так же (е) местное введение; считающиеся специалистами соответствующими для того, чтобы привести активное соединение в контакт с живой тканью.

Подходящие для введения фармацевтические композиции включают композиции, где активные компоненты содержатся в количестве, эффективном для достижения намеченной цели. Терапевтически эффективное количество раскрытых здесь соединений, требуемых как доза, будет зависеть от пути введения, типа животного, включая человека, проходящего лечение, и физических особенностей определенного животного. Доза может быть разделена для достижения желаемого эффекта, но будет зависеть от таких факторов, как вес, диета, параллельное лечение, и других факторов, которые признаны специалистами в области медицины. Более определенно, терапевтически эффективное количество означает количество соединения, эффективного для предотвращения, облегчения или уменьшения интенсивности симптомов заболевания или продления жизни субъекта, проходящего лечение. Определение терапевтически эффективного количества находится в пределах способностей специалиста в данной области, особенно в свете детального представленного здесь описания.

Для специалиста очевидно, что приемлемые для введения дозы in vivo и способы введения могут меняться в зависимости от возраста, веса и особенностей принимающего лечение млекопитающего, специфики используемых соединений и назначения, для которого используются эти соединения. Определение эффективных уровней дозировки, которые необходимы для достижения желаемого результата, может быть проведено квалифицированным в данной области специалистом, используя обычные фармакологические методы. Как правило, клиническое применение соединений для человека начинают с более низких уровней дозировки, с увеличением уровня дозировки, пока желаемый эффект не будет достигнут. Для определения уровней полезных доз и путей введения композиций настоящего изобретения можно проводить исследования in vitro существующими методами, используя установленные фармакологические методы.

Исследования на животных потенциальных продуктов начинают с более высоких уровней дозировки с уменьшением дозировки до тех пор, пока желаемый эффект больше не достигается или исчезают неблагоприятные побочные эффекты. Дозировка может иметь широкий диапазон в зависимости от желаемого эффекта и терапевтических признаков. Как правило, дозировки составляют от приблизительно 10 мкг/кг веса тела до приблизительно 100 мг/кг веса тела, предпочтительно между 100 мкг/кг веса тела и приблизительно 10 мг/кг. Специалисту понятно, что дозы могут также быть основаны и рассчитаны, считая на площадь поверхности тела пациента.

Точная лекарственная форма, путь введения и дозы для фармацевтических композиций настоящего изобретения могут быть выбраны индивидуально врачом в зависимости от состояния пациента (См. например, Fingl et al. 1975, "Pharmacological Basis of Therapeutics", которая включена сюда полностью в качестве ссылки, со специфической ссылкой на Ch.1, p.1). Как правило, диапазон доз вводимой пациенту композиции может быть приблизительно от 0.5 до 1000 мг/кг массы тела пациента. Доза может быть единичной дозой или быть разделена на ряд двух или более доз на курс из одного или более дней, как необходимо пациенту. В случаях, когда дозы для человека были установлены по крайней мере для некоторого состояния, в соответствии с настоящим изобретением будут использоваться те же самые дозировки или дозы, которые составляют приблизительно между 0.1% и 500%, более предпочтительно приблизительно между 25% и 250% от установленной для человека дозы. Когда доза для человека не установлена, что будет иметь место для недавно разработанных фармацевтических композиций, подходящая для человека доза может быть выведена из величин ED₅₀ или ID₅₀, или других соответствующих величин, полученных при исследованиях in vitro или in vivo токсичности и эффективности на животных.

Следует отметить, что лечащий врач должен знать как и когда закончить, прервать или отрегулировать введение композиций настоящего изобретения из-за дисфункции органа или токсичности. Наоборот, лечащий врач также должен знать, как приспособить лечение к более высоким уровням доз в случае, когда клинический ответ не был адекватен (устранение токсичности). Величина вводимой дозы может меняться в зависимости от серьезности состояния больного и пути введения. Серьезность состояния может, например, быть оценена частично стандартными предварительными методами оценки. Далее, доза и возможно частота дозы также могут изменяться в зависимости от возраста, массы тела и индивидуального ответа пациента. Сопоставимая обсужденному выше программа может использоваться в ветеринарии.

Хотя точная дозировка будет определена на основании препарата против препарата, в большинстве случаев некоторые обобщения относительно дозировки могут быть сделаны. Ежедневный режим дозировки для взрослого человека может быть, например, для пероральной дозы между 0.1 мг и 2000 мг каждого активного компонента, предпочтительно между 1 мг и 500 мг, например 5-200 мг. В других воплощениях изобретения внутривенная, подкожная или внутримышечная доза для каждого активного компонента составляет между 0.01 мг и 100 мг, предпочтительно между 0.1 мг и 60 мг, например, 1-40 мг. В случаях введения фармацевтически приемлемой соли дозировки могут быть рассчитаны на свободное основание. В некоторых воплощениях изобретения композицию вводят 1-4 раза в день. Композиции настоящего изобретения можно вводить непрерывным внутривенным вливанием, предпочтительно в дозе каждого активного компонента до 1000 мг в день. В определенных ситуациях может возникнуть необходимось вводить описанные здесь соединения в количествах, которые превышают или даже далеко превышают выше установленного предпочтительный диапазон доз, чтобы эффективно и настойчиво лечить особенно агрессивные болезни или инфекции. В некоторых воплощениях изобретения соединения будут вводить, рассчитывая на длительную терапию, например в течение недели или больше, или в течение многих месяцев или лет.

Величина дозы и интервал могут быть подобраны индивидуально, чтобы обеспечить такие уровни активного компонента в плазме, которые являются достаточными для поддержания эффекта модуляции или минимальной эффективной концентрации (МЕС). Для каждого соединения МЕС меняется, но может быть определена на основании данных in vitro. Дозировки, необходимые для достижения МЕС, будут зависеть от индивидуальных особенностей и пути введения. Для определения концентрации в плазме могут использоваться ВЭЖХ или биопробы.

Интервалы доз могут также быть определены, используя величину МЕС. Композиции следует вводить в таком режиме, который поддерживает уровни в плазме выше МЕС в течение 10-90% времени, предпочтительно между 30-90% и наиболее предпочтительно между 50-90%.

В случаях локального введения или селективного поглощения эффективная локальная концентрация лекарственного средства не связана с концентрацией в плазме.

Количество вводимой композиции может зависеть от пациента, который проходит лечение, его веса, серьезности заболевания, способа введения и предписания врача.

Эффективность и токсичность описываемых здесь соединений (например, полимерный конъюгат и/или агент, который он включает) могут быть определены, используя известные методы. Например, токсичность конкретного соединения или подмножества соединений, имеющих общие химические части, может быть определена in vitro на клеточной линии млекопитающего, предпочтительно человека. Результаты таких исследований являются часто прогнозирующими токсичность для животных, типа млекопитающих, или более определенно, для людей. Токсичность специфических соединений в модели животных, типа мышей, крыс, кроликов или обезьян, может быть определена с использованием известных методов. Эффективность специфического соединения может быть установлена, используя несколько признанных методов, таких как методы in vitro, модели животных или клинические испытания на человеке. Почти для каждого класса состояний существуют признанные in vitro модели, включая, но не ограничеваясь ими, рак, сердечно-сосудистые заболевания и различные иммунные дисфункции. Точно так же могут использоваться приемлемые животные модели, чтобы установить эффективность химического соединения для лечения таких состояний. Выбирая модель для определения эффективности, квалифицированный специалист может руководствоваться состоянием уровня техники, чтобы выбрать соответствующую модель, дозу, путь введения и режим. Чтобы определить эффективность соединения в людях, могут также использоваться клинические испытания на человеке.

Композиции, если желательно, могут быть представлены в пакете или в фармацевтическом устройстве, которое может содержать одну или более единичных дозированных лекарственных форм, содержащих активный компонент. Пакет может, например, включать металлическую или пластиковую фольгу, типа блистерной упаковки. Пакет или фармацевтическое устройство могут сопровождаться инструкциями для использования. Пакет или фармацевтическое устройство могут также сопровождаться уведомлением, связанным с контейнером в форме, предписанной государственным агентством, регулирующим изготовление, использование или продажу фармацевтических препаратов, в котором указано, что препарат одобрен для введения человеку или животному. Такое уведомление, например, может иметь маркировку, одобренную Американским Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов. Композиции, включающие соединение настоящего изобретения, сформированное в совместимом фармацевтическом носителе, также могут быть изготовлены, помещены в соответствующий контейнер и маркированы для лечения обозначенного заболевания.

ПРИМЕРЫ

Следующие примеры представлены в целях дальнейшего описания описанных здесь воплощений изобретения и не ограничивают объем изобретения.

Материалы:

Натриевые поли-L-глутаматные соли с различным молекулярным весом (средний молекулярный вес 41400 (PGA (97 КБ), 17600 (PGA (44 КБ), 16000 (PGA (32 КБ) и 10900 (PGA (21 КБ) дальтон, рассчитанный с помощью метода светорассеивания (MALS)); 1,3-дициклогексил карбодиимид (DCC); N-(3-диметиламинопропил)-N'этилкарбодиимид гидрохлорид (EDC); гидроксибензотриазол (HOBt); пиридин; 4-диметиаминопиридин (ДМАП); N,N'-диметилформамид (ДФА); ацетат гадолиния; хлороформ и бикарбонат натрия были приобретены от компании Sigma-Aldrich Chemocal. Поли-L-глутамат был превращет в поли-L-глутаминовую кислоту, используя 2N раствор соляной кислоты. Трифторуксусная кислота (TFA) была приобретена у Bioscience. Omniscan™ (гадодиамид) был приобретен у GE.

Гидрохлорид α-трет.-бутиловый эфир L-аспарагиновой-кислоты (Н-Asp(OtBu)-OtBu-HCl), гидрохлорид ди-трет.-бутилового эфира L-глутаминовой кислоты (H-Glu (OtBu)-OtBu-HCl), α-бензиловый эфир N-α-CBZ-L-глутаминовой кислоты (Z-Glu-OBzI) были приобретены у Novabiochem (La Jolla, СА). Паклитаксел был прибретен у PolyMed (Хьюстон, Техас). ³Н-паклитаксел был приобретен у Moravek Biochemicals, Inc. Краситель Sulforhodamine В для цитотоксического испытания МТТ (выживаемость клетки) был приобретен у Molecular Imaging Company (Мичиган). Химикат p-NH₂-Bn-DPTA-пента (t-Bu эфир) был приобретен у Macrocyclics (Даллас, Техас). Кадаверин Texas Red^® (краситель Texas Red -NH₂) был приобретен у Molecular Probe. Бычья сыворотка была приобретена у Sigma. Для удаления макрочастиц ее центрифугировали при 10000 оборотов в минуту.

Спектры ¹Н ЯМР были получены от Joel (400 MHz), размеры частицы были измерены с помощью ZetalPals (Brookhaven Instruments Corporation). Микроволновая химия была выполнена в Biotage. Молекулярные веса полимеров определялись с помощью гель-хроматографии (SEC) в комбинации с детектором (Wyatt Corporation) светорассеивания (MALS).

Условия SEC-MALS анализа

Система ВЭЖХ (HPLC): Agilent 1200   Shodex SB 806М HQ   (предел исключения для Pullulan - 20000000, размер частицы: 13 микрон, размер (мм) ID×Length; 8.0×300) Подвижная фаза: I×DPBS или 1%-й LiBr в DPBS (pH 7.0) Скорость потока: 1 мл/минута Детектор MALS: DAWN HELEOS от Wyatt Детектор DRI: Optilab rEX от Wyatt Вискозиметр on-line: ViscoStar от Wyatt Программное обеспечение: ASTRA 5.1.9 от Wyatt Концентрация образца: 1-2 мг/мл Объем впрыска: 100 мкл Величина dn/dc полимера: 0.185 использовалось при измерении.

