ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА
[1] Данная заявка заявляет приоритет предварительной заявки на патент США № 62/635133, поданной 26 февраля 2018 года, которая включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.
ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[2] Отдельные популяции Т-клеток модулируют иммунную систему для поддержания иммунного гомеостаза и толерантности. Например, регуляторные Т (Treg)-клетки предотвращают несоответствующие ответы иммунной системы посредством предотвращения патологической аутореактивности, в то время как цитотоксические Т-клетки целенаправленно воздействуют и уничтожают инфицированные клетки и/или раковые клетки. В некоторых вариантах осуществления модуляция различных популяций Т-клеток обеспечивает вариант лечения заболевания или симптома.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[3] В определенных вариантах осуществления в данном документе раскрыты конъюгаты IL-15 и их применение для лечения рака. В некоторых вариантах осуществления в данном документе также описаны способы модуляции взаимодействия между IL-15 и рецепторами IL-15 для стимуляции или размножения популяций специфических Т-клеток. В дополнительных случаях в данном документе дополнительно описаны фармацевтические композиции и наборы, содержащие один или несколько конъюгатов IL-15, описанных в данном документе.
[4] В определенных вариантах осуществления в данном документе раскрыты модифицированные полипептиды интерлейкина 15 (IL-15), содержащие по меньшей мере одну посттрансляционно модифицированную неприродную аминокислоту, где по меньшей мере одна неприродная аминокислота находится в некотором положении остатка, что селективно снижает аффинность связывания модифицированного полипептида IL-15 с α-рецептором интерлейкина 15 (IL-15Rα), где снижение аффинности связывания относится к аффинности связывания между полипептидом IL-15 дикого типа и IL-15Rα, и где взаимодействие модифицированного полипептида IL-15 с βγ-рецептором интерлейкина 2/интерлейкина 15 (IL-2/IL-15Rβγ) в значительной степени не изменяется. В некоторых вариантах осуществления положение остатка по меньшей мере одной неприродной аминокислоты выбрано из N1, W2, V3, N4, I6, S7, D8, K10, K11, E13, D14, L15, Q17, S18, M19, H20, I21, D22, A23, T24, L25, Y26, E28, S29, D30, V31, H32, P33, S34, C35, K36, V37, T38, K41, L44, E46, Q48, V49, S51, L52, E53, S54, G55, D56, A57, S58, H60, D61, T62, V63, E64, N65, I67, I68, L69, N71, N72, S73, L74, S75, S76, N77, G78, N79, V80, T81, E82, S83, G84, C85, K86, E87, C88, E89, E90, L91, E92, E93, K94, N95, I96, K97, E98, L100, Q101, S102, V104, H105, Q108, M109, F110, I111, N112, T113, и S114,, где положения остатка соответствуют положениям, представленным в SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления положение остатка по меньшей мере одной неприродной аминокислоты выбрано из D22, A23, T24, L25, Y26, L44, E46, Q48, V49, E53, E89, E90, и E93; Y26, E46, V49, E53, и L25; A23, T24, E89, и E93; D22, L44, Q48, и E90; L25, E53, N77, и S83; или L25 и E53. В некоторых вариантах осуществления положение остатка по меньшей мере одной неприродной аминокислоты выбрано из E89, E53, E93, V49, E46, Y26, L25, T24, A23, D22, I21 и L52, где положения остатка соответствуют положениям, представленным в SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления положение остатка по меньшей мере одной неприродной аминокислоты выбрано из E46, Y26, V49, E53, T24, N4, K11, N65, L69, S18, H20 и S83, где положения остатка соответствуют положениям, представленным в SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления положение остатка по меньшей мере одной неприродной аминокислоты выбрано из E46, Y26, V49, E53 и T24, где положения остатка соответствуют положениям, представленным в SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления положение остатка по меньшей мере одной неприродной аминокислоты выбрано из E46, V49, E53 и T24, где положения остатка соответствуют положениям, представленным в SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления положение остатка по меньшей мере одной неприродной аминокислоты выбрано из Y26, V49, E53 и T24, где положения остатка соответствуют положениям, представленным в SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления положение остатка по меньшей мере одной неприродной аминокислоты выбрано из V49, E53 и T24, где положения остатка соответствуют положениям, представленным в SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления положение остатка по меньшей мере одной неприродной аминокислоты выбрано из E46 и Y26, где положения остатка соответствуют положениям, представленным в SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления положение остатка по меньшей мере одной неприродной аминокислоты представляет собой E46, где положение остатка соответствует положению, представленному в SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления положение остатка по меньшей мере одной неприродной аминокислоты представляет собой Y26, где положение остатка соответствует положению, представленному в SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления положение остатка по меньшей мере одной неприродной аминокислоты представляет собой V49, где положение остатка соответствует положению, представленному в SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления положение остатка по меньшей мере одной неприродной аминокислоты представляет собой E53, где положение остатка соответствует положению, представленному в SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления положение остатка по меньшей мере одной неприродной аминокислоты представляет собой T24, где положения остатка соответствуют положению, представленному в SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления положение остатка по меньшей мере одной неприродной аминокислоты выбрано из N4, K11, N65, L69, S18, H20 и S83, где положения остатка соответствуют положениям, представленным в SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна неприродная аминокислота включает п-ацетил-L-фенилаланин, п-йод-L-фенилаланин, O-метил-L-тирозин, п-пропаргилоксифенилаланин, п-пропаргилфенилаланин, L-3-(2-нафтил)аланин, 3-метилфенилаланин, O-4-аллил-L-тирозин, 4-пропил-L-тирозин, три-O-ацетил-GlcNAcp-серин, L-допу, фторированный фенилаланин, изопропил-L-фенилаланин, п-азидо-L-фенилаланин, п-ацил-L-фенилаланин, п-бензоил-L-фенилаланин, L-фосфосерин, фосфоносерин, фосфонотирозин, п-бромфенилаланин, п-амино-L-фенилаланин, изопропил-L-фенилаланин или N6-(2-азидоэтокси)-карбонил-L-лизин. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна неприродная аминокислота включает неприродную аминокислоту, показанную на фиг. 2С. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одну неприродную аминокислоту встраивают в модифицированный полипептид IL-15 с помощью ортогональной пары тРНК-синтетаза/тРНК. В некоторых вариантах осуществления модифицированный полипептид IL-15 конъюгирован с конъюгирующим фрагментом посредством по меньшей мере одной неприродной аминокислоты. В некоторых вариантах осуществления конъюгирующий фрагмент включает водорастворимый полимер, белок или полипептид. В некоторых вариантах осуществления водорастворимый полимер включает полиэтиленгликоль (PEG), поли(пропиленгликоль) (PPG), сополимеры этиленгликоля и пропиленгликоля, поли(оксиэтилированный полиол), поли(олефиновый спирт), поли(винилпирролидон), поли(гидроксиалкилметакриламид), поли(гидроксиалкилметакрилат), поли(сахариды), поли(α-гидроксикислота), поли(виниловый спирт), полифосфазен, полиоксазолины (POZ), поли(N-акрилоилморфолин) или их комбинацию; или полисахарид. В некоторых вариантах осуществления водорастворимый полимер включает PEG. В некоторых вариантах осуществления PEG представляет собой линейный PEG или разветвленный PEG. В некоторых вариантах осуществления водорастворимый полимер включает гликан. В некоторых вариантах осуществления полисахарид включает декстран, полисиаловую кислоту (PSA), гиалуроновую кислоту (HA), амилозу, гепарин, гепарансульфат (HS), декстрин или гидроксиэтилкрахмал (HES). В некоторых вариантах осуществления конъюгирующий фрагмент включает насыщенную жирную кислоту. В некоторых вариантах осуществления насыщенная жирная кислота включает гексадекановую кислоту, тетрадекановую кислоту или 15-азидопентадекановую кислоту. В некоторых вариантах осуществления белок включает альбумин, трансферрин, транстиретин или Fc-часть антитела. В некоторых вариантах осуществления полипептид включает пептид XTEN, богатый глицином аминокислотный гомополимер (HAP), полипептид PAS, эластин-подобный полипептид (ELP), пептид CTP или полимер желатин-подобного белка (GLK). В некоторых вариантах осуществления конъюгирующий фрагмент непосредственно связан с по меньшей мере одной неприродной аминокислотой модифицированного IL-15. В некоторых вариантах осуществления конъюгирующий фрагмент опосредованно связан с по меньшей мере одной неприродной аминокислотой модифицированного IL-15 посредством линкера. В некоторых вариантах осуществления линкер включает гомобифункциональный линкер. В некоторых вариантах осуществления гомобифункциональный линкер включает реагент Ломанта, представляющий собой дитиобис(сукцинимидилпропионат) DSP, 3'3'-дитиобис(сульфосукцинимидилпропионат) (DTSSP), дисукцинимидилсуберат (DSS), бис(сульфосукцинимидил)суберат (BS), дисукцинимидилтартрат (DST), дисульфосукцинимидилтартрат (сульфо-DST), этиленгликобис(сукцинимидилсукцинат) (EGS), дисукцинимидилглутарат (DSG), N, N'-дисукцинимидилкарбонат (DSC), диметиладипимидат (DMA), диметилпимелимидат (DMP), диметилсуберимидат (DMS), диметил-3,3'-дитиобиспропионимидат (DTBP), 1,4-ди-(3'-(2'-пиридилдитио)пропионамидо)бутан (DPDPB), бисмалеимидогексан (BMH), арилгалогенид-содержащее соединение (DFDNB), такое как, например, 1,5-дифтор-2,4-динитробензол или 1,3-дифтор-4,6-динитробензол, 4,4'-дифтор-3,3'-динитрофенилсульфон (DFDNPS), бис-[β-(4-азидосалициламидо)этил]дисульфид (BASED), формальдегид, глутаральдегид, 1,4-бутандиолдиглицидиловый эфир, дигидразид адипиновой кислоты, карбогидразид, о-толуидин, 3,3'-диметилбензидин, бензидин, α,α'-п-диаминодифенил, дийод-п-ксилолсульфоновую кислоту, N, N'-этилен-бис(йодацетамид) или N, N'-гексаметилен-бис(йодацетамид). В некоторых вариантах осуществления линкер включает гетеробифункциональный линкер. В некоторых вариантах осуществления гетеробифункциональный линкер включает N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)пропионат (sPDP), длинноцепочечный N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)пропионат (LC-sPDP), водорастворимый длинноцепочечный N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)пропионат (сульфо-LC-sPDP), сукцинимидилоксикарбонил-α-метил-α-(2-пиридилдитио)толуол (sMPT), сульфосукцинимидил-6-[α-метил-α-(2-пиридилдитио)толуамидо]гексаноат (сульфо-LC-sMPT), сукцинимидил-4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат (sMCC), сульфосукцинимидил-4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат (сульфо-sMCC), сложный эфир м-малеимидобензоил-N-гидроксисукцинимида (MBs), сложный эфир м-малеимидобензоил-N-гидроксисульфосукцинимида (сульфо-MBs), N-сукцинимидил(4-йодактеил)аминобензоат (sIAB), сульфосукцинимидил(4-йодактеил)аминобензоат (сульфо-sIAB), сукцинимидил-4-(п-малеимидофенил)бутират (sMPB), сульфосукцинимидил-4-(п-малеимидофенил)бутират (сульфо-sMPB), сложный эфир N-(γ-малеимидобутирилокси)сукцинимида (GMBs), сложный эфир N-(γ-малеимидобутирилокси)сульфосукцинимида (сульфо-GMBs), сукцинимидил-6-((йодацетил)амино)гексаноат (sIAX), сукцинимидил-6-[6-(((йодацетил)амино)гексаноил)амино]гексаноат (sIAXX), сукцинимидил-4-(((йодацетил)амино)метил)циклогексан-1-карбоксилат (sIAC), сукцинимидил-6-(((((4-йодацетил)амино)метил)циклогексан-1-карбонил)амино)гексаноат (sIACX), п-нитрофенилйодацетат (NPIA), карбонил-реактивные и сульфгидрил-реактивные кросс-линкеры, такие как гидразид 4-(4-N-малеимидофенил)масляной кислоты (MPBH), 4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилгидразид-8 (M2C2H), 3-(2-пиридилдитио)пропионилгидразид (PDPH), N-гидроксисукцинимидил-4-азидосалициловую кислоту (NHs-AsA), N-гидроксисульфосукцинимидил-4-азидосалициловую кислоту (сульфо-NHs-AsA), сульфосукцинимидил-(4-азидосалициламидо)гексаноат (сульфо-NHs-LC-AsA), сульфосукцинимидил-2-(п-азидосалициламидо)этил-1,3'-дитиопропионат (sAsD), N-гидроксисукцинимидил-4-азидобензоат (HsAB), N-гидроксисульфосукцинимидил-4-азидобензоат (сульфо-HsAB), N-сукцинимидил-6-(4'-азидо-2'-нитрофениламино)гексаноат (sANPAH), сульфосукцинимидил-6-(4'-азидо-2'-нитрофениламино)гексаноат (сульфо-sANPAH), N-5-азидо-2-нитробензоилоксисукцинимид (ANB-NOs), сульфосукцинимидил-2-(м-азидо-о-нитробензамидо)-этил-1,3'-дитиопропионат (sAND), N-сукцинимидил-4-(4-азидофенил)-1,3'-дитиопропионат (sADP), N-сульфосукцинимидил(4-азидофенил)-1,3'-дитиопропионат (сульфо-sADP), сульфосукцинимидил-4-(п-азидофенил)бутират (сульфо-sAPB), сульфосукцинимидил-2-(7-азидо-4-метилкумарин-3-ацетамид)этил-1,3'-дитиопропионат (sAED), сульфосукцинимидил-7-азидо-4-метилкумарин-3-ацетат (сульфо-sAMCA), п-нитрофенилдиазопируват (ρNPDP), п-нитрофенил-2-диазо-3,3,3-трифторпропионат (PNP-DTP), 1-(п-азидосалициламидо)-4-(йодацетамидо)бутан (AsIB), N-[4-(п-азидосалициламидо)бутил]-3'-(2'-пиридилдитио)пропионамид (APDP), бензофенон-4-йодацетамид, п-азидобензоилгидразид (ABH), 4-(п-азидосалициламидо)бутиламин (AsBA) или п-азидофенилглиоксаль (APG). В некоторых вариантах осуществления линкер включает расщепляемый или нерасщепляемый дипептидный линкер. В некоторых вариантах осуществления дипептидный линкер включает Val-Cit, Phe-Lys, Val-Ala или Val-Lys. В некоторых вариантах осуществления линкер содержит малеимидную группу. В некоторых вариантах осуществления линкер содержит спейсер. В некоторых вариантах осуществления спейсер включает п-аминобензиловый спирт (PAB), п-аминобензилоксикарбонил (PABC), их производное или аналог. В некоторых вариантах осуществления конъюгирующий фрагмент способен увеличивать время полужизни модифицированного полипептида IL-15 в сыворотке крови. В некоторых вариантах осуществления снижение аффинности связывания представляет собой снижение аффинности связывания с IL-15Rα на приблизительно 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, или 99% по сравнению с полипептидом IL-15 дикого типа.. В некоторых вариантах осуществления снижение аффинности связывания с IL-15Rα является приблизительно 1-кратным, 2-кратным, 3-кратным, 4-кратным, 5-кратным, 6-кратным, 7-кратным, 8-кратным, 9-кратным, 10-кратным или больше по сравнению с полипептидом IL-15 дикого типа. В некоторых вариантах осуществления модифицированный полипептид IL-15 представляет собой функционально активный фрагмент полноразмерного полипептида IL-15. В некоторых вариантах осуществления модифицированный полипептид IL-15 представляет собой рекомбинантный полипептид IL-15. В некоторых вариантах осуществления модифицированный полипептид IL-15 представляет собой рекомбинантный человеческий полипептид IL-15. В некоторых вариантах осуществления модифицированный полипептид IL-15 со снижением аффинности связывания с IL-15Rα способен обеспечивать размножение популяций эффекторных Т-клеток (Teff) и клеток, являющихся естественными киллерами (NK).
[5] В определенных вариантах осуществления в данном документе раскрыты модифицированные полипептиды интерлейкина 15 (IL-15), содержащие по меньшей мере одну посттрансляционно модифицированную неприродную аминокислоту, где по меньшей мере одна неприродная аминокислота находится в некотором положении остатка, что существенным образом не влияет на аффинность связывания модифицированного полипептида IL-15 с α-рецептором интерлейкина 15 (IL-15Rα) или βγ-рецептором IL-2/интерлейкина 15 (IL-2/IL-15Rβγ). В некоторых вариантах осуществления модифицированный полипептид IL-15 характеризуется увеличенным временем полужизни. В некоторых вариантах осуществления положение остатка по меньшей мере одной неприродной аминокислоты выбрано из N1, W2, V3, N4, I6, S7, D8, K10, K11, E13, D14, L15, Q17, S18, M19, H20, I21, D22, A23, T24, L25, Y26, E28, S29, D30, V31, H32, P33, S34, C35, K36, V37, T38, K41, L44, E46, Q48, V49, S51, L52, E53, S54, G55, D56, A57, S58, H60, D61, T62, V63, E64, N65, I67, I68, L69, N71, N72, S73, L74, S75, S76, N77, G78, N79, V80, T81, E82, S83, G84, C85, K86, E87, C88, E89, E90, L91, E92, E93, K94, N95, I96, K97, E98, L100, Q101, S102, V104, H105, Q108, M109, F110, I111, N112, T113, и S114,, где положения остатка соответствуют положениям, представленным в SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления положение остатка по меньшей мере одной неприродной аминокислоты выбрано из D22, A23, T24, L25, Y26, L44, E46, Q48, V49, E53, E89, E90 и E93; Y26, E46, V49, E53 и L25; A23, T24, E89 и E93; D22, L44, Q48 и E90; L25, E53, N77 и S83; или L25 и E53. В некоторых вариантах осуществления положение остатка по меньшей мере одной неприродной аминокислоты выбрано из M1, S18, H20, K36, K41, G55, D56, S75, S76, N77, G78,V80, T81, S83 и K86, где положения остатка соответствуют положениям, представленным в SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна неприродная аминокислота включает п-ацетил-L-фенилаланин, п-йод-L-фенилаланин, O-метил-L-тирозин, п-пропаргилоксифенилаланин, п-пропаргилфенилаланин, L-3-(2-нафтил)аланин, 3-метилфенилаланин, O-4-аллил-L-тирозин, 4-пропил-L-тирозин, три-O-ацетил-GlcNAcp-серин, L-допу, фторированный фенилаланин, изопропил-L-фенилаланин, п-азидо-L-фенилаланин, п-ацил-L-фенилаланин, п-бензоил-L-фенилаланин, L-фосфосерин, фосфоносерин, фосфонотирозин, п-бромфенилаланин, п-амино-L-фенилаланин, изопропил-L-фенилаланин или N6-(2-азидоэтокси)-карбонил-L-лизин. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна неприродная аминокислота включает неприродную аминокислоту, показанную на фиг. 2С. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одну неприродную аминокислоту встраивают в модифицированный полипептид IL-15 с помощью ортогональной пары тРНК-синтетаза/тРНК. В некоторых вариантах осуществления модифицированный полипептид IL-15 конъюгирован с конъюгирующим фрагментом посредством по меньшей мере одной неприродной аминокислоты. В некоторых вариантах осуществления конъюгирующий фрагмент включает водорастворимый полимер, белок или полипептид. В некоторых вариантах осуществления водорастворимый полимер включает полиэтиленгликоль (PEG), поли(пропиленгликоль) (PPG), сополимеры этиленгликоля и пропиленгликоля, поли(оксиэтилированный полиол), поли(олефиновый спирт), поли(винилпирролидон), поли(гидроксиалкилметакриламид), поли(гидроксиалкилметакрилат), поли(сахариды), поли(α-гидроксикислота), поли(виниловый спирт), полифосфазен, полиоксазолины (POZ), поли(N-акрилоилморфолин) или их комбинацию; или полисахарид. В некоторых вариантах осуществления водорастворимый полимер включает PEG. В некоторых вариантах осуществления PEG представляет собой линейный PEG или разветвленный PEG. В некоторых вариантах осуществления водорастворимые полимеры включают гликан. В некоторых вариантах осуществления полисахарид включает декстран, полисиаловую кислоту (PSA), гиалуроновую кислоту (HA), амилозу, гепарин, гепарансульфат (HS), декстрин или гидроксиэтилкрахмал (HES). В некоторых вариантах осуществления конъюгирующий фрагмент включает насыщенную жирную кислоту. В некоторых вариантах осуществления насыщенная жирная кислота включает гексадекановую кислоту, тетрадекановую кислоту или 15-азидопентадекановую кислоту. В некоторых вариантах осуществления белок включает альбумин, трансферрин, транстиретин или Fc-часть антитела. В некоторых вариантах осуществления полипептид включает пептид XTEN, богатый глицином аминокислотный гомополимер (HAP), полипептид PAS, эластин-подобный полипептид (ELP), пептид CTP или полимер желатин-подобного белка (GLK). В некоторых вариантах осуществления конъюгирующий фрагмент непосредственно связан с по меньшей мере одной неприродной аминокислотой модифицированного IL-15. В некоторых вариантах осуществления конъюгирующий фрагмент опосредованно связан с по меньшей мере одной неприродной аминокислотой модифицированного IL-15 посредством линкера. В некоторых вариантах осуществления линкер включает гомобифункциональный линкер. В некоторых вариантах осуществления гомобифункциональный линкер включает реагент Ломанта, представляющий собой дитиобис(сукцинимидилпропионат) DSP, 3'3'-дитиобис(сульфосукцинимидилпропионат) (DTSSP), дисукцинимидилсуберат (DSS), бис(сульфосукцинимидил)суберат (BS), дисукцинимидилтартрат (DST), дисульфосукцинимидилтартрат (сульфо-DST), этиленгликобис(сукцинимидилсукцинат) (EGS), дисукцинимидилглутарат (DSG), N, N'-дисукцинимидилкарбонат (DSC), диметиладипимидат (DMA), диметилпимелимидат (DMP), диметилсуберимидат (DMS), диметил-3,3'-дитиобиспропионимидат (DTBP), 1,4-ди-(3'-(2'-пиридилдитио)пропионамидо)бутан (DPDPB), бисмалеимидогексан (BMH), арилгалогенид-содержащее соединение (DFDNB), такое как, например, 1,5-дифтор-2,4-динитробензол или 1,3-дифтор-4,6-динитробензол, 4,4'-дифтор-3,3'-динитрофенилсульфон (DFDNPS), бис-[β-(4-азидосалициламидо)этил]дисульфид (BASED), формальдегид, глутаральдегид, 1,4-бутандиолдиглицидиловый эфир, дигидразид адипиновой кислоты, карбогидразид, о-толуидин, 3,3'-диметилбензидин, бензидин, α,α'-п-диаминодифенил, дийод-п-ксилолсульфоновую кислоту, N, N'-этилен-бис(йодацетамид) или N, N'-гексаметилен-бис(йодацетамид). В некоторых вариантах осуществления линкер включает гетеробифункциональный линкер. В некоторых вариантах осуществления гетеробифункциональный линкер включает N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)пропионат (sPDP), длинноцепочечный N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)пропионат (LC-sPDP), водорастворимый длинноцепочечный N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)пропионат (сульфо-LC-sPDP), сукцинимидилоксикарбонил-α-метил-α-(2-пиридилдитио)толуол (sMPT), сульфосукцинимидил-6-[α-метил-α-(2-пиридилдитио)толуамидо]гексаноат (сульфо-LC-sMPT), сукцинимидил-4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат (sMCC), сульфосукцинимидил-4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат (сульфо-sMCC), сложный эфир м-малеимидобензоил-N-гидроксисукцинимида (MBs), сложный эфир м-малеимидобензоил-N-гидроксисульфосукцинимида (сульфо-MBs), N-сукцинимидил(4-йодактеил)аминобензоат (sIAB), сульфосукцинимидил(4-йодактеил)аминобензоат (сульфо-sIAB), сукцинимидил-4-(п-малеимидофенил)бутират (sMPB), сульфосукцинимидил-4-(п-малеимидофенил)бутират (сульфо-sMPB), сложный эфир N-(γ-малеимидобутирилокси)сукцинимида (GMBs), сложный эфир N-(γ-малеимидобутирилокси)сульфосукцинимида (сульфо-GMBs), сукцинимидил-6-((йодацетил)амино)гексаноат (sIAX), сукцинимидил-6-[6-(((йодацетил)амино)гексаноил)амино]гексаноат (sIAXX), сукцинимидил-4-(((йодацетил)амино)метил)циклогексан-1-карбоксилат (sIAC), сукцинимидил-6-(((((4-йодацетил)амино)метил)циклогексан-1-карбонил)амино)гексаноат (sIACX), п-нитрофенилйодацетат (NPIA), карбонил-реактивные и сульфгидрил-реактивные кросс-линкеры, такие как гидразид 4-(4-N-малеимидофенил)масляной кислоты (MPBH), 4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилгидразид-8 (M2C2H), 3-(2-пиридилдитио)пропионилгидразид (PDPH), N-гидроксисукцинимидил-4-азидосалициловую кислоту (NHs-AsA), N-гидроксисульфосукцинимидил-4-азидосалициловую кислоту (сульфо-NHs-AsA), сульфосукцинимидил-(4-азидосалициламидо)гексаноат (сульфо-NHs-LC-AsA), сульфосукцинимидил-2-(п-азидосалициламидо)этил-1,3'-дитиопропионат (sAsD), N-гидроксисукцинимидил-4-азидобензоат (HsAB), N-гидроксисульфосукцинимидил-4-азидобензоат (сульфо-HsAB), N-сукцинимидил-6-(4'-азидо-2'-нитрофениламино)гексаноат (sANPAH), сульфосукцинимидил-6-(4'-азидо-2'-нитрофениламино)гексаноат (сульфо-sANPAH), N-5-азидо-2-нитробензоилоксисукцинимид (ANB-NOs), сульфосукцинимидил-2-(м-азидо-о-нитробензамидо)-этил-1,3'-дитиопропионат (sAND), N-сукцинимидил-4-(4-азидофенил)-1,3'-дитиопропионат (sADP), N-сульфосукцинимидил(4-азидофенил)-1,3'-дитиопропионат (сульфо-sADP), сульфосукцинимидил-4-(п-азидофенил)бутират (сульфо-sAPB), сульфосукцинимидил-2-(7-азидо-4-метилкумарин-3-ацетамид)этил-1,3'-дитиопропионат (sAED), сульфосукцинимидил-7-азидо-4-метилкумарин-3-ацетат (сульфо-sAMCA), п-нитрофенилдиазопируват (ρNPDP), п-нитрофенил-2-диазо-3,3,3-трифторпропионат (PNP-DTP), 1-(п-азидосалициламидо)-4-(йодацетамидо)бутан (AsIB), N-[4-(п-азидосалициламидо)бутил]-3'-(2'-пиридилдитио)пропионамид (APDP), бензофенон-4-йодацетамид, п-азидобензоилгидразид (ABH), 4-(п-азидосалициламидо)бутиламин (AsBA) или п-азидофенилглиоксаль (APG). В некоторых вариантах осуществления линкер включает расщепляемый или нерасщепляемый дипептидный линкер. В некоторых вариантах осуществления дипептидный линкер включает Val-Cit, Phe-Lys, Val-Ala или Val-Lys. В некоторых вариантах осуществления линкер содержит малеимидную группу. В некоторых вариантах осуществления линкер содержит спейсер. В некоторых вариантах осуществления спейсер включает п-аминобензиловый спирт (PAB), п-аминобензилоксикарбонил (PABC), их производное или аналог. В некоторых вариантах осуществления модифицированный полипептид IL-15 представляет собой функционально активный фрагмент полноразмерного полипептида IL-15. В некоторых вариантах осуществления модифицированный полипептид IL-15 представляет собой рекомбинантный полипептид IL-15. В некоторых вариантах осуществления модифицированный полипептид IL-15 представляет собой рекомбинантный человеческий полипептид IL-15. В некоторых вариантах осуществления модифицированный полипептид IL-15 со снижением аффинности связывания с IL-15Rα способен обеспечивать размножение популяций эффекторных Т-клеток (Teff) и клеток, являющихся естественными киллерами (NK).
[6] В определенных вариантах осуществления в данном документе раскрыты модифицированные полипептиды интерлейкина 15 (IL-15), содержащие по меньшей мере одну посттрансляционно модифицированную неприродную аминокислоту, где по меньшей мере одна неприродная аминокислота находится в некотором положении остатка, что избирательно снижает аффинность связывания модифицированного полипептида IL-15 с β-рецептором интерлейкина 2/интерлейкина 15 (IL-2/IL-15Rβ), но не оказывает влияния на взаимодействие с α-рецептором интерлейкина 15 (IL-15Rα). В некоторых вариантах осуществления, где положение остатка по меньшей мере одной неприродной аминокислоты выбрано из V3, I6, K10, E28, S29, D30, V31, H32, P33, S102, V104, H105, Q108, M109, I111, N112, T113, и S114,, где положения остатка соответствуют положениям, представленным в SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления положение остатка по меньшей мере одной неприродной аминокислоты выбрано из V3, K10, S29, D30, H32, H105, Q108, M109, I111, N112, T113, и S114; E28, P33, S102, и V104; или I6 и V31. В некоторых вариантах осуществления положение остатка по меньшей мере одной неприродной аминокислоты выбрано из N1, N4, S7, D8, K11, D61, T62, E64, N65, I68, L69 и N72. В некоторых вариантах осуществления положение остатка по меньшей мере одной неприродной аминокислоты выбрано из N4, S7, K11 и D61; D8, E64, N65, I68 и N72 или N1, T62 и L69. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна неприродная аминокислота включает п-ацетил-L-фенилаланин, п-йод-L-фенилаланин, O-метил-L-тирозин, п-пропаргилоксифенилаланин, п-пропаргилфенилаланин, L-3-(2-нафтил)аланин, 3-метилфенилаланин, O-4-аллил-L-тирозин, 4-пропил-L-тирозин, три-O-ацетил-GlcNAcp-серин, L-допу, фторированный фенилаланин, изопропил-L-фенилаланин, п-азидо-L-фенилаланин, п-ацил-L-фенилаланин, п-бензоил-L-фенилаланин, L-фосфосерин, фосфоносерин, фосфонотирозин, п-бромфенилаланин, п-амино-L-фенилаланин, изопропил-L-фенилаланин или N6-(2-азидоэтокси)-карбонил-L-лизин. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна неприродная аминокислота включает неприродную аминокислоту, показанную на фиг. 1-3. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одну неприродную аминокислоту встраивают в модифицированный полипептид IL-15 с помощью ортогональной пары тРНК-синтетаза/тРНК. В некоторых вариантах осуществления модифицированный полипептид IL-15 конъюгирован с конъюгирующим фрагментом посредством по меньшей мере одной неприродной аминокислоты. В некоторых вариантах осуществления конъюгирующий фрагмент включает водорастворимый полимер, белок или полипептид. В некоторых вариантах осуществления водорастворимый полимер включает полиэтиленгликоль (PEG), поли(пропиленгликоль) (PPG), сополимеры этиленгликоля и пропиленгликоля, поли(оксиэтилированный полиол), поли(олефиновый спирт), поли(винилпирролидон), поли(гидроксиалкилметакриламид), поли(гидроксиалкилметакрилат), поли(сахариды), поли(α-гидроксикислота), поли(виниловый спирт), полифосфазен, полиоксазолины (POZ), поли(N-акрилоилморфолин) или их комбинацию; или полисахарид. В некоторых вариантах осуществления водорастворимый полимер включает PEG. В некоторых вариантах осуществления PEG представляет собой линейный PEG или разветвленный PEG. В некоторых вариантах осуществления водорастворимый полимер включает гликан. В некоторых вариантах осуществления полисахарид включает декстран, полисиаловую кислоту (PSA), гиалуроновую кислоту (HA), амилозу, гепарин, гепарансульфат (HS), декстрин или гидроксиэтилкрахмал (HES). В некоторых вариантах осуществления конъюгирующий фрагмент включает насыщенную жирную кислоту. В некоторых вариантах осуществления насыщенная жирная кислота включает гексадекановую кислоту, тетрадекановую кислоту или 15-азидопентадекановую кислоту. В некоторых вариантах осуществления белок включает альбумин, трансферрин, транстиретин или Fc-часть антитела. В некоторых вариантах осуществления полипептид включает пептид XTEN, богатый глицином аминокислотный гомополимер (HAP), полипептид PAS, эластин-подобный полипептид (ELP), пептид CTP или полимер желатин-подобного белка (GLK). В некоторых вариантах осуществления конъюгирующий фрагмент непосредственно связан с по меньшей мере одной неприродной аминокислотой модифицированного IL-15. В некоторых вариантах осуществления конъюгирующий фрагмент опосредованно связан с по меньшей мере одной неприродной аминокислотой модифицированного IL-15 посредством линкера. В некоторых вариантах осуществления линкер включает гомобифункциональный линкер. В некоторых вариантах осуществления гомобифункциональный линкер включает реагент Ломанта, представляющий собой дитиобис(сукцинимидилпропионат) DSP, 3'3'-дитиобис(сульфосукцинимидилпропионат) (DTSSP), дисукцинимидилсуберат (DSS), бис(сульфосукцинимидил)суберат (BS), дисукцинимидилтартрат (DST), дисульфосукцинимидилтартрат (сульфо-DST), этиленгликобис(сукцинимидилсукцинат) (EGS), дисукцинимидилглутарат (DSG), N, N'-дисукцинимидилкарбонат (DSC), диметиладипимидат (DMA), диметилпимелимидат (DMP), диметилсуберимидат (DMS), диметил-3,3'-дитиобиспропионимидат (DTBP), 1,4-ди-(3'-(2'-пиридилдитио)пропионамидо)бутан (DPDPB), бисмалеимидогексан (BMH), арилгалогенид-содержащее соединение (DFDNB), такое как, например, 1,5-дифтор-2,4-динитробензол или 1,3-дифтор-4,6-динитробензол, 4,4'-дифтор-3,3'-динитрофенилсульфон (DFDNPS), бис-[β-(4-азидосалициламидо)этил]дисульфид (BASED), формальдегид, глутаральдегид, 1,4-бутандиолдиглицидиловый эфир, дигидразид адипиновой кислоты, карбогидразид, о-толуидин, 3,3'-диметилбензидин, бензидин, α,α'-п-диаминодифенил, дийод-п-ксилолсульфоновую кислоту, N, N'-этилен-бис(йодацетамид) или N, N'-гексаметилен-бис(йодацетамид). В некоторых вариантах осуществления линкер включает гетеробифункциональный линкер. В некоторых вариантах осуществления гетеробифункциональный линкер включает N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)пропионат (sPDP), длинноцепочечный N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)пропионат (LC-sPDP), водорастворимый длинноцепочечный N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)пропионат (сульфо-LC-sPDP), сукцинимидилоксикарбонил-α-метил-α-(2-пиридилдитио)толуол (sMPT), сульфосукцинимидил-6-[α-метил-α-(2-пиридилдитио)толуамидо]гексаноат (сульфо-LC-sMPT), сукцинимидил-4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат (sMCC), сульфосукцинимидил-4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат (сульфо-sMCC), сложный эфир м-малеимидобензоил-N-гидроксисукцинимида (MBs), сложный эфир м-малеимидобензоил-N-гидроксисульфосукцинимида (сульфо-MBs), N-сукцинимидил(4-йодактеил)аминобензоат (sIAB), сульфосукцинимидил(4-йодактеил)аминобензоат (сульфо-sIAB), сукцинимидил-4-(п-малеимидофенил)бутират (sMPB), сульфосукцинимидил-4-(п-малеимидофенил)бутират (сульфо-sMPB), сложный эфир N-(γ-малеимидобутирилокси)сукцинимида (GMBs), сложный эфир N-(γ-малеимидобутирилокси)сульфосукцинимида (сульфо-GMBs), сукцинимидил-6-((йодацетил)амино)гексаноат (sIAX), сукцинимидил-6-[6-(((йодацетил)амино)гексаноил)амино]гексаноат (sIAXX), сукцинимидил-4-(((йодацетил)амино)метил)циклогексан-1-карбоксилат (sIAC), сукцинимидил-6-(((((4-йодацетил)амино)метил)циклогексан-1-карбонил)амино)гексаноат (sIACX), п-нитрофенилйодацетат (NPIA), карбонил-реактивные и сульфгидрил-реактивные кросс-линкеры, такие как гидразид 4-(4-N-малеимидофенил)масляной кислоты (MPBH), 4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилгидразид-8 (M2C2H), 3-(2-пиридилдитио)пропионилгидразид (PDPH), N-гидроксисукцинимидил-4-азидосалициловую кислоту (NHs-AsA), N-гидроксисульфосукцинимидил-4-азидосалициловую кислоту (сульфо-NHs-AsA), сульфосукцинимидил-(4-азидосалициламидо)гексаноат (сульфо-NHs-LC-AsA), сульфосукцинимидил-2-(п-азидосалициламидо)этил-1,3'-дитиопропионат (sAsD), N-гидроксисукцинимидил-4-азидобензоат (HsAB), N-гидроксисульфосукцинимидил-4-азидобензоат (сульфо-HsAB), N-сукцинимидил-6-(4'-азидо-2'-нитрофениламино)гексаноат (sANPAH), сульфосукцинимидил-6-(4'-азидо-2'-нитрофениламино)гексаноат (сульфо-sANPAH), N-5-азидо-2-нитробензоилоксисукцинимид (ANB-NOs), сульфосукцинимидил-2-(м-азидо-о-нитробензамидо)-этил-1,3'-дитиопропионат (sAND), N-сукцинимидил-4-(4-азидофенил)-1,3'-дитиопропионат (sADP), N-сульфосукцинимидил(4-азидофенил)-1,3'-дитиопропионат (сульфо-sADP), сульфосукцинимидил-4-(п-азидофенил)бутират (сульфо-sAPB), сульфосукцинимидил-2-(7-азидо-4-метилкумарин-3-ацетамид)этил-1,3'-дитиопропионат (sAED), сульфосукцинимидил-7-азидо-4-метилкумарин-3-ацетат (сульфо-sAMCA), п-нитрофенилдиазопируват (ρNPDP), п-нитрофенил-2-диазо-3,3,3-трифторпропионат (PNP-DTP), 1-(п-азидосалициламидо)-4-(йодацетамидо)бутан (AsIB), N-[4-(п-азидосалициламидо)бутил]-3'-(2'-пиридилдитио)пропионамид (APDP), бензофенон-4-йодацетамид, п-азидобензоилгидразид (ABH), 4-(п-азидосалициламидо)бутиламин (AsBA) или п-азидофенилглиоксаль (APG). В некоторых вариантах осуществления линкер включает расщепляемый или нерасщепляемый дипептидный линкер. В некоторых вариантах осуществления дипептидный линкер включает Val-Cit, Phe-Lys, Val-Ala или Val-Lys. В некоторых вариантах осуществления линкер содержит малеимидную группу. В некоторых вариантах осуществления линкер содержит спейсер. В некоторых вариантах осуществления спейсер включает п-аминобензиловый спирт (PAB), п-аминобензилоксикарбонил (PABC), их производное или аналог. В некоторых вариантах осуществления конъюгирующий фрагмент способен увеличивать время полужизни модифицированного полипептида IL-15 в сыворотке крови. В некоторых вариантах осуществления снижение аффинности связывания представляет собой снижение аффинности связывания с IL-15Rα на приблизительно 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, или 99% по сравнению с полипептидом IL-15 дикого типа. В некоторых вариантах осуществления снижение аффинности связывания с IL-15Rα является приблизительно 1-кратным, 2-кратным, 3-кратным, 4-кратным, 5-кратным, 6-кратным, 7-кратным, 8-кратным, 9-кратным, 10-кратным или больше по сравнению с полипептидом IL-15 дикого типа. В некоторых вариантах осуществления модифицированный полипептид IL-15 представляет собой функционально активный фрагмент полноразмерного полипептида IL-15. В некоторых вариантах осуществления модифицированный полипептид IL-15 представляет собой рекомбинантный полипептид IL-15. В некоторых вариантах осуществления модифицированный полипептид IL-15 представляет собой рекомбинантный человеческий полипептид IL-15. В некоторых вариантах осуществления модифицированный полипептид IL-15 со снижением аффинности связывания с IL-15Rα способен обеспечивать размножение популяций эффекторных Т-клеток (Teff) и клеток, являющихся естественными киллерами (NK).
[7] В определенных вариантах осуществления в данном документе раскрыты конъюгаты интерлейкина 15 (IL-15), содержащие выделенный и очищенный полипептид IL-15; и конъюгирующий фрагмент, который связывается с выделенным и очищенным полипептидом IL-15 в аминокислотном положении, выбранном из N4, E46, D61, E64, N65, I68 и L69, где нумерация аминокислотных остатков соответствует SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления аминокислотное положение представляет собой N4. В некоторых вариантах осуществления аминокислотное положение представляет собой E46. В некоторых вариантах осуществления аминокислотное положение представляет собой D61. В некоторых вариантах осуществления аминокислотное положение представляет собой E64. В некоторых вариантах осуществления аминокислотное положение представляет собой N65. В некоторых вариантах осуществления аминокислотное положение представляет собой I68. В некоторых вариантах осуществления аминокислотное положение представляет собой L69. В некоторых вариантах осуществления аминокислотный остаток мутирован в цистеин. В некоторых вариантах осуществления аминокислотный остаток мутирован в лизин. В некоторых вариантах осуществления аминокислотный остаток, выбранный из N4, E46, N65 и L69, дополнительно мутирован в неприродную аминокислоту. В некоторых вариантах осуществления неприродная аминокислота включает п-ацетил-L-фенилаланин, п-йод-L-фенилаланин, O-метил-L-тирозин, п-пропаргилоксифенилаланин, п-пропаргилфенилаланин, L-3-(2-нафтил)аланин, 3-метилфенилаланин, O-4-аллил-L-тирозин, 4-пропил-L-тирозин, три-O-ацетил-GlcNAcp-серин, L-допу, фторированный фенилаланин, изопропил-L-фенилаланин, п-азидо-L-фенилаланин, п-ацил-L-фенилаланин, п-бензоил-L-фенилаланин, L-фосфосерин, фосфоносерин, фосфонотирозин, п-бромфенилаланин, п-амино-L-фенилаланин, изопропил-L-фенилаланин или N6-(2-азидоэтокси)-карбонил-L-лизин. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна неприродная аминокислота включает неприродную аминокислоту, показанную на фиг. 2С. В некоторых вариантах осуществления конъюгат IL-15 характеризуется пониженной аффинностью к субъединице α-рецептора IL-15 (IL-15Rα) по сравнению с полипептидом IL-15 дикого типа. В некоторых вариантах осуществления снижение аффинности представляет собой снижение аффинности связывания с IL-15Rα на приблизительно 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, или 99% по сравнению с полипептидом IL-15 дикого типа. В некоторых вариантах осуществления снижение аффинности к IL-15Rα является приблизительно 1-кратным, 2-кратным, 3-кратным, 4-кратным, 5-кратным, 6-кратным, 7-кратным, 8-кратным, 9-кратным, 10-кратным или больше по сравнению с полипептидом IL-15 дикого типа. В некоторых вариантах осуществления конъюгирующий фрагмент нарушает или блокирует связывание IL-15 с IL-15Rα.
[8] В определенных вариантах осуществления в данном документе раскрыты фармацевтические композиции, содержащие модифицированный полипептид IL-15 или конъюгат IL-15; и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическую композицию составляют для парентерального введения.
