КОНЪЮГАТЫ ЦИТОКИНОВ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ПРОЛИФЕРАТИВНЫХ И ИНФЕКЦИОННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ Российский патент 2022 года по МПК C07K14/55 C12N15/26 A61K38/20 

Ссылка

[1] По настоящей заявке испрашивается приоритет в соответствии с предварительной заявкой на патент США №62/540781, поданной 3 августа 2017 г., которая полностью включена в настоящий документ посредством ссылки.

Перечень последовательностей

[2] В настоящей заявке содержится Перечень последовательностей, который был представлен в электронном виде в формате ASCII и полностью включен в настоящий документ посредством ссылки. Указанная копия ASCII, созданная 27 июля 2018 г., характеризуется именем 46085-710_601_SL.txt и размером 3703 байта.

Предшествующий уровень техники настоящего изобретения

[3] Различные популяции Т-клеток модулируют иммунную систему для поддержания иммунного гомеостаза и толерантности. Например, регуляторные Т-клетки (Treg) предотвращают неадекватные реакции иммунной системы, предотвращая патологическую самореактивность, в то время как цитотоксические Т клетки нацеленно воздействуют и уничтожают инфицированные клетки и/или раковые клетки. В некоторых случаях модуляция различных популяций Т-клеток обеспечивает возможность лечения заболевания или показания.

Краткое раскрытие настоящего изобретения

[4] В настоящем документе согласно определенным вариантам осуществления раскрыты конъюгаты цитокинов и их применение для лечения одного или нескольких показаний. Согласно некоторым вариантам осуществления в настоящем документе также описаны конъюгаты интерлейкина 2 (IL-2) и применение для лечения одного или нескольких показаний. В некоторых случаях одно или несколько показаний включают в себя рак или патогенную инфекцию. В некоторых случаях в настоящем документе описаны способы модуляции взаимодействия между IL-2 и рецептором IL-2 для стимуляции или экспансии популяций специфических Т-клеток, клеток естественных киллеров (NK) и/или Т-клеток естественных киллеров (NKT). В дополнительных случаях дополнительно в настоящем документе описаны фармацевтические композиции и наборы, которые содержат один или несколько описанных в настоящем документе конъюгатов интерлейкина (например, конъюгатов IL-2).

[5] В настоящем документе согласно некоторым вариантам осуществления раскрыт конъюгат интерлейкина 2 (IL-2), содержащий: выделенный и очищенный полипептид IL-2 и конъюгирующий фрагмент, который связывается с выделенным и очищенным полипептидом IL-2 в положении аминокислотного остатка, выбранном из K35, Т37, R38, Т41, F42, K43, F44, Y45, Е61, Е62, Е68, K64, Р65, V69, L72 и Y107, причем нумерация аминокислотных остатков соответствует SEQ ID NO 1. Согласно некоторым вариантам осуществления положение аминокислоты выбрано из Т37, R38, Т41, F42, F44, Y45, Е61, Е62, Е68, K64, Р65, V69, L72 и Y107. Согласно некоторым вариантам осуществления положение аминокислоты выбрано из Т37, R38, Т41, F42, F44, Y45, Е61, Е62, Е68, Р65, V69, L72 и Y107. Согласно некоторым вариантам осуществления положение аминокислоты выбрано из Т37, Т41, F42, F44, Y45, Р65, V69, L72 и Y107. Согласно некоторым вариантам осуществления положение аминокислоты выбрано из R38 и K64. Согласно некоторым вариантам осуществления положение аминокислоты выбрано из Е61, Е62 и Е68. Согласно некоторым вариантам осуществления положение аминокислоты находится в Е62. Согласно некоторым вариантам осуществления аминокислотный остаток, выбранный из K35, Т37, R38, Т41, F42, K43, F44, Y45, Е61, Е62, Е68, K64, Р65, V69, L72 и Y107, дополнительно мутирует в лизин, цистеин или гистидин. Согласно некоторым вариантам осуществления аминокислотный остаток мутирует в цистеин. Согласно некоторым вариантам осуществления аминокислотный остаток мутирует в лизин. Согласно некоторым вариантам осуществления аминокислотный остаток, выбранный из K35, Т37, R38, Т41, F42, K43, F44, Y45, Е61, Е62, Е68, К64, Р65, V69, L72 и Y107, дополнительно мутирует в неприродную аминокислоту. Согласно некоторым вариантам осуществления неприродная аминокислота включает в себя N6-азидоэтокси-L-лизин (AzK), N6-пропаргилэтокси-L-лизин (PraK), BCN-L-лизин, норборнен-лизин, ТСО-лизин, метилтетразинлизин, аллилоксикарбониллизин, 2-амино-8-оксононановую кислоту, 2-амино-8-оксооктановую кислоту, п-ацетил-L-фенилаланин, п-азидометил-L-фенилаланин (pAMF), п-йод-L-фенилаланин, м-ацетилфенилаланин, 2-амино-8-оксононановую кислоту, п-пропаргилоксифенилаланин, п-пропаргилфенилаланин, 3-метилфенилаланин, L-ДОФА, фторированный фенилаланин, изопропил-L-фенилаланин, п-азидо-L-фенилаланин, п-ацил-L-фенилаланин, п-бензоил-L-фенилаланин, п-бромфенилаланин, п-амино-L-фенилаланин, изопропил-L-фенилаланин, О-аллилтирозин, О-метил-L-тирозин, О-4-аллил-L-тирозин, 4-пропил-L-тирозин, фосфонотирозин, три-О-ацетил-GlcNAcp-серин, L-фосфосерин, фосфоносерин, L-3-(2-нафтил)аланин, 2-амино-3-((2-((3-(бензилокси)-3-оксопропил)амино)этил)селанил)пропановую кислоту, 2-амино-3-(фенилселанил)пропаноил или селеноцистеин. Согласно некоторым вариантам осуществления конъюгат IL-2 характеризуется сниженной аффинностью к субъединице рецептора α IL-2 (IL-2Rα) относительно полипептида IL-2 дикого типа. Согласно некоторым вариантам осуществления сниженная аффинность представляет собой снижение около на 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% или более чем 99% аффинности связывания к IL-2Rα относительно полипептида IL-2 дикого типа. Согласно некоторым вариантам осуществления сниженная аффинность составляет около 1-кратную, 2-кратную, 3-кратную, 4-кратную, 5-кратную, 6-кратную, 7-кратную, 8-кратную, 9-кратную, 10-кратную, 30-кратную, 50-кратную, 100-кратную, 200-кратную, 300-кратную, 500-кратную, 1000-кратную или более относительно полипептида IL-2 дикого типа. Согласно некоторым вариантам осуществления конъюгирующий фрагмент ослабляет или блокирует связывание IL-2 с IL-2Rα. Согласно некоторым вариантам осуществления конъюгирующий фрагмент содержит водорастворимый полимер. Согласно некоторым вариантам осуществления дополнительный конъюгирующий фрагмент содержит водорастворимый полимер. Согласно некоторым вариантам осуществления каждый из водорастворимых полимеров независимо включает в себя полиэтиленгликоль (PEG), поли(пропиленгликоль) (PPG), сополимеры этиленгликоля и пропиленгликоля, поли(оксиэтилированный полиол), поли(олефиновый спирт), поли(винилпирролидон), поли(гидроксиалкилметакриламид), поли(гидроксиалкилметакрилат), поли(сахариды), поли(α-гидроксикислоту), поли(виниловый спирт), полифосфазен, полиоксазолины (POZ), поли(N-акрилоилморфолин) или их комбинации. Согласно некоторым вариантам осуществления каждый из водорастворимых полимеров независимо содержит PEG. Согласно некоторым вариантам осуществления PEG представляет собой линейный PEG или разветвленный PEG. Согласно некоторым вариантам осуществления каждый из водорастворимых полимеров независимо содержит полисахарид. Согласно некоторым вариантам осуществления полисахарид включает в себя декстран, полисиаловую кислоту (PSA), гиалуроновую кислоту (НА), амилозу, гепарин, гепарансульфат (HS), декстрин или гидроксиэтилкрахмал (HES). Согласно некоторым вариантам осуществления каждый из водорастворимых полимеров независимо содержит гликан. Согласно некоторым вариантам осуществления каждый из водорастворимых полимеров независимо содержит полиамин. Согласно некоторым вариантам осуществления конъюгирующий фрагмент содержит белок. Согласно некоторым вариантам осуществления дополнительная конъюгирующая часть содержит белок. Согласно некоторым вариантам осуществления каждый из белков независимо содержит альбумин, трансферрин или транстиретин. Согласно некоторым вариантам осуществления каждый из белков независимо содержит часть Fc. Согласно некоторым вариантам осуществления каждый из белков независимо содержит Fc-часть IgG. Согласно некоторым вариантам осуществления конъюгирующий фрагмент содержит полипептид. Согласно некоторым вариантам осуществления дополнительная конъюгирующая часть содержит полипептид. Согласно некоторым вариантам осуществления каждый из полипептидов независимо содержит пептид XTEN, глицин-богатый гомоаминокислотный полимер (НАР), полипептид PAS, эластиноподобный полипептид (ELP), пептид СТР или полимер желатиноподобного белка (GLK). Согласно некоторым вариантам осуществления выделенный и очищенный полипептид IL-2 модифицирован глутамилированием. Согласно некоторым вариантам осуществления конъюгирующий фрагмент непосредственно связан с выделенным и очищенным полипептидом IL-2. Согласно некоторым вариантам осуществления конъюгирующий фрагмент опосредованно связан с выделенным и очищенным полипептидом IL-2 через линкер. Согласно некоторым вариантам осуществления линкер включает в себя гомобифункциональный линкер. Согласно некоторым вариантам осуществления гомобифункциональный линкер содержит реагент Ломанта дитиобис(сукцинимидилпропионат) DSP, 3'3'-дитиобис(сульфосукцинимидилпропионат) (DTSSP), дисукцинимидилсуберат (DSS), бис(сульфосукцинимидил)суберат (BS), дисукцинимидилтартрат (DST), дисульфосукцинимидилтартрат (сульфо DST), этиленгликобис(сукцинимидилсукцинат) (EGS), дисукцинимидилглутарат (DSG), N,N'-дисукцинимидилкарбонат (DSC), диметиладипимидат (DMA), диметилпимелимидат (DMP), диметилсуберимидат (DMS), диметил-3,3'-дитиобиспропионимидат (DTBP), 1,4-ди-(3'-(2'-пиридилдитио)пропионамидо)бутан (DPDPB), бисмалеимидогексан (ВМН), арилгалогенидсодержащее соединение (DFDNB) такое как, например, 1,5-дифтор-2,4-динитробензол или 1,3-дифтор-4,6-динитробензол, 4,4'-дифтор-3,3'-динитрофенилсульфон (DFDNPS), бис-[β-(4-азидосалициламидо)этил]дисульфид (BASED), формальдегид, глутаральдегид, диглицидиловый эфир 1,4-бутандиола, дигидразид адипиновой кислоты, карбогидразид, о-толуидин, 3,3'-диметилбензидин, бензидин, α,α'-п-диаминодифенил, дийод-п-ксилолсульфокислоту, N,N'-этилен-бис(йодацетамид) или N,N'-гексаметилен-бис(йодацетамид). Согласно некоторым вариантам осуществления линкер включает в себя гетеробифункциональный линкер. Согласно некоторым вариантам осуществления гетеробифункциональный линкер содержит N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)пропионат (sPDP), длинноцепочечный N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)пропионат (LC-sPDP), растворимый в воде длинноцепочечный N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)пропионат (сульфо-LC-sPDP), сукцинимидилоксикарбонил-α-метил-α-(2-пиридилдитио)толуол (sMPT), сульфосукцинимидил-6-[α-метил-α-(2-пиридилдитио)толуамидо]гексаноат (сульфо-LC-sMPT), сукцинимидил-4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат (sMCC), сульфосукцинимидил-4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат (сульфо-sMCC), сложный эфир м-малеимидобензоил-N-гидроксисукцинимида (MBS), сложный эфир м-малеимидобензоил-N-гидроксисульфосукцинимида (сульфо-МВ), N-сукцинимидил(4-йодацетил)аминобензоат (SIAB), сульфосукцинимидил(4-йодацетил)аминобензоат (сульфо-sIAB), сукцинимидил-4-(п-малеимидофенил)бутират (sMPB), сульфосукцинимидил-4-(п-малеимидофенил)бутират (сульфо-sMPB), сложный эфир N-(γ-малеимидобутирилокси)сукцинимида (GMBs), сложный эфир N-(γ-малеимидобутирилокси)сульфосукцинимида (сульфо-GMBs), сукцинимидил-6-((йодацетил)амино)гексаноат (sIAX), сукцинимидил-6-[6-(((йодацетил)амино)гексаноил)амино]гексаноат (sIAXX), сукцинимидил-4-(((йодацетил)амино)метил)циклогексан-1-карбоксилат (sIAC), сукцинимидил-6-(((((4-йодацетил)амино)метил)циклогексан-1-карбонил)амино)гексаноат (sIACX), п-нитрофенилйодацетат (NPIA), карбонил-реактивные и сульфгидрильно-реактивные сшиватели, такие как гидразид 4-(4-N-малеимидофенил)масляной кислоты (МРВН), 4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилгидразид-8 (М₂С₂Н), 3-(2-пиридилдитио)пропионилгидразид (PDPH), N-гидроксисукцинимидил-4-азидосалициловая кислота (NHs-AsA), N-гидроксисульфосукцинимидил-4-азидосалициловая кислота (сульфо-NHs-AsA), сульфосукцинимидил-(4-азидосалициламидо)гексаноат (сульфо-NHs-LC-AsA), сульфосукцинимидил-2-(п-азидосалициламидо)этил-1,3'-дитиопропионат (sAsD), N-гидроксисукцинимидил-4-азидобензоат (HsAB), N-гидроксисульфосукцинимидил-4-азидобензоат (сульфо-HsAB), N-сукцинимидил-6-(4'-азидо-2'-нитрофениламино)гексаноат (sANPAH), сульфосукцинимидил-6-(4'-азидо-2'-нитрофениламино)гексаноат (сульфо-sANPAH), N-5-азидо-2-нитробензоилоксисукцинимид (ANB-NOs), сульфосукцинимидил-2-(м-азидо-о-нитробензамидо)этил-1,3'-дитиопропионат (sAND), N-сукцинимидил-4(4-азидофенил)1,3'-дитиопропионат (sADP), N-сульфосукцинимидил(4-азидофенил)-1,3'-дитиопропионат (сульфо-sADP), сульфосукцинимидил-4-(п-азидофенил)бутират (сульфо-sAPB), сульфосукцинимидил-2-(7-азидо-4-метилкумарин-3-ацетамид)этил-1,3'-дитиопропионат (sAED), сульфосукцинимидил-7-азидо-4-метилкумарин-3-ацетат (сульфо-САМСА), п-нитрофенилдиазопируват (ρNPDP), п-нитрофенил-2-диазо-3,3,3-трифторпропионат (PNP-DTP), 1-(п-азидосалициламидо)-4-(йодацетамидо)бутан (AsIB), N-[4-(п-азидосалициламидо)бутил]-3'-(2'-пиридилдитио)пропионамид (APDP), бензофенон-4-йодацетамид, п-азидобензоилгидразид (АВН), 4-(п-азидосалициламидо)бутиламин (AsBA) или п-азидофенилглиоксаль (APG). Согласно некоторым вариантам осуществления линкер включает в себя расщепляемый линкер, необязательно включающий в себя дипептидный линкер. Согласно некоторым вариантам осуществления дипептидный линкер содержит Val-Cit, Phe-Lys, Val-Ala или Val-Lys. Согласно некоторым вариантам осуществления линкер включает в себя нерасщепляемый линкер. Согласно некоторым вариантам осуществления линкер содержит малеимидную группу, необязательно содержащую малеимидокапроил (mc), сукцинимидил-4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат (sMCC) или сульфосукцинимидил-4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат (сульфо-sMCC). Согласно некоторым вариантам осуществления линкер дополнительно содержит спейсер. Согласно некоторым вариантам осуществления спейсер включает в себя п-аминобензиловый спирт (РАВ), п-аминобензилоксикарбонил (РАВС), его производное или аналог.Согласно некоторым вариантам осуществления конъюгирующий фрагмент способен продлевать период полужизни в сыворотке конъюгата IL-2. Согласно некоторым вариантам осуществления дополнительный конъюгирующий фрагмент способен продлевать период полужизни в сыворотке конъюгата IL-2.

[6] В настоящем документе согласно некоторым вариантам осуществления раскрыт конъюгат интерлейкина 2 (IL-2), содержащий: выделенный и очищенный полипептид IL-2 и конъюгирующий фрагмент; причем конъюгат IL-2 характеризуется сниженной аффинностью к субъединице а рецептора IL-2 (IL-2Rα) по сравнению с полипептидом IL-2 дикого типа. Согласно некоторым вариантам осуществления конъюгирующий фрагмент связан с аминокислотным остатком, который взаимодействует с IL-2Rα. Согласно некоторым вариантам осуществления конъюгирующий фрагмент связан с аминокислотным остатком, выбранным из K35, Т37, R38, Т41, F42, K43, F44, Y45, Е61, Е62, Е68, K64, Р65, V69, L72 и Y107, причем нумерация аминокислотных остатков соответствует SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам осуществления конъюгирующий фрагмент содержит водорастворимый полимер. Согласно некоторым вариантам осуществления дополнительный конъюгирующий фрагмент содержит водорастворимый полимер. Согласно некоторым вариантам осуществления каждый из водорастворимых полимеров независимо включает в себя полиэтиленгликоль (PEG), поли(пропиленгликоль) (PPG), сополимеры этиленгликоля и пропиленгликоля, поли(оксиэтилированный полиол), поли(олефиновый спирт), поли(винилпирролидон), поли(гидроксиалкилметакриламид), поли(гидроксиалкилметакрилат), поли(сахариды), поли(α-гидроксикислоту), поли(виниловый спирт), полифосфазен, полиоксазолины (POZ), поли(N-акрилоилморфолин) или их комбинации. Согласно некоторым вариантам осуществления каждый из водорастворимых полимеров независимо содержит PEG. Согласно некоторым вариантам осуществления PEG представляет собой линейный PEG или разветвленный PEG. Согласно некоторым вариантам осуществления каждый из водорастворимых полимеров независимо содержит полисахарид. Согласно некоторым вариантам осуществления полисахарид включает в себя декстран, полисиаловую кислоту (PSA), гиалуроновую кислоту (НА), амилозу, гепарин, гепарансульфат (HS), декстрин или гидроксиэтилкрахмал (HES). Согласно некоторым вариантам осуществления каждый из водорастворимых полимеров независимо содержит гликан. Согласно некоторым вариантам осуществления каждый из водорастворимых полимеров независимо содержит полиамин. Согласно некоторым вариантам осуществления конъюгирующий фрагмент содержит белок. Согласно некоторым вариантам осуществления дополнительная конъюгирующая часть содержит белок. Согласно некоторым вариантам осуществления каждый из белков независимо содержит альбумин, трансферрин или транстиретин. Согласно некоторым вариантам осуществления каждый из белков независимо содержит Fc-часть. Согласно некоторым вариантам осуществления каждый из белков независимо содержит Fc-часть IgG Согласно некоторым вариантам осуществления конъюгирующий фрагмент содержит полипептид. Согласно некоторым вариантам осуществления дополнительная конъюгирующая часть содержит полипептид. Согласно некоторым вариантам осуществления каждый из полипептидов независимо содержит пептид XTEN, глицин-богатый гомоаминокислотный полимер (НАР), полипептид PAS, эластиноподобный полипептид (ELP), пептид СТР или полимер желатиноподобного белка (GLK). Согласно некоторым вариантам осуществления выделенный и очищенный полипептид IL-2 модифицирован глутамилированием. Согласно некоторым вариантам осуществления конъюгирующий фрагмент непосредственно связан с выделенным и очищенным полипептидом IL-2. Согласно некоторым вариантам осуществления конъюгирующий фрагмент опосредованно связан с выделенным и очищенным полипептидом IL-2 через линкер. Согласно некоторым вариантам осуществления линкер включает в себя гомобифункциональный линкер. Согласно некоторым вариантам осуществления гомобифункциональный линкер содержит реагент Ломанта дитиобис(сукцинимидилпропионат) DSP, 3'3'-дитиобис(сульфосукцинимидилпропионат) (DTSSP), дисукцинимидилсуберат (DSS), бис(сульфосукцинимидилсуберат) (BS), дисукцинимидилтартрат (DST), дисульфосукцинимидилтартрат (сульфо DST), этиленгликобис(сукцинимидилсукцинат) (EGS), дисукцинимидилглутарат (DSG), N,N'-дисукцинимидилкарбонат (DSC), диметиладипимидат (DMA), диметилдиметилпимелимидат (DMP), диметил-3,3'-дитиобиспропионимидат (DTBP), 1,4-ди-(3'-(2'-пиридилдитио)пропионамидо)бутан (DPDPB), бисмалеимидогексан (ВМН), арилгалогенидсодержащее соединение (DFDNB), такое как, например, 1,5-дифтор-2,4-динитробензол или 1,3-дифтор-4,6-динитробензол, 4,4'-дифтор-3,3'-динитрофенилсульфон (DFDNPS), бис-[р-(4-азидосалициламидо)этил]дисульфид (BASED), формальдегид, глутаральдегид, диглицидиловый эфир 1,4-бутандиола, дигидразид адипиновой кислоты, карбогидразид, о-толуидин, 3,3'-диметилбензидин, бензидин, α,α'-п-диаминодифенил, дийод-п-ксилолсульфокислоту, N,N'-этилен-бис(йодацетамид) или N,N'-гексаметилен-бис(йодацетамид). Согласно некоторым вариантам осуществления линкер включает в себя гетеробифункциональный линкер. Согласно некоторым вариантам осуществления гетеробифункциональный линкер содержит N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)пропионат (sPDP), длинноцепочечный N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)пропионат (LC-sPDP), растворимый в воде длинноцепочечный N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)пропионат (сульфо-LC-sPDP), сукцинимидилоксикарбонил-α-метил-α-(2-пиридилдитио)толуол (sMPT), сульфосукцинимидил-6-[α-метил-α-(2-пиридилдитио)толуамидо]гексаноат (сульфо-LC-sMPT), сукцинимидил-4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат (sMCC), сульфосукцинимидил-4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат (сульфо-sMCC), сложный эфир м-малеимидобензоил-N-гидроксисукцинимида (MBS), сложный эфир м-малеимидобензоил-N-гидроксисульфосукцинимида (сульфо-МВ), N-сукцинимидил(4-йодацетил)аминобензоат (sIAB), сульфосукцинимидил(4-йодацетил)аминобензоат (сульфо-sIAB), сукцинимидил-4-(п-малеимидофенил)бутират (sMPB), сульфосукцинимидил-4-(п-малеимидофенил)бутират (сульфо-sMPB), сложный эфир N-(γ-малеимидобутирилокси)сукцинимида (GMBs), сложный эфир N-(γ-малеимидобутирилокси)сульфосукцинимида (сульфо-GMBs), сукцинимидил-6-((йодацетил)амино)гексаноат (sIAX), сукцинимидил-6-[6-(((йодацетил)амино)гексаноил)амино]гексаноат (sIAXX), сукцинимидил-4-(((йодацетил)амино)метил)циклогексан-1-карбоксилат (sIAC), сукцинимидил-6-(((((4-йодацетил)амино)метил)циклогексан-1-карбонил)амино)гексаноат (sIACX), п-нитрофенилйодацетат (NPIA), карбонил-реактивные и сульфгидрильно-реактивные сшиватели, такие как гидразид 4-(4-N-малеимидофенил)масляной кислоты (МРВН), 4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилгидразид-8 (М₂С₂Н), 3-(2-пиридилдитио)пропионилгидразид (PDPH), N-гидроксисукцинимидил-4-азидосалициловая кислота (NHs-AsA), N-гидроксисульфосукцинимидил-4-азидосалициловая кислота (сульфо-NHs-AsA), сульфосукцинимидил-(4-азидосалициламидо)гексаноат (сульфо-NHs-LC-AsA), сульфосукцинимидил-2-(п-азидосалициламидо)этил-1,3'-дитиопропионат (sAsD), N-гидроксисукцинимидил-4-азидобензоат (HsAB), N-гидроксисульфосукцинимидил-4-азидобензоат (сульфо-HsAB), N-сукцинимидил-6-(4'-азидо-2'-нитрофениламино)гексаноат (sANPAH), сульфосукцинимидил-6-(4'-азидо-2'-нитрофениламино)гексаноат (сульфо-sANPAH), N-5-азидо-2-нитробензоилоксисукцинимид (ANB-NOs), сульфосукцинимидил-2-(м-азидо-о-нитробензамидо)этил-1,3'-дитиопропионат (sAND), N-сукцинимидил-4(4-азидофенил)1,3'-дитиопропионат (sADP), N-сульфосукцинимидил(4-азидофенил)-1,3'-дитиопропионат (сульфо-sADP), сульфосукцинимидил-4-(п-азидофенил)бутират (сульфо-sAPB), сульфосукцинимидил-2-(7-азидо-4-метилкумарин-3-ацетамид)этил-1,3'-дитиопропионат (sAED), сульфосукцинимидил-7-азидо-4-метилкумарин-3-ацетат (сульфо-sAMCA), п-нитрофенилдиазопируват (ρNPDP), п-нитрофенил-2-диазо-3,3,3-трифторпропионат (PNP-DTP), 1-(п-азидосалициламидо)-4-(йодацетамидо)бутан (AsIB), N-[4-(п-азидосалициламидо)бутил]-3'-(2'-пиридилдитио)пропионамид (APDP), бензофенон-4-йодацетамид, п-азидобензоилгидразид (АВН), 4-(п-азидосалициламидо)бутиламин (AsBA) или п-азидофенилглиоксаль (APG). Согласно некоторым вариантам осуществления линкер включает в себя расщепляемый линкер, необязательно включающий в себя дипептидный линкер. Согласно некоторым вариантам осуществления дипептидный линкер содержит Val-Cit, Phe-Lys, Val-Ala или Val-Lys. Согласно некоторым вариантам осуществления линкер включает в себя нерасщепляемый линкер. Согласно некоторым вариантам осуществления линкер содержит малеимидную группу, необязательно содержащую малеимидокапроил (mc), сукцинимидил-4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат (sMCC) или сульфосукцинимидил-4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат (сульфо-sMCC). Согласно некоторым вариантам осуществления линкер дополнительно содержит спейсер. Согласно некоторым вариантам осуществления спейсер включает в себя п-аминобензиловый спирт (РАВ), п-аминобензилоксикарбонил (РАВС), его производное или аналог. Согласно некоторым вариантам осуществления конъюгирующий фрагмент способен продлевать период полужизни в сыворотке конъюгата IL-2. Согласно некоторым вариантам осуществления дополнительный конъюгирующий фрагмент способен продлевать период полужизни в сыворотке конъюгата IL-2.

[7] В настоящем документе согласно некоторым вариантам осуществления раскрыт выделенный и модифицированный полипептид интерлейкин 2 (IL-2), содержащий по меньшей мере одну неприродную аминокислоту в положении на полипептиде, которое уменьшает связывание между модифицированным полипептидом IL-2 и рецептором а интерлейкина 2 (IL-2Rα), но не оказывает значительного влияния на связывание с сигнальным комплексом рецептора βγ интерлейкина 2 (IL-2Rβγ) с образованием комплекса IL-2/IL-2Rβγ, причем сниженное связывание с IL-2Rα сравнивается со связыванием между полипептидом IL-2 дикого типа и IL-2Rα. Согласно некоторым вариантам осуществления положение по меньшей мере одной неприродной аминокислоты выбрано из K35, Т37, R38, Т41, F42, K43, F44, Y45, Е60, Е61, Е62, K64, Р65, Е68, V69, N71, L72, М104, С105 и Y107, причем положения остатков соответствуют положениям 35, 37, 38, 41, 42, 43, 44, 45, 61, 62, 64, 65, 68, 69, 71, 72, 104, 105 и 107, как представлено в SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам осуществления положение по меньшей мере одной неприродной аминокислоты выбрано из Т37, R38, Т41, F42, K43, F44, Y45, Е61, Е62, Р65, Е68 и L72, причем положения остатков соответствуют положениям 37, 38, 41, 42, 43, 44, 45, 61, 62, 65, 68 и 72, как представлено в SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам осуществления положение по меньшей мере одной неприродной аминокислоты выбрано из K35, K64, V69, N71, М104, С105 и Y107, причем положения остатков соответствуют положениям 35, 64, 69, 71, 104, 105 и 107, как представлено в SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам осуществления положение по меньшей мере одной неприродной аминокислоты выбрано из Т37, R38, Т41, Y45, Е61, Е68 и L72, причем положения остатков соответствуют положениям 37, 38, 41, 45, 61, 68 и 72, как представлено в SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам осуществления положение по меньшей мере одной неприродной аминокислоты выбрано из F42, K43, F44, Е62 и Р65, причем положения остатков соответствуют положениям 42, 43, 44, 62 и 65, как представлено в SEQ. ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам осуществления по меньшей мере одна неприродная аминокислота: представляет собой аналог лизина; содержит ароматическую боковую цепь; содержит азидогруппу или содержит альдегидную или кетоновую группу. Согласно некоторым вариантам осуществления по меньшей мере одна неприродная аминокислота не содержит ароматической боковой цепи. Согласно некоторым вариантам осуществления по меньшей мере одна неприродная аминокислота включает в себя N6-азидоэтокси-L-лизин (AzK), N6-пропаргилэтокси-L-лизин (PraK), BCN-L-лизин, норборнен-лизин, ТСО-лизин, метилтетразинлизин, аллилоксикарбониллизин, 2-амино-8-оксононановую кислоту, 2-амино-8-оксооктановую кислоту, п-ацетил-L-фенилаланин, п-азидометил-L-фенилаланин (pAMF), п-йод-L-фенилаланин, м-ацетилфенилаланин, 2-амино-8-оксононановую кислоту, п-пропаргилоксифенилаланин, п-пропаргилфенилаланин, 3-метилфенилаланин, L-ДОФА, фторированный фенилаланин, изопропил-L-фенилаланин, п-азидо-L-фенилаланин, п-ацилаланин-L-фенилаланин, п-бензоил-L-фенилаланин, п-бромфенилаланин, п-амино-L-фенилаланин, изопропил-L-фенилаланин, О-аллилтирозин, О-метил-L-тирозин, O-4-аллил-L-тирозин, 4-пропил-L-тирозин, фосфонотирозин, три-O-ацетил-ClcNAcp-серин, L-фосфосерин, фосфоносерин, L-3-(2-нафтил)аланин, 2-амино-3-((2-((3-(бензилокси)-3-оксопропил)амино)этил)селанил)пропановую кислоту, 2-амино-3-(фенилселанил)пропаноил или селеноцистеин. Согласно некоторым вариантам осуществления по меньшей мере одна неприродная аминокислота включена в модифицированный полипептид IL-2 с помощью ортогональной пары тРНК-синтетаза/тРНК. Согласно некоторым вариантам осуществления ортогональная тРНК ортогональной пары синтетаза/тРНК содержит по меньшей мере одно неприродное нуклеотидное основание. Согласно некоторым вариантам осуществления модифицированный полипептид IL-2 ковалентно присоединен к конъюгирующему фрагменту по меньшей мере через одну не природную аминокислоту. Согласно некоторым вариантам осуществления конъюгирующий фрагмент содержит водорастворимый полимер, липид, белок или пептид. Согласно некоторым вариантам осуществления водорастворимый полимер включает в себя полиэтиленгликоль (PEG), поли(пропиленгликоль) (PPG), сополимеры этиленгликоля и пропиленгликоля, поли(оксиэтилированный полиол), поли(олефиновый спирт), поли(винилпирролидон), поли(гидроксиалкилметакриламид), поли(гидроксиалкилметакрилат), поли(сахариды), поли(α-гидроксикислоту), поли(виниловый спирт), полифосфазен, полиоксазолины (POZ), поли(N-акрилоилморфолин) или их комбинации. Согласно некоторым вариантам осуществления водорастворимый полимер содержит молекулу PEG. Согласно некоторым вариантам осуществления молекула PEG представляет собой линейный PEG. Согласно некоторым вариантам осуществления молекула PEG представляет собой разветвленный PEG. Согласно некоторым вариантам осуществления водорастворимый полимер содержит полисахарид. Согласно некоторым вариантам осуществления полисахарид содержит декстран, полисиаловую кислоту (PSA), гиалуроновую кислоту (НА), амилозу, гепарин, гепарансульфат (HS), декстрин или гидроксиэтилкрахмал (HES). Согласно некоторым вариантам осуществления липид содержит жирную кислоту. Согласно некоторым вариантам осуществления жирная кислота содержит от около 6 до около 26 атомов углерода, от около 6 до около 24 атомов углерода, от около 6 до около 22 атомов углерода, от около 6 до около 20 атомов углерода, от около 6 до около 18 атомов углерода, от около 20 до около 26 атомов углерода, от около 12 до около 26 атомов углерода, от около 12 до около 24 атомов углерода, от около 12 до около 22 атомов углерода, от около 12 до около 20 атомов углерода или от около 12 до около 18 атомов углерода. Согласно некоторым вариантам осуществления жирная кислота представляет собой насыщенную жирную кислоту. Согласно некоторым вариантам осуществления белок включает в себя альбумин, трансферрин или транстиретин. Согласно некоторым вариантам осуществления белок содержит агонист TLR. Согласно некоторым вариантам осуществления белок включает в себя антитело или его связывающие фрагменты. Согласно некоторым вариантам осуществления антитело или его связывающие фрагменты включают в себя Fc-часть антитела. Согласно некоторым вариантам осуществления пептид включает в себя пептид XTEN, глицин-обогащенный гомоаминокислотный полимер (НАР), полипептид PAS, эластиноподобный полипептид (ELP), пептид СТР или полимер желатиноподобного белка (GLK). Согласно некоторым вариантам осуществления конъюгирующий фрагмент опосредованно связан по меньшей мере с одной неприродной аминокислотой модифицированного IL-2 через линкер. Согласно некоторым вариантам осуществления линкер включает в себя гомобифункциональный линкер, гетеробифункциональный линкер, линкер нулевой длины, расщепляемый или нерасщепляемый дипептидный линкер, малеимидную группу, спейсер или их комбинацию. Согласно некоторым вариантам осуществления снижение аффинности связывания составляет около 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% или 99% снижения аффинности связывания с IL-2Rα относительно полипептида IL-2 дикого типа. Согласно некоторым вариантам осуществления снижение аффинности связывания составляет около 1-кратное, 2-кратное, 3-кратное, 4-кратное, 5-кратное, 6-кратное, 7-кратное, 8-кратное, 9-кратное, 10-кратное или более по отношению к IL-2Rα относительно полипептида IL-2 дикого типа. Согласно некоторым вариантам осуществления модифицированный полипептид IL-2 представляет собой: функционально активный фрагмент полноразмерного полипептида IL-2; рекомбинантный полипептид IL-2 или рекомбинантный человеческий полипептид IL-2. Согласно некоторым вариантам осуществления модифицированный полипептид IL-2 содержит N-концевую делецию, С-концевую делецию или их комбинацию. Согласно некоторым вариантам осуществления N-концевая делеция включает в себя делецию первых 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25 или 30 остатков с N-конца, причем положения остатков относятся к положениям в SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам осуществления С-концевая делеция включает в себя делецию последних 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20 или более остатков от С-конца, причем положения остатков относятся к положениям в SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам осуществления функционально активный фрагмент содержит область IL-2 10-133, 20-133, 30-133, 10-130, 20-130, 30-130, 10-125, 20-125, 30-125, 1-130 или 1-125, причем положения остатков относятся к положениям в SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам осуществления модифицированный полипептид IL-2 характеризуется идентичностью последовательности, составляющей около 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% по отношению к SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам осуществления модифицированный полипептид IL-2 со сниженной аффинностью связывания к IL-2Rα способен вызывать экспансию популяций CD4+ хелперных клеток, CD8+ эффекторных наивных клеток и клеток памяти, клеток естественных киллеров (NK), Т-клеток естественных киллеров (NKT) или их комбинаций. Согласно некоторым вариантам осуществления конъюгирующий фрагмент ослабляет или блокирует связывание IL-2 с IL-2Rα. Согласно некоторым вариантам осуществления активация популяции CD4+ хелперных клеток, CD8+ эффекторных наивных клеток и клеток памяти, клеток естественных киллеров (NK), Т-клеток естественных киллеров (NKT) через комплекс IL-2Rβγ с помощью модифицированного полипептида IL-2 существенно не отличается от активации указанной клеточной популяции полипептидом IL-2 дикого типа, и причем активность модифицированного полипептида IL-2 по меньшей мере в 1 раз выше, чем активность полипептида IL-2 дикого типа. Согласно некоторым вариантам осуществления модифицированный полипептид IL-2 вызывает экспансию CD4+ Т-регуляторных клеток (Treg) менее чем на 20%, 15%, 10%, 5%, 1% или 0,1%, когда указанный активатор находится в контакте с указанной популяцией клеток. Согласно некоторым вариантам осуществления модифицированный полипептид IL-2 не вызывает экспансии Treg-клеток в указанной популяции клеток.

[8] В настоящем документе согласно некоторым вариантам осуществления раскрыт выделенный и модифицированный полипептид интерлейкин 2 (IL-2), содержащий по меньшей мере одну неприродную аминокислоту в положении на полипептиде, которое уменьшает связывание между модифицированным полипептидом IL-2 и рецептором α интерлейкина 2 (IL-2Rα), но сохраняет значительное связывание с сигнальным комплексом рецептора βγ интерлейкина 2 (IL-2Rβγ) с образованием комплекса IL-2/IL-2Rβγ, причем сниженное связывание с IL-2Rα сравнивается со связыванием между полипептидом IL-2 дикого типа и IL-2Rα. Согласно некоторым вариантам осуществления различие в активности в рецепторной передаче сигнала составляет менее чем 5-кратное, менее чем 4-кратное, менее чем 3-кратное, менее чем 2-кратное или менее чем 1-кратное. Согласно некоторым вариантам осуществления положение по меньшей мере одной неприродной аминокислоты выбрано из K35, Т37, R38, Т41, F42, K43, F44, Y45, Е60, Е61, Е62, К64, Р65, Е68, V69, N71, L72, М104, С105 и Y107, причем положения остатков соответствуют положениям 35, 37, 38, 41, 42, 43, 44, 45, 61, 62, 64, 65, 68, 69, 71, 72, 104, 105 и 107, как представлено в SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам осуществления положение по меньшей мере одной неприродной аминокислоты выбрано из Т37, R38, Т41, F42, K43, F44, Y45, Е61, Е62, Р65, Е68 и L72, причем положения остатков соответствуют положениям 37, 38, 41, 42, 43, 44, 45, 61, 62, 65, 68 и 72, как представлено в SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам осуществления положение по меньшей мере одной неприродной аминокислоты выбрано из K35, K64, V69, N71, М104, С105 и Y107, причем положения остатков соответствуют положениям 35, 64, 69, 71, 104, 105 и 107, как представлено в SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам осуществления положение по меньшей мере одной неприродной аминокислоты выбрано из Т37, R38, Т41, Y45, Е61, Е68 и L72, причем положения остатков соответствуют положениям 37, 38, 41, 45, 61, 68 и 72, как представлено в SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам осуществления положение по меньшей мере одной неприродной аминокислоты выбрано из F42, K43, F44, Е62 и Р65, причем положения остатков соответствуют положениям 42, 43, 44, 62 и 65, как представлено в SEQ. ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам осуществления по меньшей мере одна неприродная аминокислота: представляет собой аналог лизина; содержит ароматическую боковую цепь; содержит азидогруппу; содержит алкиновую группу или содержит альдегидную или кетоновую группу. Согласно некоторым вариантам осуществления по меньшей мере одна неприродная аминокислота не содержит ароматической боковой цепи. Согласно некоторым вариантам осуществления по меньшей мере одна неприродная аминокислота включает в себя N6-азидоэтокси-L-лизин (AzK), N6-пропаргилэтокси-L-лизин (PraK), BCN-L-лизин, норборнен-лизин, ТСО-лизин, метилтетразинлизин, аллилоксикарбониллизин, 2-амино-8-оксононановую кислоту, 2-амино-8-оксооктановую кислоту, п-ацетил-L-фенилаланин, п-азидометил-L-фенил ал анин (pAMF), п-йод-L-фенилаланин, м-ацетилфенилаланин, 2-амино-8-оксононановую кислоту, п-пропаргилоксифенилаланин, п-пропаргилфенилаланин, 3-метилфенилаланин, L-ДОФА, фторированный фенилаланин, изопропил-L-фенилаланин, п-азидо-L-фенилаланин, п-ацилаланин-L-фенилаланин, п-бензоил-L-фенилаланин, п-бромфенилаланин, п-амино-L-фенилаланин, изопропил-L-фенилаланин, О-аллилтирозин, О-метил-L-тирозин, O-4-аллил-L-тирозин, 4-пропил-L-тирозин, фосфонотирозин, три-О-ацетил-GlcNAcp-серин, L-фосфосерин, фосфоносерин, L-3-(2-нафтил)аланин, 2-амино-3-((2-((3-(бензилокси)-3-оксопропил)амино)этил)селанил)пропановую кислоту, 2-амино-3-(фенилселанил)пропаноил или селеноцистеин. Согласно некоторым вариантам осуществления по меньшей мере одна неприродная аминокислота включена в модифицированный полипептид IL-2 с помощью ортогональной пары тРНК-синтетаза/тРНК. Согласно некоторым вариантам осуществления ортогональная тРНК ортогональной пары синтетаза/тРНК содержит по меньшей мере одно неприродное нуклеотидное основание. Согласно некоторым вариантам осуществления модифицированный полипептид IL-2 ковалентно присоединен к конъюгирующему фрагменту по меньшей мере через одну не природную аминокислоту. Согласно некоторым вариантам осуществления конъюгирующий фрагмент содержит водорастворимый полимер, липид, белок или пептид. Согласно некоторым вариантам осуществления водорастворимый полимер включает в себя полиэтиленгликоль (PEG), поли(пропиленгликоль) (PPG), сополимеры этиленгликоля и пропиленгликоля, поли(оксиэтилированный полиол), поли(олефиновый спирт), поли(винилпирролидон), поли(гидроксиалкилметакриламид), поли(гидроксиалкилметакрилат), поли(сахариды), поли(α-гидроксикислоту), поли(виниловый спирт), полифосфазен, полиоксазолины (POZ), поли(N-акрилоилморфолин) или их комбинации. Согласно некоторым вариантам осуществления водорастворимый полимер содержит молекулу PEG. Согласно некоторым вариантам осуществления молекула PEG представляет собой линейный PEG. Согласно некоторым вариантам осуществления молекула PEG представляет собой разветвленный PEG. Согласно некоторым вариантам осуществления водорастворимый полимер содержит полисахарид. Согласно некоторым вариантам осуществления полисахарид содержит декстран, полисиаловую кислоту (PSA), гиалуроновую кислоту (НА), амилозу, гепарин, гепарансульфат (HS), декстрин или гидроксиэтилкрахмал (HES). Согласно некоторым вариантам осуществления липид содержит жирную кислоту. Согласно некоторым вариантам осуществления жирная кислота содержит от около 6 до около 26 атомов углерода, от около 6 до около 24 атомов углерода, от около 6 до около 22 атомов углерода, от около 6 до около 20 атомов углерода, от около 6 до около 18 атомов углерода, от около 20 до около 26 атомов углерода, от около 12 до около 26 атомов углерода, от около 12 до около 24 атомов углерода, от около 12 до около 22 атомов углерода, от около 12 до около 20 атомов углерода или от около 12 до около 18 атомов углерода. Согласно некоторым вариантам осуществления жирная кислота представляет собой насыщенную жирную кислоту. Согласно некоторым вариантам осуществления белок включает в себя альбумин, трансферрин или транстиретин. Согласно некоторым вариантам осуществления конъюгирующий фрагмент содержит агонист TLR. Согласно некоторым вариантам осуществления белок включает в себя антитело или его связывающие фрагменты. Согласно некоторым вариантам осуществления антитело или его связывающие фрагменты включают в себя Fc-часть антитела. Согласно некоторым вариантам осуществления пептид включает в себя пептид XTEN, глицин-обогащенный гомоаминокислотный полимер (НАР), полипептид PAS, эластиноподобный полипептид (ELP), пептид СТР или полимер желатиноподобного белка (GLK). Согласно некоторым вариантам осуществления конъюгирующий фрагмент опосредованно связан по меньшей мере с одной неприродной аминокислотой модифицированного IL-2 через линкер. Согласно некоторым вариантам осуществления линкер включает в себя гомобифункциональный линкер, гетеробифункциональный линкер, линкер нулевой длины, расщепляемый или нерасщепляемый дипептидный линкер, малеимидную группу, спейсер или их комбинацию. Согласно некоторым вариантам осуществления снижение аффинности связывания составляет около 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% или 100% снижения аффинности связывания к IL-2Rα относительно полипептида IL-2 дикого типа. Согласно некоторым вариантам осуществления снижение аффинности связывания составляет около 3-кратное, 4-кратное, 5-кратное, 6-кратное, 7-кратное, 8-кратное, 9-кратное, 10-кратное или более к IL-2Rα относительно полипептида IL-2 дикого типа. Согласно некоторым вариантам осуществления модифицированный полипептид IL-2 представляет собой: функционально активный фрагмент полноразмерного полипептида IL-2; рекомбинантный полипептид IL-2 или рекомбинантный человеческий полипептид IL-2. Согласно некоторым вариантам осуществления модифицированный полипептид IL-2 содержит N-концевую делецию, С-концевую делецию или их комбинацию. Согласно некоторым вариантам осуществления N-концевая делеция включает в себя делецию первых 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25 или 30 остатков с N-конца, причем положения остатков относятся к положениям в SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам осуществления С-концевая делеция включает в себя делецию последних 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20 или более остатков от С-конца, причем положения остатков относятся к положениям в SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам осуществления функционально активный фрагмент содержит область IL-2 10-133, 20-133, 30-133, 10-130, 20-130, 30-130, 10-125, 20-125, 30-125, 1-130 или 1-125, причем положения остатков относятся к положениям в SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам осуществления модифицированный полипептид IL-2 характеризуется идентичностью последовательности, составляющей около 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% по отношению к SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам осуществления модифицированный полипептид IL-2 со сниженной аффинностью связывания к IL-2Rα способен вызывать экспансию популяций CD4+ хелперных клеток, CD8+ эффекторных наивных клеток и клеток-памяти, клеток естественных киллеров (NK), Т-клеток естественных киллеров (NKT) или их комбинаций. Согласно некоторым вариантам осуществления конъюгирующий фрагмент или неприродная аминокислота ослабляет или блокирует связывание IL-2 с IL-2Rα. Согласно некоторым вариантам осуществления активация популяции CD4+ хелперных клеток, CD8+ эффекторных наивных клеток и клеток-памяти, клеток естественных киллеров (NK), Т-клеток естественных киллеров (NKT) через комплекс IL-2Rβγ с помощью модифицированного полипептида IL-2 сохраняет существенную активность активации указанной клеточной популяции относительно полипептида IL-2 дикого типа. Согласно некоторым вариантам осуществления активность в рецепторной передаче сигнала модифицированного полипептида IL-2 к комплексу IL-2Rβγ выше, чем активность в рецепторной передаче сигнала полипептида IL-2 дикого типа к комплексу IL-2Rβγ. Согласно некоторым вариантам осуществления активность в рецепторной передаче сигнала модифицированного полипептида IL-2 комплекса IL-2Rβγ ниже, чем активность в рецепторной передаче сигнала полипептида IL-2 дикого типа комплекса IL-2Rβγ. Согласно некоторым вариантам осуществления модифицированный полипептид IL-2 проявляет первую активность в рецепторной передаче сигнала к IL-2Rβγ и вторую активность в рецепторной передаче сигнала к IL-2Rαβγ, и причем первая активность в рецепторной передаче сигнала является по меньшей мере 1-кратной, 2-кратной, 3-кратной, 4-кратной, 5-кратной, 6-кратной, 7-кратной, 8-кратной, 9-кратной, 10-кратной, 20-кратной, 30-кратной, 50-кратной, 100-кратной, 500-кратной или выше, чем вторая активность в рецепторной передаче сигнала. Согласно некоторым вариантам осуществления первая активность в рецепторной передаче сигнала модифицированного полипептида IL-2 выше, чем активность в рецепторной передаче сигнала полипептида IL-2 дикого типа к IL-2Rβγ, и вторая активность в рецепторной передаче сигнала модифицированного полипептида IL-2 ниже, чем активность в рецепторной передаче сигнала полипептида IL-2 дикого типа по отношению к IL-2Rαβγ. Согласно некоторым вариантам осуществления первая активность в рецепторной передаче сигнала модифицированного полипептида IL-2 по меньшей мере в 1 раз ниже, чем активность в рецепторной передаче сигнала полипептида IL-2 дикого типа.