Перед проходом образцов в качестве контроля использовался BSA

Используя описанную выше систему и условия (в дальнейшем называемые система Heleos с детектором MALS), экспериментально находили средний молекулярный вес исходных полимеров (средние молекулярные веса натриевых солей поли-L-глутамата 41400, 17600, 16000 и 10900 дальтон, по данным Sigma-Aldrich, использующей систему MALS), который составил 49000, 19800, 19450 и 9400 дальтон соответственно.

Содержание паклитаксела в конъюгате полимер-паклитаксел оценивалось с помощью UV/Vis спектрометрии (Lambda Bio 40, PerkinElmer), считая на стандартную кривую, полученную с известными концентрациями паклитаксел в метаноле (λ=228 нм).

Синтез конъюгатов поли-L-глутамат-паклитаксел (PGA-PTX) был выполнен как сообщалось ранее в предыдущей литературе. См. Li et al., "Complete Regression of Well-established tumors using a novel water-soluble poly (L-glutamic acid)-paclitaxel conijgate." Cancer Research 1998, 58, 2404-2409, содержание которого включено сюда полностью в качестве ссылки. Количество паклитаксела в PGA(97k)-PTX-20 и PGA(32k)-PTX-20, полученных из полиглутаминовых кислот со средними молекулярными весами 49000 и 19450 дальтон соответственно, было количественно определено с помощью УФ-спектрометрии при λ=229 нм как 20 вес.%. Для PGA (97k КБ)-РТХ-10 из полиглутаминовой кислоты со средним молекулярным весом 49 000 дальтон понижая количество паклитаксела, было получено 10 вес.%, считая на общий вес.

ПРИМЕР 1

Поли-(γ-аспартил-глутамин) был приготовлен в соответствии с общей схемой, приведенной на Фигуре 1, следующим образом:

К 100 мл дихлорметана (ДХМ) добавляют по частям полиглутаминовую кислоту (0,75 г), средний молекулярный вес 49000 дальтон, определенный по системе Heleos с MALS детектором. Добавляют DCC (8,7 мл, 1М в DCM) и перемешивают в течение 20 минут. На роторном испарителе удаляют ДХМ и остаток растворяют в ДФА (80 мл). Добавляют H-asp(OtBu)-(OtBu) (2,44 г), пиридин (4 мл) и ДМАП (0,1 г) и реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 15-24 часов. Реакционную смесь фильтруют в подкисленный водный раствор (500 мл, pH<2, по pH бумаге). Образовавшийся белый осадок отфильтровывают и промывают водой. Затем белый осадок растворяют в ацетоне (100 мл). Раствор фильтруют через 0,2-мкм фильтр и удаляют ацетон на роторном испарителе. Структура промежуточного полимера была подтверждена с помощью ¹Н-ЯМР наличием пика для группы O-tBu при 1,4 ppm.

Промежуточный полимер обрабатывают 95% трифторуксусной кислотой (TFA) в ДХМ в течение 5-8 часов. Добавляют ДХМ до образования осадка. Удаляют растворитель и остаток промывают большим количеством ДХМ. Остаток помещают под вакуум для удаления ДХМ. Остаток повторно растворяют в метаноле и воде и затем осуществляют диализ с использованием полупроницаемой мембраны из целлюлозы (отсекается молекулярный вес 10000 дальтон) в воде обратного осмоса (смена воды 4 раза) в течение ночи. Поли-(γ-L-аспартил-глутамин) был оптически прозрачен при pH 7 в воде после диализа. После лиофилизации был получен поли-(γ-L-аспартил-глутамин) (1,2 г) в виде белого порошка. Структура полимера была подтверждена с помощью ¹Н-ЯМР исчезновением пика для группы O-tBu при 1,4 ppm.

ПРИМЕР 2

Поли-(γ-L-аспартил-глутамин)-поли-L-глутаминовая кислота была приготовлена в соответствии с общей схемой, приведенной на Фигуре 2, следующим образом:

Полиглутаминовую кислоту со средним молекулярным весом 49 000 дальтон, определенным по системе Heleos с MALS детектором, (0,075 г) частично растворяют в ДФА (3 мл). Затем добавляют DCC (130 мг), Н-asp(OtBu)-(OtBu) (0,11 г), пиридин (200 мкл) и ДМАП (0,010г). Реакцию ведут с использованием микроволнового метода при 120°C в течение 30 минут. Затем реакционную смесь охлаждают до комнатной температуры. Завершение реакции контролируют с помощью тонкослойной хроматографии (ТХС, Rf в этилацетате = 0,4) до полного исчезновенияе H-asp(OtBu)-(OtBu). После завершения реакции реакционную смесь фильтруют в подкисленный водный раствор (150 мл, pH<2, по pH бумаге). Образовавшийся белый осадок отфильтровывают и промывают водой. Затем белый осадок растворяют в ацетоне (50 мл). Раствор фильтруют в раствор бикарбоната натрия (0,5М) и осуществляют диализ с использованием полупроницаемой мембраны из целлюлозы (отсекается молекулярный вес 10000 дальтон) в воде обратного осмоса (смена воды 4 раза) в течение ночи. Полученный после лиофилизации промежуточный полимер был белого цвета. Структура полимера была подтверждена с помощью ¹H-ЯМР наличием пика для группы O-tBu при 1,4 ppm.

Затем промежуточный полимер обрабатывают 95% трифторуксусной кислотой (TFA) в ДХМ в течение 5 часов. Добавляют ДХМ до образования осадка. Удаляют растворитель и остаток дополнительно промывают ДХМ. Остаток помещают под вакуум для удаления ДХМ. Остаток повторно растворяют в метаноле и воде и осуществляют диализ с использованием полупроницаемой мембраны из целлюлозы (отсекается молекулярный вес 10000 дальтон) в воде обратного осмоса (смена воды 4 раза) в течение ночи. После лиофилизации получают поли-(γ-L-аспартил-глутамин)-поли-L-глутаминовую кислоту (0,10 г) в виде белого порошка. Структура полимера была подтверждена с помощью ¹Н-ЯМР исчезновением пика для группы O-tBu при 1,4 ppm.

ПРИМЕР 3

Поли-(γ-L-аспартил-глутамин) был приготовлен в соответствии с общей схемой, приведенной на Фигуре 3, следующим образом:

Смешивают в ДФА (700 мл) полиглутамат натрия (10,0 г) со средним молекулярным весом 49000 дальтон, определенным по системе Heleos с MALS детектором, EDC (33,8 г), HOBt (15,9 г) и H-asp(OtBu)-(OtBu)-HCl (32,0 г). Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 15-24 часов и затем вливают в водный раствор (3 л). Отфильтровывают образовавшийся белый осадок и промывают водой. Промежуточный полимер подвергают сушке вымораживанием. Структура промежуточного полимера была подтверждена с помощью ¹Н-ЯМР наличием пика для группы O-tBu при 1,4 ppm.

Промежуточный полимер обрабатывают TFA (200 мл) в течение 5 часов. Затем TFA частично удаляют на роторном испарителе. К остатку добавляют воду и остаток подвергают диализу с использованием полупроницаемой мембраны из целлюлозы (отсекается молекулярный вес 10000 дальтон) в воде обратного осмоса (смена воды 4 раза) в течение ночи. Поли-(γ-L-аспартил-глутамин) был прозрачен при pH 7 в воде после диализа. После лиофилизации получают поли-(γ-L-аспартил-глутамин) (15,0 г) в виде белого порошка. Структура полимера была подтверждена с помощью ¹Н-ЯМР исчезновением пика для группы O-tBu при 1,4 ppm. Средний молекулярный вес поли-(γ-L-аспартил-глутамина) составлял 99400 дальтон.

ПРИМЕРЫ 3а-3b

Синтез поли-(γ-L-аспартил-глутамина) из исходных полиглутаматных натриевых солей с различными средними молекулярными весами (19800 и 9400 дальтон, определенными по системе Heleos с MALS детектором) был выполнен, используя процедуру Примера 3, и средний молекулярный вес полученных полимеров поли-(γ-L-аспартил-глутамина) составлял 39700 и 17700 дальтон соответственно.

ПРИМЕР 4

Поли-(γ-L-глутамил-глутамин) был приготовлен в соответствии с общей схемой, приведенной на Фигуре 4, следующим образом:

Смешивают в ДФА (30 мл) полиглутамат натрия (0,40 г) со средним молекулярным весом 19 800 дальтон, определенным по системе Heleos с MALS детектором, EDC (1,60 г), HOBt (0,72 г) и H-glu(OtBu)-(OtBu)-HCl (1,51 г). Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 15-24 часов и затем вливают в водный раствор (200 мл). Образовавшийся белый осадок отфильтровывают и промывают водой. Промежуточный полимер подвергают сушке вымораживанием. Структура промежуточного полимера была подтверждена с помощью ¹Н-ЯМР наличием пика для группы O-tBu при 1,4 ppm.

Промежуточный полимер обрабатывают TFA (20 мл) в течение 5-8 часов. Затем TFA частично удаляют на роторном испарителе. К остатку добавляют воду и остаток подвергают диализу с использованием полупроницаемой мембраны из целлюлозы (отсекается молекулярный вес 10 000 дальтон) в воде обратного осмоса (смена воды 4 раза) в течение ночи. Поли-(γ-L-глутамил-глутамин) был прозрачен при pH 7 в воде после диализа. После лиофилизации получают поли-(γ-L-глутамил-глутамин) (0,6 г) в виде белого порошка. Структура полимера была подтверждена с помощью ¹Н-ЯМР исчезновением пика для группы O-tBu при 1,4 ppm. Средний молекулярный вес поли-(γ-L-глутамил-глутамина) составлял 99400 дальтон.

ПРИМЕРЫ 4а-4с

Синтез поли-(γ-L-глутамил-глутамина) из поли-L-глутаматных натриевых солей с различными средними молекулярными весами (49000, 19450 и 10900, определенными по системе Heleos с MALS детектором) был выполнен, используя процедуру Примера 4. Молекулярные веса этих полимеров поли-(γ-L-глутамил-глутамина) составлял 110800, 37400 и 19800 дальтон соответственно.

ПРИМЕР 5

Поли-(γ-L-глутамил-глутамин)-поли-L-глутаминовая кислота была приготовлена в соответствии с общей схемой, приведенной на Фигуре 5, следующим образом:

Смешивают в ДФА (30 мл) полиглутамат натрия (0,50 г) со средним молекулярным весом 49 000 дальтон, определенным по системе Heleos с MALS детектором, EDC (0,26 г), HOBt (0,11 г) и H-glu(OtBu)-(OtBu)-HCl (0,05 г). Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 15-24 часов и затем вливают в водный раствор (500 мл). Образовавшийся белый осадок отфильтровывают и промывают водой. Промежуточный полимер подвергают сушке вымораживанием. Структура промежуточного полимера была подтверждена с помощью ¹Н-ЯМР наличием пика для группы O-tBu при 1,4 ppm.

Промежуточный полимер обрабатывают TFA (20 мл) в течение 5-8 часов. Затем TFA частично удаляют на роторном испарителе. К остатку добавляют воду и остаток подвергают диализу с использованием полупроницаемой мембраны из целлюлозы (отсекается молекулярный вес 10 000 дальтон) в воде обратного осмоса (смена воды 4 раза) в течение ночи. Поли-(γ-L-глутамил-глутамин)-поли-L-глутаминовая кислота была прозрачна при pH 7 в воде после диализа. После лиофилизации получают поли-(γ-L-глутамил-глутамин)-поли-L-глутаминовую кислоту (0,25 г) в виде белого порошка. Структура полимера была подтверждена с помощью ¹Н-ЯМР исчезновением пика для группы O-tBu при 1,4 ppm. Средний молекулярный вес поли-(γ-L-глутамил-глутамина) составлял 57400 дальтон.