[9] В определенных вариантах осуществления в данном документе раскрыты способы лечения пролиферативного заболевания или состояния у субъекта, нуждающегося в этом, включающие введение субъекту терапевтически эффективного количества модифицированного полипептида IL-15 или конъюгата IL-15. В некоторых вариантах осуществления пролиферативное заболевание или состояние представляет собой рак. В некоторых вариантах осуществления рак представляет собой рак в виде солидной опухоли. В некоторых вариантах осуществления рак в виде солидной опухоли представляет собой рак мочевого пузыря, рак кости, рак головного мозга, рак молочной железы, колоректальный рак, рак пищевода, рак глаза, рак головы и шеи, рак почки, рак легкого, меланому, рак яичника, рак поджелудочной железы или рак предстательной железы. В некоторых вариантах осуществления рак представляет собой гематологическое злокачественное новообразование. В некоторых вариантах осуществления гематологическое злокачественное новообразование представляет собой хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL), мелкоклеточную лимфоцитарную лимфому (SLL), фолликулярную лимфому (FL), диффузную крупноклеточную B-клеточную лимфому (DLBCL), лимфому из клеток мантийной зоны (MCL), макроглобулинемию Вальденстрема, множественную миелому, экстранодальную В-клеточную лимфому из клеток краевой зоны, нодальную В-клеточную лимфому из клеток краевой зоны, лимфому Беркитта, В-клеточную неберкиттовскую лимфому высокой степени злокачественности, первичную медиастинальную B-клеточную лимфому (PMBL), иммунобластную крупноклеточную лимфому, В-лимфобластную лимфому из клеток-предшественников, пролимфоцитарный В-клеточный лейкоз, лимфоплазмоцитарную лимфому, лимфому из клеток краевой зоны селезенки, плазмоклеточную миелому, плазмоцитому, медиастинальную (тимическую) крупноклеточную В-клеточную лимфому, внутрисосудистую крупноклеточную В-клеточную лимфому, первичную эффузионную лимфому или лимфоматоидный гранулематоз. В некоторых вариантах осуществления способы дополнительно включают введение дополнительного терапевтического средства. В некоторых вариантах осуществления модифицированный полипептид IL-15 или конъюгат IL-15 и дополнительное терапевтическое средство вводят одновременно. В некоторых вариантах осуществления модифицированный полипептид IL-15 или конъюгат IL-15 и дополнительное терапевтическое средство вводят последовательно. В некоторых вариантах осуществления модифицированный полипептид IL-15 или конъюгат IL-15 вводят перед дополнительным терапевтическим средством. В некоторых вариантах осуществления модифицированный полипептид IL-15 или конъюгат IL-15 вводят после введения дополнительного терапевтического средства. В некоторых вариантах осуществления субъект представляет собой человека.
[10] В определенных вариантах осуществления в данном документе раскрыты способы размножения популяций эффекторных Т-клеток (Teff) и клеток, являющихся естественными киллерами (NK), включающие: (a) приведение клетки в контакт с модифицированным полипептидом IL-15 или конъюгатом IL-15; и (b) взаимодействие IL-15 с субъединицами IL-15Rβ и IL-15Rγ с образованием комплекса IL-15/IL-15Rβγ; где конъюгат IL-15 характеризуется пониженной аффинностью к субъединице IL-15Rα, и где комплекс IL-15/IL-15Rβγ стимулирует размножение Teff- и NK-клеток. В некоторых вариантах осуществления клетка представляет собой эукариотическую клетку. В некоторых вариантах осуществления клетка представляет собой клетку млекопитающего. В некоторых вариантах осуществления клетка представляет собой клетку человека. В некоторых вариантах осуществления конъюгат IL-15 содержит выделенный и очищенный полипептид IL-15 и конъюгирующий фрагмент, который связывается с выделенным и очищенным полипептидом IL-2 по аминокислотному остатку, выбранному из N4, E46, N65 и L69, где нумерация аминокислотных остатков соответствует SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления снижение аффинности представляет собой снижение аффинности связывания с IL-15Rα на приблизительно 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, или 99% по сравнению с полипептидом IL-15 дикого типа. В некоторых вариантах осуществления снижение аффинности к IL-15Rα является приблизительно IL-15Rα 1-кратным, 2-кратным, 3-кратным, 4-кратным, 5-кратным, 6-кратным, 7-кратным, 8-кратным, 9-кратным, 10-кратным или больше по сравнению с полипептидом IL-15 дикого типа. В некоторых вариантах осуществления конъюгирующий фрагмент нарушает или блокирует связывание IL-15 с IL-15Rα.
[11] В определенных вариантах осуществления в данном документе раскрыты наборы, содержащие модифицированный полипептид IL-15, конъюгат IL-15 или фармацевтическую композицию.
[12] В определенных вариантах осуществления в данном документе раскрыты наборы, содержащие молекулу полинуклеиновой кислоты, кодирующую модифицированный полипептид IL-15 или полипептид IL-15.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
[13] Различные аспекты настоящего изобретения конкретно изложены в прилагаемой формуле изобретения. Лучшее понимание особенностей и преимуществ настоящего изобретения будет получено при обращении к нижеследующему подробному описанию, где излагаются иллюстративные варианты осуществления, в которых используются принципы настоящего изобретения, и прилагаемым графическим материалам, в которых:
[14] на фиг. 1 показаны иллюстративные неприродные аминокислоты. Эта фиг. адаптирована из фиг. 2 из Young et al., "Beyond the canonical 20 amino acids: expanding the genetic lexicon," J. of Biological Chemistry 285(15): 11039-11044 (2010);
[15] На фиг. 2A-2B показаны иллюстративные неприродные аминокислоты. На фиг. 2A показаны иллюстративные производные лизина. На фиг. 2B показаны иллюстративные производные фенилаланина.
[16] На фиг. 3A-3D показаны иллюстративные неприродные аминокислоты. Эти неприродные аминокислоты (UAA) генетически закодированы в белках (фиг. 3A - UAA #1-42; фиг. 3B - UAA # 43-89; фиг. 3C - UAA # 90-128; фиг. 3D - UAA # 129-167). Фиг. 3A-3D адаптированы из таблицы 1 из Dumas et al., Chemical Science 2015, 6, 50-69.
[17] На фиг. 4 показан график анионообменной хроматографии.
[18] На фиг. 5 показан график обращенно-фазовой хроматографии.
[19] На фиг. 6 показаны показаны значения ЕС50 для иллюстративных конъюгатов IL-15 с нативной активностью в анализе пролиферации CTLL2. Результаты графически представлены в виде процента ответа.
[20] На фиг. 7 показаны значения ЕС50 для иллюстративных конъюгатов IL-15 с пониженной активностью в анализе пролиферации CTLL2. Как показано в данном документе, сайт-специфическое пегилирование способствует фармакологии in vitro. Результаты графически представлены в виде процента ответа.
[21] На фиг. 8 показаны значения ЕС50 для иллюстративного IL-15, конъюгированного с PEG различных размеров. Результаты графически представлены в виде процента ответа.
[22] На фиг. 9A-9С показана зависимость единиц ответа (RU, ось Y) от времени (с, ось X) для rHuIL-15, соединений, конъюгированных с IL-15, связывающихся с IL-15Rα. Фиг. 9A: rHuIL-15; фиг. 9B: конъюгаты IL15 N77PEG30 и S83PEG30; и фиг. 9C: конъюгаты IL15 E46PEG30 и E53PEG30.
[23] На фиг. 10 показана зависимость единиц ответа (RU, ось Y) от времени (с, ось X) для rHuIL-15, IL-15 N77PEG30, связывающегося с IL-15Rα и IL-2Rβ.
[24] На фиг. 11 показана зависимость единиц ответа (RU, ось Y) от времени (с, ось X) для rHuIL-15, IL-15 E53PEG30, связывающегося с IL-15Rα и IL-2Rβ.
[25] На фиг. 12A-фиг. 12D показано фосфорилирование STAT5 на NK и CD8+ T-клетках при стимуляции иллюстративными конъюгатами IL-15 PEG. Фиг. 12A и фиг. 12C: увеличение времени полужизни (S83PEG30 и N77PEG30); фиг. 12B и фиг. 12D: модулированное взаимодействие с IL-15Rα (V49PEG30, E53PEG30 и L25PEG30).
[26] На фиг. 13 показаны профили концентрации в плазме крови rHuIL-15, IL-15 S83PEG30, IL-15 V49PEG30 IL-15 L25 PEG30 и IL-15 N77 PEG30 при 0,3 мг/кг.
[27] На фиг. 14A-14D показан процент фосфорилирования STAT5 в CD8+ T-клетках (фиг. 14A), CD8 клетках памяти (фиг. 14B), NK-клетках (фиг. 14C) и Treg-клетках (фиг. 14D) у мышей, которым вводили rHuIL-15 или пегилированные соединения.
[28] На фиг. 15A-15D показано повышение экспрессии молекулярного маркера ранней пролиферации Ki67 в CD8+ T (фиг. 15A), NK-клетках (фиг. 15B), CD8+ Tmem (фиг. 15C), но не в Treg-клетках (фиг. 15D) у животных, которым вводили пегилированные соединения.
[29] На фиг. 16A-16C показана индукция пролиферации CD8+ T-клеток (фиг. 16A), NK-клеток (фиг. 16B) и CD8 T-клеток памяти (фиг. 16C).
[30] На фиг. 17A-17B показано повышение экспрессии Ki67 в NK-клетках (фиг. 17A) и CD8+ T (фиг. 17B) с повышением дозы соединения IL-15 L25PEG30 у мышей.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[31] Рак представляет собой комплексную группу заболеваний, связанных с аномальным ростом клеток, которые способны проникать или распространяться в другие части тела. Способы терапии рака, такие как лучевая терапия и химиотерапия, направленные на определяющие факторы рака и метаболические пути, могут быть успешными. В некоторых случаях раковые клетки способны адаптироваться к этим способам терапии, что ограничивает эффективность таких способов терапии. Иммунотерапия, в отличие от хирургии, химиотерапии или лучевой терапии, стимулирует иммунную систему распознавать и уничтожать клетки опухоли.
[32] Некоторые цитокины применяются в иммунотерапии из-за их способности запускать иммунный ответ. Однако современные способы иммунотерапии с использованием цитокинов приводят к нескольким нежелательным эффектам, включая токсичность и неконтролируемую клеточную пролиферацию. В данном документе предусмотрены модифицированные цитокины или конъюгаты цитокинов для применения для лечения рака, обладающие способностью стимулировать или размножать популяции специфических Т-клеток и NK-клеток, что приводит к улучшению лечения и снижению нежелательных явлений.
[33] Цитокины включают семейство клеточных сигнальных белков, таких как хемокины, интерфероны, интерлейкины, лимфокины и факторы некроза опухоли. Цитокины продуцируются клетками иммунной системы, такими как макрофаги, В-лимфоциты, Т-лимфоциты и тучные клетки, эндотелиальными клетками, фибробластами и различными стромальными клетками. В некоторых случаях цитокины модулируют баланс между гуморальным и клеточным иммунными ответами.
[34] Интерлейкины представляют собой сигнальные белки, которые модулируют развитие и дифференцировку Т- и В-лимфоцитов, а также гемопоэтических клеток. Интерлейкины продуцируются хелперными CD4 Т-лимфоцитами, моноцитами, макрофагами и эндотелиальными клетками. В некоторых случаях имеется приблизительно 15 интерлейкинов, интерлейкины 1-13, интерлейкин 15 и интерлейкин 17.
[35] Интерлейкин-15 (IL-15) является плейотропным цитокином, структура которого представляет собой гликопротеин с молекулярным весом 14-15 кДа. Транскрипция, трансляция и секреция IL-15 регулируются посредством множества сложных механизмов. Белки IL-15 и α-рецептора IL-15 (IL-15Rα, CD215) совместно экспрессируются преимущественно активированными моноцитами и дендритными клетками (DC). Транскрипция гетеродимера IL-15/IL-15Rα происходит после взаимодействия моноцитов/DC с интерферонами (IFN) 1 или 2 типа, или лигирования CD40, или со средствами, которые действуют посредством Toll-подобных рецепторов (TLR), которые активируют NF-kB. Кроме того, экспрессия белка IL-15/IL-15Rα преимущественно контролируется на уровнях трансляции и секреции.
[36] IL-15 передает сигналы посредством гетеротримерного рецептора, содержащего уникальную α-цепь (IL-15Rα), общую с IL-2 (CD122) β-субъединицу (IL-15Rβ, CD132) и общую с несколькими цитокинами типичную γ-субъединицу (CD132; IL-15Rγ). IL-15Rα характеризуется высокой аффинностью к IL-15 с Kd, составляющей приблизительно 10-11 M.
[37] В некоторых вариантах осуществления передача сигнала IL-15 используется для модуляции ответов Т-клеток и в последующем для лечения рака. В некоторых вариантах осуществления передача сигнала IL-15 используется для симуляции пролиферации активированных CD4-CD8-, CD4+CD8+, CD4+ и CD8+ Т-клеток и их дифференцировки в определенные субпопуляции эффекторных Т-клеток. В некоторых вариантах осуществления передача сигнала IL-15 используется для симуляции образования и пролиферации клеток, являющихся естественными киллерами (NK). В некоторых вариантах осуществления передача сигнала IL-15 используется для обеспечения поддержания и выживания CD8 Т-клеток памяти, наивных CD8 Т-клеток и NK-клеток. В некоторых вариантах осуществления передача сигнала IL-15 используется для индукции образования CD8 Т-клеток памяти. В некоторых вариантах осуществления передача сигнала IL-15 используется для прайминга специфической в отношении мишени активации NK-клеток. В некоторых вариантах осуществления передача сигнала IL-15 не приводит к размножению Treg.
[38] В некоторых вариантах осуществления в данном документе описаны модифицированные полипептиды IL-15 для модуляции ответов Т-клеток и в последующем для лечения рака. В некоторых вариантах осуществления модифицированный полипептид IL-15 включает снижение степени связывания с α-рецептором интерлейкина 15 (IL-15Rα). В некоторых вариантах осуществления снижение аффинности связывания относится к аффинности связывания между полипептидом IL-15 дикого типа и IL-15Rα. В некоторых вариантах осуществления модифицированный полипептид IL-15 оказывает небольшое влияние или не оказывает влияния на взаимодействие модифицированного полипептида IL-15 с βγ-рецептором интерлейкина 2/интерлейкина 15 (IL-2/IL-15Rβγ). В некоторых вариантах осуществления модифицированный полипептид IL-15 содержит одну или несколько модификаций, которые оказывают небольшое влияние или не оказывают влияния на аффинность связывания модифицированного полипептида IL-15 с IL-15Rα и IL-15Rβγ. В некоторых вариантах осуществления модифицированный полипептид IL-15 включает снижение степени связывания с IL-2/IL-15Rβγ, а взаимодействие с IL-15Rα не изменяется.
[39] В данном документе описаны модифицированные полипептиды IL-15 или конъюгаты IL-15 с улучшенной способностью к стимуляции противоопухолевого ответа. В некоторых вариантах осуществления модифицированные полипептиды IL-15 или конъюгаты IL-15 характеризуются улучшенным профилем безопасности. В некоторых вариантах осуществления модифицированные полипептиды IL-15 или конъюгаты IL-15 содержат сайт-специфическое пегилирование для увеличения времени полужизни. В некоторых вариантах осуществления сайт-специфическое пегилирование увеличивает время полужизни и оказывает небольшое влияние или не оказывает влияния на биологическую активность. В некоторых вариантах осуществления передача сигнала модифицированных полипептидов IL-15 или конъюгатов IL-15 смещена в сторону IL-15Rβγ. В некоторых вариантах осуществления модифицированные полипептиды IL-15 или конъюгаты IL-15 содержат сайт-специфическое пегилирование для увеличения времени полужизни и снижения токсичности. В некоторых вариантах осуществления сайт-специфическое пегилирование приводит к уменьшению дозировки модифицированных полипептидов IL-15 или конъюгатов IL-15. В некоторых вариантах осуществления токсичность снижается за счет того, что модифицированные полипептиды IL-15 или конъюгаты IL-15 блокируют взаимодействие с IL-15Rα. В некоторых вариантах осуществления активность модифицированных полипептидов IL-15 или конъюгатов IL-15 ограничена участком опухоли. В некоторых вариантах осуществления модифицированные полипептиды IL-15 или конъюгаты IL-15 содержат сайт-специфическое пегилирование, так что не требуется транс-представления IL-15 для пролиферации и функционирования естественных киллеров (NK) и эффекторных клеток. В некоторых вариантах осуществления модифицированные полипептиды IL-15 или конъюгаты IL-15 содержат сайт-специфическое пегилирование, так что клиренс ингибируется или запрещается.
Модифицированные полипептиды IL-15 и конъюгаты IL-15
[40] В некоторых вариантах осуществления в данном документе описаны модифицированные полипептиды IL-15. В некоторых случаях модификация относится к природной аминокислоте. В некоторых случаях модификация относится к неприродной аминокислоте. В некоторых случаях в данном документе описан выделенный и модифицированный полипептид IL-15, который содержит по меньшей мере одну неприродную аминокислоту. В некоторых случаях полипептид IL-15 представляет собой выделенный и очищенный IL-15 млекопитающего, например, белок IL-15 человека. В некоторых случаях полипептид IL-15 представляет собой человеческий белок IL-15. В некоторых случаях полипептид IL-15 характеризуется приблизительно 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, или 99% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 1 или 2. В некоторых случаях полипептид IL-15 содержит последовательность под SEQ ID NO: 1 или 2, или состоит из нее.
[41] В некоторых случаях модифицированный полипептид IL-15 представляет собой усеченный вариант. В некоторых случаях усечение представляет собой N-концевую делецию. В других случаях усечение представляет собой С-концевую делецию. В дополнительных случаях усечение включает как N-концевую, так и C-концевую делеции. Например, усечение может представлять собой делецию по меньшей мере или приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, или более остатков либо с N-конца, либо с С-конца, либо с обоих концов. В некоторых случаях модифицированный полипептид IL-15 предусматривает N-концевую делецию по меньшей мере или приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20 или более остатков. В некоторых случаях модифицированный полипептид IL-15 предусматривает N-концевую делецию по меньшей мере или приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 остатков. В некоторых случаях модифицированный полипептид IL-15 предусматривает N-концевую делецию по меньшей мере или приблизительно 2 остатков. В некоторых случаях модифицированный полипептид IL-15 предусматривает N-концевую делецию по меньшей мере или приблизительно 3 остатков. В некоторых случаях модифицированный полипептид IL-15 предусматривает N-концевую делецию по меньшей мере или приблизительно 4 остатков. В некоторых случаях модифицированный полипептид IL-15 предусматривает N-концевую делецию по меньшей мере или приблизительно 5 остатков. В некоторых случаях модифицированный полипептид IL-15 предусматривает N-концевую делецию по меньшей мере или приблизительно 6 остатков. В некоторых случаях модифицированный полипептид IL-15 предусматривает N-концевую делецию по меньшей мере или приблизительно 7 остатков. В некоторых случаях модифицированный полипептид IL-15 предусматривает N-концевую делецию по меньшей мере или приблизительно 8 остатков. В некоторых случаях модифицированный полипептид IL-15 предусматривает N-концевую делецию по меньшей мере или приблизительно 9 остатков. В некоторых случаях модифицированный полипептид IL-15 предусматривает N-концевую делецию по меньшей мере или приблизительно 10 остатков.
[42] В некоторых вариантах осуществления модифицированный полипептид IL-15 представляет собой функционально активный фрагмент. В некоторых случаях функционально активный фрагмент содержит участок IL-15 5-114, 10-114, 15-114, 20-114, 1-110, 5-110, 10-110, 15-110, 20-110, 1-105, 5-105, 10-105, 15-105, 20-105, 1-100, 5-100, 10-100, 15-100 или 20-100, где положения остатков соответствуют положениям в SEQ ID NO: 1. В некоторых случаях функционально активный фрагмент содержит участок IL-15 5-114, 10-114, 15-114 или 20-114, где положения остатков соответствуют положениям в SEQ ID NO: 1. В некоторых случаях функционально активный фрагмент содержит участок IL-15 1-110, 5-110, 10-110, 15-110 или 20-110, где положения остатков соответствуют положениям в SEQ ID NO: 1. В некоторых случаях функционально активный фрагмент содержит участок IL-15 1-105, 5-105, 10-105, 15-105 или 20-105, где положения остатков соответствуют положениям в SEQ ID NO: 1. В некоторых случаях функционально активный фрагмент содержит участок IL-15 1-100, 5-100, 10-100, 15-100 или 20-100, где положения остатков соответствуют положениям в SEQ ID NO: 1.
[43] В некоторых вариантах осуществления функционально активный фрагмент IL-15 содержит внутреннюю делецию. В некоторых случаях внутренняя делеция включает участок петли. В некоторых случаях внутренняя делеция включает делецию 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 или более остатков.
[44] В некоторых вариантах осуществления описанный в данном документе полипептид IL-15 содержит по меньшей мере одну неприродную аминокислоту. В некоторых случаях положение остатка по меньшей мере одной неприродной аминокислоты выбрано из N1, W2, V3, N4, I6, S7, D8, K10, K11, E13, D14, L15, Q17, S18, M19, H20, I21, D22, A23, T24, L25, Y26, T27, E28, S29, D30, V31, H32, P33, S34, C35, K36, V37, T38, A39, K41, L44, L45, E46, Q48, V49, S51, L52, E53, S54, G55, D56, A57, S58, H60, D61, T62, V63, E64, N65, I67, I68, L69, N71, N72, S73, L74, S75, S76, N77, G78, N79, V80, T81, E82, S83, G84, C85, K86, E87, C88, E89, E90, L91, E92, E93, K94, N95, I96, K97, E98, L100, Q101, S102, V104, H105, Q108, M109, F110, I111, N112, T113, и S114,, где положения остатка соответствуют положениям, представленным в SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления положение остатка по меньшей мере одной неприродной аминокислоты выбрано из N1, W2, V3, N4, I6, S7, D8, K10, K11, E13, D14, L15, Q17, S18, M19, H20, I21, D22, A23, T24, L25, Y26, E28, S29, D30, V31, H32, P33, S34, C35, K36, V37, T38, K41, L44, E46, Q48, V49, S51, L52, E53, S54, G55, D56, A57, S58, H60, D61, T62, V63, E64, N65, I67, I68, L69, N71, N72, S73, L74, S75, S76, N77, G78, N79, V80, T81, E82, S83, G84, C85, K86, E87, C88, E89, E90, L91, E92, E93, K94, N95, I96, K97, E98, L100, Q101, S102, V104, H105, Q108, M109, F110, I111, N112, T113, и S114, где положения остатка соответствуют положениям, представленным в SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления положение остатка по меньшей мере одной неприродной аминокислоты выбрано из E13, D14, L15, Q17, S18, M19, H20, I21, S34, C35, K36, V37, T38, K41, L44, S51, L52, S54, G55, D56, A57, S58, H60, V63, I67, N71, S73, L74, S75, S76, N77, G78, N79, V80, T81, E82, S83, G84, C85, K86, E87, C88, L91, E92, K94, N95, I96, K97, E98, L100, Q101, и F110. В некоторых вариантах осуществления положение остатка по меньшей мере одной неприродной аминокислоты выбрано из D14, Q17, S18, K41, S51, L52, G55, D56, A57, S58, S75, S76, N77, N79, V80, T81, S83, G84, E92, K94, N95, K97, и E98. В некоторых вариантах осуществления положение остатка по меньшей мере одной неприродной аминокислоты выбрано из N1, N4, S7, D8, K11, D61, T62, E64, N65, I68, L69, и N72. В некоторых вариантах осуществления положение остатка по меньшей мере одной неприродной аминокислоты выбрано из V3, I6, K10, E28, S29, D30, V31, H32, P33, S102, V104, H105, Q108, M109, I111, N112, T113, и S114. В некоторых вариантах осуществления положение остатка по меньшей мере одной неприродной аминокислоты выбрано из D22, A23, T24, L25, Y26, L44, E46, Q48, V49, E53, E89, E90, и E93. В некоторых вариантах осуществления положение остатка по меньшей мере одной неприродной аминокислоты выбрано из Y26, E46, V49, E53 и L25. В некоторых вариантах осуществления положение остатка по меньшей мере одной неприродной аминокислоты выбрано из V3, K10, S29, D30, H32, H105, Q108, M109, I111, N112, T113, и S114. В некоторых вариантах осуществления положение остатка по меньшей мере одной неприродной аминокислоты выбрано из N4, S7, K11 и D61. В некоторых вариантах осуществления положение остатка по меньшей мере одной неприродной аминокислоты выбрано из L25, E53, N77 и S83. В некоторых вариантах осуществления положение остатка по меньшей мере одной неприродной аминокислоты выбрано из L25 и E53. В некоторых вариантах осуществления положение остатка по меньшей мере одной неприродной аминокислоты выбрано из E46, Y26, V49, E53, T24, N4, K11, N65, L69, S18, H20, и S83. В некоторых вариантах осуществления положение остатка по меньшей мере одной неприродной аминокислоты выбрано из E46, Y26, V49, E53 и T24. В некоторых вариантах осуществления положение остатка по меньшей мере одной неприродной аминокислоты выбрано из E46, V49, E53 и T24. В некоторых вариантах осуществления положение остатка по меньшей мере одной неприродной аминокислоты выбрано из Y26, V49, E53 и T24. В некоторых вариантах осуществления положение остатка по меньшей мере одной неприродной аминокислоты выбрано из V49, E53 и T24. В некоторых вариантах осуществления положение остатка по меньшей мере одной неприродной аминокислоты выбрано из E46 и Y26. В некоторых вариантах осуществления положение остатка по меньшей мере одной неприродной аминокислоты представляет собой E46. В некоторых вариантах осуществления положение остатка по меньшей мере одной неприродной аминокислоты представляет собой L25. В некоторых вариантах осуществления положение остатка по меньшей мере одной неприродной аминокислоты представляет собой Y26. В некоторых вариантах осуществления положение остатка по меньшей мере одной неприродной аминокислоты представляет собой V49. В некоторых вариантах осуществления положение остатка по меньшей мере одной неприродной аминокислоты представляет собой E53. В некоторых вариантах осуществления положение остатка по меньшей мере одной неприродной аминокислоты представляет собой T24. В некоторых вариантах осуществления положение остатка по меньшей мере одной неприродной аминокислоты представляет собой N77. В некоторых вариантах осуществления положение остатка по меньшей мере одной неприродной аминокислоты выбрано из N4, K11, N65, L69, S18, H20 и S83. Иллюстративная аминокислотная последовательность IL-15 показана в таблице 1 ниже.
(зрелая форма)
GenBank: CAA71044.1
(предшественник)
[45] В некоторых случаях по меньшей мере одна неприродная аминокислота расположена проксимальнее N-конца. Применяемый в данном документе термин "проксимальнее" относится к остатку, расположенному по меньшей мере на расстоянии 1 остатка от N-концевого остатка и до приблизительно 50 остатков от N-концевого остатка. В некоторых случаях по меньшей мере одна неприродная аминокислота расположена в пределах первых 10, 20, 30, 40 или 50 остатков от N-концевого остатка. В некоторых случаях по меньшей мере одна неприродная аминокислота расположена в пределах первых 10 остатков от N-концевого остатка. В некоторых случаях по меньшей мере одна неприродная аминокислота расположена в пределах первых 20 остатков от N-концевого остатка. В некоторых случаях по меньшей мере одна неприродная аминокислота расположена в пределах первых 30 остатков от N-концевого остатка. В некоторых случаях по меньшей мере одна неприродная аминокислота расположена в пределах первых 40 остатков от N-концевого остатка. В некоторых случаях по меньшей мере одна неприродная аминокислота расположена в пределах первых 50 остатков от N-концевого остатка.
[46] В некоторых случаях по меньшей мере одна неприродная аминокислота представляет собой N-концевой остаток.
[47] В некоторых случаях по меньшей мере одна неприродная аминокислота расположена проксимальнее C-конца. Применяемый в данном документе термин "проксимальнее" относится к остатку, расположенному по меньшей мере на расстоянии 1 остатка от C-концевого остатка и до приблизительно 50 остатков от C-концевого остатка. В некоторых случаях по меньшей мере одна неприродная аминокислота расположена в пределах первых 10, 20, 30, 40 или 50 остатков от C-концевого остатка. В некоторых случаях по меньшей мере одна неприродная аминокислота расположена в пределах первых 10 остатков от C-концевого остатка. В некоторых случаях по меньшей мере одна неприродная аминокислота расположена в пределах первых 20 остатков от C-концевого остатка. В некоторых случаях по меньшей мере одна неприродная аминокислота расположена в пределах первых 30 остатков от C-концевого остатка. В некоторых случаях по меньшей мере одна неприродная аминокислота расположена в пределах первых 40 остатков от C-концевого остатка. В некоторых случаях по меньшей мере одна неприродная аминокислота расположена в пределах первых 50 остатков от C-концевого остатка.
[48] В некоторых случаях по меньшей мере одна неприродная аминокислота представляет собой C-концевой остаток.
[49] В некоторых вариантах осуществления модифицированные полипептиды IL-15 содержат по меньшей мере одну неприродную аминокислоту, где положение остатка по меньшей мере одной неприродной аминокислоты находится в некотором положении остатка, что селективно снижает аффинность связывания полипептида IL-15 с α-рецептором интерлейкина 15 (IL-15Rα). В некоторых вариантах осуществления снижение аффинности связывания относится к аффинности связывания между полипептидом IL-15 дикого типа и IL-15Rα. В некоторых вариантах осуществления связывание модифицированного полипептида IL-15 с IL-15Rα не оказывает влияния на взаимодействие модифицированного полипептида IL-15 с βγ-рецептором интерлейкина 2/интерлейкина 15 (IL-2/IL-15R βγ) или не улучшает взаимодействие модифицированного полипептида IL-15 с IL-2/IL-15R βγ. В некоторых случаях положение остатка по меньшей мере одной неприродной аминокислоты выбрано из D22, A23, T24, L25, Y26, L44, E46, Q48, V49, E53, E89, E90 и E93, где положения остатка соответствуют положениям, представленным в SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления положение остатка по меньшей мере одной неприродной аминокислоты выбрано из Y26, E46, V49, E53 и L25, где положения остатка соответствуют положениям, представленным в SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления положение остатка по меньшей мере одной неприродной аминокислоты выбрано из A23, T24, E89 и E93, где положения остатка соответствуют положениям, представленным в SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления положение остатка по меньшей мере одной неприродной аминокислоты выбрано из D22, L44, Q48 и E90, где положения остатка соответствуют положениям, представленным в SEQ ID NO: 1. В некоторых случаях положение остатка по меньшей мере одной неприродной аминокислоты представляет собой Y26. В некоторых случаях положение остатка по меньшей мере одной неприродной аминокислоты представляет собой E46. В некоторых случаях положение остатка по меньшей мере одной неприродной аминокислоты представляет собой V49. В некоторых случаях положение остатка по меньшей мере одной неприродной аминокислоты представляет собой E53. В некоторых случаях положение остатка по меньшей мере одной неприродной аминокислоты представляет собой L25. В некоторых вариантах осуществления модифицированный полипептид IL-15 дополнительно содержит PEG. В некоторых случаях PEG конъюгирован в положении остатка, выбранном из D22, A23, T24, L25, Y26, L44, E46, Q48, V49, E53, E89, E90 и E93. В некоторых вариантах осуществления модифицированный полипептид IL-15 дополнительно содержит PEG для увеличения времени полужизни. В некоторых случаях PEG конъюгирован в положении остатка, выбранном из E13, D14, L15, Q17, S18, M19, H20, I21, S34, C35, K36, V37, T38, K41, L44, S51, L52, S54, G55, D56, A57, S58, H60, V63, I67, N71, S73, L74, S75, S76, N77, G78, N79, V80, T81, E82, S83, G84, C85, K86, E87, C88, L91, E92, K94, N95, I96, K97, E98, L100, Q101, и F110, для увеличения времени полужизни. В некоторых случаях PEG конъюгирован в положении остатка, выбранном из N71, N72 и N77. В некоторых случаях остаток, конъюгированный с PEG, мутирован в природную аминокислоту. В других случаях остаток, конъюгированный с PEG, мутирован в неприродную аминокислоту. В дополнительных случаях мутация в N71, N72 или N77 дополнительно улучшает условие по CMC (например, выход, чистоту, стабильность, снижение агрегации и/или улучшение фолдинга белка), эффективность или их комбинацию.
[50] В некоторых случаях модифицированные полипептиды IL-15 содержат по меньшей мере одну неприродную аминокислоту, где по меньшей мере одна неприродная аминокислота находится в некотором положении остатка, что селективно снижает аффинность связывания модифицированного полипептида IL-15 с IL-2/IL-15Rβ, IL-15Rγ или их комбинацией. В некоторых вариантах осуществления модифицированный IL-15 оказывает небольшое влияние или не оказывает влияния на взаимодействие с IL-15Rα. В некоторых вариантах осуществления положение остатка по меньшей мере одной неприродной аминокислоты выбрано из N1, V3, N4, I6, S7, D8, K10, K11, E28, S29, D30, V31, H32, P33, D61, T62, E64, N65, I68, L69, N72, S102, V104, H105, Q108, M109, I111, N112, T113, и S114,, где положения остатка соответствуют положениям, представленным в SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна неприродная аминокислота находится в некотором положении остатка, что селективно снижает аффинность связывания модифицированного полипептида IL-15 с IL-2/IL-15R β. В некоторых случаях положение остатка по меньшей мере одной неприродной аминокислоты выбрано из N1, N4, S7, D8, K11, D61, T62, E64, N65, I68, L69 и N72, где положения остатка соответствуют положениям, представленным в SEQ ID NO: 1. В некоторых случаях положение остатка по меньшей мере одной неприродной аминокислоты выбрано из N4, S7, K11 и D61. В некоторых случаях положение остатка по меньшей мере одной неприродной аминокислоты выбрано из D8, E64, N65, I68 и N72. В некоторых случаях положение остатка по меньшей мере одной неприродной аминокислоты выбрано из N1, T62 и L69. В некоторых случаях положение остатка по меньшей мере одной неприродной аминокислоты представляет собой N4. В некоторых случаях положение остатка по меньшей мере одной неприродной аминокислоты представляет собой S7. В некоторых случаях положение остатка по меньшей мере одной неприродной аминокислоты представляет собой K11. В некоторых случаях положение остатка по меньшей мере одной неприродной аминокислоты представляет собой D61. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна неприродная аминокислота находится в некотором положении остатка, что селективно снижает аффинность связывания модифицированного полипептида IL-15 с IL-2/IL-15Rγ. В некоторых случаях положение остатка по меньшей мере одной неприродной аминокислоты выбрано из V3, I6, K10, E28, S29, D30, V31, H32, P33, S102, V104, H105, Q108, M109, I111, N112, T113, и S114,, где положения остатка соответствуют положениям, представленным в SEQ ID NO: 1. В некоторых случаях положение остатка по меньшей мере одной неприродной аминокислоты выбрано из V3, K10, S29, D30, H32, H105, Q108, M109, I111, N112, T113, и S114. В некоторых случаях положение остатка по меньшей мере одной неприродной аминокислоты выбрано из E28, P33, S102 и V104. В некоторых случаях положение остатка по меньшей мере одной неприродной аминокислоты выбрано из I6 и V31. В некоторых случаях положение остатка по меньшей мере одной неприродной аминокислоты представляет собой V3. В некоторых случаях положение остатка по меньшей мере одной неприродной аминокислоты представляет собой K10. В некоторых случаях положение остатка по меньшей мере одной неприродной аминокислоты представляет собой S29. В некоторых случаях положение остатка по меньшей мере одной неприродной аминокислоты представляет собой D30. В некоторых случаях положение остатка по меньшей мере одной неприродной аминокислоты представляет собой H32. В некоторых случаях положение остатка по меньшей мере одной неприродной аминокислоты представляет собой H105. В некоторых случаях положение остатка по меньшей мере одной неприродной аминокислоты представляет собой Q108. В некоторых случаях положение остатка по меньшей мере одной неприродной аминокислоты представляет собой M109. В некоторых случаях положение остатка по меньшей мере одной неприродной аминокислоты представляет собой I111. В некоторых случаях положение остатка по меньшей мере одной неприродной аминокислоты представляет собой N112. В некоторых случаях положение остатка по меньшей мере одной неприродной аминокислоты представляет собой T113. В некоторых случаях положение остатка по меньшей мере одной неприродной аминокислоты представляет собой S114. В некоторых вариантах осуществления модифицированный полипептид IL-15 дополнительно содержит PEG. В некоторых случаях PEG конъюгирован в положении остатка, выбранном из N1, V3, N4, I6, S7, D8, K10, K11, E28, S29, D30, V31, H32, P33, D61, T62, E64, N65, I68, L69, N72, S102, V104, H105, Q108, M109, I111, N112, T113, и S114. В некоторых вариантах осуществления модифицированный полипептид IL-15 дополнительно содержит PEG для увеличения времени полужизни. В некоторых случаях PEG конъюгирован в положении остатка, выбранном из E13, D14, L15, Q17, S18, M19, H20, I21, S34, C35, K36, V37, T38, K41, L44, S51, L52, S54, G55, D56, A57, S58, H60, V63, I67, N71, S73, L74, S75, S76, N77, G78, N79, V80, T81, E82, S83, G84, C85, K86, E87, C88, L91, E92, K94, N95, I96, K97, E98, L100, Q101, и F110 для увеличения времени полужизни. В некоторых случаях PEG конъюгирован в положении остатка, выбранном из N71, N72 и N77. В некоторых случаях остаток, конъюгированный с PEG, мутирован в природную аминокислоту. В других случаях остаток, конъюгированный с PEG, мутирован в неприродную аминокислоту. В дополнительных случаях мутация в N71, N72 или N77 дополнительно улучшает условие по CMC (например, выход, чистоту, стабильность, снижение агрегации и/или улучшение фолдинга белка), эффективность или их комбинацию.
[51] В некоторых случаях модифицированные полипептиды IL-15 содержат по меньшей мере одну неприродную аминокислоту, где по меньшей мере одна неприродная аминокислота находится в некотором положении остатка, что не оказывает влияния на аффинность связывания модифицированного полипептида IL-15 с IL-15R α и IL-15R βγ. В некоторых вариантах осуществления модифицированный полипептид IL-15 дополнительно содержит PEG для увеличения времени полужизни. В некоторых вариантах осуществления модифицированный IL-15 содержит PEG без изменения биологической активности. В некоторых вариантах осуществления остаток модифицирован для увеличения времени полужизни. В некоторых случаях положение остатка по меньшей мере одной неприродной аминокислоты выбрано из E13, D14, L15, Q17, S18, M19, H20, I21, S34, C35, K36, V37, T38, K41, L44, S51, L52, S54, G55, D56, A57, S58, H60, V63, I67, N71, S73, L74, S75, S76, N77, G78, N79, V80, T81, E82, S83, G84, C85, K86, E87, C88, L91, E92, K94, N95, I96, K97, E98, L100, Q101, и F110, где положения остатка соответствуют положениям, представленным в SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления положение остатка по меньшей мере одной неприродной аминокислоты выбрано из D14, Q17, S18, K41, S51, L52, G55, D56, A57, S58, S75, S76, N77, N79, V80, T81, S83, G84, E92, K94, N95, K97, и E98, где положения остатка соответствуют положениям, представленным в SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления положение остатка по меньшей мере одной неприродной аминокислоты выбрано из E13, L15, M19, H20, K36, V37, T38, S54, H60, I67, N71, G78, K86, E87, и Q101, где положения остатка соответствуют положениям, представленным в SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления положение остатка по меньшей мере одной неприродной аминокислоты выбрано из I21, S34, C35, L44, V63, S73, L74, E82, C85, C88, L91, I96, L100, и F110, где положения остатка соответствуют положениям, представленным в SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления положение остатка по меньшей мере одной неприродной аминокислоты выбрано из N71, N72 и N77, где положения остатка соответствуют положениям, представленным в SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления положение остатка по меньшей мере одной неприродной аминокислоты выбрано из N77 и S83. В некоторых вариантах осуществления положение остатка по меньшей мере одной неприродной аминокислоты представляет собой D14. В некоторых вариантах осуществления положение остатка по меньшей мере одной неприродной аминокислоты представляет собой Q17. В некоторых вариантах осуществления положение остатка по меньшей мере одной неприродной аминокислоты представляет собой S18. В некоторых вариантах осуществления положение остатка по меньшей мере одной неприродной аминокислоты представляет собой K41. В некоторых вариантах осуществления положение остатка по меньшей мере одной неприродной аминокислоты представляет собой S51. В некоторых вариантах осуществления положение остатка по меньшей мере одной неприродной аминокислоты представляет собой L52. В некоторых вариантах осуществления положение остатка по меньшей мере одной неприродной аминокислоты представляет собой G55. В некоторых вариантах осуществления положение остатка по меньшей мере одной неприродной аминокислоты представляет собой D56. В некоторых вариантах осуществления положение остатка по меньшей мере одной неприродной аминокислоты представляет собой A57. В некоторых вариантах осуществления положение остатка по меньшей мере одной неприродной аминокислоты представляет собой S58. В некоторых вариантах осуществления положение остатка по меньшей мере одной неприродной аминокислоты представляет собой S75. В некоторых вариантах осуществления положение остатка по меньшей мере одной неприродной аминокислоты представляет собой S76. В некоторых вариантах осуществления положение остатка по меньшей мере одной неприродной аминокислоты представляет собой N77. В некоторых вариантах осуществления положение остатка по меньшей мере одной неприродной аминокислоты представляет собой N79. В некоторых вариантах осуществления положение остатка по меньшей мере одной неприродной аминокислоты представляет собой V80. В некоторых вариантах осуществления положение остатка по меньшей мере одной неприродной аминокислоты представляет собой T81. В некоторых вариантах осуществления положение остатка по меньшей мере одной неприродной аминокислоты представляет собой S83. В некоторых вариантах осуществления положение остатка по меньшей мере одной неприродной аминокислоты представляет собой G84. В некоторых вариантах осуществления положение остатка по меньшей мере одной неприродной аминокислоты представляет собой E92. В некоторых вариантах осуществления положение остатка по меньшей мере одной неприродной аминокислоты представляет собой K94. В некоторых вариантах осуществления положение остатка по меньшей мере одной неприродной аминокислоты представляет собой N95. В некоторых вариантах осуществления положение остатка по меньшей мере одной неприродной аминокислоты представляет собой K97. В некоторых вариантах осуществления положение остатка по меньшей мере одной неприродной аминокислоты представляет собой E98. В некоторых случаях мутация в N71, N72 или N77 включает мутацию в природную аминокислоту. В некоторых случаях мутация в N71, N72 или N77 дополнительно улучшает условие по CMC (например, выход, чистоту, стабильность, снижение агрегации и/или улучшение фолдинга белка), эффективность или их комбинацию.