[9] В настоящем документе согласно некоторым вариантам осуществления раскрыт выделенный и модифицированный полипептид интерлейкин 2 (IL-2), содержащий по меньшей мере одну неприродную аминокислоту, причем выделенный и модифицированный полипептид IL-2 проявляет первую активность в рецепторной передаче сигнала к сигнальному комплексу IL-2βγ и вторую активность в рецепторной передаче сигнала к сигнальному комплексу IL-2α, и причем разница между первой активностью в рецепторной передаче сигнала и второй активностью в рецепторной передаче сигнала является менее чем 10-кратной. Согласно некоторым вариантам осуществления различие в активности в рецепторной передаче сигнала является менее чем 5-кратным, менее чем 4-кратным, менее чем 3-кратным, менее чем 2-кратным или менее чем 1-кратным. Согласно некоторым вариантам осуществления положение по меньшей мере одной неприродной аминокислоты выбрано из К35, Т37, R38, Т41, F42, К43, F44, Y45, Е60, Е61, Е62, К64, Р65, Е68, V69, N71, L72, М104, С105 и Y107, причем положения остатков соответствуют положениям 35, 37, 38, 41, 42, 43, 44, 45, 61, 62, 64, 65, 68, 69, 71, 72, 104, 105 и 107, как представлено в SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам осуществления положение по меньшей мере одной неприродной аминокислоты выбрано из Т37, R38, Т41, F42, K43, F44, Y45, Е61, Е62, Р65, Е68 и L72, причем положения остатков соответствуют положениям 37, 38, 41, 42, 43, 44, 45, 61, 62, 65, 68 и 72, как представлено в SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам осуществления положение по меньшей мере одной неприродной аминокислоты выбрано из K35, K64, V69, N71, М104, С105 и Y107, причем положения остатков соответствуют положениям 35, 64, 69, 71, 104, 105 и 107, как представлено в SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам осуществления положение по меньшей мере одной неприродной аминокислоты выбрано из Т37, R38, Т41, Y45, Е61, Е68 и L72, причем положения остатков соответствуют положениям 37, 38, 41, 45, 61, 68 и 72, как представлено в SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам осуществления положение по меньшей мере одной неприродной аминокислоты выбрано из F42, K43, F44, Е62 и Р65, причем положения остатков соответствуют положениям 42, 43, 44, 62 и 65, как представлено в SEQ. ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам осуществления по меньшей мере одна неприродная аминокислота: представляет собой аналог лизина; содержит ароматическую боковую цепь; содержит азидогруппу; содержит алкиновую группу или содержит альдегидную или кетоновую группу. Согласно некоторым вариантам осуществления по меньшей мере одна неприродная аминокислота не содержит ароматической боковой цепи. Согласно некоторым вариантам осуществления по меньшей мере одна неприродная аминокислота включает в себя N6-азидоэтокси-L-лизин (AzK), N6-пропаргилэтокси-L-лизин (PraK), BCN-L-лизин, норборнен-лизин, ТСО-лизин, метилтетразинлизин, аллилоксикарбониллизин, 2-амино-8-оксононановую кислоту, 2-амино-8-оксооктановую кислоту, п-ацетил-L-фенилаланин, п-азидометил-L-фенилаланин (pAMF), п-йод-L-фенилаланин, м-ацетилфенилаланин, 2-амино-8-оксононановую кислоту, п-пропаргилоксифенилаланин, п-пропаргилфенилаланин, 3-метилфенилаланин, L-ДОФА, фторированный фенилаланин, изопропил-L-фенилаланин, п-азидо-L-фенилаланин, п-ацилаланин-L-фенилаланин, п-бензоил-L-фенилаланин, п-бромфенилаланин, п-амино-L-фенилаланин, изопропил-L-фенилаланин, О-аллилтирозин, О-метил-L-тирозин, O-4-аллил-L-тирозин, 4-пропил-L-тирозин, фосфонотирозин, три-О-ацетил-GlcNAcp-серин, L-фосфосерин, фосфоносерин, L-3-(2-нафтил)аланин, 2-амино-3-((2-((3-(бензилокси)-3-оксопропил)амино)этил)селанил)пропановую кислоту, 2-амино-3-(фенилселанил)пропаноил или селеноцистеин. Согласно некоторым вариантам осуществления по меньшей мере одна неприродная аминокислота включена в модифицированный полипептид IL-2 с помощью ортогональной пары тРНК-синтетаза/тРНК. Согласно некоторым вариантам осуществления ортогональная тРНК ортогональной пары синтетаза/тРНК содержит по меньшей мере одно неприродное нуклеотидное основание. Согласно некоторым вариантам осуществления модифицированный полипептид IL-2 ковалентно присоединен к конъюгирующему фрагменту по меньшей мере через одну не природную аминокислоту. Согласно некоторым вариантам осуществления конъюгирующий фрагмент содержит водорастворимый полимер, липид, белок или пептид. Согласно некоторым вариантам осуществления водорастворимый полимер включает в себя полиэтиленгликоль (PEG), поли(пропиленгликоль) (PPG), сополимеры этиленгликоля и пропиленгликоля, поли(оксиэтилированный полиол), поли(олефиновый спирт), поли(винилпирролидон), поли(гидроксиалкилметакриламид), поли(гидроксиалкилметакрилат), поли(сахариды), поли(α-гидроксикислоту), поли(виниловый спирт), полифосфазен, полиоксазолины (POZ), поли(N-акрилоилморфолин) или их комбинации. Согласно некоторым вариантам осуществления водорастворимый полимер содержит молекулу PEG. Согласно некоторым вариантам осуществления молекула PEG представляет собой линейный PEG. Согласно некоторым вариантам осуществления молекула PEG представляет собой разветвленный PEG. Согласно некоторым вариантам осуществления водорастворимый полимер содержит полисахарид. Согласно некоторым вариантам осуществления полисахарид включает в себя декстран, полисиаловую кислоту (PSA), гиалуроновую кислоту (НА), амилозу, гепарин, гепарансульфат (HS), декстрин или гидроксиэтилкрахмал (HES). Согласно некоторым вариантам осуществления липид содержит жирную кислоту. Согласно некоторым вариантам осуществления жирная кислота содержит от около 6 до около 26 атомов углерода, от около 6 до около 24 атомов углерода, от около 6 до около 22 атомов углерода, от около 6 до около 20 атомов углерода, от около 6 до около 18 атомов углерода, от около 20 до около 26 атомов углерода, от около 12 до около 26 атомов углерода, от около 12 до около 24 атомов углерода, от около 12 до около 22 атомов углерода, от около 12 до около 20 атомов углерода или от около 12 до около 18 атомов углерода. Согласно некоторым вариантам осуществления жирная кислота представляет собой насыщенную жирную кислоту. Согласно некоторым вариантам осуществления белок включает в себя альбумин, трансферрин или транстиретин. Согласно некоторым вариантам осуществления конъюгирующий фрагмент содержит агонист TLR. Согласно некоторым вариантам осуществления белок включает в себя антитело или его связывающие фрагменты. Согласно некоторым вариантам осуществления антитело или его связывающие фрагменты включают в себя Fc-часть антитела. Согласно некоторым вариантам осуществления пептид включает в себя пептид XTEN, глицин-обогащенный гомоаминокислотный полимер (НАР), полипептид PAS, эластиноподобный полипептид (ELP), пептид СТР или полимер желатиноподобного белка (GLK). Согласно некоторым вариантам осуществления конъюгирующий фрагмент опосредованно связан по меньшей мере с одной неприродной аминокислотой модифицированного IL-2 через линкер. Согласно некоторым вариантам осуществления линкер включает в себя гомобифункциональный линкер, гетеробифункциональный линкер, линкер нулевой длины, расщепляемый или нерасщепляемый дипептидный линкер, малеимидную группу, спейсер или их комбинацию. Согласно некоторым вариантам осуществления снижение аффинности связывания представляет собой снижение в аффинности связывания к IL-2Rα, составляющее около 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% или 100% относительно полипептида IL-2 дикого типа. Согласно некоторым вариантам осуществления снижение аффинности связывания является около 3-кратным, 4-кратным, 5-кратным, 6-кратным, 7-кратным, 8-кратным, 9-кратным, 10-кратным или более к IL-2Rα относительно полипептида IL-2 дикого типа. Согласно некоторым вариантам осуществления модифицированный полипептид IL-2 представляет собой: функционально активный фрагмент полноразмерного полипептида IL-2; рекомбинантный полипептид IL-2 или рекомбинантный человеческий полипептид IL-2. Согласно некоторым вариантам осуществления модифицированный полипептид IL-2 содержит N-концевую делецию, C-концевую делецию или их комбинацию. Согласно некоторым вариантам осуществления N-концевая делеция включает в себя делецию первых 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25 или 30 остатков с N-конца, причем положения остатков относятся к положениям в SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам осуществления C-концевая делеция включает в себя делецию последних 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20 или более остатков от С-конца, причем положения остатков относятся к положениям в SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам осуществления функционально активный фрагмент содержит область IL-2 10-133, 20-133, 30-133, 10-130, 20-130, 30-130, 10-125, 20-125, 30-125, 1-130 или 1-125, причем положения остатков относятся к положениям в SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам осуществления модифицированный полипептид IL-2 характеризуется идентичностью последовательности, составляющей около 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% по отношению к SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам осуществления модифицированный полипептид IL-2 со сниженной аффинностью связывания к IL-2Rα способен вызывать экспансию популяций CD4+ хелперных клеток, CD8+ эффекторных наивных клеток и клеток памяти, клеток естественных киллеров (NK), Т-клеток естественных киллеров (NKT) или их комбинаций. Согласно некоторым вариантам осуществления конъюгирующий фрагмент или неприродная аминокислота ослабляет или блокирует связывание IL-2 с IL-2Rα. Согласно некоторым вариантам осуществления активация популяции CD4+ хелперных клеток, CD8+ эффекторных наивных клеток и клеток памяти, клеток естественных киллеров (NK), Т-клеток естественных киллеров (NKT) через комплекс IL-2Rβγ с помощью модифицированного полипептида IL-2 сохраняет существенную активность активации указанной клеточной популяции относительно полипептида IL-2 дикого типа. Согласно некоторым вариантам осуществления активность в рецепторной передаче сигнала модифицированного полипептида IL-2 к комплексу IL-2Rβγ выше, чем активность в рецепторной передаче сигнала полипептида IL-2 дикого типа к комплексу IL-2Rβγ. Согласно некоторым вариантам осуществления активность в рецепторной передаче сигнала модифицированного полипептида IL-2 комплекса IL-2Rβγ ниже, чем активность в рецепторной передаче сигнала полипептида IL-2 дикого типа к комплексу IL-2Rβγ. Согласно некоторым вариантам осуществления модифицированный полипептид IL-2 проявляет первую активность в рецепторной передаче сигнала к IL-2Rβγ и вторую активность в рецепторной передаче сигнала к IL-2Rαβγ, и причем первая активность в рецепторной передаче сигнала является по меньшей мере 1-кратной, 2-кратной, 3-кратной, 4-кратной, 5-кратной, 6-кратной, 7-кратной, 8-кратной, 9-кратной, 10-кратной, 20-кратной, 30-кратной, 50-кратной, 100-кратной, 500-кратной или выше, чем вторая активность в рецепторной передаче сигнала. Согласно некоторым вариантам осуществления первая активность в рецепторной передаче сигнала модифицированного полипептида IL-2 выше, чем активность в рецепторной передаче сигнала полипептида IL-2 дикого типа к IL-2Rβγ, и вторая активность в рецепторной передаче сигнала модифицированного полипептида IL-2 ниже, чем активность в рецепторной передаче сигнала полипептида IL-2 дикого типа по отношению к IL-2Rαβγ. Согласно некоторым вариантам осуществления первая активность в рецепторной передаче сигнала модифицированного полипептида IL-2 по меньшей мере в 1 раз ниже, чем активность в рецепторной передаче сигнала полипептида IL-2 дикого типа.

[10] В настоящем документе согласно некоторым вариантам осуществления раскрыт выделенный и модифицированный полипептид интерлейкин 2 (IL-2), содержащий по меньшей мере одну неприродную аминокислоту, причем выделенный и модифицированный полипептид IL-2 обеспечивает первое значение ЕС50 для активации сигнального комплекса IL-2βγ и второе значение ЕС50 для активации сигнального комплекса IL-2αβγ, причем различие между первым значением ЕС50 и вторым значением ЕС50 является менее чем 10-кратным. Согласно некоторым вариантам осуществления различие является менее чем 5-кратным, менее чем 4-кратным, менее чем 3-кратным, менее чем 2-кратным или менее чем 1-кратным. Согласно некоторым вариантам осуществления различие в активности в рецепторной передаче сигнала является менее чем 5-кратным, менее чем 4-кратным, менее чем 3-кратным, менее чем 2-кратным или менее чем 1-кратным. Согласно некоторым вариантам осуществления положение по меньшей мере одной неприродной аминокислоты выбрано из К35, Т37, R38, Т41, F42, К43, F44, Y45, Е60, Е61, Е62, К64, Р65, Е68, V69, N71, L72, М104, С105 и Y107, причем положения остатков соответствуют положениям 35, 37, 38, 41, 42, 43, 44, 45, 61, 62, 64, 65, 68, 69, 71, 72, 104, 105 и 107, как представлено в SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам осуществления положение по меньшей мере одной неприродной аминокислоты выбрано из Т37, R38, Т41, F42, К43, F44, Y45, Е61, Е62, Р65, Е68 и L72, причем положения остатков соответствуют положениям 37, 38, 41, 42, 43, 44, 45, 61, 62, 65, 68 и 72, как представлено в SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам осуществления положение по меньшей мере одной неприродной аминокислоты выбрано из К35, К64, V69, N71, М104, С105 и Y107, причем положения остатков соответствуют положениям 35, 64, 69, 71, 104, 105, и 107, как представлено в SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам осуществления положение по меньшей мере одной неприродной аминокислоты выбрано из Т37, R38, Т41, Y45, Е61, Е68 и L72, причем положения остатков соответствуют положениям 37, 38, 41, 45, 61, 68 и 72, как представлено в SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам осуществления положение по меньшей мере одной неприродной аминокислоты выбрано из F42, К43, F44, Е62 и Р65, причем положения остатков соответствуют положениям 42, 43, 44, 62 и 65, как представлено в SEQ. ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам осуществления по меньшей мере одна неприродная аминокислота: представляет собой аналог лизина; содержит ароматическую боковую цепь; содержит азидогруппу; содержит алкиновую группу или содержит альдегидную или кетоновую группу. Согласно некоторым вариантам осуществления по меньшей мере одна неприродная аминокислота не содержит ароматической боковой цепи. Согласно некоторым вариантам осуществления по меньшей мере одна неприродная аминокислота включает в себя N6-азидоэтокси-L-лизин (AzK), N6-пропаргилэтокси-L-лизин (PraK), BCN-L-лизин, норборнен-лизин, ТСО-лизин, метилтетразинлизин, аллилоксикарбониллизин, 2-амино-8-оксононановую кислоту, 2-амино-8-оксооктановую кислоту, п-ацетил-L-фенилаланин, п-азидометил-L-фенилаланин (pAMF), п-йод-L-фенилаланин, м-ацетилфенилаланин, 2-амино-8-оксононановую кислоту, п-пропаргилоксифенилаланин, п-пропаргилфенилаланин, 3-метилфенилаланин, L-ДОФА, фторированный фенилаланин, изопропил-L-фенилаланин, п-азидо-L-фенилаланин, п-ацилаланин-L-фенилаланин, п-бензоил-L-фенилаланин, п-бромфенилаланин, п-амино-L-фенилаланин, изопропил-L-фенилаланин, О-аллилтирозин, О-метил-L-тирозин, O-4-аллил-L-тирозин, 4-пропил-L-тирозин, фосфонотирозин, три-O-ацетил-GlcHAcp-серин, L-фосфосерин, фосфоносерин, L-3-(2-нафтил)аланин, 2-амино-3-((2-((3-(бензилокси)-3-ксопропил)амино)этил)селанил)пропановую кислоту, 2-амино-3-(фенилселанил)пропаноил или селеноцистеин. Согласно некоторым вариантам осуществления по меньшей мере одна неприродная аминокислота включена в модифицированный полипептид IL-2 с помощью ортогональной пары тРНК-синтетаза/тРНК. Согласно некоторым вариантам осуществления ортогональная тРНК ортогональной пары синтетаза/тРНК содержит по меньшей мере одно неприродное нуклеотидное основание. Согласно некоторым вариантам осуществления модифицированный полипептид IL-2 ковалентно присоединен к конъюгирующему фрагменту по меньшей мере через одну не природную аминокислоту. Согласно некоторым вариантам осуществления конъюгирующий фрагмент содержит водорастворимый полимер, липид, белок или пептид. Согласно некоторым вариантам осуществления водорастворимый полимер включает в себя полиэтиленгликоль (PEG), поли(пропиленгликоль) (PPG), сополимеры этиленгликоля и пропиленгликоля, поли(оксиэтилированный полиол), поли(олефиновый спирт), поли(винилпирролидон), поли(гидроксиалкилметакриламид), поли(гидроксиалкилметакрилат), поли(сахариды), поли(α-гидроксикислоту), поли(виниловый спирт), полифосфазен, полиоксазолины (POZ), поли(N-акрилоилморфолин) или их комбинации. Согласно некоторым вариантам осуществления водорастворимый полимер содержит молекулу PEG. Согласно некоторым вариантам осуществления молекула PEG представляет собой линейный PEG. Согласно некоторым вариантам осуществления молекула PEG представляет собой разветвленный PEG. Согласно некоторым вариантам осуществления водорастворимый полимер содержит полисахарид. Согласно некоторым вариантам осуществления полисахарид включает в себя декстран, полисиаловую кислоту (PSA), гиалуроновую кислоту (НА), амилозу, гепарин, гепарансульфат (HS), декстрин или гидроксиэтилкрахмал (HES). Согласно некоторым вариантам осуществления липид содержит жирную кислоту. Согласно некоторым вариантам осуществления жирная кислота содержит от около 6 до около 26 атомов углерода, от около 6 до около 24 атомов углерода, от около 6 до около 22 атомов углерода, от около 6 до около 20 атомов углерода, от около 6 до около 18 атомов углерода, от около 20 до около 26 атомов углерода, от около 12 до около 26 атомов углерода, от около 12 до около 24 атомов углерода, от около 12 до около 22 атомов углерода, от около 12 до около 20 атомов углерода или от около 12 до около 18 атомов углерода. Согласно некоторым вариантам осуществления жирная кислота представляет собой насыщенную жирную кислоту. Согласно некоторым вариантам осуществления белок включает в себя альбумин, трансферрин или транстиретин. Согласно некоторым вариантам осуществления конъюгирующий фрагмент содержит агонист TLR. Согласно некоторым вариантам осуществления белок включает в себя антитело или его связывающие фрагменты. Согласно некоторым вариантам осуществления антитело или его связывающие фрагменты включают в себя Fc-часть антитела. Согласно некоторым вариантам осуществления пептид включает в себя пептид XTEN, глицин-обогащенный гомоаминокислотный полимер (НАР), полипептид PAS, эластиноподобный полипептид (ELP), пептид СТР или полимер желатиноподобного белка (GLK). Согласно некоторым вариантам осуществления конъюгирующий фрагмент опосредованно связан по меньшей мере с одной неприродной аминокислотой модифицированного IL-2 через линкер. Согласно некоторым вариантам осуществления линкер включает в себя гомобифункциональный линкер, гетеробифункциональный линкер, линкер нулевой длины, расщепляемый или нерасщепляемый дипептидный линкер, малеимидную группу, спейсер или их комбинацию. Согласно некоторым вариантам осуществления снижение аффинности связывания представляет собой снижение аффинности связывания к IL-2Rα, составляющее около 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% или 100% относительно полипептида IL-2 дикого типа. Согласно некоторым вариантам осуществления снижение аффинности связывания является около 3-кратным, 4-кратным, 5-кратным, 6-кратным, 7-кратным, 8-кратным, 9-кратным, 10-кратным или более к IL-2Rα относительно полипептида IL-2 дикого типа. Согласно некоторым вариантам осуществления модифицированный полипептид IL-2 представляет собой: функционально активный фрагмент полноразмерного полипептида IL-2; рекомбинантный полипептид IL-2 или рекомбинантный человеческий полипептид IL-2. Согласно некоторым вариантам осуществления модифицированный полипептид IL-2 содержит N-концевую делецию, С-концевую делецию или их комбинацию. Согласно некоторым вариантам осуществления N-концевая делеция включает в себя делецию первых 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25 или 30 остатков с N-конца, причем положения остатков относятся к положениям в SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам осуществления С-концевая делеция включает в себя делецию последних 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20 или более остатков от С-конца, причем положения остатков относятся к положениям в SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам осуществления функционально активный фрагмент содержит область IL-2 10-133, 20-133, 30-133, 10-130, 20-130, 30-130, 10-125, 20-125, 30-125, 1-130 или 1-125, причем положения остатков относятся к положениям в SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам осуществления модифицированный полипептид IL-2 характеризуется идентичностью последовательности, составляющей около 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% по отношению к SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам осуществления модифицированный полипептид IL-2 со сниженной аффинностью связывания к IL-2Rα способен вызывать экспансию популяций CD4+ хелперных клеток, CD8+ эффекторных наивных клеток и клеток памяти, клеток естественных киллеров (NK), Т-клеток естественных киллеров (NKT) или их комбинаций. Согласно некоторым вариантам осуществления конъюгирующий фрагмент или неприродная аминокислота ослабляет или блокирует связывание IL-2 с IL-2Rα. Согласно некоторым вариантам осуществления активация популяции CD4+ хелперных клеток, CD8+ эффекторных наивных клеток и клеток памяти, клеток естественных киллеров (NK), Т-клеток естественных киллеров (NKT) через комплекс IL-2Rβγ с помощью модифицированного полипептида IL-2 сохраняет существенную активность активации указанной клеточной популяции относительно полипептида IL-2 дикого типа. Согласно некоторым вариантам осуществления активность в рецепторной передаче сигнала модифицированного полипептида IL-2 к комплексу IL-2Rβγ выше, чем активность в рецепторной передаче сигнала полипептида IL-2 дикого типа к комплексу IL-2Rβγ. Согласно некоторым вариантам осуществления активность в рецепторной передаче сигнала модифицированного полипептида IL-2 к комплексу IL-2Rβγ ниже, чем активность в рецепторной передаче сигнала полипептида IL-2 дикого типа к комплексу IL-2Rβγ. Согласно некоторым вариантам осуществления модифицированный полипептид IL-2 проявляет первую активность в рецепторной передаче сигнала к IL-2Rβγ и вторую активность в рецепторной передаче сигнала к IL-2Rαβγ, и причем первая активность в рецепторной передаче сигнала является по меньшей мере 1-кратной, 2-кратной, 3-кратной, 4-кратной, 5-кратной, 6-кратной, 7-кратной, 8-кратной, 9-кратной, 10-кратной, 20-кратной, 30-кратной, 50-кратной, 100-кратной, 500-кратной или выше, чем вторая активность в рецепторной передаче сигнала. Согласно некоторым вариантам осуществления первая активность в рецепторной передаче сигнала модифицированного полипептида IL-2 выше, чем активность в рецепторной передаче сигнала полипептида IL-2 дикого типа к IL-2Rβγ, и вторая активность в рецепторной передаче сигнала модифицированного полипептида IL-2 ниже, чем активность в рецепторной передаче сигнала полипептида IL-2 дикого типа к IL-2Rαβγ. Согласно некоторым вариантам осуществления первая активность в рецепторной передаче сигнала модифицированного полипептида IL-2 по меньшей мере в 1 раз ниже, чем активность в рецепторной передаче сигнала полипептида IL-2 дикого типа.

[11] В настоящем документе согласно некоторым вариантам осуществления раскрыта фармацевтическая композиция, содержащая: описанный выше конъюгат IL-2 и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество. Согласно некоторым вариантам осуществления фармацевтическая композиция составлена для парентерального введения. [12] В настоящем документе согласно некоторым вариантам осуществления раскрыт способ лечения пролиферативного заболевания или состояния у нуждающегося в этом субъекта, предусматривающий введение субъекту терапевтически эффективного количества описанного выше выделенного и модифицированного полипептида IL-2, описанного выше конъюгата IL-2, описанного выше связывающего IL-2Rβγ белка, описанного выше активатора CD4+ хелперных клеток, CD8+ эффекторных наивных клеток и клеток памяти, клеток естественных киллеров (NK), Т-клеток естественных киллеров (NKT) или описанной выше фармацевтической композиции. Согласно некоторым вариантам осуществления пролиферативное заболевание или состояние представляет собой рак. Согласно некоторым вариантам осуществления рак представляет собой солидную злокачественную опухоль. Согласно некоторым вариантам осуществления солидная злокачественная опухоль представляет собой рак мочевого пузыря, рак кости, рак головного мозга, рак молочной железы, колоректальный рак, рак пищевода, рак глаза, рак головы и шеи, рак почки, рак легкого, меланому, рак яичника, рак поджелудочной железы или рак простаты. Согласно некоторым вариантам осуществления рак представляет собой гематологическое злокачественное новообразование. Согласно некоторым вариантам осуществления гематологическое злокачественное новообразование представляет собой хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL), мелко клеточную лимфоцитарную лимфому (SLL), фолликулярную лимфому (FL), диффузную В-крупноклеточную лимфому (DLBCL), мантийноклеточную лимфому (MCL), макроглобулинемию Вальденстрема, множественную миелому, экстранодальную В-клеточную лимфому из клеток маргинальной зоны, нодальную В-клеточную лимфому из клеток маргинальной зоны, лимфому Беркитта, В-крупноклеточную лимфому не Беркитта, первичную медиастинальную В-клеточную лимфому (PMBL), иммунобластную крупноклеточную лимфому, В-лимф областную лимфому из клеток-предшественников, пролимфоцитарный лейкоз В-клеток, лимфоплазмоцитарную лимфому, лимфому маргинальной зоны селезенки, миелому плазматических клеток, плазмоцитому, В-крупноклеточную лимфому средостения (тимуса), внутрисосудистую В-крупноклеточную лимфому, первичную выпотную лимфому или лимфоматоидный гранулематоз. Согласно некоторым вариантам осуществления способ дополнительно предусматривает введение дополнительного терапевтического средства. Согласно некоторым вариантам осуществления выделенный и модифицированный полипептид IL-2, конъюгат IL-2, связывающий IL-2Rβ белок, активатор CD4+ хелперной клетки, CD8+ эффекторной наивной клетки и клетки памяти, клетки естественного киллера (NK) или Т-клетки естественного киллера (NKT) или фармацевтическую композицию и дополнительное терапевтическое средство вводят одновременно. Согласно некоторым вариантам осуществления выделенный и модифицированный полипептид IL-2, конъюгат IL-2, связывающий IL-2Rβ белок, активатор CD4+ хелперной клетки, CD8+ эффекторной наивной клетки и клетки памяти, клетки естественного киллера (NK) или Т-клетки естественного киллера (NKT) или фармацевтическую композицию и дополнительное терапевтическое средство вводят последовательно. Согласно некоторым вариантам осуществления выделенный и модифицированный полипептид IL-2, конъюгат IL-2, связывающий IL-2Rβ белок, активатор CD4+ хелперной клетки, CD8+ эффекторной наивной клетки и клетки памяти, клетки естественного киллера (NK) или Т-клетки естественного киллера (NKT) или фармацевтическую композицию и дополнительное терапевтическое средство вводят до введения дополнительного терапевтического средства. Согласно некоторым вариантам осуществления выделенный и модифицированный полипептид IL-2, конъюгат IL-2, связывающий IL-2Rβ белок, активатор CD4+ хелперной клетки, CD8+ эффекторной наивной клетки и клетки памяти, клетки естественного киллера (NK) или Т-клетки естественного киллера (NKT) или фармацевтическую композицию и дополнительное терапевтическое средство вводят после введения дополнительного терапевтического средства.

[13] В настоящем документе согласно некоторым вариантам осуществления раскрыт способ экспансии популяции CD4+ хелперных клеток, CD8+ эффекторных наивных клеток и клеток-памяти, клеток естественных киллеров (NK) или Т-клеток естественных киллеров (NKT), предусматривающий: контактирование клеточной популяции с описанным выше выделенным и модифицированным полипептидом IL-2, описанным выше конъюгатом IL-2, описанным выше связывающим IL-2Rβγ белком, описанным выше активатором CD4+ хелперной клетки, CD8+ эффекторной наивной клетки и клетки памяти, клетки естественного киллера (NK) или Т-клетки естественного киллера (NKT) или описанной выше фармацевтической композиции в течение времени, достаточного для индуцирования образования комплекса с IL-2Rβγ, стимулируя тем самым экспансию популяции Teff- и/или NK-клеток. Согласно некоторым вариантам осуществления описанный выше выделенный и модифицированный полипептид IL-2, описанный выше конъюгат IL-2, описанный выше связывающий IL-2Rβγ белок, описанный выше активатор CD4+ хелперной клетки, CD8+ эффекторной наивной клетки и клетки памяти, клетки естественного киллера (NK) или Т-клетки естественного киллера (NKT) или описанная выше фармацевтическая композиция вызывает экспансию CD4+ Т-регуляторных клеток (Treg) менее чем на 20%, 15%, 10%, 5% или 1% в CD3+ клеточной популяции по сравнению с экспансией CD4+ Treg-клеток в CD3+ клеточной популяции, контактирующей с полипептидом IL-2 дикого типа. Согласно некоторым вариантам осуществления описанный выше выделенный и модифицированный полипептид IL-2, описанный выше конъюгат IL-2, описанный выше связывающий IL-2Rβγ белок, описанный выше активатор CD4+ хелперной клетки, CD8+ эффекторной наивной клетки и клетки памяти, клетки естественного киллера (NK) или Т-клетки естественного киллера (NKT) или описанная выше фармацевтическая композиция не вызывает экспансии CD4+ Treg-клеток в клеточной популяции. Согласно некоторым вариантам осуществления отношение Teff-клеток к Treg-клеткам в популяции клеток после инкубации с описанным выше выделенным и модифицированным полипептидом IL-2, описанным выше конъюгатом IL-2, описанным выше связывающим IL-2Rβγ белком, описанным выше активатором CD4+хелперной клетки, CD8+ эффекторной наивной клетки и клетки памяти, клетки естественного киллера (NK) или Т-клетки естественного киллера (NKT) или описанной выше фармацевтической композиции составляет около или по меньшей мере 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 20:1, 50:1 или 100:1. Согласно некоторым вариантам осуществления способ представляет собой способ in vivo. Согласно некоторым вариантам осуществления способ представляет собой способ in vitro. Согласно некоторым вариантам осуществления способ представляет собой способ ex vivo.

[14] В настоящем документе согласно некоторым вариантам осуществления раскрыт способ экспансии популяции CD4+хелперных клеток, популяции CD8+эффекторных наивных клеток и клеток памяти, популяции клеток естественных киллеров (NK) или популяции Т-клеток естественных киллеров (NKT) или их комбинации, предусматривающий: (а) контактирование клетки с описанным выше конъюгатом IL-2 и (b) взаимодействие IL-2 с субъединицами IL-2Rβ и IL-2Rγ с образованием комплекса IL-2/IL-2Rβγ; причем конъюгат IL-2 обладает сниженной аффинностью к субъединице IL-2Rα, и причем комплекс IL-2/IL-2Rβγ стимулирует экспансию CD4+ хелперных клеток, CD8+ эффекторных наивных клеток и/или клеток памяти, NK-клеток, NKT-клеток или их комбинации.

[15] В настоящем документе согласно некоторым вариантам осуществления раскрыт набор, содержащий описанный выше выделенный и модифицированный полипептид IL-2, описанный выше конъюгат IL-2, описанный выше связывающий IL-2Rβγ белок, описанный выше активатор CD4+ хелперной клетки, CD8+ эффекторной наивной клетки и клетки памяти, клетки естественного киллера (NK) или Т-клетки естественного киллера (NKT) или описанную выше фармацевтическую композицию, содержащую описанный выше конъюгат IL-2. Согласно некоторым вариантам осуществления в настоящем документе также описан набор, содержащий молекулу полинуклеиновой кислоты, кодирующую описанный выше полипептид IL-2.

Краткое описание графических материалов

[16] Новые особенности настоящего изобретения изложены с особым вниманием в прилагаемой формуле изобретения. Лучшее понимание особенностей и преимуществ настоящего изобретения будет получено со ссылкой на следующее подробное описание, в котором приведены иллюстративные варианты осуществления, в которых используются принципы настоящего изобретения, и прилагаемые графические материалы.

[17] На фиг. 1 показаны иллюстративные неприродные аминокислоты. Эта фигура адаптирована из фиг. 2 Young et al., "Beyond the canonical 20 amino acids: expanding the genetic lexicon," J. of Biological Chemistry 285(15): 11039-11044 (2010).

[18] На фиг. 2А-фиг. 2B показаны иллюстративные неприродные аминокислоты. На фиг. 2А показаны иллюстративные производные лизина. На фиг. 2 В показаны иллюстративные производные фенилаланина.

[19] На фиг. 3А-фиг. 3D показаны иллюстративные неприродные аминокислоты. Эти неприродные аминокислоты (UAA) были генетически кодированы в белках (фиг. 3А -UAA # 1-42; фиг. 3В - UAA # 43-89; фиг. 3С - UAA # 90-128; фиг. 3D - UAA # 129-167). Фиг. 3A-3D взяты из таблицы 1 в Dumas et al., Chemical Science 2015, 6, 50-69.

[1] На фиг. 4А-фиг. 4B показан анализ поверхностный плазмонный резонанс (SPR) PEG-конъюгатов Р65_30kD, Р65_5kD, Е62_30kD и Е62_5kD. На фиг. 4А показан SPR-анализ вариантов связывания IL-2 с иммобилизованным IL-2 Rα. На фиг. 4 В показан SPR-анализ вариантов связывания IL-2 с иммобилизованным IL-2 Rβ.

[2] На фиг. 5А-фиг. 5С показаны иллюстративные вариантные кривые доза-ответ IL-2 для передачи сигналов pSTATS в популяциях первичных клеток LRS человека. Фиг. 5А: нативный IL-2; фиг. 5 В: Е62_30kD и фиг. 5С: Р65_30kD.

[3] На фиг. 6 показана зависимость средней (±SD) концентрации в плазме от времени после однократной внутривенной болюсной дозы альдеслейкина (IL-2), Е62_5, Е62_30 и Р65_30 мышам C57BL/6.

[4] На фиг. 7 показан процент pSTAT5+CD8+ Т-клеток со временем в периферической крови после введения однократной внутривенной болюсной дозы Р65_30 или альдеслейкина мышам C57BL/6.

[5] На фиг. 8А-фиг. 8С показан процент CD8+ Т-клеток (фиг. 8А), NK-клеток (фиг. 8В) и CD4+ Treg-клеток (фиг. 8С) в популяции РВМС после введения однократной внутривенной болюсной дозы Р65_30 или альдеслейкина (IL-2). Кровь отбирали посредством пункции сердца в указанные моменты времени, и популяции иммунных клеток оценивали с помощью проточной цитометрии. Каждая точка данных представляет собой среднее из трех повторений в каждый момент времени ± SEM.

[6] На фиг. 9А - фиг. 9 В показаны различия между Р65_30 и IL-2 (альдеслейкин) в стимуляции пролиферации CD8+ CD44+ Т-клеток памяти в популяции CD3+ после введения однократной внутривенной болюсной дозы Р65_30 или альдеслейкина (IL-2). Кровь отбирали посредством пункции сердца в указанные моменты времени, и популяции иммунных клеток оценивали с помощью проточной цитометрии. Данные анализировали с использованием непарного критерия Стьюдента. *** обозначают значения Р<0,001. На фиг. 9А показана пролиферация CD8+ CD44+ Т-клеток памяти через 72, 96 и 120 часов. На фиг. 9 В показан анализ проточной цитометрии этих клеток в момент времени 120 часов.

[7] На фиг. 10 показано увеличение количества инфильтрирующих опухоль лимфоцитов (TIL) со временем у мышей С57В16 с сингенными опухолями B16F10 после введения однократной внутривенной болюсной дозы Р65_30. На фиг. 10А показан процент клеток NK, CD8+ Т и CD4+ Т reg у получавших Р65_30 животных по сравнению с не подвергнутыми воздействию животными (наполнитель) на 5 день воздействия. На фиг. 10 В показано соотношение CD8+/CD4+Treg-клеток у получавших Р65 30 и контрольных (наполнитель) животных. Данные анализированы с использованием непарного критерия Стьюдента. *** обозначают значения Р<0,001.

[20] На фиг. 11А - фиг. 11 В показано содержание в плазме мышиного IL-2, TNF-α, IFNγ, IL-5 и IL-6 после введения однократной внутривенной болюсной дозы Р65_30 или альдеслейкина (IL-2) при повышающихся уровнях (0,01-5 мг/кг). Концентрацию каждого цитокина в плазме определяли с помощью ELISA (Abcam, Cambridge, UK). Для каждой группы доз N=3 мыши образцы собирали через 4, 34 и 72 ч после введения дозы. На фиг. 11А показано содержание цитокинов для животных, получавших альдеслейкин, и на фиг. 11 В для животных, получавших дозу Р65_30.

[21] На фиг. 12 показано количество лейкоцитов, лимфоцитов и эозинофилов (среднее значение ± стандартное отклонение) после однократной внутривенной дозы P65_30kD самцам обезьян яванского макака.

Подробное описание настоящего раскрытия

[22] Цитокины включают в себя семейство клеточных сигнальных белков, таких как хемокины, интерфероны, интерлейкины, лимфокины, факторы некроза опухолей и другие факторы роста, играющие роль в гомеостазе врожденных и адаптивных иммунных клеток. Цитокины производятся иммунными клетками, такими как макрофаги, В-лимфоциты, Т-лимфоциты и тучные клетки, эндотелиальные клетки, фибробласты и различные стромальные клетки. В некоторых случаях цитокины модулируют баланс между гуморальным и клеточным иммунным ответами.

[23] Интерлейкины представляют собой сигнальные белки, которые модулируют развитие и дифференцировку Т- и В-лимфоцитов, клеток моноцитарного происхождения, нейтрофилов, базофилов, эозинофилов, мегакариоцитов и гемопоэтических клеток. Интерлейкины производятся хелперными CD4 Т- и В-лимфоцитами, моноцитами, макрофагами, эндотелиальными клетками и другими резидентами ткани. В некоторых случаях насчитывается около 15 интерлейкинов, интерлейкины 1-13, интерлейкин 15 и интерлейкин 17.

[24] Интерлейкин 2 (IL-2) представляет собой плейотропный цитокин типа 1, структура которого включает в себя четыре а-спиральных пучка размером 15,5 кДа. Форма предшественника IL-2 составляет в длину 153 аминокислотных остатка, причем первые 20 аминокислот образуют сигнальный пептид, а остатки 21-153 образуют зрелую форму. IL-2 производится главным образом CD4+ Т-клетками после стимуляции антигеном и в меньшей степени CD8+ клетками, клетками естественными киллерами (NK) и Т-клетками естественными киллерами (NKT), активированными дендритными клетками (DC) и тучными клетками. Передача сигналов IL-2 происходит посредством взаимодействия со специфическими комбинациями субъединиц рецептора IL-2 (IL-2R), IL-2Rα (также известным как CD25), IL-2Rβ (также известным как CD122) и IL-2Rγ (также известным как CD132). Взаимодействие IL-2 с IL-2Rα образует «низкоаффинный» рецепторный комплекс IL-2 с K_d около 10^-8 М. Взаимодействие IL-2 с IL-2Rβ и IL-2Rγ образует рецепторный комплекс IL-2 «промежуточной аффинности» с K_d около 10^-9 М. Взаимодействие IL-2 со всеми тремя субъединицами, IL-2Rα, IL-2Rβ и IL-2Rγ, образует «высокоаффинный» рецепторный комплекс IL-2 с K_d около >10^-11 М.