ПРИМЕР 6

Полимерный конъюгат, обозначенный здесь как PGA-97-A-Texas Red, был получен согласно общей схеме, приведенной на Фигуре 6, следующим образом:

Поли-(γ-L-аспартил-глутамин) со средним молекулярным весом 99 400 дальтон (100 мг) был частично растворен в ДФА (3 мл). Затем были добавлены безводный DCC (130 мг), краситель Техас Red-NH₂ (15 мг), пиридин (200 мкл) и ДМАП (10 мг). Реакция проводили с использованием микроволнового метода при 120°C в течение 30 минут. Затем реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры. Затем реакционную смесь фильтровали в подкисленный водный раствор (200 мл, pH<2, по pH бумаге). Образовавшийся фиолетовый осадок отфильтровывали и промывали водой. Затем фиолетовый осадок растворяли в ацетоне (50 мл). Раствор фильтровали в раствор бикарбоната натрия (0,5М) и осуществляли диализ с использованием полупроницаемой мембраны из целлюлозы (отсекается молекулярный вес 10000 дальтон) в воде обратного осмоса (смена воды 4 раза) в течение ночи. После лиофилизации получали полимер PGA-97-A-Texas Red (80 мг) в виде твердого фиолетового остатка.

ПРИМЕР 7

Полимерный конъюгат, обозначенный здесь как PGA-97-A-DTPA, был получен согласно общей схеме, приведенной на Фигуре 7, следующим образом:

Поли-(γ-L-аспартил-глутамин) со средним молекулярным весом 99 400 дальтон (100 мг) был частично растворен в ДФА (5 мл). Затем был добавлен DCC (200 мг). В реакционную смесь был также добавлен раствор p-NH₂-Bn-DTPA-пента-(tBu эфир) (400 мг) в ДФА (5 мл). Затем был добавлен безводный пиридин (300 мкл) и катализатор ДМАП (10 мг). Реакционную смесь премешивали при нагревании до 120°C в течение 30 минут с использованием микроволнового метода. Затем реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры до образования осадка. Осадок отфильтровали и супернатант подкисляли до pH примерно 2 разведенной в воде хлористоводородной кислотой. Раствор, содержащий промежуточный полимер, подвергали диализу в воде с целлюлозной мембраной в течение 2 дней (отсекается молекулярный вес 10 000 дальтон) и лиофилизировали промежуточный полимер. Структура промежуточного полимера была подтверждена с помощью ¹Н-ЯМР.

Промежуточный полимер обрабатывали TFA в течение 4 часов. Затем TFA удаляли на роторном испарителе. Остаток растворяли в воде и раствор подвергают диализу в воде с использованием мембраны из целлюлозы (отсекается молекулярный вес 10000 дальтон). Затем полимер лиофилизировали. Структура PGA-97-A-DTPA была подтверждена с помощью ¹Н-ЯМР.

ПРИМЕР 8

Полимерный конъюгат, обозначенный здесь как PGA-97-A-DTPA-Gd (III), был получен согласно общей схеме, приведенной на Фигуре 8, следующим образом:

PGA-97-A-DTPA, полученный в Примере 7, обрабатывали ацетатом Gd (III) в буфере в течение 4 часов. Реакционный раствор подвергали диализу в воде с целлюлозной мембраной (отсекается молекулярный вес 10000 дальтон) в течение 3 дней и лиофилизировали с получением полимера (86 мг). Количество Gd (III) было определено количественно с помощью индуктивной эмиссионной плазменно-оптической спектроскопии (ICP-OES). Количество Gd (III), как найдено, составляло 7 вес.% к весу полимера, считая на Gadolinium ICP standards (Ricca Chemical Company, Arlington, Texas (Cat №PGD1KN-500)).

ПРИМЕР 9

Полимерный конъюгат, обозначенный здесь как PGA-97-A-10, был получен согласно общей схеме, приведенной на Фигуре 9, следующим образом:

Поли-(γ-L-аспартил-глутамин) со средним молекулярным весом 99 400 дальтон (351 мг) был частично растворен в ДФА (40 мл). Затем к смеси были добавлены DCC (120 мг) и паклитаксел (44 мг) соответственно. В реакционную смесь были также добавлены ДФА (10 мл) и каталитические количества ДМАП (100 мг). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре 1 день. Окончание реакции контролировали с помощью ТСХ, которая подтверждала отсутствие свободного паклитаксела. Смесь вливали в хлороформ (300 мл) с образованием осадка. Полученный после фильтрации остаток повторно растворяли в метаноле. Выпадение осадка индуцировали добавлением 0,2 N водного раствора хлористого водорода и после центрифугирования при 10000 об/мин выделяли остаток. Затем остаток повторно растворяли в 0,5М растворе бикарбоната натрия. Раствор полимера подвергали диализу в деионизированной воде, используя целлюлозную мембрану (отсекающую 10000 дальтон) в воде обратного осмоса (смена воды 4 раза) в течение 1 дня. Полученный прозрачный раствор подвергали сушке вымораживанием. Был получен PGA-97-A-10 (340 мг) и его структура была подтверждена ¹Н ЯМР. Содержание паклитаксела в PGA-97-A-10 было определено с помощью УФ-спектрометрии и составило 10% вес/вес. Отсутствие свободного паклитаксела было также подтверждено ТСХ.

ПРИМЕР 10

Полимерный конъюгат, обозначенный здесь как PGA-97-A-20, был получен согласно общей схеме, приведенной на Фигуре 9, следующим образом:

Поли-(γ-L-аспартил-глутамин) со средним молекулярным весом 99 400 дальтон (750 мг) был частично растворен в ДФА (50 мл). Затем к смеси были добавлены DCC (450 мг) и паклитаксел (210 мг) соответственно. К смеси был также добавлен ДМАП (100 мг), действующий как катализатор. Реакционную смесь премешивали при комнатной температуре 1 день. Окончание реакции контролировали с помощью ТСХ. Смесь вливали в 0,2 N водный раствор хлористого водорода (300 мл). После центрифугирования при 10 000 об/мин собирали образовавшийся осадок. Затем остаток повторно растворяли в 0,5М растворе NaHCO₃. Раствор полимера подвергали диализу в деионизированной воде, используя целлюлозную мембрану (отсекающую 10000 дальтон) в воде обратного осмоса (смена воды 4 раза) в течение 1 дня. Полученный прозрачный раствор подвергали сушке вымораживанием. Был получен PGA-97-A-20 (700 мг) и его структура была подтверждена ¹Н ЯМР. Содержание паклитаксела в PGA-97-A-20 было определено с помощью УФ-спектрометрии и составило 20% вес/вес.

ПРИМЕРЫ 10а-10b

Синтез полимерных конъюгатов, обозначенных здесь как PGA-44-A-20 и PGA-21-A-20 из полимеров поли-(γ-L-аспартил-глутамина) со средними молекулярными весами 39700 и 17700 дальтон соответственно, был выполнен, используя процедуру Примера 10. Содержание паклитаксела в полимерах было определено с помощью УФ-спектрометрии и составило 20% вес/вес.

ПРИМЕР 10с

Синтез полимерного конъюгата, обозначенного здесь как PGA-44-A-19 из поли-(γ-L-аспартил-глутамина) со средним молекулярным весом 39 700, был выполнен используя процедуру Примера 10, и используя вместо одного паклитаксела смесь паклитаксела и ³Н-паклитаксела. Содержание паклитаксела в полимере было определено с помощью УФ-спектрометрии и составило 10% вес/вес.

ПРИМЕР 11

Полимерный конъюгат, обозначенный здесь как PGA-97-G-20, был получен согласно общей схеме, приведенной на Фигуре 10, следующим образом:

Поли-(γ-L-глутамил-глутамин) со средним молекулярным весом 110800 дальтон (1,0 г) был частично растворен в ДФА (55 мл). Затем к смеси были добавлены EDC (600 мг) и паклитаксел (282 мг) соответственно. К смеси был также добавлен ДМАП (300 мг), действующий как катализатор. Реакционную смесь премешивали при комнатной температуре 1 день. Окончание реакции контролировали с помощью ТСХ. Смесь вливали в 0,2 N водный раствор хлористого водорода (300 мл). После центрифугирования при 10 000 об/мин собирали образовавшийся осадок. Затем остаток повторно растворяли в 0,5М растворе NaHCO₃. Раствор полимера подвергали диализу в деионизированной воде, используя целлюлозную мембрану (отсекающую 10000 дальтон) в воде обратного осмоса (смена воды 4 раза) в течение 1 дня. Полученный прозрачный раствор подвергали сушке вымораживанием. Был получен PGA-97-G-20 (1,1 г) и его структура была подтверждена ¹Н ЯМР. Содержание паклитаксела в PGA-97-G-20 было определено с помощью УФ-спектрометрии и составило 20% вес/вес.

ПРИМЕРЫ 11а-11 с

Синтез полимерных конъюгатов, обозначенных здесь как PGA-44-G-20, PGA-32-G-20 и PGA-21-G-20 из полимеров поли-(γ-L-глутамил-глутамина) со средними молекулярными весами 38390, 37400 и 19800 дальтон соответственно, был выполнен используя процедуру Примера 11. Содержание паклитаксела в каждом полимере было определено с помощью УФ-спектрометрии и составило 20% вес/вес. Увеличивая количество паклитаксела достигали большей нагрузки паклитакселом. Например, PGA-32-G-40 был получен из полимера поли-(γ-L-глутамил-глутамина), имеющего среднюю молекулярную массу 37400 дальтон и используя процедуру Примера 11. Содержание паклитаксела было определено с помощью УФ-спектрометрии и составило 40% вес/вес.

ПРИМЕРЫ 12а-12с

Синтез полимерных конъюгатов, обозначенных здесь как PGA-97-G-24, PGA-32-G-19 и PGA-21-G-19 из полимеров поли-(γ-L-глутамил-глутами-на) со средними молекулярными весами 110800, 37400 и 19800 дальтон соответственно, был выполнен, используя процедуру Примера 11 и используя вместо одного паклитаксела смесь паклитаксела и ³Н-паклитаксела. Содержание паклитаксела в PGA-97-G-24, PGA-32-G-19 и PGA-21-G-19 было определено с помощью УФ-спектрометрии и составило 24%, 19% и 19% 20% вес/вес соответственно.

ПРИМЕР 13

Синтез защищенного C2'-PTX-Glu и защищенного C7-PTX-glu

Смешивали Z-GIu-OBzI (2,6 г), паклитаксел (2,0 г), EDC (1,5 г) и DMAP (300 мг) в ДФА (20 мл) и перемешивали в течение 15 часов. Результаты ТСХ показали отсутствие свободного паклитаксела в смеси. Затем смесь вливали в 0,2N водную соляную кислоту (100 мл) и органический продукт экстрагировали этилацетатом (два раза × 50 мл). Органические фазы объединяли и промывали раствором 0,5М бикарбоната натрия (100 мл). Затем органическую фазу высушивали безводным сульфатом натрия. Удаляли на роторном испарителе этилацетат и продукты очищали хроматографией на силикагеле (гексан: этилацетат, 1:1). ¹Н-ЯМР подтвердил, что полученные продукты представляли собой защищенный C2'-PTX-Glu (2,2 г) и защищенный С7-PTX-glu (0,42 г).

ПРИМЕР 13а

Синтез C2'-РТХ-Glu

Защищенный С2'-PTX-Glu (2,2 г) и 10%-й Pd/C (0,20 г) перемешивали в восстановленном метаноле (150 мл). Газообразный водород использовали из баллона. Реакцию гидрогенизации проводили в течение четырех часов. Анализ с помощью ТСХ подтвердил окончание реакции. Раствор отфильтровывали через 0,2-мкм фильтр. Получали прозрачный раствор и удаляли метанол на роторном испарителе. Сырой продукт далее очищали с помощью ВЭЖХ с обратной фазой используя градиент вода-ацетонитрил. После очистки с помощью ВЭЖХ и сушки вымораживанием получали С2'-PTX-Glu (600 мг) и продукт был подтвержден LC-MS. Результат показан на Фигуре 11. С2'-PTX-glu имел время ВЭЖХ приблизительно 32 минуты и время LC-MS приблизительно 6,2 минуты.