[52] В некоторых вариантах осуществления полипептид IL-15, содержащий по меньшей мере одну неприродную аминокислоту, дополнительно конъюгирован с конъюгирующим фрагментом с образованием конъюгата IL-15. В некоторых случаях аминокислотное положение по меньшей мере одной неприродной аминокислоты находится в N1, W2, V3, N4, I6, S7, D8, K10, K11, E13, D14, L15, Q17, S18, M19, H20, I21, D22, A23, T24, L25, Y26, T27, E28, S29, D30, V31, H32, P33, S34, C35, K36, V37, T38, A39, K41, L44, L45, E46, Q48, V49, S51, L52, E53, S54, G55, D56, A57, S58, H60, D61, T62, V63, E64, N65, I67, I68, L69, N71, N72, S73, L74, S75, S76, N77, G78, N79, V80, T81, E82, S83, G84, C85, K86, E87, C88, E89, E90, L91, E92, E93, K94, N95, I96, K97, E98, L100, Q101, S102, V104, H105, Q108, M109, F110, I111, N112, T113, или S114, где положения остатка соответствуют положениям, представленным в SEQ ID NO: 1. В некоторых случаях аминокислотное положение по меньшей мере одной неприродной аминокислоты находится в N1, W2, V3, N4, I6, S7, D8, K10, K11, E13, D14, L15, Q17, S18, M19, H20, I21, D22, A23, T24, L25, Y26, E28, S29, D30, V31, H32, P33, S34, C35, K36, V37, T38, K41, L44, E46, Q48, V49, S51, L52, E53, S54, G55, D56, A57, S58, H60, D61, T62, V63, E64, N65, I67, I68, L69, N71, N72, S73, L74, S75, S76, N77, G78, N79, V80, T81, E82, S83, G84, C85, K86, E87, C88, E89, E90, L91, E92, E93, K94, N95, I96, K97, E98, L100, Q101, S102, V104, H105, Q108, M109, F110, I111, N112, T113, или S114. В некоторых случаях конъюгирующий фрагмент связан с по меньшей мере одной неприродной аминокислотой. В некоторых случаях конъюгирующий фрагмент связан с N-концевым или C-концевым аминокислотным остатком. В некоторых случаях конъюгирующий фрагмент непосредственно связан с по меньшей мере одной неприродной аминокислотой или концевым остатком. В других случаях конъюгирующий фрагмент опосредованно связан с по меньшей мере одной неприродной аминокислотой или концевым остатком посредством линкера, описанного ниже.
[53] В некоторых вариантах осуществления снижение аффинности полипептида IL-15 или конъюгата IL-15 к субъединице α-рецептора IL-15 (IL-15Rα) по сравнению с полипептидом IL-15 дикого типа составляет приблизительно 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, или 99%. В некоторых вариантах осуществления снижение аффинности составляет приблизительно 10%. В некоторых вариантах осуществления снижение аффинности составляет приблизительно 20%. В некоторых вариантах осуществления снижение аффинности составляет приблизительно 40%. В некоторых вариантах осуществления снижение аффинности составляет приблизительно 50%. В некоторых вариантах осуществления снижение аффинности составляет приблизительно 60%. В некоторых вариантах осуществления снижение аффинности составляет приблизительно 80%. В некоторых вариантах осуществления снижение аффинности составляет приблизительно 90%. В некоторых вариантах осуществления снижение аффинности составляет приблизительно 95%. В некоторых вариантах осуществления снижение аффинности составляет 100%.
[54] В некоторых вариантах осуществления снижение аффинности полипептида IL-15 или конъюгата IL-15 к субъединице α-рецептора IL-15 (IL-15Rα) по сравнению с полипептидом IL-15 дикого типа является приблизительно 1-кратным, 2-кратным, 3-кратным, 4-кратным, 5-кратным, 6-кратным, 7-кратным, 8-кратным, 9-кратным, 10-кратным или больше. В некоторых вариантах осуществления снижение аффинности является приблизительно 1-кратным. В некоторых вариантах осуществления снижение аффинности является приблизительно 2-кратным. В некоторых вариантах осуществления снижение аффинности является приблизительно 4-кратным. В некоторых вариантах осуществления снижение аффинности является приблизительно 5-кратным. В некоторых вариантах осуществления снижение аффинности является приблизительно 6-кратным. В некоторых вариантах осуществления снижение аффинности является приблизительно 8-кратным. В некоторых вариантах осуществления снижение аффинности является приблизительно 10-кратным.
[55] В некоторых вариантах осуществления полипептид IL-15 или конъюгат IL-15 не взаимодействует с IL-15Rα.
[56] В некоторых вариантах осуществления снижение аффинности полипептида IL-15 или конъюгата IL-15 к субъединице рецептора IL-2 (IL-2R) по сравнению с полипептидом IL-15 дикого типа составляет приблизительно 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, или 99%. В некоторых вариантах осуществления субъединица IL-2R представляет собой IL-2Rβγ. В некоторых вариантах осуществления снижение аффинности составляет приблизительно 10%. В некоторых вариантах осуществления снижение аффинности составляет приблизительно 20%. В некоторых вариантах осуществления снижение аффинности составляет приблизительно 40%. В некоторых вариантах осуществления снижение аффинности составляет приблизительно 50%. В некоторых вариантах осуществления снижение аффинности составляет приблизительно 60%. В некоторых вариантах осуществления снижение аффинности составляет приблизительно 80%. В некоторых вариантах осуществления снижение аффинности составляет приблизительно 90%. В некоторых вариантах осуществления снижение аффинности составляет приблизительно 95%. В некоторых вариантах осуществления снижение аффинности составляет 100%.
[57] В некоторых вариантах осуществления снижение аффинности полипептида IL-15 или конъюгата IL-15 к субъединице рецептора IL-2 (IL-2R) по сравнению с полипептидом IL-15 дикого типа является приблизительно 1-кратным, 2-кратным, 3-кратным, 4-кратным, 5-кратным, 6-кратным, 7-кратным, 8-кратным, 9-кратным, 10-кратным или больше. В некоторых вариантах осуществления субъединица IL-2R представляет собой IL-2Rβγ. В некоторых вариантах осуществления снижение аффинности является приблизительно 1-кратным. В некоторых вариантах осуществления снижение аффинности является приблизительно 2-кратным. В некоторых вариантах осуществления снижение аффинности является приблизительно 4-кратным. В некоторых вариантах осуществления снижение аффинности является приблизительно 5-кратным. В некоторых вариантах осуществления снижение аффинности является приблизительно 6-кратным. В некоторых вариантах осуществления снижение аффинности является приблизительно 8-кратным. В некоторых вариантах осуществления снижение аффинности является приблизительно 10-кратным.
[58] В некоторых вариантах осуществления полипептид IL-15 или конъюгат IL-15 не взаимодействует с IL-2Rα.
[59] В некоторых вариантах осуществления полипептид IL-15 или конъюгат IL-15 характеризуется увеличенным временем полужизни. В некоторых случаях увеличенное время полужизни сравнивают с временем полужизни белка IL-15 дикого типа или конъюгата IL-15 дикого типа.
[60] В некоторых случаях увеличенное время полужизни полипептида IL-15 или конъюгата IL-15 составляет по меньшей мере 90 минут, 2 часа, 3 часа, 4 часа, 5 часов, 6 часов, 7 часов, 8 часов, 9 часов, 10 часов, 11 часов, 12 часов, 18 часов, 24 часа, 36 часов, 48 часов, 3 дня, 4 дня, 5 дней, 6 дней, 7 дней, 10 дней, 12 дней, 14 дней, 21 день, 28 дней, 30 дней или больше, чем время полужизни белка IL-15 дикого типа или конъюгата IL-15 дикого типа. В некоторых случаях увеличенное время полужизни полипептида IL-15 или конъюгата IL-15 составляет по меньшей мере 90 минут или больше, чем время полужизни белка IL-15 дикого типа или конъюгата IL-15 дикого типа. В некоторых случаях увеличенное время полужизни полипептида IL-15 или конъюгата IL-15 составляет по меньшей мере 2 часа или больше, чем время полужизни белка IL-15 дикого типа или конъюгата IL-15 дикого типа. В некоторых случаях увеличенное время полужизни полипептида IL-15 или конъюгата IL-15 составляет по меньшей мере 3 часа или больше, чем время полужизни белка IL-15 дикого типа или конъюгата IL-15 дикого типа. В некоторых случаях увеличенное время полужизни полипептида IL-15 или конъюгата IL-15 составляет по меньшей мере 4 часа или больше, чем время полужизни белка IL-15 дикого типа или конъюгата IL-15 дикого типа. В некоторых случаях увеличенное время полужизни полипептида IL-15 или конъюгата IL-15 составляет по меньшей мере 5 часов или больше, чем время полужизни белка IL-15 дикого типа или конъюгата IL-15 дикого типа. В некоторых случаях увеличенное время полужизни полипептида IL-15 или конъюгата IL-15 составляет по меньшей мере 6 часов или больше, чем время полужизни белка IL-15 дикого типа или конъюгата IL-15 дикого типа. В некоторых случаях увеличенное время полужизни полипептида IL-15 или конъюгата IL-15 составляет по меньшей мере 10 часов или больше, чем время полужизни белка IL-15 дикого типа или конъюгата IL-15 дикого типа. В некоторых случаях увеличенное время полужизни полипептида IL-15 или конъюгата IL-15 составляет по меньшей мере 12 часов или больше, чем время полужизни белка IL-15 дикого типа или конъюгата IL-15 дикого типа. В некоторых случаях увеличенное время полужизни полипептида IL-15 или конъюгата IL-15 составляет по меньшей мере 18 часов или больше, чем время полужизни белка IL-15 дикого типа или конъюгата IL-15 дикого типа. В некоторых случаях увеличенное время полужизни полипептида IL-15 или конъюгата IL-15 составляет по меньшей мере 24 часа или больше, чем время полужизни белка IL-15 дикого типа или конъюгата IL-15 дикого типа. В некоторых случаях увеличенное время полужизни полипептида IL-15 или конъюгата IL-15 составляет по меньшей мере 36 часов или больше, чем время полужизни белка IL-15 дикого типа или конъюгата IL-15 дикого типа. В некоторых случаях увеличенное время полужизни полипептида IL-15 или конъюгата IL-15 составляет по меньшей мере 48 часов или больше, чем время полужизни белка IL-15 дикого типа или конъюгата IL-15 дикого типа. В некоторых случаях увеличенное время полужизни полипептида IL-15 или конъюгата IL-15 составляет по меньшей мере 3 дня или больше, чем время полужизни белка IL-15 дикого типа или конъюгата IL-15 дикого типа. В некоторых случаях увеличенное время полужизни полипептида IL-15 или конъюгата IL-15 составляет по меньшей мере 4 дня или больше, чем время полужизни белка IL-15 дикого типа или конъюгата IL-15 дикого типа. В некоторых случаях увеличенное время полужизни полипептида IL-15 или конъюгата IL-15 составляет по меньшей мере 5 дней или больше, чем время полужизни белка IL-15 дикого типа или конъюгата IL-15 дикого типа. В некоторых случаях увеличенное время полужизни полипептида IL-15 или конъюгата IL-15 составляет по меньшей мере 6 дней или больше, чем время полужизни белка IL-15 дикого типа или конъюгата IL-15 дикого типа. В некоторых случаях увеличенное время полужизни полипептида IL-15 или конъюгата IL-15 составляет по меньшей мере 7 дней или больше, чем время полужизни белка IL-15 дикого типа или конъюгата IL-15 дикого типа. В некоторых случаях увеличенное время полужизни полипептида IL-15 или конъюгата IL-15 составляет по меньшей мере 10 дней или больше, чем время полужизни белка IL-15 дикого типа или конъюгата IL-15 дикого типа. В некоторых случаях увеличенное время полужизни полипептида IL-15 или конъюгата IL-15 составляет по меньшей мере 12 дней или больше, чем время полужизни белка IL-15 дикого типа или конъюгата IL-15 дикого типа. В некоторых случаях увеличенное время полужизни полипептида IL-15 или конъюгата IL-15 составляет по меньшей мере 14 дней или больше, чем время полужизни белка IL-15 дикого типа или конъюгата IL-15 дикого типа. В некоторых случаях увеличенное время полужизни полипептида IL-15 или конъюгата IL-15 составляет по меньшей мере 21 день или больше, чем время полужизни белка IL-15 дикого типа или конъюгата IL-15 дикого типа. В некоторых случаях увеличенное время полужизни полипептида IL-15 или конъюгата IL-15 составляет по меньшей мере 28 дней или больше, чем время полужизни белка IL-15 дикого типа или конъюгата IL-15 дикого типа. В некоторых случаях увеличенное время полужизни полипептида IL-15 или конъюгата IL-15 составляет по меньшей мере 30 дней или больше, чем время полужизни белка IL-15 дикого типа или конъюгата IL-15 дикого типа.
[61] В некоторых случаях увеличенное время полужизни полипептида IL-15 или конъюгата IL-15 составляет приблизительно 4 часа, 5 часов, 6 часов, 7 часов, 8 часов, 9 часов, 10 часов, 11 часов, 12 часов, 18 часов, 24 часа, 36 часов, 48 часов, 3 дня, 4 дня, 5 дней, 6 дней, 7 дней, 10 дней, 12 дней, 14 дней, 21 день, 28 дней или 30 дней по сравнению с временем полужизни белка IL-15 дикого типа или конъюгата IL-15 дикого типа. В некоторых случаях биологически активный полипептид IL-15 или конъюгат IL-15 характеризуется увеличенным временем полужизни, составляющим приблизительно 90 минут. В некоторых случаях биологически активный полипептид IL-15 или конъюгат IL-15 характеризуется увеличенным временем полужизни, составляющим приблизительно 2 часа. В некоторых случаях биологически активный полипептид IL-15 или конъюгат IL-15 характеризуется увеличенным временем полужизни, составляющим приблизительно 3 часа. В некоторых случаях биологически активный полипептид IL-15 или конъюгат IL-15 характеризуется увеличенным временем полужизни, составляющим приблизительно 4 часа. В некоторых случаях биологически активный полипептид IL-15 или конъюгат IL-15 характеризуется увеличенным временем полужизни, составляющим приблизительно 5 часов. В некоторых случаях биологически активный полипептид IL-15 или конъюгат IL-15 характеризуется увеличенным временем полужизни, составляющим приблизительно 6 часов. В некоторых случаях биологически активный полипептид IL-15 или конъюгат IL-15 характеризуется увеличенным временем полужизни, составляющим приблизительно 7 часов. В некоторых случаях биологически активный полипептид IL-15 или конъюгат IL-15 характеризуется увеличенным временем полужизни, составляющим приблизительно 8 часов. В некоторых случаях биологически активный полипептид IL-15 или конъюгат IL-15 характеризуется увеличенным временем полужизни, составляющим приблизительно 9 часов. В некоторых случаях биологически активный полипептид IL-15 или конъюгат IL-15 характеризуется увеличенным временем полужизни, составляющим приблизительно 10 часов. В некоторых случаях биологически активный полипептид IL-15 или конъюгат IL-15 характеризуется увеличенным временем полужизни, составляющим приблизительно 11 часов. В некоторых случаях биологически активный полипептид IL-15 или конъюгат IL-15 характеризуется увеличенным временем полужизни, составляющим приблизительно 12 часов. В некоторых случаях биологически активный полипептид IL-15 или конъюгат IL-15 характеризуется увеличенным временем полужизни, составляющим приблизительно 18 часов. В некоторых случаях биологически активный полипептид IL-15 или конъюгат IL-15 характеризуется увеличенным временем полужизни, составляющим приблизительно 24 часа. В некоторых случаях биологически активный полипептид IL-15 или конъюгат IL-15 характеризуется увеличенным временем полужизни, составляющим приблизительно 36 часов. В некоторых случаях биологически активный полипептид IL-15 или конъюгат IL-15 характеризуется увеличенным временем полужизни, составляющим приблизительно 48 часов. В некоторых случаях биологически активный полипептид IL-15 или конъюгат IL-15 характеризуется увеличенным временем полужизни, составляющим приблизительно 3 дня. В некоторых случаях биологически активный полипептид IL-15 или конъюгат IL-15 характеризуется увеличенным временем полужизни, составляющим приблизительно 4 дня. В некоторых случаях биологически активный полипептид IL-15 или конъюгат IL-15 характеризуется увеличенным временем полужизни, составляющим приблизительно 5 дней. В некоторых случаях биологически активный полипептид IL-15 или конъюгат IL-15 характеризуется увеличенным временем полужизни, составляющим приблизительно 6 дней. В некоторых случаях биологически активный полипептид IL-15 или конъюгат IL-15 характеризуется увеличенным временем полужизни, составляющим приблизительно 7 дней. В некоторых случаях биологически активный полипептид IL-15 или конъюгат IL-15 характеризуется увеличенным временем полужизни, составляющим приблизительно 10 дней. В некоторых случаях биологически активный полипептид IL-15 или конъюгат IL-15 характеризуется увеличенным временем полужизни, составляющим приблизительно 12 дней. В некоторых случаях биологически активный полипептид IL-15 или конъюгат IL-15 характеризуется увеличенным временем полужизни, составляющим приблизительно 14 дней. В некоторых случаях биологически активный полипептид IL-15 или конъюгат IL-15 характеризуется увеличенным временем полужизни, составляющим приблизительно 21 день. В некоторых случаях биологически активный полипептид IL-15 или конъюгат IL-15 характеризуется увеличенным временем полужизни, составляющим приблизительно 28 дней. В некоторых случаях биологически активный полипептид IL-15 или конъюгат IL-15 характеризуется увеличенным временем полужизни, составляющим приблизительно 30 дней.
[62] В некоторых вариантах осуществления модифицированный полипептид IL-15 сохраняет значительную эффективность передачи сигнала совместно с сигнальным комплексом βγ-рецептора интерлейкина 15 (IL-15Rβγ). В некоторых случаях эффективность передачи сигнала представлена в сравнении с эффективностью передачи сигнала между полипептидом IL-15 дикого типа и IL-15Rβγ. В некоторых случаях разница в эффективности рецепторной передачи сигнала между комплексом модифицированного IL-15/IL-15Rβγ и комплексом IL-15 дикого типа/IL-15Rβγ является менее чем 1000-кратной, менее чем 500-кратной, менее чем 200-кратной, менее чем 100-кратной, менее чем 50-кратной, менее чем 10-кратной, менее чем 5-кратной, менее чем 4-кратной, менее чем 3-кратной, менее чем 2-кратной или менее чем 1-кратной. В некоторых случаях разница в эффективности рецепторной передачи сигнала между комплексом модифицированного IL-15/IL-15Rβγ и комплексом IL-15 дикого типа/IL-15Rβγ является более чем 10-кратной, более чем 20-кратной, более чем 30-кратной, более чем 40-кратной, более чем 50-кратной, более чем 100-кратной, более чем 200-кратной, более чем 300-кратной, более чем 400-кратной или более чем 500-кратной. В некоторых случаях модифицированный полипептид IL-15 является частичным агонистом, например агонистом, который активирует рецептор (например, сигнальный комплекс IL-15βγ), но характеризуется лишь частичной эффективностью в отношении рецептора по сравнению с полным агонистом. В некоторых случаях модифицированный полипептид IL-15 является полным агонистом, например агонистом, который активирует рецептор (например, сигнальный комплекс IL-15βγ) с максимальным ответом.
[63] В некоторых случаях эффективность рецепторной передачи сигнала измеряют с помощью значения EC50. В некоторых случаях модифицированный полипептид IL-15 обеспечивает значение EC50, которое менее чем в 1000 раз, менее чем в 500 раз, менее чем в 200 раз, менее чем в 100 раз, менее чем в 50 раз, менее чем в 10 раз, менее чем в 5 раз, менее чем в 4 раза, менее чем в 3 раза, менее чем в 2 раза или менее чем в 1 раз отличается от значения EC50 комплекса IL-15 дикого типа/IL-15Rβγ. В некоторых случаях модифицированный полипептид IL-15 обеспечивает значение EC50, которое более чем в 10 раз, более чем в 20 раз, более чем в 30 раз, более чем в 40 раз, более чем в 50 раз, более чем в 100 раз, более чем в 200 раз, более чем в 300 раз, более чем в 400 раз или более чем в 500 раз отличается от значения EC50 комплекса IL-15 дикого типа/IL-15Rβγ.
[64] В некоторых случаях эффективность рецепторной передачи сигнала измеряют с помощью значения ED50. В некоторых случаях модифицированный полипептид IL-15 обеспечивает значение ED50, которое менее чем в 1000 раз, менее чем в 500 раз, менее чем в 200 раз, менее чем в 100 раз, менее чем в 50 раз, менее чем в 10 раз, менее чем в 5 раз, менее чем в 4 раза, менее чем в 3 раза, менее чем в 2 раза или менее чем в 1 раз отличается от значения EC50 комплекса IL-15 дикого типа/IL-15Rβγ. В некоторых случаях модифицированный полипептид IL-15 обеспечивает значение ED50, которое более чем в 10 раз, более чем в 20 раз, более чем в 30 раз, более чем в 40 раз, более чем в 50 раз, более чем в 100 раз, более чем в 200 раз, более чем в 300 раз, более чем в 400 раз или более чем в 500 раз отличается от значения EC50 комплекса IL-15 дикого типа/IL-15Rβγ.
[65] В некоторых вариантах осуществления полипептид IL-15 модифицирован (например, пегилирован) для увеличения времени полужизни, улучшения стабильности, увеличения выхода после очистки, повышения чистоты, снижения агрегации, улучшения фолдинга белка или их комбинации на стадии химических свойств, изготовления и контроля (CMC). В некоторых случаях полипептид IL-15 модифицирован в аминокислотном положении: N71, N72 или N77, где положения остатка соответствуют положениям, представленным в SEQ ID NO: 1. В некоторых случаях полипептид IL-15 модифицирован по остатку N77, например, посредством пегилирования, для увеличения времени полужизни, улучшения стабильности, увеличения выхода после очистки, повышения чистоты, снижения агрегации, улучшения фолдинга белка или их комбинации на стадии CMC. В некоторых случаях полипептид IL-15 дополнительно модифицирован в положении N1, W2, V3, N4, I6, S7, D8, K10, K11, E13, D14, L15, Q17, S18, M19, H20, I21, D22, A23, T24, L25, Y26, E28, S29, D30, V31, H32, P33, S34, C35, K36, V37, T38, K41, L44, E46, Q48, V49, S51, L52, E53, S54, G55, D56, A57, S58, H60, D61, T62, V63, E64, N65, I67, I68, L69, N71, N72, S73, L74, S75, S76, N77, G78, N79, V80, T81, E82, S83, G84, C85, K86, E87, C88, E89, E90, L91, E92, E93, K94, N95, I96, K97, E98, L100, Q101, S102, V104, H105, Q108, M109, F110, I111, N112, T113, или S114. В некоторых случаях полипептид IL-15 дополнительно модифицирован в положении D22, A23, T24, L25, Y26, L44, E46, Q48, V49, E53, E89, E90 или E93, где модификация нарушает взаимодействие с IL-15Rα. В некоторых случаях полипептид IL-15 дополнительно модифицирован в положении N1, N4, S7, D8, K11, D61, T62, E64, N65, I68, L69 или N72, где модификация нарушает взаимодействие с IL-15Rβ. В некоторых случаях полипептид IL-15 дополнительно модифицирован в положении V3, I6, K10, E28, S29, D30, V31, H32, P33, S102, V104, H105, Q108, M109, I111, N112, T113, или S114, где модификация нарушает взаимодействие с IL-15Rγ. В некоторых случаях полипептид IL-15 дополнительно модифицирован в положении E13, D14, L15, Q17, S18, M19, H20, I21, S34, C35, K36, V37, T38, K41, L44, S51, L52, S54, G55, D56, A57, S58, H60, V63, I67, N71, S73, L74, S75, S76, N77, G78, N79, V80, T81, E82, S83, G84, C85, K86, E87, C88, L91, E92, K94, N95, I96, K97, E98, L100, Q101, или F110, где модификация увеличивает продолжительность времени полужизни. В некоторых случаях полипептид IL-15 дополнительно модифицирован в одном или нескольких из указанных выше положений для нарушения взаимодействия с IL-15Rα, нарушения взаимодействия с IL-15Rβ, нарушения взаимодействия с IL-15Rγ, увеличения продолжительности времени полужизни или их комбинации.
Предшественники конъюгата IL-15
[66] В данном документе раскрыты предшественники конъюгата IL-15, содержащие модифицированный полипептид IL-15, в котором одна или несколько аминокислот были мутированы из аминокислоты дикого типа. Такие предшественники часто применяются в раскрытых в данном документе способах для лечения заболеваний или состояний. В некоторых вариантах осуществления предшественник IL-15 не конъюгирован. Такие мутации различным образом включают добавления, делеции или замены. В некоторых случаях добавление предусматривает включение 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более остатков в N-конец, C-конец или во внутренний участок полипептида IL-15. В дополнительных случаях делеция предусматривает удаление 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более остатков с N-конца, C-конца или в пределах внутреннего участка полипептида IL-15.
Природные и неприродные аминокислоты
[67] В некоторых вариантах осуществления аминокислотный остаток, раскрытый в данном документе (например, в полипептиде IL-15), мутирован в лизин, цистеин, гистидин, аргинин, аспарагиновую кислоту, глутаминовую кислоту, серин, треонин или тирозин до связывания (или осуществлением реакции) с конъюгирующим фрагментом. Например, боковая цепь лизина, цистеина, гистидина, аргинина, аспарагиновой кислоты, глутаминовой кислоты, серина, треонина или тирозина может связываться с конъюгирующим фрагментом, раскрытым в данном документе. В некоторых случаях аминокислотный остаток мутирован в цистеин, лизин или гистидин. В некоторых случаях аминокислотный остаток мутирован в цистеин. В некоторых случаях аминокислотный остаток мутирован в лизин. В некоторых случаях аминокислотный остаток мутирован в гистидин. В некоторых случаях аминокислотный остаток мутирован в тирозин. В некоторых случаях аминокислотный остаток мутирован в триптофан. В некоторых случаях аминокислотный остаток расположен проксимальнее N- или C-конца, на N- или C-конце или в положении внутреннего остатка. В некоторых случаях аминокислотный остаток представляет собой N- или C-концевой остаток, и мутация представляет собой замену на цистеин или лизин. В некоторых случаях аминокислотный остаток расположен проксимальнее N- или C-концевого остатка (например, в пределах 50, 40, 30, 20 или 10 остатков от N- или C-концевого остатка), и мутация представляет собой замену на цистеин или лизин.
[68] В некоторых случаях аминокислотный остаток добавляется к N- или C-концевому остатку, то есть полипептид IL-15 содержит дополнительный аминокислотный остаток на N- или C-конце, и дополнительный аминокислотный остаток представляет собой цистеин или лизин. В некоторых случаях дополнительный аминокислотный остаток представляет собой цистеин. В некоторых случаях дополнительная аминокислота конъюгирована с конъюгирующим фрагментом.
[69] В некоторых вариантах осуществления описанный в данном документе аминокислотный остаток (например, в пределах полипептида IL-15) мутирован в неприродную аминокислоту. В некоторых вариантах осуществления неприродная аминокислота не конъюгирована с конъюгирующим фрагментом. В некоторых вариантах осуществления полипептид IL-15, раскрытый в данном документе, содержит неприродную аминокислоту, где IL-15 конъюгирован с белком, при этом точка присоединения не представляет собой неприродную аминокислоту.
[70] В некоторых вариантах осуществления аминокислотный остаток, раскрытый в данном документе (например, в пределах полипептида IL-15), мутирован в неприродную аминокислоту до связывания с конъюгирующим фрагментом. В некоторых случаях мутация в неприродную аминокислоту предотвращает или минимизирует ответ иммунной системы на аутоантиген. Применяемый в данном документе термин "неприродная аминокислота" относится к аминокислоте, отличной от 20 аминокислот, которые встречаются в белке естественным образом. Неограничивающие примеры неприродных аминокислот включают п-ацетил-L-фенилаланин, п-йод-L-фенилаланин, п-метоксифенилаланин, O-метил-L-тирозин, п-пропаргилоксифенилаланин, п-пропаргилфенилаланин, L-3-(2-нафтил)аланин, 3-метилфенилаланин, O-4-аллил-L-тирозин, 4-пропил-L-тирозин, три-O-ацетил-GlcNAcp-серин, L-допу, фторированный фенилаланин, изопропил-L-фенилаланин, п-азидо-L-фенилаланин, п-ацил-L-фенилаланин, п-бензоил-L-фенилаланин, п-боронфенилаланин, O-пропаргилтирозин, L-фосфосерин, фосфоносерин, фосфонотирозин, п-бромфенилаланин, селеноцистеин, п-амино-L-фенилаланин, изопропил-L-фенилаланин, N6-[(2-азидоэтокси)карбонил]-L-лизин (AzK), неприродный аналог аминокислоты тирозина; неприродный аналог аминокислоты глутамина; неприродный аналог аминокислоты фенилаланина; неприродный аналог аминокислоты серина; неприродный аналог аминокислоты треонина; аминокислоту, замещенную алкилом, арилом, ацилом, азидо-, циано-, галогеном, гидразином, гидразидом, гидроксилом, алкенилом, алкинилом, эфиром, тиолом, сульфонилом, селено-, сложным эфиром, тиокислотой, боратом, боронатом, фосфо-, фосфоно-, фосфином, гетероциклом, еноном, имином, альдегидом, гидроксиламином, кето- или амино-, или их комбинацию; аминокислоту с фотоактивируемым кросс-линкером; спин-меченую аминокислоту; флуоресцентную аминокислоту; связывающуюся с металлом аминокислоту; металлсодержащую аминокислоту; радиоактивную аминокислоту; фотоэкранированную и/или фотоизомеризуемую аминокислоту; аминокислоту, содержащую биотин или аналог биотина; кетосодержащую аминокислоту; аминокислоту, содержащую полиэтиленгликоль или полиэфир; аминокислоту, замещенную тяжелым атомом; химически расщепляемую или фоторасщепляемую аминокислоту; аминокислоту с удлиненной боковой цепью; аминокислоту, содержащую токсичную группу; замещенную сахаром аминокислоту; аминокислоту, содержащую углерод-связанный сахар; редокс-активную аминокислоту; а-гидроксисодержащую кислоту; аминотиокислоту; α,α-дизамещенную аминокислоту; β-аминокислоту; циклическую аминокислоту, отличную от пролина или гистидина, и ароматическую аминокислоту, отличную от фенилаланина, тирозина или триптофана.
[71] В некоторых вариантах осуществления неприродная аминокислота содержит селективную реакционноспособную группу или реакционноспособную группу для сайт-селективного мечения целевого полипептида. В некоторых случаях химия представляет собой биортогональную реакцию (например, биосовместимые и селективные реакции). В некоторых случаях химия представляет собой Cu(I)-катализируемую или "не требующую участия меди" алкин-азидную реакцию образования триазолов, лигирование по Штаудингеру, реакцию Дильса-Альдера с обращенными электронными требованиями (IEDDA), "фото-клик"-химию или опосредованный металлом процесс, такой как метатезис олефинов и кросс-сочетание Сузуки-Мияуры или Соногаширы.
[72] В некоторых вариантах осуществления неприродная аминокислота содержит фотореактивную группу, которая сшивается при облучении, например, УФ.
[73] В некоторых вариантах осуществления неприродная аминокислота включает фотоэкранированную аминокислоту.
[74] В некоторых случаях неприродная аминокислота представляет собой пара-замещенное, мета-замещенное или орто-замещенное производное аминокислоты.
[75] В некоторых случаях неприродная аминокислота включает п-ацетил-L-фенилаланин, п-азидометил-L-фенилаланин (pAMF), п-йод-L-фенилаланин, O-метил-L-тирозин, п-метоксифенилаланин, п-пропаргилоксифенилаланин, п-пропаргилфенилаланин, L-3-(2-нафтил)аланин, 3-метилфенилаланин, O-4-аллил-L-тирозин, 4-пропил-L-тирозин, три-O-ацетил-GlcNAcp-серин, L-допу, фторированный фенилаланин, изопропил-L-фенилаланин, п-азидо-L-фенилаланин, п-ацил-L-фенилаланин, п-бензоил-L-фенилаланин, L-фосфосерин, фосфоносерин, фосфонотирозин, п-бромфенилаланин, п-амино-L-фенилаланин или изопропил-L-фенилаланин.
[76] В некоторых случаях неприродная аминокислота представляет собой 3-аминотирозин, 3-нитротирозин, 3,4-дигидроксифенилаланин или 3-йодтирозин.
[77] В некоторых случаях неприродная аминокислота представляет собой фенилселеноцистеин.
[78] В некоторых случаях неприродная аминокислота представляет собой бензофенон-, кетон-, йодид-, метокси-, ацетил-, бензоил- или азид-содержащее производное фенилаланина.
[79] В некоторых случаях неприродная аминокислота представляет собой бензофенон-, кетон-, йодид-, метокси-, ацетил-, бензоил- или азид-содержащее производное лизина.
[80] В некоторых случаях неприродная аминокислота содержит ароматическую боковую цепь.
[81] В некоторых случаях неприродная аминокислота не содержит ароматическую боковую цепь.
[82] В некоторых случаях неприродная аминокислота содержит азидогруппу.
[83] В некоторых случаях неприродная аминокислота содержит группу акцепторов Михаэля. В некоторых случаях группы акцепторов Михаэля включают ненасыщенный фрагмент, способный к образованию ковалентной связи в реакции 1,2-присоединения. В некоторых случаях группы акцепторов Михаэля включают электронодефицитные алкены или алкины. В некоторых случаях группы акцепторов Михаэля включают без ограничения альфа-, бета-ненасыщенные кетоны, альдегиды, сульфоксиды, сульфоны, нитрилы, имины или ароматические соединения.
[84] В некоторых случаях неприродная аминокислота представляет собой дегидроаланин.
[85] В некоторых случаях неприродная аминокислота содержит альдегидную или кетонную группу.
[86] В некоторых случаях неприродная аминокислота представляет собой производное лизина, содержащее альдегидную или кетонную группу.
[87] В некоторых случаях неприродная аминокислота представляет собой производное лизина, содержащее один или несколько атомов O, N, Se или S в бета-, гамма- или дельта-положении. В некоторых случаях неприродная аминокислота представляет собой производное лизина, содержащее атомы O, N, Se или S в гамма-положении.
[88] В некоторых случаях неприродная аминокислота представляет собой производное лизина, в котором эпсилон-атом N заменен на атом кислорода.
[89] В некоторых случаях неприродная аминокислота представляет собой производное лизина, которое не является встречающимся в природе посттрансляционно модифицированным лизином.
[90] В некоторых случаях неприродная аминокислота представляет собой аминокислоту, содержащую боковую цепь, в которой шестой атом от альфа-положения содержит карбонильную группу. В некоторых случаях неприродная аминокислота представляет собой аминокислоту, содержащую боковую цепь, в которой шестой атом от альфа-положения содержит карбонильную группу, а пятый атом от альфа-положения представляет собой азот. В некоторых случаях неприродная аминокислота представляет собой аминокислоту, содержащую боковую цепь, в которой седьмой атом от альфа-положения представляет собой атом кислорода.
[91] В некоторых случаях неприродная аминокислота представляет собой производное серина, содержащее селен. В некоторых случаях неприродная аминокислота представляет собой селеносерин (2-амино-3-гидроселенопропановую кислоту). В некоторых случаях неприродная аминокислота представляет собой 2-амино-3-((2-((3-(бензилокси)-3-оксопропил)амино)этил)селанил)пропановую кислоту. В некоторых случаях неприродная аминокислота представляет собой 2-амино-3-(фенилселанил)пропановую кислоту. В некоторых случаях неприродная аминокислота содержит селен, где окисление селена приводит к образованию неприродной аминокислоты, содержащей алкен.
[92] В некоторых случаях неприродная аминокислота содержит циклооктинильную группу.
[93] В некоторых случаях неприродная аминокислота содержит трансциклооктенильную группу.
[94] В некоторых случаях неприродная аминокислота содержит норборненильную группу.
[95] В некоторых случаях неприродная аминокислота содержит циклопропенильную группу.
[96] В некоторых случаях неприродная аминокислота содержит диазириновую группу.
[97] В некоторых случаях неприродная аминокислота содержит тетразиновую группу.
[98] В некоторых случаях неприродная аминокислота представляет собой производное лизина, в котором азот боковой цепи карбамилирован. В некоторых случаях неприродная аминокислота представляет собой производное лизина, в котором азот боковой цепи ацилирован. В некоторых случаях неприродная аминокислота представляет собой 2-амино-6-{[(трет-бутокси)карбонил]амино}гексановую кислоту. В некоторых случаях неприродная аминокислота представляет собой 2-амино-6-{[(трет-бутокси)карбонил]амино}гексановую кислоту. В некоторых случаях неприродная аминокислота представляет собой N6-Boc-N6-метиллизин. В некоторых случаях неприродная аминокислота представляет собой N6-ацетиллизин. В некоторых случаях неприродная аминокислота представляет собой пирролизин. В некоторых случаях неприродная аминокислота представляет собой N6-трифторацетиллизин. В некоторых случаях неприродная аминокислота представляет собой 2-амино-6-{[(бензилокси)карбонил]амино}гексановую кислоту. В некоторых случаях неприродная аминокислота представляет собой 2-амино-6-{[(п-йодбензилокси)карбонил]амино}гексановую кислоту. В некоторых случаях неприродная аминокислота представляет собой 2-амино-6-{[(п-нитробензилокси)карбонил]амино}гексановую кислоту. В некоторых случаях неприродная аминокислота представляет собой N6-пролиллизин. В некоторых случаях неприродная аминокислота представляет собой 2-амино-6-{[(циклопентилокси)карбонил]амино}гексановую кислоту. В некоторых случаях неприродная аминокислота представляет собой N6-(циклопентанкарбонил)лизин. В некоторых случаях неприродная аминокислота представляет собой N6-(тетрагидрофуран-2-карбонил)лизин. В некоторых случаях неприродная аминокислота представляет собой N6-(3-этинилтетрагидрофуран-2-карбонил)лизин. В некоторых случаях неприродная аминокислота представляет собой N6-((проп-2-ин-1-илокси)карбонил)лизин. В некоторых случаях неприродная аминокислота представляет собой 2-амино-6-{[(2-азидоциклопентилокси)карбонил]амино}гексановую кислоту. В некоторых случаях неприродная аминокислота представляет собой N6-[(2-азидоэтокси)карбонил]лизин. В некоторых случаях неприродная аминокислота представляет собой 2-амино-6-{[(2-нитробензилокси)карбонил]амино}гексановую кислоту. В некоторых случаях неприродная аминокислота представляет собой 2-амино-6-{[(2-циклооктинилокси)карбонил]амино}гексановую кислоту. В некоторых случаях неприродная аминокислота представляет собой N6-(2-аминобут-3-иноил)лизин. В некоторых случаях неприродная аминокислота представляет собой 2-амино-6-((2-аминобут-3-иноил)окси)гексановую кислоту. В некоторых случаях неприродная аминокислота представляет собой N6-(аллилоксикарбонил)лизин. В некоторых случаях неприродная аминокислота представляет собой N6-(бутенил-4-оксикарбонил)лизин. В некоторых случаях неприродная аминокислота представляет собой N6-(пентенил-5-оксикарбонил)лизин. В некоторых случаях неприродная аминокислота представляет собой N6-((бут-3-ин-1-илокси)карбонил)лизин. В некоторых случаях неприродная аминокислота представляет собой N6-((пент-4-ин-1-илокси)карбонил)лизин. В некоторых случаях неприродная аминокислота представляет собой N6-(тиазолидин-4-карбонил)лизин. В некоторых случаях неприродная аминокислота представляет собой 2-амино-8-оксононановую кислоту. В некоторых случаях неприродная аминокислота представляет собой 2-амино-8-оксооктановую кислоту. В некоторых случаях неприродная аминокислота представляет собой N6-(2-оксоацетил)лизин.
[99] В некоторых случаях неприродная аминокислота представляет собой N6-пропиониллизин. В некоторых случаях неприродная аминокислота представляет собой N6-бутириллизин. В некоторых случаях неприродная аминокислота представляет собой N6-(бут-2-еноил)лизин. В некоторых случаях неприродная аминокислота представляет собой N6-((бицикло[2.2.1]гепт-5-ен-2-илокси)карбонил)лизин. В некоторых случаях неприродная аминокислота представляет собой N6-((спиро[2.3]гекс-1-ен-5-илметокси)карбонил)лизин. В некоторых случаях неприродная аминокислота представляет собой N6-(((4-(1-(трифторметил)циклопроп-2-ен-1-ил)бензил)окси)карбонил)лизин. В некоторых случаях неприродная аминокислота представляет собой N6-((бицикло[2.2.1]гепт-5-ен-2-илметокси)карбонил)лизин. В некоторых случаях неприродная аминокислота представляет собой цистеиниллизин. В некоторых случаях неприродная аминокислота представляет собой N6-((1-(6-нитробензо[d][1,3]диоксол-5-ил)этокси)карбонил)лизин. В некоторых случаях неприродная аминокислота представляет собой N6-((2-(3-метил-3H-диазирин-3-ил)этокси)карбонил)лизин. В некоторых случаях неприродная аминокислота представляет собой N6-((3-(3-метил-3H-диазирин-3-ил)пропокси)карбонил)лизин. В некоторых случаях неприродная аминокислота представляет собой N6-((мета-нитробензилокси)-N6-метилкарбонил)лизин. В некоторых случаях неприродная аминокислота представляет собой N6-((бицикло[6.1.0]нон-4-ин-9-илметокси)карбонил)лизин. В некоторых случаях неприродная аминокислота представляет собой N6-((циклогепт-3-ен-1-илокси)карбонил)-L-лизин.
[100] В некоторых случаях неприродная аминокислота представляет собой 2-амино-3-(((((бензилокси)карбонил)амино)метил)селанил)пропановую кислоту.
[101] В некоторых вариантах осуществления неприродную аминокислоту встраивают в полипептид IL-15 с помощью перепрофилированного стоп-кодона амбер, стоп-кодона опал или стоп-кодона охра.
[102] В некоторых вариантах осуществления неприродную аминокислоту встраивают в полипептид IL-15 с помощью 4-нуклеотидного кодона.
[103] В некоторых вариантах осуществления неприродную аминокислоту встраивают в полипептид IL-15 с помощью перепрофилированного редкого смыслового кодона или перепрофилированного обычного смыслового кодона.
[104] В некоторых вариантах осуществления неприродную аминокислоту встраивают в полипептид IL-15 с помощью синтетического кодона, содержащего неприродную нуклеиновую кислоту.