[25] В некоторых случаях передача сигналов IL-2 через «высокоаффинный» комплекс IL-2Rαβγ модулирует активацию и пролиферацию регуляторных Т-клеток. Регуляторные Т-клетки или CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺ регуляторные Т-клетки (Treg) опосредуют поддержание иммунного гомеостаза путем супрессии эффекторных клеток, таких как CD4⁺ Т-клетки, CD8⁺ Т-клетки, В-клетки, NK-клетки и NKT-клетки. В некоторых случаях Treg-клетки производятся из тимуса (tTreg-клетки) или индуцируются из наивных Т-клеток на периферии (pTreg-клетки). В некоторых случаях Treg-клетки рассматриваются как медиатор периферической толерантности. В самом деле, в одном исследовании перенос периферических истощенных по CD25 CD4⁺ Т-клеток вызывал различные аутоиммунные заболевания у голых мышей, тогда как совместный перенос CD4⁺ CD25⁺ Т-клеток супрессировал развитие аутоиммунитета (Sakaguchi, et al., "Immunologic self-tolerance maintained by activated T cells expressing IL-2 receptor alpha-chains (CD25)," J. Immunol. 155(3): 1151-1164 (1995)). Увеличение популяции Treg-клеток подавляет пролиферацию эффекторных Т-клеток и супрессирует аутоиммунитет и противоопухолевые ответы Т-клеток.

[26] Передача сигналов IL-2 через комплекс IL-2Rβγ «промежуточной аффинности» модулирует активацию и пролиферацию CD8⁺ эффекторных Т-клеток (Teff), NK-клеток и NKT-клеток. CD8⁺ Teff-клетки (также известные как цитотоксические Т-клетки, Тс-клетки, цитотоксические Т-лимфоциты, CTL, клетки Т-киллеры, цитолитические Т-клетки, Tcon или киллерные Т-клетки) представляют собой Т-лимфоциты, которые распознают и убивают поврежденные клетки, раковые клетки и зараженные патогеном клетки. Клетки NK и NKT представляют собой типы лимфоцитов, которые, подобно CD8⁺ Teff-клеткам, нацелены на раковые клетки и клетки, инфицированные патогеном.

[27] В некоторых случаях передача сигналов IL-2 используется для модуляции Т-клеточных ответов, а затем для лечения рака. Например, IL-2 вводят в высокодозовой форме, чтобы индуцировать экспансию популяций Teff-клеток для лечения рака. Тем не менее, IL2 в высоких дозах дополнительно приводят к сопутствующей стимуляции Treg-клеток, которые ослабляют противоопухолевые иммунные ответы. IL2 в высоких дозах также индуцирует токсические нежелательные явления, обусловленные вовлечением в сосудистую сеть клеток, экспрессирующих альфа-цепь IL-2R, включая в себя врожденные иммунные клетки 2-го типа (ILC-2), эозинофилы и эндотелиальные клетки. Это приводит к эозинофилии, синдрому повышенной проницаемости капилляров и синдрому пропотеванию жидкости из сосудов (VLS).

[28] В настоящем документе согласно некоторым вариантам осуществления раскрыт способ селективного активирования отдельной популяции(й) лимфоцитов (например, CD4+ хелперные клетки, CD8+ эффекторные наивные клетки и клетки памяти, NK-клетки и NKT-клетки) посредством передачи сигналов цитокин/рецептор цитокина. В некоторых случаях цитокин включает в себя интерлейкин, интерферон или фактор некроза опухолей. В некоторых случаях цитокин представляет собой конъюгат цитокина, например, конъюгат интерлейкина, конъюгат интерферона или конъюгат фактора некроза опухоли. В дополнительных описанных в настоящем документе случаях включены фармацевтические композиции и наборы, содержащие один или несколько описанных в настоящем документе конъюгатов цитокинов.

[29] Согласно некоторым вариантам осуществления в настоящем документе также описан способ избирательной активации популяций CD4+ хелперных клеток, CD8+ эффекторных наивных клеток и клеток памяти, NK-клеток и NKT-клеток посредством передачи сигналов IL-2/IL-2R. В некоторых случаях IL-2 представляет собой конъюгат IL-2, который взаимодействует с комплексом IL-2Rαβγ «промежуточной аффинности», необязательно со схожей эффективностью как с комплексом IL-2Rαβγ и с ослабленным взаимодействием IL-2Rα относительно IL-2 дикого типа. Согласно некоторым вариантам осуществления в настоящем документе дополнительно описаны способы лечения рака с использованием описанного в настоящем документе конъюгата IL-2. Согласно дополнительным вариантам осуществления в настоящем документе описаны фармацевтические композиции и наборы, которые содержат один или несколько описанных в настоящем документе конъюгатов IL-2.

Конъюгаты цитокинов

[30] Согласно некоторым вариантам осуществления в настоящем документе описаны конъюгаты цитокинов. В некоторых случаях цитокин включает в себя интерлейкины, фактор некроза опухоли, интерферон, хемокин, лимфокин или фактор роста. В некоторых случаях цитокин представляет собой интерлейкин. В некоторых случаях цитокин представляет собой интерферон. В дополнительных случаях цитокин представляет собой фактор некроза опухоли. В дополнительных случаях цитокин представляет собой фактор роста.

[31] Согласно некоторым вариантам осуществления в настоящем документе описан конъюгат интерлейкина. Иллюстративные интерлейкины включают в себя, без ограничения, интерлейкин 1 (IL-1), интерлейкин 2 (IL-2), интерлейкин 7 (IL-7), интерлейкин 10 (IL-10), интерлейкин 12 (IL-12), интерлейкин 15 (IL-15), интерлейкин 18 (IL-18) и интерлейкин 21 (IL-21). В некоторых случаях в настоящем документе описан конъюгат интерлейкина, в котором интерлейкин выбран из IL-1, IL-2, IL-7, IL-10, IL-12, IL-15, IL-18 и IL-21.

Копъюгаты IL-2

[32] Согласно некоторым вариантам осуществления в настоящем документе описаны конъюгаты IL-2, модифицированные в положении аминокислоты. В некоторых случаях модификация относится к природной аминокислоте. В некоторых случаях модификация относится к неприродной аминокислоте. В некоторых случаях в настоящем документе описан выделенный и модифицированный полипептид IL-2, который содержит по меньшей мере одну неприродную аминокислоту. В некоторых случаях полипептид IL-2 представляет собой выделенный и очищенный IL-2 млекопитающего, например, белок IL-2 грызунов или белок IL-2 человека. В некоторых случаях полипептид IL-2 представляет собой белок IL-2 человека. В некоторых случаях полипептид IL-2 характеризуется идентичностью последовательности, составляющей около 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% по отношению к SEQ ID NO: 1. В некоторых случаях полипептид IL-2 содержит последовательность SEQ ID NO: 1. В некоторых случаях полипептид IL-2 состоит из последовательности SEQ ID NO: 1. В дополнительных случаях полипептид IL-2 характеризуется идентичностью последовательности, составляющей около 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% по отношению к SEQ ID NO: 2. В дополнительных случаях полипептид IL-2 содержит последовательность SEQ ID NO: 2. В дополнительных случаях полипептид IL-2 состоит из последовательности SEQ ID NO: 2.

[33] В некоторых случаях полипептид IL-2 представляет собой усеченный вариант. В некоторых случаях усечение представляет собой N-концевую делецию. В других случаях усечение представляет собой С-концевую делецию. В дополнительных случаях усечение включает в себя как N-концевые, так и С-концевые делеции. Например, усечение может представлять собой делецию по меньшей мере или около 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20 или более остатков либо с N-конца, либо с С-конца, либо с обоих концов. В некоторых случаях полипептид IL-2 содержит N-концевую делецию по меньшей мере или около 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20 или более остатков. В некоторых случаях полипептид IL-2 содержит N-концевую делецию по меньшей мере или около 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 остатков. В некоторых случаях полипептид IL-2 содержит N-концевую делецию по меньшей мере или около 2 остатков. В некоторых случаях полипептид IL-2 содержит N-концевую делецию по меньшей мере или около 3 остатков. В некоторых случаях полипептид IL-2 содержит N-концевую делецию по меньшей мере или около 4 остатков. В некоторых случаях полипептид IL-2 содержит N-концевую делецию по меньшей мере или около 5 остатков. В некоторых случаях полипептид IL-2 содержит N-концевую делецию по меньшей мере или около 6 остатков. В некоторых случаях полипептид IL-2 содержит N-концевую делецию по меньшей мере или около 7 остатков. В некоторых случаях полипептид IL-2 содержит N-концевую делецию по меньшей мере или около 8 остатков. В некоторых случаях полипептид IL-2 содержит N-концевую делецию по меньшей мере или около 9 остатков. В некоторых случаях полипептид IL-2 содержит N-концевую делецию по меньшей мере или около 10 остатков.

[34] Согласно некоторым вариантам осуществления полипептид IL-2 представляет собой функционально активный фрагмент. В некоторых случаях функционально активный фрагмент содержит область IL-2 10-133, 20-133, 30-133, 10-130, 20-130, 30-130, 10-125, 20-125, 30-125, 1-130 или 1-125, причем положения остатков относятся к положениям в SEQ ID NO: 1. В некоторых случаях функционально активный фрагмент содержит область 10-133 IL-2, причем положения остатков относятся к положениям в SEQ ID NO: 1. В некоторых случаях функционально активный фрагмент содержит область 20-133 IL-2, причем положения остатков относятся к положениям в SEQ ID NO: 1. В некоторых случаях функционально активный фрагмент содержит область 30-133 IL-2, причем положения остатков относятся к положениям в SEQ ID NO: 1. В некоторых случаях функционально активный фрагмент содержит область 10-125 IL-2, причем положения остатков относятся к положениям в SEQ ID NO: 1. В некоторых случаях функционально активный фрагмент содержит область 20-125 IL-2, причем положения остатков относятся к положениям в SEQ ID NO: 1. В некоторых случаях функционально активный фрагмент содержит область 1-130 IL-2, причем положения остатков относятся к положениям в SEQ ID NO: 1. В некоторых случаях функционально активный фрагмент содержит область 1-125 IL-2, причем положения остатков относятся к положениям в SEQ ID NO: 1.

[35] Согласно некоторым вариантам осуществления описанный в настоящем документе конъюгат IL-2, который содержит выделенный, очищенный и модифицированный полипептид IL-2 и конъюгирующий фрагмент. В некоторых случаях конъюгат IL-2 обладает сниженной аффинностью к субъединице α рецептора IL-2 (IL-2Rα) по сравнению с полипептидом IL-2 дикого типа. В некоторых случаях конъюгирующий фрагмент связан с аминокислотным остатком, который взаимодействует с IL-2Rα (например, в области контакта IL-2/IL-2Rα). В некоторых случаях конъюгирующий фрагмент связан с аминокислотным остатком, который проксимален к области контакта IL-2/IL-2Rα (например, около 5Å, около 10 Å, около 15 Å или около 20 Å от области контакта IL-2/IL-2Rα). Как используется в настоящем документе, остатки, участвующие в области контакта IL-2/IL-2Rα, включают в себя остатки IL-2, которые образуют гидрофобные взаимодействия, водородные связи или ионные взаимодействия с остатками из субъединицы IL-2Rα.

[36] В некоторых случаях конъюгирующий фрагмент связан с аминокислотным остатком, выбранным из положения аминокислоты Y31, К32, N33, Р34, К35, Т37, R38, Т41, F42, К43, F44, Y45, Р47, К48, Q57, Е60, Е61, Е62, L63, К64, Р65, Е68, V69, N71, L72, Q74, S75, К76, N77, М104, С105, Е106, Y107, А108, D109, Е110, T111 или А112, причем нумерация аминокислотных остатков соответствует SEQ ID NO: 1. В некоторых случаях положение аминокислоты выбрано из Y31, К32, N33, Р34, К35, Т37, R38, Т41, F42, К43, F44, Y45, Р47, К48, Е61, Е62, Е68, К64, Р65, V69, L72, Q74, S75, К76, N77, M104, С105, Е106, Y107, А108, D109, Е110, T111 и А112. В некоторых случаях положение аминокислоты выбрано из N33, Р34, К35, Т37, R38, М39, Т41, F42, К43, F44, Y45, Q57, Е60, Е61, Е62, L63, К64, Р65, Е68, V69, N71, L72, М104, С105, Е106, Y107, А108, D109, Е110, T111 и А112. В некоторых случаях положение аминокислоты выбрано из К35, Т37, R38, Т41, F42, К43, F44, Y45, Е61, Е62, Е68, К64, Р65, V69, L72 и Y107. В некоторых случаях положение аминокислоты выбрано из Т37, R38, Т41, F42, F44, Y45, Е61, Е62, Е68, К64, Р65, V69, L72 и Y107. В некоторых случаях положение аминокислоты выбрано из Т37, R38, Т41, F42, F44, Y45, Е61, Е62, Е68, Р65, V69, L72 и Y107. В некоторых случаях положение аминокислоты выбрано из Т37, Т41, F42, F44, Y45, Р65, V69, L72 и Y107. В некоторых случаях положение аминокислоты выбрано из R38 и К64. В некоторых случаях положение аминокислоты выбрано из Е61, Е62 и Е68. В некоторых случаях положение аминокислоты находится в К35. В некоторых случаях положение аминокислоты находится в Т37. В некоторых случаях положение аминокислоты находится в R38. В некоторых случаях положение аминокислоты находится в Т41. В некоторых случаях положение аминокислоты находится в F42. В некоторых случаях положение аминокислоты находится в К43. В некоторых случаях положение аминокислоты находится в F44. В некоторых случаях положение аминокислоты находится в Y45. В некоторых случаях положение аминокислоты находится в Е61. В некоторых случаях положение аминокислоты находится в Е62. В некоторых случаях положение аминокислоты находится в К64. В некоторых случаях положение аминокислоты находится в Е68. В некоторых случаях положение аминокислоты находится в Р65. В некоторых случаях положение аминокислоты находится в V69. В некоторых случаях положение аминокислоты находится в L72. В некоторых случаях положение аминокислоты находится в Y107. В некоторых случаях положение аминокислоты находится в L72. В некоторых случаях положение аминокислоты находится в D109. [37] В некоторых случаях конъюгат IL-2 дополнительно содержит дополнительную мутацию. В некоторых случаях дополнительная мутация представляет собой положение аминокислоты, выбранное из К35, Т37, R38, Т41, F42, К43, F44, Y45, Е61, Е62, Е68, К64, Р65, V69, L72 и Y107. В таких случаях аминокислота конъюгирует с дополнительным конъюгирующим фрагментом для увеличения периода полужизни, стабильности или их комбинации в сыворотке. Альтернативно, аминокислота сначала мутирует в природную аминокислоту, такую как лизин, цистеин, гистидин, аргинин, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота, серии, треонин или тирозин; или до неприродной аминокислоты перед связыванием с дополнительным конъюгирующим фрагментом.

[38] Согласно некоторым вариантам осуществления сниженная аффинность модифицированного полипептида IL-2 к субъединице рецептора a IL-2 (IL-2Rα) относительно полипептида IL-2 дикого типа без неприродной модификации аминокислоты (например, полипептида IL-2 дикого типа) составляет около 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% или 99% или более чем 99%. В некоторых случаях снижение аффинности составляет около 10%. В некоторых случаях снижение аффинности составляет около 20%. В некоторых случаях снижение аффинности составляет около 40%. В некоторых случаях снижение аффинности составляет около 50%. В некоторых случаях снижение аффинности составляет около 60%. В некоторых случаях снижение аффинности составляет около 80%. В некоторых случаях снижение аффинности составляет около 90%. В некоторых случаях снижение аффинности составляет около 99%. В некоторых случаях снижение аффинности превышает 99%. В некоторых случаях снижение аффинности составляет около 80%. В некоторых случаях снижение аффинности составляет около 100%.

[39] Согласно некоторым вариантам осуществления снижение аффинности модифицированного полипептида IL-2 к субъединице рецептора a IL-2 (IL-2Rα) относительно эквивалентного полипептида IL-2 без неприродной аминокислотной модификации (например, полипептида IL-2 дикого типа) является около 1-кратным, 2-кратным, 3-кратным, 4-кратным, 5-кратным, 6-кратным, 7-кратным, 8-кратным, 9-кратным, 10-кратным, 30-кратным, 50-кратным, 100-кратным, 200-кратным, 300-кратным, 400-кратным, 500-кратным, 1000-кратным или более. В некоторых случаях снижение аффинности является около 1-кратным. В некоторых случаях снижение аффинности является около 2-кратным. В некоторых случаях снижение аффинности является около 4-кратным. В некоторых случаях снижение аффинности является около 5-кратным. В некоторых случаях снижение аффинности является около 6-кратным. В некоторых случаях снижение аффинности является около 8-кратным. В некоторых случаях снижение аффинности является около 10-кратным. В некоторых случаях снижение аффинности является около 30-кратным. В некоторых случаях снижение аффинности является около 50-кратным. В некоторых случаях снижение аффинности является около 100-кратным. В некоторых случаях снижение аффинности является около 300-кратным. В некоторых случаях снижение аффинности является около 500-кратным. В некоторых случаях снижение аффинности является около 1000-кратным. В некоторых случаях снижение аффинности является более чем 1000-кратным.

[40] В некоторых случаях модифицированный полипептид IL-2 не взаимодействует с IL-2Rα. В некоторых случаях модифицированный полипептид IL-2 дополнительно конъюгируют с конъюгирующим фрагментом. В некоторых случаях конъюгат IL-2 не взаимодействует с IL-2Rα.

[41] Согласно некоторым вариантам осуществления модифицированный полипептид IL-2 проявляет первую активность в рецепторной передаче сигнала для сигнального комплекса IL-2βγ и вторую активность в рецепторной передаче сигнала для сигнального комплекса IL-2αβγ, и причем разница между первой активностью в рецепторной передаче сигнала и второй активностью в рецепторной передаче сигнала является менее чем 10-кратной. Согласно некоторым вариантам осуществления модифицированный полипептид IL-2 проявляет первую активность в рецепторной передаче сигнала к сигнальному комплексу IL-2βγ и вторую активность в рецепторной передаче сигнала к сигнальному комплексу IL-2αβγ, и причем разница между первой активностью в рецепторной передаче сигнала и второй активностью в рецепторной передаче сигнала является менее чем 5-кратной. В некоторых случаях разница является менее чем 9-кратной, менее чем 8-кратной, менее чем 7-кратной, менее чем 6-кратной, менее чем 5-кратной, менее чем 4-кратной, менее чем 3-кратной, менее чем 2-кратной или менее чем 1-кратной. В некоторых случаях модифицированный полипептид IL-2 является частичным агонистом, например, агонистом, который активирует рецептор (например, сигнальный комплекс IL-2βγ или сигнальный комплекс IL-2αβγ), но обладает только частичной эффективностью в отношении рецептора относительно полного агониста. В некоторых случаях модифицированный полипептид IL-2 является полным агонистом, например, агонистом, который активирует рецептор (например, сигнальный комплекс IL-2βγ или сигнальный комплекс IL-2αβγ) при максимальном ответе.

[42] В некоторых случаях активность в рецепторной передаче сигнала измеряется значением ЕС50. В некоторых случаях модифицированный полипептид IL-2 обеспечивает первое значение ЕС50 для активации сигнального комплекса IL-2βγ и второе значение ЕС50 для активации сигнального комплекса IL-2αβ, и причем разница между первым значением ЕС50 и вторым значением ЕС50 является менее чем 10-кратной. В некоторых случаях модифицированный полипептид IL-2 обеспечивает первое значение ЕС50 для активации сигнального комплекса IL-2βγ и второе значение ЕС50 для активации сигнального комплекса IL-2αβ, и причем разница между первым значением ЕС50 и вторым значением ЕС50 является менее чем 5-кратной. В некоторых случаях разница является менее чем 9-кратной, менее чем 8-кратной, менее чем 7-кратной, менее чем 6-кратной, менее чем 5-кратной, менее чем 4-кратной, менее чем 3-кратной, менее чем 2-кратной или менее чем 1-кратной.

[43] В некоторых случаях активность в рецепторной передаче сигнала измеряется значением ED50. В некоторых случаях модифицированный полипептид IL-2 обеспечивает первое значение ED50 для активации сигнального комплекса IL-2βγ и второе значение ED50 для активации сигнального комплекса IL-2αβγ, и причем разница между первым значением ED50 и вторым значением ED50 является менее чем 10-кратной. В некоторых случаях модифицированный полипептид IL-2 обеспечивает первое значение ED50 для активации сигнального комплекса IL-2βγ и второе значение ED50 для активации сигнального комплекса IL-2αβγ, и причем разница между первым значением ED50 и вторым значением ED50 является менее чем 5-кратной. В некоторых случаях разница является менее чем 9-кратной, менее чем 8-кратной, менее чем 7-кратной, менее чем 6-кратной, менее чем 5-кратной, менее чем 4-кратной, менее чем 3-кратной, менее чем 2-кратной или менее чем 1-кратной.

[44] Согласно некоторым вариантам осуществления конъюгирующий фрагмент связан с N-концом или С-концом полипептида IL-2 либо прямо, либо опосредованно через линкерный пептид. В некоторых случаях конъюгирующий фрагмент (например, полимер, белок или пептид) генетически слит с IL-2 на N-конце или С-конце IL-2 и либо прямо, либо опосредованно через линкерный пептид. В некоторых случаях конъюгирующий фрагмент связан с N-концом или аминокислотным остатком С-конца. В некоторых случаях конъюгирующий фрагмент связан с реакционноспособной группой, которая связана с N-концом или С-концом аминокислотного остатка.

[45] Согласно некоторым вариантам осуществления конъюгат IL-2 с пониженной аффинностью связывания к IL-2Rα способен вызывать экспансию популяций CD4+ хелперных клеток, CD8+ эффекторных наивных Т-клеток и Т-клеток памяти, клеток естественных киллеров (NK) или Т-клеток естественных киллеров (NKT). В некоторых случаях конъюгирующий фрагмент ослабляет или блокирует связывание IL-2 с IL-2Rα.

[46] В некоторых случаях активация популяции CD4+ хелперных клеток, CD8+ эффекторных наивных клеток и клеток памяти, клеток естественных киллеров (NK) или Т-клеток естественных киллеров (NKT) через комплекс IL-2Rβγ с помощью модифицированного полипептида IL-2 сохраняет значительную активность активации указанной клеточной популяции относительно полипептида IL-2 дикого типа. В некоторых случаях активация модифицированным полипептидом IL-2 эквивалентна таковой полипептида IL-2 дикого типа. В других случаях активация модифицированным полипептидом IL-2 выше, чем таковая полипептида IL-2 дикого типа. В некоторых случаях активность в рецепторной передаче сигнала модифицированного полипептида IL-2 к комплексу IL-2Rβ выше, чем активность в рецепторной передаче сигнала полипептида IL-2 дикого типа к комплексу IL-2Rβγ. В некоторых случаях активность в рецепторной передаче сигнала модифицированного полипептида IL-2 по меньшей мере в 1 раз выше, чем соответствующая активность полипептида IL-2 дикого типа. В некоторых случаях активность в рецепторной передаче сигнала модифицированного полипептида IL-2 около или по меньшей мере в 2 раза, 3 раза, 4 раза, 5 раз, 6 раз, 7 раз, 8 раз, 9 раз, 10 раз, 15 раз, 20 раз, 25 раз, 30 раз, 40 раз, 50 раз, 60 раз, 70 раз, 80 раз, 90 раз, 100 раз, 150 раз, 200 раз, 300 раз, 400 раз, 500 раз, 1000 раз или более выше соответствующей активности полипептида IL-2 дикого типа. В таких случаях доза или концентрация модифицированного полипептида IL-2, используемая для достижения аналогичного уровня активации популяции CD4+ хелперных клеток, CD8+ эффекторных наивных Т-клеток и Т-клеток памяти, клеток естественных киллеров (NK) или Т-клеток естественных киллеров (NKT) в виде полипептида IL-2 дикого типа ниже, чем доза или концентрация, используемая для полипептида IL-2 дикого типа.

[47] Согласно некоторым вариантам осуществления активация популяции CD4+ хелперных клеток, CD8+ эффекторных наивных Т-клеток и Т-клеток памяти, клеток естественных киллеров (NK) или Т-клеток естественных киллеров (NKT) через комплекс IL-2Rβγ с помощью модифицированного полипептида IL-2 сохраняет значительную активность активации указанной клеточной популяции полипептидом IL-2 дикого типа. В некоторых случаях активность в рецепторной передаче сигнала модифицированного полипептида IL-2 к комплексу IL-2Rβγ ниже, чем активность в рецепторной передаче сигнала полипептида IL-2 дикого типа к комплексу IL-2Rβγ. В некоторых случаях активность в рецепторной передаче сигнала рецептора модифицированного полипептида IL-2 около или по меньшей мере в 1 раз, 2 раза, 3 раза, 4 раза, 5 раз, 10 раз, 20 раз или 50 раз ниже, чем соответствующая активность полипептида IL-2 дикого типа.

[48] Согласно некоторым вариантам осуществления модифицированный полипептид IL-2 проявляет первую активность в рецепторной передаче сигнала к IL-2Rβγ и вторую активность в рецепторной передаче сигнала к IL-2Rαβγ. В некоторых случаях первая активность в рецепторной передаче сигнала к IL-2Rβ представляет собой улучшенную активностью по сравнению с полипептидом IL-2 дикого типа. В некоторых случаях вторая активность в рецепторной передаче сигнала к IL-2Rαβ представляет собой нарушенную активность по сравнению с полипептидом IL-2 дикого типа. Согласно некоторым вариантам осуществления модифицированный полипептид IL-2 проявляет первую активность в рецепторной передаче сигнала к IL-2Rβγ и вторую активность в рецепторной передаче сигнала к IL-2Rαβγ, и причем первая активность в рецепторной передаче сигнала является по меньшей мере 1-кратной, 2-кратной, 3-кратной, 4-кратной, 5-кратной, 6-кратной, 7-кратной, 8-кратной, 9-кратной, 10-кратной, 20-кратной, 30-кратной, 50-кратной, 100-кратной, 500-кратной, 1000-кратной или выше, чем вторая активность в рецепторной передаче сигнала. В некоторых случаях первая активность в рецепторной передаче сигнала по меньшей мере в 1 раз или более выше, чем вторая активность в рецепторной передаче сигнала. В некоторых случаях первая активность в рецепторной передаче сигнала по меньшей мере в 2 раза или более выше, чем вторая активность в рецепторной передаче сигнала. В некоторых случаях первая активность в рецепторной передаче сигнала по меньшей мере в 5 раз или более выше, чем вторая активность в рецепторной передаче сигнала. В некоторых случаях первая активность в рецепторной передаче сигнала по меньшей мере в 10 раз или более выше, чем вторая активность в рецепторной передаче сигнала. В некоторых случаях первая активность в рецепторной передаче сигнала по меньшей мере в 20 раз или более выше, чем вторая активность в рецепторной передаче сигнала. В некоторых случаях первая активность в рецепторной передаче сигнала по меньшей мере в 50 раз или более выше, чем вторая активность в рецепторной передаче сигнала. В некоторых случаях первая активность в рецепторной передаче сигнала по меньшей мере в 100 раз или более выше, чем вторая активность в рецепторной передаче сигнала. В некоторых случаях первая активность в рецепторной передаче сигнала по меньшей мере в 500 раз или более выше, чем вторая активность в рецепторной передаче сигнала. В некоторых случаях первая активность в рецепторной передаче сигнала по меньшей мере в 1000 раз или более выше, чем вторая активность в рецепторной передаче сигнала. В некоторых случаях первая активность в рецепторной передаче сигнала модифицированного полипептида IL-2 выше, чем активность в рецепторной передаче сигнала полипептида IL-2 дикого типа к IL-2Rβγ, и вторая активность в рецепторной передаче сигнала модифицированного IL-2 полипептид ниже, чем активность в рецепторной передаче сигнала полипептида IL-2 дикого типа к IL-2Rαβγ. В некоторых случаях обе активности в рецепторной передаче сигнала ниже, чем их соответствующие активности в полипептиде IL-2 дикого типа. В других случаях обе активности в рецепторной передаче сигнала выше, чем их соответствующие активности в полипептиде IL-2 дикого типа.

[49] Согласно некоторым вариантам осуществления конъюгат IL-2 уменьшает токсическое нежелательное явление у субъекта, которому вводят конъюгат IL-2. Иллюстративные токсические нежелательные явления включают в себя эозинофилию, синдром повышенной проницаемости капилляров и синдром пропотевания жидкости из сосудов (VLS). В некоторых случаях конъюгат IL-2 снижает вероятность токсического нежелательного явления у субъекта около на 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% или около на 100% относительно второго субъекта, которому вводили IL-2 дикого типа или альдеслейкин. В некоторых случаях конъюгат IL-2 снижает тяжесть токсического нежелательного явления у субъекта около на 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% или около на 100% относительно второго субъекта, которому вводили IL-2 дикого типа или альдеслейкин.

[50] В некоторых случаях токсическим нежелательным явлением является эозинофилия. В некоторых случаях конъюгат IL-2 снижает вероятность возникновения эозинофилии у субъекта около на 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% или около на 100% относительно второго субъекта, которому вводили IL-2 дикого типа или альдеслейкин. В некоторых случаях конъюгат IL-2 снижает тяжесть эозинофилии у субъекта около на 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% или около на 100% относительно второго субъекта, которому вводили IL-2 дикого типа или альдеслейкин.

[51] В некоторых случаях токсическим нежелательным явлением является повышенная проницаемость капилляров. В некоторых случаях конъюгат IL-2 уменьшает вероятность повышенной проницаемости капилляров у субъекта около на 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% или около на 100% относительно второго субъекта, которому вводили IL-2 дикого типа или альдеслейкин. В некоторых случаях конъюгат IL-2 снижает тяжесть повышенной проницаемости капилляров у субъекта около на 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% или около на 100% относительно второго субъекта, которому вводили IL-2 дикого типа или альдеслейкин.

[52] В некоторых случаях токсическим нежелательным явлением является VLS. В некоторых случаях конъюгат IL-2 снижает вероятность возникновения VLS у субъекта около на 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% или около на 100% относительно второго субъекта, которому вводили IL-2 дикого типа или альдеслейкин. В некоторых случаях конъюгат IL-2 снижает тяжесть VLS у субъекта около на 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% или около на 100% относительно второго субъекта, которому вводили IL-2 дикого типа или альдеслейкин.

[53] Согласно некоторым вариантам осуществления конъюгат IL-2 характеризуется периодом полужизни в плазме, превышающим 1 час, 2 часа, 3 часа, 4 часа, 5 часов, 6 часов, 7 часов, 8 часов, 9 часов, 10 часов 12 часов, 18 часов, 24 часа, 2 дня, 3 дня, 4 дня, 5 дней, 6 дней, 7 дней или более. Согласно некоторым вариантам осуществления конъюгат IL-2 характеризуется периодом полужизни в плазме, превышающим 1 час, 2 часа, 3 часа, 4 часа, 5 часов, 6 часов, 7 часов, 8 часов, 9 часов, 10 часов или более. Согласно некоторым вариантам осуществления конъюгат IL-2 характеризуется периодом полужизни в плазме более 1 часа. Согласно некоторым вариантам осуществления конъюгат IL-2 характеризуется периодом полужизни в плазме более 2 часов. Согласно некоторым вариантам осуществления конъюгат IL-2 характеризуется периодом полужизни в плазме более 3 часов. Согласно некоторым вариантам осуществления конъюгат IL-2 характеризуется периодом полужизни в плазме более 4 часов. Согласно некоторым вариантам осуществления конъюгат IL-2 характеризуется периодом полужизни в плазме более 5 часов. Согласно некоторым вариантам осуществления конъюгат IL-2 характеризуется периодом полужизни в плазме более 6 часов. Согласно некоторым вариантам осуществления конъюгат IL-2 характеризуется периодом полужизни в плазме более 7 часов. Согласно некоторым вариантам осуществления конъюгат IL-2 характеризуется периодом полужизни в плазме более 8 часов. Согласно некоторым вариантам осуществления конъюгат IL-2 характеризуется периодом полужизни в плазме более 9 часов. Согласно некоторым вариантам осуществления конъюгат IL-2 характеризуется периодом полужизни в плазме более 10 часов. Согласно некоторым вариантам осуществления конъюгат IL-2 характеризуется периодом полужизни в плазме более 12 часов. Согласно некоторым вариантам осуществления конъюгат IL-2 характеризуется периодом полужизни в плазме более 18 часов. Согласно некоторым вариантам осуществления конъюгат IL-2 характеризуется периодом полужизни в плазме более 24 часов.

[54] Согласно некоторым вариантам осуществления конъюгат IL-2 характеризуется периодом полужизни в плазме, составляющим по меньшей мере 1 час, 2 часа, 3 часа, 4 часа, 5 часов, 6 часов, 7 часов, 8 часов, 9 часов, 10 часов, 12 часов, 15 часов, 18 часов, 24 часа, 2 дня, 3 дня, 4 дня, 5 дней, 6 дней, 7 дней или более. Согласно некоторым вариантам осуществления конъюгат IL-2 характеризуется периодом полужизни в плазме, составляющим по меньшей мере 1 час, 2 часа, 3 часа, 4 часа, 5 часов, 6 часов, 7 часов, 8 часов, 9 часов, 10 часов, 12 часов, 15 часов, 18 часов, 24 часа или больше. Согласно некоторым вариантам осуществления конъюгат IL-2 характеризуется периодом полужизни в плазме, составляющим по меньшей мере 1 час. Согласно некоторым вариантам осуществления конъюгат IL-2 характеризуется периодом полужизни в плазме, составляющим по меньшей мере 2 часа. Согласно некоторым вариантам осуществления конъюгат IL-2 характеризуется периодом полужизни в плазме, составляющим по меньшей мере 3 часа. Согласно некоторым вариантам осуществления конъюгат IL-2 характеризуется периодом полужизни в плазме, составляющим по меньшей мере 4 часа. Согласно некоторым вариантам осуществления конъюгат IL-2 характеризуется периодом полужизни в плазме, составляющим по меньшей мере 5 часов. Согласно некоторым вариантам осуществления конъюгат IL-2 характеризуется периодом полужизни в плазме, составляющим по меньшей мере 6 часов. Согласно некоторым вариантам осуществления конъюгат IL-2 характеризуется периодом полужизни в плазме, составляющим по меньшей мере 7 часов. Согласно некоторым вариантам осуществления конъюгат IL-2 характеризуется периодом полужизни в плазме, составляющим по меньшей мере 8 часов. Согласно некоторым вариантам осуществления конъюгат IL-2 характеризуется периодом полужизни в плазме, составляющим по меньшей мере 9 часов. Согласно некоторым вариантам осуществления конъюгат IL-2 характеризуется периодом полужизни в плазме, составляющим по меньшей мере 10 часов. Согласно некоторым вариантам осуществления конъюгат IL-2 характеризуется периодом полужизни в плазме, составляющим по меньшей мере 12 часов. Согласно некоторым вариантам осуществления конъюгат IL-2 характеризуется периодом полужизни в плазме, составляющим по меньшей мере 18 часов. Согласно некоторым вариантам осуществления конъюгат IL-2 характеризуется периодом полужизни в плазме, составляющим по меньшей мере 24 часа.

[55] Согласно некоторым вариантам осуществления конъюгат IL-2 характеризуется периодом полужизни в плазме, составляющим по меньшей мере от около 1 часа до около 7 дней, от около 12 часов до около 7 дней, от около 18 часов до около 7 дней, от около 24 часов до около 7 дней, от около 1 часа до около 5 дней, от около 12 часов до около 5 дней, от около 24 часов до около 5 дней, от около 2 дней до около 5 дней или от около 2 дней до около 3 дней.

[56] Согласно некоторым вариантам осуществления конъюгат IL-2 характеризуется периодом полужизни в плазме, составляющим по меньшей мере от около 1 часа до около 18 часов, от около 1 часа до около 12 часов, от около 2 часов до около 10 часов, от около 2 часов до около 8 часов, от около 4 часов до около 18 часов, от около 4 часов до около 12 часов, от около 4 часов до около 10 часов, от около 4 часов до около 8 часов, от около 6 часов до около 18 часов, от около 6 часов до около 12 часов, от около 6 часов до около 10 часов, от около 6 часов до около 8 часов, от около 8 часов до около 18 часов, от около 8 часов до около 12 часов или от около 8 часов до 10 часов.

[57] Согласно некоторым вариантам осуществления конъюгат IL-2 характеризуется периодом полужизни в плазме, при котором способен приводить к пролиферации и/или экспансии CD4+ хелперных клеток, CD8+ эффекторных наивных Т-клеток и Т-клеток памяти, клеток естественных киллеров (NK) или Т-клеток естественных киллеров (NKT) или их комбинации, но не оказывает вредного воздействия, такого как апоптоз.

[58] Согласно некоторым вариантам осуществления конъюгат IL-2 характеризуется увеличенным периодом полужизни в плазме, например, по меньшей мере на 1 час, 2 часа, 3 часа, 4 часа, 5 часов, 6 часов, 7 часов, 8 часов, 9 часов, 10 часов, 12 часов, 15 часов, 18 часов, 24 часа, 2 дня, 3 дня, 4 дня, 5 дней, 6 дней, 7 дней или более относительно IL-2 дикого типа. Согласно некоторым вариантам осуществления конъюгат IL-2 характеризуется увеличенным периодом полужизни в плазме, например, по меньшей мере на 1 час, 2 часа, 3 часа, 4 часа, 5 часов, 6 часов, 7 часов, 8 часов, 9 часов, 10 часов, 12 часов, 15 часов, 18 часов, 24 часа или более относительно IL-2 дикого типа.

[59] Согласно некоторым вариантам осуществления конъюгат IL-2 характеризуется увеличенным периодом полужизни в плазме, например, от около 1 часа до около 18 часов, от около 1 часа до около 12 часов, от около 2 часов до около 10 часов, от около 2 часов до около 8 часов, от около 4 часов до около 18 часов, от около 4 часов до около 12 часов, от около 4 часов до около 10 часов, от около 4 часов до около 8 часов, от около 6 часов до около 18 часов, от около 6 часов до около 12 часов, от около 6 часов до около 10 часов, от около 6 часов до около 8 часов, от около 8 часов до около 18 часов, от около 8 часов до около 12 часов или от около 8 часов до около 10 часов относительно IL-2 дикого типа.

[60] Согласно некоторым вариантам осуществления конъюгат IL-2 характеризуется увеличенным периодом полужизни в плазме, например, по меньшей мере на 1 час, 2 часа, 3 часа, 4 часа, 5 часов, 6 часов, 7 часов, 8 часов, 9 часов, 10 часов, 12 часов, 15 часов, 18 часов, 24 часа, 2 дня, 3 дня, 4 дня, 5 дней, 6 дней, 7 дней или более по отношению к альдеслейкину. Согласно некоторым вариантам осуществления конъюгат IL-2 характеризуется увеличенным периодом полужизни в плазме, например, по меньшей мере на 1 час, 2 часа, 3 часа, 4 часа, 5 часов, 6 часов, 7 часов, 8 часов, 9 часов, 10 часов, 12 часов, 15 часов, 18 часов, 24 часа или более по отношению к альдеслейкину

[61] Согласно некоторым вариантам осуществления конъюгат IL-2 характеризуется увеличенным периодом полужизни в плазме, например, от около 1 часа до около 18 часов, от около 1 часа до около 12 часов, от около 2 часов до около 10 часов, от около 2 часов до около 8 часов, от около 4 часов до около 18 часов, от около 4 часов до около 12 часов, от около 4 часов до около 10 часов, от около 4 часов до около 8 часов, от около 6 часов до около 18 часов, от около 6 часов до около 12 часов, от около 6 часов до около 10 часов, от около 6 часов до около 8 часов, от около 8 часов до около 18 часов, от около 8 часов до около 12 часов или от около 8 часов до около 10 часов относительно альдеслейкина.

[62] Согласно некоторым вариантам осуществления конъюгат IL-2 характеризуется увеличенным периодом полужизни в плазме с пониженной токсичностью. В некоторых случаях конъюгат IL-2 характеризуется увеличенным периодом полужизни в плазме по меньшей мере на 1 час, 2 часа, 3 часа, 4 часа, 5 часов, 6 часов, 7 часов, 8 часов, 9 часов, 10 часов, 12 часов, 15 часов, 18 часов, 24 часа, 2 дня, 3 дня, 4 дня, 5 дней, 6 дней, 7 дней или более с пониженной токсичностью. В некоторых случаях конъюгат IL-2 характеризуется увеличенным периодом полужизни в плазме по меньшей мере на 1 час, 2 часа, 3 часа, 4 часа, 5 часов, 6 часов, 7 часов, 8 часов, 9 часов, 10 часов, 12 часов, 15 часов, 18 часов, 24 часа или более с пониженной токсичностью. В некоторых случаях конъюгат IL-2 характеризуется увеличенным периодом полужизни в плазме от около 1 часа до около 18 часов, от около 1 часа до около 12 часов, от около 2 часов до около 10 часов, от около 2 часов до около 8 часов, от около 4 часов до около 18 часов, от около 4 часов до около 12 часов, от около 4 часов до около 10 часов, от около 4 часов до около 8 часов, от около 6 часов до около 18 часов, от около 6 часов до около 12 часов, от около 6 часов до около 10 часов, от около 6 часов до около 8 часов, от около 8 часов до около 18 часов, от около 8 часов до около 12 часов или от около 8 часов до около 10 часов с пониженной токсичностью. В некоторых случаях снижение токсичности является по меньшей мере 1-кратным, 2-кратным, 3-кратным, 4-кратным, 5-кратным, 6-кратным, 7-кратным, 8-кратным, 9-кратным, 10-кратным, 20-кратным, 30-кратным, 50-кратным, 100-кратным или более относительно IL2 дикого типа. В некоторых случаях пониженная токсичность представляет собой снижение по меньшей мере на 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% или более относительно IL-2 дикого типа.

[63] Согласно некоторым вариантам осуществления конъюгат IL-2 характеризуется увеличенным периодом полужизни в плазме с пониженной токсичностью. В некоторых случаях конъюгат IL-2 характеризуется увеличенным периодом полужизни в плазме по меньшей мере на 1 час, 2 часа, 3 часа, 4 часа, 5 часов, 6 часов, 7 часов, 8 часов, 9 часов, 10 часов, 12 часов, 15 часов, 18 часов, 24 часа, 2 дня, 3 дня, 4 дня, 5 дней, 6 дней, 7 дней или более с пониженной токсичностью. В некоторых случаях конъюгат IL-2 характеризуется увеличенным периодом полужизни в плазме по меньшей мере на 1 час, 2 часа, 3 часа, 4 часа, 5 часов, 6 часов, 7 часов, 8 часов, 9 часов, 10 часов, 12 часов, 15 часов, 18 часов, 24 часа или более с пониженной токсичностью. В некоторых случаях конъюгат IL-2 характеризуется увеличенным периодом полужизни в плазме от около 1 часа до около 18 часов, от около 1 часа до около 12 часов, от около 2 часов до около 10 часов, от около 2 часов до около 8 часов, от около 4 часов до около 18 часов, от около 4 часов до около 12 часов, от около 4 часов до около 10 часов, от около 4 часов до около 8 часов, от около 6 часов до около 18 часов, от около 6 часов до около 12 часов, от около 6 часов до около 10 часов, от около 6 часов до около 8 часов, от около 8 часов до около 18 часов, от около 8 часов до около 12 часов или от около 8 часов до около 10 часов с пониженной токсичностью. В некоторых случаях снижение токсичности является по меньшей мере 1-кратным, 2-кратным, 3-кратным, 4-кратным, 5-кратным, 6-кратным, 7-кратным, 8-кратным, 9-кратным, 10-кратным, 20-кратным, 30-кратным, 50-кратным, 100-кратным или более относительно IL2 дикого типа. В некоторых случаях пониженная токсичность представляет собой снижение по меньшей мере на 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% или более относительно альдеслейкина.