ПРИМЕР 13b.

Синтез C7-PTX-Glu

Защищенный C7-PTX-Glu (250 мг) и 10%-й Pd/C (0,20 г) размешивали в растворе восстановленного метанола (150 мл). Газообразный водород вводили в рствор из баллона и реакцию гидрогенизации проводили в течение четырех часов. После завершения реакции по данным ТСХ раствор отфильтровывали через 0,2-мкм фильтр. Получали прозрачный раствор и удаляли метанол на роторном испарителе. Сырой продукт далее очищали с помощью ВЭЖХ с обратной фазой, используя градиент вода-ацетонитрил. После очистки с помощью ВЭЖХ и сушки вымораживанием получали С2'-PTX-Glu (600 мг) и продукт был подтвержден LC-MS. Результат показан на Фигуре 11. С2'-PTX-glu имел время ВЭЖХ приблизительно 35 минут и время LC-MS приблизительно 6,4 минуты.

ПРИМЕР 14

Полимерный конъюгат, обозначенный здесь как PGA-97-G-27, был получен согласно общей схеме, приведенной на Фигуре 12, следующим образом:

Поли-L-глутаминовую кислоту (210 мг) растворяли в ДФА (10 мл). К смеси добавляли EDC (65% мол) и NHS (65% мол) и перемешивали в течение 15 часов. Затем к смеси добавляли раствор С2'-PTX-Glu (105 мг) в ДФА (2 мл). После этого добавляли 0,5 М раствор бикарбоната натрия (3 мл). Смесь перемешивали в течение 3 часов и затем вливали в разбавленный раствор 0,2N соляной кислоты (300 мл). После центрифугирования при 10000 об/мин собирали образовавшийся осадок.

Остаток повторно растворяли в 0,5 М растворе бикарбоната натрия. Раствор полимера подвергали диализу в деионизированной воде, используя целлюлозную мембрану (отсекающую 10 000 дальтон) в воде обратного осмоса (смена воды 4 раза) в течение 1 дня. Полученный прозрачный раствор подвергали сушке вымораживанием. Был получен PGA-97-G-27 (250 мг) и его структура была подтверждена ¹Н ЯМР. Содержание паклитаксела в PGA-97-G-27 было определено с помощью УФ-спектрометрии и составило 27% вес/вес.

ПРИМЕР 15

Синтез РGА-97-G-Доксорубицин

Поли-(γ-L-аспартил-глутамин) (70 мг), доксорубицин (30 мг), EDC (50 мг), HOBt (15 мг) растворяли в ДФА (4 мл). Смесь помещали в микроволновую печь при 120°C на 10 минут и затем вливали в 0,2N раствор соляной кислоты. Собирали образовавшийся осадок. Остаток повторно растворяли в разбавленном 0,5М растворе бикарбоната натрия и подвергали диализу в деионизированной воде, используя целлюлозную мембрану (отсекающую 10 000 дальтон) в воде обратного осмоса (смена воды 4 раза) в течение 1 дня. Полученный прозрачный раствор подвергали сушке вымораживанием. Был получен PGA-97-G-Доксорубицин (80 мг) и его структура была подтверждена ¹Н ЯМР.

ПРИМЕР 16

Синтез PGA-97-G-Камтотецина

Поли-(γ-L-аспартил-глутамин) (70 мг), глицил-камптотецин (30 мг), EDC (50 мг), HOBt (15 мг) растворяли в ДФА (4 мл). Смесь помещали в микроволновую печь при 120°C на 10 минут и затем вливали в DCM (150 мл), при этом образовывался осадок. Остаток обрабатывали ультразвуком в разбавленном 0,2N растворе соляной кислоты. Полученный твердый остаток отфильтровывали, промывали дистиллированной водой, подвергали сушке вымораживанием. Образовавшийся РGА-97-G-Камтотецин собирали в виде светло-желтого твердого остатка (50 мг).

ПРИМЕР 17

Растворимость

Растворимость различных полимеров проверяли при различных уровнях pH и сравнивали с контрольной поли-L-глутаминовой кислотой (PGA-19,800) со средним молекулярным весом 19 800 дальтон. Тестируемыми полимерами были поли-(γ-глутамил)-поли-L-глутамин (PGPG-19800), со средней молекулярной массой 19800 дальтон; поли-(γ-глутамил)-поли-L-глутамин (PGPG-37,400), со средней молекулярной массой 37 400 дальтон; поли-L-глутамат-паклитаксел-20% (PGA (32k)-РТХ-20), полученный из исходного полимера PGA-19,800 и содержащий паклитаксел в количестве 20% вес/вес; PGA-21-G-20, полученный из исходного полимера поли-(γ-глутамил)-поли-L-глутамина-19 800 и содержащий паклитаксел в количестве 20% вес/вес; и PGA-32-G-20, полученный из исходного полимера поли-(γ-глутамил)-поли-L-глутамина-37400 и содержащий паклитаксел в количестве 20% вес\вес.

Каждый полимер (5 мг) был добавлен в pH буфер (1 мл) и смесь обрабатывали ультразвуком в течение 2 минут. Тогда смеси давали отстояться при комнатной температуре в течение 30 минут. Растворимость наблюдали визуально и регистрировали в масштабе 1 к 10, где 1 нерастворимо, 5 - непрозрачная суспензия и 10 - прозрачный раствор. Результаты приведены в следующей Таблице1.

Пример 18а

Культура клеток и подготовка

Клетки B16F0 были взяты из АТСС (CRL-6322, АТСС American Туре Culture Collection, Rockville, MD) и выращивали в измененной Дульбекко среде Игла (DMEM) с 10% фетальной сывороткой и 100 ед/мл пенициллина. Клетки росли при 37°C в 5% CO₂. Культуральную среду отделяли и сбрасывали. Клетки промывали Фосфатным Буферным Раствором Дульбекко (DPBS) с добавлением раствора Трипсин-этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) (0.5 мл) и клетки исследовали под инвертированным микроскопом, убеждаясь, что они отходят. Дополнительно добавляли ростовую среду (от 6.0 до 8.0 мл) и клетки осторожно пептировали. Клеточную суспензию в определенном количестве переносили в новую культуральную питательную среду в чашке Петри. Клетки выращивали при 37°C в 5% СO₂ в течение 24 часов перед дальнейшими экспериментами.

Пример 18b

Исследование клеточного усвоения in vitro

Красители PGA-97-A-Texas Red и Texas Red (TR) отдельно растворяли в DPBS. Оба раствора, содержащие краситель, добавляли к клеткам до конечной концентрации от 0.1 мкМ до 10 мкМ. Клетки со смесью инкубировали при 37°C в течение 8-24 часов, затем клетки трижды промывали DPBS. Обработанные клетки изучали под флуоресцентным микроскопом OLYMPUS, возбуждение и выделение измеряли при длине волны 591 и 612 нм, соответственно. Результаты показали, что клетки не усваивали краситель Texas Red из PGA-97-A-Texas Red, но не из одного Texas Red.

Три сосуда с образцами содержали примерно одинаковое количество клеток меланомы B15F0, которые инкубировали с 1 мкМ PGA-97-A-Texas Red, и 10 мкМ только Texas Red соответственно, в течение 24 часов. Фотографировали клеточное усвоение in vitro каждого взятого сосуда с помощью камеры на системе флуоресцентного микроскопа Olympus. На фотографии образца с 1 мкМ PGA-97-A-Texas Red примерно 30% клеток были красными. На фотографии образца с 0.1 мкМ PGA-97-A-Texas Red примерно 10% клеток были красными. На фотографии образца с 10 мкМ только Texas Red 0% клеток были красными. Результаты показали, что клетки усваивают краситель из PGA-97-A-Texas Red, но не усваивают краситель из одного Texas Red. Полимерный конъюгат эффективен для внутриклеточной доставки лекарства.

Пример 18с

Клеточное усвоение было также подтверждено конфокальной микроскопией (Olympus FV1000). Клеточные ядра были окрашены Hoechst 33342 в течение 5-20 минут, промывали 2-3 раза DPBS и исследовали под сканирующим лазерным конфокальным микроскопом. Возбуждение и выделение Hoechst 33342 измеряли при длине волны 405 и 461 нм, соответственно. Texas Red (TR) был возбужден лазером при 543 нм и обнаруживался при 615 нм в условиях 5% CO₂ при 37°C. Результаты показали, что краситель Texas Red из PGA-97-A-Texas Red был усвоен клетками B16F0 после 24 часов воздействия. Texas Red из PGA-97-A-Texas Red был найден в цитоплазме и не усвоен ядрами.

Фотографии с помощью конфокальной микроскопии (Olympus FV100) показали усвоение клетками in vitro 1 мкМ PGA-97-A-Texas Red, где сравнивали усвоение цитоплазмой и усвоение ядрами. Фотографии показали, что PGA-97-A-Texas Red был усвоен клетками B16F0 после 24 часов взаимодействия. PGA-97-A-Texas Red был обнаружен в цитоплазме и не усвоен ядрами.

Пример 19.

Модель изогенной опухоли

Животные: nu/nu мыши, самки, 6-8 недель (22-25 г). Солитарная опухоль была вызвана инъекцией 2x10⁵ мышиных клеток меланомы (B16F0) подкожно в правое бедро. Спустя 5-7 дней опухоль достигла 500 мм, краситель PGA-97-A-Texas Red или Texas Red был введен внутривенно в опухоль.

Пример 20.

Применение PGA-97-A-Texas Red или TR и криостанный срез

PGA-97-A-Texas Red или Texas Red отдельно растворяли в DFBS и фильтровали через 0.2 мкм фильтры перед тем, как применять животным. 100 мкл PGA-97-A-Texas Red (TR в конценрации 2.5%) или 0,1-10 мМ Texas Red вводили внутривенно в опухоль с использованием модели изогенной опухоли Примера 19. Опухоль разрезали, заливали оптимальной температурой для разрезания и замораживали жидким азотом. Делали криостанный срез (6-15 мкм) и фиксировали 4% формальдегидом с 0.03М сахарозой на льду на 10-30 мин. Разрезы промывали DFBS 2 раза, окрашивали Hoechst 33342 (1 мкг/мл) в течение 10 минут и снова промывали DFBS. Разрезы затем готовили к исследованию с флуоресцентной готовой средой (Dako-Cytomation) и покрывали покровным стеклом. Криостанный срез опухоли исследовали под сканирующим лазерным конфокальным микроскопом. Изображение показало, что краситель Texas Red из PGA-97-A-Texas Red накапливается в опухолевых клетках in vivo через 24 часа после того, как применяли внутривенно PGA-97-A-Texas Red, но не накапливается с одним красителем Texas Red.

Фотографии криостанного поперечного среза опухолевой ткани in vivo показали, что PGA-97-A-Texas Red и один краситель Texas Red были усвоены. Для каждого были взяты три различных поперечных для набора шести изображений. Три фотографии различных поперечных срезов с красителем только Texas Red наблюдались как зеленые, оранжево-желтые и фактически черными. Три фотографии с различными поперечными срезами с PGA-97-A-Texas Red наблюдались как зеленые, оранжево-желтые и немного красных областей. Краситель Texas Red из PGA-97-A-Texas Red был обнаружен в опухолевой ткани на одной из фотографий. С другой стороны, краситель Texas Red не был обнаружен в похожих фотографиях одного Техаs Red. Эти результаты показали, что краситель Texas Red из PGA-97-A-Texas Red накапливается в опухолевых клетках in vivo через 24 часа после внутривенного применения PGA-97-A-Texas Red, но не накапливается с одним только Texas Red.