[105] В некоторых случаях неприродную аминокислоту встраивают в IL-15 с помощью ортогональной модифицированной пары синтетаза/тРНК. Такие ортогональные пары содержат неприродную синтетазу, которая способна загружать неприродную тРНК неприродной аминокислотой, при этом минимизируя загрузку а) других эндогенных аминокислот на неприродную тРНК и b) неприродных аминокислот на другие эндогенные тРНК. Такие ортогональные пары содержат тРНК, которые способны загружаться неприродной синтетазой, избегая при этом загрузки другими эндогенными аминокислотами с помощью эндогенных синтетаз. В некоторых вариантах осуществления такие пары идентифицированы у различных организмов, таких как бактерии, дрожжи, археи или люди. В некоторых вариантах осуществления ортогональная пара синтетаза/тРНК содержит компоненты из одного организма. В некоторых вариантах осуществления ортогональная пара синтетаза/тРНК содержит компоненты из двух различных организмов. В некоторых вариантах осуществления ортогональная пара синтетаза/тРНК содержит компоненты, которые до модификации способствуют трансляции двух различных аминокислот. В некоторых вариантах осуществления ортогональная синтетаза представляет собой модифицированную аланинсинтетазу. В некоторых вариантах осуществления ортогональная синтетаза представляет собой модифицированную аргининсинтетазу. В некоторых вариантах осуществления ортогональная синтетаза представляет собой модифицированную аспарагинсинтетазу. В некоторых вариантах осуществления ортогональная синтетаза представляет собой модифицированную синтетазу аспарагиновой кислоты. В некоторых вариантах осуществления ортогональная синтетаза представляет собой модифицированную цистеинсинтетазу. В некоторых вариантах осуществления ортогональная синтетаза представляет собой модифицированную глутаминсинтетазу. В некоторых вариантах осуществления ортогональная синтетаза представляет собой модифицированную синтетазу глутаминовой кислоты. В некоторых вариантах осуществления ортогональная синтетаза представляет собой модифицированный аланин глицин. В некоторых вариантах осуществления ортогональная синтетаза представляет собой модифицированную гистидинсинтетазу. В некоторых вариантах осуществления ортогональная синтетаза представляет собой модифицированную лейцинсинтетазу. В некоторых вариантах осуществления ортогональная синтетаза представляет собой модифицированную изолейцинсинтетазу. В некоторых вариантах осуществления ортогональная синтетаза представляет собой модифицированную лизинсинтетазу. В некоторых вариантах осуществления ортогональная синтетаза представляет собой модифицированную метионинсинтетазу. В некоторых вариантах осуществления ортогональная синтетаза представляет собой модифицированную фенилаланинсинтетазу. В некоторых вариантах осуществления ортогональная синтетаза представляет собой модифицированную пролинсинтетазу. В некоторых вариантах осуществления ортогональная синтетаза представляет собой модифицированную серинсинтетазу. В некоторых вариантах осуществления ортогональная синтетаза представляет собой модифицированную треонинсинтетазу. В некоторых вариантах осуществления ортогональная синтетаза представляет собой модифицированную триптофансинтетазу. В некоторых вариантах осуществления ортогональная синтетаза представляет собой модифицированную тирозинсинтетазу. В некоторых вариантах осуществления ортогональная синтетаза представляет собой модифицированную валинсинтетазу. В некоторых вариантах осуществления ортогональная синтетаза представляет собой модифицированную фосфосеринсинтетазу. В некоторых вариантах осуществления ортогональная тРНК представляет собой модифицированную тРНК аланина. В некоторых вариантах осуществления ортогональная тРНК представляет собой модифицированную тРНК аргинина. В некоторых вариантах осуществления ортогональная тРНК представляет собой модифицированную тРНК аспарагина. В некоторых вариантах осуществления ортогональная тРНК представляет собой модифицированную тРНК аспарагиновой кислоты. В некоторых вариантах осуществления ортогональная тРНК представляет собой модифицированную тРНК цистеина. В некоторых вариантах осуществления ортогональная тРНК представляет собой модифицированную тРНК глутамина. В некоторых вариантах осуществления ортогональная тРНК представляет собой модифицированную тРНК глутаминовой кислоты. В некоторых вариантах осуществления ортогональная тРНК представляет собой модифицированный аланин глицин. В некоторых вариантах осуществления ортогональная тРНК представляет собой модифицированную тРНК гистидина. В некоторых вариантах осуществления ортогональная тРНК представляет собой модифицированную тРНК лейцина. В некоторых вариантах осуществления ортогональная тРНК представляет собой модифицированную тРНК изолейцина. В некоторых вариантах осуществления ортогональная тРНК представляет собой модифицированную тРНК лизина. В некоторых вариантах осуществления ортогональная тРНК представляет собой модифицированную тРНК метионина. В некоторых вариантах осуществления ортогональная тРНК представляет собой модифицированную тРНК фенилаланина. В некоторых вариантах осуществления ортогональная тРНК представляет собой модифицированную тРНК пролина. В некоторых вариантах осуществления ортогональная тРНК представляет собой модифицированную тРНК серина. В некоторых вариантах осуществления ортогональная тРНК представляет собой модифицированную тРНК треонина. В некоторых вариантах осуществления ортогональная тРНК представляет собой модифицированную тРНК триптофана. В некоторых вариантах осуществления ортогональная тРНК представляет собой модифицированную тРНК тирозина. В некоторых вариантах осуществления ортогональная тРНК представляет собой модифицированную тРНК валина. В некоторых вариантах осуществления ортогональная тРНК представляет собой модифицированную тРНК фосфосерина.
[106] В некоторых вариантах осуществления неприродную аминокислоту встраивают в полипептид IL-15 с помощью пары аминоацил(aaRS или RS)-тРНК-синтетаза-тРНК. Иллюстративные пары aaRS-тРНК включают без ограничения пары aaRS/тРНК Methanococcus jannaschii (Mj-Tyr), пары TyrRS E. coli (Ec-Tyr)/тРНКCUA B. stearothermophilus, пары LeuRS (Ec-Leu) E. coli/тРНКCUA B. stearothermophilus и пары пирролизил-тРНК. В некоторых случаях неприродную аминокислоту встраивают в цитокин (например, в полипептид IL) с помощью пары RS/тРНК Mj-Tyr. Иллюстративные UAA, которые можно встраивать с помощью пары RS/тРНК Mj-Tyr, включают без ограничения пара-замещенные производные фенилаланина, такие как п-аминофенилаланин и п-метоксифенилаланин; мета-замещенные производные тирозина, такие как 3-аминотирозин, 3-нитротирозин, 3,4-дигидроксифенилаланин и 3-йодтирозин; фенилселеноцистеин; п-боронфенилаланин и о-нитробензилтирозин.
[107] В некоторых случаях неприродную аминокислоту встраивают в полипептид IL-15 с помощью пары Ec-Tyr/тРНКCUA или Ec-Leu/тРНКCUA. Иллюстративные UAA, которые можно встраивать с помощью пары Ec-Tyr/тРНКCUA или Ec-Leu/тРНКCUA, включают без ограничения производные фенилаланина, содержащие заместители, представляющие собой бензофенон, кетон, йодид или азид; О-пропаргилтирозин; α-аминокаприловую кислоту, O-метилтирозин, O-нитробензилцистеин и 3-(нафталин-2-иламино)-2-аминопропановую кислоту.
[108] В некоторых случаях неприродную аминокислоту встраивают в полипептид IL-15 с помощью пары пирролизил-тРНК. В некоторых случаях PylRS получают из архебактерии, например, из метаногенной архебактерии. В некоторых случаях PylRS получают из Methanosarcina barkeri, Methanosarcina mazei или Methanosarcina acetivorans. Иллюстративные UAA, которые можно встраивать с помощью пары пирролизил-тРНК, включают без ограничения амид- и карбамат-замещенные лизины, такие как 2-амино-6-((R)-тетрагидрофуран-2-карбоксамидо)гексановая кислота, N-ε-D-пролил-L-лизин и N-ε-циклопентилоксикарбонил-L-лизин; N-ε-акрилоил-L-лизин; N-ε-[(1-(6-нитробензо[d][1,3]диоксол-5-ил)этокси)карбонил]-L-лизин и N-ε-(1-метилциклопро-2-ен-карбоксамидо)лизин.
[109] В некоторых случаях неприродную аминокислоту встраивают в полипептид IL-15 с помощью синтетазы, раскрытой в US 9988619 и US 9938516. Иллюстративные UAA, которые можно встраивать с помощью таких синтетаз, включают пара-метилазидо-L-фенилаланин, замещенные аралкилом, гетероциклилом, гетероаралкилом неприродные аминокислоты и другие. В некоторых вариантах осуществления такие UAA включают пиридил, пиразинил, пиразолил, триазолил, оксазолил, тиазолил, тиофенил или другой гетероцикл. Такие аминокислоты в некоторых вариантах осуществления включают азиды, тетразины или другую химическую группу, способную к конъюгации с партнером по сочетанию, таким как водорастворимый фрагмент. В некоторых вариантах осуществления такие синтетазы экспрессируются и применяются для встраивания UAA в цитокины in vivo. В некоторых вариантах осуществления такие синтетазы применяются для встраивания UAA в цитокины с применением бесклеточной системы трансляции.
[110] В некоторых случаях неприродную аминокислоту встраивают в полипептид IL-15 с помощью встречающейся в природе синтетазы. В некоторых вариантах осуществления неприродную аминокислоту встраивают в цитокин с помощью организма, который является ауксотрофным по одной или нескольким аминокислотам. В некоторых вариантах осуществления синтетазы, соответствующие ауксотрофной аминокислоте, способны загружать соответствующую тРНК неприродной аминокислотой. В некоторых вариантах осуществления неприродная аминокислота представляет собой селеноцистеин или его производное. В некоторых вариантах осуществления неприродная аминокислота представляет собой селенометионин или его производное. В некоторых вариантах осуществления неприродная аминокислота представляет собой ароматическую аминокислоту, где ароматическая аминокислота включает арилгалогенид, такой как йодид. В вариантах осуществления неприродная аминокислота структурно подобна ауксотрофной аминокислоте.
[111] В некоторых случаях неприродная аминокислота включает неприродную аминокислоту, показанную на фиг. 1.
[112] В некоторых случаях неприродная аминокислота включает производное или аналог лизина или фенилаланина. В некоторых случаях неприродная аминокислота включает производное лизина или аналог лизина. В некоторых случаях неприродная аминокислота включает пирролизин (Pyl). В некоторых случаях неприродная аминокислота включает производное фенилаланина или аналог фенилаланина. В некоторых случаях неприродная аминокислота представляет собой неприродную аминокислоту, описанную в Wan, et al., "Pyrrolysyl-tRNA synthetase: an ordinary enzyme but an outstanding genetic code expansion tool," Biocheim Biophys Aceta 1844(6): 1059-4070 (2014). В некоторых случаях неприродная аминокислота включает неприродную аминокислоту, показанную на фиг. 2 (например, фиг. 2A и фиг. 2B).
[113] В некоторых вариантах осуществления неприродная аминокислота включает неприродную аминокислоту, показанную на фиг. 3A - фиг. 3D (адаптированы из таблицы 1 из Dumas et al., Chemical Science 2015, 6, 50-69).
[114] В некоторых вариантах осуществления неприродная аминокислота, встроенная в полипептид IL-15, раскрыта в US 9840493; US 9682934; US 2017/0260137; US 9938516; или US 2018/0086734. Иллюстративные UAA, которые можно встраивать с помощью таких синтетаз, включают пара-метилазидо-L-фенилаланин, аралкил, гетероциклил и гетероаралкил, а также неприродные аминокислоты, представляющие собой производные лизина. В некоторых вариантах осуществления такие UAA включают пиридил, пиразинил, пиразолил, триазолил, оксазолил, тиазолил, тиофенил или другой гетероцикл. Такие аминокислоты в некоторых вариантах осуществления включают азиды, тетразины или другую химическую группу, способную к конъюгации с партнером по сочетанию, таким как водорастворимый фрагмент. В некоторых вариантах осуществления UAA включает азид, присоединенный к ароматическому фрагменту посредством алкильного линкера. В некоторых вариантах осуществления алкильный линкер представляет собой линкер C1-C10. В некоторых вариантах осуществления UAA включает тетразин, присоединенный к ароматическому фрагменту посредством алкильного линкера. В некоторых вариантах осуществления UAA включает тетразин, присоединенный к ароматическому фрагменту посредством аминогруппы. В некоторых вариантах осуществления UAA включает тетразин, присоединенный к ароматическому фрагменту посредством алкиламиногруппы. В некоторых вариантах осуществления UAA включает азид, присоединенный к концевому азоту (например, N6 из производного лизина, или N5, N4 или N3 из производного, содержащего более короткую алкильную боковую цепь) боковой цепи аминокислоты посредством алкильной цепи. В некоторых вариантах осуществления UAA включает тетразин, присоединенный к концевому азоту боковой цепи аминокислоты посредством алкильной цепи. В некоторых вариантах осуществления UAA включает азид или тетразин, присоединенный к амиду посредством алкильного линкера. В некоторых вариантах осуществления UAA представляет собой азид- или тетразинсодержащий карбамат или амид 3-аминоаланина, серина, лизина или их производного. В некоторых вариантах осуществления такие UAA встраивают в цитокины in vivo. В некоторых вариантах осуществления такие UAA встраивают в цитокины в бесклеточной системе.
Конъюгирующие фрагменты
[115] В определенных вариантах осуществления в данном документе раскрыты конъюгирующие фрагменты, которые связаны с одним или несколькими модифицированными полипептидами IL-15, описанными выше. В некоторых вариантах осуществления конъюгирующий фрагмент представляет собой молекулу, которая нарушает взаимодействие IL-15 с его рецептором. В некоторых вариантах осуществления конъюгирующий фрагмент представляет собой любую молекулу, которая при связывании с IL-15 позволяет конъюгату IL-15 модулировать иммунный ответ. В некоторых вариантах осуществления конъюгирующий фрагмент связан с IL-15 посредством ковалентной связи. В некоторых случаях описанный в данном документе IL-15 присоединен к конъюгирующему фрагменту с помощью триазольной группы. В некоторых случаях описанный в данном документе IL-15 присоединен к конъюгирующему фрагменту с помощью дигидропиридазиновой или пиридазиновой группы. В некоторых случаях конъюгирующий фрагмент включает водорастворимый полимер. В других случаях конъюгирующий фрагмент включает белок или его связывающий фрагмент. В дополнительных случаях конъюгирующий фрагмент включает пептид. В дополнительных случаях конъюгирующий фрагмент включает нуклеиновую кислоту. В дополнительных случаях конъюгирующий фрагмент включает небольшую молекулу. В дополнительных случаях конъюгирующий фрагмент включает биоконъюгат (например, агонист TLR, такой как агонист TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8 или TLR9; или синтетический лиганд, такой как Pam3Cys, CFA, MALP2 , Pam2Cys, FSL-1, Hib-OMPC, поли I:C, поли A:U, AGP, MPL A, RC-529, MDF2β, CFA или флагеллин). В некоторых случаях конъюгирующий фрагмент увеличивает время полужизни в сыворотке крови и/или улучшает стабильность. В некоторых случаях конъюгирующий фрагмент снижает взаимодействие цитокина с одним или несколькими доменами или субъединицами рецептора цитокина. В дополнительных случаях конъюгирующий фрагмент блокирует взаимодействие IL-15 с одним или несколькими IL-15 доменами или субъединицами своего (своих) когнатного (когнатных) рецептора(рецепторов). В некоторых вариантах осуществления описанные в данном документе конъюгаты IL-15 содержат несколько конъюгирующих фрагментов. В некоторых вариантах осуществления конъюгирующий фрагмент присоединен к неприродной или природной аминокислоте в полипептиде IL-15. В некоторых вариантах осуществления конъюгат IL-15 содержит конъюгирующий фрагмент, присоединенный к природной аминокислоте. В некоторых вариантах осуществления конъюгат IL-15 присоединен к неприродной аминокислоте в пептиде цитокина. В некоторых вариантах осуществления конъюгирующий фрагмент присоединен к N- или C-концевой аминокислоте полипептида IL-15. В данном документе раскрыты различные комбинации сайтов, например, первый конъюгирующий фрагмент присоединен к неприродной или природной аминокислоте в полипептиде IL-15, а второй конъюгирующий фрагмент присоединен к N- или C-концевой аминокислоте полипептида IL-15. В некоторых вариантах осуществления один конъюгирующий фрагмент присоединен к нескольким остаткам полипептида IL-15 (например, к петле). В некоторых вариантах осуществления конъюгирующий фрагмент присоединен как к N-, так и к C-концевой аминокислоте полипептида IL-15.
Водорастворимые полимеры
[116] В некоторых вариантах осуществления описанный в данном документе конъюгирующий фрагмент представляет собой водорастворимый полимер. В некоторых вариантах осуществления водорастворимый полимер является непептидным, нетоксичным и биосовместимым. Применяемое в данном документе вещество считается биосовместимым, если положительные эффекты, связанные с применением вещества отдельно или с другим веществом (например, активного средства, такого как фрагмент IL-15), в связи с живыми тканями (например, введение пациенту) перевешивают любые вредные эффекты по оценке клинициста, например, врача. В некоторых вариантах осуществления водорастворимый полимер дополнительно является неиммуногенным. В некоторых вариантах осуществления вещество считается неиммуногенным, если предполагаемое применение вещества in vivo не вызывает нежелательного иммунного ответа (например, образования антител) или, если иммунный ответ возникает, то такой ответ не считается клинически значимым или важным по оценке клинициста, например врача, токсиколога или специалиста по клинической разработке.
[117] В некоторых вариантах осуществления водорастворимый полимер характеризуется наличием от приблизительно 2 до приблизительно 300 концов. Иллюстративные водорастворимые полимеры включают без ограничения поли(алкиленгликоли), такие как полиэтиленгликоль ("PEG"), поли(пропиленгликоль) ("PPG"), сополимеры этиленгликоля и пропиленгликоля и т.п., поли(оксиэтилированный полиол), поли(олефиновый спирт), поли(винилпирролидон), поли(гидроксиалкилметакриламид), поли(гидроксиалкилметакрилат), поли(сахариды), поли(α-гидроксикислота), поли(виниловый спирт), полифосфазен, полиоксазолины ("POZ") (которые описаны в WO 2008/106186), поли(N-акрилоилморфолин) и комбинации любых из вышеперечисленных.
[118] В некоторых вариантах осуществления водорастворимый полимер не ограничен конкретной структурой. В некоторых вариантах осуществления водорастворимый полимер является линейным (например, кэпированным на конце, например, алкокси-PEG или бифункциональный PEG), разветвленным или имеющим несколько плеч (например, раздвоенный PEG или PEG, присоединенный к ядру полиола), характеризуется дендритным (или звездчатым) строением, каждый с одной или несколькими разрушаемыми связями или без них. Более того, внутренняя структура водорастворимого полимера может быть организована в виде любого количества различных повторяющихся паттернов и может быть выбрана из группы, состоящей из гомополимера, чередующегося сополимера, статистического сополимера, блок-сополимера, чередующегося триполимера, статистического триполимера и блок-триполимера.
[119] В некоторых вариантах осуществления средневесовой молекулярный вес водорастворимого полимера в конъюгате IL-21 составляет от приблизительно 100 дальтон до приблизительно 150000 дальтон. Иллюстративные диапазоны включают, например, средневесовые значения молекулярного веса в диапазоне от более чем 5000 дальтон до приблизительно 100000 дальтон, в диапазоне от приблизительно 6000 дальтон до приблизительно 90000 дальтон, в диапазоне от приблизительно 10000 дальтон до приблизительно 85000 дальтон, в диапазоне от более чем 10000 дальтон до приблизительно 85000 дальтон, в диапазоне от приблизительно 20000 дальтон до приблизительно 85000 дальтон, в диапазоне от приблизительно 53000 дальтон до приблизительно 85000 дальтон, в диапазоне от приблизительно 25000 дальтон до приблизительно 120000 дальтон, в диапазоне от приблизительно 29000 дальтон до приблизительно 120000 дальтон, в диапазоне от приблизительно 35000 дальтон до приблизительно 120000 дальтон и в диапазоне от приблизительно 40000 дальтон до приблизительно 120000 дальтон.
[120] Иллюстративные средневесовые значения молекулярного веса водорастворимого полимера включают приблизительно 100 дальтон, приблизительно 200 дальтон, приблизительно 300 дальтон, приблизительно 400 дальтон, приблизительно 500 дальтон, приблизительно 600 дальтон, приблизительно 700 дальтон, приблизительно 750 дальтон, приблизительно 800 дальтон, приблизительно 900 дальтон, приблизительно 1000 дальтон, приблизительно 1500 дальтон, приблизительно 2000 дальтон, приблизительно 2200 дальтон, приблизительно 2500 дальтон, приблизительно 3000 дальтон, приблизительно 4000 дальтон, приблизительно 4400 дальтон, приблизительно 4500 дальтон, приблизительно 5000 дальтон, приблизительно 5500 дальтон, приблизительно 6000 дальтон, приблизительно 7000 дальтон, приблизительно 7500 дальтон, приблизительно 8000 дальтон, приблизительно 9000 дальтон, приблизительно 10000 дальтон, приблизительно 11000 дальтон, приблизительно 12000 дальтон, приблизительно 13000 дальтон, приблизительно 14000 дальтон, приблизительно 15000 дальтон, приблизительно 20000 дальтон, приблизительно 22500 дальтон, приблизительно 25000 дальтон, приблизительно 30000 дальтон, приблизительно 35000 дальтон, приблизительно 40000 дальтон, приблизительно 45000 дальтон, приблизительно 50000 дальтон, приблизительно 55000 дальтон, приблизительно 60000 дальтон, приблизительно 65000 дальтон, приблизительно 70000 дальтон и приблизительно 75000 дальтон. Также можно применять разветвленные варианты водорастворимого полимера (например, разветвленный водорастворимый полимер с молекулярным весом 40000 дальтон, состоящий из двух полимеров с молекулярным весом 20000 дальтон), имеющие общий молекулярный вес любого из вышеперечисленных. В одном или нескольких вариантах осуществления конъюгат не будет содержать каких-либо фрагментов PEG, присоединенных, непосредственно или опосредованно, к PEG, имеющему средневесовой молекулярный вес менее чем приблизительно 6000 дальтон.
[121] Как правило, PEG будут содержать ряд мономеров (OCH2CH2) [или мономеров (CH2CH2O), в зависимости от того, как определяется PEG]. Применяемое в данном документе количество повторяющихся звеньев обозначается индексом "n" в "(OCH2CH2)n". Таким образом, значение (n) обычно попадает в один или несколько из следующих диапазонов: от 2 до приблизительно 3400, от приблизительно 100 до приблизительно 2300, от приблизительно 100 до приблизительно 2270, от приблизительно 136 до приблизительно 2050, от приблизительно 225 до приблизительно 1930, от приблизительно 450 до приблизительно 1930, от приблизительно 1200 до приблизительно 1930, от приблизительно 568 до приблизительно 2727, от приблизительно 660 до приблизительно 2730, от приблизительно 795 до приблизительно 2730, от приблизительно 795 до приблизительно 2730, от приблизительно 909 до приблизительно 2730 и от приблизительно 1200 до приблизительно 1900. Для любого данного полимера, для которого известен молекулярный вес, можно определить количество повторяющихся звеньев (т.е. "n"), разделив общий средневесовой молекулярный вес полимера на молекулярный вес повторяющегося мономера.
[122] В некоторых вариантах осуществления водорастворимый полимер представляет собой полимер, кэпированный на конце, то есть полимер, имеющий по меньшей мере один конец, кэпированный относительно инертной группой, такой как низшая C1-6-алкоксигруппа или гидроксильная группа. Когда полимер представляет собой PEG, например, можно применять метокси-PEG (обычно называемый mPEG), который является линейной формой PEG, где один конец полимера представляет собой метокси(-OCH3)-группу, тогда как другой конец представляет собой гидроксил или другую функциональную группу, которая необязательно может быть химически модифицирована.
[123] В некоторых вариантах осуществления иллюстративные водорастворимые полимеры включают без ограничения линейный или разветвленный дискретный PEG (dPEG) от Quanta Biodesign, Ltd; линейные, разветвленные или раздвоенные PEG от Nektar Therapeutics; линейные, разветвленные или Y-образные производные PEG от JenKem Technology.
[124] В некоторых вариантах осуществления описанный в данном документе полипептид IL-15 конъюгирован с водорастворимым полимером, выбранным из поли(алкиленгликоли), таким как полиэтиленгликоль ("PEG"), поли(пропиленгликоль) ("PPG"), сополимеры этиленгликоля и пропиленгликоля и т.п., поли(оксиэтилированный полиол), поли(олефиновый спирт), поли(винилпирролидон), поли(гидроксиалкилметакриламид), поли(гидроксиалкилметакрилат), поли(сахариды), поли(α-гидроксикислота), поли(виниловый спирт), полифосфазен, полиоксазолины ("POZ"), поли(N-акрилоилморфолин) и их комбинация. В некоторых вариантах осуществления полипептид IL-15 конъюгирован с PEG (например, пегилирован). В некоторых вариантах осуществления полипептид IL-15 конъюгирован с PPG. В некоторых вариантах осуществления полипептид IL-15 конъюгирован с POZ. В некоторых случаях полипептид IL-15 конъюгирован с PVP.
[125] В некоторых случаях водорастворимый полимер включает полиглицерин (PG). В некоторых случаях полиглицерин представляет собой гиперразветвленный PG (HPG) (например, как описано в Imran, et al. "Influence of architecture of high molecular weight linear and branched polyglycerols on their biocompatibility and biodistribution," Biomaterials 33:9135-9147 (2012)). В других случаях полиглицерин представляет собой линейный PG (LPG). В дополнительных случаях полиглицерин представляет собой полуфункциональный PG, линейно-блочно-гиперразветвленный PG (например, как описано в Wurm et al., "Squaric acid mediated synthesis and biological activity of a library of linear and hyperbranched poly(glycerol)-protein conjugates," Biomacromolecules 13:1161-1171 (2012)) или PG с функциональными боковыми цепями (например, как описано в Li, et. al., "Synthesis of linear polyether polyol derivatives as new materials for bioconjugation," Bioconjugate Chem. 20:780-789 (2009).
[126] В некоторых случаях полипептид IL-15, описанный в данном документе, конъюгирован с PG, например, HPG, LPG, полуфункциональным PG, линейно-блочно-гиперразветвленным PG или PG с функциональными боковыми цепями.
[127] В некоторых вариантах осуществления водорастворимый полимер представляет собой разрушаемую синтетическую альтернативу PEG. Иллюстративные разрушаемые синтетические альтернативы PEG включают без ограничения поли[олиго(этиленгликоль)метилметакрилат] (POEGMA); производные PEG с модифицированным остовом, полученные с помощью полимеризации телехелатных или функционализированных с обоих концов макромономеров на основе PEG; производные PEG, включающие сомономеры, содержащие разрушаемую связь, такие как сополимер [(этиленоксида) и (метиленэтиленоксида)][P(EO-co-MEO)], циклические ацетали кетена, такие как 5,6-бензо-2-метилен-1,3-диоксепан (BMDO), 2-метилен-1,3-диоксепан (MDO) и 2-метилен-4-фенил-1,3-диоксолан (MPDL), сополимеризованные с OEGMA; или поли(этиленоксид) с привитым поли(ε-капролактоном) (PCL-g-PEO).
[128] В некоторых случаях описанный в данном документе полипептид IL-15 конъюгирован с разрушаемой синтетической альтернативой PEG, такой как, например, POEGM; производными PEG с модифицированным остовом, полученными с помощью полимеризации телехелатных или функционализированных с обоих концов макромономеров на основе PEG; P(EO-co-MEO); циклическими ацеталями кетена, такими как BMDO, MDO и MPDL, сополимеризованные с OEGMA; или PCL-g-PEO.
[129] В некоторых вариантах осуществления водорастворимый полимер включает поли(цвиттер-ионы). Иллюстративные поли(цвиттер-ионы) включают без ограничения поли(сульфобетаинметакрилат) (PSBMA), поли(карбоксибетаинметакрилат) (PCBMA) и поли(2-метакрилоилоксиэтилфосфорилхолин) (PMPC). В некоторых случаях полипептид IL-15 конъюгирован с поли(цвиттер-ионом), таким как PSBMA, PCBMA или PMPC.
[130] В некоторых вариантах осуществления водорастворимый полимер включает поликарбонат. Иллюстративные поликарбонаты включают без ограничения пентафторфенил-5-метил-2-оксо-1,3-диоксан-5-карбоксилат (MTC-OC6F5). В некоторых случаях полипептид IL-15, описанный в данном документе, конъюгирован с поликарбонатом, таким как MTC-OC6F5.
[131] В некоторых вариантах осуществления водорастворимый полимер включает гибрид полимеров, такой как, например, гибрид полимеров поликарбонат/PEG, конъюгат полимера пептид/белок или гидроксилсодержащий и/или цвиттер-ионный дериватизированный полимер (например, гидроксилсодержащий и/или цвиттер-ионный дериватизированный полимер PEG). В некоторых случаях полипептид IL-15, описанный в данном документе, конъюгирован с гибридом полимеров, таким как гибрид полимеров поликарбонат/PEG, конъюгат полимера пептид/белок или гидроксилсодержащий и/или цвиттер-ионный дериватизированный полимер (например, гидроксилсодержащий и/или цвиттер-ионный дериватизированный полимер PEG).
[132] В некоторых вариантах осуществления водорастворимый полимер включает полисахарид. Иллюстративные полисахариды включают без ограничения декстран, полисиаловую кислоту (PSA), гиалуроновую кислоту (HA), амилозу, гепарин, гепарансульфат (HS), декстрин или гидроксиэтилкрахмал (HES). В некоторых вариантах осуществления полипептид IL-15 конъюгирован с декстраном. В некоторых вариантах осуществления полипептид IL-15 конъюгирован с PSA. В некоторых вариантах осуществления полипептид IL-15 конъюгирован с HA. В некоторых вариантах осуществления полипептид IL-15 конъюгирован с амилозой. В некоторых вариантах осуществления полипептид IL-15 конъюгирован с гепарином. В некоторых вариантах осуществления полипептид IL-15 конъюгирован с HS. В некоторых вариантах осуществления полипептид IL-15 конъюгирован с декстрином. В некоторых вариантах осуществления полипептид IL-15 конъюгирован с HES.
[133] В некоторых вариантах осуществления водорастворимый полимер включает гликан. Иллюстративные классы гликанов включают N-связанные гликаны, O-связанные гликаны, гликолипиды, O-GlcNAc и гликозаминогликаны. В некоторых вариантах осуществления полипептид IL-15 конъюгирован с гликаном. В некоторых вариантах осуществления полипептид IL-15 конъюгирован с N-связанными гликанами. В некоторых вариантах осуществления полипептид IL-15 конъюгирован с O-связанными гликанами. В некоторых вариантах осуществления полипептид IL-15 конъюгирован с гликолипидами. В некоторых вариантах осуществления полипептид IL-15 конъюгирован с O-GlcNAc. В некоторых вариантах осуществления полипептид IL-15 конъюгирован с гликозаминогликанами.
[134] В некоторых вариантах осуществления водорастворимый полимер включает полимер полиоксазолина. Полимер полиоксазолина представляет собой линейный синтетический полимер и, как и PEG, характеризуется низкой полидисперсностью. В некоторых вариантах осуществления полимер полиоксазолина представляет собой полидисперсный полимер полиоксазолина, характеризующийся средним молекулярным весом. В некоторых вариантах осуществления средний молекулярный вес полимера полиоксазолина составляет, например, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 6500, 7000, 7500, 8000, 10,000, 12,000, 20,000, 35,000, 40,000, 50,000, 60,000, 100,000, 200,000, 300,000, 400,000, или 500,000 Да. В некоторых вариантах осуществления полимер полиоксазолина включает поли(2-метил-2-оксазолин) (PMOZ), поли(2-этил-2-оксазолин) (PEOZ) или поли(2-пропил-2-оксазолин) (PPOZ). В некоторых вариантах осуществления полипептид IL-15 конъюгирован с полимером полиоксазолина. В некоторых вариантах осуществления полипептид IL-15 конъюгирован с PMOZ. В некоторых вариантах осуществления полипептид IL-15 конъюгирован с PEOZ. В некоторых вариантах осуществления полипептид IL-15 конъюгирован с PPOZ.
[135] В некоторых вариантах осуществления водорастворимый полимер включает полимер полиакриловой кислоты. В некоторых вариантах осуществления полипептид IL-15 конъюгирован с полимером полиакриловой кислоты.
[136] В некоторых вариантах осуществления водорастворимый полимер включает полиамин. Полиамин представляет собой органический полимер, содержащий две или более первичные аминогруппы. В некоторых вариантах осуществления полиамин включает разветвленный полиамин, линейный полиамин или циклический полиамин. В некоторых вариантах осуществления полиамин представляет собой низкомолекулярный линейный полиамин. Иллюстративные полиамины включают путресцин, кадаверин, спермидин, спермин, этилендиамин, 1,3-диаминопропан, гексаметилендиамин, тетраэтилметилендиамин и пиперазин. В некоторых вариантах осуществления полипептид IL-15 конъюгирован с полиамином. В некоторых вариантах осуществления полипептид IL-15 конъюгирован с путресцином, кадаверином, спермидином, спермином, этилендиамином, 1,3-диаминопропаном, гексаметилендиамином, тетраэтилметилендиамином или пиперазином.
Липиды
[137] В некоторых вариантах осуществления описанный в данном документе конъюгирующий фрагмент представляет собой липид. В некоторых случаях липид представляет собой жирную кислоту. В некоторых случаях жирная кислота представляет собой насыщенную жирную кислоту. В других случаях жирная кислота представляет собой ненасыщенную жирную кислоту. Иллюстративные жирные кислоты включают без ограничения жирные кислоты, содержащие от приблизительно 6 до приблизительно 26 атомов углерода, от приблизительно 6 до приблизительно 24 атомов углерода, от приблизительно 6 до приблизительно 22 атомов углерода, от приблизительно 6 до приблизительно 20 атомов углерода, от приблизительно 6 до приблизительно 18 атомов углерода, от приблизительно 20 до приблизительно 26 атомов углерода, от приблизительно 12 до приблизительно 26 атомов углерода, от приблизительно 12 до приблизительно 24 атомов углерода, от приблизительно 12 до приблизительно 22 атомов углерода, от приблизительно 12 до приблизительно 20 атомов углерода или от приблизительно 12 до приблизительно 18 атомов углерода. В некоторых случаях липид связывается с одним или несколькими белками сыворотки крови, тем самым повышая стабильность в сыворотке крови и/или время полужизни в сыворотке крови.
[138] В некоторых вариантах осуществления липид конъюгирован с полипептидом IL-15, описанным в данном документе. В некоторых случаях липид представляет собой жирную кислоту, например, насыщенную жирную кислоту или ненасыщенную жирную кислоту. В некоторых случаях жирная кислота содержит от приблизительно 6 до приблизительно 26 атомов углерода, от приблизительно 6 до приблизительно 24 атомов углерода, от приблизительно 6 до приблизительно 22 атомов углерода, от приблизительно 6 до приблизительно 20 атомов углерода, от приблизительно 6 до приблизительно 18 атомов углерода, от приблизительно 20 до приблизительно 26 атомов углерода, от приблизительно 12 до приблизительно 26 атомов углерода, от приблизительно 12 до приблизительно 24 атомов углерода, от приблизительно 12 до приблизительно 22 атомов углерода, от приблизительно 12 до приблизительно 20 атомов углерода или от приблизительно 12 до приблизительно 18 атомов углерода. В некоторых случаях длина жирной кислоты составляет приблизительно 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, или 26 атомов углерода. В некоторых случаях жирная кислота включает капроновую кислоту (гексановую кислоту), энантовую кислоту (гептановую кислоту), каприловую кислоту (октановую кислоту), пеларгоновую кислоту (нонановую кислоту), каприновую кислоту (декановую кислоту), ундециловую кислоту (ундекановую кислоту), лауриновую кислоту (додекановую кислоту), тридециловую кислоту (тридекановую кислоту), миристиновую кислоту (тетрадекановую кислоту), пентадециловую кислоту (пентадекановую кислоту), пальмитиновую кислоту (гексадекановую кислоту), маргариновую кислоту (гептадекановую кислоту), стеариновую кислоту (октадекановую кислоту), нонадециловую кислоту (нонадекановую кислоту), арахидиновую кислоту (эйкозановую кислоту), генейкозиловую кислоту (генейкозановую кислоту), бегеновую кислоту (докозановую кислоту), трикозиловую кислоту (трикозановую кислоту), лигноцериновую кислоту (тетракозановую кислоту), пентакозиловую кислоту (пентакозановую кислоту) или церотовую кислоту (гексакозановую кислоту).
[139] В некоторых вариантах осуществления липидный конъюгат IL-15 повышает стабильность в сыворотке крови и/или время полужизни в сыворотке крови.
Белки
[140] В некоторых вариантах осуществления описанный в данном документе конъюгирующий фрагмент представляет собой белок или его связывающий фрагмент. Иллюстративные белки включают альбумин, трансферрин или транстиретин. В некоторых вариантах осуществления белок или его связывающий фрагмент включает антитело или его связывающие фрагменты. В некоторых вариантах осуществления конъюгат IL-15 содержит белок или его связывающий фрагмент. В некоторых вариантах осуществления конъюгат IL-15, содержащий белок или его связывающий фрагмент, характеризуется увеличенным временем полужизни в сыворотке крови и/или повышенной стабильностью. В некоторых вариантах осуществления конъюгат IL-15, содержащий белок или его связывающий фрагмент, характеризуется пониженным взаимодействием IL-15 с одной или несколькими субъединицами IL-15R/IL-2R. В дополнительных случаях белок или его связывающий фрагмент блокирует взаимодействие IL-15 с одной или несколькими субъединицами IL-15R/IL-2R.
[141] В некоторых вариантах осуществления конъюгирующий фрагмент представляет собой альбумин. Альбумин представляет собой семейство водорастворимых глобулярных белков. Обычно он обнаруживается в плазме крови, составляя приблизительно 55-60% от всех белков плазмы крови. Человеческий сывороточный альбумин (HSA) представляет собой полипептид из 585 аминокислот, в котором третичная структура разделена на три домена: домен I (аминокислотные остатки 1-195), домен II (аминокислотные остатки 196-383) и домен III (аминокислотные остатки 384-585). Каждый домен дополнительно содержит сайт связывания, который способен обратимо или необратимо взаимодействовать с эндогенными лигандами, такими как длинно- и среднецепочечные жирные кислоты, билирубин или гемин, или экзогенными соединениями, такими как гетероциклические или ароматические соединения.
[142] В некоторых вариантах осуществления полипептид IL-15 конъюгирован с альбумином. В некоторых вариантах осуществления полипептид IL-15 конъюгирован с человеческим сывороточным альбумином (HSA). В дополнительных случаях полипептид IL-15 конъюгирован с функциональным фрагментом альбумина.
[143] В некоторых вариантах осуществления конъюгирующий фрагмент представляет собой трансферрин. Трансферрин представляет собой полипептид из 679 аминокислот, который имеет размер приблизительно 80 кДа и содержит два сайта связывания Fe3+, один из которых находится в N-концевом домене, а другой - в C-концевом домене. В некоторых вариантах осуществления человеческий трансферрин характеризуется временем полужизни, составляющим приблизительно 7-12 дней.
[144] В некоторых вариантах осуществления полипептид IL-15 конъюгирован с трансферрином. В некоторых вариантах осуществления полипептид IL-15 конъюгирован с человеческим трансферрином. В дополнительных случаях полипептид IL-15 конъюгирован с функциональным фрагментом трансферрина.
[145] В некоторых вариантах осуществления конъюгирующий фрагмент представляет собой транстиретин (TTR). Транстиретин представляет собой транспортный белок, расположенный в сыворотке крови и спинномозговой жидкости, который транспортирует тиреоидный гормон тироксин (T4) и ретинол-связывающий белок, связанный с ретинолом.
[146] В некоторых вариантах осуществления полипептид IL-15 конъюгирован с транстиретином (с помощью одного из его концов или с помощью внутреннего шарнирного участка). В некоторых вариантах осуществления полипептид IL-15 конъюгирован с функциональным фрагментом транстиретина.
[147] В некоторых вариантах осуществления конъюгирующий фрагмент представляет собой антитело или его связывающие фрагменты. В некоторых вариантах осуществления антитело или его связывающие фрагменты содержат гуманизированное антитело или его связывающий фрагмент, мышиное антитело или его связывающий фрагмент, химерное антитело или его связывающий фрагмент, моноклональное антитело или его связывающий фрагмент, моновалентный Fab', бивалентный Fab2, F(ab)'3-фрагменты, одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv), бис-scFv, (scFv)2, диатело, миниантитело, нанотело, триатело, тетратело, гуматело, дисульфид-стабилизированный белок Fv (dsFv), однодоменное антитело (sdAb), Ig NAR, верблюжье антитело или его связывающий фрагмент, биспецифическое антитело или его связывающий фрагмент, или их химически модифицированное производное.
[148] В некоторых случаях конъюгирующий фрагмент содержит scFv, бис-scFv, (scFv)2, dsFv или sdAb. В некоторых случаях конъюгирующий фрагмент содержит scFv. В некоторых случаях конъюгирующий фрагмент содержит бис-scFv. В некоторых случаях конъюгирующий фрагмент содержит (scFv)2. В некоторых случаях конъюгирующий фрагмент содержит dsFv. В некоторых случаях конъюгирующий фрагмент содержит sdAb.
[149] В некоторых вариантах осуществления конъюгирующий фрагмент содержит Fc-часть антитела, например, IgG, IgA, IgM, IgE или IgD. В некоторых вариантах осуществления фрагмент содержит Fc-часть IgG (например, IgG1, IgG3 или IgG4).
[150] В некоторых вариантах осуществления полипептид IL-15 конъюгирован с антителом или его связывающими фрагментами. В некоторых вариантах осуществления полипептид IL-15 конъюгирован с гуманизированным антителом или его связывающим фрагментом, мышиным антителом или его связывающим фрагментом, химерным антителом или его связывающим фрагментом, моноклональным антителом или его связывающим фрагментом, моновалентным Fab', бивалентным Fab2, F(ab)'3-фрагментами, одноцепочечным вариабельным фрагментом (scFv), бис-scFv, (scFv)2, диателом, миниантителом, нанотелом, триателом, тетрателом, гумателом, дисульфид-стабилизированным белком Fv (dsFv), однодоменным антителом (sdAb), Ig NAR, верблюжьим антителом или его связывающим фрагментом, биспецифическим антителом или его связывающим фрагментом, или их химически модифицированным производным. В дополнительных случаях полипептид IL-15 конъюгирован с Fc-частью антитела. В дополнительных случаях полипептид IL-15 конъюгирован с Fc-частью IgG (например, IgG1, IgG3 или IgG4).
[151] В некоторых вариантах осуществления полипептид IL-15 конъюгирован с водорастворимым полимером (например, PEG) и антителом или его связывающим фрагментом. В некоторых случаях антитело или его связывающие фрагменты содержат гуманизированное антитело или его связывающий фрагмент, мышиное антитело или его связывающий фрагмент, химерное антитело или его связывающий фрагмент, моноклональное антитело или его связывающий фрагмент, моновалентный Fab', бивалентный Fab2, F(ab)'3-фрагменты, одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv), бис-scFv, (scFv)2, диатело, миниантитело, нанотело, триатело, тетратело, гуматело, дисульфид-стабилизированный белок Fv (dsFv), однодоменное антитело (sdAb), Ig NAR, верблюжье антитело или его связывающий фрагмент, биспецифическое антитело или его связывающий фрагмент, или их химически модифицированное производное. В некоторых случаях антитело или его связывающие фрагменты включают scFv, бис-scFv, (scFv)2, dsFv или sdAb. В некоторых случаях антитело или его связывающие фрагменты включают scFv. В некоторых случаях антитело или его связывающий фрагмент направляет конъюгат IL-15 к представляющей интерес целевой клетке, а водорастворимый полимер повышает стабильность и/или время полужизни в сыворотке крови.
[152] В некоторых случаях один или несколько конъюгатов полипептида IL-15 и водорастворимого полимера (например, PEG) дополнительно связаны с антителом или его связывающими фрагментами. В некоторых случаях соотношение конъюгата IL-15 и антитела составляет приблизительно 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 11:1 или 12:1. В некоторых случаях соотношение конъюгата IL-15 и антитела составляет приблизительно 1:1. В других случаях соотношение конъюгата IL-15 и антитела составляет приблизительно 2:1, 3:1 или 4:1. В дополнительных случаях соотношение конъюгата IL-15 и антитела составляет приблизительно 6:1 или выше.
[153] В некоторых вариантах осуществления один или несколько конъюгатов полипептида IL-15 и водорастворимого полимера (например, PEG) непосредственно связаны с антителом или его связывающими фрагментами. В других случаях конъюгат IL-15 опосредованно связан с антителом или его связывающими фрагментами с помощью линкера. Иллюстративные линкеры включают гомобифункциональные линкеры, гетеробифункциональные линкеры, линкеры на основе малеимида, бесследные линкеры, саморасщепляющиеся линкеры, спейсеры и т.п.
[154] В некоторых вариантах осуществления антитело или его связывающие фрагменты непосредственно или опосредованно связаны с частью полипептида IL-15 в конъюгате полипептида IL-15 и водорастворимого полимера (например, PEG). В таких случаях сайт конъюгации антитела с полипептидом IL-15 находится в сайте, который не будет препятствовать связыванию полипептида IL-15 с IL-15R. В дополнительных случаях сайт конъюгации антитела с полипептидом IL-15 находится в участке, который частично блокирует связывание полипептида IL-15 с IL-15R. В других вариантах осуществления антитело или его связывающие фрагменты непосредственно или опосредованно связаны с частью водорастворимого полимера в конъюгате полипептида IL-15 и водорастворимого полимера (например, PEG).