[64] Согласно некоторым вариантам осуществления конъюгат IL-2 содержит конъюгирующий фрагмент, причем размер (например, объем или длина) конъюгирующего фрагмента повышает стабильность в плазме, но не снижает активность. В некоторых случаях размер конъюгирующего фрагмента увеличивает период полужизни в плазме по меньшей мере на 1 час, 2 часа, 3 часа, 4 часа, 5 часов, 6 часов, 7 часов, 8 часов, 9 часов, 10 часов, 12 часов, 15 часов, 18 часов, 24 часа, 2 дня, 3 дня, 4 дня, 5 дней, 6 дней, 7 дней или более. В некоторых случаях размер конъюгирующего фрагмента увеличивает период полужизни в плазме по меньшей мере на 1 час, 2 часа, 3 часа, 4 часа, 5 часов, 6 часов, 7 часов, 8 часов, 9 часов, 10 часов, 12 часов, 15 часов, 18 часов, 24 часа или более. В некоторых случаях размер конъюгирующего фрагмента увеличивает период полужизни в плазме от около 1 часа до около 18 часов, от около 1 часа до около 12 часов, от около 2 часов до около 10 часов, от около 2 часов до около 8 часов, от около 4 часов до около 18 часов, от около 4 часов до около 12 часов, от около 4 часов до около 10 часов, от около 4 часов до около 8 часов, от около 6 часов до около 18 часов, от около 6 часов до около 12 часов, от около 6 часов до около 10 часов, от около 6 часов до около 8 часов, от около 8 часов до около 18 часов, от около 8 часов до около 12 часов или от около 8 часов до около 10 часов. В некоторых случаях размер конъюгирующего фрагмента снижает активность менее чем на 5%, 4%, 3%, 2%, 1% или менее относительно альдеслейкина.

[65] Согласно некоторым вариантам осуществления конъюгат IL-2 содержит конъюгирующий фрагмент, в котором размер (например, объем или длина) конъюгирующего фрагмента повышает стабильность и активность плазмы. В некоторых случаях размер конъюгирующего фрагмента увеличивает период полужизни в плазме по меньшей мере на 1 час, 2 часа, 3 часа, 4 часа, 5 часов, 6 часов, 7 часов, 8 часов, 9 часов, 10 часов, 12 часов 15 часов, 18 часов, 24 часа, 2 дня, 3 дня, 4 дня, 5 дней, 6 дней, 7 дней или более. В некоторых случаях размер конъюгирующего фрагмента увеличивает период полужизни в плазме по меньшей мере на 1 час, 2 часа, 3 часа, 4 часа, 5 часов, 6 часов, 7 часов, 8 часов, 9 часов, 10 часов, 12 часов, 15 часов, 18 часов, 24 часа или больше. В некоторых случаях размер конъюгирующего фрагмента увеличивает период полураспада в плазме от около 1 часа до около 18 часов, от около 1 часа до около 12 часов, от около 2 часов до около 10 часов, от около 2 часов до около 8 часов, от около 4 часов до около 18 часов, от около 4 часов до около 12 часов, от около 4 часов до около 10 часов, от около 4 часов до около 8 часов, от около 6 часов до около 18 часов, от около 6 часов до около 12 часов, от около 6 часов до около 10 часов, от около 6 часов до около 8 часов, от около 8 часов до около 18 часов, от около 8 часов до около 12 часов или от около 8 часов до около 10 часов. В некоторых случаях размер конъюгирующего фрагмента дополнительно увеличивает активность более чем на 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200% или более по отношению к альдеслейкину.

[66] Согласно некоторым вариантам осуществления в настоящем документе описан конъюгат IL-2, содержащий неприродную аминокислоту, ковалентно присоединенную к конъюгирующему фрагменту, причем неприродная аминокислота расположена в области 35-107 и причем область 35-107 соответствует остаткам K35-Y107 в SEQ ID NO: 1.

[67] Согласно некоторым вариантам осуществления в настоящем документе описан белок, связывающий рецептор βγ интерлейкина 2 (IL-2Rβγ), причем аффинность связывания к рецептору α интерлейкина 2 (IL-2Rα) указанного связывающего белка меньше, чем у человеческого IL-2 дикого типа (hIL-2), причем аффинность связывания к рецептору α интерлейкина 2 (IL-2Rα) указанного связывающего белка меньше, чем у человеческого IL-2 дикого типа (hIL-2). Согласно некоторым вариантам осуществления в настоящем документе описан белок, связывающий рецептор βγ интерлейкина 2 (IL-2Rβγ), причем аффинность связывания к рецептору α интерлейкина 2 (IL-2Rα) указанного связывающего белка меньше, чем у человеческого IL-2 дикого типа (hIL-2), и причем указанный связывающий белок содержит по меньшей мере одну неприродную аминокислоту. В некоторых случаях указанный связывающий белок представляет собой модифицированный полипептид IL-2 или его функционально активный фрагмент, причем модифицированный полипептид IL-2 содержит по меньшей мере одну неприродную аминокислоту. В некоторых случаях по меньшей мере одна неприродная аминокислота расположена в области 35-107, и причем область 35-107 соответствует остаткам K35-Y107 в SEQIDNO: 1.

[68] Согласно некоторым вариантам осуществления в настоящем документе описан комплекс IL-2/IL-2Rβγ, содержащий модифицированный полипептид IL-2, содержащий мутацию, и IL-2Rβγ, причем модифицированный полипептид IL-2 обладает сниженной аффинностью связывания к IL-2Rα и причем сниженная аффинность связывания сравнивается с аффинностью связывания между полипептидом IL-2 дикого типа и IL-2Rα. В некоторых случаях модифицированный полипептид IL-2 дополнительно содержит конъюгирующий фрагмент, ковалентно связанный с сайтом мутации. В некоторых случаях сайт мутации содержит аминокислоту, мутированную в природную аминокислоту. В некоторых случаях сайт мутации содержит аминокислоту, мутированную в остаток цистеина. В других случаях сайт мутации содержит аминокислоту, мутированную в остаток лизина.

[69] Согласно некоторым вариантам осуществления в настоящем документе описан комплекс IL-2/IL-2Rβγ, содержащий модифицированный полипептид IL-2, содержащий неприродную аминокислоту и IL-2Rβγ, причем модифицированный полипептид IL-2 характеризуется сниженной аффинностью связывания к IL-2Rα, и причем сниженная аффинность связывания сравнивается с аффинностью связывания между полипептидом IL-2 дикого типа и IL-2Rα. В некоторых случаях модифицированный полипептид IL-2 дополнительно содержит конъюгирующий фрагмент, ковалентно связанный с неприродной аминокислотой.

[70] Согласно некоторым вариантам осуществления в настоящем документе описан комплекс IL-2/IL-2Rβγ, содержащий модифицированный полипептид IL-2, содержащий неприродную аминокислоту, и IL-2Rβγ, причем модифицированный полипептид IL-2 обладает сниженной активностью в рецепторной передаче сигналов по отношению к IL-2Rα, и причем сниженная активность в рецепторной передаче сигналов сравнивается с активностью в рецепторной передаче сигналов между полипептидом IL-2 дикого типа и IL-2Rα. В некоторых случаях модифицированный полипептид IL-2 дополнительно содержит конъюгирующий фрагмент, ковалентно связанный с неприродной аминокислотой.

[71] Согласно некоторым вариантам осуществления в настоящем документе описан активатор CD4+ хелперных клеток, CD8+ эффекторных наивных Т-клеток и Т-клеток памяти, клеток естественных киллеров (NK) или Т-клеток естественных киллеров (NKT), который избирательно вызывает экспансию CD4+ хелперных клеток, CD8+ эффекторных наивных Т-клеток и Т-клеток памяти, NK-клеток, NKT-клеток или их комбинации в клеточной популяции, причем указанный активатор содержит модифицированный полипептид интерлейкин 2 (IL-2), содержащий по меньшей мере одну мутацию. В некоторых случаях мутация относится к природной аминокислоте. В других случаях мутация относится к неприродной аминокислоте. Согласно некоторым вариантам осуществления в настоящем документе описан активатор CD4+ хелперных клеток, CD8+э ффекторных наивных Т-клеток и Т-клеток памяти, клеток естественных киллеров (NK) или Т-клеток естественных киллеров (NKT), который избирательно вызывает экспансию CD4+ хелперных клеток, CD8+ эффекторных наивных Т-клеток и Т-клеток памяти, NK-клеток, NKT-клеток или их комбинации в клеточной популяции, причем указанный активатор содержит модифицированный полипептид интерлейкин 2 (IL-2), содержащий по меньшей мере одну неприродную аминокислоту. В некоторых случаях указанный активатор вызывает экспансию CD4+ Т регуляторных (Treg) клеток менее чем на 20%, 15%, 10%, 5%, 1% или менее чем на 0,1%, когда указанный активатор находится в контакте с указанной популяцией CD3+ клеток по сравнению с экспансией CD4+ Treg-клеток в популяции CD3+ клеток, контактирующих с полипептидом IL-2 дикого типа. В некоторых случаях указанный активатор не вызывает экспансии Treg-клеток в указанной клеточной популяции. В некоторых случаях указанная клеточная популяция представляет собой клеточную популяцию in vivo. В некоторых случаях указанная клеточная популяция представляет собой клеточную популяцию in vitro. В некоторых случаях указанная клеточная популяция представляет собой клеточную популяцию ex vivo.

[72] В некоторых случаях в настоящем документе также описан способ экспансии популяции CD4+ хелперных клеток, CD8+э ффекторных наивных Т-клеток и Т-клеток памяти, клеток естественных киллеров (NK) или Т-клеток естественных киллеров (NKT), предусматривающий контакт указанной клеточной популяции с терапевтически эффективным количеством активатора CD4+ хелперных клеток, CD8+ эффекторных наивных Т-клеток и Т-клеток памяти, клеток естественных киллеров (NK) или Т-клеток естественных киллеров (NKT), причем указанный активатор включает в себя модифицированный полипептид интерлейкин 2 (IL-2), содержащий по меньшей мере одну мутацию, таким образом вызывая экспансию популяции CD4+ хелперных клеток, CD8+ эффекторных наивных Т-клеток и Т-клеток памяти, клеток естественных киллеров (NK) или Т-клеток естественных киллеров (NKT). В некоторых случаях мутация происходит в природную аминокислоту. В других случаях мутация происходит в неприродную аминокислоту. В некоторых случаях в настоящем документе также описан способ экспансии популяции CD4+ хелперных клеток, CD8+ эффекторных наивных Т-клеток и Т-клеток памяти, клеток естественных киллеров (NK) или Т-клеток естественных киллеров (NKT), предусматривающий контакт указанной клеточной популяции с терапевтически эффективным количеством активатора CD4+ хелперных клеток, CD8+ эффекторных наивных Т-клеток и Т-клеток памяти, клеток естественных киллеров (NK) или Т-клеток естественных киллеров (NKT), причем указанный активатор содержит модифицированный полипептид интерлейкин 2 (IL-2), содержащий по меньшей мере одну неприродную аминокислоту, таким образом, вызывая экспансию популяции CD4+ хелперных клеток, CD8+ эффекторных наивных Т-клеток и Т-клеток памяти, клеток естественных киллеров (NK) или Т-клеток естественных киллеров (NKT).

Копъюгаты IL-15

[73] Согласно некоторым вариантам осуществления в настоящем документе описаны конъюгаты IL-15, модифицированные в положении аминокислоты. IL-15 регулирует активацию и пролиферацию Т-клеток и NK клеток. В некоторых случаях конъюгат IL-15 содержит выделенный и очищенный полипептид IL-15 и конъюгирующий фрагмент. В некоторых случаях конъюгат IL-15 характеризуется сниженной аффинностью к рецептору IL-15 по сравнению с полипептидом IL-15 дикого типа. В некоторых случаях конъюгирующий фрагмент связан с аминокислотным остатком, который взаимодействует с рецептором IL-15 (например, в области контакта IL-15/IL-15Rα) или с субъединицами IL-2Rβγ. В некоторых случаях конъюгирующий фрагмент связан с аминокислотным остатком, который проксимален к области контакта IL-15/IL-15Ra (например, около 5 Å, около 10 Å, около 15 Å или около 20 Å от области контакта IL-15/IL-15Rα) или проксимален к субъединицам IL-2Rβγ. Как используется в настоящем документе, остатки, вовлеченные в область контакта IL-15/IL-15R, включают в себя остатки IL-15, которые образуют гидрофобные взаимодействия, водородные связи или ионные взаимодействия с остатками из IL-15R. Сходным образом, остатки, вовлеченные в область контакта IL-15/IL-2Rβγ, включают в себя остатки IL-15, которые образуют гидрофобные взаимодействия, водородные связи или ионные взаимодействия с остатками из субъединиц IL-2Rβγ. В некоторых случаях конъюгирующий фрагмент связан с N-концом или С-концом полипептида IL-15 (например, с аминокислотным остатком N-конца или С-конца или с реакционноспособной группой, связанной с концевым аминокислотным остатком) либо прямо, либо опосредованно через линкерный пептид. В дополнительных случаях конъюгирующий фрагмент модулирует взаимодействие между IL-15 и IL-15R. В некоторых случаях конъюгат IL-15 активирует различные популяции инфильтрующих опухоли лимфоцитов посредством передачи сигналов IL-15/IL-15R. В некоторых случаях конъюгат IL-15 обеспечивает снижение пролиферации и/или экспансии опухолеассоциированных лимфоцитов. В некоторых случаях конъюгат IL-15 модулирует иммунную активность.

Дополнительные конъюгаты цитокинов

[74] Согласно некоторым вариантам осуществления в настоящем документе описан один или несколько дополнительных конъюгатов цитокинов, модифицированных в положении аминокислоты. Иллюстративные цитокины включают в себя, без ограничения, IL-1β, IL-7, IL-10, IL-12, IL-18, IL-21, INF (например, IFN-α, IFN-β, IFN-κ, IFN-δ, IFN-ε, IFN-τ, IFN-ω или IFN-ζ и TNF (например, TNFα или CD40L). В некоторых случаях конъюгат цитокина содержит выделенный и очищенный полипептид цитокина и конъюгирующий фрагмент. В некоторых случаях конъюгат цитокина характеризуется сниженной аффинностью к своему соответствующему рецептору по сравнению с цитокином дикого типа. В некоторых случаях конъюгирующий фрагмент связан с аминокислотным остатком, который проксимален к области контакта рецепторов (например, около 5 Å, около 10 Å, около 15 Å или около 20 Å от области контакта рецептора). В некоторых случаях конъюгирующий фрагмент связан с N-концом или С-концом цитокина прямо или опосредованно через линкерный пептид. В дополнительных случаях конъюгирующий фрагмент модулирует взаимодействие между цитокином и его соответствующим рецептором. В некоторых случаях конъюгат цитокина активирует различные популяции инфильтрующих опухоли лимфоцитов. В некоторых случаях конъюгат цитокина обеспечивает снижение пролиферации и/или экспансии опухолеассоциированных лимфоцитов. В некоторых случаях конъюгат цитокина модулирует иммунную активность.

Предшественники конъюгатов цитокинов

[75] В настоящем документе описаны предшественники конъюгатов цитокинов, содержащие мутантный цитокин (такой как IL-2), в котором одна или несколько аминокислот были мутированы из аминокислоты дикого типа. Такие предшественники часто используются в описанных в настоящем документе способах для лечения заболеваний или состояний. Согласно некоторым вариантам осуществления предшественник цитокина не конъюгирован. Такие мутации по-разному включают в себя добавления, делеции или замены. Согласно некоторым вариантам осуществления мутация включает в себя замену другой природной аминокислоты. В некоторых случаях мутантный цитокин содержит мутацию в положении аминокислоты Y31, K32, N33, Р34, K35, Т37, R38, Т41, F42, K43, F44, Y45, Р47, K48, Q57, Е60, Е61, Е62, L63, K64, Р65, Е68, V69, N71, L72, Q74, S75, K76, N77, М104, С105, Е106, Y107, А108, D109, E110, T111 или A112, причем нумерация аминокислотных остатков соответствует SEQ ID NO: 1. В некоторых случаях положение аминокислоты выбрано из Y31, K32, N33, Р34, K35, Т37, R38, Т41, F42, K43, F44, Y45, Р47, K48, Е61, Е62, Е68, K64, Р65, V69, L72, Q74, S75, K76, N77, М104, С105, Е106, Y107, А108, D109, Е110, T111 и А112. В некоторых случаях положение аминокислоты выбрано из N33, Р34, K35, Т37, R38, М39, Т41, F42, K43, F44, Y45, Q57, Е60, Е61, Е62, L63, K64, Р65, Е68, V69, N71, L72, М104, С105, Е106, Y107, А108, D109, Е110, T111 и А112. В некоторых случаях положение аминокислоты выбрано из K35, Т37, R38, Т41, F42, K43, F44, Y45, Е61, Е62, Е68, K64, Р65, V69, L72 и Y107. В некоторых случаях положение аминокислоты выбрано из Т37, R38, Т41, F42, F44, Y45, Е61, Е62, Е68, K64, Р65, V69, L72 и Y107. В некоторых случаях положение аминокислоты выбрано из Т37, R38, Т41, F42, F44, Y45, Е61, Е62, Е68, Р65, V69, L72 и Y107. В некоторых случаях положение аминокислоты выбрано из Т37, Т41, F42, F44, Y45, Р65, V69, L72 и Y107. В некоторых случаях положение аминокислоты выбрано из R38 и K64. В некоторых случаях положение аминокислоты выбрано из Е61, Е62 и Е68. В некоторых случаях положение аминокислоты находится в K35. В некоторых случаях положение аминокислоты находится в Т37. В некоторых случаях положение аминокислоты находится в R38. В некоторых случаях положение аминокислоты находится в Т41. В некоторых случаях положение аминокислоты находится в F42. В некоторых случаях положение аминокислоты находится в K43. В некоторых случаях положение аминокислоты находится в F44. В некоторых случаях положение аминокислоты находится в Y45. В некоторых случаях положение аминокислоты находится в Е61. В некоторых случаях положение аминокислоты находится в Е62. В некоторых случаях положение аминокислоты находится в K64. В некоторых случаях положение аминокислоты находится в Е68. В некоторых случаях положение аминокислоты находится в Р65. В некоторых случаях положение аминокислоты находится в V69. В некоторых случаях положение аминокислоты находится в L72. В некоторых случаях положение аминокислоты находится в Y107. В некоторых случаях положение аминокислоты находится в L72. В некоторых случаях положение аминокислоты находится в D109. Согласно некоторым вариантам осуществления мутант цитокина содержит конъюгирующий фрагмент, причем конъюгирующий фрагмент присоединен к мутированному сайту в мутантном цитокине.

[76] Описанные в настоящем документе мутанты цитокинов часто содержат одну или несколько мутаций в природные аминокислоты. Согласно некоторым вариантам осуществления мутант цитокина содержит SEQ ID NO: 1 и по меньшей мере одну мутацию. Согласно некоторым вариантам осуществления мутант цитокина содержит SEQ ID NO: 1 и мутацию Е62К. Согласно некоторым вариантам осуществления мутант цитокина содержит SEQ ID NO: 1 и мутацию Е62С. Согласно некоторым вариантам осуществления мутант цитокина содержит SEQ ID NO: 1 и мутацию Е62А. Согласно некоторым вариантам осуществления мутант цитокина содержит SEQ ID NO: 1 и мутацию E62I. Согласно некоторым вариантам осуществления мутант цитокина содержит SEQ ID NO: 1 и мутацию E62L. Согласно некоторым вариантам осуществления мутант цитокина содержит SEQ ID NO: 1 и мутацию E62Y. Согласно некоторым вариантам осуществления мутант цитокина содержит SEQ ID NO: 1 и мутацию E62W. Согласно некоторым вариантам осуществления мутант цитокина содержит SEQ ID NO: 1 и мутацию E62N. Согласно некоторым вариантам осуществления мутант цитокина содержит SEQ ID NO: 1 и мутацию E62R. Согласно некоторым вариантам осуществления мутант цитокина содержит SEQ ID NO: 1 и мутацию E62D. Согласно некоторым вариантам осуществления мутант цитокина содержит SEQ ID NO: 1 и мутацию E62Q. Согласно некоторым вариантам осуществления мутант цитокина содержит SEQ ID NO: 1 и мутацию E62G. Согласно некоторым вариантам осуществления мутант цитокина содержит SEQ ID NO: 1 и мутацию Е62Н. Согласно некоторым вариантам осуществления мутант цитокина содержит SEQ ID NO: 1 и мутацию Е62М. Согласно некоторым вариантам осуществления мутант цитокина содержит SEQ ID NO: 1 и мутацию E62F. Согласно некоторым вариантам осуществления мутант цитокина содержит SEQ ID NO: 1 и мутацию Е62Р. Согласно некоторым вариантам осуществления мутант цитокина содержит SEQ ID NO: 1 и мутацию E62S. Согласно некоторым вариантам осуществления мутант цитокина содержит SEQ ID NO: 1 и мутацию Е62Т. Согласно некоторым вариантам осуществления мутант цитокина содержит SEQ ID NO: 1 и мутацию E62V.

[77] Согласно некоторым вариантам осуществления мутант цитокина содержит SEQ ID NO: 1и по меньшей мере одну мутацию. Согласно некоторым вариантам осуществления мутант цитокина содержит SEQ ID NO: 1 и мутацию P65K. Согласно некоторым вариантам осуществления мутант цитокина содержит SEQ ID NO: 1 и мутацию Р65С. Согласно некоторым вариантам осуществления мутант цитокина содержит SEQ ID NO: 1 и мутацию Р65А. Согласно некоторым вариантам осуществления мутант цитокина содержит SEQ ID NO: 1 и мутацию P65I. Согласно некоторым вариантам осуществления мутант цитокина содержит SEQ ID NO: 1 и мутацию P65L. Согласно некоторым вариантам осуществления мутант цитокина содержит SEQ ID NO: 1 и мутацию P65Y. Согласно некоторым вариантам осуществления мутант цитокина содержит SEQ ID NO: 1 и мутацию P65W. Согласно некоторым вариантам осуществления мутант цитокина содержит SEQ ID NO: 1 и мутацию P65N. Согласно некоторым вариантам осуществления мутант цитокина содержит SEQ ID NO: 1 и мутацию P65R. Согласно некоторым вариантам осуществления мутант цитокина содержит SEQ ID NO: 1 и мутацию P65D. Согласно некоторым вариантам осуществления мутант цитокина содержит SEQ ID NO: 1 и мутацию P65Q. Согласно некоторым вариантам осуществления мутант цитокина содержит SEQ ID NO: 1 и мутацию P65G. Согласно некоторым вариантам осуществления мутант цитокина содержит SEQ ID NO: 1 и мутацию Р65Н. Согласно некоторым вариантам осуществления мутант цитокина содержит SEQ ID NO: 1 и мутацию Р65М. Согласно некоторым вариантам осуществления мутант цитокина содержит SEQ ID NO: 1 и мутацию P65F. Согласно некоторым вариантам осуществления мутант цитокина содержит SEQ ID NO: 1 и мутацию Р65Е. Согласно некоторым вариантам осуществления мутант цитокина содержит SEQ ID NO: 1 и мутацию P65S. Согласно некоторым вариантам осуществления мутант цитокина содержит SEQ ID NO: 1 и мутацию Р65Т. Согласно некоторым вариантам осуществления мутант цитокина содержит SEQ ID NO: 1 и мутацию P65V.

Слияния белков или пептидов

[78] Согласно некоторым вариантам осуществления описанный в настоящем документе конъюгат цитокина содержит цитокин (например, IL-2 или другой цитокин), который слит с пептидом или белком (слияние). Согласно некоторым вариантам осуществления пептид или белок представляет собой антитело или фрагмент антитела. Согласно некоторым вариантам осуществления описанный в настоящем документе конъюгат цитокина содержит цитокин (например, IL-2 или другой цитокин), который слит с антителом или его связывающими фрагментами. Согласно некоторым вариантам осуществления описанный в настоящем документе цитокин слит с несколькими белками или пептидами. Согласно некоторым вариантам осуществления конъюгат цитокина включает в себя слияние цитокина с белком или пептидом и по меньшей мере один конъюгирующий фрагмент. В некоторых случаях антитело или его связывающие фрагменты включают в себя гуманизированное антитело или его связывающий фрагмент, мышиное антитело или его связывающий фрагмент, химерное антитело или его связывающий фрагмент, моноклональное антитело или его связывающий фрагмент, одновалентный Fab', двухвалентный Fab₂, фрагменты F(ab)'₃, одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv), bis-scFv, (scFv)₂, диатело, миниантитело, нанотело, триатело, тетратело, humabody, дисульфид-стабилизированный белок Fv (dsFv), однодоменное антитело (sdAb), Ig NAR, антитело верблюда или его связывающий фрагмент, биспецифическое антитело или его связывающий фрагмент или его химически модифицированное производное. Такие слитые белки в некоторых случаях производятся непосредственно посредством трансляции. Согласно некоторым вариантам осуществления слияния получают с использованием химического или другого ферментативного способа лигирования. Согласно некоторым вариантам осуществления конъюгат цитокина содержит слитый пептид или белок, присоединенный линкером. Согласно некоторым вариантам осуществления линкер представляет собой пептид. Согласно некоторым вариантам осуществления конъюгат цитокина содержит N-концевой пептид или белок слияния. Согласно некоторым вариантам осуществления конъюгат цитокина содержит слитый С-концевой пептид или белок. В некоторых случаях цитокин, слитый с пептидом или белком, дополнительно конъюгируют с одним или несколькими описанными ниже конъюгирующими фрагментами.

[79] В некоторых случаях конъюгат цитокина включает в себя слияние со слиянием scFv, bis-scFv, (scFv)₂, dsFv или sdAb. В некоторых случаях слияние включает в себя scFv. В некоторых случаях цитокиновый конъюгат включает в себя слияние с bis-scFv. В некоторых случаях конъюгат цитокина включает в себя слияние с (scFv)₂. В некоторых случаях конъюгат цитокина включает в себя слияние с dsFv. В некоторых случаях конъюгат цитокина включает в себя слияние с sdAb. В некоторых случаях цитокин, слитый с scFv, bis-scFv, (scFv)₂, dsFv или sdAb, дополнительно конъюгируют с одним или несколькими описанными ниже конъюгирующими фрагментами.

[80] В некоторых случаях конъюгат цитокина включает в себя слияние с Fc-частью антитела, например, IgG, IgA, IgM, IgE или IgD. В некоторых случаях конъюгат цитокина включает в себя слияние с Fc-частью IgG (например, IgG1, IgG3 или IgG4). В некоторых случаях цитокин, слитый с Fc-частью, дополнительно конъюгируют с одним или несколькими описанными ниже конъюгирующими фрагментами.

[81] В некоторых случаях полипептид цитокина (например, интерлейкина, IFN или TNF) сливают с антителом или его связывающими фрагментами. В некоторых случаях полипептид цитокина сливают с гуманизированным антителом или его связывающим фрагментом, мышиным антителом или его связывающим фрагментом, химерным антителом или его связывающим фрагментом, моноклональным антителом или его связывающим фрагментом, фрагментами моновалентным Fab', двухвалентным Fab₂, F(ab)'₃, одноцепочечным вариабельным фрагментом (scFv), bis-scFv, (scFv)₂, диателом, миниантителом, нанотелом, триателом, тетрателом, humabody, стабилизированным дисульфидом белком Fv (dsFv), однодоменным антителом (sdAb), Ig NAR, антителом верблюда или его связывающим фрагментом, биспецифическим антителом или его связывающим фрагментом или его химически модифицированным производным. В дополнительных случаях полипептид цитокина сливают с Fc-частью антитела. В дополнительных случаях полипептид цитокина сливают с Fc-частью IgG (например, IgG1, IgG3 или IgG4). В некоторых случаях цитокин, слитый с антителом или его связывающими фрагментами, дополнительно конъюгируют с одним или несколькими описанными ниже конъюгирующими фрагментами.

[82] В некоторых случаях полипептид IL-2 сливают с антителом или его связывающими фрагментами. В некоторых случаях полипептид IL-2 сливают с гуманизированным антителом или его связывающим фрагментом, мышиным антителом или его связывающим фрагментом, химерным антителом или его связывающим фрагментом, моноклональным антителом или его связывающим фрагментом, фрагментами моновалентным Fab', двухвалентным Fab₂, F(ab)'₃, одноцепочечным вариабельным фрагментом (scFv), bis-scFv, (scFv)₂, диателом, миниантителом, нанотелом, триателом, тетрателом, humabody, стабилизированным дисульфидом белком Fv (dsFv), однодоменным антителом (sdAb), Ig NAR, антителом верблюда или его связывающим фрагментом, биспецифическим антителом или его связывающим фрагментом или его химически модифицированным производным. В дополнительных случаях полипептид IL-2 сливают с Fc-частью антитела. В дополнительных случаях полипептид IL-2 сливают с Fc-частью IgG (например, IgG1, IgG3 или IgG4). В некоторых случаях полипептид IL-2, слитый с антителом или его связывающими фрагментами, дополнительно конъюгируют с одним или несколькими описанными ниже конъюгирующими фрагментами.

Природные и неприродные аминокислоты

[83] Согласно некоторым вариантам осуществления описанный в настоящем документе аминокислотный остаток (например, в цитокине, таком как IL-2) мутирует в лизин, цистеин, гистидин, аргинин, аспарагиновую кислоту, глутаминовую кислоту, серии, треонин или тирозин для связывания (или взаимодействия) с конъюгирующим фрагментом. Например, боковая цепь лизина, цистеина, гистидина, аргинина, аспарагиновой кислоты, глутаминовой кислоты, серина, треонина или тирозина может связываться с описанным в настоящем документе конъюгирующим фрагментом. В некоторых случаях аминокислотный остаток мутирует в цистеин, лизин или гистидин. В некоторых случаях аминокислотный остаток мутирует в цистеин. В некоторых случаях аминокислотный остаток мутирует в лизин. В некоторых случаях аминокислотный остаток мутирует в гистидин. В некоторых случаях аминокислотный остаток мутирует в тирозин. В некоторых случаях аминокислотный остаток мутирует в триптофан. Согласно некоторым вариантам осуществления неприродная аминокислота не конъюгирует с конъюгирующим фрагментом. Согласно некоторым вариантам осуществления описанный в настоящем документе цитокин содержит неприродную аминокислоту, причем цитокин конъюгирован с белком, причем точка присоединения не представляет собой неприродную аминокислоту.

[84] Согласно некоторым вариантам осуществления описанный в настоящем документе аминокислотный остаток (например, в цитокине, таком как IL-2) перед связыванием с конъюгирующим фрагментом мутирует в неприродную аминокислоту. В некоторых случаях мутация в неприродную аминокислоту предотвращает или сводит к минимуму ответ на аутоантиген иммунной системы. Используемый в настоящем документе термин «неприродная аминокислота» относится к аминокислоте, отличной от 20 аминокислот, которые естественным образом присутствуют в белке. Неограничивающие примеры неприродных аминокислот включают в себя: п-ацетил-L-фенилаланин, п-йод-L-фенилаланин, п-метоксифенилаланин, О-метил-L-тирозин, п-пропаргилоксифенилаланин, п-пропаргилфенилаланин, L-3-(2-нафтил)аланин, 3-метилфенилаланин, O-4-аллил-L-тирозин, 4-пропил-L-тирозин, три-О-ацетил-GlcNAcp-серин, L-ДОФА, фторированный фенилаланин, изопропил-L-фенилаланин, п-азидо-L-фенилаланин, п-ацил-L-фенилаланин, п-бензоил-L-фенилаланин, п-борофофенилаланин, О-пропаргилтирозин, L-фосфосерин, фосфоносерин, фосфонотирозин, п-бромфенилаланин, селеноцистеин, п-амино-L-фенилаланин, изопропил-L-фенилаланин, азидо-лизин (AzK), неприродный аналог аминокислоты тирозин; неприродный аналог аминокислоты глутамин; неприродный аналог аминокислоты фенилаланин; неприродный аналог аминокислоты серии; неприродный аналог аминокислоты треонин; алкил, арил, ацил, азидо, циано, галоген, гидразин, гидразид, гидроксил, алкенил, алкинил, эфир, тиол, сульфонил, селено, сложный эфир, тиокислота, борат, боронат, фосфо, фосфоно, фосфин, гетероцикл, енон, имин, альдегид, гидроксиламин, кето или амино-замещенная аминокислота или их комбинация; аминокислота с фотоактивируемым сшивателем; спин-меченная аминокислота; флуоресцентная аминокислота; металлсвязывающая аминокислота; металлсодержащая аминокислота; радиоактивная аминокислота; фотоэлемент и/или фотоизомеризуемая аминокислота; биотин или аналог биотина, содержащий аминокислоту; кетосодержащая аминокислота; аминокислота, содержащая полиэтиленгликоль или простой полиэфир; аминокислота, замещенная тяжелым атомом; химически расщепляемая или фоторасщепляемая аминокислота; аминокислота с удлиненной боковой цепью; аминокислота, содержащая токсическую группу; замещенная сахаром аминокислота; связанная с углеродом сахаросодержащая аминокислота; окислительно-восстановительная аминокислота; а-гидроксисодержащая кислота; аминотиокислота; α,α-дизамещенная аминокислота; β-аминокислота; циклическая аминокислота, отличная от пролина или гистидина, и ароматическая аминокислота, отличная от фенилаланина, тирозина или триптофана.

[85] Согласно некоторым вариантам осуществления неприродная аминокислота содержит селективную реакционноспособную группу или реакционноспособную группу для сайт-селективного мечения целевого полипептида. В некоторых случаях химия представляет собой биортогональную реакцию (например, биосовместимые и селективные реакции). В некоторых случаях химия представляет собой катализируемую Cu(I) или «не содержащую меди» реакцию образования алкиназида триазола, лигирование по Штаудингеру, реакцию Дильса-Альдера с обратными электронными требованиями (IEDDA), «фото-клик» химия или процесс, опосредованный металлом, такой как метатезис олефинов и перекрестное сочетание Сузуки-Мияура или Соногашира.

[86] Согласно некоторым вариантам осуществления неприродная аминокислота содержит фотореактивную группу, которая сшивается при облучении, например, УФ-излучением.

[87] Согласно некоторым вариантам осуществления неприродная аминокислота содержит фотосшитую аминокислоту.

[88] В некоторых случаях неприродная аминокислота представляет собой паразамещенное, метазамещенное или ортозамещенное производное аминокислоты.

[89] В некоторых случаях неприродная аминокислота включает в себя п-ацетил-L-фенилаланин, п-азидометил-L-фенилаланин (pAMF), п-йод-L-фенилаланин, о-метил-L-тирозин, п-метоксифенилаланин, п-пропаргилоксифенилаланин, п-пропаргилфенилаланин, L-3-(2-нафтил)аланин, 3-метилфенилаланин, О-4-аллил-L-тирозин, 4-пропил-L-тирозин, три-О-ацетил-GlcNAcp-серин, L-ДОФА, фторированный фенилаланин, изопропил-L-фенилаланин, п-азидо-L-фенилаланин, п-ацил-L-фенилаланин, п-бензоил-L-фенилаланин, L-фосфосерин, фосфоносерин, фосфонотирозин, п-бромфенилаланин, п-амино-L-фенилаланин или изопропил-L-фенилаланин.

[90] В некоторых случаях неприродная аминокислота представляет собой 3-аминотирозин, 3-нитротирозин, 3,4-дигидроксифенилаланин или 3-йодтирозин.

[91] В некоторых случаях неприродная аминокислота представляет собой фенилселеноцистеин.

[92] В некоторых случаях неприродная аминокислота представляет собой производное фенилаланина, содержащее бензофенон, кетон, йодид, метокси, ацетил, бензоил или азид.

[93] В некоторых случаях неприродная аминокислота представляет собой производное лизина, содержащее бензофенон, кетон, йодид, метокси, ацетил, бензоил или азид.

[94] В некоторых случаях неприродная аминокислота содержит ароматическую боковую цепь.

[95] В некоторых случаях неприродная аминокислота не содержит ароматической боковой цепи.

[96] В некоторых случаях неприродная аминокислота содержит азидогруппу.

[97] В некоторых случаях неприродная аминокислота содержит акцепторную группу Михаэля. В некоторых случаях акцепторные группы Михаэля содержат ненасыщенный фрагмент, способный образовывать ковалентную связь посредством реакции 1,2-присоединения. В некоторых случаях акцепторные группы Михаэля включают в себя электронодефицитные алкены или алкины. В некоторых случаях акцепторные группы Михаэля включают в себя, без ограничения, альфа, бета ненасыщенные: кетоны, альдегиды, сульфоксиды, сульфоны, нитрилы, имины или ароматические соединения.

[98] В некоторых случаях неприродная аминокислота представляет собой дегидроаланин.

[99] В некоторых случаях неприродная аминокислота содержит альдегидную или кетоновую группу.

[100] В некоторых случаях неприродная аминокислота представляет собой производное лизина, содержащее альдегидную или кетоновую группу.

[101] В некоторых случаях неприродная аминокислота представляет собой производное лизина, содержащее один или несколько атомов О, N, Se или S в положении бета, гамма или дельта. В некоторых случаях неприродная аминокислота представляет собой производное лизина, содержащее атомы О, N, Se или S в положении гамма.

[102] В некоторых случаях неприродная аминокислота представляет собой производное лизина, в котором эпсилон N-атом заменен атомом кислорода.

[103] В некоторых случаях неприродная аминокислота представляет собой производное лизина, которое не является природным посттрансляционно модифицированным лизином.

[104] В некоторых случаях неприродная аминокислота представляет собой аминокислоту, содержащую боковую цепь, в которой шестой атом от положения альфа содержит карбонильную группу. В некоторых случаях неприродная аминокислота представляет собой аминокислоту, содержащую боковую цепь, в которой шестой атом от положения альфа содержит карбонильную группу, а пятый атом от положения альфа представляет собой азот. В некоторых случаях неприродная аминокислота представляет собой аминокислоту, содержащую боковую цепь, в которой седьмой атом от положения альфа представляет собой атом кислорода.

[105] В некоторых случаях неприродная аминокислота представляет собой производное серина, содержащее селен. В некоторых случаях неприродная аминокислота представляет собой селеносерин (2-амино-3-гидроселенпропановую кислоту). В некоторых случаях неприродная аминокислота представляет собой 2-амино-3-((2-((3-(бензилокси)-3-оксопропил)амино)этил)селанил)пропановую кислоту. В некоторых случаях неприродная аминокислота представляет собой 2-амино-3-(фенилселанил)пропановую кислоту. В некоторых случаях неприродная аминокислота включает в себя селен, причем окисление селена приводит к образованию неприродной аминокислоты, содержащей алкен.

[106] В некоторых случаях неприродная аминокислота содержит циклооктинильную группу.

[107] В некоторых случаях неприродная аминокислота содержит трансциклоктенильную группу.

[108] В некоторых случаях неприродная аминокислота содержит норборненильную группу.

[109] В некоторых случаях неприродная аминокислота содержит циклопропенильную группу.

[110] В некоторых случаях неприродная аминокислота содержит диазириновую группу.

[111] В некоторых случаях неприродная аминокислота содержит тетразиновую группу.

[112] В некоторых случаях неприродная аминокислота представляет собой производное лизина, в котором азот боковой цепи является карбамилированным. В некоторых случаях неприродная аминокислота представляет собой производное лизина, в котором азот боковой цепи ацилирован. В некоторых случаях неприродная аминокислота представляет собой 2-амино-6-{[(трет-бутокси)карбонил]амино}гексановую кислоту. В некоторых случаях неприродная аминокислота представляет собой 2-амино-6-{[(трет-бутокси)карбонил]амино}гексановую кислоту. В некоторых случаях неприродная аминокислота представляет собой N6-Вос-N6-метиллизин. В некоторых случаях неприродная аминокислота представляет собой N6-ацетиллизин. В некоторых случаях неприродная аминокислота представляет собой пирролизин. В некоторых случаях неприродная аминокислота представляет собой N6-трифторацетиллизин. В некоторых случаях неприродная аминокислота представляет собой 2-амино-6-{[(бензилокси)карбонил]амино}гексановую кислоту. В некоторых случаях неприродная аминокислота представляет собой 2-амино-6-{[(п-йодбензилокси)карбонил]амино}гексановую кислоту. В некоторых случаях неприродная аминокислота представляет собой 2-амино-6-{[(п-нитробензилокси)карбонил]амино}гексановую кислоту. В некоторых случаях неприродная аминокислота представляет собой N6-пролиллизин. В некоторых случаях неприродная аминокислота представляет собой 2-амино-6-{[(циклопентилокси)карбонил]амино}гексановую кислоту. В некоторых случаях неприродная аминокислота представляет собой Н6-(циклопентанкарбонил)лизин. В некоторых случаях неприродная аминокислота представляет собой N6-(тетрагидрофуран-2-карбонил)лизин. В некоторых случаях неприродная аминокислота представляет собой N6-(3-этинилтетрагидрофуран-2-карбонил)лизин. В некоторых случаях неприродная аминокислота представляет собой N6-((проп-2-ин-1-илокси)карбонил)лизин. В некоторых случаях неприродная аминокислота представляет собой 2-амино-6-{[(2-азидоциклопентилокси)карбонил]амино}гексановую кислоту. В некоторых случаях неприродная аминокислота представляет собой N6-((2-азидоэтокси)карбонил)лизин. В некоторых случаях неприродная аминокислота представляет собой 2-амино-6-{[(2-нитробензилокси)карбонил]амино}гексановую кислоту. В некоторых случаях неприродная аминокислота представляет собой 2-амино-6-{[(2-циклооктинилокси)карбонил]амино}гексановую кислоту. В некоторых случаях неприродная аминокислота представляет собой N6-(2-аминобут-3-иноил)лизин. В некоторых случаях неприродная аминокислота представляет собой 2-амино-6-((2-аминобут-3-иноил)окси)гексановую кислоту. В некоторых случаях неприродная аминокислота представляет собой N6-(аллилоксикарбонил)лизин. В некоторых случаях неприродная аминокислота представляет собой N6-(бутенил-4-оксикарбонил)лизин. В некоторых случаях неприродная аминокислота представляет собой К6-(пентенил-5-оксикарбонил)лизин. В некоторых случаях неприродная аминокислота представляет собой N6-((бут-3-ин-1-илокси)карбонил)лизин. В некоторых случаях неприродная аминокислота представляет собой N6-((пент-4-ин-1-илокси)карбонил)лизин. В некоторых случаях неприродная аминокислота представляет собой N6-(тиазолидин-4-карбонил)лизин. В некоторых случаях неприродная аминокислота представляет собой 2-амино-8-оксононановую кислоту. В некоторых случаях неприродная аминокислота представляет собой 2-амино-8-оксооктановую кислоту. В некоторых случаях неприродная аминокислота представляет собой N6-(2-оксоацетил)лизин.

[113] В некоторых случаях неприродная аминокислота представляет собой N6-пропиониллизин. В некоторых случаях неприродная аминокислота представляет собой N6-бутириллизин. В некоторых случаях неприродная аминокислота представляет собой N6-(бут-2-еноил)лизин. В некоторых случаях неприродная аминокислота представляет собой N6-((бицикло[2.2.1]гепт-5-ен-2-илокси)карбонил)лизин. В некоторых случаях неприродная аминокислота представляет собой N6-((спиро[2,3]гекс-1-ен-5-илметокси)карбонил)лизин. В некоторых случаях неприродная аминокислота представляет собой N6-(((4-(1-(трифторметил)циклопроп-2-ен-1-ил)бензил)окси)карбонил)лизин. В некоторых случаях неприродная аминокислота представляет собой N6-((бицикло[2.2.1]гепт-5-ен-2-илметокси)карбонил)лизин. В некоторых случаях неприродная аминокислота представляет собой цистеиниллизин. В некоторых случаях неприродная аминокислота представляет собой N6-((1-(6-нитробензо[d][1,3]диоксол-5-ил)этокси)карбонил)лизин. В некоторых случаях неприродная аминокислота представляет собой N6-((2-(3-метил-3Н-диазирин-3-ил)этокси)карбонил)лизин. В некоторых случаях неприродная аминокислота представляет собой N6-((3-(3-метил-3Н-диазирин-3-ил)пропокси)карбонил)лизин. В некоторых случаях неприродная аминокислота представляет собой N6-((метанитробенилокси)N6-метилкарбонил)лизин. В некоторых случаях неприродная аминокислота представляет собой N6-((бицикло[6.1.0]нон-4-ин-9-илметокси)карбонил)лизин. В некоторых случаях неприродная аминокислота представляет собой N6-((циклогепт-3-ен-1-илокси)карбонил)-L-лизин.