Кроме того, краситель Texas Red из PGA-97-A-Texas Red можно также увидеть в эндотелиальных клетках около кровеносного сосуда опухоли. Были сделаны дополнительные фотографии других поперечных срезов опухолевой ткани. Красный краситель наблюдался около кровеносных сосудов через 24 часа после внутривенного применения в хвостовую вену PGA-97-A-Texas Red. Результаты показали, что PGA-97-A-Texas Red может наблюдаться в эндотелиальных клетках около сосудов опухоли.

Пример 21

Исследование цитотоксичности МТТ in vitro

Описываемые здесь конъюгаты полимеров, содержащие паклитаксел, оценивали на воздействие на пролиферацию клеток меланомы B16F0 с различными концентрациями лекарственного средства. Исследование цитотоксичности МТТ было выполнено, как описано в Monks et al. JNCI 1991, 83, 757-766, которые здесь приведены в качестве ссылки во всей своей полноте. PGA-44A-20 был приготовлен как в Примере 10а, с поли-(γ-L-аспартил-глутамином), имеющим среднюю молекулярную массу 39,700 дальтон, на основе системы Heleos с MALS детектором, процентное содержание паклитаксела в полимере была 20%. PGA-97-А-20 был приготовлен, как в Примере 10, из поли-(γ-L-аспартил-глутамином), имеющим среднюю молекулярную массу 99,400 дальтон на основе системы Heleos с MALS детектором, процентное содержание паклитаксела в полимере была 20%. PGA(97k)-PTX-20 использовали как контрольный образец полимера и получали согласно литературному методу из поли-L-глутамиловой кислотой, имеющей молекулярную массу 49,000 дальтон на основе системы Heleos с MALS детектором, процентная масса паклитаксела в полимере была 20% (See Li et al., "Complete Regression of Well-established tumors using a novel water soluble poly(L-glutamic acid)-паклитаксел conjugate." Cancer Research 1998, 58, 2404-2409). Результаты показаны на Фигуре 13. Уменьшение жизнеспособности клеток меланомы с увеличением концентрации лекарственного вещества показано на Фигуре 13. Эти результаты показали, что PGA-44-A-20 и PGA-97-A-20 являются эффективными противоопухолевыми агентами.

Пример 22

Исследование цитотоксичности МТТ in vitro

Конъюгат полимера, содержащий паклитаксел, сравнивали с контрольным полимером, не содержащим паклитаксел, и контролем Таксол без полимера, и наблюдали их влияние на пролиферацию клеток меланомы B16F0 при нескольких различных концентраций лекарственного средства. Исследование цитотоксичности МТТ описано в Monks et al. JNCI 1991, 83, 757-766. PGA-97-A-10 был приготовлен как в Примере 9 с поли-(γ-L-аспартил-глутамином), имеющим молекулярную массу 99,400 дальтон на основе системы Heleos с MALS детектором, а процентное содержание паклитаксел в полимере было 10%. PGA (97k)-РТХ-10 использовали в качестве контрольного образца полимера, который приготовляли согласно литературным данным (Li et al., "Complete Regression of Well-established tumors using a novel water soluble poly(L-glutamic acid)-паклитаксел conjugate." Cancer Research 1998, 58, 2404-2409) с поли-L-глутамиловая кислотой, имеющей молекулярную массу 49,000 дальтон на основе системы Heleos с MALS детектором, процентное содержание паклитаксела в полимере 10%. Полимером, не содержащим паклитаксел, был поли-(γ-L-аспартил-глутамин) натриевая соль.

Результаты показаны на Фигуре 14. Натриевая соль полимера, не имеющая противоопухолевого лекарственного средства, обладает маленьким действием на жизнедеятельность клетки меланомы. PGA-97-A-10 сравнивали с положительным контролем полимера, содержащим противоопухолевое лекарственное средство. Как показано на Фигуре 14, PGA-97-А-10 действует как эффективный противоопухолевый агент.

Пример 23

Животные и Модели Опухолей для Фармакологических исследований

Голые мыши (6-7 недель жизни, весом 25-30, самки) приобретены в Charles River Lab (Willington, MA). Клеточная линия B16F0 была получена из АТСС (CRL-6322, АТСС American Type Culture Collection, Rockville, MD). Клетки B16F0 культивировались в DMEM, дополненной 10% фетальной бычьей сывороткой, 2 мкМ Глутамина, 1 мМ не-эссенциальных аминокислот, 1 мМ пирувата натрия, 100 Ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина. Клетки B16F0, собранные из культуральной ткани, подсчитывали и ресуспендировали до концентрации 5×10⁶ на мл. Использовали ТБ шприц 0.4 мл (общее количество 2×10⁶ клеток), применяли для подкожной инъекции каждой мыши. Четыре опухоли привили животным в области правой лопатки, левой лопатки, правого бедра, правого бедра и левого бедра.

Пример 23а

При том значении, когда средний объем опухоли для целой популяции мышей из Примера 23 имеет 200-300 мм³ (диаметр 6-8 мм), каждая опухоль животного возникала, принимая однократно IV инъекции ударной дозы ³Н-Таксола (контроль) или PGA-44-А-19 через хвостовую вену.

PGA-44-А-19 был приготовлен, как в Примере 10с, с поли-(γ-L-аспартил-глутамином), имеющим среднюю молекулярную массу 39,700 дальтон на основе системы Heleos с MALS детектором, процентное содержание паклитаксела в полимере составляло 19%. Контролем для этого образца был Таксол. Доза свободного Н-Таксола (контроль) и PGA-44-А-19 составляла эквивалент паклитаксела 20 мг на кг. Для каждого лекарственного средства, группы по 4 мыши были анестезированы в разные моменты времени (каждая в час): 0 (настолько быстро насколько возможно после IV инъекции), 0.083, 0.25, 1.0, 2.0, 4.0, 8.0, 48, 72, 96, 120 и 144. Собранные 0.5 мл крови взяты из сердца и орбитальной вены. Затем мышь убивали до прихода в себя из анестезии. Образец крови каждой мыши центрифугировали при 11,000 об/мин. Супернатант плазмы (0,2-0,3 мл) из образца крови собирали и переносили в новую пробирку. 0,1 мл Плазмы каждого образца был отдельно перенесен в новую 10-мл пробирку куда добавляли сцинтилляционную жидкость (5 мл). Содержание паклитаксела было анализировано с использованием сцинтилляционной жидкости LS6500 вычислительной системы (Beckman) и рассчитывали из стандартной кривой каждого образца. Результаты показаны на Фигуре 15. Концентрация паклитаксела PGA-44-А-19 сохраняется гораздо более длительный период времени. Эти результаты показали, что паклитаксел в PGA-44-А-19 имеет более длительный срок эффективности в циркулирующей крови по сравнению с одним Таксолом.

Пример 24.

При том значении, когда средний объем опухоли для целой популяции мышей из Примера 23 имеет 200-300 мм³ (диаметр 6-8 мм), каждая опухоль животного возникала, принимая однократно IV инъекции ударной дозы ³Н-Таксола (контроль) или PGA-44-А-19 через хвостовую вену.

PGA-44-А-19 был получен, как в Примере 10 с, из поли-(γ-L-аспартил-глутамина), имеющего среднюю молекулярную массу 39,700 дальтон на основе системы Heleos с MALS детектором, а процентное содержание паклитаксела в полимере 19%. Доза свободного ³Н-Таксол (контроль) и PGA-44-А-19 составляла эквивалент паклитаксела 20 мг на кг. Для других лекарственных средств группы по 4 мыши были анестезированы в разные моменты времени (каждая в час): 0 (настолько быстро, насколько возможно после IV инъекции), 0,083, 0,25, 1,0, 2,0, 4,0, 8,0, 48, 72, 96, 120 и 144. Опухоли из двух бедер и двух лопаток собраны раздельно. Затем мышь убивали до прихода в себя из анестезии. Приблизительно 80-180 мг от каждой опухоли помещали в сцинтилляционную пробирку и опухоль была поглощена Soluene (тканевой растворитель) (1 мл). Затем 0,1 мл усвоенной ткани перенесли в 10-мл пробирку и смешали с сцинтилляционной жидкостью (5 мл) в пробирке. Содержание паклитаксела было проанализировано с помощью сцинтилляционной жидкости LS6500 расчетной системы (Beckman) и рассчитано из стандартной кривой каждого образца. PGA-44-А-19 был сравнен с контролем Таксол. Результаты показаны на Фигуре 16. Паклитаксел PGA-44-А-19 накапливался в опухоли и сохранялся более долгий период времени. Эти результаты определили, что паклитаксел с PGA-44-А-19 лучше накапливается в опухоли по сравнению с одним Таксолом.

Пример 25

Животные и Модели Опухолей для исследования эффективности in vivo

Голые мыши (6-8 недель жизни, весом 21-25 г, самцы) были получены в Charles River Lab (Willington, MA). Стабильные клетки B16F0 поддерживались в культуре клеток в DMEM, дополнительно содержащей 10% Бычьей Сыворотки и 100 Ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина. Клетки разделяли 48 часов перед засевом, чтобы они были в экспоненциальной фазе роста после их сбора. Клетки были собраны из культуральной ткани с помощью трипсин-ЭДТА и посчитаны на гемоцитометре в присутствии трипанового синего. Клетки были суспенизированы при концентрации 5×10⁶ на мл в среде DMEM без сыворотки. Суспензию клеток опухоли прививали с помощью инсулинового шприца 1 сс в концентрации 5×10⁶ на мл через лопатку и через бедро, вводя 0.1 мл суспензии опухолевых клеток (4 области/мышь).

В день прививания опухоли мышей одну за другой помещали в одну из 6 групп и сажали по 3 мыши в клетку с общим числом 12. Каждой мыши прокалывали под анестезией ухо во время прививания опухоли, чтобы однозначно индетифицировать в ходе эксперимента. Каждая клетка была помечена лекарственным средством, дозой лекарственного средства, применяемого животным и числом содержащихся животных.

Пример 25а

Измеряли токсическое снижение веса при максимальной толерантной дозе (МТД) полимеров, полученных в соответствии с Примерами 11а-11с. МТД определялась тогда, как доза производила максимум 15% потери веса тела за 2 недели. PGA-21-G-20 и PGA-32-G-20 приготавливали, как раскрыто в Примере 11с и 11b, соответственно из начальных полимеров поли-(γ-L-глутамил-глутамина), имеющих молекулярную массу 19,800 и 37,400 дальтон, соответственно, на основе системы Heleos с MALS детектором, процентное содержание паклитаксел в каждом полимере было 20%. PGA-21-G-20 и PGA-32-G-20 растворяли в солевом растворе 50 мг на мл. Контрольным противоопухолевым лекарственным средством для этого образца был Abraxane, который согласован FDA как противоопухолевое лекарственное средство. В качестве негативного контроля был использован солевой раствор, не содержащий противоопухолевого лекарственного средства. Действующую дозу введенного лекарственного вещества устанавливали на основании веса тела каждого животного. Первая доза лекарственно средства была дана мыши, когда средняя величина опухоли целой популяции мышей достигала от 15 до 50 мм³ (размер опухоли был предположен из формулы (w²×l)/2, где l это самый большой диаметр опухоли, a w - диаметр, перпендикулярный самому большому диаметру, измеренному в миллиметрах). Мыши получали 2 дозы лекарственного средства в последующие два дня, вводимой через хвостовую вену вместе с анестезией. Основной раствор готовили свежим в день инъекции. Основной раствор лекарственного средства набирали 1 сс шприцом и вводили внутривенно. Мыши взвешивались до примерно 0,1 г. Голым nu/nu мышам путем инъекции вводили как PGA-32-G-20 мг/кг в дозе 150 мг/кг так и PGA-32-G-20 в дозе 150 мг/кг по сравнению с Abraxane в дозе 100 мг/кг эквивалента паклитаксела. Изменение веса тела (%) при лечении каждым лекарственным средством наблюдали независимо друг от друга и регистрировали во времени (дни). Результаты показаны на Фигуре 17. PGA-21-G-20 показал незначительное снижение веса тела при очень больших дозах. PGA-32-G-20 показал снижение веса по сравнению с Abraxane при более высоких дозах. Эти результаты показывают, что предпочтительные полимеры настоящего изобретения, конъюгированные с противоопухолевым лекарственным средством, являются менее токсичными для мышей.