Пептиды
[155] В некоторых вариантах осуществления описанный в данном документе конъюгирующий фрагмент представляет собой пептид. В некоторых вариантах осуществления пептид представляет собой неструктурированный пептид. В некоторых вариантах осуществления полипептид цитокина (например, интерлейкина, IFN или TNF) конъюгирован с пептидом. В некоторых вариантах осуществления конъюгат IL-15, содержащий пептид, характеризуется увеличенным временем полужизни в сыворотке крови и/или повышенной стабильностью. В некоторых вариантах осуществления конъюгат IL-15, содержащий пептид, характеризуется пониженным взаимодействием IL-15 с одной или несколькими субъединицами IL-15R. В дополнительных случаях пептид блокирует взаимодействие IL-15 с одной или несколькими субъединицами IL-15R.
[156] В некоторых вариантах осуществления конъюгирующий фрагмент представляет собой пептид XTEN™ (Amunix Operating Inc.), и модификация называется XTENилированием. XTENилирование представляет собой генетическое слияние нуклеиновой кислоты, кодирующей представляющий интерес полипептид, с нуклеиновой кислотой, кодирующей пептид XTEN™ (Amunix Operating Inc.), длинный неструктурированный гидрофильный пептид, содержащий в разном процентном соотношении шесть аминокислот: Ala, Glu, Gly, Ser и Thr. В некоторых вариантах осуществления пептид XTEN™ выбирают на основе таких свойств как экспрессия, генетическая стабильность, растворимость, устойчивость к агрегации, увеличенное время полужизни, повышенная эффективность и/или повышенная активность in vitro в комбинации с представляющим интерес полипептидом. В некоторых вариантах осуществления полипептид цитокина (например, интерлейкина, IFN или TNF) конъюгирован с пептидом XTEN. В некоторых вариантах осуществления полипептид IL-15 конъюгирован с пептидом XTEN.
[157] В некоторых вариантах осуществления конъюгирующий фрагмент представляет собой богатый глицином аминокислотный гомополимер (HAP), и модификация называется HAPилированием. HAPилирование представляет собой генетическое слияние нуклеиновой кислоты, кодирующей представляющий интерес полипептид, с нуклеиновой кислотой, кодирующей богатый глицином аминокислотный гомополимер (HAP). В некоторых вариантах осуществления полимер HAP содержит повторяющийся мотив (Gly4Ser)n и иногда имеет длину, составляющую приблизительно 50, 100, 150, 200, 250, 300 или более остатков. В некоторых вариантах осуществления полипептид цитокина (например, интерлейкина, IFN или TNF) конъюгирован с HAP. В некоторых вариантах осуществления полипептид IL-15 конъюгирован с HAP.
[158] В некоторых вариантах осуществления конъюгирующий фрагмент представляет собой полипептид PAS, и модификация называется PASизированием. PASилирование представляет собой генетическое слияние нуклеиновой кислоты, кодирующей представляющий интерес полипептид, с нуклеиновой кислотой, кодирующей полипептид PAS. Полипептид PAS представляет собой гидрофильный незаряженный полипептид, состоящий из остатков Pro, Ala и Ser. В некоторых вариантах осуществления длина полипептида PAS составляет по меньшей мере приблизительно 100, 200, 300, 400, 500 или 600 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления полипептид цитокина (например, интерлейкина, IFN или TNF) конъюгирован с полипептидом PAS. В некоторых вариантах осуществления полипептид IL-15 конъюгирован с полипептидом PAS.
[159] В некоторых вариантах осуществления конъюгирующий фрагмент представляет собой эластин-подобный полипептид (ELP), и модификация называется ELPилированием. ELPилирование представляет собой генетическое слияние нуклеиновой кислоты, кодирующей представляющий интерес полипептид, с нуклеиновой кислотой, кодирующей эластин-подобный полипептид (ELP). ELP содержит повторяющийся мотив VPGxG, в котором x представляет собой любую аминокислоту, за исключением пролина. В некоторых вариантах осуществления полипептид цитокина (например, интерлейкина, IFN или TNF) конъюгирован с ELP. В некоторых вариантах осуществления полипептид IL-15 конъюгирован с ELP.
[160] В некоторых вариантах осуществления конъюгирующий фрагмент представляет собой пептид CTP. Пептид CTP включает пептид из 31 аминокислотного остатка, а именно FQSSSS*KAPPPS*LPSPS*RLPGPS*DTPILPQ, в котором S* обозначает сайты O-гликозилирования (OPKO). В некоторых вариантах осуществления пептид CTP генетически слит с полипептидом цитокина (например, полипептидом IL-15). В некоторых вариантах осуществления полипептид цитокина (например, полипептид IL-15) конъюгирован с пептидом CTP.
[161] В некоторых вариантах осуществления цитокин (например, полипептид IL-15) модифицирован посредством глутамилирования. Глутамилирование (или полиглутамилирование) представляет собой обратимую посттрансляционную модификацию глутамата, при которой γ-карбоксильная группа глутамата образует подобную пептидной связь с аминогруппой свободного глутамата, в котором α-карбоксильная группа переходит в полиглутаматную цепь.
[162] В некоторых вариантах осуществления полипептид IL-15 модифицирован с помощью полимера желатин-подобного белка (GLK). В некоторых вариантах осуществления полимер GLK содержит несколько повторов Gly-Xaa-Yaa, где Xaa и Yaa преимущественно содержат пролин и 4-гидроксипролин, соответственно. В некоторых вариантах осуществления полимер GLK дополнительно содержит аминокислотные остатки Pro, Gly, Glu, Qln, Asn, Ser и Lys. В некоторых вариантах осуществления длина полимера GLK составляет приблизительно 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 150 остатков или более.
Дополнительные конъюгирующие фрагменты
[163] В некоторых вариантах осуществления конъюгирующий фрагмент включает внеклеточный биомаркер. В некоторых вариантах осуществления внеклеточный биомаркер представляет собой опухолевый антиген. В некоторых вариантах осуществления иллюстративный внеклеточный биомаркер включает CD19, PSMA, B7-H3, B7-H6, CD70, CEA, CSPG4, EGFRvIII, EphA3, EpCAM, EGFR, ErbB2 (HER2), FAP, FRα, GD2, GD3, Lewis-Y, мезотелин, Muc1, Muc16, ROR1, TAG72, VEGFR2, CD11, Gr-1, CD204, CD16, CD49b, CD3, CD4, CD8 и B220. В некоторых вариантах осуществления конъюгирующий фрагмент связан или конъюгирован с IL-15. В некоторых вариантах осуществления конъюгирующий фрагмент генетически слит, например, с N-концом или C-концом IL-15.
[164] В некоторых вариантах осуществления конъюгирующий фрагмент включает молекулу с посттрансляционной модификацией. В некоторых вариантах осуществления примеры посттрансляционной модификации включают миристоилирование, пальмитоилирование, изопренилирование (или пренилирование) (например, фарнезилирование или геранилгеранилирование), глипирование, ацилирование (например, O-ацилирование, N-ацилирование, S-ацилирование), алкилирование (например, дополнительными алкильными группами, такими как метильные или этильные группы), амидирование, гликозилирование, гидроксилирование, йодирование, добавление нуклеотидов, окисление, фосфорилирование, сукцинилирование, сульфатирование, гликозилирование, карбамилирование, глутамилирование или дезамидирование. В некоторых вариантах осуществления IL-15 модифицирован посредством посттрансляционной модификации, такой как миристоилирование, пальмитоилирование, изопренилирование (или пренилирование) (например, фарнезилирование или геранилгеранилирование), глипирование, ацилирование (например, O-ацилирование, N-ацилирование, S-ацилирование), алкилирование (например, дополнительными алкильными группами, такими как метильные или этильные группы), амидирование, гликозилирование, гидроксилирование, йодирование, добавление нуклеотидов, окисление, фосфорилирование, сукцинилирование, сульфатирование, гликозилирование, карбамилирование, глутамилирование или дезамидирование.
Линкеры
[165] В некоторых вариантах осуществления применимые функциональные реакционноспособные группы для конъюгации или связывания конъюгирующего фрагмента с полипептидом IL-15, описанным в данном документе, включают, например, линкеры нулевого или более высокого порядка. В некоторых случаях неприродная аминокислота, встроенная в описанный в данном документе интерлейкин, содержит функциональную реакционноспособную группу. В некоторых случаях линкер содержит функциональную реакционноспособную группу, которая реагирует с неприродной аминокислотой, встроенной в описанный в данном документе интерлейкин. В некоторых случаях конъюгирующий фрагмент содержит функциональную реакционноспособную группу, которая реагирует с неприродной аминокислотой, встроенной в описанный в данном документе интерлейкин. В некоторых случаях конъюгирующий фрагмент содержит функциональную реакционноспособную группу, которая реагирует с линкером (необязательно предварительно присоединенным к пептиду цитокина), описанным в данном документе. В некоторых вариантах осуществления линкер содержит реакционноспособную группу, которая реагирует с природной аминокислотой в полипептиде IL-15, описанном в данном документе. В некоторых случаях линкеры более высокого порядка включают бифункциональные линкеры, такие как гомобифункциональные линкеры или гетеробифункциональные линкеры. Иллюстративные гомобифункциональные линкеры включают без ограничения реагент Ломанта, представляющий собой дитиобис(сукцинимидилпропионат) DSP, 3'3'-дитиобис(сульфосукцинимидилпропионат (DTSSP), дисукцинимидилсуберат (DSS), бис(сульфосукцинимидил)суберат (BS), дисукцинимидилтартрат (DST), дисульфосукцинимидилтартрат (сульфо-DST), этиленгликобис(сукцинимидилсукцинат) (EGS), дисукцинимидилглутарат (DSG), N, N'-дисукцинимидилкарбонат (DSC), диметиладипимидат (DMA), диметилпимелимидат (DMP), диметилсуберимидат (DMS), диметил-3,3'-дитиобиспропионимидат (DTBP), 1,4-ди-3'-(2'-пиридилдитио)пропионамидо)бутан (DPDPB), бисмалеимидогексан (BMH), арилгалогенид-содержащее соединение (DFDNB), такое как, например, 1,5-дифтор-2,4-динитробензол или 1,3-дифтор-4,6-динитробензол, 4,4'-дифтор-3,3'-динитрофенилсульфон (DFDNPS), бис-[β-(4-азидосалициламидо)этил]дисульфид (BASED), формальдегид, глутаральдегид, 1,4-бутандиолдиглицидиловый эфир, дигидразид адипиновой кислоты, карбогидразид, о-толуидин, 3,3'-диметилбензидин, бензидин, α,α'-п-диаминодифенил, дийод-п-ксилолсульфоновую кислоту, N, N'-этилен-бис(йодацетамид) или N, N'-гексаметилен-бис(йодацетамид).
[166] В некоторых вариантах осуществления бифункциональный линкер включает гетеробифункциональный линкер. Иллюстративный гетеробифункциональный линкер включает без ограничения аминореактивные и сульфгидрильные кросс-линкеры, такие как N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)пропионат (sPDP), длинноцепочечный N-сукцинимидил 3-(2-пиридилдитио)пропионат (LC-sPDP), водорастворимый длинноцепочечный N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)пропионат (сульфо-LC-sPDP), сукцинимидилоксикарбонил-α-метил-α-(2-пиридилдитио)толуол (sMPT), сульфосукцинимидил-6-[α-метил-α-(2-пиридилдитио)толуамидо]гексаноат (сульфо-LC-sMPT), сукцинимидил-4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат (sMCC), сульфосукцинимидил-4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат (сульфо-sMCC), сложный эфир м-малеимидобензоил-N-гидроксисукцинимида (MBs) сложный эфир м-малеимидобензоил-N-гидроксисульфосукцинимида (сульфо-MBs), N-сукцинимидил(4-йодактеил)аминобензоат (sIAB), сульфосукцинимидил(4-йодактеил)аминобензоат (сульфо-sIAB), сукцинимидил-4-(п-малеимидофенил)бутират (sMPB), сульфосукцинимидил-4-(п-малеимидофенил)бутират (сульфо-sMPB), сложный эфир N-(γ-малеимидобутирилокси)сукцинимида (GMBs), сложный эфир N-(γ-малеимидобутирилокси)сульфосукцинимида (сульфо-GMBs), сукцинимидил-6-((йодацетил)амино)гексаноат (sIAX), сукцинимидил-6-[6-(((йодацетил)амино)гексаноил)амино]гексаноат (sIAXX), сукцинимидил-4-(((йодацетил)амино)метил)циклогексан-1-карбоксилат (sIAC), сукцинимидил-6-(((((4-йодацетил)амино)метил)циклогексан-1-карбонил)амино)гексаноат (sIACX), п-нитрофенилйодацетат (NPIA), карбонил-реактивные и сульфгидрил-реактивные кросс-линкеры, такие как гидразид 4-(4-N-малеимидофенил)масляной кислоты (MPBH), 4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилгидразид-8 (M2C2H), 3-(2-пиридилдитио)пропионилгидразид (PDPH), аминореактивные и фотореактивные кросс-линкеры, такие как N-гидроксисукцинимидил-4-азидосалициловая кислота (NHs-AsA), N-гидроксисульфосукцинимидил-4-азидосалициловая кислота (сульфо-NHs-AsA), сульфосукцинимидил-(4-азидосалициламидо)гексаноат (сульфо-NHs-LC-AsA), сульфосукцинимидил-2-(п-азидосалициламидо)этил-1,3'-дитиопропионат (sAsD), N-гидроксисукцинимидил-4-азидобензоат (HsAB), N-гидроксисульфосукцинимидил-4-азидобензоат (сульфо-HsAB), N-сукцинимидил-6-(4'-азидо-2'-нитрофениламино)гексаноат (sANPAH), сульфосукцинимидил-6-(4'-азидо-2'-нитрофениламино)гексаноат (сульфо-sANPAH), N-5-азидо-2-нитробензоилоксисукцинимид (ANB-NOs), сульфосукцинимидил-2-(м-азидо-о-нитробензамидо)-этил-1,3'-дитиопропионат (sAND), N-сукцинимидил-4-(4-азидофенил)-1,3'-дитиопропионат (sADP), N-сульфосукцинимидил-(4-азидофенил)-1,3'-дитиопропионат (сульфо-sADP), сульфосукцинимидил-4-(п-азидофенил)бутират (сульфо-sAPB), сульфосукцинимидил-2-(7-азидо-4-метилкумарин-3-ацетамид)этил-1,3'-дитиопропионат (sAED), сульфосукцинимидил-7-азидо-4-метилкумарин-3-ацетат (сульфо-sAMCA), п-нитрофенилдиазопируват (ρNPDP), п-нитрофенил-2-диазо-3,3,3-трифторпропионат (PNP-DTP), сульфгидрил-реактивные и фотореактивные кросс-линкеры, такие как 1-(п-азидосалициламидо)-4-(йодацетамидо)бутан (AsIB), N-[4-(п-азидосалициламидо)бутил]-3'-(2'-пиридилдитио)пропионамид (APDP), бензофенон-4-йодацетамид, бензофенон-4-малеимид, карбонил-реактивные и фотореактивные кросс-линкеры, такие как п-азидобензоилгидразид (ABH), карбоксилат-реактивные и фотореактивные кросс-линкеры, такие как 4-(п-азидосалициламидо)бутиламин (AsBA) и аргинин-реактивные и фотореактивные кросс-линкеры, такие как п-азидофенилглиоксаль (APG).
[167] В некоторых случаях реакционноспособная функциональная группа включает нуклеофильную группу, которая реагирует с электрофильной группой, присутствующей на связывающем фрагменте (например, на конъюгирующем фрагменте или на IL-15). Иллюстративные электрофильные группы включают карбонильные группы, такие как альдегидная, кетонная, карбонильная группа карбоновой кислоты, сложного эфира, амида, енона, ацилгалогенида или ангидрида кислоты. В некоторых вариантах осуществления реакционноспособная функциональная группа представляет собой альдегидную группу. Иллюстративные нуклеофильные группы включают гидразидную, оксимную, амино, гидразинную, тиосемикарбазонную, гидразинкарбоксилатную и арилгидразидную. В некоторых вариантах осуществления неприродная аминокислота, встроенная в описанный в данном документе интерлейкин, содержит электрофильную группу.
[168] В некоторых вариантах осуществления линкер представляет собой расщепляемый линкер. В некоторых вариантах осуществления расщепляемый линкер представляет собой дипептидный линкер. В некоторых вариантах осуществления дипептидный линкер представляет собой валин-цитруллин (Val-Cit), фенилаланин-лизин (Phe-Lys), валин-аланин (Val-Ala) и валин-лизин (Val-Lys). В некоторых вариантах осуществления дипептидный линкер представляет собой валин-цитруллин.
[169] В некоторых вариантах осуществления линкер представляет собой пептидный линкер, содержащий, например, по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, или более аминокислот. В некоторых случаях пептидный линкер содержит не больше 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, или менее аминокислот. В дополнительных случаях пептидный линкер содержит приблизительно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, или 50 аминокислот.
[170] В некоторых вариантах осуществления линкер содержит саморасщепляющийся линкерный фрагмент. В некоторых вариантах осуществления саморасщепляющийся линкерный фрагмент включает п-аминобензиловый спирт (PAB), п-аминобензилоксикарбонил (PABC) или их производные или аналоги. В некоторых вариантах осуществления линкер содержит дипептидный линкерный фрагмент и саморасщепляющийся линкерный фрагмент. В некоторых вариантах осуществления саморасщепляющийся линкерный фрагмент является таким, как описано в патенте США № 9089614 и заявке согласно WIPO № WO2015038426.
[171] В некоторых вариантах осуществления расщепляемый линкер представляет собой глюкуронид. В некоторых вариантах осуществления расщепляемый линкер представляет собой расщепляемый кислотой линкер. В некоторых вариантах осуществления расщепляемый кислотой линкер представляет собой гидразин. В некоторых вариантах осуществления расщепляемый линкер представляет собой восстанавливаемый линкер.
[172] В некоторых вариантах осуществления линкер содержит малеимидную группу. В некоторых случаях малеимидную группу также называют малеимидным спейсером. В некоторых случаях малеимидная группа дополнительно содержит капроновую кислоту, образующую малеимидокапроил (mc). В некоторых случаях линкер содержит малеимидокапроил (mc). В некоторых случаях линкер представляет собой малеимидокапроил (mc). В других случаях малеимидная группа включает малеимидометильную группу, такую как сукцинимидил-4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат (sMCC) или сульфосукцинимидил-4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат (сульфо-sMCC), описанные выше.
[173] В некоторых вариантах осуществления малеимидная группа представляет собой самостабилизирующийся малеимид. В некоторых случаях в самостабилизирующемся малеимиде применяется диаминопропионовая кислота (DPR) для встраивания основной аминогруппы, смежной с малеимидом, для обеспечения внутримолекулярного катализа гидролиза тиосукцинимидного кольца, тем самым устраняя малеимид в ходе реакции элиминирования посредством обратной реакции Михаэля. В некоторых случаях самостабилизирующийся малеимид представляет собой малеимидную группу, описанную в Lyon, et al., "Self-hydrolyzing maleimides improve the stability and pharmacological properties of antibody-drug conjugates," Nat. Biotechnol. 32(10):1059-1062 (2014). В некоторых случаях линкер содержит самостабилизирующийся малеимид. В некоторых случаях линкер представляет собой самостабилизирующийся малеимид.
Химия конъюгации
[174] Различные реакции конъюгации применяются для конъюгации линкеров, конъюгирующих фрагментов и неприродных аминокислот, встроенных в полипептиды IL-15, описанные в данном документе. Такие реакции конъюгации часто совместимы с водными условиями, такие как "биоортогональные" реакции. В некоторых вариантах осуществления реакции конъюгации опосредуются химическими реагентами, такими как катализаторы, свет или реакционноспособные химические группы, обнаруженные на линкерах, конъюгирующих фрагментах или в неприродных аминокислотах. В некоторых вариантах осуществления реакции конъюгации опосредуются ферментами. В некоторых вариантах осуществления применяемая в данном документе реакция конъюгации описана в Gong, Y., Pan, L. Tett. Lett. 2015, 56, 2123. В некоторых вариантах осуществления применяемая в данном документе реакция конъюгации описана в Chen, X.; Wu. Y-W. Org. Biomol. Chem. 2016, 14, 5417.
[175] В некоторых вариантах осуществления, описанных в данном документе, реакция конъюгации включает реакцию кетона или альдегида с нуклеофилом. В некоторых вариантах осуществления реакция конъюгации включает реакцию кетона с аминооксигруппой с образованием оксима. В некоторых вариантах осуществления реакция конъюгации включает реакцию кетона с арильной или гетероариламиногруппой с образованием имина. В некоторых вариантах осуществления реакция конъюгации включает реакцию альдегида с арильной или гетероариламиногруппой с образованием имина. В некоторых вариантах осуществления описанная в данном документе реакция конъюгации приводит к получению полипептида IL-15, содержащего линкер или конъюгирующий фрагмент, присоединенный посредством оксима. В некоторых вариантах осуществления реакция конъюгации включает реакцию Пикте-Шпенглера альдегида или кетона с нуклеофилом, представляющим собой триптамин. В некоторых вариантах осуществления реакция конъюгации включает реакцию Пикте-Шпенглера с гидразином. В некоторых вариантах осуществления реакция конъюгации включает лигирование по Пикте-Шпенглеру.
[176] В некоторых вариантах осуществления, описанных в данном документе, описанная в данном документе реакция конъюгации включает реакцию азида и фосфина (лигирование по Штаудингеру). В некоторых вариантах осуществления фосфин представляет собой арилфосфин. В некоторых вариантах осуществления арилфосфин содержит группу сложного ортоэфира. В некоторых вариантах осуществления фосфин характеризуется структурой метил-2-(дифенилфосфанил)бензоата. В некоторых вариантах осуществления описанная в данном документе реакция конъюгации приводит к получению полипептида IL-15, содержащего линкер или конъюгирующий фрагмент, присоединенный посредством ариламида. В некоторых вариантах осуществления описанная в данном документе реакция конъюгации приводит к получению полипептида IL-15, содержащего линкер или конъюгирующий фрагмент, присоединенный посредством амида.
[177] В некоторых вариантах осуществления, описанных в данном документе, описанная в данном документе реакция конъюгации включает реакцию 1,3-диполярного циклоприсоединения. В некоторых вариантах осуществления реакция 1,3-диполярного циклоприсоединения включает реакцию азида и фосфина ("клик"-реакцию). В некоторых вариантах осуществления реакция конъюгации катализируется медью. В некоторых вариантах осуществления описанная в данном документе реакция конъюгации приводит к получению полипептида IL-15, содержащего линкер или конъюгирующий фрагмент, присоединенный посредством триазола. В некоторых вариантах осуществления описанная в данном документе реакция конъюгации включает реакцию азида с напряженным олефином. В некоторых вариантах осуществления описанная в данном документе реакция конъюгации включает реакцию азида с напряженным алкином. В некоторых вариантах осуществления описанная в данном документе реакция конъюгации включает реакцию азида с циклоалкином, например, OCT, DIFO, DIFBO, DIBO, BARAC, TMTH или другим напряженным циклоалкином, структуры которого показаны в Gong, Y., Pan, L. Tett. Lett. 2015, 56, 2123. В некоторых вариантах осуществления реакция 1,3-диполярного циклоприсоединения катализируется светом ("фотоклик"). В некоторых вариантах осуществления описанная в данном документе реакция конъюгации включает реакцию концевой аллильной группы с тетразолом на свету. В некоторых вариантах осуществления описанная в данном документе реакция конъюгации включает реакцию концевой алкинильной группы с тетразолом на свету. В некоторых вариантах осуществления описанная в данном документе реакция конъюгации включает реакцию O-аллиламинокислоты с тетразином на свету. В некоторых вариантах осуществления описанная в данном документе реакция конъюгации включает реакцию O-аллилтирозина с тетразином на свету.
[178] В некоторых вариантах осуществления, описанных в данном документе, описанная в данном документе реакция конъюгации включает реакцию циклоприсоединения с обращенными электронными требованиями, включающую диен и диенофил. В некоторых вариантах осуществления диен включает тетразин. В некоторых вариантах осуществления диенофил включает алкен. В некоторых вариантах осуществления диенофил включает алкин. В некоторых вариантах осуществления алкин представляет собой напряженный алкин. В некоторых вариантах осуществления алкен представляет собой напряженный диен. В некоторых вариантах осуществления алкин представляет собой транс-циклооктин. В некоторых вариантах осуществления алкин представляет собой циклооктен. В некоторых вариантах осуществления алкен представляет собой циклопропен. В некоторых вариантах осуществления алкен представляет собой фторциклопропен. В некоторых вариантах осуществления описанная в данном документе реакция конъюгации приводит к образованию полипептида IL-15, присоединенного к линкеру или конъюгирующему фрагменту посредством 6-членного кольцевого гетероцикла, содержащего два атома азота в кольце.
[179] В некоторых вариантах осуществления, описанных в данном документе, описанная в данном документе реакция конъюгации включает реакцию метатезиса олефинов. В некоторых вариантах осуществления описанная в данном документе реакция конъюгации включает реакцию алкена и алкина с рутениевым катализатором. В некоторых вариантах осуществления описанная в данном документе реакция конъюгации включает реакцию двух алкенов с рутениевым катализатором. В некоторых вариантах осуществления описанная в данном документе реакция конъюгации включает реакцию двух алкинов с рутениевым катализатором. В некоторых вариантах осуществления описанная в данном документе реакция конъюгации включает реакцию алкена или алкина с рутениевым катализатором и аминокислотой, содержащей аллильную группу. В некоторых вариантах осуществления описанная в данном документе реакция конъюгации включает реакцию алкена или алкина с рутениевым катализатором и аминокислотой, содержащей аллилсульфид или селенид. В некоторых вариантах осуществления рутениевый катализатор представляет собой катализатор Ховейды-Граббса 2-го поколения. В некоторых вариантах осуществления реакция метатезиса олефинов включает реакцию одного или нескольких напряженных алкенов или алкинов.
[180] В некоторых вариантах осуществления, описанных в данном документе, описанная в данном документе реакция конъюгации включает реакцию (4+2+ циклоприсоединения с алкеном.
[181] В некоторых вариантах осуществления, описанных в данном документе, описанная в данном документе реакция конъюгации включает реакцию кросс-сочетания. В некоторых вариантах осуществления реакции кросс-сочетания включают катализаторы на основе переходных металлов, таких как иридий, золото, рутений, родий, палладий, никель, платина, или катализатор на основе другого переходного металла, и один или несколько лигандов. В некоторых вариантах осуществления катализаторы на основе переходных металлов являются водорастворимыми. В некоторых вариантах осуществления, описанных в данном документе, описанная в данном документе реакция конъюгации включает реакцию кросс-сочетания Сузуки-Мияуры. В некоторых вариантах осуществления, описанных в данном документе, описанная в данном документе реакция конъюгации включает реакцию арилгалогенида (или трифлата, или тозилата), арил- или алкенилбороновой кислоты и палладиевого катализатора. В некоторых вариантах осуществления, описанных в данном документе, описанная в данном документе реакция конъюгации включает реакцию кросс-сочетания Соногаширы. В некоторых вариантах осуществления, описанных в данном документе, описанная в данном документе реакция конъюгации включает реакцию арилгалогенида (или трифлата, или тозилата), алкина и палладиевого катализатора. В некоторых вариантах осуществления реакции кросс-сочетания приводят к присоединению линкера или конъюгирующего фрагмента к полипептиду IL-15 посредством углерод-углеродной связи.
[182] В некоторых вариантах осуществления, описанных в данном документе, описанная в данном документе реакция конъюгации включает реакцию снятия защиты или "освобождения" реакционноспособной группы перед конъюгацией. В некоторых вариантах осуществления описанная в данном документе реакция конъюгации включает освобождение реакционноспособной группы с помощью света с последующей реакцией конъюгации. В некоторых вариантах осуществления реакционноспособная группа защищена аралкильным фрагментом, содержащим одну или несколько нитрогрупп. В некоторых вариантах осуществления освобождение реакционноспособной группы приводит к образованию свободного амина, сульфида или другой реакционноспособной группы. В некоторых вариантах осуществления описанная в данном документе реакция конъюгации включает освобождение реакционноспособной группы с помощью катализатора на основе переходного металла с последующей реакцией конъюгации. В некоторых вариантах осуществления катализатор на основе переходного металла содержит палладий и один или несколько лигандов. В некоторых вариантах осуществления реакционноспособная группа защищена аллильным фрагментом. В некоторых вариантах осуществления реакционноспособная группа защищена аллильным карбаматом. В некоторых вариантах осуществления реакционноспособная группа защищена пропаргильным фрагментом. В некоторых вариантах осуществления реакционноспособная группа защищена пропаргилкарбаматом. В некоторых вариантах осуществления реакционноспособная группа защищена диенофилом, где воздействие диена (такого как тетразин) приводит к снятию защиты с реакционноспособной группы.
[183] В некоторых вариантах осуществления, описанных в данном документе, описанная в данном документе реакция конъюгации включает лиганд-направленную реакцию, где лиганд (необязательно), присоединенный к реакционноспособной группе), обеспечивает сайт конъюгации между реакционноспособной группой и полипептидом IL-15. В некоторых вариантах осуществления лиганд отщепляется в ходе или после реакции полипептида IL-15 с реакционноспособной группой. В некоторых вариантах осуществления сайт конъюгации полипептида IL-15 представляет собой природную аминокислоту. В некоторых вариантах осуществления сайт конъюгации полипептида IL-15 представляет собой лизин, цистеин или серин. В некоторых вариантах осуществления сайт конъюгации полипептида IL-15 представляет собой неприродную аминокислоту, описанную в данном документе. В некоторых вариантах осуществления реакционноспособная группа включает уходящую группу, такую как бедная электронами арильная или гетероарильная группа. В некоторых вариантах осуществления реакционноспособная группа включает уходящую группу, такую как бедная электронами алкильная группа, которая замещается полипептидом IL-15. В некоторых вариантах осуществления описанная в данном документе реакция конъюгации включает реакцию улавливающего радикалы средства с химическим радикалом. В некоторых вариантах осуществления описанная в данном документе реакция конъюгации включает реакцию присоединения окислительного радикала. В некоторых вариантах осуществления улавливающее радикалы средство представляет собой ариламин. В некоторых вариантах осуществления химический радикал представляет собой тирозильный радикал. В некоторых вариантах осуществления химические радикалы генерируются рутениевым катализатором (таким как [Ru(bpy)3]) и светом.
[184] Ферментативные реакции необязательно применяются для описанных в данном документе реакций конъюгации. Примеры ферментативных конъюгаций включают конъюгацию, опосредованную SortA, конъюгацию, опосредованную TG, или конъюгацию, опосредованную FGE. В некоторых вариантах осуществления описанная в данном документе реакция конъюгации включает лигирование нативного белка (NPL) по концевой 1-амино-2-тиогруппе с тиоэфиром с образованием амидной связи.
[185] В данном документе описаны различные реакции конъюгации для осуществления реакции линкера или конъюгирующего фрагмента с полипептидом IL-15, где реакция происходит с природной ("канонической") аминокислотой в полипептиде IL-15. В некоторых вариантах осуществления природная аминокислота обнаруживается в положении конъюгации, находящемся в последовательности дикого типа, или, в качестве альтернативы, положение было мутировано. В некоторых вариантах осуществления реакция конъюгации включает образование дисульфидной связи в остатке IL-15. В некоторых вариантах осуществления реакция конъюгации включает реакцию Михаэля 1,4-присоединения цистеина или лизина. В некоторых вариантах осуществления реакция конъюгации включает лигирование цианобензотиазола с IL-15. В некоторых вариантах осуществления реакция конъюгации включает сшивание с ацетоновым фрагментом, таким как 1,3-дихлор-2-пропионон. В некоторых вариантах осуществления реакция конъюгации включает 1,4-присоединение по Михаэлю к дегидроаланину, образованному в реакции цистеина с O-мезитиленсульфонилгидроксиламином. В некоторых вариантах осуществления реакция конъюгации включает реакцию тирозина с триазолиндионом (TAD) или производным TAD. В некоторых вариантах осуществления реакция конъюгации включает реакцию триптофана с карбеноидом родия.
Способы применения
Пролиферативные заболевания или состояния
[186] В некоторых вариантах осуществления в данном документе описан способ лечения пролиферативного заболевания или состояния у субъекта, нуждающегося в этом, который включает введение субъекту терапевтически эффективного количества конъюгата IL-15, описанного в данном документе. В некоторых вариантах осуществления конъюгат IL-15 содержит выделенный и очищенный полипептид IL-15 и конъюгирующий фрагмент, где конъюгат IL-15 характеризуется пониженной аффинностью к субъединице α-рецептора IL-15 (IL-15Rα) по сравнению с полипептидом IL-15 дикого типа. В некоторых вариантах осуществления конъюгат IL-15 содержит выделенный и очищенный полипептид IL-15 и конъюгирующий фрагмент, который связывается с выделенным и очищенным полипептидом IL-15 в аминокислотном положении, выбранном из N1, W2, V3, N4, I6, S7, D8, K10, K11, E13, D14, L15, Q17, S18, M19, H20, I21, D22, A23, T24, L25, Y26, T27, E28, S29, D30, V31, H32, P33, S34, C35, K36, V37, T38, A39, K41, L44, L45, E46, Q48, V49, S51, L52, E53, S54, G55, D56, A57, S58, H60, D61, T62, V63, E64, N65, I67, I68, L69, N71, N72, S73, L74, S75, S76, N77, G78, N79, V80, T81, E82, S83, G84, C85, K86, E87, C88, E89, E90, L91, E92, E93, K94, N95, I96, K97, E98, L100, Q101, S102, V104, H105, Q108, M109, F110, I111, N112, T113, и S114, где нумерация аминокислотных остатков соответствует SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления конъюгат IL-15 содержит выделенный и очищенный полипептид IL-15 и конъюгирующий фрагмент, который связывается с выделенным и очищенным полипептидом IL-15 в аминокислотном положении, выбранном из N1, W2, V3, N4, I6, S7, D8, K10, K11, E13, D14, L15, Q17, S18, M19, H20, I21, D22, A23, T24, L25, Y26, E28, S29, D30, V31, H32, P33, S34, C35, K36, V37, T38, K41, L44, E46, Q48, V49, S51, L52, E53, S54, G55, D56, A57, S58, H60, D61, T62, V63, E64, N65, I67, I68, L69, N71, N72, S73, L74, S75, S76, N77, G78, N79, V80, T81, E82, S83, G84, C85, K86, E87, C88, E89, E90, L91, E92, E93, K94, N95, I96, K97, E98, L100, Q101, S102, V104, H105, Q108, M109, F110, I111, N112, T113, и S114.
[187] В некоторых вариантах осуществления конъюгат IL-15 предпочтительно взаимодействует с субъединицами IL-15Rβ и IL-15Rβγ с образованием комплекса IL-15/IL-15Rβγ. В некоторых вариантах осуществления комплекс IL-15/IL-15Rβγ стимулирует и/или усиливает размножение Teff-клеток (например, CD8+ Teff-клеток) и/или NK-клеток. В дополнительных случаях размножение Teff-клеток сдвигает соотношение Teff:Treg в сторону популяции Teff.
[188] В некоторых вариантах осуществления пролиферативное заболевание или состояние представляет собой рак. В некоторых вариантах осуществления рак представляет собой солидную опухоль. В некоторых вариантах осуществления описанный в данном документе конъюгат IL-15 вводят субъекту, нуждающемуся в этом, для лечения солидной опухоли. В таких случаях у субъекта имеется рак мочевого пузыря, рак кости, рак головного мозга, рак молочной железы, колоректальный рак, рак пищевода, рак глаза, рак головы и шеи, рак почки, рак легкого, меланома, рак яичника, рак поджелудочной железы или рак предстательной железы. В некоторых вариантах осуществления конъюгат IL-15 вводят субъекту для лечения рака мочевого пузыря. В некоторых вариантах осуществления конъюгат IL-15 вводят субъекту для лечения рака молочной железы. В некоторых вариантах осуществления конъюгат IL-15 вводят субъекту для лечения колоректального рака. В некоторых вариантах осуществления конъюгат IL-15 вводят субъекту для лечения рака пищевода. В некоторых вариантах осуществления конъюгат IL-15 вводят субъекту для лечения рака головы и шеи. В некоторых вариантах осуществления конъюгат IL-15 вводят субъекту для лечения рака почки. В некоторых вариантах осуществления конъюгат IL-15 вводят субъекту для лечения рака легкого. В некоторых вариантах осуществления конъюгат IL-15 вводят субъекту для лечения меланомы. В некоторых вариантах осуществления конъюгат IL-15 вводят субъекту для лечения рака яичника. В некоторых вариантах осуществления конъюгат IL-15 вводят субъекту для лечения рака поджелудочной железы. В некоторых вариантах осуществления конъюгат IL-15 вводят субъекту для лечения рака предстательной железы. В некоторых вариантах осуществления конъюгат IL-15 вводят субъекту для лечения метастатического рака. В дополнительных случаях конъюгат IL-15 вводят субъекту для лечения рецидивирующего или рефрактерного рака.
[189] В некоторых вариантах осуществления рак представляет собой гематологическое злокачественное новообразование. В некоторых вариантах осуществления описанный в данном документе конъюгат IL-15 вводят субъекту, нуждающемуся в этом, для лечения гематологического злокачественного новообразования. В некоторых вариантах осуществления у субъекта имеется хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL), мелкоклеточная лимфоцитарная лимфома (SLL), фолликулярная лимфома (FL), диффузная крупноклеточная B-клеточная лимфома (DLBCL), лимфома из клеток мантийной зоны (MCL), макроглобулинемия Вальденстрема, множественная миелома, экстранодальная В-клеточная лимфома из клеток краевой зоны, нодальная В-клеточная лимфома из клеток краевой зоны, лимфома Беркитта, В-клеточная неберкиттовская лимфома высокой степени злокачественности, первичная медиастинальная B-клеточная лимфома (PMBL), иммунобластная крупноклеточная лимфома, В-лимфобластная лимфома из клеток-предшественников, пролимфоцитарный В-клеточный лейкоз, лимфоплазмоцитарная лимфома, лимфома из клеток краевой зоны селезенки, плазмоклеточная миелома, плазмоцитома, медиастинальная (тимическая) крупноклеточная В-клеточная лимфома, внутрисосудистая крупноклеточная В-клеточная лимфома, первичная эффузионная лимфома или лимфоматоидный гранулематоз. В некоторых вариантах осуществления конъюгат IL-15 вводят субъекту для лечения CLL. В некоторых вариантах осуществления конъюгат IL-15 вводят субъекту для лечения SLL. В некоторых вариантах осуществления конъюгат IL-15 вводят субъекту для лечения FL. В некоторых вариантах осуществления конъюгат IL-15 вводят субъекту для лечения DLBCL. В некоторых вариантах осуществления конъюгат IL-15 вводят субъекту для лечения MCL. В некоторых вариантах осуществления конъюгат IL-15 вводят субъекту для лечения макроглобулинемии Вальденстрема. В некоторых вариантах осуществления конъюгат IL-15 вводят субъекту для лечения множественной миеломы. В некоторых вариантах осуществления конъюгат IL-15 вводят субъекту для лечения лимфомы Беркитта. В некоторых вариантах осуществления конъюгат IL-15 вводят субъекту для лечения метастатического гематологического злокачественного новообразования. В дополнительных случаях конъюгат IL-15 вводят субъекту для лечения рецидивирующего или рефрактерного гематологического злокачественного новообразования.
[190] В некоторых вариантах осуществления субъекту дополнительно вводят дополнительное терапевтическое средство. В некоторых вариантах осуществления дополнительное терапевтическое средство вводят одновременно с конъюгатом IL-15. В других случаях дополнительное терапевтическое средство и конъюгат IL-15 вводят последовательно, например, конъюгат IL-15 вводят перед дополнительным терапевтическим средством или конъюгат IL-15 вводят после введения дополнительного терапевтического средства.
[191] В некоторых вариантах осуществления дополнительное терапевтическое средство включает химиотерапевтическое средство, иммунотерапевтическое средство, направленную терапию, лучевую терапию или их комбинацию. Иллюстративные дополнительные терапевтические средства включают без ограничения алкилирующие средства, такие как альтретамин, бусульфан, карбоплатин, кармустин, хлорамбуцил, цисплатин, циклофосфамид, дакарбазин, ломустин, мелфалан, оксалаплатин, темозоломид или тиотепа; антиметаболиты, такие как 5-фторурацил (5-FU), 6-меркаптопурин (6-MP), капецитабин, цитарабин, флоксуридин, флударабин, гемцитабин, гидроксимочевина, метотрексат или пеметрексед; антрациклины, такие как даунорубицин, доксорубицин, эпирубицин или идарубицин; ингибиторы топоизомеразы I, такие как топотекан или иринотекан (СРТ-11); ингибиторы топоизомеразы II, такие как этопозид (VP-16), тенипозид или митоксантрон; ингибиторы митоза, такие как доцетаксел, эстрамустин, иксабепилон, паклитаксел, винбластин, винкристин или винорелбин; или кортикостероиды, такие как преднизон, метилпреднизолон или дексаметазон.
[192] В некоторых случаях дополнительное терапевтическое средство включает терапию первой линии. Применяемый в данном документе термин "терапия первой линии" включает первичное лечение субъекта с раком. В некоторых случаях рак представляет собой первичный или местнораспространенный рак. В других случаях рак представляет собой метастатический или рецидивирующий рак. В некоторых случаях терапия первой линии включает химиотерапию. В других случаях лечение первой линии включает иммунотерапию, направленную терапию или лучевую терапию. Квалифицированный специалист легко поймет, что различные способы лечения первой линии могут быть применимы к различным типам рака.
[193] В некоторых вариантах осуществления конъюгат IL-15 вводят с дополнительным терапевтическим средством, выбранным из алкилирующего средства, такого как альтретамин, бусульфан, карбоплатин, кармустин, хлорамбуцил, цисплатин, циклофосфамид, дакарбазин, ломустин, мелфалан, оксалаплатин, темозоломид или тиотепа; антиметаболита, такого как 5-фторурацил (5-FU), 6-меркаптопурин (6-MP), капецитабин, цитарабин, флоксуридин, флударабин, гемцитабин, гидроксимочевина, метотрексат или пеметрексед; антрациклина, такого как даунорубицин, доксорубицин, эпирубицин или идарубицин; ингибитора топоизомеразы I, такого как топотекан или иринотекан (СРТ-11); ингибитора топоизомеразы II, такого как этопозид (VP-16), тенипозид или митоксантрон; ингибитора митоза, такого как доцетаксел, эстрамустин, иксабепилон, паклитаксел, винбластин, винкристин или винорелбин; или кортикостероида, такого как преднизон, метилпреднизолон или дексаметазон.
[194] В некоторых случаях описанный в данном документе конъюгат IL-15 вводят с ингибитором фермента поли-АДФ-рибозополимеразы (PARP). Иллюстративные ингибиторы PARP включают без ограничения олапариб (AZD-2281, Lynparza®, от Astra Zeneca), рукапариб (PF-01367338, Rubraca®, от Clovis Oncology), нирапариб (MK-4827, Zejula®, от Tesaro), талазопариб (BMN-673, от BioMarin Pharmaceutical Inc.), велипариб (ABT-888, от AbbVie), CK-102 (ранее CEP 9722, от Teva Pharmaceutical Industries Ltd.), E7016 (от Eisai), инипариб (BSI 201, от Sanofi) и памипариб (BGB-290, от BeiGene). В некоторых случаях конъюгат IL-15 вводят в комбинации с ингибитором PARP, таким как олапариб, рукапариб, нирапариб, талазопариб, велипариб, СК-102, E7016, инипариб или памипариб.