[114] В некоторых случаях неприродная аминокислота представляет собой 2-амино-3-(((((бензилокси)карбонил)амино)метил)селанил)пропановую кислоту.

[115] Согласно некоторым вариантам осуществления неприродная аминокислота включается в цитокин (например, полипептид IL) с помощью реорганизованного амбер, опал или охра стоп кодона.

[116] Согласно некоторым вариантам осуществления неприродная аминокислота включается в цитокин (например, полипептид IL) с помощью кодона из 4 оснований.

[117] Согласно некоторым вариантам осуществления неприродная аминокислота включается в цитокин (например, полипептид IL) с помощью реорганизованного редкого смыслового кодона.

[118] Согласно некоторым вариантам осуществления неприродная аминокислота включается в цитокин (например, полипептид IL) посредством синтетического кодона, содержащего неприродную нуклеиновую кислоту. В некоторых случаях неприродная аминокислота включается в цитокин посредством ортогональной пары модифицированная синтетаза/тРНК. Такие ортогональные пары содержат неприродную синтетазу, которая способна заряжать неприродную тРНК неприродной аминокислотой, в то же время сводя к минимуму зарядку а) других эндогенных аминокислот на неприродной тРНК и b) неприродных аминокислот на другие эндогенные тРНК. Такие ортогональные пары содержат тРНК, которые способны заряжаться неприродной синтетазой, избегая при этом зарядки а) другими эндогенными аминокислотами эндогенными синтетазами. Согласно некоторым вариантам осуществления такие пары идентифицированы из различных организмов, таких как бактериальные, дрожжевые, архейные или человеческие источники. Согласно некоторым вариантам осуществления ортогональная пара синтетаза/тРНК содержит компоненты из одного организма. Согласно некоторым вариантам осуществления ортогональная пара синтетаза/тРНК содержит компоненты двух разных организмов. Согласно некоторым вариантам осуществления ортогональная пара синтетаза/тРНК содержит компоненты, которые перед модификацией способствуют трансляции двух разных аминокислот. Согласно некоторым вариантам осуществления ортогональная синтетаза представляет собой модифицированную по аланину синтетазу. Согласно некоторым вариантам осуществления ортогональная синтетаза представляет собой модифицированную по аргинину синтетазу. Согласно некоторым вариантам осуществления ортогональная синтетаза представляет собой модифицированную по аспарагину синтетазу. Согласно некоторым вариантам осуществления ортогональная синтетаза представляет собой модифицированную по аспарагиновой кислоте синтетазу. Согласно некоторым вариантам осуществления ортогональная синтетаза представляет собой модифицированную по цистеину синтетазу. Согласно некоторым вариантам осуществления ортогональная синтетаза представляет собой модифицированную по глутамину синтетазу. Согласно некоторым вариантам осуществления ортогональная синтетаза представляет собой модифицированную по глутаминовой кислоте синтетазу. Согласно некоторым вариантам осуществления ортогональная синтетаза представляет собой модифицированную по аланину и глицину. Согласно некоторым вариантам осуществления ортогональная синтетаза представляет собой модифицированную по гистидину синтетазу. Согласно некоторым вариантам осуществления ортогональная синтетаза представляет собой модифицированную по лейцину синтетазу. Согласно некоторым вариантам осуществления ортогональная синтетаза представляет собой модифицированную по изолейцину синтетазу. Согласно некоторым вариантам осуществления ортогональная синтетаза представляет собой модифицированную по лизину синтетазу. Согласно некоторым вариантам осуществления ортогональная синтетаза представляет собой модифицированную по метионину синтетазу. Согласно некоторым вариантам осуществления ортогональная синтетаза представляет собой модифицированную по фенилаланину синтетазу. Согласно некоторым вариантам осуществления ортогональная синтетаза представляет собой модифицированную по пролину синтетазу. Согласно некоторым вариантам осуществления ортогональная синтетаза представляет собой модифицированную по серину синтетазу. Согласно некоторым вариантам осуществления ортогональная синтетаза представляет собой модифицированную по треонину синтетазу. Согласно некоторым вариантам осуществления ортогональная синтетаза представляет собой модифицированную по триптофану синтетазу. Согласно некоторым вариантам осуществления ортогональная синтетаза представляет собой модифицированную по тирозину синтетазу. Согласно некоторым вариантам осуществления ортогональная синтетаза представляет собой модифицированную по валину синтетазу. Согласно некоторым вариантам осуществления ортогональная синтетаза представляет собой модифицированную по фосфосерину синтетазу. Согласно некоторым вариантам осуществления ортогональная тРНК представляет собой модифицированную по аланину тРНК. Согласно некоторым вариантам осуществления ортогональная тРНК представляет собой модифицированную по аргинину тРНК. Согласно некоторым вариантам осуществления ортогональная тРНК представляет собой модифицированную по аспарагину тРНК. Согласно некоторым вариантам осуществления ортогональная тРНК представляет собой модифицированную по аспарагиновой кислоте тРНК. Согласно некоторым вариантам осуществления ортогональная тРНК представляет собой модифицированную по цистеину тРНК. Согласно некоторым вариантам осуществления ортогональная тРНК представляет собой модифицированную по глутамину тРНК. Согласно некоторым вариантам осуществления ортогональная тРНК представляет собой модифицированную по глутаминовой кислоте тРНК. Согласно некоторым вариантам осуществления ортогональная тРНК представляет собой модифицированную по аланину и глицину. Согласно некоторым вариантам осуществления ортогональная тРНК представляет собой модифицированную по гистидину тРНК. Согласно некоторым вариантам осуществления ортогональная тРНК представляет собой модифицированную по лейцину тРНК. Согласно некоторым вариантам осуществления ортогональная тРНК представляет собой модифицированную по изолейцину тРНК. Согласно некоторым вариантам осуществления ортогональная тРНК представляет собой модифицированную по лизину тРНК. Согласно некоторым вариантам осуществления ортогональная тРНК представляет собой модифицированную по метионину тРНК. Согласно некоторым вариантам осуществления ортогональная тРНК представляет собой модифицированную по фенилаланину тРНК. Согласно некоторым вариантам осуществления ортогональная тРНК представляет собой модифицированную по пролину тРНК. Согласно некоторым вариантам осуществления ортогональная тРНК представляет собой модифицированную по серину тРНК. Согласно некоторым вариантам осуществления ортогональная тРНК представляет собой модифицированную по треонину тРНК. Согласно некоторым вариантам осуществления ортогональная тРНК представляет собой модифицированную по триптофану тРНК. Согласно некоторым вариантам осуществления ортогональная тРНК представляет собой модифицированную по тирозину тРНК. Согласно некоторым вариантам осуществления ортогональная тРНК представляет собой модифицированную по валину тРНК. Согласно некоторым вариантам осуществления ортогональная тРНК представляет собой модифицированную по фосфосерину тРНК.

[119] Согласно некоторым вариантам осуществления неприродная аминокислота включена в цитокин (например, полипептид IL) с помощью пары аминоацил (aaRS или RS)-тРНК-синтетазы-тРНК. Иллюстративные пары aaRS-тРНК включают в себя, без ограничения, пары aaRS Methanococcus jannaschii (Mj-Tyr)/тРНК, пары TyrRS E.coli (Ес-Tyr)/tRNA_CUA В. stearothermophilus, пары LeuRS E.coli (Ec-Leu)/tRNA_CUA В. stearothermophilus и пары пирролизил-тРНК. В некоторых случаях неприродная аминокислота включается в цитокин (например, полипептид IL) с помощью пары Mj-TyrRS/тРНК. Иллюстративные UAA, которые могут быть включены парой Mj-TyrRS/тРНК, включают в себя, без ограничения, паразамещенные производные фенилаланина, такие как п-аминофенилаланин и п-метойфенилаланин; метазамещенные производные тирозина, такие как 3-аминотирозин, 3-нитротирозин, 3,4-дигидроксифенилаланин и 3-йодтирозин; фенилселенцитозин; п-борфенилаланин и о-нитробензилтирозин.

[120] В некоторых случаях неприродная аминокислота включается в цитокин (например, полипептид IL) с помощью пары Ec-Tyr/tRNA_CUA или Ec-Leu/tRNA_CUA. Иллюстративные UAA, которые могут быть включены с помощью пары Ec-Tyr/tRNA_CUA или пары Ec-Leu/tRNA_CUA, включают в себя, без ограничения, производные фенилаланина, содержащие бензофеновые, кетоновые, йодидные или азидные заместители; О-пропаргилтирозин; α-аминокаприловую кислоту, О-метилтирозин, О-нитробензилцистеин и 3-(нафталин-2-иламино)-2-аминопропановую кислоту.

[121] В некоторых случаях неприродная аминокислота включается в цитокин (например, полипептид IL) с помощью пары пирролизил-тРНК. В некоторых случаях PylRS получают из архебактериальных, например, из метаногенных архебактериальных. В некоторых случаях PylRS получают из Methanosarcina barkeri, Methanosarcina mazei или Methanosarcina acetivorans. Иллюстративные UAA, которые могут быть включены парой пирролизил-тРНК, включают в себя, без ограничения, замещенные амидом и карбаматом лизины, такие как 2-амино-6-((R)-тетрагидрофуран-2-карбоксамидо)гексановая кислота, N-ε-D-пролил-L-лизин и N-ε-циклопентилоксикарбонил-L-лизин; N-ε-акрилоил-L-лизин; N-ε-[(1-(6-нитробензо[d][1,3]диоксол-5-ил)этокси)карбонил]-L-лизин и N-ε-(1-метилциклопро-2-энкарбоксамидо)лизин.

[122] В некоторых случаях неприродная аминокислота включается в описанный в настоящем документе цитокин (например, полипептид IL) с помощью синтетазы, раскрытой в патентах США №9888819 и №9938516. Иллюстративные UAA, которые могут быть включены такими синтетазами, включают в себя пара-метилазидо-L-фенилаланин, аралкил, гетероциклил, гетероаралкил, неприродные аминокислоты и другие. Согласно некоторым вариантам осуществления такие UAA включают в себя пиридил, пиразинил, пиразолил, триазолил, оксазолил, тиазолил, тиофенил или другой гетероцикл. Такие аминокислоты согласно некоторым вариантам осуществления включают в себя азиды, тетразины или другие химические группы, способные к конъюгации с партнером по связыванию, таким как водорастворимый фрагмент. Согласно некоторым вариантам осуществления такие синтетазы экспрессируются и используются для включения UAA в цитокины in vivo. Согласно некоторым вариантам осуществления такие синтетазы используются для включения UAA в цитокины с использованием бесклеточной системы трансляции.

[123] В некоторых случаях неприродная аминокислота включается в цитокин, описанный в настоящем документе (например, полипептид IL), посредством встречающейся в природе синтетазы. Согласно некоторым вариантам осуществления неприродная аминокислота включается в цитокин организмом, который является ауксотрофным по отношению к одной или нескольким аминокислотам. Согласно некоторым вариантам осуществления синтетазы, соответствующие ауксотрофной аминокислоте, способны заряжать соответствующую тРНК неприродной аминокислотой. Согласно некоторым вариантам осуществления неприродная аминокислота представляет собой селеноцистеин или его производное. Согласно некоторым вариантам осуществления неприродная аминокислота представляет собой селенометионин или его производное. Согласно некоторым вариантам осуществления неприродная аминокислота представляет собой ароматическую аминокислоту, причем ароматическая аминокислота содержит арилгалогенид, такой как йодид. Согласно вариантам осуществления неприродная аминокислота структурно аналогична ауксотрофной аминокислоте.

[124] В некоторых случаях неприродная аминокислота включает в себя неприродную аминокислоту, показанную на фиг. 1.

[125] В некоторых случаях неприродная аминокислота включает в себя производное или аналог лизина или фенилаланина. В некоторых случаях неприродная аминокислота включает в себя производное лизина или аналог лизина. В некоторых случаях неприродная аминокислота включает в себя пирролизин (Pyl). В некоторых случаях неприродная аминокислота включает в себя производное фенилаланина или аналог фенилаланина. В некоторых случаях неприродная аминокислота представляет собой неприродную аминокислоту, описанную в Wan, et al., "Pyrrolysyl-tRNA synthetase: an ordinary enzyme but an outstanding genetic code expansion tool, "Biocheim Biophys Aceta 1844(6): 1059-4070 (2014). В некоторых случаях неприродная аминокислота содержит неприродную аминокислоту, показанную на фиг. 2 (например, фиг. 2А и фиг. 2В).

[126] Согласно некоторым вариантам осуществления неприродная аминокислота включает в себя неприродную аминокислоту, изображенную на фиг. 3А-фиг. 3D (взята из таблицы 1 Dumas et al., Chemical Science 2015, 6, 50-69).

[127] Согласно некоторым вариантам осуществления неприродная аминокислота, включенная в описанный в настоящем документе цитокин (например, полипептид IL), раскрыта в US 9840493; US 9682934; US 2017/0260137; US 9938516 или US 2018/0086734. Иллюстративные UAA, которые могут быть включены с помощью таких синтетаз, включают в себя пара-метилазидо-L-фенилаланин, аралкил, гетероциклил и гетероаралкил и производные лизина неприродных аминокислот. Согласно некоторым вариантам осуществления такие UAA включают в себя пиридил, пиразинил, пиразолил, триазолил, оксазолил, тиазолил, тиофенил или другой гетероцикл. Такие аминокислоты согласно некоторым вариантам осуществления включают в себя азиды, тетразины или другие химические группы, способные к конъюгации с партнером по связыванию, таким как водорастворимый фрагмент. Согласно некоторым вариантам осуществления UAA содержит азид, присоединенный к ароматическому фрагменту через алкильный линкер. Согласно некоторым вариантам осуществления алкильный линкер представляет собой линкер C₁-С₁₀. Согласно некоторым вариантам осуществления UAA содержит тетразин, присоединенный к ароматическому фрагменту через алкильный линкер. Согласно некоторым вариантам осуществления UAA содержит тетразин, присоединенный к ароматическому фрагменту через аминогруппу. Согласно некоторым вариантам осуществления UAA содержит тетразин, присоединенный к ароматическому фрагменту через алкиламиногруппу. Согласно некоторым вариантам осуществления UAA содержит азид, присоединенный к концевому азоту (например, N6 производного лизина или N5, N4 или N3 производного, содержащего более короткую алкильную боковую цепь) боковой цепи аминокислоты через алкильную цепь. Согласно некоторым вариантам осуществления UAA содержит тетразин, присоединенный к концевому азоту боковой цепи аминокислоты через алкильную цепь. Согласно некоторым вариантам осуществления UAA содержит азид или тетразин, присоединенный к амиду через алкильный линкер. Согласно некоторым вариантам осуществления UAA представляет собой азид или тетразинсодержащий карбамат или амид 3-аминоаланина, серина, лизина или их производного. Согласно некоторым вариантам осуществления такие UAA включаются в цитокины in vivo. Согласно некоторым вариантам осуществления такие UAA включаются в цитокины в бесклеточной системе.

Конъюгирующие фрагменты

[128] Согласно определенным вариантам осуществления в настоящем документе раскрыты конъюгирующие фрагменты, которые связаны с одним или несколькими описанными выше цитокинами (например, интерлейкинами, IFN или TNF). В некоторых случаях конъюгирующий фрагмент представляет собой молекулу, которая нарушает взаимодействие цитокина с его рецептором. В некоторых случаях конъюгирующий фрагмент представляет собой любую молекулу, которая, связываясь с цитокином, позволяет конъюгату цитокина модулировать иммунный ответ. В некоторых случаях конъюгирующий фрагмент связан с цитокином через ковалентную связь. В некоторых случаях описанный в настоящем документе цитокин присоединен к конъюгирующему фрагменту с триазольной группой. В некоторых случаях описанный в настоящем документе цитокин присоединен к конъюгирующему фрагменту с группой дигидропиридазина или пиридазина. В некоторых случаях конъюгирующий фрагмент содержит водорастворимый полимер. В других случаях конъюгирующий фрагмент содержит белок или его связывающий фрагмент. В дополнительных случаях конъюгирующий фрагмент содержит пептид. В дополнительных случаях конъюгирующий фрагмент содержит нуклеиновую кислоту. В дополнительных случаях конъюгирующий фрагмент содержит небольшую молекулу. В дополнительных случаях конъюгирующий фрагмент содержит биоконъюгат (например, агонист TLR, такой как агонист TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8 или TLR9, или синтетический лиганд, такой как Pam3Cys, CFA, CFA, CFA, Pam2Cys, FSL-1, Hib-OMPC, Poly I:C, poly A:U, AGP, MPL A, RC-529, MDF2β, CFA или флагеллин). В некоторых случаях конъюгирующий фрагмент увеличивает период полужизни в сыворотке и/или улучшает стабильность. В некоторых случаях конъюгирующий фрагмент снижает взаимодействие цитокинов с одним или несколькими рецепторными доменами или субъединицами цитокинов. В дополнительных случаях конъюгирующий фрагмент блокирует цитокиновое взаимодействие одного или нескольких цитокиновых доменов или субъединиц со своим родственным рецептором(ами). Согласно некоторым вариантам осуществления описанные в настоящем документе конъюгаты цитокинов содержат множество конъюгирующих фрагментов. Согласно некоторым вариантам осуществления конъюгирующий фрагмент присоединен к неприродной или природной аминокислоте в пептиде цитокина. Согласно некоторым вариантам осуществления конъюгат цитокина содержит конъюгирующий фрагмент, присоединенный к природной аминокислоте. Согласно некоторым вариантам осуществления конъюгат цитокина присоединен к неприродной аминокислоте в пептиде цитокина. Согласно некоторым вариантам осуществления конъюгирующий фрагмент присоединен к N- или С-концевой аминокислоте пептида цитокина. В настоящем документе раскрыты различные сайты комбинаций, например, первый конъюгирующий фрагмент присоединен к неприродной или природной аминокислоте в пептиде цитокина, а второй конъюгирующий фрагмент присоединен к N или С-концевой аминокислоте пептида цитокина. Согласно некоторым вариантам осуществления один конъюгирующий фрагмент присоединен к множеству остатков пептида цитокина (например, скобки). Согласно некоторым вариантам осуществления конъюгирующий фрагмент присоединен как к N-, так и к С-концевым аминокислотам пептида цитокина.

Водорастворимые полимеры

[129] Согласно некоторым вариантам осуществления описанный в настоящем документе конъюгирующий фрагмент представляет собой водорастворимый полимер. В некоторых случаях водорастворимый полимер является непептидным, нетоксичным и биосовместимым. Как используется в настоящем документе, вещество считается биосовместимым, если положительные эффекты, связанные с использованием вещества отдельно или с другим веществом (например, активным средством, таким как цитокиновый фрагмент) в связи с живыми тканями (например, введение пациенту), превышают любые вредные эффекты, оцениваемые клиницистом, например, врачом, токсикологом или специалистом по клинической разработке. В некоторых случаях водорастворимый полимер также является неиммуногенным. В некоторых случаях вещество считается неиммуногенным, если предполагаемое использование вещества in vivo не вызывает нежелательного иммунного ответа (например, образование антител) или, если возникает иммунный ответ, такой ответ не считается клинически значимым или важным по оценке клинициста, например, врача, токсиколога или специалиста по клиническим разработкам.

[130] В некоторых случаях водорастворимый полимер характеризуется наличием от около 2 до около 300 концов. Иллюстративные водорастворимые полимеры включают в себя, без ограничения, поли(алкиленгликоли), такие как полиэтиленгликоль («PEG»), поли(пропиленгликоль) («PPG»), сополимеры этиленгликоля и пропиленгликоля и т.п., поли(оксиэтилированный полиол), поли(олефиновый спирт), поли(винилпирролидон), поли(гидроксиалкилметакриламид), поли(гидроксиалкилметакрилат), полисахариды, поли(α-гидроксикислоту), поливиниловый спирт (PVA), полиакриламид (PAAm), поли(N-(2-гидроксипропил)метакриламид) (РНРМА), полидиметилакриламид (PDAAm), полифосфазен, полиоксазолины («POZ») (которые описаны в WO 2008/106186), поли(N-акрилоилморфолин) и комбинации любых из вышеперечисленных.

[131] В некоторых случаях водорастворимый полимер не ограничен конкретной структурой. В некоторых случаях водорастворимый полимер является линейным (например, с концевой группой, например, алкокси-PEG или бифункциональный PEG), разветвленным или многолучевым (например, разветвленный PEG или PEG, прикрепленный к полиольному ядру), характеризоваться дендритной (или звездной) архитектурой, каждая с одной или несколькими разлагаемыми связями или без них. Кроме того, внутренняя структура водорастворимого полимера может быть организована в любом количестве различных повторяющихся структур и может быть выбрана из группы, состоящей из гомополимера, переменного сополимера, статистического сополимера, блок-сополимера, переменного триполимера, случайного триполимера и блок-триполимера.

[132] Согласно некоторым вариантам осуществления средневесовая молекулярная масса водорастворимого полимера в конъюгате IL-2 составляет от около 100 дальтон до около 150000 дальтон. Иллюстративные диапазоны включают в себя, например, средневесовые молекулярные массы в диапазоне от более чем 5000 Дальтон до около 100000 дальтон, в диапазоне от около 6000 дальтон до около 90000 дальтон, в диапазоне от около 10000 дальтон до около 85000 дальтон, в диапазоне от более чем 10000 дальтон до около 85000 дальтон, в диапазоне от около 20000 дальтон до около 85000 дальтон, в диапазоне от около 53000 дальтон до около 85000 дальтон, в диапазоне от около 25000 дальтон до около 120000 дальтон, в диапазоне от около 29000 дальтон до около 120000 дальтон, в диапазоне от около 35000 дальтон до около 120000 дальтон и в диапазоне от около 40000 дальтон до около 120000 дальтон.

[133] Иллюстративные средневесовые молекулярные массы для водорастворимого полимера включают в себя около 100 дальтон, около 200 дальтон, около 300 дальтон, около 400 дальтон, около 500 дальтон, около 600 дальтон, около 700 дальтон, около 750 дальтон, около 800 дальтон, около 900 дальтон, около 1000 дальтон, около 1500 дальтон, около 2000 дальтон, около 2200 дальтон, около 2500 дальтон, около 3000 дальтон, около 4000 дальтон, около 4400 дальтон, около 4500 дальтон, около 5000 дальтон, около 5500 дальтон, около 6000 дальтон, около 7000 дальтон, около 7500 дальтон, около 8000 дальтон, около 9000 дальтон, около 10000 дальтон, около 11000 дальтон, около 12000 дальтон, около 13000 дальтон, около 14000 дальтон, около 15000 дальтон, около 20000 дальтон, около 22500 дальтон, около 25000 дальтон, около 30000 дальтон, около 35000 дальтон, около 40000 дальтон, около 45000 дальтон, около 50000 дальтон, около 55000 дальтон, около 60000 дальтон, около 65000 дальтон, около 70000 дальтон и около 75000 дальтон. Разветвленные версии водорастворимого полимера (например, разветвленный водорастворимый полимер с молекулярной массой 40000 дальтон, состоящий из двух полимеров с молекулярной массой 20000 дальтон), характеризующиеся общей молекулярной массой любого из вышеуказанных факторов, также могут быть использованы. Согласно одному или нескольким вариантам осуществления конъюгат не будет иметь никаких фрагментов PEG, связанных, прямо или опосредованно, с PEG, характеризующимся средневесовой молекулярной массой менее чем около 6000 дальтон.

[134] PEG, как правило, содержат ряд (ОСН₂СН₂) мономеров [или (СН₂СН₂О) мономеров, в зависимости от того, как определен PEG]. Как используется в настоящем документе, количество повторяющихся блоков идентифицируется нижним индексом «n» в «(OCH₂CH₂)n». Таким образом, значение (n), как правило, находится в одном или нескольких из следующих диапазонов: от 2 до около 3400, от около 100 до около 2300, от около 100 до около 2270, от около 136 до около 2050, от около 225 до около 1930, от около 450 до около 1930, от около 1200 до около 1930, от около 568 до около 2727, от около 660 до около 2730, от около 795 до около 2730, от около 795 до около 2730, от около 909 до около 2730 и от около 1200 до около 1900. Для любого данного полимера, у которого известна молекулярная масса, можно определить количество повторяющихся блоков (то есть «n») путем деления общей средневесовой молекулярной массы полимера на молекулярную массу повторяющегося мономера.

[135] В некоторых случаях водорастворимый полимер представляет собой полимер с концевой группой, т.е. полимер, содержащий по меньшей мере один конец, покрытый относительно инертной группой, такой как низшая С_1-6 алкоксигруппа или гидроксильная группа. Когда полимер представляет собой, например, PEG, можно использовать метокси-PEG (как правило, называемый mPEG), который представляет собой линейную форму PEG, где один конец полимера представляет собой группу метокси (-ОСН₃), а другой конец представляет собой гидроксильную или другую функциональную группу, которая может быть необязательно химически модифицирована.

[136] Согласно некоторым вариантам осуществления иллюстративные водорастворимые полимеры включают в себя, без ограничения, линейный или разветвленный дискретный PEG (dPEG) от Quanta Biodesign, Ltd.; линейные, разветвленные или раздвоенные PEG от Nektar Therapeutics и Y-образные производные PEG от JenKem Technology.

[137] Согласно некоторым вариантам осуществления описанный в настоящем документе полипептид цитокин (например, интерлейкин, IFN или TNF) конъюгирован с водорастворимым полимером, выбранным из поли(алкиленгликолей), таких как полиэтиленгликоль («PEG»), поли(пропиленгликоль) («PPG»), сополимеры этиленгликоля и пропиленгликоля и т.п., поли(оксиэтилированного полиола), поли(олефинового спирта), поли(винилпирролидона), поли(гидроксиалкилметакриламида), поли(гидроксиалкилметакрилата), поли(сахаридов), поли(α-гидроксикислоты), поли(винилового спирта) (PVA), полиакриламида (PAAm), полидиметилакриламида (PDAAm), поли(N-(2-гидроксипропил)метакриламида) (РНРМА), полифосфазена, полиоксазолинов («POZ»), поли(N-акрилоилморфолина) и их комбинации. В некоторых случаях полипептид цитокин конъюгирован с PEG (например, пегилирован). В некоторых случаях полипептид цитокин конъюгирован с PPG. В некоторых случаях полипептид цитокин конъюгирован с POZ. В некоторых случаях полипептид цитокин конъюгирован с PVP.

[138] Согласно некоторым вариантам осуществления описанный в настоящем документе полипептид IL-2 конъюгирован с водорастворимым полимером, выбранным из поли(алкиленгликолей), таких как полиэтиленгликоль («PEG»), поли(пропиленгликоль) («PPG»), сополимеры этиленгликоля и пропиленгликоля и т.п., поли(оксиэтилированного полиола), поли(олефинового спирта), поли(винилпирролидона), поли(гидроксиалкилметакриламида), поли(гидроксиалкилметакрилата), поли(сахаридов), поли(α-гидроксикислоты), поли(винилового спирта) (PVA), полиакриламида (PAAm), полидиметилакриламида (PDAAm), поли(N-(2-гидроксипропил)метакриламида) (РНРМА), полифосфазена, полиоксазолинов («POZ»), поли(N-акрилоилморфолина) и их комбинации. В некоторых случаях полипептид IL-2 конъюгирован с PEG (например, пегилирован). В некоторых случаях полипептид IL-2 конъюгирован с PPG. В некоторых случаях полипептид IL-2 конъюгирован с POZ. В некоторых случаях полипептид IL-2 конъюгирован с PVP.

[139] В некоторых случаях водорастворимый полимер содержит полиглицерин (PG). В некоторых случаях полиглицерин представляет собой гиперразветвленный PG (HPG) (например, как описано в Imran, et al. "Influence of architecture of high molecular weight linear and branched polyglycerols on their biocompatibility and biodistribution," Biomaterials 33:9135-9147 (2012)). В других случаях полиглицерин представляет собой линейный PG (LPG). В дополнительных случаях полиглицерин представляет собой среднефункциональный PG, линейно-блок-гиперразветвленный PG (например, как описано в Wurm et. Al., "Squaric acid mediated synthesis and biological activity of a library of linear and hyperbranched poly(glycerol)-protein conjugates," Biomacromolecules 13:1161-1171 (2012)) или функциональный PG с боковой цепью (например, как описано в Li, et. al., "Synthesis of linear polyether polyol derivatives as new materials for bioconjugation," Bioconjugate Chem. 20:780-789 (2009).

[140] В некоторых случаях описанный в настоящем документе полипептид цитокин (например, интерлейкин, IFN или TNF) конъюгирован с PG, например, HPG, LPG, среднефункциональный PG, линейно-блок-гиперразветвленным PG или функциональным PG с боковой цепью. В некоторых случаях цитокин представляет собой полипептид IL-2. В некоторых случаях полипептид IL-2 конъюгирован с PG, среднефункциональным PG, линейно-блок-гиперразветвленным PG.

[141] Согласно некоторым вариантам осуществления водорастворимый полимер представляет собой разлагаемую синтетическую альтернативу PEG. Иллюстративные разлагаемые синтетические альтернативы PEG включают в себя, без ограничения, поли[олиго(этиленгликоль)метилметакрилат] (POEGMA); модифицированные по основной цепи производные PEG, полученные полимеризацией телехелатных или ди-концевых функционализированных макромономеров на основе PEG; производные PEG, содержащие сомономеры, содержащие разлагаемую связь, такие как поли[(этиленокси)-со-(метиленэтиленоксид)] [Р(ЕО-co-МЕО)], циклические кетеновые ацетали, такие как 5,6-бензо-2-метилен-1,3-диоксепан (BMDO), 2-метилен-1,3-диоксепан (MDO) и 2-метилен-4-фенил-1,3-диоксолан (MPDL), сополимеризованный с OEGMA; или поли-(ε-капролактон)-трансплантат-поли(этиленоксид) (PCL-g-PEO).

[142] В некоторых случаях описанный в настоящем документе полипептид цитокин (например, интерлейкин, IFN или TNF) конъюгирован с деградируемой синтетической альтернативой PEG, такой как, например, POEGM; модифицированные по основной цепи производные PEG, полученные полимеризацией телехелатных или ди-концевых функционализированных макромономеров на основе PEG; Р(ЕО-со-МЕО); циклические кетеновые ацетали, такие как BMDO, MDO и MPDL, со полимер изо ванные с OEGMA или PCL-g-PEO. В некоторых случаях цитокин представляет собой полипептид IL-2. В некоторых случаях полипептид IL-2 конъюгирован с разлагаемой синтетической альтернативой PEG, такой как, например, POEGM; модифицированные по основной цепи производные PEG, полученные полимеризацией телехелатных или ди-концевых функционализированных макромономеров на основе PEG; Р(ЕО-со-МЕО); циклические кетеновые ацетали, такие как BMDO, MDO и MPDL, со полимер изо ванные с OEGMA или PCL-g-PEO.

[143] Согласно некоторым вариантам осуществления водорастворимый полимер содержит поли(цвиттерионы). Иллюстративные поли(цвиттерионы) включают в себя, без ограничения, поли(сульфобетаинметакрилат) (PSBMA), поли(карбоксибетаинметакрилат) (РСВМА) и поли(2-метакрилоилоксиэтилфосфорилхолин) (РМРС). В некоторых случаях описанный в настоящем документе полипептид цитокин (например, интерлейкин, IFN или TNF) конъюгирован с поли(цвиттерионом), таким как PSBMA, РСВМА или РМРС. В некоторых случаях цитокин представляет собой полипептид IL-2. В некоторых случаях полипептид IL-2 конъюгирован с поли(цвиттерионом), таким как PSBMA, РСВМА или РМРС.

[144] Согласно некоторым вариантам осуществления водорастворимый полимер содержит поликарбонат. Иллюстративные поликарбонаты включают в себя, без ограничения, пентафторфенил-5-метил-2-оксо-1,3-диоксан-5-карбоксилат (MTC-OC₆F₅). В некоторых случаях описанный в настоящем документе полипептид цитокин (например, интерлейкин, IFN или TNF) конъюгирован с поликарбонатом, таким как MTC-OC₆F₅. В некоторых случаях цитокин представляет собой полипептид IL-2. В некоторых случаях полипептид IL-2 конъюгирован с поликарбонатом, таким как MTC-OC₆F₅.

[145] Согласно некоторым вариантам осуществления водорастворимый полимер включает в себя гибрид полимера, такой как, например, гибрид полимера поликарбонат/PEG, конъюгат пептид/белок-полимер или гидроксилсодержащий и/или цвиттер-ионный дериватизованный полимер (например, гидроксилсодержащий и/или цвиттер-ионный дериватизированный PEG-полимер). В некоторых случаях описанный в настоящем документе полипептид цитокин (например, интерлейкин, IFN или TNF) конъюгирован с полимерным гибридом, таким как гибрид поликарбоната/полимера PEG, конъюгат пептид/белок-полимер или гидроксилсодержащий и/или цвиттерионный дериватизированный полимер (например, гидроксилсодержащий и/или цвиттерионный дериватизированный PEG-полимер). В некоторых случаях цитокин представляет собой полипептид IL-2. В некоторых случаях полипептид IL-2 конъюгирован с гибридом полимера, таким как гибрид полимера поликарбонат/PEG, конъюгат пептид/белок-полимер или гидроксилсодержащий и/или цвиттерионный дериватизированный полимер (например, гидроксилсодержащий и/или цвиттерионный) дериватизированный полимер PEG).

[146] В некоторых случаях водорастворимый полимер содержит полисахарид. Иллюстративные полисахариды включают в себя, без ограничения, декстран, полисиаловую кислоту (PSA), гиалуроновую кислоту (НА), амилозу, гепарин, гепарансульфат (HS), декстрин или гидроксиэтилкрахмал (HES). В некоторых случаях полипептид цитокин (например, интерлейкин, IFN или TNF) конъюгирован с полисахаридом. В некоторых случаях полипептид IL-2 конъюгирован с декстраном. В некоторых случаях полипептид IL-2 конъюгирован с PSA. В некоторых случаях полипептид IL-2 конъюгирован с НА. В некоторых случаях полипептид IL-2 конъюгирован с амилозой. В некоторых случаях полипептид IL-2 конъюгирован с гепарином. В некоторых случаях полипептид IL-2 конъюгирован с HS. В некоторых случаях полипептид IL-2 конъюгирован с декстрином. В некоторых случаях полипептид IL-2 конъюгирован с HES.

[147] В некоторых случаях водорастворимый полимер содержит гликан. Иллюстративные классы гликанов включают в себя N-связанные гликаны, О-связанные гликаны, гликолипиды, O-GlcNAc и гликозаминогликаны. В некоторых случаях полипептид цитокин (например, интерлейкин, IFN или TNF) конъюгирован с гликаном. В некоторых случаях полипептид IL-2 конъюгирован с N-связанными гликанами. В некоторых случаях полипептид IL-2 конъюгирован с О-связанными гликанами. В некоторых случаях полипептид IL-2 конъюгирован с гликолипидами. В некоторых случаях полипептид IL-2 конъюгирован с O-GlcNAc. В некоторых случаях полипептид IL-2 конъюгирован с гликозаминогликанами.

[148] Согласно некоторым вариантам осуществления водорастворимый полимер включает в себя полиоксазолиновый полимер. Полиоксазолиновый полимер представляет собой линейный синтетический полимер и, подобно PEG, обладает низкой полидисперсностью. В некоторых случаях полиоксазолиновый полимер представляет собой полидисперсный полиоксазолиновый полимер, характеризующийся средней молекулярной массой. В некоторых случаях средняя молекулярная масса полиоксазолинового полимера включает в себя, например, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 6500, 7000, 7500, 8000, 10000, 12000, 20000, 35000, 40000, 50000, 60000, 100000, 200000, 300000, 400000 или 500000 Да. В некоторых случаях полиоксазолиновый полимер включает в себя поли(2-метил 2-оксазолин) (PMOZ), поли(2-этил 2-оксазолин) (PEOZ) или поли(2-пропил 2-оксазолин) (PPOZ). В некоторых случаях полипептид цитокин (например, интерлейкин, IFN или TNF) конъюгирован с полиоксазолиновым полимером. В некоторых случаях полипептид IL-2 конъюгирован с полиоксазолиновым полимером. В некоторых случаях полипептид IL-2 конъюгирован с PMOZ. В некоторых случаях полипептид IL-2 конъюгирован с PEOZ. В некоторых случаях полипептид IL-2 конъюгирован с PPOZ.

[149] В некоторых случаях водорастворимый полимер включает в себя полимер полиакриловой кислоты. В некоторых случаях полипептид цитокин (например, интерлейкин, IFN или TNF) конъюгирован с полимером полиакриловой кислоты. В некоторых случаях полипептид IL-2 конъюгирован с полимером полиакриловой кислоты.

[150] В некоторых случаях водорастворимый полимер включает в себя полиамин. Полиамин представляет собой органический полимер, содержащий две или более первичных аминогрупп. Согласно некоторым вариантам осуществления полиамин включает в себя разветвленный полиамин, линейный полиамин или циклический полиамин. В некоторых случаях полиамин представляет собой низкомолекулярный линейный полиамин. Иллюстративные полиамины включают в себя путресцин, кадаверин, спермидин, спермин, этилендиамин, 1,3-диаминопропан, гексаметилендиамин, тетраэтилметилендиамин и пиперазин. В некоторых случаях полипептид цитокин (например, интерлейкин, IFN или TNF) конъюгирован с полиамином. В некоторых случаях полипептид IL-2 конъюгирован с полиамином. В некоторых случаях полипептид IL-2 конъюгирован с путресцином, кадаверином, спермидином, спермином, этилендиамином, 1,3-диаминопропаном, гексаметилендиамином, тетраэтилметилендиамином или пиперазином.

[151] В некоторых случаях водорастворимый полимер описан в патентах США №7744861, 8273833 и 7803777. В некоторых случаях полипептид цитокин (например, интерлейкин, IFN или TNF) конъюгирован с линкером, описанным в патенте США №7744861, 8273833 или 7803777. В некоторых случаях полипептид IL-2 конъюгирован с линкером, описанным в патенте США№7744861, 8273833 или 7803777.

Липиды

[152] Согласно некоторым вариантам осуществления описанный в настоящем документе конъюгирующий фрагмент представляет собой липид. В некоторых случаях липид представляет собой жирную кислоту. В некоторых случаях жирная кислота представляет собой насыщенную жирную кислоту. В других случаях жирная кислота представляет собой ненасыщенную жирную кислоту. Иллюстративные жирные кислоты включают в себя, без ограничения, жирные кислоты, содержащие от около 6 до около 26 атомов углерода, от около 6 до около 24 атомов углерода, от около 6 до около 22 атомов углерода, от около 6 до около 20 атомов углерода, от около 6 до около 18 атомов углерода, от около 20 до около 26 атомов углерода, от около 12 до около 26 атомов углерода, от около 12 до около 24 атомов углерода, от около 12 до около 22 атомов углерода, от около 12 до около 20 атомов углерода или от около 12 до около 18 атомов углерода. В некоторых случаях липид связывается с одним или несколькими белками сыворотки, тем самым увеличивая стабильность в сыворотке и/или период полужизни в сыворотке.

[153] Согласно некоторым вариантам осуществления липид конъюгирован с IL-2. В некоторых случаях липид представляет собой жирную кислоту, например, насыщенную жирную кислоту или ненасыщенную жирную кислоту. В некоторых случаях жирная кислота содержит от около 6 до около 26 атомов углерода, от около 6 до около 24 атомов углерода, от около 6 до около 22 атомов углерода, от около 6 до около 20 атомов углерода, от около 6 до около 18 атомов углерода, от около 20 до около 26 атомов углерода, от около 12 до около 26 атомов углерода, от около 12 до около 24 атомов углерода, от около 12 до около 22 атомов углерода, от около 12 до около 20 атомов углерода или от около 12 до около 18 атомов углерода. В некоторых случаях жирная кислота составляет около 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или 26 атомов углерода в длину. В некоторых случаях жирная кислота включает в себя капроновую кислоту (гексановую кислоту), энантановую кислоту (гептановую кислоту), каприловую кислоту (октановую кислоту), пеларгоновую кислоту (нонановую кислоту), каприновую кислоту (декановую кислоту), ундециловую кислоту (ундекановую кислоту), лауриновую кислоту (додекановую кислоту), тридециловую кислоту (тридекановую кислоту), миристиновую кислоту (тетрадекановую кислоту), пентадециловую кислоту (пентадекановую кислоту), пальмитиновую кислоту (гексадекановую кислоту), маргариновую кислоту (гептадекановую кислоту), стеариновую кислоту (октадекановую кислоту), неадециловую кислоту (неадекановую кислоту), арахидиновую кислоту (эйкозановую кислоту), генэйкозиловую кислоту (генэйкозановую кислоту), бегеновую кислоту (докозановую кислоту), трикозиловую кислоту (трикозановую кислоту), лигноцериновую кислоту (тетракозановую кислоту), пентакозиловую кислоту (пентакозановую кислоту) или церотиновую кислоту (гексакозановую кислоту)

[154] Согласно некоторым вариантам осуществления липидный конъюгат IL-2 повышает стабильность в сыворотке и/или период полужизни в сыворотке.

Белки

[155] Согласно некоторым вариантам осуществления описанный в настоящем документе конъюгирующий фрагмент представляет собой белок или его связывающий фрагмент. Иллюстративные белки включают в себя альбумин, трансферрин или транстиретин. В некоторых случаях белок или его связывающий фрагмент содержит антитело или его связывающие фрагменты. В некоторых случаях конъюгат цитокина содержит белок или его связывающий фрагмент. В некоторых случаях конъюгат IL-2, содержащий белок или его связывающий фрагмент, характеризуется повышенным временем полужизни в сыворотке и/или стабильностью. В некоторых случаях конъюгат IL-2, содержащий белок или его связывающий фрагмент, характеризуется сниженным взаимодействием IL-2 с одной или несколькими субъединицами IL-2R. В дополнительных случаях белок или его связывающий фрагмент блокирует взаимодействие IL-2 с одной или несколькими субъединицами IL-2R.

[156] Согласно некоторым вариантам осуществления конъюгирующий фрагмент представляет собой альбумин. Альбумин представляет собой семейство растворимых в воде глобулярных белков. Он, как правило, содержится в плазме крови, составляющей около 55-60% всех белков плазмы. Человеческий сывороточный альбумин (HSA) представляет собой полипептид из 585 аминокислот, в котором третичная структура разделена на три домена: домен I (аминокислотные остатки 1-195), домен II (аминокислотные остатки 196-383) и домен III (аминокислотные остатки 384-585). Каждый домен дополнительно содержит сайт связывания, который может либо обратимо, либо необратимо взаимодействовать с эндогенными лигандами, такими как жирные кислоты с длинной и средней цепью, билирубин или гемин, или с экзогенными соединениями, такими как гетероциклические или ароматические соединения.

[157] В некоторых случаях полипептид цитокин (например, интерлейкин, IFN или TNF) конъюгирован с альбумином. В некоторых случаях полипептид цитокин конъюгирован с человеческим сывороточным альбумином (HSA). В дополнительных случаях полипептид цитокин конъюгирован с функциональным фрагментом альбумина.

[158] В некоторых случаях полипептид IL-2 конъюгирован с альбумином. В некоторых случаях полипептид IL-2 конъюгирован с человеческим сывороточным альбумином (HSA). В дополнительных случаях полипептид IL-2 конъюгирован с функциональным фрагментом альбумина.

[159] Согласно некоторым вариантам осуществления конъюгирующий фрагмент представляет собой трансферрин. Трансферрин представляет собой полипептид из 679 аминокислот, размер которого составляет около 80 кДа и содержит два сайта связывания Fe³⁺, один из которых находится на N-концевом домене, а другой - на С-концевом домене. В некоторых случаях человеческий трансферрин характеризуется периодом полураспада около 7-12 дней.

[160] В некоторых случаях полипептид цитокин (например, интерлейкин, IFN или TNF) конъюгирован с трансферрином. В некоторых случаях полипептид цитокин конъюгирован с человеческим трансферрином. В дополнительных случаях полипептид цитокин конъюгирован с функциональным фрагментом трансферрина.

[161] В некоторых случаях полипептид IL-2 конъюгирован с трансферрином. В некоторых случаях полипептид IL-2 конъюгирован с человеческим трансферрином. В дополнительных случаях полипептид IL-2 конъюгирован с функциональным фрагментом трансферрина.