Пример 26

Исследование эффективности in vivo

Измеряли противоопухолевый эффект PGA-21-G-20, PGA-32-G-20 и Abraxane в максимальной толерантной дозе (МТД) на опухоли меланомы B16F0-EGF у голой мыши, как описано в Примере 25 во времени, с солевым раствором в качестве негативного контроля. PGA-21-G-20 и PGA-32-G-20 разводили 50 мг на мл. Контрольным противоопухолевым лекарственным средством для этого образца был Abraxane, согласованный FDA как противоопухолевое лекарственное средство. Солевой раствор использовали в качестве другого контроля без противоопухолевого лекарственного средства. Действующую дозу введенного лекарственного вещества устанавливали в зависимости от веса тела каждого животного. Первая доза лекарственного средства была дана мыши, когда средняя величина опухоли целой популяции мышей достигала от 15 до 50 мм³. Мыши получали 2 дозы лекарственного средства в последующие два дня, вводимого через хвостовую вену вместе с анестезией. Основной раствор готовили свежим в день инъекции. Основной раствор лекарственного средства набирали 1 сс шприцом и вводили внутривенно. Размер опухоли измеряли до приблизительно 0.1 мм. Голым мышам вводили более высокие количества как PGA-21-G-20 в дозе 175 мг/кг, так и PGA-32-G-20 в дозе 150 мг/кг по сравнению с Abraxane контролем в дозе 100 мг/кг эквивалента паклитаксела. Изменение размера опухоли при лечении каждым лекарственным средством наблюдали независимо друг от друга и регистрировали во времени (дней). Результаты показаны на Фигуре 18. Оба PGA-21-G-20 и PGA-32-G-20 значительно ингибируют опухолевый рост. Эти результаты показали, что предпочтительные полимеры представленного изобретения, конъюгированные с противоопухолевым лекарственным средством, являются эффективными противораковыми агентами.

Пример 27

Измеряли токсическое снижение веса при МТД полимера, полученного в соответствии с Примером 11. PGA-97-G-20 был приготовлен по методу, описанному в Примере 11. Исходным материалом был поли-(γ-L-глутамил-глутамин) с примерной молекулярной массой 110,800 дальтон на основании системы Heleos с MALS детектором. Процентное содержание паклитаксела в полимере было 20%. PGA-97-G-20 разводили в солевом растворе 50 мг на мл. Контролем противоопухолевого лекарственного средства для этого образца был Таксол и Abraxane, одобренный FDA как противоопухолевое лекарственное средство. Действующую дозу введенного лекарственного вещества устанавливали в зависимости от веса тела каждого животного. Первая доза лекарственного средства была дана мыши, когда средняя величина опухоли целой популяции мышей достигала от 15 до 50 мм³. Мыши получали 2 дозу лекарственного средства в последующие два дня, вводимую через хвостовую вену вместе с анестезией. Основной раствор готовили свежим в день инъекции. Основной раствор лекарственного средства набирали 1 сс шприцом и вводили внутривенно. Мышей взвешивали примерно до 0,1 г. Голым nu/nu мышам вводили более высокие количества PGA-97-G-20 (60 мг/кг) по сравнению с Abraxane (мг/кг) и Таксолом (50 мг/кг) как их эквивалента паклитакселу. Изменение веса тела (%) при лечении каждым лекарственным средством наблюдали независимо друг от друга и регистрировали во времени (дни). Результаты показаны на Фигуре 19. Как показано на Фигуре 19, PGA-97-G-20 показал сравнимое уменьшение веса тела по сравнению с контролем при более высокой дозировке. Эти результаты показали, что предпочтительные полимеры настоящего изобретения, конъюгированные с противоопухолевыми средствами, имеют сравнимую токсичность по отношению к клинически одобренным лекарственным средствам.

Пример 28

Исследование эффективности in vivo

Измеряли противоопухолевый эффект PGA-97-G-20, Таксола и Abraxane при максимальной толерантной дозе (МТД) на опухоли меланомы B16F0-EGF у голой nu/nu мыши во времени с солевым раствором в качестве негативного контроля. PGA-97-G-20 разводили в солевом растворе 50 мг на мл. Контрольным противоопухолевым лекарственным средством для этого образца были Таксол и Abraxane, одобренные FDA как противоопухолевые лекарственные средства. Действующую дозу введенного лекарственного вещества устанавливали по весу тела каждого животного. Первая доза лекарственно средства была дана мыши, когда средняя величина опухоли целой популяции мышей достигала от 15 до 50 мм³. Мыши получали 2 дозу лекарственного средства, вводимого через IV хвостовую вену без анестезии на следующий день. Исходный раствор готовили свежим в день инъекции. Исходный раствор лекарственного средства набирали 1 сс шприцом и вводили внутривенно. Размер опухоли измеряли до приблизительно 0,1 мм. Голым nu/nu мышам вводили более высокие количества PGA-97-G-20 в дозе 60 мг/кг по сравнению с Abraxane в дозе 100 мг/кг и Таксола 50 мг/кг, как эквивалентов паклитаксела. Изменение размера опухоли при лечении каждым лекарственным средством наблюдали независимо друг от друга и регистрировали во времени (дни). Результаты показаны на Фигуре 20. Как показано на Фигуре 20, PGA-97-G-20 оказывает существенный эффект на опухолевый рост и показывает лучшие результаты, чем Таксол и Abraxane. Эти результаты показали, что предпочтительные полимеры заявленного изобретения, конъюгированные с противоопухолевым лекарственным средством, являются эффективными противоопухолевыми агентами.

Пример 29.

Измеряли токсическое снижение веса при максимальной толерантной дозе конъюгатов полимера, содержащих паклитаксел, по сравнению с полиглутамиловой кислотой, конъюгированной с паклитакселом. PGA-32-G-20 был приготовлен по методу, описанному в Примере 11b. Исходным материалом был полимер поли-(γ-L-глутамил-глутамин) с приблизительной молекулярной массой 37,400 дальтон на основании системы Heleos с MALS детектором, процентное содержание паклитаксела в каждом полимере было 20%. PGA-32-G-20 сравнивали с контрольной полиглутамиловой кислотой с молекулярной массой 19,450 дальтон (на основании системы Heleos с MALS), конъюгированной с паклитакселом, при условии процентного содержания паклитаксела в полимере 20% (PGA(32k)-PTX-20). Солевой раствор был использован как основной контроль с не противоопухолевым лекарственным средством. Оба PGA-32-G-20 и PGA(32k)-PTX-20 растворяли в солевом растворе 50 мг на мл. Солевой раствор был использован как контроль с не противоопухолевым лекарственным средством. Действующую дозу введенного лекарственного вещества устанавливали на основании веса тела каждого животного. Первая доза лекарственно средства была дана мыши, когда средняя величина опухоли целой популяции мышей достигала от 15 до 50 мм³. Мыши получали 2 дозу лекарственного средства, вводимую через IV хвостовую вену без анестезии на следующий день. Исходный раствор готовили непосредственно в день инъекции. Исходный раствор лекарственного средства набирали 1 сс шприцом и вводили внутривенно. Мышей взвешивали примерно до 0.1 г. Голой nu/nu мыши вводили более высокие количества PGA-32-G-20 в дозе 125 мг/кг по сравнению с PGA(32k)-PTX-20 в дозе 100 мг/кг эквивалента паклитаксела. Изменение веса тела (%) при лечении каждым лекарственным средством наблюдали независимо друг от друга и регистрировали во времени (дни). Результаты приведены на Фигуре 21. PGA-32-G-20 показал сравнимую потерю веса по отношению к контролю при более высокой дозе. Эти результаты показывают, что предпочтительные полимеры настоящего изобретения, конъюгированные с противоопухолевым лекарственным средством, имеют сравнимую токсичность с исследованными лекарствами.

Пример 30

Исследование эффективности in vivo

Противоопухолевый эффект PGA-32-G-20 и PGA(32k)-PTX-20 максимальной толерантной дозы (МТД) на опухоль меланомы B16F0-EGF у голой nu/nu мыши измеряли во времени с солевым раствором в качестве негативного контроля. Оба PGA-32-G-20 и PGA(32k)-PTX-20 разводили в солевом растворе 50 мг на мл. Действующую дозу введенного лекарственного вещества устанавливали на основании веса тела каждого животного. Первая доза лекарственно средства была дана мыши, когда средняя величина опухоли целой популяции мышей достигала от 15 до 50 мм³. Мыши получали 2 дозу лекарственного средства, вводимого через IV хвостовую вену без анестезии, на следующий день. Исходный раствор готовили непосредственно в день инъекции. Исходный раствор лекарственного средства втягивают 1 сс шприцом и вводят внутривенно. Мышей взвешивали примерно до 0.1 г. Голым nu/nu мышам вводили более высокие количества PGA-32G-20 в дозе 125 мг/кг по сравнению PGA(32k)-PTX-20 в дозе 100 мг/кг эквивалент паклитаксела. Размер опухоли измеряли до приблизительно 0.1 мм. Изменение размера опухоли при лечении каждым лекарственным средством наблюдали независимо друг от друга и регистрировали во времени (дни). Результаты приведены на Фигуре 22. PGA-32-G-20 оказывает существенный эффект на опухолевый рост и показывает лучшие результаты, чем PGA(32k)-PTX-20. Эти результаты показали, что предпочтительные полимеры заявленного изобретения, конъюгированные с противоопухолевым лекарственным средством, являются эффективными противоопухолевыми агентами.

Пример 31

Полимерные конъюгаты были исследованы для установления скорости высвобождения паклитаксела в соответствии с различными выбранными молекулярными массами полимеров. PGA-21-G-20, PGA-32-G-20, PGA-97-G-20 и контроль PGA(32k)-PTX-20 помещали в фосфатные буферы в концентрации 2 мг на мг и измеряли скорость высвобождения. Раствор конъюгата полимер-паклитаксел инкубировали при 37°C. В различные моменты времени брали аликвоты по 50 мкл и замораживали. Затем все аликвоты анализировали с помощью LS-MS. Измеряли сумму участков пиков профиля высвобождения лекарственного средства с помощью ВЭЖХ. Количество вывобожденного паклитаксела рассчитывали из стандартной кривой. Результаты приведены на Фигуре 23, где показано, что при увеличении молекулярного веса полимерных конъюгатов, уменьшается процент высвобождения паклитаксела. Эти результаты показывают, что скорость высвобождения паклитаксела может контролироваться выбором различных молекулярных масс для полимера.

Пример 32

Животные и Модели Опухоли для Фармакокинетических исследований

Голые (безтимусные) мыши (6-8 недель жизни, весом 25-30 г, самки) были получены в Charles River Lab (Willington, MA). Клеточная линия B16F0 была взята из АТСС (CRL-6322, АТСС American Type Culture Collection, Rockville, MD). Клетки B16F0 культивировали в DMEM, дополненной 10% фетальной бычьей сывороткой, 2 мкМ Глутамина, 1 мМ не-эссенциальных аминокислот, 1 мМ пирувата натрия, 100 Ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина. Клетки B16F0, собранные из культуральной ткани, подсчитывали и ресуспендировали до концентрации 5×10⁶ на мл. Используя ТБ шприц вводили 0.4 мл (общее количество 2×10⁶ клеток) путем подкожной инъекции каждой мыши. Четыре опухоли привили животным в области правой лопатки, левой лопатки, правого бедра и левого бедра.