[195] В некоторых вариантах осуществления описанный в данном документе конъюгат IL-15 вводят с ингибитором тирозинкиназы (TKI). Иллюстративные TKI включают без ограничения афатиниб, алектиниб, акситиниб, босутиниб, кабозантиниб, церитиниб, кобиметиниб, кризотиниб, дабрафениб, дазатиниб, эрлотиниб, гефитиниб, ибрутиниб, иматиниб, лапатиниб, ленватиниб, нилотиниб, нинтеданиб, осимертиниб, пазопаниб, понатиниб, регорафениб, руксолитиниб, сорафениб, сунитиниб, тофацитиниб и вандетаниб.
[196] В некоторых случаях описанный в данном документе конъюгат IL-15 вводят с модулятором контрольной точки иммунного ответа. Иллюстративные модуляторы контрольных точек включают:
[197] модуляторы PD-L1, такие как MPDL3280A (RG7446) от Genentech, авелумаб (Bavencio) от Merck/Pfizer, дурвалумаб (Imfinzi) от AstraZeneca, клон 10F.9G2 антитела к PD-L1 мыши (номер по каталогу BE0101) от BioXcell, моноклональное антитело MDX-1105 (BMS-936559), BMS-935559 и BMS-986192 к PD-L1 от Bristol-Myer's Squibb, MSB0010718C, мышиный клон 29E.2A3 к PD-L1, CX-072 от XytomX Therapeutics, FAZ053 от Novartis Pharmaceuticals, KN035 от 3D Medicine, LY3300054 от Eli Lilly и MEDI4736 от AstraZeneca;
[198] модуляторы PD-L2, такие как AMP-224 (амплиммун) от GlaxoSmithKline и rHIgM12B7;
[199] модуляторы PD-1, такие как клон J43 антитела к мышиному PD-1 (номер по каталогу BE0033-2) от BioXcell, клон RMP1-14 антитела к мышиному PD-1 (номер по каталогу BE0146) от BioXcell, клон EH12 антитела к мышиному PD-1, антитело MK-3475 к мышиному PD-1 (Keytruda, пембролизумаб, ламбролизумаб) от Merck, антитело к PD-1 от AnaptysBio, известное как ANB011, антитело MDX-1 106 (ONO-4538), моноклональное антитело ниволумаб на основе человеческого IgG4 (Opdivo®, BMS-936558, MDX1106) от Bristol-Myers Squibb, AMP-514 и AMP-224 от AstraZeneca, синтилимаб (IBI-308) от Eli Lilly/Innovent Biologics, AGEN 2034 от Agenus, BGB-A317 от BeiGene, Bl-754091 от Boehringer-Ingelheim Pharmaceuticals, CBT-501 (генолимзумаб) от CBT Pharmaceuticals, INCSHR1210 от Incyte, JNJ-63723283 от Janssen Research & Development, MEDI0680 от MedImmune, PDR001 от Novartis Pharmaceuticals, PF-06801591 от Pfizer, REGN2810 от Regeneron Pharmaceuticals и пидилизумаб (CT-011) от CureTech Ltd;
[200] модуляторы CTLA-4, такие как антитело ипилимумаб к CTLA-4 (также известное как Yervoy®, MDX-010, BMS-734016 и MDX-101) от Bristol Myers Squibb, клон 9H10 антитела к CTLA4 от Millipore, тремелимумаб (CP-675,206, тицилимумаб) от Pfizer, AGEN 1884 от Agenus и клон BNI3 антитела к CTLA4 от Abcam;
[201] модуляторы LAG3, такие как клон eBioC9B7W антитела к Lag-3 (C9B7W) от eBioscience, антитело LS-B2237 к Lag3 от LifeSpan Biosciences, IMP701 и LAG525 от Novartis Pharmaceuticals, IMP321 (ImmuFact) от Immutep, антитело BMS-986016 к Lag3, BMS-986016 от Bristol-Myers Squibb, REGN3767 от Regeneron Pharmaceuticals и химерное антитело A9H12 к LAG-3;
[202] модуляторы B7-H3, такие как MGA271;
[203] модуляторы KIR, такие как лирилумаб (IPH2101) от Bristol-Myers Squibb;
[204] модуляторы CD137, такие как урелумаб (BMS-663513, Bristol-Myers Squibb), PF-05082566 (к 4-1BB, PF-2566, Pfizer) или XmAb-5592 (Xencor);
[205] модуляторы PS, такие как бавитуксимаб;
[206] модуляторы OX40, такие как BMS-986178 от Bristol-Myers Squibb, GSK3174998 от GlaxoSmithKline, INCAGN1949 от Agenus, MEDI0562 от MedImmune, PF-04518600 от Pfizer или RG7888 от Genentech;
[207] модуляторы GITR, такие как GWN323 от Novartis Pharmaceuticals, INCAGN1876 от Agenus или TRX518 от Leap Therapeutics;
[208] модуляторы TIM3, такие как MBG453 от Novartis Pharmaceuticals или TSR-042 от TESARO;
[209] и модуляторы, такие как антитело или его фрагменты (например, моноклональное антитело, человеческое, гуманизированное или химерное антитело), молекулы для RNAi или небольшие молекулы к CD52, CD30, CD20, CD33, CD27, ICOS, BTLA (CD272), CD160, 2B4, LAIR1, TIGHT, LIGHT, DR3, CD226, CD2 или SLAM.
[210] В некоторых случаях конъюгат IL-15 вводят в комбинации с пембролизумабом, ниволумабом, тремелимумабом или ипилимумабом.
[211] В некоторых случаях описанный в данном документе конъюгат IL-15 вводят с антителом, таким как алемтузумаб, трастузумаб, ибритумомаб тиуксетан, брентуксимаб ведотин, адо-трастузумаб эмтанзин или блинатумомаб.
[212] В некоторых случаях конъюгат IL-15 вводят с дополнительным терапевтическим средством, выбранным из антитела к VEGFR. Иллюстративные антитела к VEGFR включают без ограничения бевацизумаб или рамуцирумаб. В некоторых случаях конъюгат IL-15 усиливает ADCC-эффект дополнительного терапевтического средства.
[213] В некоторых случаях конъюгат IL-15 вводят с дополнительным терапевтическим средством, выбранным из цетуксимаба, имгатузумаба, матузумаба (EMD 72000), томузотуксимаба или панитумумаба. В некоторых случаях конъюгат IL-15 усиливает ADCC-эффект дополнительного терапевтического средства.
[214] В некоторых случаях конъюгат IL-15 вводят с дополнительным терапевтическим средством, выбранным из дополнительного цитокина (например, либо нативного цитокина, либо сконструированного цитокина, такого как пегилированный и/или слитый цитокин). В некоторых случаях дополнительный цитокин усиливает и/или синергизирует размножение и/или пролиферацию эффекторных Т-клеток. В некоторых случаях дополнительный цитокин включает IL-1β, IL-2, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, IL-18, IL-21 или TNFα. В некоторых случаях дополнительный цитокин представляет собой IL-2. В некоторых случаях дополнительный цитокин представляет собой IL-21. В некоторых случаях дополнительный цитокин представляет собой IL-10. В некоторых случаях дополнительный цитокин представляет собой TNFα.
[215] В некоторых случаях конъюгат IL-15 вводят с дополнительным терапевтическим средством, выбранным из агониста рецептора. В некоторых случаях агонист рецептора включает лиганд Toll-подобного рецептора (TLR). В некоторых случаях лиганд TLR включает TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8 или TLR9. В некоторых случаях лиганд TLR включает синтетический лиганд, такой как, например, Pam3Cys, CFA, MALP2, Pam2Cys, FSL-1, Hib-OMPC, поли I:C, поли A:U, AGP, MPL A, RC-529, MDF2β, CFA или флагеллин. В некоторых случаях конъюгат IL-21 вводят с одним или несколькими агонистами TLR, выбранными из TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8 и TLR9. В некоторых случаях конъюгат IL-15 вводят с одним или несколькими агонистами TLR, выбранными из Pam3Cys, CFA, MALP2, Pam2Cys, FSL-1, Hib-OMPC, поли I:C, поли A:U, AGP, MPL A, RC-529, MDF2β, CFA и флагеллина.
[216] В некоторых вариантах осуществления описанный в данном документе конъюгат IL-15 применяют в сочетании с терапией, заключающейся в адоптивном переносе Т-клеток (ACT). В одном варианте осуществления ACT включает идентификацию аутологичных Т-лимфоцитов у субъекта, например, с противоопухолевой активностью, размножение аутологичных Т-лимфоцитов in vitro и последующую реинфузию размноженных Т-лимфоцитов субъекту. В другом варианте осуществления ACT включает применение аллогенных Т-лимфоцитов, например, с противоопухолевой активностью, размножение Т-лимфоцитов in vitro и последующую инфузию размноженных аллогенных Т-лимфоцитов субъекту, нуждающемуся в этом. В некоторых вариантах осуществления описанный в данном документе конъюгат IL-15 применяют в сочетании с аутологичными Т-лимфоцитами в качестве части ACT-терапии. В других случаях описанный в данном документе конъюгат IL-15 применяют в сочетании с аллогенными Т-лимфоцитами в качестве части ACT-терапии. В некоторых вариантах осуществления конъюгат IL-15 вводят одновременно с ACT-терапией субъекту, нуждающемуся в этом. В других случаях конъюгат IL-15 вводят последовательно с АСТ-терапией субъекту, нуждающемуся в этом.
[217] В некоторых вариантах осуществления конъюгат IL-15, описанный в данном документе, применяют для ex vivo активации и/или размножения аутологичных и/или аллогенных Т-клеток при переносе. В таких случаях конъюгат IL-15 применяют для активации и/или размножения образца, содержащего аутологичные и/или аллогенные Т-клетки, и конъюгат IL-15 необязательно удаляют из образца перед введением образца субъекту, нуждающемуся в этом.
[218] В некоторых вариантах осуществления описанный в данном документе конъюгат IL-15 вводят с вакциной. В некоторых случаях конъюгат IL-21 используют в комбинации с онколитическим вирусом. В таких случаях конъюгат IL-21 действует как стимулирующее средство для модуляции иммунного ответа. В некоторых случаях конъюгат IL-21 применяют с онколитическим вирусом в качестве части адъювантной терапии. Иллюстративные онколитические вирусы включают T-Vec (Amgen), G47Δ (Todo et al.), JX-594 (Sillajen), CG0070 (Cold Genesys) и реолизин (Oncolytics Biotech). В некоторых случаях конъюгат IL-21 применяют в комбинации с онколитическим вирусом, таким как T-Vec, G47Δ, JX-594, CG0070 или реолизин.
[219] В некоторых вариантах осуществления конъюгат IL-15 вводят в комбинации с лучевой терапией.
Способы размножения популяций клеток
[220] В некоторых вариантах осуществления в данном документе дополнительно описаны способы размножения популяций лимфоцитов, например, популяций эффекторных Т-клеток (Teff), Т-клеток памяти (Tmem) и/или клеток, являющихся естественными киллерами (NK). В некоторых вариантах осуществления способ включает приведение в контакт клетки с конъюгатом цитокина, описанным в данном документе, и взаимодействие цитокина с рецептором цитокина с образованием комплекса, где комплекс стимулирует размножение отдельной популяции лимфоцитов.
[221] В некоторых вариантах осуществления способ размножения популяций эффекторных T-клеток (Teff), T-клеток памяти (Tmem) и/или клеток, являющихся естественными киллерами (NK), включает: (a) приведение клетки в контакт с модифицированным полипептидом IL-15 или конъюгатом IL-15; и взаимодействие IL-15 с субъединицами IL-15Rβ и IL-15Rγ с образованием комплекса IL-15/IL-15Rβγ; где конъюгат IL-15 характеризуется пониженной аффинностью к субъединице IL-15Rα, и где комплекс IL-15/IL-15Rβγ стимулирует размножение Teff-, Tmem- и NK-клеток. Как описано в данном документе, в некоторых вариантах осуществления модифицированный полипептид IL-15 содержит по меньшей мере одну посттрансляционно модифицированную неприродную аминокислоту в положении остатка, выбранном из N1, W2, V3, N4, I6, S7, D8, K10, K11, E13, D14, L15, Q17, S18, M19, H20, I21, D22, A23, T24, L25, Y26, T27, E28, S29, D30, V31, H32, P33, S34, C35, K36, V37, T38, A39, K41, L44, L45, E46, Q48, V49, S51, L52, E53, S54, G55, D56, A57, S58, H60, D61, T62, V63, E64, N65, I67, I68, L69, N71, N72, S73, L74, S75, S76, N77, G78, N79, V80, T81, E82, S83, G84, C85, K86, E87, C88, E89, E90, L91, E92, E93, K94, N95, I96, K97, E98, L100, Q101, S102, V104, H105, Q108, M109, F110, I111, N112, T113, и S114, где положения остатка соответствуют положениям, представленным в SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления положение остатка выбрано из N1, W2, V3, N4, I6, S7, D8, K10, K11, E13, D14, L15, Q17, S18, M19, H20, I21, D22, A23, T24, L25, Y26, E28, S29, D30, V31, H32, P33, S34, C35, K36, V37, T38, K41, L44, E46, Q48, V49, S51, L52, E53, S54, G55, D56, A57, S58, H60, D61, T62, V63, E64, N65, I67, I68, L69, N71, N72, S73, L74, S75, S76, N77, G78, N79, V80, T81, E82, S83, G84, C85, K86, E87, C88, E89, E90, L91, E92, E93, K94, N95, I96, K97, E98, L100, Q101, S102, V104, H105, Q108, M109, F110, I111, N112, T113, и S114. В некоторых вариантах осуществления положение остатка выбрано из E13, D14, L15, Q17, S18, M19, H20, I21, S34, C35, K36, V37, T38, K41, L44, S51, L52, S54, G55, D56, A57, S58, H60, V63, I67, N71, S73, L74, S75, S76, N77, G78, N79, V80, T81, E82, S83, G84, C85, K86, E87, C88, L91, E92, K94, N95, I96, K97, E98, L100, Q101, и F110. В некоторых вариантах осуществления положение остатка выбрано из D14, Q17, S18, K41, S51, L52, G55, D56, A57, S58, S75, S76, N77, N79, V80, T81, S83, G84, E92, K94, N95, K97, и E98. В некоторых вариантах осуществления положение остатка выбрано из N1, N4, S7, D8, K11, D61, T62, E64, N65, I68, L69, и N72. В некоторых вариантах осуществления положение остатка выбрано из V3, I6, K10, E28, S29, D30, V31, H32, P33, S102, V104, H105, Q108, M109, I111, N112, T113, и S114. В некоторых вариантах осуществления положение остатка выбрано из D22, A23, T24, L25, Y26, L44, E46, Q48, V49, E53, E89, E90, и E93. В некоторых вариантах осуществления положение остатка выбрано из Y26, E46, V49, E53 и L25. В некоторых вариантах осуществления положение остатка выбрано из V3, K10, S29, D30, H32, H105, Q108, M109, I111, N112, T113 и S114. В некоторых вариантах осуществления положение остатка выбрано из N4, S7, K11 и D61. В некоторых вариантах осуществления положение остатка выбрано из L25, E53, N77 и S83. В некоторых вариантах осуществления положение остатка выбрано из L25 и E53. В некоторых вариантах осуществления положение остатка выбрано из E46, Y26, V49, E53, T24, N4, K11, N65, L69, S18, H20 и S83. В некоторых вариантах осуществления положение остатка выбрано из E46, Y26, V49, E53 и T24. В некоторых вариантах осуществления положение остатка выбрано из E46, V49, E53 и T24. В некоторых вариантах осуществления положение остатка выбрано из Y26, V49, E53 и T24. В некоторых вариантах осуществления положение остатка выбрано из V49, E53 и T24. В некоторых вариантах осуществления положение остатка выбрано из E46 и Y26. В некоторых вариантах осуществления положение остатка представляет собой E46. В некоторых вариантах осуществления положение остатка представляет собой L25. В некоторых вариантах осуществления положение остатка представляет собой Y26. В некоторых вариантах осуществления положение остатка представляет собой V49. В некоторых вариантах осуществления положение остатка представляет собой E53. В некоторых вариантах осуществления положение остатка представляет собой T24. В некоторых вариантах осуществления положение остатка представляет собой N77. В некоторых вариантах осуществления положение остатка представляет собой S83.
[222] Способы размножения описанных в данном документе популяций эффекторных T-клеток (Teff), T-клеток памяти (Tmem) и/или клеток, являющихся естественными киллерами (NK), в некоторых вариантах осуществления включают приведение клетки в контакт с конъюгатом IL-15. Как описано в данном документе, в некоторых вариантах осуществления конъюгаты интерлейкина 15 (IL-15) содержат выделенный и очищенный полипептид IL-15; и конъюгирующий фрагмент, который связывается с выделенным и очищенным полипептидом IL-15 в аминокислотном положении, выбранном из N1, W2, V3, N4, I6, S7, D8, K10, K11, E13, D14, L15, Q17, S18, M19, H20, I21, D22, A23, T24, L25, Y26, T27, E28, S29, D30, V31, H32, P33, S34, C35, K36, V37, T38, A39, K41, L44, L45, E46, Q48, V49, S51, L52, E53, S54, G55, D56, A57, S58, H60, D61, T62, V63, E64, N65, I67, I68, L69, N71, N72, S73, L74, S75, S76, N77, G78, N79, V80, T81, E82, S83, G84, C85, K86, E87, C88, E89, E90, L91, E92, E93, K94, N95, I96, K97, E98, L100, Q101, S102, V104, H105, Q108, M109, F110, I111, N112, T113, и S114, где положения остатка соответствуют положениям, представленным в SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления положение остатка выбрано из N1, W2, V3, N4, I6, S7, D8, K10, K11, E13, D14, L15, Q17, S18, M19, H20, I21, D22, A23, T24, L25, Y26, E28, S29, D30, V31, H32, P33, S34, C35, K36, V37, T38, K41, L44, E46, Q48, V49, S51, L52, E53, S54, G55, D56, A57, S58, H60, D61, T62, V63, E64, N65, I67, I68, L69, N71, N72, S73, L74, S75, S76, N77, G78, N79, V80, T81, E82, S83, G84, C85, K86, E87, C88, E89, E90, L91, E92, E93, K94, N95, I96, K97, E98, L100, Q101, S102, V104, H105, Q108, M109, F110, I111, N112, T113, и S114. В некоторых вариантах осуществления положение остатка выбрано из E13, D14, L15, Q17, S18, M19, H20, I21, S34, C35, K36, V37, T38, K41, L44, S51, L52, S54, G55, D56, A57, S58, H60, V63, I67, N71, S73, L74, S75, S76, N77, G78, N79, V80, T81, E82, S83, G84, C85, K86, E87, C88, L91, E92, K94, N95, I96, K97, E98, L100, Q101, и F110. В некоторых вариантах осуществления положение остатка выбрано из D14, Q17, S18, K41, S51, L52, G55, D56, A57, S58, S75, S76, N77, N79, V80, T81, S83, G84, E92, K94, N95, K97, и E98. В некоторых вариантах осуществления положение остатка выбрано из N1, N4, S7, D8, K11, D61, T62, E64, N65, I68, L69, и N72. В некоторых вариантах осуществления положение остатка выбрано из V3, I6, K10, E28, S29, D30, V31, H32, P33, S102, V104, H105, Q108, M109, I111, N112, T113, и S114. В некоторых вариантах осуществления положение остатка выбрано из D22, A23, T24, L25, Y26, L44, E46, Q48, V49, E53, E89, E90, и E93. В некоторых вариантах осуществления положение остатка выбрано из Y26, E46, V49, E53 и L25. В некоторых вариантах осуществления положение остатка выбрано из V3, K10, S29, D30, H32, H105, Q108, M109, I111, N112, T113, и S114. В некоторых вариантах осуществления положение остатка выбрано из N4, S7, K11 и D61. В некоторых вариантах осуществления положение остатка выбрано из L25, E53, N77 и S83. В некоторых вариантах осуществления положение остатка выбрано из L25 и E53. В некоторых вариантах осуществления положение остатка выбрано из E46, Y26, V49, E53, T24, N4, K11, N65, L69, S18, H20, и S83. В некоторых вариантах осуществления положение остатка выбрано из E46, Y26, V49, E53 и T24. В некоторых вариантах осуществления положение остатка выбрано из E46, V49, E53 и T24. В некоторых вариантах осуществления положение остатка выбрано из Y26, V49, E53 и T24. В некоторых вариантах осуществления положение остатка выбрано из V49, E53 и T24. В некоторых вариантах осуществления положение остатка выбрано из E46 и Y26. В некоторых вариантах осуществления положение остатка представляет собой E46. В некоторых вариантах осуществления положение остатка представляет собой L25. В некоторых вариантах осуществления положение остатка представляет собой Y26. В некоторых вариантах осуществления положение остатка представляет собой V49. В некоторых вариантах осуществления положение остатка представляет собой E53. В некоторых вариантах осуществления положение остатка представляет собой T24. В некоторых вариантах осуществления положение остатка представляет собой N77. В некоторых вариантах осуществления положение остатка представляет собой S83.
Получение полипептида IL-15
[223] В некоторых вариантах осуществления полипептиды IL-15, описанные в данном документе, содержащие либо мутацию природной аминокислоты, либо мутацию неприродной аминокислоты, получают рекомбинантно или синтезируют химически. В некоторых вариантах осуществления полипептиды IL-15, описанные в данном документе, получают рекомбинантно, например, либо в системе клеток-хозяев, либо в бесклеточной системе.
[224] В некоторых вариантах осуществления полипептиды IL-15 получают рекомбинантно с применением системы клеток-хозяев. В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин представляет собой эукариотическую клетку (например, клетку млекопитающего, клетки насекомых, дрожжевые клетки или растительную клетку), прокариотическую клетку (например, грамположительную бактерию или грамотрицательную бактерию) или клетку архей. В некоторых случаях эукариотическая клетка-хозяин представляет собой клетку-хозяина млекопитающего. В некоторых случаях клетка-хозяин млекопитающего является стабильной линией клеток или линией клеток, которая содержит встроенный представляющий интерес генетический материал в свой собственный геном и обладает способностью экспрессировать продукт генетического материала после многих поколений клеточного деления. В других случаях клетка-хозяин млекопитающего представляет собой транзиентную линию клеток или линию клеток, которая не содержит встроенный представляющий интерес генетический материал в свой собственный геном и не обладает способностью экспрессировать продукт генетического материала после многих поколений клеточного деления.
[225] Иллюстративные клетки-хозяева млекопитающих включают линию клеток 293T, линию клеток 293A, линию клеток 293FT, клетки 293F, клетки 293 H, клетки A549, клетки MDCK, клетки CHO DG44, клетки CHO-S, клетки CHO-K1, клетки Expi293F™, линию клеток Flp-In™ T-REx™ 293, линию клеток Flp-In™-293, линию клеток Flp-In™-3T3, линию клеток Flp-In™-BHK, линию клеток Flp-In™-CHO, линию клеток Flp-In™-CV-1, линию клеток Flp-In™-Jurkat, клетки FreeStyle™ 293-F, клетки FreeStyle™ CHO-S, линию клеток GripTite™ 293 MSR, линию клеток GS-CHO, клетки HepaRG™, линию клеток T-REx™ Jurkat, клетки Per.C6, линию клеток T-REx™-293, линию клеток T-REx™-CHO и линию клеток T-REx™-HeLa.
[226] В некоторых вариантах осуществления эукариотическая клетка-хозяин представляет собой клетку-хозяина насекомого. Иллюстративная клетка-хозяин насекомого включает клетки S2 Drosophila, клетки Sf9, клетки Sf21, клетки High Five™ и клетки expresSF+®.
[227] В некоторых вариантах осуществления эукариотическая клетка-хозяин представляет собой дрожжевую клетку-хозяина. Иллюстративные дрожжевые клетки-хозяева включают такие штаммы дрожжей Pichia pastoris, как GS115, KM71H, SMD1168, SMD1168H и X-33, и такой штамм дрожжей Saccharomyces cerevisiae, как INVSc1.
[228] В некоторых вариантах осуществления эукариотическая клетка-хозяин представляет собой растительную клетку-хозяина. В некоторых вариантах осуществления растительные клетки включают клетку водоросли. Иллюстративные линии растительных клеток включают штаммы из Chlamydomonas reinhardtii 137c или Synechococcus elongatus PPC 7942.
[229] В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин представляет собой прокариотическую клетку-хозяина. Иллюстративные прокариотические клетки-хозяева включают BL21, Mach1™, DH10B™, TOP10, DH5α, DH10Bac™, OmniMax™, MegaX™, DH12S™, INV110, TOP10F', INVαF, TOP10/P3, ccdB Survival, PIR1, PIR2, Stbl2™, Stbl3™ или Stbl4™.
[230] В некоторых вариантах осуществления подходящие молекулы полинуклеиновой кислоты или векторы для получения полипептида IL-15, описанного в данном документе, включают любые подходящие векторы, полученные из либо эукариотических, либо прокариотических источников. Иллюстративные молекулы полинуклеиновой кислоты или векторы включают векторы из бактерий (например, E. coli), насекомых, дрожжей (например, Pichia pastoris), водорослей или источника, представляющего собой млекопитающее. Бактериальные векторы включают, например, pACYC177, pASK75, ряд векторов pBAD, ряд векторов pBADM, ряд векторов pET, ряд векторов pETM, ряд векторов pGEX, pHAT, pHAT2, pMal-c2, pMal-p2, ряд векторов pQE, pRSET A, pRSET B, pRSET C, ряд pTrcHis2, pZA31-Luc, pZE21-MCS-1, pFLAG ATS, pFLAG CTS, pFLAG MAC, pFLAG Shift-12c, pTAC-MAT-1, pFLAG CTC или pTAC-MAT-2.
[231] Векторы насекомых включают, например, pFastBac1, pFastBac DUAL, pFastBac ET, pFastBac HTa, pFastBac HTb, pFastBac HTc, pFastBac M30a, pFastBact M30b, pFastBac, M30c, pVL1392, pVL1393, pVL1393 M10, pVL1393 M11, pVL1393 M12, такие векторы FLAG, как pPolh-FLAG1 или pPolh-MAT 2, или такие векторы MAT, как pPolh-MAT1 или pPolh-MAT2.
[232] Дрожжевые векторы включают, например, вектор Gateway® pDEST™ 14, вектор Gateway® pDEST™ 15, вектор Gateway® pDEST™ 17, вектор Gateway® pDEST™ 24, вектор Gateway® pYES-DEST52, вектор доставки pBAD-DEST49 Gateway®, вектор pAO815 Pichia, вектор pFLD1 Pichi pastoris, вектор pGAPZA, B & C Pichia pastoris, вектор pPIC3.5K Pichia, вектор pPIC6 A, B & C Pichia, вектор pPIC9K Pichia, pTEF1/Zeo, дрожжевой вектор pYES2, дрожжевой вектор pYES2/CT, дрожжевой вектор pYES2/NT A, B & C или дрожжевой вектор pYES3/CT.
[233] Векторы водорослей включают, например, вектор pChlamy-4 или вектор MCS.
[234] Векторы млекопитающих включают, например, векторы транзиентной экспрессии или векторы стабильной экспрессии. Иллюстративные векторы транзиентной экспрессии млекопитающих включают p3xFLAG-CMV 8, pFLAG-Myc-CMV 19, pFLAG-Myc-CMV 23, pFLAG-CMV 2, pFLAG-CMV 6a, b,c, pFLAG-CMV 5.1, pFLAG-CMV 5a, b,c, p3xFLAG-CMV 7.1, pFLAG-CMV 20, p3xFLAG-Myc-CMV 24, pCMV-FLAG-MAT1, pCMV-FLAG-MAT2, pBICEP-CMV 3 или pBICEP-CMV 4. Иллюстративные векторы стабильной экспрессии млекопитающих включают pFLAG-CMV 3, p3xFLAG-CMV 9, p3xFLAG-CMV 13, pFLAG-Myc-CMV 21, p3xFLAG-Myc-CMV 25, pFLAG-CMV 4, p3xFLAG-CMV 10, p3xFLAG-CMV 14, pFLAG-Myc-CMV 22, p3xFLAG-Myc-CMV 26, pBICEP-CMV 1 или pBICEP-CMV 2.
[235] В некоторых вариантах осуществления для получения полипептида IL-15, описанного в данном документе, применяют бесклеточную систему. В некоторых вариантах осуществления бесклеточная система содержит смесь цитоплазматических и/или ядерных компонентов клетки (например, состоящую из полностью очищенных рекомбинантных компонентов или частично очищенных компонентов) и подходит для синтеза нуклеиновых кислот in vitro. В некоторых случаях в бесклеточной системе применяют компоненты прокариотических клеток. В других случаях в бесклеточной системе применяют компоненты эукариотических клеток. Синтез нуклеиновых кислот достигается в бесклеточной системе, например, на основе клетки дрозофилы, яйца Xenopus, архей или клеток HeLa. Иллюстративные бесклеточные системы включают систему на основе экстракта S30 E. coli, систему S30 E. coli T7 или PURExpress®, XpressCF и XpressCF+.
[236] Бесклеточные системы трансляции различным образом содержат такие компоненты, как плазмиды, мРНК, ДНК, тРНК, синтетазы, факторы высвобождения, рибосомы, белки-шапероны, факторы инициации и элонгации трансляции, природные и/или неприродные аминокислоты и/или другие компоненты, применяемые для экспрессии белка. Такие компоненты необязательно модифицируют для повышения выхода, увеличения скорости синтеза, повышения соответствия белкового продукта или встраивания неприродных аминокислот. В некоторых вариантах осуществления цитокины, описанные в данном документе, синтезируют с применением бесклеточных систем трансляции, описанных в US 8778631; US 2017/0283469; US 2018/0051065; US 2014/0315245; или US 8778631. В некоторых вариантах осуществления бесклеточные системы трансляции включают модифицированные факторы высвобождения или даже удаление одного или нескольких факторов высвобождения из системы. В некоторых вариантах осуществления бесклеточные системы трансляции содержат пониженную концентрацию протеазы. В некоторых вариантах осуществления бесклеточные системы трансляции содержат модифицированные тРНК с переназначенными кодонами, применяемыми для кодирования неприродных аминокислот. В некоторых вариантах осуществления синтетазы, описанные в данном документе, предназначенные для встраивания неприродных аминокислот, применяют в бесклеточных системах трансляции. В некоторых вариантах осуществления тРНК предварительно загружают неприродными аминокислотами с применением ферментативных или химических способов перед добавлением в бесклеточную систему трансляции. В некоторых вариантах осуществления компоненты для бесклеточной системы трансляции получают из модифицированных организмов, таких как модифицированные бактерии, дрожжи или другой организм.
[237] В некоторых вариантах осуществления полипептид IL-15 получают в виде циркулярно пермутированной формы либо с помощью системы экспрессии хозяина, либо с помощью бесклеточной системы.
Получение полипептида IL-15, содержащего неприродную аминокислоту
[238] В настоящем изобретении можно применять ортогональный или расширенный генетический код, в котором один или несколько конкретных кодонов, присутствующих в последовательности нуклеиновой кислоты полипептида IL-15, предназначены для кодирования неприродной аминокислоты, чтобы ее можно было генетически встроить в IL-15 с применением ортогональной пары тРНК-синтетаза/тРНК. Ортогональная пара тРНК-синтетаза/тРНК способна загружать тРНК неприродной аминокислотой и способна встраивать эту неприродную аминокислоту в полипептидную цепь в ответ на кодон.
[239] В некоторых вариантах осуществления кодон представляет собой амбер-кодон, охра-кодон, опал-кодон или квадруплетный кодон. В некоторых случаях кодон соответствует ортогональной тРНК, которая будет применяться для переноса неприродной аминокислоты. В некоторых случаях кодон представляет собой амбер-кодон. В других случаях кодон представляет собой ортогональный кодон.
[240] В некоторых случаях кодон представляет собой квадруплетный кодон, который может декодироваться ортогональной рибосомой ribo-Q1. В некоторых случаях квадруплетный кодон является таким, как показано в Neumann, et al., "Encoding multiple unnatural amino acids via evolution of a quadruplet-decoding ribosome," Nature, 464(7287): 441-444 (2010).
[241] В некоторых случаях кодон, применяемый в настоящем изобретении, представляет собой перекодированный кодон, например, синонимичный кодон или редкий кодон, который заменен альтернативным кодоном. В некоторых случаях перекодированный кодон является таким, как описано в Napolitano, et al., "Emergent rules for codon choice elucidated by editing rare arginine codons in Escherichia coli," PNAS, 113(38): E5588-5597 (2016). В некоторых случаях перекодированный кодон является таким, как описано в Ostrov et al., "Design, synthesis, and testing toward a 57-codon genome," Science 353(6301): 819-822 (2016).
[242] В некоторых вариантах осуществления используются неприродные нуклеиновые кислоты, что приводит к встраиванию одной или нескольких неприродных аминокислот в IL-15. Иллюстративные неприродные нуклеиновые кислоты включают без ограничения урацил-5-ил, гипоксантин-9-ил (I), 2-аминоаденин-9-ил, 5-метилцитозин (5-me-C), 5-гидроксиметилцитозин, ксантин, гипоксантин, 2-аминоаденин, 6-метил- и другие алкилпроизводные аденина и гуанина, 2-пропил- и другие алкилпроизводные аденина и гуанина, 2-тиоурацил, 2-тиотимин и 2-тиоцитозин, 5-галогенурацил и цитозин, 5-пропинилурацил и цитозин, 6-азоурацил, цитозин и тимин, 5-урацил (псевдоурацил), 4-тиоурацил, 8-галоген, 8-амино, 8-тиол, 8-тиоалкил, 8-гидроксил и другие 8-замещенные аденины и гуанины, 5-галоген, в частности 5-бром, 5-трифторметил и другие 5-замещенные урацилы и цитозины, 7-метилгуанин и 7-метиладенин, 8-азагуанин и 8-азааденин, 7-деазагуанин и 7-деазааденин, а также 3-деазагуанин и 3-деазааденин. Определенные неприродные нуклеиновые кислоты, такие как 5-замещенные пиримидины, 6-азапиримидины и N-2-замещенные пурины, N-6-замещенные пурины, O-6-замещенные пурины, 2-аминопропиладенин, 5-пропинилурацил, 5-пропинилцитозин, 5-метилцитозин, те, которые повышают стабильность образования дуплекса, универсальные нуклеиновые кислоты, гидрофобные нуклеиновые кислоты, разнородные нуклеиновые кислоты, нуклеиновые кислоты с увеличенным размером, фторированные нуклеиновые кислоты, 5-замещенные пиримидины, 6-азапиримидины и N-2-, N-6- и О-6-замещенные пурины, включая 2-аминопропиладенин, 5-пропинилурацил и 5-пропинилцитозин. 5-Метилцитозин (5-me-C), 5-гидроксиметилцитозин, ксантин, гипоксантин, 2-аминоаденин, 6-метил, другие алкильные производные аденина и гуанина, 2-пропил и другие алкильные производные аденина и гуанина, 2-тиоурацил, 2-тиотимин и 2-тиоцитозин, 5-галогенурацил, 5-галогенцитозин, 5-пропинил(-C≡C-CH3)-урацил, 5-пропинилцитозин, другие алкинильные производные пиримидиновых нуклеиновых кислот, 6-азоурацил, 6-азоцитозин, 6-азотимин, 5-урацил (псевдоурацил), 4-тиоурацил, 8-галоген, 8-амино, 8-тиол, 8-тиоалкил, 8-гидроксил и другие 8-замещенные аденины и гуанины, 5-галоген, в частности 5-бром, 5-трифторметил, другие 5-замещенные урацилы и цитозины, 7-метилгуанин, 7-метиладенин, 2-F-аденин, 2-аминоаденин, 8-азагуанин, 8-азааденин, 7-деазагуанин, 7-деазааденин, 3-деазагуанин, 3-деазааденин, трициклические пиримидины, феноксазинцитидин ([5,4-b][1,4]бензоксазин-2(3Н)-он), фенотиазинцитидин (1Н-пиримидо[5,4-b][1,4]бензотиазин-2(3H)-он), G-зажимы, феноксазинцитидин (например, 9-(2-аминоэтокси)-H-пиримидо[5,4-b][1,4]бензоксазин-2(3H)-он), карбазолцитидин (2H-пиримидо[4,5-b]индол-2-он), пиридоиндолцитидин (H-пиридо[3',2':4,5]пирроло[2,3-d]пиримидин-2-он), те, в которых пуриновое или пиримидиновое основание заменено другими гетероциклами, 7-деазааденин, 7-деазагуанозин, 2-аминопиридин, 2-пиридон, азацитозин, 5-бромцитозин, бромурацил, 5-хлорцитозин, хлорированный цитозин, циклоцитозин, цитозин-арабинозид, 5-фторцитозин, фторпиримидин, фторурацил, 5,6-дигидроцитозин, 5-йодоцитозин, гидроксимочевина, йодоурацил, 5-нитроцитозин, 5-бромурацил, 5-хлорурацил, 5-фторурацил и 5-йодоурацил, 2-аминоаденин, 6-тиогуанин, 2-тиотимин, 4-тиотимин, 5-пропинилурацил, 4-тиоурацил, N4-этилцитозин, 7-деазагуанин, 7-деаза-8-азагуанин, 5-гидроксицитозин, 2'-дезоксиуридин, 2-амино-2'-дезоксиаденозин и те, которые описаны в патентах США №№ 3687808; 4845205; 4910300; 4948882; 5093232; 5130302; 5134066; 5175273; 5367066; 5432272; 5457187; 5459255; 5484908; 5502177; 5525711; 5552540; 5587469; 5594121; 5596091; 5614617; 5645985; 5681941; 5750692; 5763588; 5830653 и 6005096; WO 99/62923; Kandimalla et al., (2001) Bioorg. Med. Chem. 9:807-813; The Concise Encyclopedia of Polymer Science and Engineering, Kroschwitz, J.I., Ed., John Wiley & Sons, 1990, 858-859; Englisch et al., Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613; и Sanghvi, Chapter 15, Antisense Research and Applications, Crooke and Lebleu Eds., CRC Press, 1993, 273-288. Дополнительные модификации оснований можно найти, например, в патенте США № 3687808; Englisch et al., Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613; и Sanghvi, Chapter 15, Antisense Research and Applications, страницы 289-302, Crooke and Lebleu ed., CRC Press, 1993.
[243] Неприродные нуклеиновые кислоты, содержащие различные гетероциклические основания и различные сахарные фрагменты (и аналоги сахаров), доступны в данной области техники, и нуклеиновые кислоты в некоторых случаях содержат одно или несколько гетероциклических оснований, отличных от основных пяти компонентов-оснований встречающихся в природе нуклеиновых кислот. Например, гетероциклическое основание включает в некоторых случаях урацил-5-ильные, цитозин-5-ильные, аденин-7-ильные, аденин-8-ильные, гуанин-7-ильные, гуанин-8-ильные, 4-аминопирроло[2.3-d]пиримидин-5-ильные, 2-амино-4-оксопироло[2, 3-d]пиримидин-5-ильные, 2-амино-4-оксопирроло[2.3-d]пиримидин-3-ильные группы, где пурины присоединены к сахарному фрагменту нуклеиновой кислоты через положение 9, пиримидины через положение 1, пирролопиримидины через положение 7 и пиразолопиримидины через положение 1.
[244] В некоторых вариантах осуществления аналоги нуклеотидов также модифицированы в фосфатном фрагменте. Модифицированные фосфатные фрагменты включают без ограничения фрагменты с модификацией в связи между двумя нуклеотидами и включают, например, фосфоротиоат, хиральный фосфоротиоат, фосфородитиоат, фосфотриэфир, аминоалкилфосфотриэфир, метил- и другие алкилфосфонаты, включая 3'-алкиленфосфонат и хиральные фосфонаты, фосфинаты, фосфорамидаты, включая 3'-аминофосфорамидат и аминоалкилфосфорамидаты, тионофосфорамидаты, тионоалкилфосфонаты, тионоалкилфосфотриэфиры и боранофосфаты. Следует понимать, что эти фосфатные или модифицированные фосфатные связи между двумя нуклеотидами образованы посредством 3'-5'-связи или 2'-5'-связи, и связь характеризуется инвертированной полярностью, такой как с 3'-5' на 5'-3' или с 2'-5' на 5'-2'. Также включены различные соли, смешанные соли и формы свободных кислот. Во многих патентах США описывается как получать и применять нуклеотиды, содержащие модифицированные фосфаты, и они включают без ограничения 3687808; 4469863; 4476301; 5023243; 5177196; 5188897; 5264423; 5276019; 5278302; 5286717; 5321131; 5399676; 5405939; 5453496; 5455233; 5466677; 5476925; 5519126; 5536821; 5541306; 5550111; 5563253; 5571799; 5587361 и 5625050.
[245] В некоторых вариантах осуществления неприродные нуклеиновые кислоты включают 2',3'-дидезокси-2',3'-дидегидронуклеозиды (PCT/US2002/006460), 5'-замещенные производные ДНК и РНК (PCT/US2011/033961; Saha et al., J. Org Chem., 1995, 60, 788-789; Wang et al., Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 1999, 9, 885-890; и Mikhailov et al., Nucleosides & Nucleotides, 1991, 10(1-3), 339-343; Leonid et al., 1995, 14(3-5), 901-905; и Eppacher et al., Helvetica Chimica Acta, 2004, 87, 3004-3020; PCT/JP2000/004720; PCT/JP2003/002342; PCT/JP2004/013216; PCT/JP2005/020435; PCT/JP2006/315479; PCT/JP2006/324484; PCT/JP2009/056718; PCT/JP2010/067560), или 5'-замещенные мономеры, полученные в виде монофосфата с модифицированными основаниями (Wang et al., Nucleosides Nucleotides & Nucleic Acids, 2004, 23 (1 & 2), 317-337).
[246] В некоторых вариантах осуществления неприродные нуклеиновые кислоты включают модификации в 5'-положении и 2'-положении сахарного кольца (PCT/US94/02993), например, 5'-CH2-замещенные 2'-O-защищенные нуклеозиды (Wu et al., Helvetica Chimica Acta, 2000, 83, 1127-1143 и Wu et al., Bioconjugate Chem. 1999, 10, 921-924). В некоторых случаях неприродные нуклеиновые кислоты включают нуклеозидные димеры с амидной связью, полученные для встраивания в олигонуклеотиды, где 3'-связанный нуклеозид в димере (от 5' к 3') содержит 2'-OCH3 и 5'-(S)-CH3 (Mesmaeker et al., Synlett, 1997, 1287-1290). Неприродные нуклеиновые кислоты могут содержать 2'-замещенные 5'-CH2 (или O) модифицированные нуклеозиды (PCT/US92/01020). Неприродные нуклеиновые кислоты могут включать 5'-метиленфосфонатные мономеры ДНК и РНК, а также димеры (Bohringer et al., Tet. Lett., 1993, 34, 2723-2726; Collingwood et al., Synlett, 1995, 7, 703-705; и Hutter et al., Helvetica Chimica Acta, 2002, 85, 2777-2806). Неприродные нуклеиновые кислоты могут включать 5'-фосфонатные мономеры, имеющие 2'-замещение (US2006/0074035), и другие модифицированные 5'-фосфонатные мономеры (WO1997/35869). Неприродные нуклеиновые кислоты могут включать 5'-модифицированные метиленфосфонатные мономеры (EP614907 и EP629633). Неприродные нуклеиновые кислоты могут включать аналоги 5'- или 6'-фосфонатных рибонуклеозидов, содержащие гидроксильную группу в 5'- и/или 6'-положении (Chen et al., Phosphorus, Sulfur and Silicon, 2002, 777, 1783-1786; Jung et al., Bioorg. Med. Chem., 2000, 8, 2501-2509; Gallier et al., Eur. J. Org. Chem., 2007, 925-933; и Hampton et al., J. Med. Chem., 1976, 19(8), 1029-1033). Неприродные нуклеиновые кислоты могут включать 5'-фосфонатные дезоксирибонуклеозидные мономеры и димеры, имеющие 5'-фосфатную группу (Nawrot et al., Oligonucleotides, 2006, 16(1), 68-82). Неприродные нуклеиновые кислоты могут включать нуклеозиды, имеющие 6'-фосфонатную группу, в которой 5'- или/и 6'-положение является незамещенным или замещенным тио-трет-бутильной группой (SC(CH3)3) (и ее аналогами); метиленаминогруппой (CH2NH2) (и ее аналогами) или цианогруппой (CN) (и ее аналогами) (Fairhurst et al., Synlett, 2001, 4, 467-472; Kappler et al., J. Med. Chem., 1986, 29, 1030-1038; Kappler et al., J. Med. Chem., 1982, 25, 1179-1184; Vrudhula et al., J. Med. Chem., 1987, 30, 888-894; Hampton et al., J. Med. Chem., 1976, 19, 1371-1377; Geze et al., J. Am. Chem. Soc, 1983, 105(26), 7638-7640; и Hampton et al., J. Am. Chem. Soc, 1973, 95(13), 4404-4414).