[162] Согласно некоторым вариантам осуществления конъюгирующий фрагмент представляет собой транстиретин (TTR). Транстиретин представляет собой транспортный белок, расположенный в сыворотке и спинномозговой жидкости, который транспортирует гормон щитовидной железы тироксин (Т₄) и связанный с ретинолом связывающий ретинол белок.

[163] В некоторых случаях полипептид цитокин (например, интерлейкин, IFN или TNF) конъюгирован с транстиретином (через один из его концов или через внутреннюю шарнирную область). В некоторых случаях полипептид цитокин конъюгирован с функциональным фрагментом транстиретина.

[164] В некоторых случаях полипептид IL-2 конъюгирован с транстиретином (через один из его концов или через внутреннюю шарнирную область). В некоторых случаях полипептид IL-2 конъюгирован с функциональным фрагментом транстиретина.

[165] Согласно некоторым вариантам осуществления конъюгирующий фрагмент представляет собой антитело или его связывающие фрагменты. В некоторых случаях антитело или его связывающие фрагменты включают в себя гуманизированное антитело или его связывающий фрагмент, мышиное антитело или его связывающий фрагмент, химерное антитело или его связывающий фрагмент, моноклональное антитело или его связывающий фрагмент, фрагменты одновалентный Fab', двухвалентный Fab₂, F(ab)'₃, одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv), bis-scFv, (scFv)₂, диатело, миниантитело, нанотело, триатело, тетратело, humabody, дисульфид-стабилизированный белок Fv (dsFv), однодоменное антитело (sdAb), Ig NAR, антитело верблюда или его связывающий фрагмент, биспецифическое антитело или его связывающий фрагмент или его химически модифицированное производное.

[166] В некоторых случаях конъюгирующий фрагмент содержит scFv, bis-scFv, (scFv)₂, dsFv или sdAb. В некоторых случаях конъюгирующий фрагмент содержит scFv. В некоторых случаях конъюгирующий фрагмент содержит bis-scFv. В некоторых случаях конъюгирующий фрагмент содержит (scFv)₂. В некоторых случаях конъюгирующий фрагмент содержит dsFv. В некоторых случаях конъюгирующий фрагмент содержит sdAb.

[167] В некоторых случаях конъюгирующий фрагмент содержит Fc-часть антитела, например, IgG, IgA, IgM, IgE или IgD. В некоторых случаях фрагмент содержит Fc-часть IgG (например, IgG₁, IgG₃ или IgG₄).

[168] В некоторых случаях полипептид цитокин (например, интерлейкин, IFN или TNF) конъюгирован с антителом или его связывающими фрагментами. В некоторых случаях полипептид цитокин конъюгирован с гуманизированным антителом или его связывающим фрагментом, мышиным антителом или его связывающим фрагментом, химерным антителом или его связывающим фрагментом, моноклональным антителом или его связывающим фрагментом, фрагментами одновалентным Fab', двухвалентным Fab₂, F(ab)^'₃, одноцепочечным вариабельным фрагментом (scFv), bis-scFv, (scFv)₂, диателом, миниантителом, нанотелом, триателом, тетрателом, humabody, дисульфид-стабилизированным белком Fv (dsFv), однодоменным антителом (sdAb), Ig NAR, антителом верблюда или его связывающим фрагментом, биспецифическим антителом или его связывающим фрагментом или его химически модифицированным производным. В дополнительных случаях полипептид цитокин конъюгирован с Fc-частью антитела. В дополнительных случаях полипептид цитокин конъюгирован с Fc-частью IgG (например, IgG₁, IgG₃ или IgG₄).

[169] В некоторых случаях полипептид IL-2 конъюгирован с антителом или его связывающими фрагментами. В некоторых случаях полипептид IL-2 конъюгирован с гуманизированным антителом или его связывающим фрагментом, мышиным антителом или его связывающим фрагментом, химерным антителом или его связывающим фрагментом, моноклональным антителом или его связывающим фрагментом, фрагментами одновалентным Fab', двухвалентным Fab₂, F(ab)^'₃, одноцепочечным вариабельным фрагментом (scFv), bis-scFv, (scFv)₂, диателом, миниантителом, нанотелом, триателом, тетрателом, humabody, дисульфид-стабилизированным белком Fv (dsFv), однодоменным антителом (sdAb), Ig NAR, антителом верблюда или его связывающим фрагментом, биспецифическим антителом или его связывающим фрагментом или его химически модифицированным производным. В дополнительных случаях полипептид IL-2 конъюгирован с Fc-частью антитела. В дополнительных случаях полипептид IL-2 конъюгирован с Fc-частью IgG (например, IgG₁, IgG₃ или IgG₄).

[170] Согласно некоторым вариантам осуществления полипептид IL-2 конъюгирован с водорастворимым полимером (например, PEG) и антителом или его связывающим фрагментом. В некоторых случаях антитело или его связывающие фрагменты включают в себя гуманизированное антитело или его связывающий фрагмент, мышиное антитело или его связывающий фрагмент, химерное антитело или его связывающий фрагмент, моноклональное антитело или его связывающий фрагмент, фрагменты одновалентный Fab', двухвалентный Fab₂, F(ab)^'₃, одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv), bis-scFv, (scFv)₂, диатело, миниантитело, нанотело, триатело, тетратело, humabody, дисульфид-стабилизированный белок Fv (dsFv), однодоменное антитело (sdAb), Ig NAR, антитело верблюда или его связывающий фрагмент, биспецифическое антитело или его связывающий фрагмент или его химически модифицированное производное. В некоторых случаях антитело или его связывающие фрагменты содержат scFv, bis-scFv, (scFv)₂, dsFv или sdAb. В некоторых случаях антитело или его связывающие фрагменты содержат scFv. В некоторых случаях антитело или его связывающий фрагмент направляют конъюгат IL-2 к представляющей интерес целевой клетке, а водорастворимый полимер увеличивает стабильность и/или период полураспада в сыворотке.

[171] В некоторых случаях один или несколько конъюгатов полипептид IL-2-водорастворимый полимер (например, PEG) дополнительно связаны с антителом или его связывающими фрагментами. В некоторых случаях отношение конъюгата IL-2 к антителу составляет около 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 11:1 или 12:1. В некоторых случаях отношение конъюгата IL-2 к антителу составляет около 1:1. В других случаях отношение конъюгата IL-2 к антителу составляет около 2:1, 3:1 или 4:1. В дополнительных случаях отношение конъюгата IL-2 к антителу составляет около 6:1 или выше.

[172] Согласно некоторым вариантам осуществления один или несколько конъюгатов полипептид IL-2 водорастворимый полимер (например, PEG) непосредственно связаны с антителом или его связывающими фрагментами. В других случаях конъюгат IL-2 опосредованно связан с антителом или его связывающими фрагментами линкером. Иллюстративные линкеры включают в себя гомобифункциональные линкеры, гетеробифункциональные линкеры, линкеры на основе малеимида, линкеры с нулевым следом, саморасщепляемые линкеры, спейсеры и т.п.

[173] Согласно некоторым вариантам осуществления антитело или его связывающие фрагменты связаны прямо или опосредованно с полипептидной частью IL-2 конъюгата полипептид IL-2-водорастворимый полимер (например, PEG). В таких случаях сайт конъюгации антитела с полипептидом IL-2 находится в сайте, который не будет препятствовать связыванию полипептида IL-2 с IL-2Rβγ. В дополнительных случаях сайт конъюгации антитела с полипептидом IL-2 находится в сайте, который частично блокирует связывание полипептида IL-2 с IL-2Rβγ. В дополнительных случаях сайт конъюгации антитела с полипептидом IL-2 находится в сайте, который будет препятствовать или дополнительно препятствовать связыванию полипептида IL-2 с IL-2Rα. Согласно другим вариантам осуществления антитело или его связывающие фрагменты связаны прямо или опосредованно с водорастворимой полимерной частью конъюгата полипептид IL-2 водорастворимый полимер (например, PEG).

Пептиды

[174] Согласно некоторым вариантам осуществления описанный в настоящем документе конъюгирующий фрагмент представляет собой пептид. В некоторых случаях пептид представляет собой неструктурированный пептид. В некоторых случаях полипептид цитокин (например, интерлейкин, IFN или TNF) конъюгирован с пептидом. В некоторых случаях конъюгат IL-2, содержащий пептид, характеризуется увеличенным временем полужизни в сыворотке и/или стабильностью. В некоторых случаях конъюгат IL-2, содержащий пептид, характеризуется сниженным взаимодействием IL-2 с одной или несколькими субъединицами IL-2R. В дополнительных случаях пептид блокирует взаимодействие IL-2 с одной или несколькими субъединицами IL-2R.

[175] В некоторых случаях конъюгирующий фрагмент представляет собой пептид XTEN™ (Amunix Operating Inc.), и эта модификация называется XTENylation. XTENylation представляет собой генетическое слияние нуклеиновой кислоты, кодирующей представляющий интерес полипептид, с нуклеиновой кислотой, кодирующей пептид XTEN™ (Amunix Operating Inc.), длинный неструктурированный гидрофильный пептид, содержащий различный процент шести аминокислот: Ala, Glu, Gly, Ser и Thr. В некоторых случаях пептид XTEN™ выбирают на основе таких свойств, как экспрессия, генетическая стабильность, растворимость, устойчивость к агрегации, увеличенный период полужизни, повышенная активность и/или повышенная активность in vitro в сочетании с представляющим интерес полипептидом. В некоторых случаях полипептид цитокин (например, интерлейкин, IFN или TNF) конъюгирован с пептидом XTEN. В некоторых случаях полипептид IL-2 конъюгирован с пептидом XTEN.

[176] В некоторых случаях конъюгирующий фрагмент представляет собой богатый глицином го мо аминокислотный полимер (НАР), и эта модификация называется HAPylation. HAPylation представляет собой генетическое слияние нуклеиновой кислоты, кодирующей представляющий интерес полипептид, с нуклеиновой кислотой, кодирующей богатый глицином полимер гомоаминокислоты (НАР). В некоторых случаях полимер НАР содержит повторяющийся мотив (Gly₄Ser)_n (SEQ ID NO: 3) и иногда составляет в длину около 50, 100, 150, 200, 250, 300 или более остатков. В некоторых случаях полипептид цитокин (например, интерлейкин, IFN или TNF) конъюгирован с НАР. В некоторых случаях полипептид IL-2 конъюгирован с НАР.

[177] Согласно некоторым вариантам осуществления конъюгирующий фрагмент представляет собой полипептид PAS, и эта модификация называется PASylation. PASylation представляет собой генетическое слияние нуклеиновой кислоты, кодирующей представляющий интерес полипептид, с нуклеиновой кислотой, кодирующей полипептид PAS. Полипептид PAS представляет собой гидрофильный незаряженный полипептид, состоящий из остатков Pro, Ala и Ser. В некоторых случаях длина полипептида PAS составляет по меньшей мере около 100, 200, 300, 400, 500 или 600 аминокислот. В некоторых случаях полипептид цитокин (например, интерлейкин, IFN или TNF) конъюгирован с полипептидом PAS. В некоторых случаях полипептид IL-2 конъюгирован с полипептидом PAS.

[178] Согласно некоторым вариантам осуществления конъюгирующий фрагмент представляет собой эластиноподобный полипептид (ELP), и модификация называется ELPylation. ELPylation представляет собой генетическое слияние нуклеиновой кислоты, кодирующей представляющий интерес полипептид, с нуклеиновой кислотой, кодирующей эластиноподобный полипептид (ELP). ELP содержит повторный мотив VPGxG (SEQ ID NO: 4), в котором х представляет собой любую аминокислоту, кроме пролина. В некоторых случаях полипептид цитокин (например, интерлейкин, IFN или TNF) конъюгирован с ELP. В некоторых случаях полипептид IL-2 конъюгирован с ELP.

[179] Согласно некоторым вариантам осуществления конъюгирующий фрагмент представляет собой СТР-пептид. СТР-пептид содержит пептид из 31 аминокислотного остатка FQSSSS*KAPPPS*LPSPS*RLPGPS*DTPILPQ (SEQ ID NO: 5), в котором S* обозначает сайты О-гликозилирования (OPKO). В некоторых случаях пептид СТР генетически слит с полипептидом цитокином (например, полипептидом IL-2). В некоторых случаях полипептид цитокин (например, полипептид IL-2) конъюгирован с пептидом СТР.

[180] Согласно некоторым вариантам осуществления цитокин (например, полипептид IL-2) модифицирован глутамилированием. Глутамилирование (или полиглутамилирование) представляет собой обратимую посттрансляционную модификацию глутамата, в которой γ-карбоксигруппа глутамата образует пептид о подобную связь с аминогруппой свободного глутамата, в которой α-карбоксигруппа распространяется в полиглутаматную цепь.

[181] Согласно некоторым вариантам осуществления цитокин (например, полипептид IL-2) модифицирован полимером желатиноподобного белка (GLK). В некоторых случаях полимер GLK содержит несколько повторов Gly-Xaa-Yaa, где Хаа и Yaa в основном содержат пролин и 4-гидроксипролин, соответственно. В некоторых случаях полимер GLK дополнительно содержит аминокислотные остатки Pro, Gly, Glu, Qln, Asn, Ser и Lys. В некоторых случаях длина полимера GLK составляет около 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 150 остатков или более.

Дополнительные конъюгирующие фрагменты

[182] В некоторых случаях конъюгирующий фрагмент содержит внеклеточный биомаркер. В некоторых случаях внеклеточный биомаркер представляет собой опухолевый антиген. В некоторых случаях иллюстративный внеклеточный биомаркер содержит CD 19, PSMA, В7-Н3, В7-Н6, CD70, СЕА, CSPG4, EGFRvIII, EphA3, ЕрСАМ, EGFR, ErbB2 (HER2), FAP, FRα, GD2, GD3, Lewis-Y, мезотелин, Mucl, Muc 16, ROR1, TAG72, VEGFR2, CD11, Gr-1, CD204, CD16, CD49b, CD3, CD4, CD8 и B220. В некоторых случаях конъюгирующий фрагмент связан или конъюгирован с цитокином (например, IL-2). В некоторых случаях конъюгирующий фрагмент генетически слит, например, на N-конце или С-конце цитокина (например, IL-2).

[183] В некоторых случаях конъюгирующий фрагмент содержит молекулу посттрансляционной модификации. В некоторых случаях примеры посттрансляционной модификации включают в себя миристоилирование, пальмитоилирование, изопренилирование (или пренилирование) (например, фарнезилирование или геранилгеранилирование), глипиация («glypiation»), ацилирование (например, О-ацилирование, N-ацилирование, S-ацилирование), алкилирование (например, дополнительными алкильными группами, такими как метальные или этильные группы), амидирование, гликозилирование, гидроксилирование, йодирование, добавление нуклеотидов, окисление, фосфорилирование, сукцинилирование, сульфатирование, гликирование, карбамилирование, глутамилирование или дезамидирование. В некоторых случаях цитокин (например, IL-2) модифицируется посттрансляционной модификацией, такой как миристоилирование, пальмитоилирование, изопренилирование (или пренилирование) (например, фарнезилирование или геранилгеранилирование), glypiation, ацилирование (например, О-ацилирование, N-ацилирование, S-ацилирование), алкилирование (например, дополнительными алкильными группами, такими как метальные или этильные группы), амидирование, гликозилирование, гидроксилирование, йодирование, добавление нуклеотидов, окисление, фосфорилирование, сукцинилирование, сульфатирование, гликирование, карбамилирование, глутамилирование или дезамидирование.

Конъюгация

Линкеры

[184] Согласно некоторым вариантам осуществления применимые функциональные реакционноспособные группы для конъюгирования или связывания конъюгирующего фрагмента с описанным в настоящем документе полипептидом цитокином (например, полипептидом IL-2) включают в себя, например, линкеры нулевого или более высокого порядка. В некоторых случаях неприродная аминокислота, включенная в описанный в настоящем документе интерлейкин, содержит функциональную реакционноспособную группу. В некоторых случаях линкер содержит функциональную реакционноспособную группу, которая реагирует с неприродной аминокислотой, включенной в описанный в настоящем документе интерлейкин. В некоторых случаях конъюгирующий фрагмент содержит функциональную реакционноспособную группу, которая реагирует с неприродной аминокислотой, включенной в описанный в настоящем документе интерлейкин. В некоторых случаях конъюгирующий фрагмент содержит функциональную реакционноспособную группу, которая реагирует с описанным в настоящем документе линкером (необязательно предварительно присоединенным к пептиду цитокину). Согласно некоторым вариантам осуществления линкер содержит реакционноспособную группу, которая реагирует с природной аминокислотой в описанном в настоящем документе пептиде цитокине. В некоторых случаях линкеры высшего порядка включают в себя бифункциональные линкеры, такие как гомобифункциональные линкеры или гетеробифункциональные линкеры. Иллюстративные гомобифункциональные линкеры включают в себя, без ограничения, реагент Ломанта дитиобис(сукцинимидилпропионат) DSP, 3'3'-дитиобис(сульфосукцинимидилпропионат) (DTSSP), дисукцинимидилсуберат (DSS), бис(сульфосукцинимидил)суберат (BS), дисукцинимидилтартрат (DST), дисульфосукцинимидилтартрат (сульфо DST), этиленгликобис(сукцинимидилсукцинат) (EGS), дисукцинимидилглутарат (DSG), N,N'-дисукцинимидилкарбонат (DSC), диметиладипимидимидат (DMA), диметилпимелимидат (DMP), диметилсуберимидат (DMS), диметил-3,3'-дитиобиспропионимидат (DTBP), 1,4-ди-3'-(2'-пиридилдитио)пропионамидо)бутан (DPDPB), бисмалеимидогексан (ВМН), арилгалогенидсодержащее соединение (DFDNB), например, 1,5-дифтор-2,4-динитробензол или 1,3-дифтор-4,6-динитробензол, 4,4'-дифтор-3,3'-динитрофенилсульфон (DFDNPS), бис-[β-(4-азидосалициламидо)этил]дисульфид (BASED), формальдегид, глутаральдегид, диглицидиловый эфир 1,4-бутандиола, дигидразид адипиновой кислоты, карбогидразид, о-толуидин, 3,3'-диметилбензидин, бензидин, α,α'-п-диаминодифенил, дийод-п-ксилолсульфокислоту, N,N'-этилен-бис(йодацетамид) или N,N'-гексаметилен-бис(йодацетамид).

[185] Согласно некоторым вариантам осуществления бифункциональный линкер включает в себя гетеробифункциональный линкер. Иллюстративные гетеробифункциональные линкеры включают в себя, без ограничения, амин-реактивные и сульфгидрильные сшиватели, такие как N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)пропионат (sPDP), длинноцепочечный N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)пропионат (LC-sPDP), водорастворимый длинноцепочечный N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)пропионат (сульфо-LC-sPDP), сукцинимидилоксикарбонил-α-метил-α-(2-пиридилдитио)толуол (sMPT), сульфосукцинимидил-6-[α-метил-α-(2-пиридилдитио)толуамидо]гексаноат (сульфо-LC-sMPT), сукцинимидил-4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат (sMCC), сульфосукцинимидил-4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат (сульфо-sMCC), м-малеимидобензоил-N-гидроксисукцинимидный эфир (MBs), м-малеимидобензоил-N-гидроксисульфосукцинимидный эфир (сульфо-MBs), N-сукцинимидил(4-йодактеил)аминобензоат (sIAB), сульфосукцинимидил(4-йодактеил)аминобензоат (сульфо-sIAB), сукцинимидил-4-(п-малеимидофенил)бутират (sMPB), сульфосукцинимидил-4-(п-малеимидофенил)бутират (сульфо-SIAB), сложный эфир γ-малеимидобутирилокси)сукцинимида (GMBs), сложный эфир N-(γ-малеимидобутирилокси)сульфосукцинимида (сульфо-GMBs), сукцинимидил-6-((йодацетил)амино)гексаноат (sIAX), сукцинимидил-6-[6-((йодацетил)амино)амино]гексаноат (sIAXX), сукцинимидил-4-(((йодацетил)амино)метил)циклогексан-1-карбоксилат (sIAC), сукцинимидил-6-(((((4-йодацетил)амино)метил)циклогексан-1-карбонил)амино)гексаноат (sIACX), п-нитрофенилйодацетат (NPIA), карбонил-реактивные и сульфгидрильно-реактивные сшиватели, такие как 4-гидразид-(4-N-малеимидофенил)масляной кислоты (МРВН), 4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилгидразид-8 (М₂С₂Н), 3-(2-пиридилдитио)пропионилгидразид (PDPH), амин-реактивные и фотореактивные сшиватели, такие как N-гидроксисукцинимидил-4-азидосалициловая кислота (NHs-AsA), Х-гидроксисульфосукцинимидил-4-азидосалициловая кислота (сульфо-NHs-AsA), сульфосукцинимидил-(4-азидосалициламид)гексаноат (сульфо-NHs-LC-AsA), сульфосукцинимидил-2-(п-азидосалициламидо)этил-1,3'-дитиопропионат (sAsD), N-гидроксисукцинимидил-4-азидобензоат (HsAB), N-гидроксисульфосукцинимидил-4-азидобензоат (сульфо-HsAB) Х-сукцинимидил-6-(4'-азидо-2'-нитрофениламино)гексаноат (sANPAH), сульфосукцинимидил-6-(4'-азидо-2'-нитрофениламино)гексаноат (сульфо-sANPAH), N-5-азидо-2-нитробензоилоксисукцинимид (ANB-NOs), сульфосукцинимидил-2-(м-азидо-о-нитробензамидо)этил-1,3'-дитиопропионат (sAND), N-сукцинимидил-4-(4-азидофенил)-1,3'-дитиопропионат (sADP), N-сульфосукцинимидил-(4-азидофенил)-1,3'-дитиопропионат (сульфо-sADP), сульфосукцинимидил-4-(п-азидофенил)бутират (сульфо-sAPB), сульфосукцинимидил-2-(7-азидо-4-метилкумарин-3-ацетамид)этил-1,3'-дитиопропионат (sAED), сульфосукцинимидил-7-азидо-4-метилкумарин-3-ацетат (сульфо-sAMCA), п-нитрофенилдиазопируват (pNPDP), п-нитрофенил-2-диазо-3,3,3-трифторпропионат (PNP-DTP), сульфгидрильно-реактивные и фотореактивные сшиватели, такие как 1-(п-азидосалициламидо)-4-(йодацетамидо)бутан (AsIB), N-[4-(п-азидосалициламидо)бутил]-3'-(2'-пиридилдитио)пропионамид (APDP), бензофенон-4-йодацетамид, бензофенон-4-малеимид, карбонил-реактивные и фотореактивные сшиватели, такие как п-азидобензоилгидразид (АВН), карбоксилат-реактивные и фотореактивные сшиватели, такие как 4-(п-азидосалициламидо)бутиламин (AsBA) и аргинин-реактивные и фотореактивные сшиватели, такие как п-азидофенилглиоксаль (APG).

[186] В некоторых случаях реакционноспособная функциональная группа содержит нуклеофильную группу, которая реагирует на электрофильную группу, присутствующую в связывающем фрагменте (например, в конъюгирующем фрагменте или в IL-2). Иллюстративные электрофильные группы включают в себя карбонильные группы, такие как альдегид, кетон, карбоновая кислота, сложный эфир, амид, енон, ацилгалогенид или кислотный ангидрид. Согласно некоторым вариантам осуществления реакционноспособной функциональной группой является альдегид. Иллюстративные нуклеофильные группы включают в себя гидразид, оксим, амино, гидразин, тиосемикарбазон, гидразинкарбоксилат и арилгидразид. Согласно некоторым вариантам осуществления неприродная аминокислота, включенная в описанный в настоящем документе интерлейкин, содержит электрофильную группу.

[187] Согласно некоторым вариантам осуществления линкер представляет собой расщепляемый линкер. Согласно некоторым вариантам осуществления расщепляемый линкер представляет собой дипептидный линкер. Согласно некоторым вариантам осуществления дипептидный линкер представляет собой валин-цитруллин (Val-Cit), фенилаланин-лизин (Phe-Lys), валин-аланин (Val-Ala) и валин-лизин (Val-Lys). Согласно некоторым вариантам осуществления дипептидный линкер представляет собой валин-цитруллин.

[188] Согласно некоторым вариантам осуществления линкер представляет собой пептидный линкер, содержащий, например, по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 или более аминокислот. В некоторых случаях пептидный линкер содержит не более чем 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 или менее аминокислот. В дополнительных случаях пептидный линкер содержит около 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 или 50 аминокислот.

[189] Согласно некоторым вариантам осуществления линкер включает в себя саморасщепляющийся линкерный фрагмент. Согласно некоторым вариантам осуществления саморасщепляющийся линкерный фрагмент включает в себя п-аминобензиловый спирт (РАВ), п-аминобензилоксикарбонил (РАВС) или их производные или аналоги. Согласно некоторым вариантам осуществления линкер включает в себя дипептидный линкерный фрагмент и саморасщепляющийся линкерный фрагмент. Согласно некоторым вариантам осуществления саморасщепляющийся линкерный фрагмент является таким, как описан в патенте США №9089614 и заявке ВОИС № WO 2015038426.

[190] Согласно некоторым вариантам осуществления расщепляемый линкер представляет собой глюкуронид. Согласно некоторым вариантам осуществления расщепляемый линкер представляет собой расщепляемый кислотой линкер. Согласно некоторым вариантам осуществления расщепляемый кислотой линкер представляет собой гидразин. Согласно некоторым вариантам осуществления расщепляемый линкер представляет собой восстанавливаемый линкер.

[191] Согласно некоторым вариантам осуществления линкер содержит малеимидную группу. В некоторых случаях малеимидная группа также упоминается как малеимидный спейсер. В некоторых случаях малеимидная группа дополнительно содержит капроновую кислоту, образуя малеимидокапроил (mc). В некоторых случаях линкер содержит малеимидокапроил (mc). В некоторых случаях линкер представляет собой малеимидокапроил (mc). В других случаях малеимидная группа включает в себя малеимидометильную группу, такую как описанные выше сукцинимидил-4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат (sMCC) или сульфосукцинимидил-4-(N-малеимидометил)циклогексан-1 -карбоксилат (сульфо-sCC).

[192] Согласно некоторым вариантам осуществления малеимидная группа представляет собой само стабилизирующийся малеимид. В некоторых случаях самостабилизирующийся малеимид использует диаминопропионовую кислоту (DPR) для включения основной аминогруппы, смежной с малеимидом, для обеспечения внутримолекулярного катализа гидролиза тиосукцинимидного кольца, таким образом исключая малеимид от прохождения реакции элиминации посредством реакции ретро-Михаэля. В некоторых случаях самостабилизирующийся малеимид представляет собой группу малеимида, описанную в Lyon, et al., "Self-hydrolyzing maleimides improve the stability and pharmacological properties of antibody-drug conjugates," Nat. Biotechnol. 32(10): 1059-1062 (2014). В некоторых случаях линкер содержит самостабилизирующийся малеимид. В некоторых случаях линкер представляет собой самостабилизирующийся малеимид.

Химия конъюгации

[193] Различные реакции конъюгации используют для конъюгирования линкеров, конъюгирующих фрагментов и неприродных аминокислот, включенных в описанные в настоящем документе пептиды цитокины. Такие реакции конъюгации часто совместимы с водными условиями, такими как «биоортогональные» реакции. Согласно некоторым вариантам осуществления реакции конъюгации опосредуются химическими реагентами, такими как катализаторы, свет или реакционноспособные химические группы, обнаруженные в линкерах, конъюгирующих фрагментах или неприродных аминокислотах. Согласно некоторым вариантам осуществления реакции конъюгации опосредованы ферментами. Согласно некоторым вариантам осуществления описанная в настоящем документе реакция конъюгации описана в Gong, Y., Pan, L. Tett. Lett. 2015, 56, 2123. Согласно некоторым вариантам осуществления описанная в настоящем документе реакция конъюгации описана в Chen, X.; Wu. Y-W. Org. Biomol. Chem. 2016, 14, 5417.

[194] Согласно некоторым описанным в настоящем документе вариантам осуществления реакция конъюгации включает в себя реакцию кетона или альдегида с нуклеофилом. Согласно некоторым вариантам осуществления реакция конъюгации включает в себя реакцию кетона с амино-группой с образованием оксима. Согласно некоторым вариантам осуществления реакция конъюгации включает в себя реакцию кетона с арильной или гетероариламиногруппой с образованием имина. Согласно некоторым вариантам осуществления реакция конъюгации включает в себя реакцию альдегида с арильной или гетероариламиногруппой с образованием имина. Согласно некоторым вариантам осуществления описанная в настоящем документе реакция конъюгации приводит к получению пептида цитокина, содержащего линкер или конъюгирующий фрагмент, присоединенный через оксим. Согласно некоторым вариантам осуществления реакция конъюгации включает в себя реакцию Пикте-Шпенглера альдегида или кетона с триптаминовым нуклеофилом. Согласно некоторым вариантам осуществления реакция конъюгации включает в себя реакцию гидразино-Пикте-Шпенглера. Согласно некоторым вариантам осуществления реакция конъюгации включает в себя лигирование по Пикте-Шпенглеру.

[195] Согласно некоторым описанным в настоящем документе вариантам осуществления описанная в настоящем документе реакция конъюгации включает в себя реакцию азида и фосфина (лигирование Штаудингера). Согласно некоторым вариантам осуществления фосфин представляет собой арилфосфин. Согласно некоторым вариантам осуществления арилфосфин содержит группу ортоэфира. Согласно некоторым вариантам осуществления фосфин характеризуется структурой метил-2-(дифенилфосфаненил)бензоат. Согласно некоторым вариантам осуществления описанная в настоящем документе реакция конъюгации приводит к получению пептида цитокина, содержащего линкер или конъюгирующий фрагмент, присоединенный через ариламид. Согласно некоторым вариантам осуществления описанная в настоящем документе реакция конъюгации приводит к получению пептида цитокина, содержащего линкер или конъюгирующий фрагмент, присоединенный через амид.

[196] Согласно некоторым описанным в настоящем документе вариантам осуществления описанная в настоящем документе реакция конъюгации включает в себя реакцию 1,3-диполярного циклоприсоединения. Согласно некоторым вариантам осуществления реакция 1,3-диполярного циклоприсоединения включает в себя реакцию азида и фосфина («клик» реакция). Согласно некоторым вариантам осуществления реакция конъюгации катализируется медью. Согласно некоторым вариантам осуществления описанная в настоящем документе реакция конъюгации приводит к получению пептида цитокина, содержащего линкер или конъюгирующий фрагмент, присоединенный через триазол. Согласно некоторым вариантам осуществления описанная в настоящем документе реакция конъюгации включает в себя реакцию азида с напряженным олефином. Согласно некоторым вариантам осуществления описанная в настоящем документе реакция конъюгации включает в себя реакцию азида с напряженным алкином. Согласно некоторым вариантам осуществления описанная в настоящем документе реакция конъюгации включает в себя реакцию азида с циклоалкином, например, OCT, DIFO, DIFBO, DIBO, BARAC, ТМТН или другим напряженным циклоалкином, структуры которого показаны в Gong, Y., Pan, L. Tett. Lett. 2015, 56, 2123. Согласно некоторым вариантам осуществления реакция 1,3-диполярного циклоприсоединения катализируется светом («фотоклик»). Согласно некоторым вариантам осуществления описанная в настоящем документе реакция конъюгации включает в себя реакцию концевой аллильной группы с тетразолом и светом. Согласно некоторым вариантам осуществления описанная в настоящем документе реакция конъюгации включает в себя реакцию концевой алкинильной группы с тетразолом и светом. Согласно некоторым вариантам осуществления описанная в настоящем документе реакция конъюгации включает в себя реакцию О-аллильной аминокислоты с тетразином и светом. Согласно некоторым вариантам осуществления описанная в настоящем документе реакция конъюгации включает в себя реакцию О-аллилтирозина с тетразином и светом.

[197] Согласно некоторым описанным в настоящем документе вариантам осуществления описанная в настоящем документе реакция конъюгации включает в себя реакцию циклоприсоединения с обратными электронными требованиями, содержащую диен и диенофил. Согласно некоторым вариантам осуществления диен содержит тетразин. Согласно некоторым вариантам осуществления диенофил содержит алкен. Согласно некоторым вариантам осуществления диенофил содержит алкин. Согласно некоторым вариантам осуществления алкин представляет собой напряженный алкин. Согласно некоторым вариантам осуществления алкен представляет собой напряженный диен. Согласно некоторым вариантам осуществления алкин представляет собой трансциклооктин. Согласно некоторым вариантам осуществления алкин представляет собой циклооктен. Согласно некоторым вариантам осуществления алкен представляет собой циклопропен. Согласно некоторым вариантам осуществления алкен представляет собой фторциклопропен. Согласно некоторым вариантам осуществления описанная в настоящем документе реакция конъюгации приводит к образованию пептида цитокина, присоединенного к линкеру или конъюгирующему фрагменту через 6-членный кольцевой гетероцикл, содержащий два атома азота в кольце.

[198] Согласно некоторым описанным в настоящем документе вариантам осуществления описанная в настоящем документе реакция конъюгации включает в себя реакцию метатезиса олефина. Согласно некоторым вариантам осуществления описанная в настоящем документе реакция конъюгации включает в себя реакцию алкена и алкина с рутениевым катализатором. Согласно некоторым вариантам осуществления описанная в настоящем документе реакция конъюгации включает в себя реакцию двух алкенов с рутениевым катализатором. Согласно некоторым вариантам осуществления описанная в настоящем документе реакция конъюгации включает в себя реакцию двух алкинов с рутениевым катализатором. Согласно некоторым вариантам осуществления описанная в настоящем документе реакция конъюгации включает в себя реакцию алкена или алкина с рутениевым катализатором и аминокислотой, содержащей аллильную группу. Согласно некоторым вариантам осуществления описанная в настоящем документе реакция конъюгации включает в себя реакцию алкена или алкина с рутениевым катализатором и аминокислотой, содержащей аллилсульфид или селенид. Согласно некоторым вариантам осуществления рутениевый катализатор представляет собой катализатор Ховеда-Граббса 2-го поколения. Согласно некоторым вариантам осуществления реакция метатезиса олефина включает в себя реакцию одного или нескольких напряженных алкенов или алкинов.

[199] Согласно некоторым описанным в настоящем документе вариантам осуществления описанная в настоящем документе реакция конъюгации включает в себя реакцию перекрестного сочетания. Согласно некоторым вариантам осуществления реакции перекрестного сочетания включают в себя катализаторы на основе переходных металлов, такие как иридий, золото, рутений, родий, палладий, никель, платина или другой катализатор на основе переходного металла, и один или несколько лигандов. Согласно некоторым вариантам осуществления катализаторы на основе переходных металлов являются водорастворимыми. Согласно некоторым описанным в настоящем документе вариантам осуществления описанная в настоящем документе реакция конъюгации включает в себя реакцию перекрестного сочетания Сузуки-Мияуры. Согласно некоторым описанным в настоящем документе вариантам осуществления описанная в настоящем документе реакция конъюгации включает в себя реакцию арилгалогенида (или трифлата или тозилата), арила или алкенилбороновой кислоты и палладиевого катализатора. Согласно некоторым описанным в настоящем документе вариантам осуществления описанная в настоящем документе реакция конъюгации включает в себя реакцию перекрестного сочетания по Соногашира. Согласно некоторым описанным в настоящем документе вариантам осуществления описанная в настоящем документе реакция конъюгации включает в себя реакцию арилгалогенида (или трифлата, или тозилата), алкина и палладиевого катализатора. Согласно некоторым вариантам осуществления реакции перекрестного сочетания приводят к присоединению линкера или конъюгирующего фрагмента к пептиду цитокина через углерод-углеродную связь.

[200] Согласно некоторым описанным в настоящем документе вариантам осуществления описанная в настоящем документе реакция конъюгации включает в себя реакцию снятия защиты или «освобождения» реакционноспособной группы перед конъюгацией. Согласно некоторым вариантам осуществления описанная в настоящем документе реакция конъюгации включает в себя расщепление реакционноспособной группы светом с последующей реакцией конъюгации. Согласно некоторым вариантам осуществления реакционноспособная группа защищена аралкильной группой, содержащей одну или несколько нитрогрупп. Согласно некоторым вариантам осуществления расщепление реакционноспособной группы приводит к образованию свободного амина, сульфида или другой реакционноспособной группы. Согласно некоторым вариантам осуществления описанная в настоящем документе реакция конъюгации включает в себя расщепление реакционноспособной группы с катализатором на основе переходного металла с последующей реакцией конъюгации. Согласно некоторым вариантам осуществления катализатор на основе переходного металла содержит палладий и один или несколько лигандов. Согласно некоторым вариантам осуществления реакционноспособная группа защищена аллильной группой. Согласно некоторым вариантам осуществления реакционноспособная группа защищена аллильным карбаматом. Согласно некоторым вариантам осуществления реакционноспособная группа защищена пропаргильной группой. Согласно некоторым вариантам осуществления реакционноспособная группа защищена пропаргилкарбаматом. Согласно некоторым вариантам осуществления реакционноспособная группа защищена диенофилом, причем воздействие диена (такого как тетразин) приводит к снятию защиты с реакционноспособной группы.

[201] Согласно некоторым описанным в настоящем документе вариантам осуществления описанная в настоящем документе реакция конъюгации включает в себя лиганд-направленную реакцию, в которой лиганд (необязательно, присоединенный к реакционноспособной группе), облегчает сайт конъюгации между реакционноспособной группой и пептидом цитокина. Согласно некоторым вариантам осуществления лиганд расщепляется во время или после реакции пептида цитокина с реакционноспособной группой. Согласно некоторым вариантам осуществления сайт конъюгации пептида цитокина представляет собой природную аминокислоту. Согласно некоторым вариантам осуществления сайт конъюгации пептида цитокина представляет собой лизин, цистеин или серии. Согласно некоторым вариантам осуществления сайт конъюгации пептида цитокина представляет собой описанную в настоящем документе неприродную аминокислоту. Согласно некоторым вариантам осуществления реакционноспособная группа включает в себя замещаемую группу, такую как бедная электронами арильная или гетероарильная группа. Согласно некоторым вариантам осуществления реакционноспособная группа включает в себя замещаемую группу, такую как бедная электронами алкильная группа, которая замещается пептидом цитокина. Согласно некоторым вариантам осуществления описанная в настоящем документе реакция конъюгации включает в себя реакцию улавливающего радикал средства с радикальными соединениями. Согласно некоторым вариантам осуществления описанная в настоящем документе реакция конъюгации включает в себя реакцию присоединения окислительного радикала. Согласно некоторым вариантам осуществления улавливающее радикал средство представляет собой ариламин. Согласно некоторым вариантам осуществления радикальная частица представляет собой тирозильный радикал. Согласно некоторым вариантам осуществления радикальные частицы производятся рутениевым катализатором (таким как [Ru(bpy)₃]) и светом.

[202] Ферментативные реакции необязательно используют для описанных в настоящем документе реакций конъюгации. Иллюстративные ферментативные конъюгации включают в себя SortA-опосредованную конъюгацию, TGs-опосредованную конъюгацию или FGE-опосредованную конъюгацию. Согласно некоторым вариантам осуществления описанная в настоящем документе реакция конъюгации включает в себя лигирование нативного белка (NPL) концевой 1-амино-2-тио-группы с тиоэфиром с образованием амидной связи.

[203] В настоящем документе описаны различные реакции конъюгации для взаимодействия линкера или конъюгирующего фрагмента с пептидом цитокином, причем реакция происходит с природной («канонической») аминокислотой в пептиде цитокине. Согласно некоторым вариантам осуществления природная аминокислота, обнаруженная в положении конъюгации, обнаружена в последовательности дикого типа, или, альтернативно, положение было мутированным. Согласно некоторым вариантам осуществления реакция конъюгации предусматривает образование дисульфидной связи у остатка цистеина. Согласно некоторым вариантам осуществления реакция конъюгации включает в себя реакцию 1,4-присоединения по Михаэлю цистеина или лизина. Согласно некоторым вариантам осуществления реакция конъюгации включает в себя цианобензотиазольное лигирование цистеина. Согласно некоторым вариантам осуществления реакция конъюгации включает в себя сшивание с ацетоновым фрагментом, таким как 1,3-дихлор-2-пропионон. Согласно некоторым вариантам осуществления реакция конъюгации включает в себя 1,4-присоединение по Михаэлю к дегидроаланину, образованному реакцией цистеина с О-мезитиленсульфонилгидроксиламином. Согласно некоторым вариантам осуществления реакция конъюгации включает в себя реакцию тирозина с триазолиндионом (TAD) или производным TAD. Согласно некоторым вариантам осуществления реакция конъюгации включает в себя реакцию триптофана с карбеноидом родия.

Способы применения

Пролиферативные заболевания или состояния

[204] Согласно некоторым вариантам осуществления в настоящем документе описан способ лечения пролиферативного заболевания или состояния у нуждающегося в этом субъекта, который предусматривает введение субъекту терапевтически эффективного количества конъюгата цитокина (например, конъюгата IL-2) в настоящем документе. В некоторых случаях конъюгат IL-2 содержит выделенный и очищенный полипептид IL-2 и конъюгирующий фрагмент, причем конъюгат IL-2 характеризуется сниженной аффинностью к субъединице α рецептора IL-2 (IL-2Rα) относительно полипептида IL-2 дикого типа. В некоторых случаях конъюгат IL-2 содержит выделенный и очищенный полипептид IL-2 и конъюгирующий фрагмент, который связывается с выделенным и очищенным полипептидом IL-2 по положению аминокислоты, выбранному из K35, Т37, R38, Т41, F42, K43, F44, Y45, Е60, Е61, Е62, K64, Р65, Е68, V69, N71, L72, М104, С105 и Y107, причем нумерация аминокислотных остатков соответствует SEQ ID NO 1. В некоторых случаях конъюгат IL-2 преимущественно взаимодействует с субъединицами IL-2Rβ и IL-2Rβγ с образованием комплекса IL-2/IL-2Rβγ. В некоторых случаях комплекс IL-2/IL-2Rαβγ стимулирует и/или усиливает экспансию CD4+ хелперных клеток, CD8+ эффекторных наивных Т-клеток и Т-клеток памяти, NK-клеток и/или NKT-клеток. В дополнительных случаях экспансия Teff-клеток смещает отношение Teff : Treg к популяции Teff.

[205] Согласно некоторым вариантам осуществления пролиферативное заболевание или состояние представляет собой рак. В некоторых случаях рак представляет собой солидную опухоль. Иллюстративные солидные опухоли включают в себя, без ограничения, рак мочевого пузыря, рак кости, рак головного мозга, рак молочной железы, колоректальный рак, рак пищевода, рак глаза, рак головы и шеи, рак почки, рак легкого, меланому, рак яичника, рак поджелудочной железы или рак предстательной железы. В некоторых случаях солидная опухоль представляет собой метастатический рак. В некоторых случаях солидная опухоль представляет собой рецидивирующий или рефрактерный рак.

[206] В некоторых случаях описанный в настоящем документе конъюгат цитокина (например, интерлейкина, IFN или TNF) вводят нуждающемуся в этом субъекту для лечения солидной опухоли. В таких случаях субъект характеризуется наличием рака мочевого пузыря, рака кости, рака головного мозга, рака молочной железы, колоректального рака, рака пищевода, рака глаза, рака головы и шеи, рака почки, рака легких, меланомы, рака яичников, рака поджелудочной железы или рака предстательной железы. В некоторых случаях солидная опухоль представляет собой метастатический рак. В некоторых случаях солидная опухоль представляет собой рецидивирующий или рефрактерный рак.

[207] В некоторых случаях описанный в настоящем документе конъюгат IL-2 вводят нуждающемуся в этом субъекту для лечения солидной опухоли. В таких случаях субъект характеризуется наличием рака мочевого пузыря, рака кости, рака головного мозга, рака молочной железы, колоректального рака, рака пищевода, рака глаза, рака головы и шеи, рака почки, рака легких, меланомы, рака яичников, рака поджелудочной железы или рака предстательной железы. В некоторых случаях конъюгат IL-2 вводят субъекту для лечения рака мочевого пузыря. В некоторых случаях конъюгат IL-2 вводят субъекту для лечения рака молочной железы. В некоторых случаях конъюгат IL-2 вводят субъекту для лечения колоректального рака. В некоторых случаях конъюгат IL-2 вводят субъекту для лечения рака пищевода. В некоторых случаях конъюгат IL-2 вводят субъекту для лечения рака головы и шеи. В некоторых случаях конъюгат IL-2 вводят субъекту для лечения рака почки. В некоторых случаях конъюгат IL-2 вводят субъекту для лечения рака легкого. В некоторых случаях конъюгат IL-2 вводят субъекту для лечения меланомы. В некоторых случаях конъюгат IL-2 вводят субъекту для лечения рака яичника. В некоторых случаях конъюгат IL-2 вводят субъекту для лечения рака поджелудочной железы. В некоторых случаях конъюгат IL-2 вводят субъекту для лечения рака предстательной железы.