Пример 32а

Для определения концентрации паклитаксела в плазме во времени тестировали различные конъюгированные с лекарственным средством полимеры против контроля Таксола. На стадии, когда средний размер опухоли всей популяции мышей из Примера 32 имел размер 200-300 мм (6-8 мм в диаметре), каждое животное с опухолью получало однократную IV болюсную инъекцию ударной дозы ³Н-Таксола (контроль), PGA-21-A-19, PGA-32-А-19, PGA-97-A-24 через хвостовую вену.

PGA-21-G-19 был приготовлен из полимера поли-(γ-L-глутамил-глутамина), имеющего молекулярную массу 19,800 дальтон и процентное содержание паклитаксела в полимере 19%. PGA-32-G-19 был приготовлен из полимера поли-(γ-L-глутамил-глутамина), имеющего молекулярную массу 37,400 дальтон и процентное содержание паклитаксела в полимере 19%. PGA-97-G-24 был приготовлен из полимера поли-(γ-L-глутамил-глутамина), имеющего молекулярную массу 110,800 дальтон и процентное содержание паклитаксела в полимере 24%.

Доза, не содержащая ³Н-Таксола (контроль), PGA-21-A-19, PGA-32-А-19, PGA-97-A-24 составляла 20 мг эквивалентов паклитаксела на кг. Для каждого лекарственного средства группы из 4 мышей анестезировали в различные моменты времени (каждую в час): 1.0, 2.0, 4.0 и 24. Собранные 0.5 мл крови были взяты из сердца и орбитальной вены и были помещены в гепаринизированную пробирку. Затем мышей убивали до прихода в себя от анестезии. Образцы крови каждой мыши центрифугировали при 11,000 об/мин. Супернатант плазмы (0.2-0.3 мл) из образцов крови собирали и переносили в новые пробирки. 0.1 мл плазмы каждого образца отдельно переносили в новую 10-мл пробирку и добавляли в нее раствор сцинтилляционной жидкости (5 мл). Содержание паклитаксела исследовали с помощью сцинтилляционной жидкости LS6500 измерительной системы и рассчитывали из стандартной кривой каждого образца. Результаты показаны на Фигуре 24. Эти результаты показывают, что паклитаксел в предпочтительных полимерных конъюгатах настоящего изобретения имеет более длительную циркуляцию в плазме по сравнению с Таксолом.

Пример 33

Для определения концентрации паклитаксела в опухоли во времени тестировали различные конъюгированные с лекарственным средством полимеры против контроля Таксола. На стадии, когда средний размер опухоли всей популяции мышей из Примера 32 имел размер 200-300 мм³ (6-8 мм в диаметре), каждое животное с опухолью получало однократную IV болюсную инъекцию ударной дозы ³Н-Таксола (контроль), PGA-21-A-19, PGA-32-А-19, PGA-97-A-24 через хвостовую вену.

PGA-21-G-19 был приготовлен из полимера поли-(γ-L-глутамил-глутамина), имеющего молекулярную массу 19,800 дальтон и процентное содержание паклитаксела в полимере 19%. PGA-32-G-19 был приготовлен из полимера поли-(γ-L-глутамил-глутамина), имеющего молекулярную массу 37,400 дальтон и процентное содержание паклитаксела в полимере 19%. PGA-97-G-24 был приготовлен из полимера поли-(γ-L-глутамил-глутамина), имеющего молекулярную массу 110,800 дальтон и процентное содержание паклитаксела в полимере было 24%.

Доза, не содержащая ³Н-Таксол (контроль), PGA-21-A-19, PGA-32-A-19, PGA-97-A-24, составляла 20 мг эквивалентов паклитаксела на кг. Для каждого лекарственного средства группы из 4 мышей анестезировали в различные моменты времени (каждую в час): 1.0, 2.0, 4.0 и 24. Опухоли из двух бедер и двух лопаток были собраны по отдельности. Затем мышей убивали до прихода в себя от анестезии. Приблизительно 80-180 мг каждой опухоли помещали в сцинтилляционный флакон и опухоли усваивались Solune (тканевой растворитель) (1 мл). Затем 0.1 мл усвоенной ткани переносили в 10 мл пробирку и добавляли жидкий сцинтилляционный коктейль (5 мл). Процентное содержание паклитаксела анализировали с использованием сцинтилляционного раствора LS6500 измерительной системы (Beckman) и рассчитывали из стандартной кривой каждого образца. Результаты показаны на Фигуре 25. Эти результаты показали, что паклитаксел лекарственного средства в предпочтительных полимерных конъюгатах заявленного изобретения имеет большую концентрацию в опухоли за курс лечения по сравнению с Таксолом.

Пример 34

Животные и Модели Опухоли

Голые (бестимусные) мыши (6-7 недель жизни, весом 25-30 г, самцы) приобретены в Charles River Lab (Willington, MA). Клеточная линия B16F0 была получена из АТСС (CRL-6322, АТСС American Type Culture Collection, Rockville, МЕ)). Клетки B16F0 культивировались в DMEM, дополненной 10% фетальной бычьей сывороткой, 2 мкМ Глутамина, 1 мМ не-эссенциальных аминокислот, 1 мМ пирувата натрия, 100 Ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина. Клетки B16F0, собранные из культуральной ткани, подсчитывали и ресуспендировали до концентрации 5×10⁶ на мл. Используя ТБ шприц, каждой мыши вводили 0.2 мл (общее количество 1×10⁶ клеток) путем подкожной инъекции. Одна опухоль была привита на правом бедре животного. Область введения опухоли сбривали, чтобы облегчить измерение опухоли во время ее роста.

Пример 35

Магнитно-резонансная визуализация опухолевого накопления

Изображения мышей сделаны на сканере GE 3Т MR до и после контрастирования. Параметры изображения ТЕ следующие: minful, TR=250 ms, FOV:8 и 24 частей/общего и толщина коронарного среза 0.1 мм. PGA-97-A-DTPA-Gd(III) был приготовлен, как в примере 7-8, из поли-(γ-L-аспартил-глутамина), имеющего среднюю молекулярную массу 99,400 дальтон на основе системы Heleos с MALS детектором. Контрольным материалом для этого примера был Omniscan-Gd(III)-ДTПA-BMA (0.1 ммоль Gd(III)/кг). Доза вводимого PGA-97-ДTПA-Gd(III) была 0.1 ммоль Gd(III)/кг. Доза вводимого Omniscan™ была 0.1 ммоль Gd(III)/кг. Два лекарственных препарата вводили в хвостовую вену анестезированной мыши и получали изображения до инъекции и от 6 минут до 4 часов после инъекции контрастных агентов. Результаты MRI показаны на Фигуре 26. Как показано на Фигуре 26, количество хелата PGA-97A-DTPA-Gd(III), накопившегося в опухолевой ткани, больше, чем количество имеющего небольшие молекулы Omniscan-Gd(III). Эти результаты показывают, что хелаты PGA-97A-ДТПA-Gd(III) обладают повышенной специфичностью и удерживанием.

Пример 36

Исследование формирования наночастиц

Различные растворы (отфильтровыванные через 0.2 мкм фильтры) добавляли в поли-(γ-L-аспартил-глутамин), имеющий молекулярную массу 99,400 дальтон) по 1 мг/мл. Все растворы гомогенно растворяли. Размеры частиц, полидисперстность и индекс исходного уровня измеряли светорассеиванием на ZatalPals (Brookhaven Instrument Corporation). Результаты приведены в Таблице 2. Вода MilliQ, означает воду, которая была отфильтрована через очистельную систему с 0,2 мкм фильтрами.

Таблица 2 Формирование наночастиц полиглутамат-аспарагиновая кислота   Средний диаметр Полидисперстность Индекс исходного уровня Вода MilliQ 244.8 нм 0.264 9.6 Вода MilliQ (0,1 мг/мл) 198.0 нм 0.176 8.6 Вода MilliQ (0.1 М) 169.4 нм 0.336 10.0 NaNO₃)       PBS (pH 7.4) 138.8 нм 0.345 7.8 PBS (pH 5.0) 141.0 нм 0.325 9.9

Пример 37

Формирование наночастиц PGA-97-A-10.

PGA-97-A-10 расворяли в деионизированной воде при различных концентрациях. Размеры частиц, полидисперстность и индекс исходного уровня измеряли светорассеиванием на ZatalPals (Brookhaven Instrument Corporation). Результаты приведены в Таблице 3.

Таблица 3 Формирование наночастиц PGA-97-A-10 в деионизированной воде Конц. (мг/мл) Размер (нм) Полидисперстность Индекс исходного уровня 722 438.9 0.133 9.7 289 379.0 0.169 8.8 100 357.5 0.226 9.1 50 309.4 0.215 9.5 10 209.6 0.220 9.3 5 194.9 0.208 8.1 1 178.0 0.172 7.4 0.5 N/A 0.122 0

Пример 38

Электронно-микроскопическое изображение поверхности излома образца конъюгата полимер-лекарственное средство было взято из Nano Analytical Laboratory (San Francisco, СА). Полимером был PGA-44-A-19, полученный из поли-(g-L-аспартил-глутамина), имеющего молекулярную массу 39,700 дальтон и процентное содержание паклитаксела в полимере 20%. Он был приготовлен в концентрации 0,1 мг/мл в солевом растворе после обработки ультразвуком (~5 мин). После этого его завернули в пленку и сразу же послали в фирму (около одного дня в пути). По прибыти хранили при 4°C. Полимер помещали в водный солевой раствор для определения образования наночастиц. Воспроизведение электоромикроскопического изображения показано на Фигуре 27. На изображении можно увидеть наночастицы выбранного лекарства, конъюгированного с полимером настоящего изобретения, образовавшиеся при помещении полимерного конъюгата в солевой раствор.

Пример 39

Частицы лекарства, конъюгированного с полимером, исследовали на стабильность при различных концентрациях лекарственных средств. PGA-44-А-20 и PGA-97-A-20 были сформированы в частицы при различных концентрациях лекарственного средства и измеряли размеры частиц. Результаты показаны на Фигуре 28. Частицы оставались в диапазоне наночастиц и были стабильными даже при повышенной концентрации лекарственного средства. Эти результаты показывают, что стабильные наночастицы могут формироваться при различных концентрациях лекарственного средства.

Пример 40

Частицы конъюгата полимер-лекарственное средство исследовали на стабильность при различных концентрациях лекарственных средств. PGA-21-G-20 и PGA-32-G-20 были сформированы в частицы при различных концентрациях лекарственного средства и измеряли размеры частиц. Результаты показаны на Фигуре 28. Частицы оставались в диапазоне наночастиц и были стабильными даже при повышенной концентрации лекарственного средства. Эти результаты показывают, что стабильные наночастицы могут формироваться при различных концентрациях лекарственного средства.

Специалисту будет понятно, что могут существовать разные варианты настоящего изобретения без выхода за рамки настоящего изобретения. Затем, специалисту понятно, что примеры настоящего изобретения только иллюстрируют изобретение и не предполагают ограничения его объема.

Настоящее изобретение относится к кислотам, пригодным для использования в медицине, включающим звенья формул (I) и (II)

где n равен 1 или 2; А¹ выбран из О или NR⁵, R⁵ является Н или С_1-4алкилом; А² является О; R³ и R⁴ выбраны из Н, NH₄ или щелочного металла; R¹ и R² выбраны из С_1-10алкила, С_6-20арила, NH₄, щелочного металла и агента: таксана, камптотецина, доксорубицина, акридинового, кумаринового, родаминового, ксантенового, цианинового или пиренового красителя, агента магнитно-резонансной визуализации, полидентатного лиганда или его предшественника формул

где R⁷ выбран из Н, NH₄ или щелочного металла, при условии, что один из R¹ и R² является указанным агентом, конъюгированным с полимером непосредственно или посредством линкерной группы, и отношение агента к полимерному конъюгату от 1 до 50% (вес/вес). Предложен новый биодеградируемый конъюгат, который, в сравнении с сопоставимым конъюгатом полиглутаминовой кислоты, обладает повышенной растворимостью и обеспечивает раствору большую оптическую прозрачность в широком диапазоне pH. 6 н. и 47 з.п. ф-лы, 29 ил., 38 пр., 3 табл.