[247] В некоторых вариантах осуществления неприродные нуклеиновые кислоты также содержат модификации сахарного фрагмента. В некоторых случаях нуклеиновые кислоты содержат один или несколько нуклеозидов, где сахарная группа была модифицирована. Такие нуклеозиды с модифицированным сахаром способны придавать повышенную стабильность в отношении нуклеаз, повышенную аффинность связывания или некоторые другие полезные биологические свойства. В определенных вариантах осуществления нуклеиновые кислоты содержат химически модифицированный фрагмент рибофуранозного кольца. Примеры химически модифицированных рибофуранозных колец включают без ограничения добавление замещающих групп (включая 5'- и/или 2'-замещающие группы, соединение мостиком двух атомов кольца с образованием бициклических нуклеиновых кислот (BNA), замену атома кислорода рибозильного кольца на S, N(R) или C(R1)(R2) (R=H, C1-C12-алкил или защитную группу); и их комбинации. Примеры химически модифицированных сахаров можно найти в WO2008/101157, US2005/0130923 и WO2007/134181.
[248] В некоторых случаях модифицированная нуклеиновая кислота содержит модифицированные сахара или аналоги сахаров. Таким образом, в дополнение к рибозе и дезоксирибозе сахарный фрагмент может представлять собой пентозу, дезоксипентозу, гексозу, дезоксигексозу, глюкозу, арабинозу, ксилозу, ликсозу или циклопентильную группу, представляющую собой "аналог" сахара. Сахар может быть в пиранозильной или фуранозильной форме. Сахарный фрагмент может представлять собой фуранозид рибозы, дезоксирибозы, арабинозы или 2'-O-алкилрибозы, и сахар может быть присоединен к соответствующим гетероциклическим основаниям либо в [альфа], либо в [бета]-аномерной конфигурации. Модификации сахара включают без ограничения аналоги 2'-алкокси-РНК, аналоги 2'-амино-РНК, 2'-фтор-ДНК и 2'-алкокси- или химеры амино-РНК/ДНК. Например, модификация сахара может включать 2'-O-метилуридин или 2'-O-метилцитидин. Модификации сахара включают 2'-O-алкилзамещенные дезоксирибонуклеозиды и 2'-O-этиленгликоль-подобные рибонуклеозиды. Известно получение этих сахаров или аналогов сахаров и соответствующих "нуклеозидов", где такие сахара или аналоги присоединены к гетероциклическому основанию (основанию нуклеиновой кислоты). Модификации сахара также могут быть получены и объединены с другими модификациями.
[249] Модификации сахарного фрагмента включают природные модификации рибозы и дезоксирибозы, а также неприродные модификации. Модификации сахара включают без ограничения следующие модификации в 2'-положении: OH; F; O-, S- или N-алкил; O-, S- или N-алкенил; O-, S- или N-алкинил; или O-алкил-O-алкил, где алкил, алкенил и алкинил могут представлять собой замещенный или незамещенный C1-С10алкил или C2-С10алкенил и алкинил. 2'-Модификации сахара также включают без ограничения -O[(CH2)nO]m CH3, -O(CH2)nOCH3, -O(CH2)nNH2, -O(CH2)nCH3, -O(CH2)nONH2 и -O(CH2)nON[(CH2)n CH3)]2, где n и m равняются от 1 до приблизительно 10.
[250] Другие модификации в 2'-положении включают без ограничения низший C1-С10алкил, замещенный низший алкил, алкарил, аралкил, O-алкарил, O-аралкил, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, SOCH3, SO2 CH3, ONO2, NO2, N3, NH2, гетероциклоалкил, гетероциклоалкарил, аминоалкиламино, полиалкиламино, замещенный силил, расщепляющую РНК группу, репортерную группу, интеркалятор, группу для улучшения фармакокинетических свойств олигонуклеотида или группу для улучшения фармакодинамических свойств олигонуклеотида, а также другие заместители с аналогичными свойствами. Аналогичные модификации также могут быть осуществлены в других положениях в сахаре, в частности в 3'-положении сахара в 3'-концевом нуклеотиде или в 2'-5'-связанных олигонуклеотидах и в 5'-положении 5'-концевого нуклеотида. Модифицированные сахара также включают сахара, которые содержат модификации в мостиковом кислороде кольца, такие как CH2 и S. Нуклеотиды с аналогами сахаров также могут содержать миметики сахаров, такие как циклобутильные фрагменты вместо пентофуранозильного сахара. Существует множество патентов США, в которых описывается получение таких модифицированных структур сахаров, и в которых подробно излагается и описывается ряд модификаций оснований, например, патенты США №№ 4981957; 5118800; 5319080; 5359044; 5393878; 5446137; 5466786; 5514785; 5519134; 5567811; 5576427; 5591722; 5597909; 5610300; 5627053; 5639873; 5646265; 5658873; 5670633; 4845205; 5130302; 5134066; 5175273; 5367066; 5432272; 5,457,187; 5459255; 5484908; 5502177; 5525711; 5552540; 5587469; 5594121, 5596091; 5614617; 5681941 и 5700920, каждый из которых включен в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.
[251] Примеры нуклеиновых кислот, имеющих модифицированные сахарные фрагменты, включают без ограничения нуклеиновые кислоты, содержащие замещающие группы, представляющие собой 5'-винильную, 5'-метильную (R или S), 4'-S, 2'-F, 2'-OCH3 и 2'-O(CH2)2OCH3. Заместитель в 2'-положении также может быть выбран из аллила, амино, азидо, тио, O-аллила, O-(C1-C1Oалкила), OCF3, O(CH2)2SCH3, O(CH2)2-O-N(Rm)(Rn) и O-CH2-C(=O)-N(Rm)(Rn), где каждый Rm и Rn независимо представляет собой H или замещенный или незамещенный C1-С10алкил.
[252] В определенных вариантах осуществления нуклеиновые кислоты, описанные в данном документе, включают одну или несколько бициклических нуклеиновых кислот. В определенных таких вариантах осуществления бициклическая нуклеиновая кислота содержит мостик между 4'- и 2'-атомами рибозильного кольца. В определенных вариантах осуществления нуклеиновые кислоты, предусмотренные в данном документе, включают одну или несколько бициклических нуклеиновых кислот, где мостик содержит 4'-2'-бициклическую нуклеиновую кислоту. Примеры таких 4'-2'-бициклических нуклеиновых кислот включают без ограничения одну из формул: 4'-(CH2)-O-2' (LNA); 4'-(CH2)-S-2'; 4'-(CH2)2-O-2' (ENA); 4'-CH(CH3)-O-2' и 4'-CH(CH2OCH3)-O-2' и их аналоги (см. патент США № 7399845); 4'-C(CH3)(CH3)-O-2' и ее аналоги (см. WO2009/006478, WO2008/150729, US2004/0171570, патент США № 7427672, Chattopadhyaya et al., J. Org. Chem., 209, 74, 118-134 и WO2008/154401). Также см., например: Singh et al., Chem. Commun., 1998, 4, 455-456; Koshkin et al., Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630; Wahlestedt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 2000, 97, 5633-5638; Kumar et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1998, 8, 2219-2222; Singh et al., J. Org. Chem., 1998, 63, 10035-10039; Srivastava et al., J. Am. Chem. Soc., 2007, 129(26) 8362-8379; Elayadi et al., Curr. Opinion Invens. Drugs, 2001, 2, 558-561; Braasch et al., Chem. Biol, 2001, 8, 1-7; Oram et al., Curr. Opinion Mol. Ther., 2001, 3, 239-243; патенты США №№ 4849513; 5015733; 5118800; 5118802; 7053207; 6268490; 6770748; 6794499; 7034133; 6525191; 6670461 и 7399845; международные публикации №№ WO2004/106356, WO1994/14226, WO2005/021570, WO2007/090071 и WO2007/134181; публикации патентов США №№ US2004/0171570, US2007/0287831 и US2008/0039618; предварительные заявки на патент США №№ 60/989574, 61/026995, 61/026998, 61/056564, 61/086,231, 61/097787 и 61/099844; и международные заявки на патент №№ PCT/US2008/064591, PCT US2008/066154, PCT US2008/068922 и PCT/DK98/00393.
[253] В определенных вариантах осуществления нуклеиновые кислоты включают связанные нуклеиновые кислоты. Нуклеиновые кислоты могут быть связаны вместе с применением любой связи между нуклеиновыми кислотами. Два основных класса групп, связывающих между собой нуклеиновые кислоты, определяются наличием или отсутствием атома фосфора. Типичные фосфорсодержащие связи между нуклеиновыми кислотами включают без ограничения фосфодиэфирные, фосфотриэфирные, метилфосфонатные, фосфорамидатные и фосфоротиоатные (P=S). Типичные не содержащие фосфор группы, связывающие между собой нуклеиновые кислоты, включают без ограничения метиленметилимино (-CH2-N(CH3)-O-CH2-), тиодиэфирную (-O-C(O)-S-), тионокарбаматную (-O-C(O)(NH)-S-); силоксановую (-O-Si(H)2-O-) и N, N*-диметилгидразиновую (-CH2-N(CH3)-N(CH3)). В определенных вариантах осуществления связи между нуклеиновыми кислотами, имеющие хиральный атом, можно получать в виде рацемической смеси, в виде отдельных энантиомеров, например, алкилфосфонатов и фосфоротиоатов. Неприродные нуклеиновые кислоты могут содержать одну модификацию. Неприродные нуклеиновые кислоты могут содержать несколько модификаций в одном из фрагментов или между различными фрагментами.
[254] Модификации фосфата остова в нуклеиновой кислоте включают без ограничения метилфосфонат, фосфоротиоат, фосфорамидат (мостиковый или не мостиковый), фосфотриэфир, фосфородитиоат, фосфодитиоат и боранофосфат и могут применяться в любой комбинации. Другие нефосфатные связи также можно применять.
[255] В некоторых вариантах осуществления модификации остова (например, метилфосфонатные, фосфоротиоатные, фосфорамидатные и фосфородитиоатные межнуклеотидные связи) могут придавать иммуномодулирующую активность модифицированной нуклеиновой кислоте и/или повышать ее стабильность in vivo.
[256] В некоторых случаях производное фосфора (или модифицированная фосфатная группа) присоединена к сахару или фрагменту аналога сахара и может представлять собой монофосфат, дифосфат, трифосфат, алкилфосфонат, фосфоротиоат, фосфородитиоат, фосфорамидат или т.п. Иллюстративные полинуклеотиды, содержащие модифицированные фосфатные связи или нефосфатные связи, можно найти в Peyrottes et al., 1996, Nucleic Acids Res. 24: 1841-1848; Chaturvedi et al., 1996, Nucleic Acids Res. 24:2318-2323; и Schultz et al., (1996) Nucleic Acids Res. 24:2966-2973; Matteucci, 1997, "Oligonucleotide Analogs: an Overview" in Oligonucleotides as Therapeutic Agents, (Chadwick and Cardew, ed.) John Wiley and Sons, New York, NY; Zon, 1993, "Oligonucleoside Phosphorothioates" в Protocols for Oligonucleotides and Analogs, Synthesis and Properties, Humana Press, pp. 165-190; Miller et al., 1971, JACS 93:6657-6665; Jager et al., 1988, Biochem. 27:7247-7246; Nelson et al., 1997, JOC 62:7278-7287; патенте США № 5453496 и Micklefield, 2001, Curr. Med. Chem. 8: 1157-1179.
[257] В некоторых случаях модификация остова включает замену фосфодиэфирной связи альтернативным фрагментом, таким как анионная, нейтральная или катионная группа. Примеры таких модификаций включают анионную межнуклеозидную связь; модификацию фосфорамидата от N3' к P5'; боранофосфатную ДНК; проолигонуклеотиды; нейтральные межнуклеозидные связи, такие как метилфосфонаты; ДНК с амидной связью; метиленовые(метилимино) связи; формацетальные и тиоформацетальные связи; остовы, содержащие сульфонильные группы; морфолиновые олигонуклеотиды; пептидные нуклеиновые кислоты (PNA) и положительно заряженные дезоксирибонуклеиновые гуанидиновые (DNG) олигонуклеотиды (Micklefield, 2001, Current Medicinal Chemistry 8: 1157-1179). Модифицированная нуклеиновая кислота может содержать химерный или смешанный остов, содержащий одну или несколько модификаций, например, комбинацию фосфатных связей, такую как комбинация фосфодиэфирных и фосфоротиоатных связей.
[258] Заместители для фосфата включают, например, короткоцепочечные алкильные или циклоалкильные межнуклеозидные связи, смешанные гетероатомные и алкильные или циклоалкильные межнуклеозидные связи, или одну или несколько короткоцепочечных гетероатомных или гетероциклических межнуклеозидных связей. К ним относятся те, которые имеют морфолиновые связи (образованные частично из сахарной части нуклеозида); силоксановые остовы; сульфидные, сульфоксидные и сульфоновые остовы; формацетильные и тиоформацетильные остовы; метиленформацетильные и тиоформацетильные остовы; алкенсодержащие остовы; сульфаматные остовы; метилениминовые и метиленгидразиновые остовы; сульфонатные и сульфонамидные остовы; амидные остовы и другие, имеющие смешанные части компонентов N, O, S и CH2. Во многих патентах США раскрыто, как получать и применять эти типы заменителей фосфата, и они включают без ограничения патенты США №№ 5034506; 5166315; 5185444; 5214134; 5216141; 5235033; 5264562; 5264564; 5405938; 5434257; 5466677; 5470967; 5489677; 5541307; 5561225; 5596086; 5602240; 5610289; 5602240; 5608046; 5610289; 5618704; 5623070; 5663312; 5633360; 5677437 и 5677439. Также следует понимать, что при замене нуклеотида можно заменять как сахарный, так и фосфатный фрагменты нуклеотида, например, с помощью связи амидного типа (аминоэтилглицин) (PNA). В патентах США №№ 5539082; 5714331 и 5719262 описывается, как получать и применять молекулы PNA, каждый из которых включен в данный документ посредством ссылки. См. также Nielsen et al., Science, 1991, 254, 1497-1500. Также возможно связать другие типы молекул (конъюгатов) с нуклеотидами или аналогами нуклеотидов, чтобы усилить, например, поглощение клеткой. Конъюгаты могут быть химически связаны с нуклеотидом или аналогами нуклеотидов. Такие конъюгаты включают без ограничения липидные фрагменты, такие как холестериновый фрагмент (Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86, 6553-6556), холиновую кислоту (Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1994, 4, 1053-1060), простой тиоэфир, например, гексил-S-тритилтиол (Manoharan et al., Ann. KY. Acad. Sci., 1992, 660, 306-309; Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1993, 3, 2765-2770), тиохолестерин (Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20, 533-538), алифатическую цепь, например, додекандиоловые или ундециловые остатки (Saison-Behmoaras et al., EM5OJ, 1991, 10, 1111-1118; Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259, 327-330; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75, 49-54), фосфолипид, например, ди-гексадецил-рац-глицерин или 1-ди-O-гексадецил-рац-глицеро-S-H-фосфонат триэтиламмония (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654; Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18, 3777-3783), цепь полиамина или полиэтиленгликоля (Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14, 969-973) или адамантануксусную кислоту (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654), пальмитиловый фрагмент (Mishra et al., Biochem. Biophys. Acta, 1995, 1264, 229-237) или октадециламиновый или гексиламинокарбонилоксихолестериновый фрагмент (Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277, 923-937). Во множестве патентов США описывается получение таких конъюгатов, и они включают без ограничения патенты США №№ 4828979; 4948882; 5218105; 5525465; 5541313; 5545730; 5552538; 5578717, 5580731; 5580731; 5591584; 5109124; 5118802; 5138045; 5414077; 5486603; 5512439; 5578718; 5608046; 4587044; 4605735; 4667025; 4762779; 4789737; 4824941; 4835263; 4876335; 4904582; 4958013; 5082830; 5112963; 5214136; 5082830; 5112963; 5214136; 5245022; 5254469; 5258506; 5262536; 5272250; 5292873; 5317098; 5371241, 5391723; 5416203, 5451463; 5510475; 5512667; 5514785; 5565552; 5567810; 5574142; 5585481; 5587371; 5595726; 5597696; 5599923; 5599928 и 5688941.
[259] В некоторых вариантах осуществления неприродные нуклеиновые кислоты дополнительно образуют неприродные пары оснований. Иллюстративные неприродные нуклеотиды, способные к образованию неприродной пары оснований ДНК или РНК (UBP) в условиях in vivo включают без ограничения 5SICS, d5SICS, NAM, dNaM, TPT3TP, dTPT3TP и их комбинации. В некоторых вариантах осуществления неприродные нуклеотиды включают:
[260] В некоторых вариантах осуществления неприродная пара оснований генерирует неприродную аминокислоту, описанную в Dumas et al., "Designing logical codon reassignment - Expanding the chemistry in biology," Chemical Science, 6: 50-69 (2015).
[261] Клетку-хозяина, в которую вводят раскрытые в данном документе конструкции или векторы, культивируют или поддерживают в подходящей среде таким образом, что продуцируются тРНК, тРНК-синтетаза и представляющий интерес белок. Среда также содержит неприродную (неприродные) аминокислоту (аминокислоты), так что в представляющий интерес белок встраивается (встраиваются) неприродная (неприродные) аминокислота (аминокислоты).
[262] Ортогональная пара тРНК-синтетаза/тРНК загружает тРНК неприродной аминокислотой и встраивает неприродную аминокислоту в полипептидную цепь в ответ на кодон. Иллюстративные пары aaRS-тРНК включают без ограничения пары aaRS/тРНК Methanococcus jannaschii (Mj-Tyr), пары TyrRS E. coli (Ec-Tyr)/тРНКCUA B. stearothermophilus, пары LeuRS (Ec-Leu) E. coli/тРНКCUA B. stearothermophilus и пары пирролизил-тРНК.
[263] Полипептид IL-15, содержащий неприродную (неприродные) аминокислоту (аминокислоты), получают посредством введения в клетку-хозяина описанных в данном документе конструкций нуклеиновых кислот, содержащих тРНК и тРНК-синтетазу и включающих представляющую интерес последовательность нуклеиновой кислоты с одним или несколькими ортогональными (стоп-)кодонами в рамке считывания. Клетку-хозяина подвергают воздействию физиологического раствора, содержащего неприродную (неприродные) аминокислоту (аминокислоты), и затем клетки-хозяева поддерживают в условиях, которые обеспечивают экспрессию кодирующей последовательности представляющего интерес белка. Неприродная (неприродные) аминокислота (аминокислоты) встраивается (встраиваются) в полипептидную цепь в ответ на кодон. Например, одна или несколько неприродных аминокислот встраиваются в полипептид IL-15. В качестве альтернативы, две или более неприродных аминокислот могут быть встроены в полипептид IL-15 в двух или более сайтах белка.
[264] Когда несколько неприродных аминокислот должны быть встроены в полипептид IL-15 следует понимать, что несколько кодонов необходимо будет встроить в кодирующую последовательность нуклеиновой кислоты в требуемых положениях таким образом, чтобы пары тРНК-синтетаза/тРНК могли контролировать встраивание неприродных аминокислот в ответ на кодон(кодоны). По меньшей мере 1, 2, 3, 4 или более нуклеиновых кислот, кодирующих кодон, могут быть встроены в представляющую интерес последовательность нуклеиновой кислоты.
[265] Когда требуется встроить более чем один тип неприродной аминокислоты в один представляющий интерес белок можно применять вторую или дополнительную ортогональную пару тРНК-тРНК синтетаза для встраивания второй или дополнительной неприродной аминокислоты; соответственно, указанная вторая или дополнительная ортогональная пара тРНК-тРНК синтетаза распознает другой кодон в нуклеиновой кислоте, кодирующей представляющий интерес белок, так что две или более неприродных аминокислот могут быть специфически встроены в различные определенные сайты в белке на одной стадии изготовления. Следовательно, в определенных вариантах осуществления можно применять две или более ортогональных пар тРНК-тРНК синтетаза.
[266] После того, как полипептид IL-15 со встроенной (встроенными) неприродной (неприродными) аминокислотой (аминокислотами) был получен в клетке-хозяине, его можно извлечь из нее с применением различных методик, известных из уровня техники, включая ферментативный, химический и/или осмотический лизис и физическое разрушение. Полипептид IL-15 можно очищать с применением стандартных методик, известных из уровня техники, таких как препаративная хроматография, аффинная очистка или любая другая подходящая методика.
[267] Подходящие клетки-хозяева могут включать бактериальные клетки (например, E. coli), но наиболее подходящими клетками-хозяевами являются эукариотические клетки, например, клетки насекомых (например, дрозофилы, такой как Drosophila melanogaster), дрожжевые клетки, клетки нематод (например, Caenorhabditis elegans), мышей (например, Mus musculus) или клетки млекопитающих (такие как клетки яичника китайского хомяка (СНО) или клетки COS, клетки 293T человека, клетки HeLa, клетки NIH 3T3 и клетки эритролейкоза мыши (MEL)), или клетки человека или другие эукариотические клетки. Другие подходящие клетки-хозяева известны специалистам в данной области техники. Соответственно, клетка-хозяин представляет собой клетку млекопитающего, такую как клетка человека, или клетку насекомого.
[268] Другими подходящими клетками-хозяевами, которые в целом можно применять в вариантах осуществления настоящего изобретения, являются клетки, упомянутые в разделе "Примеры". Векторную ДНК можно вводить в клетки-хозяева с помощью обычных методик трансформации или трансфекции. Применяемые в данном документе термины "трансформация" и "трансфекция" предназначены для обозначения множества хорошо известных методик введения молекулы чужеродной нуклеиновой кислоты (например, ДНК) в клетку-хозяина, включая совместное осаждение фосфатом кальция или хлоридом кальция, опосредованную DEAE-декстраном трансфекцию, липофекцию или электропорацию. Подходящие способы трансформации или трансфекции клеток-хозяев хорошо известны из уровня техники.
[269] При создании линий клеток обычно предпочтительно получать стабильные линии клеток. Например, известно, что в случае стабильной трансфекции клеток млекопитающих в зависимости от применяемых вектора экспрессии и методики трансфекции только небольшая часть клеток может интегрировать чужеродную ДНК в свой геном. Для идентификации и отбора этих интегрантов в клетки-хозяева вместе с представляющим интерес геном обычно вводят ген, который кодирует селектируемый маркер (например, для устойчивости к антибиотикам). Предпочтительные селектируемые маркеры включают маркеры, которые придают устойчивость к лекарственным средствам, таким как G418, гигромицин или метотрексат. Молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие селектируемый маркер, можно вводить в клетку-хозяина в том же векторе или можно вводить в отдельном векторе. Клетки, стабильно трансфицированные введенной молекулой нуклеиновой кислоты, можно идентифицировать посредством отбора с лекарственным средством (например, клетки, которые содержат встроенный ген селектируемого маркера, выживут, тогда как другие клетки погибают).
[270] В одном варианте осуществления описанные в данном документе конструкции интегрируют в геном клетки-хозяина. Преимущество стабильной интеграции состоит в том, что достигается однородность между отдельными клетками или клонами. Еще одно преимущество состоит в возможности осуществления отбора лучших продуцентов. Соответственно, желательно создать стабильные линии клеток. В другом варианте осуществления описанными в данном документе конструкциями трансфицируют клетку-хозяина. Преимущество трансфекции клетки-хозяина конструкциями состоит в том, что выход белка может быть максимизирован. В одном аспекте описана клетка, содержащая конструкцию нуклеиновой кислоты или вектор, описанный данном документе.
Фармацевтические композиции и составы
[271] В некоторых вариантах осуществления фармацевтическую композицию и составы, описанные в данном документе, вводят субъекту несколькими путями введения, включая без ограничения парентеральный, пероральный или трансдермальный пути введения. В некоторых случаях парентеральное введение включает внутривенное, подкожное, внутримышечное, интрацеребральное, интраназальное, внутриартериальное, внутрисуставное, внутрикожное, интравитреальное, внутрикостную инфузию, интраперитонеальное или интратекальное введение. В некоторых случаях фармацевтическую композицию составляют для местного введения. В других случаях фармацевтическую композицию составляют для системного введения.
[272] В некоторых вариантах осуществления фармацевтические составы включают без ограничения водные жидкие дисперсии, самоэмульгирующиеся дисперсии, липосомальные дисперсии, аэрозоли, составы с немедленным высвобождением, составы с контролируемым высвобождением, составы с замедленным высвобождением, составы с пролонгированным высвобождением, составы с пульсирующим высвобождением и смешанные составы с немедленным и контролируемым высвобождением.
[273] В некоторых вариантах осуществления фармацевтические составы содержат носитель или материалы-носители, выбранные на основе совместимости с композицией, раскрытой в данном документе, и характеристик профиля высвобождения желаемой лекарственной формы. Иллюстративные материалы-носители включают, например, связующие вещества, поверхностно-активные вещества, солюбилизаторы, стабилизаторы, смазывающие средства, смачивающие средства, разбавители и т.п. Фармацевтически совместимые материалы-носители включают без ограничения аравийскую камедь, желатин, коллоидный диоксид кремния, глицерофосфат кальция, лактат кальция, мальтодекстрин, глицерин, силикат магния, поливинилпирролидон (PVP), холестерин, сложные эфиры холестерина, казеинат натрия, соевый лецитин, таурохолевую кислоту, фосфатидилхолин, хлорид натрия, трикальцийфосфат, дикалийфосфат, целлюлозу и конъюгаты целлюлозы, сахара, стеароиллактилат натрия, каррагинан, моноглицерид, диглицерид, прежелатинизированный крахмал и т.п. См., например, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Nineteenth Ed (Easton, Pa.: Mack Publishing Company, 1995), Hoover, John E., Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania 1975, Liberman, H.A. и Lachman, L., Eds., Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Decker, New York, N.Y., 1980, и Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Seventh Ed. (Lippincott Williams & Wilkins1999).
[274] В некоторых случаях фармацевтическую композицию составляют в виде иммунолипосомы, которая содержит множество конъюгатов IL-15, непосредственно или опосредованно связанных с липидным бислоем липосом. Иллюстративные липиды включают без ограничения жирные кислоты; фосфолипиды; стерины, такие как холестерины; сфинголипиды, такие как сфингомиелин; гликосфинголипиды, такие как ганглиозиды, глобозиды и цереброзиды; амины поверхностно-активных веществ, такие как стеарил-, олеил- и линолеиламины. В некоторых случаях липид включает катионный липид. В некоторых случаях липид включает фосфолипид. Иллюстративные фосфолипиды включают без ограничения фосфатидную кислоту ("PA"), фосфатидилхолин ("PC"), фосфатидилглицерин ("PG"), фосфатидилэтаноламин ("PE"), фосфатидилинозитол ("PI") и фосфатидилсерин ("PS"), сфингомиелин (включая сфингомиелин головного мозга), лецитин, лизолецитин, лизофосфатидилэтаноламин, цереброзиды, диарахидоилфосфатидилхолин ("DAPC"), дидеканоил-L-альфа-фосфатидилхолин ("DDPC"), диелаидоилфосфатидилхолин ("DEPC"), дилауроилфосфатидилхолин ("DLPC"), дилинолеоилфосфатидилхолин, димиристоилфосфатидилхолин ("DMPC"), диолеоилфосфатидилхолин ("DOPC"), дипальмитоилфосфатидилхолин ("DPPC"), дистеароилфосфатидилхолин ("DSPC"), 1-пальмитоил-2-олеоилфосфатидилхолин ("POPC"), диарахидоилфосфатидилглицерин ("DAPG"), дидеканоил-L-альфа-фосфатидилглицерин ("DDPG"), диелаидоилфосфатидилглицерин ("DEPG"), дилауроилфосфатидилглицерин ("DLPG"), дилинолеоилфосфатидилглицерин, димиристоилфосфатидилглицерин ("DMPG"), диолеоилфосфатидилглицерин ("DOPG"), дипальмитоилфосфатидилглицерин ("DPPG"), дистеароилфосфатидилглицерин ("DSPG"), 1-пальмитоил-2-олеоилфосфатидилглицерин ("POPG"), диарахидоилфосфатидилэтаноламин ("DAPE"), дидеканоил-L-альфа-фосфатидилэтаноламин ("DDPE"), диелаидоилфосфатидилэтаноламин ("DEPE"), дилауроилфосфатидилэтаноламин ("DLPE"), дилинолеоилфосфатидилэтаноламин, димиристоилфосфатидилэтаноламин ("DMPE"), диолеоилфосфатидилэтаноламин ("DOPE"), дипальмитоилфосфатидилэтаноламин ("DPPE"), дистеароилфосфатидилэтаноламин ("DSPE"), 1-пальмитоил-2-олеоилфосфатидилэтаноламин ("POPE"), диарахидоилфосфатидилинозитол ("DAPI"), дидеканоил-L-альфа-фосфатидилинозитол ("DDPI"), диелаидоилфосфатидилинозитол ("DEPI"), дилауроилфосфатидилинозитол ("DLPI"), дилинолеоилфосфатидилинозитол, димиристоилфосфатидилинозитол ("DMPI"), диолеоилфосфатидилинозитол ("DOPI"), дипальмитоилфосфатидилинозитол ("DPPI"), дистеароилфосфатидилинозитол ("DSPI"), 1-пальмитоил-2-олеоилфосфатидилинозитол ("POPI"), диарахидоилфосфатидилсерин ("DAPS"), дидеканоил-L-альфа-фосфатидилсерин ("DDPS"), диелаидоилфосфатидилсерин ("DEPS"), дилауроилфосфатидилсерин ("DLPS"), дилинолеоилфосфатидилсерин, димиристоилфосфатидилсерин ("DMPS"), диолеоилфосфатидилсерин ("DOPS"), дипальмитоилфосфатидилсерин ("DPPS"), дистеароилфосфатидилсерин ("DSPS"), 1-пальмитоил-2-олеоил-фосфатидилсерин ("POPS"), диарахидоилсфингомиелин, дидеканоилсфингомиелин, диелаидоилсфингомиелин, дилауроилсфингомиелин, дилинолеоилсфингомиелин, димиристоилсфингомиелин, сфингомиелин, диолеоилсфингомиелин, дипальмитоилсфингомиелин, дистеароилсфингомиелин и 1-пальмитоил-2-олеоилсфингомиелин.
[275] В некоторых вариантах осуществления фармацевтические составы дополнительно содержат средства для доведения pH или буферные средства, которые включают кислоты, такие как уксусная, борная, лимонная, молочная, фосфорная и соляная кислоты, основания, такие как гидроксид натрия, фосфат натрия, борат натрия, цитрат натрия, ацетат натрия, лактат натрия и трис-гидроксиметиламинометан, и буферы, такие как цитрат/декстроза, бикарбонат натрия и хлорид аммония. Такие кислоты, основания и буферы включают в количестве, необходимом для поддержания pH композиции в приемлемом диапазоне.
[276] В некоторых случаях фармацевтический состав содержит одну или несколько солей в количестве, необходимом для приведения осмоляльности композиции в приемлемый диапазон. Такие соли включают соли, содержащие катионы натрия, калия или аммония и анионы хлорида, цитрата, аскорбата, бората, фосфата, бикарбоната, сульфата, тиосульфата или бисульфита, подходящие соли включают хлорид натрия, хлорид калия, тиосульфат натрия, бисульфит натрия и сульфат аммония.
[277] В некоторых вариантах осуществления фармацевтические составы включают без ограничения сахара, такие как трегалоза, сахароза, маннит, сорбит, мальтоза, глюкоза, или соли, такие как фосфат калия, цитрат натрия, сульфат аммония и/или другие средства, такие как гепарин, для повышения растворимости и стабильности полипептидов in vivo.
[278] В некоторых вариантах осуществления фармацевтические составы дополнительно содержат разбавитель, который применяют для стабилизации соединений, поскольку они способны обеспечить более стабильную среду. Соли, растворенные в буферных растворах (которые также способны обеспечивать контроль или поддержание pH), применяют в качестве разбавителей в данной области техники, включая без ограничения забуференный фосфатом раствор хлорида натрия.
[279] Стабилизаторы включают такие как любые антиоксидантные средства, буферы, кислоты, консерванты и т.п. Иллюстративные стабилизаторы включают гидрохлорид L-аргинина, трометамин, альбумин (человеческий), лимонную кислоту, бензиловый спирт, фенол, дигидрат динатрия бифосфата, пропиленгликоль, метакрезол или м-крезол, ацетат цинка, полисорбат-20 или Tween® 20, или трометамол.
[280] Поверхностно-активные вещества включают такие соединения, как лаурилсульфат натрия, докузат натрия, Tween 60 или 80, триацетин, витамин E TPGS, сорбитанмоноолеат, полиоксиэтиленсорбитанмоноолеат, полисорбаты, полаксомеры, соли желчных кислот, глицерилмоностеарат, сополимеры этиленоксида и пропиленоксида, например, Pluronic® (BASF) и т.п. Дополнительные поверхностно-активные вещества включают полиоксиэтиленовые глицериды жирных кислот и растительных масел, например, полиоксиэтиленовое (60) гидрогенизированное касторовое масло, а также алкиловые эфиры и алкилфениловые эфиры полиоксиэтилена, например, октоксинол 10, октоксинол 40. Иногда поверхностно-активные вещества включают для повышения физической стабильности или для других целей.
Терапевтические режимы
[281] В некоторых вариантах осуществления описанные в данном документе фармацевтические композиции вводят для терапевтических применений. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическую композицию вводят один раз в день, два раза в день, три раза в день или более. Фармацевтическую композицию вводят ежедневно, каждый день, через день, пять дней в неделю, один раз в неделю, через неделю, две недели в месяц, три недели в месяц, один раз в месяц, два раза в месяц, три раза в месяц или более. Фармацевтическую композицию вводят в течение по меньшей мере 1 месяца, 2 месяцев, 3 месяцев, 4 месяцев, 5 месяцев, 6 месяцев, 7 месяцев, 8 месяцев, 9 месяцев, 10 месяцев, 11 месяцев, 12 месяцев, 18 месяцев, 2 лет, 3 лет или более.
[282] В случае, когда состояние пациента действительно улучшается, по усмотрению врача введение композиции осуществляется непрерывно, альтернативно, дозу подлежащей введению композиции временно снижают или временно приостанавливают на определенный период времени (т.е. "перерыв в применении лекарственного средства"). В некоторых вариантах осуществления продолжительность перерыва в применении лекарственного средства варьируется от 2 дней до 1 года, включая только в качестве примера 2 дня, 3 дня, 4 дня, 5 дней, 6 дней, 7 дней, 10 дней, 12 дней, 15 дней, 20 дней, 28 дней, 35 дней, 50 дней, 70 дней, 100 дней, 120 дней, 150 дней, 180 дней, 200 дней, 250 дней, 280 дней, 300 дней, 320 дней, 350 дней или 365 дней. Снижение дозы во время перерыва в применении лекарственного средства составляет 10-100%, включая только в качестве примера 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 100%.
[283] После улучшения состояния пациента при необходимости вводят поддерживающую дозу. Впоследствии дозировку или частоту введения, или и то и другое, можно уменьшать в зависимости от симптомов до уровня, на котором поддерживается улучшение состояния при заболевании, нарушении или состоянии.
[284] В некоторых вариантах осуществления количество данного средства, которое соответствует такому количеству, варьируется в зависимости от таких факторов, как конкретное соединение, тяжесть заболевания, индивидуальные характеристики (например, вес) субъекта или хозяина, нуждающегося в лечении, но тем не менее обычно определяется способом, известным из уровня техники, в соответствии с конкретными обстоятельствами, относящимися к случаю, включая, например, конкретное подлежащее введению средство, путь введения и субъекта или хозяина, подлежащего лечению. В некоторых вариантах осуществления требуемая доза обычно представлена в виде однократной дозы или разделенных доз, вводимых одновременно (или в течение короткого периода времени) или с соответствующими интервалами, например, в виде двух, трех, четырех или более субдоз в день.
[285] Вышеупомянутые диапазоны являются просто предположительными, поскольку количество переменных в отношении индивидуального режима лечения велико, и существенные отклонения от этих рекомендуемых значений не являются редкостью. Такие дозы изменяются в зависимости от ряда переменных, не ограничиваясь активностью применяемого соединения, заболеванием или состоянием, подлежащим лечению, способом введения, потребностями отдельного субъекта, тяжестью заболевания или состояния, подлежащего лечению, и мнением практикующего специалиста.
[286] В некоторых вариантах осуществления токсичность и терапевтическую эффективность таких терапевтических режимов определяют с помощью стандартных фармацевтических процедур с применением культур клеток или экспериментальных животных, включая без ограничения определение LD50 (дозы, летальной для 50% популяции) и ED50 (дозы, терапевтически эффективной для 50% популяции). Соотношение доз для токсических и терапевтических эффектов представляет собой терапевтический индекс и выражается в виде соотношения между LD50 и ED50. Предпочтительными являются соединения, демонстрирующие высокие терапевтические индексы. Данные, полученные в анализах с применением культур клеток и в исследованиях на животных, применяются при составлении диапазона дозировки для применения у человека. Дозировка таких соединений предпочтительно находится в пределах диапазона циркулирующих концентраций, который включает ED50 с минимальной токсичностью. Дозировка варьируется в пределах этого диапазона в зависимости от используемой лекарственной формы и используемого пути введения.
Наборы/изделие
[287] В данном документе в определенных вариантах осуществления раскрыты наборы и изделия для применения с одним или несколькими способами и композициями, описанными в данном документе. Такие наборы включают носитель, упаковку или контейнер, который разделен на части для размещения одного или нескольких контейнеров, таких как флаконы, пробирки и т.п., причем каждый контейнер содержит один из отдельных элементов, которые должны применяться в способе, описанном в данном документе. Подходящие контейнеры включают, например, бутылки, флаконы, шприцы и тестовые пробирки. В одном варианте осуществления контейнеры получают из различных материалов, таких как стекло или пластик.
[288] Предусмотренные в данном документе изделия содержат упаковочные материалы. Примеры фармацевтических упаковочных материалов включают без ограничения блистерные упаковки, бутылки, пробирки, пакеты, контейнеры, бутылки и любой упаковочный материал, подходящий для выбранного состава и предполагаемого способа введения и лечения.
[289] Например, контейнер (контейнеры) включает (включают) один или несколько полипептидов IL-15 или конъюгатов IL-15, раскрытых в данном документе и, необязательно, одно или несколько фармацевтических вспомогательных веществ, описанных в данном документе, для облегчения доставки полипептидов IL-15 или конъюгатов IL-15. Такие наборы дополнительно необязательно включают идентифицирующее описание или этикетку, или инструкции, относящиеся к их применению в способах, описанных в данном документе.
[290] Набор обычно включает этикетки с перечнем содержимого и/или инструкциями по применению, а также листки-вкладыши с инструкциями по применению. Также обычно включается набор инструкций.
[291] В одном варианте осуществления этикетка находится в на контейнере или связана с ним. В одном варианте осуществления этикетка находится на контейнере, когда буквы, числа или другие символы, образующие этикетку, прикреплены, отформованы или вытравлены на самом контейнере, при этом этикетка связана с контейнером, когда она находится внутри приспособления или держателя, который также удерживает контейнер, например, в виде листка-вкладыша. В одном варианте осуществления этикетка применяется для обозначения того, что содержимое должно применяться для конкретного терапевтического применения. Этикетка также указывает направления для применения содержимого, такие как в описанных в данном документе способах.
[292] В определенных вариантах осуществления фармацевтические композиции представлены в упаковке или дозирующем устройстве, которые содержат одну или несколько стандартных лекарственных форм, содержащих соединение, предусмотренное в данном документе. Упаковка, например, содержит металлическую или пластиковую фольгу, такую как блистерная упаковка. В одном варианте осуществления упаковка или дозирующее устройство сопровождается инструкциями по введению. В одном варианте осуществления упаковка или дозатор также сопровождается уведомлением, связанным с контейнером, по форме, предписанной государственным агентством, регулирующим изготовление, применение или продажу фармацевтических препаратов, причем уведомление отражает одобрение агентством формы лекарственного средства для введения человеку или в ветеринарии. Такое уведомление, например, представляет собой этикетку, одобренную Управлением по контролю за продуктами и лекарственными средствами США для лекарственных средств, или листок-вкладыш одобренного продукта. В одном варианте осуществления композиции, содержащие соединение, предусмотренное в данном документе, составленные в совместимом фармацевтическом носителе, также получают, помещают в соответствующий контейнер и маркируют для лечения указанного состояния.
Определенная терминология
[293] Если не указано иное, все технические и научные термины, применяемые в данном документе, имеют то же значение, которое обычно понимается специалистом в данной области техники, к которой принадлежит заявленный объект изобретения. Следует понимать, что подробное описание является лишь иллюстративным и пояснительным и не ограничивает какой-либо заявленный объект изобретения. В данной заявке применение единственного числа включает множественное число, если специально не указано иное. Следует отметить, что применяемые в данном описании формы единственного числа включают ссылки на множественное число, если контекстом явно не предписывается иное. В данной заявке применение "или" означает "и/или", если не указано иное. Кроме того, применение термина "включая", а также других форм, таких как "включать", "включает" и "включенный", не является ограничивающим.
[294] Хотя различные признаки настоящего изобретения могут быть описаны в контексте одного варианта осуществления, признаки также могут быть предусмотрены отдельно или в любой подходящей комбинации. Наоборот, несмотря на то, что настоящее изобретение может быть описано в данном документе в контексте отдельных вариантов осуществления для ясности, настоящее изобретение также может быть реализовано в одном варианте осуществления.
[295] Ссылка в настоящем описании на "некоторые варианты осуществления", "вариант осуществления", "один вариант осуществления" или "другие варианты осуществления" означает, что конкретный признак, структура или характеристика, описанные в связи с вариантами осуществления, включены по меньшей мере в некоторые варианты осуществления, но не обязательно во все варианты осуществления настоящего изобретения.
[296] Применяемые в данном документе, диапазоны и количества могут быть выражены как "приблизительно" конкретное значение или диапазон. "Приблизительно" также включает точное количество. Следовательно "приблизительно 5 мкл" означает "приблизительно 5 мкл", а также "5 мкл." Как правило, термин "приблизительно" включает количество, которое, как ожидается, будет находиться в пределах экспериментальной ошибки.
[297] Применяемые в данном документе заголовки разделов служат только в организационных целях и не должны пониматься как ограничивающие описываемый объект изобретения.
[298] Применяемые в данном документе термины "индивидуум (индивидуумы)", "субъект (субъекты)" и "пациент (пациенты)" означают любое млекопитающее. В некоторых вариантах осуществления млекопитающее является человеком. В некоторых вариантах осуществления млекопитающее является отличным от человека. Ни один из терминов не требует ситуаций, характеризующихся наблюдением (например, постоянным или периодическим) медицинского работника (например, врача, дипломированной медсестры, практикующей медсестры, фельдшера, санитара или работника хосписа), или не ограничивается ими.