[208] Согласно некоторым вариантам осуществления конъюгат IL-2 вводят субъекту для лечения метастатического рака. В некоторых случаях метастатический рак включает в себя метастатический рак мочевого пузыря, метастатический рак кости, метастатический рак головного мозга, метастатический рак молочной железы, метастатический колоректальный рак, метастатический рак пищевода, метастатический рак глаза, метастатический рак головы и шеи, метастатический рак почки, метастатический рак легкого, метастатическую меланому, метастатический рак яичников, метастатический рак поджелудочной железы или метастатический рак предстательной железы. В некоторых случаях конъюгат IL-2 вводят субъекту для лечения метастатического рака мочевого пузыря, метастатического рака кости, метастатического рака головного мозга, метастатического рака молочной железы, метастатического колоректального рака, метастатического рака пищевода, метастатического рака глаза, метастатического рака головы и шеи, метастатического рака почки, метастатического рака легких, метастатической меланомы, метастатического рака яичников, метастатического рака поджелудочной железы или метастатического рака предстательной железы.

[209] В некоторых случаях конъюгат IL-2 вводят субъекту для лечения рецидивирующего или рефрактерного рака. В некоторых случаях рецидивирующий или рефрактерный рак включает в себя рецидивирующий или рефрактерный рак мочевого пузыря, рецидивирующий или рефрактерный рак кости, рецидивирующий или рефрактерный рак головного мозга, рецидивирующий или рефрактерный рак молочной железы, рецидивирующий или рефрактерный колоректальнй рак, рецидивирующий или рефрактерный рак пищевода, рецидивирующий или рефрактерный рак глаза, рецидивирующий или рефрактерный рак головы и шеи, рецидивирующий или рефрактерный рак почки, рецидивирующий или рефрактерный рак легкого, рецидивирующую или рефрактерную меланому, рецидивирующий или рефрактерный рак яичников, рецидивирующий или рефрактерный рак поджелудочной железы или рецидивирующий или рефрактерный рак предстательной железы. В некоторых случаях конъюгат IL-2 вводят субъекту для лечения рецидивирующего или рефрактерного рака мочевого пузыря, рецидивирующего или рефрактерного рака костей, рецидивирующего или рефрактерного рака головного мозга, рецидивирующего или рефрактерного рака молочной железы, рецидивирующего или рефрактерного колоректального рака, рецидивирующего или рефрактерного рака пищевода, рецидивирующего или рефрактерного рака глаза, рецидивирующего или рефрактерного рака головы и шеи, рецидивирующего или рефрактерного рака почки, рецидивирующего или рефрактерного рака легкого, рецидивирующей или рефрактерной меланомы, рецидивирующего или рефрактерного рака яичника, рецидивирующего или рефрактерного рака поджелудочной железы или рецидивирующего или рефрактерный рак предстательной железы.

[210] Согласно некоторым вариантам осуществления рак представляет собой не подвергавшийся лечению рак. В таких случаях не подвергавшийся лечению рак представляет собой рак, который не подвергали лечению с помощью терапии. В некоторых случаях не подвергавшийся лечению рак представляет собой солидную опухоль, такую как рак мочевого пузыря, рак кости, рак головного мозга, рак молочной железы, колоректальный рак, рак пищевода, рак глаза, рак головы и шеи, рак почки, рак легких, меланома, рак яичников, рак поджелудочной железы или рак предстательной железы. Согласно некоторым вариантам осуществления в настоящем документе описан способ лечения не подвергавшейся лечению солидной опухоли у нуждающегося в этом субъекта, который предусматривает введение субъекту описанного в настоящем документе конъюгата цитокина (например, конъюгата IL-2).

[211] Согласно некоторым вариантам осуществления рак представляет собой гематологическое злокачественное новообразование. В некоторых случаях гематологическое злокачественное новообразование включает в себя лейкоз, лимфому или миелому. В некоторых случаях гематологическое злокачественное новообразование представляет собой Т-клеточное злокачественное новообразование. В других случаях гематологическое злокачественное новообразование представляет собой В-клеточное злокачественное новообразование. Иллюстративные гематологические злокачественные новообразования включают в себя, без ограничения, хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL), мелкоклеточную лимфоцитарную лимфому (SLL), фолликулярную лимфому (FL), диффузную В-крупноклеточную лимфому (DLBCL), мантийноклеточную лимфому (MCL), макроглобулинемию Вальденстрема, множественную миелому, экстранодальную В-клеточную лимфому из клеток маргинальной зоны, нодальную В-клеточную лимфому из клеток маргинальной зоны, лимфому Беркитта, В-крупноклеточную лимфому не Беркитта, первичную медиастинальную В-клеточную лимфому (PMBL), иммунобластную крупноклеточную лимфому, В-лимфобластную лимфому из клеток-предшественников, пролимфоцитарный лейкоз В-клеток, лимфоплазмоцитарную лимфому, лимфому маргинальной зоны селезенки, миелому плазматических клеток, плазмоцитому, В-крупноклеточную лимфому средостения (тимуса), внутрисосудистую В-крупноклеточную лимфому, первичную выпотную лимфому или лимфоматоидный гранулематоз.

[212] В некоторых случаях гематологическое злокачественное новообразование представляет собой метастатический рак. В некоторых случаях метастатический рак представляет собой метастатическое Т-клеточное злокачественное новообразование или метастатическое В-клеточное злокачественное новообразование.

[213] В некоторых случаях гематологическое злокачественное новообразование представляет собой рецидивирующий или рефрактерный рак. В некоторых случаях рецидивирующий или рефрактерный рак представляет собой рецидивирующее или рефрактерное Т-клеточное злокачественное новообразование или рецидивирующее или рефрактерное В-клеточное злокачественное новообразование.

[214] В некоторых случаях описанный в настоящем документе цитокин (например, интерлейкин, IFN или TNF) вводят нуждающемуся в этом субъекту для лечения гематологического злокачественного новообразование. В некоторых случаях у субъекта имеется Т-клеточное злокачественное новообразование. В некоторых случаях у субъекта имеется В-клеточное злокачественное новообразование. В некоторых случаях у субъекта имеется хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL), мелкоклеточная лимфоцитарная лимфома (SLL), фолликулярная лимфома (FL), диффузная В-крупноклеточная лимфома (DLBCL), мантийноклеточная лимфома (MCL), макроглобулинемия Вальденстрема, множественная миелома, экстранодальная В-клеточная лимфома из клеток маргинальной зоны, нодальная В-клеточная лимфома из клеток маргинальной зоны, лимфома Беркитта, В-крупноклеточная лимфома не Беркитта, первичная медиастинальная В-клеточная лимфома (PMBL), иммунобластная крупноклеточная лимфома, В-лимфобластная лимфома из клеток-предшественников, пролимфоцитарный лейкоз В-клеток, лимфоплазмоцитарная лимфома, лимфома маргинальной зоны селезенки, миелома плазматических клеток, плазмоцитома, В-крупноклеточная лимфома средостения (тимуса), внутрисосудистая В-крупноклеточная лимфома, первичная выпотная лимфома или лимфоматоидный гранулематоз.

[215] В некоторых случаях описанный в настоящем документе конъюгат IL-2 вводят нуждающемуся в этом субъекту для лечения гематологического злокачественного новообразования. В некоторых случаях у субъекта имеется Т-клеточное злокачественное новообразование. В некоторых случаях у субъекта имеется В-клеточное злокачественное новообразование. В некоторых случаях у субъекта имеется хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL), мелкоклеточная лимфоцитарная лимфома (SLL), фолликулярная лимфома (FL), диффузная В-крупноклеточная лимфома (DLBCL), мантийноклеточная лимфома (MCL), макроглобулинемия Вальденстрема, множественная миелома, экстранодальная В-клеточная лимфома из клеток маргинальной зоны, нодальная В-клеточная лимфома из клеток маргинальной зоны, лимфома Беркитта, В-крупноклеточная лимфома не Беркитта, первичная медиастинальная В-клеточная лимфома (PMBL), иммунобластная крупноклеточная лимфома, В-лимфобластная лимфома из клеток-предшественников, пролимфоцитарный лейкоз В-клеток, лимфоплазмоцитарная лимфома, лимфома маргинальной зоны селезенки, миелома плазматических клеток, плазмоцитома, В-крупноклеточная лимфома средостения (тимуса), внутрисосудистая В-крупноклеточная лимфома, первичная выпотная лимфома или лимфоматоидный гранулематоз. В некоторых случаях конъюгат IL-2 вводят субъекту для лечения CLL. В некоторых случаях конъюгат IL-2 вводят субъекту для лечения SLL. В некоторых случаях конъюгат IL-2 вводят субъекту для лечения FL. В некоторых случаях конъюгат IL-2 вводят субъекту для лечения DLBCL. В некоторых случаях конъюгат IL-2 вводят субъекту для лечения MCL. В некоторых случаях конъюгат IL-2 вводят субъекту для лечения макроглобулинемии Вальденстрема. В некоторых случаях конъюгат IL-2 вводят субъекту для лечения множественной миеломы. В некоторых случаях конъюгат IL-2 вводят субъекту для лечения лимфомы Беркитта.

[216] В некоторых случаях конъюгат IL-2 вводят субъекту для лечения метастатического гематологического злокачественного новообразования. В некоторых случаях конъюгат IL-2 вводят субъекту для лечения метастатического Т-клеточного злокачественного новообразования. В некоторых случаях конъюгат IL-2 вводят субъекту для лечения метастатического В-клеточного злокачественного новообразования. В некоторых случаях конъюгат IL-2 вводят субъекту для лечения метастатического хронического лимфоцитарного лейкоза (CLL), мелкоклеточной лимфоцитарной лимфомы (SLL), фолликулярной лимфомы (FL), диффузной В-крупноклеточной лимфомы (DLBCL), мантийноклеточной лимфомы (MCL), макроглобулинемии Вальденстрема, множественной миеломы, экстранодальной В-клеточной лимфомы из клеток маргинальной зоны, нодальной В-клеточной лимфомы из клеток маргинальной зоны, лимфомы Беркитта, В-крупноклеточной лимфомы не Беркитта, первичной медиастинальной В-клеточной лимфомы (PMBL), иммунобластной крупноклеточной лимфомы, В-лимфобластной лимфомы из клеток-предшественников, пролимфоцитарного лейкоза В-клеток, лимфоплазмоцитарной лимфомы, лимфомы маргинальной зоны селезенки, миеломы плазматических клеток, плазмоцитомы, В-крупноклеточной лимфомы средостения (тимуса), внутрисосудистой В-крупноклеточной лимфомы, первичной выпотной лимфомы или лимфоматоидного гранулематоза.

[217] В некоторых случаях конъюгат IL-2 вводят субъекту для лечения рецидивирующего или рефрактерного гематологического злокачественного новообразования. В некоторых случаях конъюгат IL-2 вводят субъекту для лечения рецидивирующего или рефрактерного Т-клеточного злокачественного новообразования. В некоторых случаях конъюгат IL-2 вводят субъекту для лечения рецидивирующего или рефрактерного В-клеточного злокачественного новообразования. В некоторых случаях конъюгат IL-2 вводят субъекту для лечения рецидивирующего или рефрактерного хронического лимфоцитарного лейкоза (CLL), мелкоклеточной лимфоцитарной лимфомы (SLL), фолликулярной лимфомы (FL), диффузной В-крупноклеточной лимфомы (DLBCL), мантийноклеточной лимфомы (MCL), макроглобулинемии Вальденстрема, множественной миеломы, экстранодальной В-клеточной лимфомы из клеток маргинальной зоны, нодальной В-клеточной лимфомы из клеток маргинальной зоны, лимфомы Беркитта, В-крупноклеточной лимфомы не Беркитта, первичной медиастинальной В-клеточной лимфомы (PMBL), иммунобластной крупноклеточной лимфомы, В-лимфобластной лимфомы из клеток-предшественников, пролимфоцитарного лейкоза В-клеток, лимфоплазмоцитарной лимфомы, лимфомы маргинальной зоны селезенки, миеломы плазматических клеток, плазмоцитомы, В-крупноклеточной лимфомы средостения (тимуса), внутрисосудистой В-крупноклеточной лимфомы, первичной выпотной лимфомы или лимфоматоидного гранулематоза.

Дополнительные терапевтические средства

[218] Согласно некоторым вариантам осуществления дополнительное терапевтическое средство дополнительно вводят субъекту. В некоторых случаях дополнительное терапевтическое средство вводят одновременно с конъюгатом цитокинов (например, конъюгатом IL-2). В других случаях дополнительное терапевтическое средство и конъюгат IL-2 вводят последовательно, например, конъюгат цитокина (например, конъюгат IL-2) вводят до введения дополнительного терапевтического средства или конъюгат цитокина (например, конъюгат IL-2) вводят после введения дополнительного терапевтического средства.

[219] В некоторых случаях дополнительное терапевтическое средство включает в себя химиотерапевтическое средство, иммунотерапевтическое средство, таргетную терапию, лучевую терапию или их комбинацию. Иллюстративные дополнительные терапевтические средства включают в себя, без ограничения, такие алкилирующие средства, как алтретамин, бусульфан, карбоплатин, кармустин, хлорамбуцил, цисплатин, циклофосфамид, дакарбазин, ломустин, мелфалан, оксаплатин, темозоломид или тиотепа; такие антиметаболиты, как 5-фторурацил (5-FU), 6-меркаптопурин (6-МР), капецитабин, цитарабин, флоксуридин, флударабин, гемцитабин, гидроксимочевина, метотрексат или пеметрексед; такие антрациклины, как даунорубицин, доксорубицин, эпирубицин или идарубицин; такие ингибиторы топоизомеразы I, как топотекан или иринотекан (СРТ-11); такие ингибиторы топоизомеразы II, как этопозид (VP-16), тенипозид или митоксантрон; такие ингибиторы митоза, как доцетаксел, эстрамустин, иксабепилон, паклитаксел, винбластин, винкристин или винорелбин; или такие кортикостероиды, как преднизон, метилпреднизолон или дексаметазон.

[220] В некоторых случаях дополнительное терапевтическое средство включает в себя терапию первой линии. Используемый в настоящем документе термин «терапия первой линии» включает в себя первичное лечение для субъекта с раком. В некоторых случаях рак представляет собой первичный рак. В других случаях рак представляет собой метастатический или рецидивирующий рак. В некоторых случаях терапия первой линии включает в себя химиотерапию. В других случаях терапия первой линии включает в себя лучевую терапию. Специалист в настоящей области техники легко поймет, что различные терапии первой линии могут быть применимы к различным типам рака.

[221] В некоторых случаях конъюгат цитокина (например, конъюгат IL-2) вводят с дополнительным терапевтическим средством, выбранным из такого алкилирующего средства, как алтретамин, бусульфан, карбоплатин, кармустин, хлорамбуцил, цисплатин, циклофосфамид, дакарбазин, ломустин, мелфалан, оксаплатин, темозоломид или тиотепа; такого антиметаболита, как 5-фторурацил (5-FU), 6-меркаптопурин (6-МР), капецитабин, цитарабин, флоксуридин, флударабин, гемцитабин, гидроксимочевина, метотрексат или пеметрексед; такого антрациклина, как даунорубицин, доксорубицин, эпирубицин или идарубицин; такого ингибитора топоизомеразы I, как топотекан или иринотекан (СРТ-11); такого ингибитора топоизомеразы II, как этопозид (VP-16), тенипозид или митоксантрон; такого ингибитора митоза, как доцетаксел, эстр амустин, иксабепилон, паклитаксел, винбластин, винкристин или винорелбин; или такого кортикостероида, как преднизон, метилпреднизолон или дексаметазон.

[222] В некоторых случаях описанный в настоящем документе конъюгат цитокина (например, конъюгат IL-2) вводят с ингибитором фермента поли(АДФ-рибоза)-полимеразы (PARP). Иллюстративные ингибиторы PARP включают в себя, без ограничения, олапариб (AZD-2281, Lynparza® от Astra Zeneca), рукапариб (PF-01367338, Rubraca® от Clovis Oncology), нирапариб (MK-4827, Zejula® от Tesaro), талазопариб (BMN-673 от BioMarin Pharmaceutical Inc.), велипариб (АВТ-888 от Abb Vie), СК-102 (ранее СЕР 9722, от Teva Pharmaceutical Industries Ltd.), E7016 (от Eisai), инипариб (BSI 201 от Sanofi) и памипариб (BGB-290 от BeiGene). В некоторых случаях конъюгат цитокина (например, конъюгат IL-2) вводят в комбинации с ингибитором PARP, таким как олапариб, рукапариб, нирапариб, талазопариб, велипариб, СК-102, Е7016, инипариб или памипариб.

[223] В некоторых случаях описанный в настоящем документе конъюгат цитокина (например, конъюгат IL-2) вводят с ингибитором иммунной контрольной точки. Иллюстративные ингибиторы контрольных точек включают в себя:

[224] такие ингибиторы PD-L1, как MPDL3280A (RG7446) Genentech, клон 10F.9G2 антитела к PD-L1 мыши (кат. номер ВЕ0101) от BioXcell, моноклональное антитело к PD-Ll MDX-1105 (BMS-936559) и BMS-935559 от Bristol-Meyer Squibb, MSB0010718C, мышиный клон 29Е.2А3 к PD-L1 и AstraZeneca MEDI4736;

[225] такие ингибиторы PD-L2, как АМР-224 (Amplimmune) от GlaxoSmithKline и rHIgM12B7;

[226] такие ингибиторы PD-1, как клон J43 антитела к PD-1 мыши (кат. номер ВЕ0033-2) от BioXcell, клон RMP1-14 антитела к PD-1 мыши (кат. номер ВЕ0146) от BioXcell, клон ЕН12 мышиного антитела к PD-1, антитело к PD-1 мыши Merk's МК-3475 (Keytruda, пембролизумаб, ламбролизумаб), антитело к PD-1 AnaptysBio, известное как ANB011, антитело MDX-1 106 (ONO-4538), человеческое моноклональное антитело IgG4 от Bristol-Myers Squibb's - ниволумаб (Opdivo®, BMS-936558, MDX1106), АМР-514 и АМР-224 AstraZeneca и пидилизумаб (СТ-011) от Cure Tech Ltd;

[227] такие ингибиторы CTLA-4, как антитело к CTLA-4 ипилимумаб Bristol-Myers Squibb's (также известное как Yervoy®, MDX-010, BMS-734016 и MDX-101), клон 9Н10 антитела к CTLA4 от Millipore, тремелимумаб Pfizer (СР-675,206, тицилимумаб) и клон BNI3 антитела к CTLA4 от Abcam;

[228] такие ингибиторы LAG3, как клон eBioC9B7W антитела к Lag-3 (C9B7W) от eBioscience, антитело LS-B2237 к Lag3 от Lifespan Biosciences, IMP321 (LnmuFact) от Immutep, антитело BMS-986016 к Lag3 и LAG-3 химерное антитело А9Н12;

[229] такие ингибиторы В7-Н3, как MGA271;

[230] такие ингибиторы KIR, как лирилумаб (IPH2101);

[231] такие ингибиторы CD137, как урелумаб (BMS-663513, Bristol-Myers Squibb), PF-05082566 (анти-4-1ВВ, PF-2566, Pfizer) или XmAb-5592 (Xencor);

[232] такие ингибиторы PS, как бавитуксимаб;

[233] и такие ингибиторы, как антитело или его фрагменты (например, моноклональное антитело, человеческое, гуманизированное или химерное антитело), молекулы RNAi или небольшие молекулы к TIM3, CD52, CD30, CD20, CD33, CD27, ОХ40, GITR, ICOS, BTLA (CD272), CD 160, 2В4, LAIR1, TIGHT, LIGHT, DR3, CD226, CD2 или SLAM.

[234] В некоторых случаях конъюгат цитокина (например, конъюгат IL-2) вводят в комбинации с пембролизумабом, ниволумабом, тремелимумабом или ипилимумабом.

[235] В некоторых случаях описанный в настоящем документе конъюгат цитокина (например, конъюгат IL-2) вводят с таким антителом, как алемтузумаб, трастузумаб, ибритумомаб тиуксетан, брентуксимаб ведотин, адотрастузумаб эмтансин или блинатумомаб.

[236] В некоторых случаях конъюгат цитокина (например, конъюгат IL-2) вводят с дополнительным терапевтическим средством, выбранным из дополнительного цитокина. В некоторых случаях дополнительный цитокин усиливает и/или синергирует экспансию и/или пролиферацию Т-эффекторных клеток. В некоторых случаях дополнительный цитокин включает в себя IL-1β, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, IL-15, IL-21 или TNFα. В некоторых случаях дополнительный цитокин представляет собой IL-7. В некоторых случаях дополнительный цитокин представляет собой IL-15. В некоторых случаях дополнительный цитокин представляет собой IL-21. В некоторых случаях дополнительный цитокин представляет собой TNFα.

[237] В некоторых случаях конъюгат цитокина (например, конъюгат IL-2) вводят с дополнительным терапевтическим средством, выбранным из агониста рецептора. В некоторых случаях агонист рецептора содержит лиганд Toll-подобного рецептора (TLR). В некоторых случаях лиганд TLR включает в себя TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8 или TLR9. В некоторых случаях лиганд TLR включает в себя синтетический лиганд, такой как, например, Pam3Cys, CFA, MALP2, Pam2Cys, FSL-1, Hib-OMPC, Poly I:C, поли A:U, AGP, MPL A, RC-529, MDF2β, CFA или флагеллин. В некоторых случаях конъюгат цитокина (например, конъюгат IL-2) вводят с одним или несколькими агонистами TLR, выбранными из TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8 и TLR9. В некоторых случаях конъюгат цитокина (например, конъюгат IL-2) вводят с одним или несколькими агонистами TLR, выбранными из Pam3Cys, CFA, MALP2, Pam2Cys, FSL-1, Hib-OMPC, Poly I:C, poly A:U, AGP, MPL A, RC-529, MDF2β, CFA и флагеллина.

[238] Согласно некоторым вариантам осуществления конъюгат цитокина (например, конъюгат IL-2) используется в сочетании с терапией адаптивным переносом Т-лимфоцитов (ACT). Согласно одному варианту осуществления ACT включает в себя идентификацию аутологичных Т-лимфоцитов у субъекта, например, с противоопухолевой активностью, экспансию аутологичных Т-лимфоцитов in vitro и последующую реинфузию подвергнутых экспансии Т-лимфоцитов субъекту. Согласно другому варианту осуществления ACT включает в себя использование аллогенных Т-лимфоцитов, например, с противоопухолевой активностью, экспансию Т-лимфоцитов in vitro и последующую инфузию подвергнутых экспансии аллогенных Т-лимфоцитов нуждающемуся в этом субъекту. В некоторых случаях описанный в настоящем документе конъюгат цитокина (например, конъюгат IL-2) используется в сочетании с аутологичными Т-лимфоцитами как часть терапии ACT. В других случаях описанный в настоящем документе конъюгат цитокина (например, конъюгат IL-2) используется в сочетании с аллогенными Т-лимфоцитами как часть терапии ACT. В некоторых случаях конъюгат цитокина (например, конъюгат IL-2) вводят одновременно с терапией ACT нуждающемуся в этом субъекту. В других случаях конъюгат цитокина (например, конъюгат IL-2) вводят последовательно с терапией ACT нуждающемуся в этом субъекту.

[239] Согласно некоторым вариантам осуществления конъюгат цитокина (например, конъюгат IL-2) используется для активации ex-vivo и/или экспансии аутологичного и/или аллогенного переноса Т-клеток. В таких случаях конъюгат цитокина (например, конъюгат IL-2) используется для активации и/или экспансии образца, содержащего аутологичные и/или аллогенные Т-клетки, и конъюгат цитокина (например, конъюгат IL-2) необязательно удаляют из образца до введения образца нуждающемуся в этом субъекту.

[240] Согласно некоторым вариантам осуществления конъюгат цитокина (например, конъюгат IL-2) вводят с вакциной. В некоторых случаях конъюгат цитокина (например, конъюгат IL-2) используют в сочетании с онколитическим вирусом. В таких случаях конъюгат цитокина (например, конъюгат IL-2) действует как стимулирующее средство для модуляции иммунного ответа. В некоторых случаях конъюгат цитокина (например, конъюгат IL-2) используют с онколитическим вирусом как часть адъювантной терапии. Иллюстративные онколитические вирусы включают в себя T-Vec (Amgen), G47Δ (Todo et al.), JX-594 (Sillajen), CG0070 (Cold Genesys) и Reolysin (Oncolytics Biotech). В некоторых случаях конъюгат цитокина (например, конъюгат IL-2) используют в комбинации с онколитическим вирусом, таким как T-Vec, G47A, JX-594, CG0070 или реолизин.

[241] Согласно некоторым вариантам осуществления конъюгат цитокина (например, конъюгат IL-2) вводят в сочетании с лучевой терапией.

[242] Согласно некоторым вариантам осуществления конъюгат цитокина (например, конъюгат IL-2) вводят в комбинации с хирургическим вмешательством.

Патогенные инфекции

[243] Согласно некоторым вариантам осуществления в настоящем документе описан способ лечения патогенной инфекции у нуждающегося в этом субъекта, который предусматривает введение субъекту терапевтически эффективного количества описанного в настоящем документе конъюгата цитокина (например, конъюгата IL-2). В некоторых случаях конъюгат IL-2 содержит выделенный и очищенный полипептид IL-2 и конъюгирующий фрагмент, причем конъюгат IL-2 характеризуется сниженной аффинностью к субъединице (IL-2Rα) рецептора IL-2 относительно полипептида IL-2 дикого типа. В некоторых случаях конъюгат IL-2 содержит выделенный и очищенный полипептид IL-2 и конъюгирующий фрагмент, который связывается с выделенным и очищенным полипептидом IL-2 в положении аминокислоты, выбранном из K35, Т37, R38, Т41, F42, K43, F44, Y45, Е60, Е61, Е62, K64, Р65, Е68, V69, N71, L72, М104, С105 и Y107, причем нумерация аминокислотных остатков соответствует SEQ ID NO:l. В некоторых случаях конъюгат IL-2 преимущественно взаимодействует с субъединицами IL-2Rβ и IL-2Rβγ с образованием комплекса IL-2/IL-2Rβγ, который стимулирует и/или усиливает экспансию CD4+ хелперных клеток, CD8+ эффекторных наивных клеток и клеток памяти, NK-клеток и/или NKT-клеток. В дополнительных случаях конъюгат IL-2 облегчает распознавание патогенного резервуара CD8+ Т-клетками.

[244] Согласно некоторым вариантам осуществления патогенная инфекция представляет собой вирусную инфекцию, при которой после лечения антивирусной терапией вирусный резервуар (например, покоящиеся CD4+ Т-клетки) сохраняется в подвергнутом лечению хозяине. В таких случаях описанный в настоящем документе конъюгат цитокина (например, конъюгат IL-2) индуцирует распознавание вирусного резервуара CD8+ Т-клетками (или цитотоксическими Т-клетками). В некоторых случаях конъюгат цитокина (например, конъюгат IL-2) используют в качестве монотерапии для перенаправления CD8+ Т-клеток к инфицированным покоящимся клеткам для элиминации. В некоторых случаях конъюгат цитокина (например, конъюгат IL-2) используют в сочетании с дополнительной терапией для перенаправления CD8+ Т-клеток к инфицированным покоящимся клеткам для элиминации. Иллюстративная дополнительная терапия включает в себя противовирусное лечение, такое как ацикловир, бривудин, докозанол, фамцикловир, фоскарнет, идоксуридин, пенцикловир, трифлуридин, валацикловир и прителивир.

[245] Согласно некоторым вариантам осуществления вирус представляет собой ДНК-вирус или РНК-вирус. ДНК-вирусы включают в себя одноцепочечные (оц) ДНК-вирусы, двухцепочечные (дц) ДНК-вирусы или ДНК-вирусы, которые содержат как оц, так и дц ДНК-области. РНК-вирусы включают в себя одноцепочечные (оц) РНК-вирусы или двухцепочечные (дц) РНК-вирусы. В некоторых случаях оцРНК-вирусы дополнительно классифицируются на РНК-вирусы с положительно полярной нитью или РНК-вирусы с отрицательно-полярной нитью.

[246] Иллюстративные дцДНК-вирусы включают в себя вирусы из семейства: Myoviridae, Podoviridae, Siphoviridae, Alloherpesviridae, Herpesviridae, Malacoherpesviridae, Lipothrixviridae, Rudiviridae, Adenoviridae, Ampullaviridae, Ascoviridae, Asfaviridae, Baculoviridae, Bicaudaviridae, Clavaviridae, Corticoviridae, Fuselloviridae, Globuloviridae, Guttaviridae, Hytrosaviridae, Iridoviridae, Marseilleviridae, Mimiviridae, Nimaviridae, Pandoraviridae, Papillomaviridae, Phycodnaviridae, Plasmaviridae, Polydnaviruses, Polyomaviridae, Poxviridae, Sphaerolipoviridae и Tectiviridae.

[247] Иллюстративные оцДНК-вирусы включают в себя вирусы из семейства: Anelloviridae, Bacillariodnaviridae, Bidnaviridae, Circoviridae, Geminiviridae, Inoviridae, Microviridae, Nanoviridae, Parvoviridae и Spiraviridae.

[248] Иллюстративные ДНК-вирусы, которые содержат как оц-, так и дц-области ДНК, включают в себя вирусы из группы плеолиповирусов. В некоторых случаях плеолиповирусы включают в себя Haloarcula hispanica pleomorphic virus 1, Halogeometricum pleomorphic virus 1, Halorubrum pleomorphic virus 1, Halorubrum pleomorphic virus 2, Halorubrum pleomorphic virus 3 и Halorubrum pleomorphic virus 6.

[249] Иллюстративные дцРНК-вирусы включают в себя вирусы из семейства: Birnaviridae, Chrysoviridae, Cystoviridae, Endornaviridae, Hypoviridae, Megavirnaviridae, Partitiviridae, Picobirnaviridae, Reoviridae, Rotavirus и Totiviridae.

[250] Иллюстративные оцРНК-вирусы включают в себя вирусы из семейства: Alphaflexiviridae, Alphatetraviridae, Alvernaviridae, Arteriviridae, Astroviridae, Barnaviridae, Betaflexiviridae, Bromoviridae, Caliciviridae, Carmotetraviridae, Closteroviridae, Coronaviridae, Dicistroviridae, Flaviviridae, Gammaflexiviridae, Iflaviridae, Leviviridae, Luteoviridae, Marnaviridae, Mesoniviridae, Narnaviridae, Nodaviridae, Permutotetraviridae, Picornaviridae, Potyviridae, Roniviridae, Retroviridae, Secoviridae, Togaviridae, Tombusviridae, Tymoviridae и Virgaviridae.

[251] Иллюстративные оцРНК-вирусы с отрицательно-полярной нитью включают в себя вирусы из семейства: Arenaviridae, Bornaviridae, Bunyaviridae, Filoviridae, Nyamiviridae, Ophioviridae, Orthomyxoviridae, Paramyxoviridae и Rhabdoviridae.

[252] Согласно некоторым вариантам осуществления патогенная инфекция вызывается вирусом лейкоза Абельсона, вирусом мышиного лейкоза Абельсона, вирусом Абельсона, вирусом острого ларинготрахеобронхита, вирусом реки Аделаиды, группой аденоассоциированныхвирусов, аденовирусом, вирусом африканской чумы лошадей, вирусом африканской чумы свиней, вирусом AIDS, парвовирусом алеутской болезни норок, альфа-ретровирусом, альфа-вирусом, связанным с ALV вирусом, вирусом Амапари, афтовирусом, вирусом Aquareovirus, арбовирусом, арбовирусом С, группой А арбовируса, группой В арбовируса, группой аренавируса, вирусом аргентинской геморрагической лихорадки, артеривирусом, астровирусом, группой герпесвирусов Ateline, вирусом болезни Ауезки, аура-вирусом, вирусом болезни Аусдука, австралийским лиссавирусом летучих мышей, авиаденовирусом, вирусом эритробластоза птиц, вирусом инфекционного бронхита птиц, вирусом птичьего лейкоза, вирусом птичьго лимфоматоза, вирусом миелобластоза птиц, птичьим парамиксовирусом, вирусом псевдочумы птиц, вирусом птичьего гриппа, парамиксовирусом, вирусом птичьего пневмоэнцефалита, вирусом птичьего ретикулоэндотелиоза, вирусом саркомы птиц, группой ретровирусов типа С птиц, авихепаднавирусом, авипоксвирусом, В-вирусом, вирусом В19, вирусом Babanki, герпес-вирусом бабуина, бакуло вирус ом, вирусом Barmah Forest, вирусом Bebaru, вирусом Berrimah, бета-ретровирусом, вирусом Вогпа, вирусом Биттнера, вирусом ВК, вирусом Black Creek Canal, вирусом синего языка овец, вирусом боливийской геморрагической лихорадки, вирусом болезни Бома, вирусом пограничной болезни овец, вирусом Вогпа, вирусом альфа-герпеса 1 крупного рогатого скота, вирусом альфа-герпеса 2 крупного рогатого скота, коронавирусом крупного рогатого скота, вирусом эфемерной лихорадки крупного рогатого скота, вирусом иммунодефицита крупного рогатого скота, вирусом лейкоза крупного рогатого скота, вирусом лейкоза свиньи вирусом маммиллита крупного рогатого скота, вирусом папилломы крупного рогатого скота, вирусом папулезного стоматита крупного рогатого скота, парвовирусом крупного рогатого скота, синцитиальным вирусом крупного рогатого скота, онковирусом типа С крупного рогатого скота, вирусом вирусной диареи крупного рогатого скота, вирусом Buggy Creek, группой вирусов палочковидной формы, супергруппой вируса Bunyamwera, буньявирусом, вирусом лимфомы Беркитта, вирусом лихорадки Бвамба, СА-вирусом, калицивирусом, вирусом калифорнийского энцефалита, вирусом верблюжьей оспы, вирусом канарипокс, герпесвирусом собак, коронавирусом собак, вирусом собачьей чумы, собачьим герпесвирусом, собачим мельчайшим вирусом, собачим парвовирусом, вирусом Сапо Delgadito, вирусом артрита коз и овец, вирусом энцефалита коз и овец, козьим вирусом герпеса, вирусом оспы овец, кардиовирусом, герпесвирусом свинковых грызунов 1, герпесвирусом мартышковых 1, герпесвирусом мартышек 1, герпесвирусом мартышек 2, вирусом Чандипура, вирусом Чангвинола, вирусом американского канального сома, вирусом Шарлевиля, вирусом ветряной оспы, вирусом чикунгуньи, вирусом герпеса шимпанзе, реовирусом голавля, вирусом кеты, вирусом Кокала, реовирусом кижуча, вирусом коитальной сыпи, вирусом клещевой лихорадки Колорадо, колтивирусом, вирусом Columbia SK, вирусом острой респираторной инфекции, вирусом контагиозного пустулезного дерматита, вирусом контагиозного гнойничкового дерматита, коронавирусом, вирусом Corriparta, вирусом острого ринита, вирусом коровьей оспы, вирусом Коксаки, CPV (вирусом цитоплазматического полиэдроза), вирусом паралича сверчка, вирусом конго-крымской геморрагической лихорадки, вирусом псевдокрупа, криптовирусом, вирусом Cypovirus, цитомегаловирусом, группой цитомегаловируса, вирусом цитоплазматического полиэдроза, папилломавирусом оленей, дельтаретровирусом, вирусом денге, денсовирусом, депендовирусом, вирусом Дхори, вирусом diploma, вирусом Drosophila С, вирусом гепатита В утки, вирусом гепатита 1 утки, вирусом гепатита 2 утки, дуовирусом, вирусом Duvenhage, вирусом деформированного крыла DWV, вирусом восточного конского энцефалита, вирусом восточного конского энцефаломиелита, вирусом ЕВ, вирусом Эбола, похожим на Эбола вирусом, эховирусом, эховирусом, эховирусом 10, эховирусом 28, эховирусом 9, вирусом эктромелии, вирусом ЕЕЕ, вирусом EIA, вирусом EIA, вирусом энцефалита, вирусом группы энцеф ало миокардитов, вирусом энцеф ало миокардита, энтеровирусом, повышающим содержание ферментов вирусом, повышающим содержание ферментов вирусом (LDH), вирусом эпидемической геморрагической лихорадки, вирусом эпизоотической геморрагической болезни, вирусом Эпштейна-Барра, альфа-герпесвирусом лошадей 1, альфа-герпесвирусом лошадей 4, альфа-герпесвирусом лошадей 2, вызываемым аборт у лошадей вирусом, вирусом лошадиного артериита, вирусом энцефалоза лошадей, вирусом инфекционной анемии лошадей, морбилливирусом лошадей, вирусом ринопневмонита лошадей, риновирусом лошадей, вирусом Eubenangu, вирусом европейской папилломы лося, вирусом европейской чумы свиней, вирусом Everglades, вирусом Eyach, вирусом кошачьего герпеса 1, кошачьим калицивирусом, вирусом фибросаркомы кошек, вирусом герпеса кошек, вирусом иммунодефицита кошек, вирусом инфекционного перитонита кошек, вирусом лейкоза/саркомы кошек, вирусом лейкоза кошек, вирусом панлейкопении кошек, парвовирусом кошек, вирусом саркомы кошек, синцитиальным вирусом кошек, филовирусом, вирусом Фландерс, флавивирусом, вирусом ящура, вирусом Fort Morgan, хантавирусом Four Corners, вирусом домашней птицы 1, вирусом оспы кур, вирусом Фрэнд, гаммаретровирусом, вирусом гепатита GB, вирусом GB, вирусом немецкой кори, вирусом Гета, вирусом лейкоза гиббоновых обезьян, вирусом инфекционного мононуклеоза, вирусом козьей оспы, вирусом золотого нотемигонуса, вирусом Gonometa, вирусом парвовируса гусей, вирусом гранулезной болезни, вирусом Гросса, вирусом гепатита В сусликов, арбовирусом группы А, вирусом Guanarito, цитомегаловирусом морской свинки, вирусом типа С морской свинки, вирусом Хантаан, хантавирусом, реовирусом твердого моллюска, вирусом фибромы зайцев, HCMV (цитомегаловирусом человека), вирусом гемадсорбции 2, гемагглютинирующим вирусом Японии, вирусом геморрагической лихорадки, вирусом Хендра, вирусом Нипах, вирусом гепатита кошек, вирусом гепатита А, группой вирусов гепатита В, вирусом гепатита С, вирусом гепатита D, вирусом гепатита дельта, вирусом гепатита Е, вирусом гепатита F, вирусом гепатита G, вирусом гепатита nonA, вирусом гепатита nonB, вирусом гепатита (нечеловеческим), реовирусом гепатоэнцеф ало миелита 3, гепатовирусом, вирусом гепатита В цапли, вирусом герпеса В, вирусом простого герпеса, вирусом простого герпеса 1, вирусом простого герпеса 2, вирусом простого герпеса 2, герпесвирусом, герпесвирусом 7, герпесвирусом паукообразной обезьяны, вирусом простого герпеса, вызывающим инфекцию герпесвирусом, вирусом герпеса Саймири, вызывающим болезнь Ауески вирусом, вирусом ветряной оспы, вирусом Highlands J, рабдовирусом азиатских паралихтов, вирусом холеры свиней, аденовирусом человека 2, альфа-герпесвирусом человека 1, альфа-герпесвирусом человека 2, альфа-герпесвирусом человека 3, В-лимфотропным вирусом человека, бета-герпесвирусом человека 5, коронавирусом человека, группой цитомегаловируса человека, пенящим вирусом человека, гамма-герпесвирусом человека 4, гамма-герпесвирусом человека 6, вирусом гепатита А человека, группой герпесвируса 1 человека, группой герпесвируса 2 человека, группой герпесвируса 3 человека, группой герпесвируса 4 человека, герпесвирусом человека 6, герпесвирусом человека 8, вирусом иммунодефицита человека, вирусом 1 иммунодефицита человека, вирусом 2 иммунодефицита человека, вирусом папилломы человека, вирусом Т-клеточного лейкоза человека, вирусом Т-клеточного лейкоза I человека, вирусом Т-клеточного лейкоза II человека, вирусом Т-клеточного лейкоза III человека, вирусом Т-клеточной лимфомы I человека, вирусом Т-клеточной лимфомы II человека, лимфотропным вирусом типа 1 Т-клеток человека, лимфотропным вирусом типа 2 Т-клеток человека, Т-лимфотропным вирусом I человека, Т-лимфотропным вирусом II человека, Т-лимфотропным вирусом III человека, ихновирусом, вирусом детского гастроэнтерита, вирусом инфекционного бычьего ринотрахеита, вирусом инфекционного гематопоэтического панкреоза, вирусом некроза, вирусом гриппа А, вирусом гриппа В, вирусом гриппа С, вирусом гриппа D, вирусом гриппа рг8, вирусом insect iridescent, вирусом насекомого, иридовирусом, японским вирусом В, вирусом японского энцефалита, вирусом JC, вирусом Junin, связанным с саркомой Капоши герпесвирусом, вирусом Кемерово, вирусом Килхэма крыс, вирусом Klamath, вирусом Kolongo, вирусом корейской геморрагической лихорадки, вирусом кумба, вирусом Киасанурской лесной болезни, вирусом Кызылагач, вирусом Ла Кросс, повышающим лактатдегидрогеназу вирусом, лактатдегидрогеназным вирусом, вирусом Лагос летучих мышей, вирусом лангура, парвовирусом кроликов, вирусом геморрагической лихорадки Ласса, вирусом Ласса, латентным вирусом крысы, вирусом LCM, вирусом Leaky, лентивирусом, лепорипоксвирусом, вирусом лейкоза, лейковирусом, вирусом нодулярного дерматоза, связанным с лимфаденопатией вирусом, лимфокриптовирусом, вирусом лимфоцитарного хориоменингита, группой лимфопролиферативных вирусов, вирусом геморрагической лихорадки Мачупо, вирусом инфекционного бульбарного паралича, группой онковирусов типа В млекопитающих, ретровирусами типа В млекопитающих, группой ретровирусов типа С млекопитающих, ретровирусами типа D млекопитающих, вирусом опухоли молочной железы, вирусом Mapuera, марбургским вирусом, марбургоподобным вирусом, обезьяним вирусом Мейсон-Пфайзер, мастаденовирусом, вирусом Майаро, вирусом ME, вирусом кори, вирусом Menangle, вирусом Менго, менговирусом, вирусом Мидделбурга, вирусом заболевания узелки доильщиц, вирусом энтерита норок, мелким вирусом мышей, связанным с MLV вирусом, вирусом ММ, вирусом Мокола, вирусом моллюсков, вирусом контагиозного моллюска, вирусом В обезьян, вирусом оспы обезьян, вирусами Mononegavirales, вирусом Morbillivirus, вирусом Elgon летучих мышей, цитомегаловирусом мышей, вирусом мышиного энцефаломиелита, вирусом мышиного гепатита, вирусом К мыши, вирусом мышиного лейкоза, вирусом опухоли молочной железы мышей, минутным вирусом мышей, вирусом мышиной пневмонии, вирусом мышиного полиомиелита, полиомавирусом мышей, вирусом саркомы мышей, вирусом мышиной оспы, вирусом Мозамбика, вирусом Mucambo, вирусом заболевания слизистых оболочек, вирусом паротита, бета-герпесвирусом 1 мышиных, цитомегаловирусом 2 мышиных, группой цитомегаловирусов мышиных, вирусом энцефаломиелита мышиных, вирусом гепатита мышиных, вирусом лейкоза мышиных, индуцирующим образование узелков вирусом мышиных, полиомавирусом мышиных, вирусом саркомы мышиных, муромегаловирусом, вирусом энцефалита долины Мюррея, вирусом миксомы, миксовирусом, миксовирусом мультиформным, вирусом Myxovirus parotitidis, вирусом Найроби овец, вирусом Nairovirus, вирусом Nanimavirus, вирусом Нарива, вирусом Ндумо, вирусом Neethling, вирусом Nelson Bay, нейротропным вирусом, аренавирусом New World, вирусом пневмонита новорожденных, вирусом ньюкаслской болезни, вирусом Нипах, нецитопатогенным вирусом, вирусом Норуолк, вирусом ядерного полиэдроза (NPV), вирусом nipple neck, вирусом лихорадки О'ньонг'ньонг, вирусом Оккельбо, онкогенным вирусом, онкогенной вирусоподобной частицей, онкорнавирусом, орбивирусом, вирусом Орф, вирусом Оропуш, ортогепаднавирусом, ортомиксо вирус ом, ортопоксвирусом, ортореовирусом, Орунго, папилломавирусом овец, овечьим вирусом катаральной лихорадки, герпесвирусом совинолицей мартышки, вирусом Пальям, папилломавирусом, папилломавирусом sylvilagi, паповавирусом, вирусом парагриппа, вирусом парагриппа типа 1, вирусом парагриппа типа 2, вирусом парагриппа типа 3, вирусом парагриппа типа 4, парамиксовирусом, парапоксвирусом, вирусом paravaccinia, парвовирусом, парвовирусом В19, группой парвовирусов, пестивирусом, флебовирусом, вирусом чумы свиней, пикоднавирусом, пикорнавирусом, вирусом цитомегаловируса свиней, вирусом оспы свиней, вирусом Piry, вирусом Pixuna, вирусом пневмонии мышей, пневмовирусом, вирусом полиомиелита, полиовирусом, полиднавирусом, вирусом ядерного полиэдрза, вирусом полиомы, полиомавирусом, Polyomavirus bovis, Polyomavirus cercopitheci, полиомавирусом человека 2, полиомавирусом макак 1, мышиным полиомавирусом 1, мышиным полиомавирусом 2, вирусом Polyomavirus papionis 1, вирусом Polyomavirus papionis 2, вирусом Polyomavirus sylvilagi, герпесвирусом орангутанов 1, вирусом эпидемической диареи свиней, вирусом гемагглютинирующего энцефаломиелита свиней, парвовирусом свиней, вирусом трансмиссивного гастроэнтерита свиней, вирусом типа С свиней, вирусом оспы, поксвирусом, вирусом poxvirus variolae, вирусом Prospect Hill, провирусом, вирусом псевдооспы коров, вирусом болезни Ауески, вирусом оспы попугаев, вирусом оспы перепелов, вирусом фибромы кролика, вакуолизирующим вирусом кролика, папилломавирусом кролика, вирусом бешенства, парвовирусом енота, вирусом оспы енота, вирусом Ranikhet, цитомегаловирусом крысы, парвовирусом крысы, вирусом крысы, вирусом Раушера, рекомбинантным вирусом коровьей оспы, рекомбинантным вирусом, реовирусом, реовирусом 1, реовирусом 2, реовирусом 3, вирусом типа С рептилий, вирусом респираторной инфекции, респираторно-синцитиальным вирусом, респираторным вирусом, вирусом ретикулоэндотелиоза, рабдовирусом, вирусом Rhabdovirus carpia, вирусом Rhadinovirus, риновирусом, ризидиовирусом, вирусом лихорадки Рифт-Валли, вирусом Райли, вирусом чумы крупного рогатого скота, вирусом РНК-опухоли, вирусом реки Росс, ротавирусом, вирусом rougeole, вирусом саркомы Рауса, вирусом краснухи, рубивирусом, вирусом русского осеннего энцефалита, вирусом обезьян SA 11, вирусом SA2, вирусом Сабиа, вирусом Sagiyama, вирусом Saimirine herpesvirus 1, вирусом слюнной железы, группой вирусов флеботомной лихорадки, вирусом Sandjimba, вирусом SARS, SDAV (вирусом сиалодакриоаденита), вирусом оспы, вирусом леса Семлики, вирусом Сеула, вирусом оспы овец, вирусом фибромы шопа, вирусом папилломы шопа, вакуолизирующим вирусом обезьян, вирусом гепатита А обезьян, вирусом человеческого иммунодефицита обезьян, вирусом иммунодефицита обезьян, вирусом парагриппа обезьян, лимфотрофным вирусом Т-клеток обезьян, вирусом обезьян, вирусом обезьян 40, вирусом Simplexvirus, вирусом Син Номбре, вирусом лихорадки Синдбис, вирусом натуральной оспы, вирусом геморрагической лихорадки Южной Америки, вирусом воробьиной оспы, спумавирусом, вирусом фибромы белок, ретровирусом беличьей обезьяны, группой вирусов SSV 1, типом I STLV (Т-лимфотропным вирусом обезьяны), типом II STLV (Т-лимфотропным вирусом обезьяны), типом III STLV (Т-лимфотропным вирусом обезьяны), вирусом папулезного стоматита, субмаксиллярным вирусом, вирусом герпеса свиней 1, вирусом герпеса свиней 2, вирусом Suipoxvirus, вирусом болотной лихорадки, вирусом оспы свиней, вирусом лейкоза мышей линии Swiss, вирусом ТАС, вирусом комплекса Tacaribe, вирусом Tacaribe, танапоксвирусом, вирусом оспы песчанок, реовирусом Tench, вирусом энцефаломиелита Тейлера, вирусом Тейлера, вирусом Тогото, вирусом Thottapalayam, вирусом клещевого энцефалита, вирусом Tioman, тогавирусом, торовирусом, вирусом опухоли, вирусом Tupaia, вирусом ринотрахеита индейки, вирусом оспы индейки, ретровирусом типа С, онковирусом типа D, группой ретровирусов типа D, рабдовирусом язвенного заболевания, вирусом Una, группой вирусов Uukuniemi, вирусом коровьей оспы, вакуолизирующим вирусом, вирусом ветряной оспы, вирусом Varicellovirus, вирусом Varicola, вирусом variola major, вирусом натуральной оспы, вирусом болезни Уасингишу, вирусом VEE, вирусом венесуэльского энцефалита лошадей, вирусом венесуэльского энцефаломиелита лошадей, вирусом венесуэльской геморрагической лихорадки, вирусом везикулярного стоматита, везикул о вирусом, вирусом вилюйского энцефаломиелита, ретровирусом гадюки, вирусом геморрагической септицемии, вирусом Visna Maedi, вирусом Visna, volepox virus, VSV (вирусом везикулярного стоматита), вирусом Wallal, вирусом Warrego, вирусом бородавок, вирусом WEE, вирусом Западного Нила, вирусом западного энцефалита лошадей, вирусом западного энцефаломиелита лошадей, вирусом Whataroa, вирусом зимней рвоты, вирусом гепатита В сурка, вирусом саркомы шерстистой обезьяны, вирусом раневой опухоли, вирусом WRSV, вирусом опухоли обезьяны Ябы, вирусом Ябы, вирусом Yatapoxvirus, вирусом желтой лихорадки или вирусом Yug Bogdanovac.