1. Полимерный конъюгат, включающий повторяющееся звено формулы (I) и повторяющееся звено формулы (II):

где каждый n независимо равен 1 или 2;
А¹ представляет кислород или NR⁵, где R⁵ представляет собой водород или С_1-4алкил;
каждый А² представляет кислород;
R³ и R⁴ независимо выбирают из водорода, аммония или щелочного металла;
R¹ и R² независимо выбран из С_1-10алкила, С_6-20арила, аммония, щелочного металла или агента, представляющего собой противораковое средство, выбранное из группы таксана, камптотецина или доксорубицина, агент оптической визуализации, выбранный из акридинового, кумаринового, родаминового, ксантенового, цианинового или пиренового красителя, агент для магнитно-резонансной визуализации формулы

полидентатный лиганд формулы

и линкера, предшественника полидентатного лиганда с защищенными атомами кислорода и линкера, агента или агента и линкера;
где линкер выбирают из группы, состоящей из амина, амида, простого эфира, сложного эфира, гидроксила, карбонила, тиола, алкила, алкоксила, арила, (C_1-6алкила), гетероарила и гетероарила(С_1-6алкила);
где агент выбирают из группы, состоящей из противоракового средства, агента оптической визуализации и агента магнитно-резонансной визуализации;
где, по крайней мере, один из R¹ и R² представляет собой полидентатный лиганд и линкер, предшественник полидентатного лиганда с защищенными атомами кислорода и линкер, агент или агент и линкер;
где полидентатный лиганд представляет собой

где каждый R⁷ независимо выбран из водорода, аммония или щелочного металла, или предшественник полидентатного лиганда формулы

при условии, что, по крайней мере, один из R¹ и R² представляют собой указанный агент, который может быть конъюгирован с полимером непосредственно или посредством линкерной группы, которая включает амин, амид, простой эфир, сложный эфир, карбонил, алкил, С₆-арильную группу, С₆-арил-С_1-6-алкильную группу или гетероалкильную группу;
где полимерный конъюгат включает агент в количестве от приблизительно 1% до приблизительно 50% (вес./вес.), считая на массовое отношение агента к полимерному конъюгату;
где количество агента, процент повторяющихся звеньев формулы (I) и процент повторяющихся звеньев формулы (II) выбирают таким образом, чтобы обеспечить полимерному конъюгату растворимость, которая больше растворимости сопоставимого конъюгата полиглутаминовой кислоты, включающего по существу то же самое количество агента, при этом раствор полимерного конъюгата, включающий, по крайней мере, 5 мг/мл полимерного конъюгата в 0,9 вес.%, водном NaCl, при 22°C имеют большую оптическую прозрачность при более широком диапазоне pH, чем сопоставимый раствор конъюгата полиглутаминовой кислоты.

2. Полимерный конъюгат по п.1, далее включающий повторяющееся звено формулы (III):

где R⁶ является водородом, аммонием или щелочным металлом.

3. Полимерный конъюгат по п.1, где весовое процентное содержание агента составляет от 5% до 40% (вес./вес.), считая на массовое соотношение агента к полимерному конъюгату.

4. Полимерный конъюгат по п.1, где весовое процентное содержание агента составляет от 10% до 30% (вес./вес.), считая на массовое соотношение агента к полимерному конъюгату.

5. Полимерный конъюгат по п.1, где, по крайней мере, один из R¹ и R² является агентом оптической визуализации, конъюгированным с полимером непосредственно или посредством линкерной группы.

6. Полимерный конъюгат по п.1, где, по крайней мере, один из R¹ и R² является противораковым средством, конъюгированным с полимером непосредственно или посредством линкерной группы.

7. Полимерный конъюгат по п.6, где противораковое средство выбрано из группы таксана и представляет собой паклитаксел и докситаксел.

8. Полимерный конъюгат по п.7, где паклитаксел конъюгирован с повторяющимся звеном формулы (I) по атому кислорода, связанному с С2'-углеродом паклитаксела.

9. Полимерный конъюгат по п.7, где паклитаксел конъюгирован с повторяющимся звеном формулы (I) по атому кислорода, связанному с С7-углеродом паклитаксела.

10. Полимерный конъюгат по п.7, где таксан является паклитакселом в количестве, равном 20% (вес./вес.) считая на массовое соотношение агента к полимерному конъюгату.

11. Полимерный конъюгат по п.1, где R¹ является противораковым средством, конъюгированным с полимером непосредственно или посредством линкерной группы, а R², R³ и R⁴ являются щелочными металлами.

12. Полимерный конъюгат по п.1, где, по крайней мере, один из R¹ или R² является агентом магнитно-резонансной визуализации, конъюгированным с полимером непосредственно или посредством линкерной группы.

13. Полимерный конъюгат по п.12, где агент магнитно-резонансной визуализации составляет 7% (вес./вес.), считая массовое соотношение агента к полимерному конъюгату.

14. Полимерный конъюгат по п.1, где R¹ является агентом магнитно-резонансной визуализации, а R², R³, R⁴ являются щелочными металлами.

15. Полимерный конъюгат по п.1, где, по крайней мере, один из R¹ и R² является полидентатным лигандом:

где каждый R⁷ независимо представляет собой водород, аммоний или щелочной металл.

16. Полимерный конъюгат по п.1, где, по крайней мере, один из R¹ и R² является предшественником полидентатного лиганда с защищенными атомами кислорода, включающим:
.

17. Полимерный конъюгат по п.1, где полимерный конъюгат включает от 1 мол.% до 30 мол.% повторяющихся звеньев формулы (I), считая на общее число молей повторяющихся звеньев формул (I) и (II).

18. Полимерный конъюгат по п.1, где полимерный конъюгат включает от 1 мол.% до 20 мол.% повторяющихся звеньев формулы (I), считая на общее число молей повторяющихся звеньев формул (I) и (II).

19. Полимерный конъюгат по п.1, где полимерный конъюгат включает от 1 мол.% до 10 мол.% повторяющихся звеньев формулы (I), считая на общее число молей повторяющихся звеньев формул (I) и (II).

20. Полимерный конъюгат по п.2, где полимерный конъюгат включает от 1 мол.% до 30 мол.% повторяющихся звеньев формулы (I), считая на общее число молей повторяющихся звеньев формул (I), (II) и (III).

21. Полимерный конъюгат по п.2, где полимерный конъюгат включает от 1 мол.% до 20 мол.% повторяющихся звеньев формулы (I), считая на общее число молей повторяющихся звеньев формул (I), (II) и (III).

22. Полимерный конъюгат по п.1, где полимерный конъюгат включает от 1 мол.% до 10 мол.% повторяющихся звеньев формулы (I), считая на общее число молей повторяющихся звеньев формул (I), (II) и (III).

23. Полимерный конъюгат по п.1, где щелочной металл представляет собой натрий.

24. Полимерный конъюгат по п.1, растворимый в диапазоне pH приблизительно 3.

25. Полимерный конъюгат по п.1, растворимый в диапазоне pH приблизительно 8.

26. Полимерный конъюгат по п.1, растворимый в диапазоне pH приблизительно 9.

27. Полимерный конъюгат по п.1, растворимый при значениях pH от 2 до 5.

28. Полимерный конъюгат по п.1 с растворимостью 10 мг/мл.

29. Полимерный конъюгат по п.1 с растворимостью 25 мг/мл.

30. Полимерный конъюгат по п.1 с растворимостью 100 мг/мл.

31. Полимерный конъюгат по п.1 с растворимостью 150 мг/мл.

32. Полимерный конъюгат по п.1, где каждый n равен 2; каждый А¹ и А² является кислородом; один из R¹ и R² является пакситакселом, а другой является щелочным металлом; каждый из R³ и R⁴ является либо водородом, либо щелочным металлом, и где полимерный конъюгат содержит количество агента от 5% до 40% (вес./вес.), считая массовое соотношение агента к полимерному конъюгату, где количество повторяющихся звеньев формулы (I) и количество повторяющихся звеньев формулы (II) находятся в соотношении от 100 до 2000.

33. Полимерный конъюгат по п.32, где один из R¹ и R² является паклитакселом, а другой из R¹ и R² является щелочным металлом.

34. Способ получения полимерного конъюгата по п.1, включающий реакцию в подходящем полярном растворителе полимерного реагента, включающего звенья формулы (IV):

где каждый n независимо равен 1 или 2, А³ является кислородом, R⁷ и R⁸ каждый независимо выбирают из водорода, аммония и щелочного металла, с, по крайней мере, одним из агентов, охарактеризованных в п.1, в присутствии агента сочетания, выбранного из 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)-карбодиимида, 1,3-дициклогексил карбодиимида, 1,1'-карбонилдиимидазола, N,N'-дисукцинимидил карбоната, N-[(диметиламино)-1H-1,2,3-триазоло-[4,5-b]пиридин-1-илметилен]-N-метилметанаммоний гексафторфосфат N-оксида, 2-[(1H-бензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметиламмоний гексафторфосфата, 2-[(6-хлор-1H-бензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметиламмоний гексафторфосфата, бензотриазол-1-ил-окситрис-пирролидин-фосфоний гексафторфосфата, бромтриспирролидинфосфоний гексафтор-фосфата, 2-[(1H-бензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметиламмоний тетрафторбората и бензотриазол-1-илокситрис-(диметиламино)-фосфоний гексафторфосфата.

35. Способ по п.34, где полимерный реагент содержит повторяющееся звено формулы (V):

где R⁹ является водородом, аммонием или щелочным металлом.

36. Способ по п.34, где вступающий в реакцию агент включает группы гидроксила и амина.

37. Способ по п.34, где вступающий в реакцию агент является противораковым средством.

38. Способ по п.34, где вступающий в реакцию агент является агентом оптической визуализации.

39. Способ по п.34, где вступающий в реакцию агент является агентом магнитно-резонансной визуализации.

40. Способ по п.37, где вступающий в реакцию агент является паклитакселом или доцетакселом.

41. Способ по п.40, где паклитаксел является конъюгантом по отношению к повторяющемуся звену формулы (I) по атому кислорода, связанному с С2'-углеродом паклитаксела.

42. Способ по п.40, где паклитаксел является конъюгантом по отношению к повторяющемуся звену формулы (I) по атому кислорода, связанному с С7-углеродом паклитаксела.

43. Способ по п.34, где растворитель выбирают из группы, состоящей из N,N-диметилформамида, диметилсульфоксида, N-метил-2-пиридон и N,N-диметилацетамида.

44. Способ по п.34, полимерный реагент растворяют в присутствии катализатора.

45. Способ по п.44, где катализатор представляет собой 4-диметил-аминопиридин.

46. Фармацевтическая композиция, используемая для диагностики раковых заболеваний, включающая полимерный конъюгат по п.1 и, по крайней мере, один выбранный из фармацевтически приемлемого эксципиент, носитель и разбавитель.

47. Фармацевтическая композиция, используемая для лечения раковых заболеваний, включающая полимерный конъюгат по п.1 и, по крайней мере, один выбранный из фармацевтически приемлемого эксципиент, носитель и разбавитель.

48. Способ лечения раковых заболеваний, включающий введение млекопитающему эффективного количества полимерного конъюгата по п.1, включающего противораковое средство.

49. Способ по п.48, где раковым заболеванием является меланома.

50. Способ по п.48, где полимер включен в форме инъекций.

51. Способ диагностики ракового заболевания, включающий введение млекопитающему эффективного количества полимерного конъюгата по п.1, включающего агент магнитно-резонансной визуализации.

52. Способ по п.51, где раковым заболеванием является меланома.

53. Способ по п.51, где полимер используется в виде инъекций.