[299] Применяемые в данном документе термины "значительный" и "в значительной степени" применительно к связыванию рецептора означают изменение, достаточное для воздействия на связывание полипептида IL-15 с целевым рецептором. В некоторых случаях термин относится к изменению на по меньшей мере 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% или более. В некоторых случаях термин означает изменение в по меньшей мере 2 раза, 3 раза, 4 раза, 5 раз, 6 раз, 7 раз, 8 раз, 9 раз, 10 раз, 50 раз, 100 раз, 500 раз, 1000 раз или более.
[300] В некоторых случаях термин "в значительной степени" применительно к активации одной или нескольких популяций клеток посредством сигнального комплекса цитокина означает изменение, достаточное для активации популяции клеток. В некоторых случаях изменение для активации популяции клеток измеряется как эффективность рецепторной передачи сигнала. В таких случаях может быть предусмотрено значение EC50. В других случаях может быть предусмотрено значение ED50. В дополнительных случаях может быть предусмотрена концентрация или дозировка цитокина.
[301] Применяемый в данном документе термин "эффективность" относится к количеству цитокина (например, полипептида IL-15), необходимому для достижения целевого эффекта. В некоторых случаях термин "эффективность" относится к количеству цитокина (например, полипептида IL-15), необходимому для активации целевого рецептора цитокина (например, рецептора IL-15). В других случаях термин "эффективность" относится к количеству цитокина (например, полипептида IL-15), необходимому для активации целевой популяции клеток. В некоторых случаях эффективность измеряется как ED50 (эффективная доза 50) или доза, необходимая для достижения 50% от максимального эффекта. В других случаях эффективность измеряется как ЕС50 (эффективная концентрация 50) или доза, необходимая для достижения целевого эффекта у 50% популяции.
[302] Применяемый в данном документе термин "клетка (клетки) иммунной системы, инфильтрующая (инфильтрующие) опухоль", относится к клеткам иммунной системы, которые инфильтровали участок, содержащий клетки опухоли (например, микроокружение опухоли). В некоторых случаях клетки иммунной системы, инфильтрующие опухоль, связаны с разрушением клеток опухоли, снижением пролиферации клеток опухоли, снижением опухолевой нагрузки или их комбинациями. В некоторых случаях клетки иммунной системы, инфильтрующие опухоль, включают инфильтрующие опухоль лимфоциты (TIL). В некоторых случаях клетки иммунной системы, инфильтрующие опухоль, включают Т-клетки, В-клетки, клетки, являющиеся естественными киллерами, макрофаги, нейтрофилы, дендритные клетки, тучные клетки, эозинофилы или базофилы. В некоторых случаях клетки иммунной системы, инфильтрующие опухоль, включают CD4+ или CD8+ Т-клетки.
ПРИМЕРЫ
[303] Данные примеры предусмотрены в исключительно иллюстративных целях и не ограничивают объем предусмотренной в данном документе формулы изобретения.
ПРИМЕР 1.
[304] Экспрессия модифицированных полипептидов IL-15
[305] Модифицированный полипептид IL-16 выращивали при 37°C, 250 об/мин и индукции в течение 5 часов. Компонент среды показан в таблице 2.
Таблица 2.
На 1 л: 2x гранулы 2xYT, одноосновный фосфат калия, двухосновный фосфат калия
Автоклав с жидкостным циклом для стерилизации
30,8 мM двухосновного фосфата калия
19,2 мM одноосновного фосфата калия
100 мкг/мл ампициллина
5 мкг/мл хлорамфеникола
50 мкг/мл зеоцина
37,5 мкM dTPT3TP
150 мкМ dNAMTP
[306] Когда культура для экспрессии достигает значения OD600, составляющего 0,85-0,9, в культуру предварительно загружали NaMTP (в конечной концентрации 250 мкМ), TPT3TP (в конечной концентрации 25 мкМ) и азидолизин (в конечной концентрации 15 мМ). Приблизительно через 15-20 минут после предварительной загрузки рибонуклеотидов и аминокислоты добавляли IPTG, и белок экспрессировался в течение приблизительно 5 часов.
[307] Тельце включения
[308] После сбора осадка клеток осадки подвергали дальнейшей обработке для получения телец включения. Вкратце, осадок клеток объемом 1 л ресуспендировали в 10 мл лизирующего буфера (20 мМ Трис-HCl, pH 8,0; 150 мМ NaCl; 1 мМ DTT; и ингибиторе протеазы (1 осадок/50 мл)). После ресуспендирования объем осадка объемом 1 л увеличивали на 45 мл с помощью лизирующего буфера и пропускали через микрофлюидайзер 2 раза. Затем образец переносили в центрифужную пробирку объемом 50 мл и центрифугировали при 16 тыс. об/мин в течение 20 минут при 4°C. Затем осадок ресуспендировали в 5 мл лизирующего буфера и общий объем увеличивали до 30 мл с помощью лизирующего буфера. Приблизительно 10% Triton X-100 добавляли до конечной концентрации 0,5%. Затем раствор центрифугировали при 16 тыс. об/мин в течение 20 минут при 4°C, затем осадок собирали и промывали 3 раза с помощью 30 мл лизирующего буфера. Для полного ресуспендирования при каждой промывке применяли шприц объемом 5 мл с иглами. После окончательного центрифугирования удаленный супернатант и осадок мгновенно замораживали для хранения при -80°C.
[309] Солюбилизация и рефолдинг
[310] К осадку телец включения добавляли приблизительно 5 мл буфера для солюбилизации. После ресуспендирования объем увеличивали до 30 мл в буфере для солюбилизации. Затем образец инкубировали при 4°C в течение 30-60 минут. Затем образец переносили в центрифужную пробирку объемом 2 х 50 мл (15 мл/пробирка) и добавляли 15 мл буфера для разведения в каждую пробирку. Затем образец в дальнейшем подвергали диализу в буфере A1 в течение ночи при 4°C, затем в буфере для диализа A2, в буфере для диализа A3, в буфере для диализа A4 и в буфере для диализа A5. После диализа образец центрифугировали при 4000 об/мин в течение 30 минут при 4°C и концентрировали до приблизительно 5 мл.
[311] В таблице 3 показаны буферы для солюбилизации.
20 мM Трис-HCl, pH 8,0
1 мM DTT
20 мM имидазола
20 мM Трис-HCl, pH 8,0
1 мM DTT
20 мM имидазола
20 мM Трис-HCl, pH 8,5
150 мM NaCl
1 мM GSH (восстановленный глутатион)
0.1 мM GSSG (окисленный глутатион)
0,4 M L-аргинина
20 мM Трис-HCl, pH 8,5
150 мM NaCl
1 мM GSH (восстановленный глутатион)
0,1 мM GSSG (окисленный глутатион)
0,4 M L-аргинина
150 мM NaCl
1 мM GSH (восстановленный глутатион)
0,1 мM GSSG (окисленный глутатион)
0,1 M L-аргинина
150 мM NaCl
12,5 мM NaCl
[312] Очистка
[313] Образец очищали сначала на колонке для гель-фильтрации GE HiLoad 16/600 Superdex 200 pg с элюирующим буфером 1хPBS, затем на колонке для анионообменной хроматографии GE HiTrapQ для удаления свободного PEG, а затем с помощью обращенно-фазовой хроматографии с градиентным элюированием с помощью 30%-70% элюирующего буфера в 20 объемах колонки.
[314] В таблице 4 показаны буферы, применяемые для анионообменной хроматографии. В Таблице 5 показаны буферы, применяемые для обращенно-фазовой хроматографии.
Таблица 4
500 мM NaCl
Таблица 5
0,043% TFA
0,028% TFA
[315] На фиг. 4 показан иллюстративный прогон анионообменной хроматографии.
[316] На фиг. 5 показан иллюстративный прогон обращенно-фазовой хроматографии.
ПРИМЕР 2
[317] Скрининг на основе клеток для идентификации пегилированных соединений IL-15 с либо нативным взаимодействием с IL-15Rα, либо без него
[318] Структурные данные сигнального комплекса IL-15/гетеротримерный рецептор (PDB: 4GS7) применяли для управления конструированием сайтов nAA-пегилирования, чтобы либо сохранить нативное взаимодействие с гетеротримерным рецептором, либо специфически отменить взаимодействие IL-15 и субъединицы α-рецептора IL-15 (IL-15Rα). Иллюстративные конъюгаты IL-15 подвергали функциональному анализу: S18, A23, T24, L25, Y26, E46, V49, L52, E53, N77, S83, E89, E90. Конъюгаты IL-15 экспрессировали в виде телец включения в E. coli, очищали и подвергали повторному фолдингу с применением стандартных процедур перед сайт-специфическим пегилированием продукта IL-15 с применением DBCO-опосредованной клик-химии без участия меди для стабильного ковалентного присоединения фрагментов mPEG к AzK. Конъюгаты IL-15 подвергали скринингу в отношении функциональной активности с применением колориметрического анализа пролиферации CTLL2. CTLL2 представляет собой субклон Т-клеток мыши, который экспрессирует все три субъединицы рецептора IL-15 и требует IL-2/IL-15 для роста. Предварительные эксперименты проводили для определения оптимальной плотности клеток, диапазона стандарта IL-15 или конъюгатов IL-15 для получения адекватной кривой доза-ответ, а также времени инкубации. Рекомбинантный человеческий IL-15 (rHuIL-15) собственного производства сравнивали с коммерческим стандартом IL-15 (R&D, номер по каталогу 247-IL). В определенных условиях ЕС50 для коммерческого стандарта IL-15 составляла приблизительно 10,7 пМ и 9,7 пМ для rHuIL-15 собственного производства.
[319] В таблице 6 показаны данные ЕС50 для конъюгатов IL-15 с линейным пегилированием с молекулярным весом 30 кДа, сконструированных с сохранением нативного взаимодействия с гетеротримерным рецептором IL-15. В скобках указано количество значений, входящих в среднее значение. Результаты демонстрируют, что биоконъюгация с PEG с молекулярным весом 30 кДа не оказывает влияния на эффективность тримерного рецептора с менее чем 5-кратным снижением EC50 по сравнению с природным IL-15.
Таблица 6
IL-15 PEG30/rHuIL-15
[320] В Таблице 7 показаны данные ЕС50 для конъюгатов IL-15 с линейным пегилированием с молекулярным весом 30 кДа и разветвленным пегилированием с молекулярным весом 40 кДа, сконструированных для специфической отмены взаимодействия IL-15 и субъединицы α-рецептора IL-15 (IL-15Rα). В скобках указано количество значений, входящих в среднее значение. Результаты демонстрируют, что биоконъюгация с PEG с молекулярным весом 30 кДа снизила эффективность тримерного рецептора по сравнению с природным IL-15. Биоконъюгация линейного PEG с молекулярным весом 30 кДа или разветвленного PEG с молекулярным весом 40 кДа с V49 умеренно снижает эффективность тримерного рецептора по сравнению с rHuIL-15 (~в 6-8 раз, от 814,4 пг/мл до 1029 пг/мл против 124,62 пг/мл, соответственно). Кроме того, эффективность PEG39 L25 сильнее снижалась по сравнению с rHuIL-15 (~в 54 раза, 6827 пг/мл против 124,62 пг/мл, соответственно).
Таблица 7
IL-15 PEG/rHuIL-15
[321] На фиг. 6 показаны значения ЕС50 для иллюстративных конъюгатов IL-15 с нативной активностью в анализе пролиферации CTLL2. Результаты графически представлены в виде процента ответа.
[322] На фиг. 7 показаны значения ЕС50 для иллюстративных конъюгатов IL-15. Как показано в данном документе, сайт-специфическое пегилирование способствует фармакологии in vitro. Результаты графически представлены в виде процента ответа.
[323] На фиг. 8 показаны значения ЕС50 для иллюстративного IL-15, конъюгированного с PEG различных размеров. Результаты графически представлены в виде процента ответа.
ПРИМЕР 3
[324] Биохимические взаимодействия пегилированного IL-15 с субъединицами рецептора IL-15 человека
[325] Кинетику взаимодействий пегилированного соединения IL-15 с субъединицами рецептора IL-15 человека измеряли с помощью поверхностного плазмонного резонанса (SPR) в Biofizik (Сан-Диего, Калифорния). Для этих исследований слитые с Fc человеческого IgG1 внеклеточные домены IL-15 Rα (Sino Biological, номер по каталогу 18366-H02H, R&D, номер по каталогу 7194-IR) и IL-2 Rβ (Sino Biological, номер по каталогу 10696-H02H) захватывали на поверхности сенсорного чипа CM3 или CM4, покрытого белком А, от Biacore. Белок А связывали с помощью аминного связывания при плотности, составляющей приблизительно 1500 RU, на чипе CM3 при 25°C. Приблизительно 400 RU продукта слияния IL15Rα-Fc захватывали с применением времени контакта 4 мин с последующим временем ожидания 20 минут перед введением аналита. Регенерацию поверхности между введениями осуществляли с применением 100 мМ фосфорной кислоты. Свежий рецептор захватывали в каждом цикле после регенерации. Эти поверхности зондировали трижды при 25°C. В типичном эксперименте вводили 10 доз аналита с максимальной концентрацией 500 нМ. В некоторых случаях требовался диапазон высоких концентраций, а в других более высокие дозы не включали в анализ.
[326] Из-за более слабого связывания соединений с IL2Rβ в регенерации не было необходимости, и исследования ортогонального связывания проводили без стадии регенерации. Приблизительно 600-700 RU продукта слияния IL2Rβ Fc захватывали с применением времени контакта 1-2 мин при разведении 1/100 исходного раствора в рабочем буфере. Для тестируемых соединений вводили 10 доз аналита с самой высокой концентрацией 1000 нМ. Исходные данные анализировали с применением программы Scrubber2 с помощью процедуры двойного сравнения с эталоном, при которой сигнал соединения корректируется до пустой поверхности и введения буфера на поверхность белка. См. таблицы 8-10.
Таблица 8. Кинетические параметры для rHuIL-15 и соединений пегилированного IL-15 с поверхностями субъединицы IL-15Rα.
Таблица 9. Кинетические параметры для rHuIL-15 и соединений пегилированного IL-15 со сниженной степенью связывания с поверхностями субъединицы IL-15Rα.
Таблица 10. Кинетические параметры для rHuIL-15 и пегилированных соединений IL-15 с поверхностями субъединицы IL-2Rβ.
[327] На поверхностях сенсора, содержащих иммобилизованный IL-15Rα, нативный IL-15 (rHuIL-15 и коммерческий IL-15 от R&D) продемонстрировал быструю ассоциацию и очень медленную кинетику диссоциации, демонстрируя связывание с очень высокой аффинностью (фиг. 9A). Пегилированные варианты IL-15, разработанные для увеличения времени полужизни без блокирования взаимодействия с рецепторами IL-15, демонстрируют кинетику связывания, аналогичную нативному IL-15. Незначительная разница в KD (~10- и ~3-кратное снижение KD в случае IL-15 N77PEG30 и IL-15 S83PEG30, соответственно), наблюдаемая между соединениями в случае субъединицы, связана со снижением скорости ассоциации конъюгированных соединений IL-15 относительно rHuIL-15, что ожидаемо, исходя из более низкого коэффициента диффузии пегилированного соединения и неспецифических экранирующих эффектов крупного фрагмента PEG на отдаленных связывающих поверхностях (фиг. 9B). Напротив, IL-15 E46PEG30 взаимодействует с IL-15 Rα с медленной ассоциацией и медленной диссоциацией, тогда как IL-15 E53PEG30 демонстрирует быструю ассоциацию и быструю диссоциацию (фиг. 9C) из-за специфической локализации фрагмента PEG на связывающей поверхности IL-15Rα.
[328] Поверхности, содержащие иммобилизованный IL-2 Rβ, демонстрировали сопоставимые реакции ассоциации и диссоциации как с нативным IL-15, так и с соединениями, сконструированными для увеличения времени полужизни при взаимодействии с нативным рецептором. Соединения, в которых фрагмент PEG локализован на связывающей поверхности IL-15Rα, демонстрируют различную кинетику связывания с поверхностями IL-2Rβ. В то время как IL-15 E46PEG30 и IL-15 L25PEG демонстрируют ~10- и ~30-кратное снижение степени связывания с этой поверхностью, IL-15 E53PEG30 сохраняет "нативное" связывание с IL-2Rβ. Эти результаты позволяют предположить, что специфическая локализация фрагмента PEG может придавать различные модальности взаимодействию IL-15 с его рецептором.
[329] На фиг. 9A-9С показана зависимость единиц ответа (RU, ось Y) от времени (с, ось X) для rHuIL-15, соединений, конъюгированных с IL-15, связывающихся с IL-15Rα. Анализ кинетики связывания подтверждает, что сайт-специфическое пегилирование модулирует взаимодействие с IL-15Rα.
[330] На фиг. 10 показана зависимость единиц ответа (RU, ось Y) от времени (с, ось X) для rHuIL-15, IL-15 N77PEG30, связывающегося с IL-15Rα и IL-2Rβ. Анализ кинетики связывания подтверждает, что сайт-специфическое пегилирование в положении N77 сохраняет нативное взаимодействие с IL-15Rα и IL-2Rβ.
[331] На фиг. 11 показана зависимость единиц ответа (RU, ось Y) от времени (с, ось X) для rHuIL-15, IL-15 E53PEG30, связывающегося с IL-15Rα и IL-2Rβ. Анализ кинетики связывания подтверждает, что сайт-специфическое пегилирование в положении E53 снижает степень связывания с IL-15Rα, сохраняя при этом нативное взаимодействие с IL-2Rβ.
ПРИМЕР 4
[332] Профилирование иммунного ответа ex vivo конъюгатов IL-15 PEG в образцах РВМС, полученных с помощью системы редукции первичных лейкоцитов человека (LRS)
[333] Для определения того, как разная рецепторная специфичность конъюгатов IL-15 PEG влияет на активацию субпопуляций первичных клеток иммунной системы, осуществляли профилирование концентрации-ответа активации лимфоцитов в образцах мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC) человека, полученных с помощью LRS, с применением многоцветной проточной цитометрии. Эти исследования проводили в PrimityBio LLC (Фремонт, Калифорния). Свежие образцы, полученные с помощью LRS, обрабатывали либо с помощью rHuIL-15, либо различными пегилированными соединениями IL-15 в серии 5-кратных разведений, начиная с максимальной концентрации 30 мкг/мл. Обработанные популяции клеток инкубировали при 37°C в течение 45 минут перед добавлением буфера BD Lyse/Fix и окрашиванием с помощью панели флуоресцентных антител, показанной в таблице 11. Многоцветную проточную цитометрию применяли для выявления и количественной оценки активации pSTAT5 в различных субпопуляциях T-клеток и NK-клеток. Данные проточной цитометрии анализировали в отношении активации различных субпопуляций Т- и NK-клеток в режиме "концентрация-ответ", считывая накопление pSTAT5 после обработки с помощью rHuIL-15 или пегилированных соединений IL-15.
Таблица 11. Панель окрашивания для исследования с помощью проточной цитометрии образцов PBMC, полученных с помощью LRS
[334] В популяциях NK и эффекторных Т-клеток (CD3+ CD8+) IL-15 N77PEG30 и IL-15 S83PEG30 сохраняли эффективность по сравнению с rHuIL-15 со значениями EC50 для получения pSTAT5 в пределах 2-кратного значения, характерного для нативного цитокина. Напротив, значения EC50 в случае индукции pSTAT5 для IL-15 L25PEG30 в популяциях CD8+ T- и NK-клеток были снижены в ~14 и ~18 раз, соответственно, по сравнению с rHuIL-15. Существенное повышение EC50 в случае IL-15 L25PEG30 указывает на то, что пегилирование IL-15 в этом положении снижает агонизм к рецепторам IL-15. Значения EC50 в случае индукции pSTAT5 для IL-15 E53PEG30 в популяциях CD8+ T- и NK-клеток были снижены только в ~2 раза по сравнению с rHuIL-15. В целом, это соединение демонстрирует быструю ассоциацию и быструю кинетику диссоциации связывания с IL-15Rα.
[335] В таблице 12 показана зависимость доза-ответ для передачи сигнала STAT5 (EC50) в образцах человека, полученных с помощью LRS и обработанных с помощью rHuIL-15 или конъюгатов IL-15.
EC50 (нг/мл)
EC50 (нг/мл)
EC50 (нг/мл)
EC50 (нг/мл)
[336] На фиг. 12A-12D показано фосфорилирование STAT5 на NK и CD8+ T-клетках при стимуляции иллюстративными конъюгатами IL-15 PEG.
ПРИМЕР 5
[337] Исследование фармакологии in vivo иллюстративных конъюгатов IL-15
[338] Исследования PK у наивных мышей C57BL/6 (E3826-U1821)
[339] Мышам вводили либо rHuIL-15 и конъюгаты IL-15 S83-PEG с молекулярным весом 30 кДа, V49-PEG с молекулярным весом 30 кДа, L25-PEG с молекулярным весом 30 кДа, либо N77-PEG с молекулярным весом 30 кДа при 0,3 мг/кг. Кровь отбирали через следующие моменты времени: 0,25, 0,5, 2, 8, 24, 48, 72, 96, 120, 144 и 192 часа.
[340] В таблице 13 показана структура эксперимента. Каждая мышь получала однократную IV дозу либо носителя, rHuIL-15, либо одного из трех конъюгатов IL-15.
[341] Концентрации rHuIL-15, пегилированных соединений IL-15 и внутреннего стандарта в образцах, полученных из плазмы крови, определяли с помощью анализа ELISA. Анализ данных PK выполняли в NW Solutions (Сиэтл, Вашингтон). Данные PK импортировали в Phoenix WinNonlin v6.4 (Certara/Pharsight, Принстон, Нью-Джерси) для анализа. Средние концентрации в плазме крови в группе в зависимости от времени анализировали с помощью 3-компонентного способа с применением модели IV болюсного введения.
[342] В таблице 14 показано увеличенное время полужизни конъюгатов IL-15 у мышей по сравнению с rHuIL-15.
(мг/кг)
[343] На фиг. 13 показаны профили концентраций в плазме крови rHuIL-15, IL-15 S83PEG30, IL-15 V49PEG30, IL-15 N77PEG30 и IL-15 PEG30 L25 при 0,3 мг/кг.
[344] Как и ожидалось, пегилированные соединения демонстрируют лучший профиль PK по сравнению с rHuIL-15, как обобщено в таблице 14. MRT (среднее время пребывания) представляет собой среднее время пребывания молекулы тестируемого изделия в организме и принимает во внимание весь профиль PK. Пегилированные соединения демонстрируют ~5-кратное увеличение MRT по сравнению с rHuIL-15. IL-15 S18PEG30 продемонстрировал ~15-кратное увеличение бета t1/2 (15,8 ч против 1,08 ч) и приблизительно 59-кратное снижение CL2 (5,68 против 333 мл/ч/кг) по сравнению с rHuIL-15. Объем распределения пегилированных соединений уменьшался по сравнению с rHuIL-15, что свидетельствует о том, что пегилированные соединения в основном распределяются в системном кровотоке.
ПРИМЕР 6
[345] Фармакодинамические наблюдения в компартменте периферической крови
[346] Исследования PD у наивных мышей C57BL/6 (E3826-U1821)
[347] Мышам вводили либо rHuIL-15, конъюгат IL-15 S18-PEG с молекулярным весом 30 кДа, конъюгат IL-15 V49-PEG с молекулярным весом 30 кДа, либо конъюгат IL-15 S83-PEG с молекулярным весом 30 кДа при 0,1, 0,3 или 1 мг/кг (таблица 10). Кровь отбирали через следующие моменты времени: 0,25, 0,5, 2, 8, 24, 48, 72, 96, 120, 144 и 192 часа. Дополнительный момент времени 0,13 включили в случае rHuIL-15 с учетом известного короткого времени полужизни. Показатели PD включали мониторинг внутриклеточного pSTAT5 и фенотипирование CD8+ Т-клеток для всех моментов времени.
[348] В таблице 15 показана структура эксперимента. Каждая мышь получала однократную IV дозу либо носителя, rHuIL-15, либо одного из трех конъюгатов IL-15.
[349] Фосфорилирование STAT5 и индукцию пролиферации клеток (ранний молекулярный маркер Ki-67 и подсчеты клеток) применяли в качестве фармакодинамических показателей для оценки фармакологического профиля IL-15 S18PEG30, IL-15 V49PEG30 и IL-15 L25 PEG30. В то время как более низкое или аналогичное повышение уровня pSTAT5 наблюдали у мышей, которым вводили пегилированные соединения, фосфорилирование STAT5 переводили в более высокую пролиферацию и устойчивость (дни с 1 по 7 после введения дозы) NK-клеток, CD8+ эффекторных Т-клеток и Т-клеток памяти, но не Treg-клеток. (Фиг. 14-17).
[350] На фиг. 14A-14D показан % pSTAT5 в различных популяциях клеток периферической крови.
[351] На фиг. 15A-15D показана повышенная экспрессия раннего молекулярного маркера пролиферации Ki67 в CD8+ T-, CD8+ Tmem- и NK-клетках, но не в Treg-клетках у животных, которым вводили пегилированные соединения.
[352] На фиг. 16A-16C показаны устойчивые периферические CD8+ T-, CD8+ Tmem- и NK-клетки, но не Treg-клетки у животных, которым вводили пегилированные соединения.
[353] На фиг. 17A-17B показана повышенная экспрессия Ki67 в CD8+ T-и NK-клетках с повышенной дозой соединения IL-15 L25PEG30 у мышей.
Хотя в данном документе были показаны и описаны предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения, специалистам в данной области техники будет очевидно, что такие варианты осуществления предусмотрены только в качестве примера. Многочисленные вариации, изменения и замены теперь будут очевидны специалистам в данной области техники без отклонения от настоящего изобретения. Следует понимать, что различные альтернативы вариантам осуществления настоящего изобретения, описанные в данном документе, можно применять при осуществлении настоящего изобретения на практике. Подразумевается, что нижеследующая формула изобретения определяет объем настоящего изобретения, и что способы и структуры в пределах объема этой формулы изобретения и их эквиваленты охвачены ею.
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> СИНТОРКС, ИНК.
<120> КОНЪЮГАТЫ IL-15 И ПУТИ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ
<130> 46085-713.601
<140> PCT/US2019/019637
<141> 2019-02-26
<150> 62/635,133
<151> 2018-02-26
<160> 5
<170> PatentIn версия 3.5
<210> 1
<211> 114
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 1
Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile
1. 5 10 15
Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His
20 25 30
Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln
35 40 45
Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu
50 55 60
Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val
65 70 75 80
Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile
85 90 95
Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn
100 105 110
Thr Ser
<210> 2
<211> 136
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 2
Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser
1. 5 10 15
Val Ile Met Ser Arg Ala Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys
20 25 30
Lys Ile Glu Asp Leu Ile Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr
35 40 45
Thr Glu Ser Asp Val His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys
50 55 60
Phe Leu Leu Glu Leu Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser
65 70 75 80
Ile His Asp Thr Val Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu
85 90 95
Ser Ser Asn Gly Asn Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu
100 105 110
Leu Glu Glu Lys Asn Ile Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile
115 120 125
Val Gln Met Phe Ile Asn Thr Ser
130 135
<210> 3
<211> 5
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид
<220>
<221> MOD_RES
<222> (4)..(4)
<223> Любая аминокислота, за исключением Pro
<400> 3
Val Pro Gly Xaa Gly
1. 5
<210> 4
<211> 30
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид
<400> 4
Phe Gln Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro
1. 5 10 15
Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln
20 25 30
<210> 5
<211> 5
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид
<400> 5
Gly Gly Gly Gly Ser
1. 5
<---
| название | год | авторы | номер документа |
|---|---|---|---|
| КОНЪЮГАТЫ ЦИТОКИНОВ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ АУТОИММУННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ | 2018 |
|
RU2787201C2 |
| КОНЪЮГАТЫ ЦИТОКИНОВ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ПРОЛИФЕРАТИВНЫХ И ИНФЕКЦИОННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ | 2018 |
|
RU2786116C2 |
| КОНЪЮГАТЫ ИНТЕРЛЕЙКИНА 10 И ВАРИАНТЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ | 2019 |
|
RU2815891C2 |
| ИММУНОЦИТОКИНЫ НА ОСНОВЕ IL-15 И IL-R[альфа] ДОМЕНА SUSHI | 2012 |
|
RU2644671C2 |
| СПОСОБ ОЧИСТКИ КОНЪЮГАТОВ НА ОСНОВЕ IL-15/IL-15R-АЛЬФА | 2015 |
|
RU2701301C2 |
| САЙТ-СПЕЦИФИЧЕСКАЯ КОНЪЮГАЦИЯ АНТИТЕЛО-ЛЕКАРСТВЕННОЕ СРЕДСТВО ПОСРЕДСТВОМ ГЛИКОИНЖЕНЕРИИ | 2014 |
|
RU2711935C2 |
| ГИПЕРГЛИКОЗИЛИРОВАННЫЕ СВЯЗЫВАЮЩИЕ ПОЛИПЕПТИДЫ | 2014 |
|
RU2708314C2 |
| ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЕ КОНСТРУКЦИИ С ПОВЫШЕННОЙ АФФИННОСТЬЮ СВЯЗЫВАНИЯ С АЛЬБУМИНОМ | 2018 |
|
RU2753880C1 |
| ИММУНОЦИТОКИНЫ НА ОСНОВЕ IL-15 И IL-15Rα ДОМЕНА SUSHI | 2012 |
|
RU2763298C2 |
| КОНЪЮГАТ АНТИТЕЛА И ЛЕКАРСТВЕННОГО СРЕДСТВА, КОМПОЗИЦИИ НА ЕГО ОСНОВЕ И СПОСОБЫ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ | 2015 |
|
RU2728235C2 |
Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению конъюгатов интерлейкина 15 (IL-15), и может быть использовано в медицине для лечения рака. Предложены модифицированные полипептиды IL-15, конъюгированные с водорастворимым полимером молекулярной массы 20 кДа - 85 кДа. При этом указанный полимер присоединен к полипептиду IL-15 посредством неприродной аминокислоты с азидогруппой в положении, выбранном из L25, N77, V49 и S83 согласно SEQ ID NO: 1. Изобретение обеспечивает получение конъюгатов IL-15 с увеличенным временем полужизни в сравнении с временем полужизни белка IL-15 дикого типа и со сниженным связыванием с α-рецептором интерлейкина 15 (IL-15Rα), но сохранением значительной степени связывания с сигнальным комплексом βγ-рецептора интерлейкина 15 (IL-15Rβγ) с образованием комплекса IL-15/IL-15Rβγ, где степень связывания с IL-15Rα является сниженной по сравнению со связыванием между полипептидом IL-15 дикого типа и IL-15Rα. 5 н. и 41 з.п. ф-лы, 17 ил., 15 табл., 6 пр.
1. Модифицированный полипептид интерлейкина 15 (IL-15), обладающий увеличенным временем полужизни, где полипептид содержит по меньшей мере одну неприродную аминокислоту и конъюгирующий фрагмент, ковалентно присоединенный по меньшей мере к одной неприродной аминокислоте, где конъюгирующий фрагмент включает водорастворимый полимер, обладающий средневесовым молекулярным весом от приблизительно 20 кДа до приблизительно 85 кДа; где модифицированный полипептид IL-15 обладает по меньшей мере приблизительно 90% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 1; где по меньшей мере одна неприродная аминокислота содержит азидогруппу; где положение по меньшей мере одной неприродной аминокислоты выбрано из L25, N77, V49 и S83, где положения остатков соответствуют положениям, представленным в SEQ ID NO: 1, и где по меньшей мере одна неприродная аминокислота находится в полипептиде в положении, которое увеличивает время полужизни, при этом увеличенное время полужизни сравнивают с временем полужизни белка IL-15 дикого типа.
2. Модифицированный полипептид интерлейкина 15 (IL-15), обладающий сниженным связыванием с α-рецептором интерлейкина 15, где полипептид содержит по меньшей мере одну неприродную аминокислоту и конъюгирующий фрагмент, ковалентно присоединенный по меньшей мере к одной неприродной аминокислоте, где конъюгирующий фрагмент включает водорастворимый полимер, обладающий средневесовым молекулярным весом от приблизительно 20 кДа до приблизительно 85 кДа; где модифицированный полипептид IL-15 обладает по меньшей мере приблизительно 90% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 1; где по меньшей мере одна неприродная аминокислота содержит азидогруппу; где положение по меньшей мере одной неприродной аминокислоты выбрано из L25, N77, V49 и S83, где положения остатков соответствуют положениям, представленным в SEQ ID NO: 1; и где по меньшей мере одна неприродная аминокислота находится в полипептиде в положении, которое снижает связывание между модифицированным полипептидом IL-15 и α-рецептором интерлейкина 15 (IL-15Rα), но сохраняет значительную степень связывания с сигнальным комплексом βγ-рецептора интерлейкина 15 (IL-15Rβγ) с образованием комплекса IL-15/IL-15Rβγ, где степень связывания с IL-15Rα является сниженной по сравнению со связыванием между полипептидом IL-15 дикого типа и IL-15Rα.
3. Модифицированный полипептид IL-15 по п. 1 или 2, отличающийся тем, что одна аминокислота заменена по меньшей мере одной неприродной аминокислотой.
4. Модифицированный полипептид IL-15 по п. 2 или 3, отличающийся тем, что положение остатка по меньшей мере одной неприродной аминокислоты представляет собой E46.
5. Модифицированный полипептид IL-15 по п. 1 или 3, отличающийся тем, что положение остатка по меньшей мере одной неприродной аминокислоты представляет собой V49.
6. Модифицированный полипептид IL-15 по п. 2 или 3, отличающийся тем, что положение остатка по меньшей мере одной неприродной аминокислоты представляет собой E53.
7. Модифицированный полипептид IL-15 по п. 2 или 3, отличающийся тем, что положение остатка по меньшей мере одной неприродной аминокислоты представляет собой L25.
8. Модифицированный полипептид IL-15 по п. 1 или 3, отличающийся тем, что положение остатка по меньшей мере одной неприродной аминокислоты представляет собой S83.
9. Модифицированный полипептид IL-15 по п. 1 или 3, отличающийся тем, что положение остатка по меньшей мере одной неприродной аминокислоты представляет собой N77.
10. Модифицированный полипептид IL-15 по любому из пп. 1-9, в котором по меньшей мере одна неприродная аминокислота представляет собой аналог лизина или содержит ароматическую боковую цепь.
11. Модифицированный полипептид IL-15 по п. 10, в котором по меньшей мере одна неприродная аминокислота включает N6-азидоэтокси-L-лизин (AzK), n-азидометил-L-фенилаланин (pAMF) или n-азидо-L-фенилаланин.
12. Модифицированный полипептид IL-15 по любому из пп. 1-11, в котором водорастворимый полимер включает молекулу PEG.
13. Модифицированный полипептид IL-15 по п. 12, в котором молекула PEG представляет собой линейный PEG.
14. Модифицированный полипептид IL-15 по п. 12, в котором молекула PEG представляет собой разветвленную молекулу PEG.
15. Модифицированный полипептид IL-15 по любому из пп. 12-14, отличающийся тем, что молекула PEG имеет средневесовой молекулярный вес приблизительно 20 кДа, приблизительно 25 кДа, приблизительно 30 кДа, приблизительно 35 кДа, приблизительно 40 кДа, приблизительно 45 кДа или приблизительно 50 кДа.
16. Выделенный и модифицированный полипептид IL-15 по любому из пп. 1-15, в котором конъюгирующий фрагмент связан с по меньшей мере одной неприродной аминокислотой модифицированного полипептида IL-15 посредством линкера.
17. Модифицированный полипептид IL-15 по п. 16, в котором линкер включает гомобифункциональный линкер, гетеробифункциональный линкер, расщепляемый или нерасщепляемый дипептидный линкер, спейсер или их комбинацию.
18. Модифицированный полипептид IL-15 по любому из пп. 1-17, отличающийся тем, что модифицированный полипептид IL-15 содержит N-концевую делецию первых 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 остатков с N-конца, где положения остатков соответствуют положениям в SEQ ID NO: 1.
19. Модифицированный полипептид IL-15 по любому из пп. 2-4, 6, 7 и 10-18, отличающийся тем, что модифицированный полипептид IL-15 способен обеспечивать размножение популяций CD8+ эффекторных наивных клеток и CD8+ эффекторных клеток памяти, клеток, являющихся естественными киллерами (NK), T-клеток, являющихся естественными киллерами (NKT), или их комбинации.
20. Модифицированный полипептид IL-15 по любому из пп. 2-4, 6, 7 и 10-18, в котором конъюгирующий фрагмент или неприродная аминокислота нарушает или блокирует связывание модифицированного полипептида IL-15 с IL-15Rα.
21. Модифицированный полипептид IL-15 по любому из пп. 1, 3, 5 и 8-18, в котором конъюгирующий фрагмент или неприродная аминокислота увеличивает время полужизни, но не нарушает или не блокирует связывание модифицированного полипептида IL-15 с рецепторами IL-15.
22. Модифицированный полипептид IL-15 по любому из пп. 2-4, 6, 7 и 10-18, в котором конъюгирующий фрагмент или неприродная аминокислота повышает степень связывания модифицированного полипептида IL-15 с IL-15Rβ и/или IL-15Rγ.
23. Модифицированный полипептид IL-15 по п. 21, в котором увеличенное время полужизни модифицированного полипептида IL-15 составляет по меньшей мере 90 минут, 2 часа, 3 часа, 4 часа, 5 часов, 6 часов, 7 часов, 8 часов, 9 часов, 10 часов, 11 часов, 12 часов, 18 часов, 24 часа, 36 часов, 48 часов, 3 дня, 4 дня, 5 дней, 6 дней, 7 дней или является более длительным, чем время полужизни полипептида IL-15 дикого типа в плазме крови.
24. Модифицированный полипептид IL-15 по п. 21, в котором увеличенное время полужизни модифицированного полипептида IL-15 составляет приблизительно 90 минут, 2 часа, 3 часа, 4 часа, 5 часов, 6 часов, 7 часов, 8 часов, 9 часов, 10 часов, 11 часов, 12 часов, 18 часов, 24 часа, 36 часов, 48 часов, 3 дня, 4 дня, 5 дней, 6 дней или 7 дней.
25. Модифицированный полипептид IL-15 по любому из пп. 2-4, 6, 7 и 10-18, в котором активация популяции CD8+ эффекторных наивных клеток и CD8+ эффекторных клеток памяти, клеток, являющихся естественными киллерами (NK), или T-клеток, являющихся естественными киллерами (NKT), модифицированным полипептидом IL-15 посредством комплекса IL-15Rβγ обеспечивает сохранение значительной эффективности активации указанной популяции клеток по сравнению с полипептидом IL-15 дикого типа.
26. Модифицированный полипептид IL-15 по п. 25, в котором эффективность рецепторной передачи сигнала модифицированным полипептидом IL-15 комплексу IL-15Rβγ выше, чем эффективность рецепторной передачи сигнала полипептидом IL-15 дикого типа комплексу IL-15Rβγ.
27. Фармацевтическая композиция для лечения рака, содержащая:
эффективное количество модифицированного полипептида IL-15 по любому из пп. 1-26; и
фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество.
28. Фармацевтическая композиция по п. 27, в которой фармацевтическая композиция составлена для парентерального введения.
29. Способ лечения рака у субъекта, нуждающегося в этом, включающий введение субъекту терапевтически эффективного количества модифицированного полипептида IL-15 по любому из пп. 1-26, и, необязательно, дополнительного терапевтического средства.
30. Способ по п. 29, в котором рак представляет собой рак в виде солидной опухоли.
31. Способ по п. 30, в котором рак в виде солидной опухоли представляет собой рак мочевого пузыря, рак кости, рак головного мозга, рак молочной железы, колоректальный рак, рак пищевода, рак глаза, рак головы и шеи, рак почки, рак легкого, меланому, рак яичника, рак поджелудочной железы или рак предстательной железы.
32. Способ по п. 29, в котором рак представляет собой гематологическое злокачественное новообразование.
33. Способ по п. 32, в котором гематологическое злокачественное новообразование представляет собой хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL), мелкоклеточную лимфоцитарную лимфому (SLL), фолликулярную лимфому (FL), диффузную крупноклеточную B-клеточную лимфому (DLBCL), лимфому из клеток мантийной зоны (MCL), макроглобулинемию Вальденстрема, множественную миелому, экстранодальную В-клеточную лимфому из клеток краевой зоны, нодальную В-клеточную лимфому из клеток краевой зоны, лимфому Беркитта, В-клеточную неберкиттовскую лимфому высокой степени злокачественности, первичную медиастинальную B-клеточную лимфому (PMBL), иммунобластную крупноклеточную лимфому, В-лимфобластную лимфому из клеток-предшественников, пролимфоцитарный В-клеточный лейкоз, лимфоплазмоцитарную лимфому, лимфому из клеток краевой зоны селезенки, плазмоклеточную миелому, плазмоцитому, медиастинальную (тимическую) крупноклеточную В-клеточную лимфому, внутрисосудистую крупноклеточную В-клеточную лимфому, первичную эффузионную лимфому или лимфоматоидный гранулематоз.
34. Способ по п. 29, дополнительно включающий введение дополнительного терапевтического средства.
35. Способ по п. 34, в котором модифицированный полипептид IL-15 и дополнительное терапевтическое средство вводят одновременно.
36. Способ по п. 34, в котором модифицированный полипептид IL-15 и дополнительное терапевтическое средство вводят последовательно.
37. Способ по п. 36, в котором модифицированный полипептид IL-15 вводят перед дополнительным терапевтическим средством.
38. Способ по п. 36, в котором модифицированный полипептид IL-15 вводят после введения дополнительного терапевтического средства.
39. Способ по любому из пп. 29-38, в котором субъектом является человек.
40. Способ размножения популяций эффекторных T-клеток (Teff), T-клеток памяти (Tmem) и клеток, являющихся естественными киллерами (NK), включающий:
приведение клетки Teff, Tmem или NK в контакт с модифицированным полипептидом IL-15 по любому из пп. 2-4, 6, 7 и 10-18; и
взаимодействие модифицированного полипептида IL-15 с субъединицами IL-15Rβ и IL-15Rγ с образованием комплекса IL-15/IL-15Rβγ;
где модифицированный полипептид IL-15 характеризуется пониженной аффинностью к субъединице IL-15Rα по сравнению с полипептидом IL-15 дикого типа, и где комплекс IL-15/IL-15Rβγ стимулирует размножение Teff-, Tmem- и NK-клеток.
41. Способ по п. 40, в котором клетка представляет собой эукариотическую клетку.
42. Способ по п. 40 или 41, в котором клетка представляет собой клетку млекопитающего.
43. Способ по любому из пп. 40-42, в котором клетка представляет собой клетку человека.
44. Способ по любому из пп. 40-43, в котором снижение аффинности составляет приблизительно 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% или 99% от снижения аффинности связывания с IL-15Rα по сравнению с полипептидом IL-15 дикого типа.
45. Способ по любому из пп. 40-43, в котором снижение аффинности к IL-15Rα является приблизительно 1-кратным, 2-кратным, 3-кратным, 4-кратным, 5-кратным, 6-кратным, 7-кратным, 8-кратным, 9-кратным, 10-кратным или больше по сравнению с полипептидом IL-15 дикого типа.
46. Способ по любому из пп. 40-45, в котором конъюгирующий фрагмент нарушает или блокирует связывание модифицированного полипептида IL-15 с IL-15Rα.
| US 9328159 B2, 03.05.2016. WO 2015153753 А2, 08.10.2015. US 2006057680 A1, 16.03.2006. DEITERS A | |||
| et al., Site-specific PEGylation of proteins containing unnatural amino acids, BIORGANIC & MEDICINAL CHEMISTRY LETTERS, 2004, v | |||
| Паровоз для отопления неспекающейся каменноугольной мелочью | 1916 |
|
SU14A1 |
| Прибор для равномерного смешения зерна и одновременного отбирания нескольких одинаковых по объему проб | 1921 |
|
SU23A1 |