[253] Согласно некоторым вариантам осуществления патогенная инфекция вызывается ретровирусом. Иллюстративные ретровирусы включают в себя, без ограничения, вирус иммунодефицита человека (HIV), вирусы Т-клеточного лейкоза человека (HTLV), вирус мышиного лейкоза Молони (MuLV), вирус опухоли молочной железы мыши (MMTV), вирусы птичьего лейкоза и саркомы или вирус обезьян Мейсон-Пфайзер.

[254] Согласно некоторым вариантам осуществления описанный в настоящем документе конъюгат цитокина (например, конъюгат IL-2) вводят субъекту с ретровирусной инфекцией или в течение латентного периода для уменьшения и/или устранения инфицированных клеток, которые находятся в периоде покоя. В некоторых случаях ретровирус включает в себя вирус иммунодефицита человека (HIV), вирусы Т-клеточного лейкоза человека (HTLV), вирус мышиного лейкоза Молони (MuLV), вирус опухоли молочной железы мыши (MMTV), вирусы птичьего лейкоза и саркомы или вирус обезьян Мейсон-Пфайзер. В некоторых случаях конъюгат цитокина перенаправляет CD8+ Т-клетки для распознавания и уничтожения инфицированных клеток, находящихся в состоянии покоя.

[255] В некоторых случаях конъюгат цитокина представляет собой конъюгат IL-2. В некоторых случаях конъюгат IL-2 вводят субъекту с ретровирусной инфекцией или в течение латентного периода для уменьшения и/или устранения инфицированных клеток, находящихся в периоде покоя. В некоторых случаях ретровирус включает в себя вирус иммунодефицита человека (HIV), вирусы Т-клеточного лейкоза человека (HTLV), вирус мышиного лейкоза Молони (MuLV), вирус опухоли молочной железы мыши (MMTV), вирусы птичьего лейкоза и саркомы или вирус обезьян Мейсон-Пфайзер. В некоторых случаях конъюгат IL-2 перенаправляет CD8+Т-клетки для распознавания и уничтожения инфицированных клеток, находящихся в состоянии покоя. В дополнительных случаях конъюгат IL-2 вводят субъекту в сочетании с антиретровирусной терапией.

[256] Согласно некоторым вариантам осуществления ретровирус представляет собой HIV. В некоторых случаях описанный в настоящем документе конъюгат цитокина (например, конъюгат IL-2) вводят субъекту с синдромом приобретенного иммунодефицита (AIDS) или в течение латентного периода для уменьшения и/или устранения инфицированных HIV клеток (например, CD4+ Т-клеток), которые находятся в состоянии покоя. В некоторых случаях конъюгат цитокина представляет собой конъюгат IL-2. В некоторых случаях конъюгат IL-2 вводят субъекту в сочетании с антиретровирусной терапией. Иллюстративная антиретровярусная терапия HIV включает в себя:

[257] такие нуклеозидные ингибиторы обратной транскриптазы (NRTI), как абакавир, эмтрицитабин, ламивудин, тенофовир дисопроксилфумарат и зидовудин;

[258] такие ненуклеозидные ингибиторы обратной транскриптазы (NNRTI), как эфавиренц, этравирин, невирапин или рилпивирин;

[259] такие ингибиторы протеазы (PI), как атазанавир, дарунавир, фосампренавир, ритонавир, саквинавир и типранавир;

[260] такие ингибиторы слияния, как энфувиртид;

[261] такие антагонисты CCR5, как маравирок;

[262] такие ингибиторы интегразы, как долутегравир и ралтегравир;

[263] такие ингибиторы после прикрепления, как ибализумаб;

[264] такие фармакокинетические энхансеры, как кобицистат; и

[265] такие коктейли, как абакавир и ламивудин; абакавир, долутегравир и ламивудин; абакавир, ламивудин и зидовудин; атазанавир и кобицистат; биктегравир, эмтрицитабин и тенофовир алафенамид; дарунавир и кобицистат; долутегравир и рилпивирин; эфавиренц, эмтрицитабин и тенофовир дисопроксилфумарат; эфавиренц, ламивудин и тенофовир дисопроксилфумарат; эфавиренц, ламивудин и тенофовир дисопроксилфумарат; элвитегравир, кобицистат, эмтрицитабин и тенофовир алафенамидфумарат; элвитегравир, кобицистат, эмтрицитабин и тенофовир дисопроксилфумарат; эмтрицитабин, рилпивирин и тенофовир алафенамид; эмтрицитабин, рилпивирин и тенофовир дисопроксилфумарат; эмтрицитабин и тенофовир алафенамид; эмтрицитабин и тенофовир дисопроксилфумарат; ламивудин и тенофовир дисопроксилфумарат; ламивудин и зидовудин; и лопинавир и ритонавир.

[266] В некоторых случаях конъюгат IL-2 вводят субъекту в комбинации с антиретровирусной терапией, такой как нуклеозидные ингибиторы обратной транскриптазы (NRTI), такие как абакавир, эмтрицитабин, ламивудин, тенофовир дисопроксилфумарат и зидовудин; ненуклеозидные ингибиторы обратной транскриптазы (NNRTI), такие как эфавиренц, этравирин, невирапин или рилпивирин; ингибиторы протеазы (PI), такие как атазанавир, дарунавир, фосампренавир, ритонавир, саквинавир и типранавир; такие ингибиторы слияния, как энфувиртид; такие антагонисты CCR5, как маравирок; такие ингибиторы интегразы, как долутегравир и ралтегравир; такие ингибиторы после прикрепления, как ибализумаб; такие фармакокинетические энхансеры, как кобицистат; или такие коктейли, как абакавир и ламивудин; абакавир, долутегравир и ламивудин; абакавир, ламивудин и зидовудин; атазанавир и кобицистат; биктегравир, эмтрицитабин и тенофовир алафенамид; дарунавир и кобицистат; долутегравир и рилпивирин; эфавиренц, эмтрицитабин и тенофовир дисопроксилфумарат; эфавиренц, ламивудин и тенофовир дисопроксилфумарат; эфавиренц, ламивудин и тенофовир дисопроксилфумарат; элвитегравир, кобицистат, эмтрицитабин и тенофовир алафенамид фумарат; элвитегравир, кобицистат, эмтрицитабин и тенофовир дисопроксилфумарат; эмтрицитабин, рилпивирин и тенофовир алафенамид; эмтрицитабин, рилпивирин и тенофовир дисопроксилфумарат; эмтрицитабин и тенофовир алафенамид; эмтрицитабин и тенофовир дисопроксилфумарат; ламивудин и тенофовир дисопроксилфумарат; ламивудин и зидовудин и лопинавир и ритонавир.

[267] Согласно некоторым вариантам осуществления вирус представляет собой вирус гепатита, например гепатита А, В, С, D или Е. В некоторых случаях описанный в настоящем документе конъюгат цитокина (например, конъюгат IL-2) вводят субъекту с инфекцией гепатита или в течение латентного периода для уменьшения и/или устранения инфицированных клеток, находящихся в периоде покоя. В некоторых случаях конъюгат цитокина перенаправляет CD8+Т-клетки для распознавания и уничтожения инфицированных клеток, находящихся в состоянии покоя.

[268] В некоторых случаях конъюгат цитокина представляет собой конъюгат IL-2. В некоторых случаях конъюгат IL-2 вводят субъекту с инфекцией гепатита или в течение латентного периода для уменьшения и/или устранения инфицированных клеток, находящихся в состоянии покоя. В некоторых случаях конъюгат IL-2 перенаправляет CD8+ Т-клетки для распознавания и уничтожения инфицированных клеток, находящихся в состоянии покоя. В некоторых случаях конъюгат IL-2 вводят субъекту в комбинации с противовирусной терапией. Иллюстративная противовирусная терапия гепатита включает в себя рибавирин; такие ингибиторы протеазы NS3/4A, как паритапревир, симепревир и гразопревир; такие ингибиторы протеазы NS5A, как ледипасвир, омбитасвир, эльбасвир и даклатасвир; такие нуклеотидные/нуклеозидные и ненуклеозидные ингибиторы полимераз NS5B, как софосбувир и дасабувир; и такие комбинации, как ледипасвир-софосбувир, дасабувир-омбитасвир-паритапревир-ритонавир; эльбасвир-гразопревир, омбитасвир-паритапревир-ритонавир, софосбувир-велпатасвир, софосбувир-велпатасвир-воксилапревир и гликапревир-пибрентасвир и такие интерфероны, как пегинтерферон альфа-2а, пегинтерферон альфа-2b и интерферон альфа-2b. В некоторых случаях конъюгат IL-2 вводят субъекту в комбинации с противовирусной терапией, такой как рибавирин; такими ингибиторами протеазы NS3/4A, как паритапревир, симепревир и гразопревир; такими ингибиторами протеазы NS5A, как ледипасвир, омбитасвир, эльбасвир и даклатасвир; такими нуклеотидными/нуклеозидными и ненуклеозидными ингибиторами полимераз NS5B, как софосбувир и дасабувир; и такими комбинациями, как ледипасвир-софосбувир, дасабувир-омбитасвир-паритапревир-ритонавир; эльбасвир-гразопревир, омбитасвир-паритапревир-ритонавир, софосбувир-велпатасвир, софосбувир-велпатасвир-воксилапревир и гликапревир-пибрентасвир; и такими интерферонами, как пегинтерферон альфа-2а, пегинтерферон альфа-2b и интерферон альфа-2b.

Способы экспансии клеточной популяции

[269] Согласно некоторым вариантам осуществления дополнительно описаны в настоящем документе способы экспансии популяций лимфоцитов, например, популяций CD4+ хелперных клеток, CD8+ эффекторных наивных клеток и клеток памяти, NK-клеток и/или NKT-клеток. В некоторых случаях способ предусматривает контактирование клетки с описанным в настоящем документе конъюгатом цитокина и взаимодействие цитокина с рецептором цитокина с образованием комплекса, причем комплекс стимулирует экспансию отдельной популяции лимфоцитов.

[270] Согласно некоторым вариантам осуществления способ экспансии популяции CD4+ хелперных клеток, CD8+ эффекторных наивных клеток и клеток памяти, клеток естественных киллеров (NK) и/или Т-клеток естественных киллеров (NKT) предусматривает контактирование клетки с описанным выше выделенным и модифицированным полипептидом IL-2 в течение времени, достаточного для индукции образования комплекса с IL-2Rβ, тем самым стимулируя экспансию популяции клеток TefF и/или NK. В некоторых случаях способ экспансии популяций CD4+ хелперных клеток, CD8+ эффекторных наивных клеток и клеток памяти, NK-клеток и/или NKT-клеток предусматривает (а) контактирование клеточной популяции с описанным в настоящем документе конъюгатом IL-2 и (b) взаимодействие IL-2 с субъединицами IL-2Rβ и IL-2βγ с образованием комплекса IL-2/IL-2Rβγ; причем конъюгат IL-2 обладает сниженной аффинностью к субъединице IL-2Rα, и причем комплекс IL-2/IL-2Rβγ стимулирует экспансию CD4+ хелперных клеток, CD8+ эффекторных наивных клеток и клеток памяти, NK-клеток и/или NKT-клеток. Как описано выше, конъюгат IL-2 содержит выделенный и очищенный полипептид IL-2 и конъюгирующий фрагмент, который связывается с выделенным и очищенным полипептидом IL-2 в положении аминокислоты, выбранном из K35, Т37, R38, Т41, F42, K43, F44, Y45, Е60, Е61, Е62, K64, Р65, Е68, V69, N71, L72, М104, С105 и Y107, причем нумерация аминокислотных остатков соответствует SEQ ID NO:1. В некоторых случаях положение аминокислоты выбрано из K35, Т37, R38, Т41, F42, K43, F44, Y45, Е61, Е62, Е68, K64, Р65, V69, L72 и Y107. В некоторых случаях положение аминокислоты выбрано из Т37, R38, Т41, F42, F44, Y45, Е61, Е62, Е68, K64, Р65, V69, L72 и Y107. В некоторых случаях положение аминокислоты выбрано из Т37, R38, Т41, F42, F44, Y45, Е61, Е62, Е68, Р65, V69, L72 и Y107. В некоторых случаях положение аминокислоты выбрано из Т37, Т41, F42, F44, Y45, Р65, V69, L72 и Y107. В некоторых случаях положение аминокислоты выбрано из R38 и K64. В некоторых случаях положение аминокислоты выбрано из Е61, Е62 и Е68. В некоторых случаях положение аминокислоты находится в Е62.

[271] В некоторых случаях конъюгат IL-2 вызывает экспансию CD4+ Т регуляторных (Treg) клеток менее чем на 20%, 15%, 10%, 5% или 1% в клеточной популяции. В некоторых случаях конъюгат IL-2 не вызывает экспансию CD4+ Treg-клеток в клеточной популяции. В некоторых случаях отношение клеток Teff к клеткам Treg в клеточной популяции после инкубации с выделенным и модифицированным полипептидом IL-2 составляет по меньшей мере 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 20:1, 50:1 или 100:1. В некоторых случаях отношение клеток Teff к клеткам Treg в клеточной популяции после инкубации с выделенным и модифицированным полипептидом IL-2 составляет около 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 20:1, 50:1 или 100:1.

[272] В некоторых случаях время, достаточное для индуцирования образования комплекса с IL-2Rβ, составляет по меньшей мере 5 минут, 10 минут, 15 минут, 20 минут, 30 минут, 1 час, 2 часа, 3 часа, 4 часа, 5 часов, 8 часов, 10 часов, 12 часов, 18 часов, 24 часа, 2 дня, 3 дня, 4 дня, 5 дней, 6 дней или 7 дней. В некоторых случаях время, достаточное для индуцирования образования комплекса с IL-2Rβ, составляет около 5 минут, 10 минут, 15 минут, 20 минут, 30 минут, 1 час, 2 часа, 3 часа, 4 часа, 5 часов, 8 часов, 10 часов, 12 часов, 18 часов, 24 часа, 2 дня, 3 дня, 4 дня, 5 дней, 6 дней или 7 дней.

[273] В некоторых случаях способ представляет собой способ in vivo.

[274] В некоторых случаях способ представляет собой способ in vitro.

[275] В некоторых случаях способ представляет собой способ ex vivo.

Производство полипептидов цитокинов

[276] В некоторых случаях описанные в настоящем документе полипептиды цитокины (например, интерлейкин, IFN или TNF), содержащие либо природную аминокислотную мутацию, либо неприродную аминокислотную мутацию, производятся рекомбинантно или синтезируются химически. В некоторых случаях описанные в настоящем документе полипептиды цитокины (например, IL-2) производятся рекомбинантно, например, либо системой клеток-хозяев, либо в бесклеточной системе.

[277] В некоторых случаях полипептиды цитокины (например, IL-2) производятся рекомбинантно через систему клеток-хозяев. В некоторых случаях клетка-хозяин представляет собой эукариотическую клетку (например, клетку млекопитающего, клетки насекомых, дрожжевые клетки или растительную клетку) или прокариотическую клетку (например, грамположительной бактерии или грамотрицательной бактерии). В некоторых случаях эукариотическая клетка-хозяин представляет собой клетку-хозяина млекопитающего. В некоторых случаях клетка-хозяин млекопитающего представляет собой стабильную клеточную линию или клеточную линию, которая включила представляющий интерес генетический материал в свой собственный геном и обладает способностью экспрессировать продукт генетического материала после многих поколений клеточного деления. В других случаях клетка-хозяин млекопитающего представляет собой временную клеточную линию или клеточную линию, которая не включила представляющий интерес генетический материал в свой собственный геном и не обладает способностью экспрессировать продукт генетического материала после многих поколений деления клеток.

[278] Иллюстративные клетки-хозяева млекопитающих включают в себя клеточную линию 293Т, клеточную линию 293А, клеточную линию 293FT, клетки 293F, клетки 293 H, клетки А549, клетки MDCK, клетки СНО DG44, клетки CHO-S, клетки СНО-K1, клетки Expi293F™, клеточную линию Flp-In™ T-REx™ 293, клеточную линию Flp-In™-293, клеточную линию Flp-In™-3T3, клеточную линию Flp-In™-BHK, клеточную линию Flp-In™-CHO, клеточную линию Flp-In™-CV-l, клеточную линию Flp-In™-Jurkat, клеточную линию FreeStyle™ 293-F, клетки FreeStyle™ CHO-S, клеточную линию GripTite™ 293 MSR, клеточную линию GS-CHO, клетки HepaRG™, клеточную линию Т-REx™ Jurkat, клетки Per.С6, клеточную линию T-REx™-293, клеточную линию T-REx™-СНО и клеточную линию T-REx™-HeLa.

[279] Согласно некоторым вариантам осуществления эукариотическая клетка-хозяин представляет собой клетку-хозяина насекомого. Иллюстративные клетки-хозяева насекомых включают в себя клетки S2 Drosophila, клетки Sf9, клетки Sf21, клетки High Five™ и клетки expresSF+®.

[280] Согласно некоторым вариантам осуществления эукариотическая клетка-хозяин представляет собой дрожжевую клетку-хозяина. Иллюстративные дрожжевые клетки-хозяева включают в себя штаммы дрожжей Pichia pastoris, такие как GS115, KM71H, SMD1168, SMD1168H и Х-33, и штамм дрожжей Saccharomyces cerevisiae, такой как INVScl.

[281] Согласно некоторым вариантам осуществления эукариотическая клетка-хозяин представляет собой растительную клетку-хозяина. В некоторых случаях растительные клетки включают в себя клетки из водорослей. Иллюстративные линии растительных клеток включают в себя штаммы Chlamydomonas reinhardtii 137с или Synechococcus elongatus РРС 7942.

[282] Согласно некоторым вариантам осуществления клетка-хозяин представляет собой прокариотическую клетку-хозяина. Иллюстративные прокариотические клетки-хозяева включают в себя BL21, Machl™, DH10B™, ТОР10, DH5α, DH10Bac™, OmniMax™, MegaX™, DH12S™, INV110, TOP10F', INVαF, TOP10/P3, ccdB Survival, PIR1, PIR2, Stb12™, Stb13™ или Stbl4™.

[283] В некоторых случаях подходящие молекулы или векторы полинуклеиновой кислоты для производства описанного в настоящем документе полипептида IL-2 включают в себя любые подходящие векторы, полученные из источника эукариот или прокариот. Иллюстративные молекулы или векторы полинуклеиновой кислоты включают в себя векторы из бактерий (например, E.coli), насекомых, дрожжей (например, Pichia pastoris), водорослей или млекопитающих. Бактериальные векторы включают в себя, например, векторные серии pACYC177, pASK75, pBAD, векторные серии pBADM, векторные серии рЕТ, векторные серии рЕТМ, векторные серии pGEX, рНАТ, рНАТ2, pMal-c2, pMal-p2, векторные серии pQE, pRSET A, pRSET В, pRSET С, серии pTrcHis2, pZA31-Luc, pZE21-MCS-1, pFLAG ATS, pFLAG CTS, pFLAG MAC, pFLAG Shift-12c, pTAC-MAT-1, pFLAG CTC или pTAC-MAT-2.

[284] Векторы насекомых включают в себя, например, pFastBac1, pFastBac DUAL, pFastBac ET, pFastBac HTa, pFastBac HTb, pFastBac HTc, pFastBac М30а, pFastBact M30b, pFastBac, M30c, pVL1392, pVL1393, pVL1393 M10, pVL1393 M11, pVL1393 M12, векторы FLAG, такие как pPolh-FLAGl или pPolh-MAT 2, или векторы MAT, такие как pPolh-МАТ1 или pPolh-MAT2.

[285] Векторы дрожжей включают в себя, например, вектор pDEST™ 14 Gateway®, вектор pDEST™ 15 Gateway®, вектор pDEST™ 17 Gateway®, вектор pDEST™ 24 Gateway®, вектор pYES-DEST52 Gateway®, вектор назначения pBAD-DEST49 Gateway®, вектор PA0815 Pichia, вектор pFLDl Pichi pastoris, вектор pGAPZA, В и С Pichia pastoris, вектор pPIC3.5K Pichia, вектор pPIC6 А, В и С Pichia, вектор pPIC9K Pichia, вектор дрожжей pTEFl/Zeo, pYES2, вектор дрожжей pYES2/CT, вектор дрожжей pYES2/NT А, В и С или вектор дрожжей pYES3/CT.

[286] Векторы водорослей включают в себя, например, вектор pChlamy-4 или вектор MCS.

[287] Векторы млекопитающих включают в себя, например, векторы временной экспрессии или векторы стабильной экспрессии. Иллюстративные векторы временной экспрессии млекопитающих включают в себя p3xFLAG-CMV 8, pFLAG-Myc-CMV 19, pFLAG-Myc-CMV 23, pFLAG-CMV 2, pFLAG-CMV 6a,b,c, pFLAG-CMV 5.1, pFLAG-CMV 5a,b,c, p3xFLAG-CMV 7.1, pFLAG-CMV 20, p3xFLAG-Myc-CMV 24, pCMV-FLAG-MAT1, pCMV-FLAG-MAT2, pBICEP-CMV 3 или pBICEP-CMV 4. Иллюстративные векторы стабильной экспрессии млекопитающих включают в себя pFLAG-CMV 3, p3xFLAG-CMV 9, P3xFLAG-CMV 13, pFLAG-Myc-CMV 21, P3xFLAG-Myc-CMV 25, pFLAG-CMV 4, p3xFLAG-CMV 10, p3xFLAG-CMV 14, pFLAG-Myc-CMV 22, p3xFLAG-Myc-CMV 26, pBICEP-CMV 1 или pBICEP-CMV 2.

[288] В некоторых случаях используется бесклеточная система для производства описанного в настоящем документе полипептида цитокина (например, IL-2). В некоторых случаях бесклеточная система содержит смесь цитоплазматических и/или ядерных компонентов клетки и подходит для синтеза нуклеиновых кислот in vitro. В некоторых случаях в бесклеточной системе используются компоненты прокариотических клеток. В других случаях в бесклеточной системе используются компоненты эукариотических клеток. Синтез нуклеиновых кислот получают в бесклеточной системе на основе, например, клеток Drosophila, Xenopus egg, Archaea или HeLa. Иллюстративные бесклеточные системы включают в себя систему экстракта Е. coli S30, систему Е. coli Т7 S30 или PURExpress®, XpressCF и XpressCF+.

[289] Бесклеточные системы трансляции по-разному включают в себя компоненты, такие как плазмиды, мРНК, ДНК, тРНК, синтетазы, факторы высвобождения, рибосомы, белки-шапероны, факторы инициации и удлинения трансляции, природные и/или неприродные аминокислоты и/или другие компоненты, используемые для экспрессии белка. Такие компоненты необязательно модифицируют для улучшения выхода, увеличения скорости синтеза, повышения точности белкового продукта или включения неприродных аминокислот. Согласно некоторым вариантам осуществления описанные в настоящем документе цитокины синтезируют с использованием бесклеточных систем трансляции, описанных в US 8778631; US 2017/0283469; US 2018/0051065; US 2014/0315245 или US 8787831. Согласно некоторым вариантам осуществления бесклеточные системы трансляции содержат модифицированные факторы высвобождения или даже удаление одного или нескольких факторов высвобождения из системы. Согласно некоторым вариантам осуществления бесклеточные системы трансляции содержат пониженную концентрацию протеазы. Согласно некоторым вариантам осуществления бесклеточные системы трансляции содержат модифицированные тРНК с переназначенными кодонами, используемыми для кодирования неприродных аминокислот. Согласно некоторым вариантам осуществления описанные в настоящем документе синтетазы для включения неприродных аминокислот используются в бесклеточных системах трансляции. Согласно некоторым вариантам осуществления тРНК предварительно загружают неприродными аминокислотами с использованием ферментативных или химических способов перед добавлением в бесклеточную систему трансляции. Согласно некоторым вариантам осуществления компоненты для бесклеточной системы трансляции получают из модифицированных организмов, таких как модифицированные бактерии, дрожжи или другие организмы.

[290] Согласно некоторым вариантам осуществления полипептид цитокин (например, IL-2) производится в виде формы с циклическими перестановками либо через систему экспрессии с хозяином, либо через бесклеточную систему.

Получение полипептида цитокина, содержащего неприродную аминокислоту

[291] В настоящем документе может быть использован ортогональный или расширенный генетический код, в котором один или несколько специфических кодонов, присутствующих в последовательности нуклеиновой кислоты полипептида цитокина (например, IL-2), выделены для кодирования неприродной аминокислоты, так что он может быть генетически включен в цитокин (например, IL-2) с использованием ортогональной пары тРНК-синтетазы/тРНК. Ортогональная пара тРНК-синтетаза/тРНК способна заряжать тРНК неприродной аминокислотой и способна включать эту неприродную аминокислоту в полипептидную цепь в ответ на кодон.

[292] В некоторых случаях кодон представляет собой амбер-кодон, охра-кодон, опал-кодон или квадруплетный кодон. В некоторых случаях кодон соответствует ортогональной тРНК, которая будет использоваться для переноса неприродной аминокислоты. В некоторых случаях кодон представляет собой амбер-кодон. В других случаях кодон представляет собой ортогональный кодон.

[293] В некоторых случаях кодон представляет собой квадруплетный кодон, который может быть декодирован с помощью ортогональной рибосомы ribo-Q1. В некоторых случаях квадруплетный кодон является таким, как показано в Neumann, et at., "Encoding multiple unnatural amino acids via evolution of a quadruplet-decoding ribosome," Nature, 464(7287): 441-444 (2010).

[294] В некоторых случаях используемый в настоящем раскрытии кодон представляет собой перекодированный кодон, например, синонимичный кодон или редкий кодон, который заменен альтернативным кодоном. В некоторых случаях перекодированный кодон является таким, как описано в Napolitano, et al., "Emergent rules for codon choice elucidated by editing rare argine codons in Escherichia coli," PNAS, 113(38): E5588-5597 (2016). В некоторых случаях перекодированный кодон является таким, как описано в Ostrov et al., "Design, synthesis, and testing toward a 57-codon genome," Science 353(6301): 819-822 (2016).

[295] В некоторых случаях используются неприродные нуклеиновые кислоты, приводящие к включению одной или нескольких неприродных аминокислот в цитокин (например, IL-2). Иллюстративные неприродные нуклеиновые кислоты включают в себя, без ограничения, урацил-5-ил, гипоксантин-9-ил (I), 2-аминоаденин-9-ил, 5-метилцитозин (5-me-С), 5-гидроксиметилцитозин, ксантин, гипоксантин, 2-аминоаденин, 6-метил и другие алкильные производные аденина и гуанина, 2-пропил и другие алкильные производные аденина и гуанина, 2-тиоурацил, 2-тиотимин и 2-тиоцитозин, 5-галоурацил и цитозин, 5-пропинилурацил и цитозин, 6-азоурацил, цитозин и тимин, 5-урацил (псевдоурацил), 4-тиоурацил, 8-галоген, 8-амино, 8-тиол, 8-тиоалкил, 8-гидроксил и другие 8-замещенные аденины и гуанины, 5-галоген, в частности 5-бром, 5-трифторметил и другие 5-замещенные урацилы и цитозины, 7-метилгуанин и 7-метиладенин, 8-азагуанин и 8-азааденин, 7-деазагуанин и 7-деазааденин и 3-деазагуанин и 3-деазааденин. Определенные неприродные нуклеиновые кислоты, такие как 5-замещенные пиримидины, 6-азапиримидины и N-2-замещенные пурины, N-6-замещенные пурины, O-6-замещенные пурины, 2-аминопропиладенин, 5-пропинилурацил, 5-пропинилцитозин, 5-метилцитозин, те, которые повышают стабильность образования дуплекса, универсальные нуклеиновые кислоты, гидрофобные нуклеиновые кислоты, разнородные нуклеиновые кислоты, нуклеиновые кислоты с увеличенным размером, фторированные нуклеиновые кислоты, 5-замещенные пиримидины, 6-азапиримидины и N-2, N-6 и O-6 замещенные пурины, в том числе 2-аминопропиладенин, 5-пропинилурацил и 5-пропинилцитозин, 5-метилцитозин (5-me-С), 5-гидроксиметилцитозин, ксантин, гипоксантин, 2-аминоаденин, 6-метил, другие алкильные производные аденина и гуанина, 2-пропил и другие алкильные производные аденина и гуанина, 2-тиоурацил, 2-тиотимин и 2-тиоцитозин, 5-галоурацил, 5-галоцитозин, 5-пропинил (-С≡С-С₃) урацил, 5-пропинилцитозин, другие алкинильные производные пиримидиновых нуклеиновых кислот, 6-азоурацил, 6-азо-цитозин, 6-азотимин, 5-урацил (псевдоурацил), 4-тиоурацил, 8-гало, 8-амино, 8-тиол, 8-тиоалкил, 8-гидроксил и другие 8-замещенные аденины и гуанины, 5-галоген, в частности 5-бром, 5-трифторметил, другие 5-замещенные урацилы и цитозины, 7-метилгуанин, 7-метиладенин, 2-F-аденин, 2-аминоаденин, 8-азагуанин, 8-азааденин, 7-деазагуанин, 7-деазааденин, 3-деазагуанин, 3-деазааденин, трициклические пиримидины, феноксазинцитидин([5,4-b][1,4]бензоксазин-2(3Н)-он), фенотиазинцитидин(1Н-пиримидо[5,4]-b][1,4]бензотиазин-2(3Н)-он), G-фиксаторы, феноксазинцитидин (например, 9-(2-аминоэтокси)-Н-пиримидо[5,4-b][1,4]бензоксазин-2(3Н)-он), карбазолцитидин(2Н-пиримидо[4,5-b]индол-2-он), пиридоиндолцитидин(Н-пиридо[3',2':4,5]пирроло[2,3-d]пиримидин-2-он), в котором пуриновое или пиримидиновое основание заменено другими гетероциклами, 7-деазааденин, 7-деазагуанозин, 2-аминопиридин, 2-пиридон, азацитозин, 5-бромцитозин, бромурацил, 5-хлорцитозин, хлорированный цитозин, циклоцитозин, цитозинарабинозид, 5-фторцитозин, фторпиримидин, фторурацил, 5,6-дигидроцитозин, 5-йодцитозин, гидроксимочевина, йодурацил, 5-нитроцитозин, 5-бромурацил, 5-хлорурацил, 5-фторурацил и 5-йодурацил, 2-аминоаденин, 6-тиогуанин, 2-тиотимин, 4-тиотимин, 5-пропинилурацил, 4-тиоурацил, N4-этилцитозин, 7-деазагуанин, 7-деаза-8-азагуанин, 5-гидроксицитозин, 2'-дезоксиуридин, 2-амино-2'-дезоксиаденозин и те, которые описаны в патентах США №3687808; 4845205; 4910300; 4948882; 5093232; 5130302; 5134066; 5175273; 5367066; 5432272; 5457187; 5459255; 5484908; 5502177; 5525711; 5552540; 5587469; 5594121; 5596091; 5614617; 5645985; 5681941; 5750692; 5763588; 5830653 и 6005096; WO 99/62923; Kandimalla et al., (2001) Bioorg. Med. Chem. 9:807-813; The Concise Encyclopedia of Polymer Science and Engineering, Kroschwitz, J.I., Ed., John Wiley & Sons, 1990, 858-859; Englisch et al., Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613 и Sanghvi, Chapter 15, Antisense Research and Applications, Crookeand Lebleu Eds., CRC Press, 1993, 273-288 Дополнительные модификации оснований можно найти, например, в патенте США №№3687808; Englisch et al., Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613 и Sanghvi, Chapter 15, Antisense Research and Applications, pages 289-302, Crooke and Lebleu ed., CRC Press, 1993.

[296] Неприродные нуклеиновые кислоты, содержащие различные гетероциклические основания и различные фрагменты сахара (и аналоги сахара), доступны в настоящей области техники, и нуклеиновые кислоты в некоторых случаях включают в себя одно или несколько гетероциклических оснований, отличных от основных пяти компонентов оснований встречающихся в природе нуклеиновых кислот. Например, гетероциклическое основание включает в себя, в некоторых случаях, группы урацил-5-ил, цитозин-5-ил, аденин-7-ил, аденин-8-ил, гуанин-7-ил, гуанин-8-ил, 4-аминопирроло[2,3-d]пиримидин-5-ил, 2-амино-4-оксопироло[2,3-d]пиримидин-5-ил, 2-амино-4-оксопирроло[2,3-d]пиримидин-3-ил, где пурины присоединены к фрагменту сахара нуклеиновой кислоты через положение 9, пиримидины через положение 1, пирролопиримидины через положение 7 и пиразолопиримидины через положение 1.

[297] Согласно некоторым вариантам осуществления нуклеотидные аналоги также модифицированы в фосфатной части. Модифицированные фосфатные фрагменты включают в себя, без ограничения, те, которые имеют модификацию в связи между двумя нуклеотидами и содержат, например, фосфоротиоат, хиральный фосфоротиоат, фосфородитиоат, фосфотриэфир, аминоалкилфосфотриэфир, метил и другие алкилфосфонаты, включая в себя 3'-алкиленфосфонат и хиральные фосфонаты, фосфинаты, фосфорамидаты, включая в себя 3'-аминофосфорамидат и аминоалкилфосфорамидаты, тионофосфорамидаты, тионоалкилфосфонаты, тионоалкилфосфотриэфиры и боранофосфаты. Понятно, что эти фосфатные или модифицированные фосфатные связи между двумя нуклеотидами проходят через 3'-5' связь или 2'-5' связь, и эта связь содержит обратную полярность, такую как от 3'-5' к 5'-3' или от 2'-5' к 5'-2'. Различные соли, смешанные соли и формы свободных кислот также включены. Многочисленные патенты США описывают, как производить и применять нуклеотиды, содержащие модифицированные фосфаты, и включают в себя, без ограничения, 3687808; 4469863; 4476301; 5023243; 5177196; 5188897; 5264423; 5276019; 5278302; 5286717; 5321131; 5399676; 5405939; 5453496; 5455233; 5466677; 5476925; 5519126; 5536821; 5541306; 5550111; 5563253; 5571799; 5587361 и 5625050.

[298] Согласно некоторым вариантам осуществления неприродные нуклеиновые кислоты включают в себя 2,3'-дидезокси-2',3,-дидегидро-нуклеозиды (PCT/US 2002/006460), 5'-замещенные производные ДНК и РНК (PCT/US 2011/033961); Saha et al., J. Org Chem., 1995, 60, 788-789; Wang et al., Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 1999, 9, 885-890 и Mikhailov et al., Nucleosides & Nucleotides, 1991, 10(1-3), 339-343; Leonid et al., 1995, 14(3-5), 901-905; и Eppacher et al., Helvetica Chimica Acta, 2004, 87, 3004-3020; PCT/JP 2000/004720; PCT/JP 2003/002342; PCT/JP 2004/013216; PCT/JP 2005/020435; PCT/JP 2006/315479; PCT/JP 2006/324484; PCT/JP 2009/056718; PCT/JP 2010/067560) или 5'-замещенные мономеры, полученные в виде монофосфата с модифицированными основаниями (Wang et al., Nucleosides Nucleotides & Nucleic Acids, 2004, 23 (1 & 2), 317-337).

[299] Согласно некоторым вариантам осуществления неприродные нуклеиновые кислоты включают в себя модификации в 5'-положении и 2'-положении сахарного кольца (PCT/US 94/02993), такие как 5'-СН₂-замещенный 2'-O-защищенный нуклеозиды (Wu et al., Helvetica Chimica Acta, 2000, 83, 1127-1143 и Wu et al., Bioconjugate Chem. 1999, 10, 921-924). В некоторых случаях неприродные нуклеиновые кислоты включают в себя амидосвязанные нуклеозидные димеры, полученные для включения в олигонуклеотиды, где 3' связанный нуклеозид в димере (от 5' к 3') содержит 2'-ОСН₃ и 5'-(S)-CH₃ (Mesmaeker et al., Synlett, 1997, 1287-1290). Неприродные нуклеиновые кислоты могут включать в себя 2'-замещенные 5'-CH₂ (или О) модифицированные нуклеозиды (PCT/US 92/01020). Неприродные нуклеиновые кислоты могут включать в себя 5'-метиленфосфонатные ДНК и РНК-мономеры и димеры (Bohringer et al., Tet. Lett., 1993, 34, 2723-2726; Collingwood et al., Synlett, 1995, 7, 703-705 и Hutter et al., Helvetica Chimica Acta, 2002, 85, 2777-2806). Неприродные нуклеиновые кислоты могут включать в себя 5'-фосфонатные мономеры, содержащие 2'-замену (US 2006/0074035), и другие модифицированные 5'-фосфонатные мономеры (WO 1997/35869). Неприродные нуклеиновые кислоты могут включать в себя 5'-модифицированные метиленфосфонатные мономеры (ЕР 614907 и ЕР 629633). Неприродные нуклеиновые кислоты могут включать в себя аналоги 5' или 6'-фосфонатных рибонуклеозидов, содержащих гидроксильную группу в 5' и/или 6'-положении (Chen et al., Phosphorus, Sulfur and Silicon, 2002, 777, 1783-1786; Jung et al., Bioorg. Med. Chem., 2000, 8, 2501-2509; Gallier et al., Eur. J. Org. Chem., 2007, 925-933 и Hampton et al., J. Med. Chem., 1976, 19(8), 1029-1033). Неприродные нуклеиновые кислоты могут включать в себя 5'-фосфонатные дезоксирибонуклеозидные мономеры и димеры, содержащие 5'-фосфатную группу (Nawrot et al., Oligonucleotides, 2006, 16 (1), 68-82). Неприродные нуклеиновые кислоты могут включать в себя нуклеозиды, содержащие 6'-фосфонатную группу, в которой положение 5' или/и 6' является незамещенным или замещенным тио-трет-бутильной группой (SC(CH₃)₃) (и ее аналогами); метиленаминогруппой (CH₂NH₂) (и ее аналогами) или цианогруппой (CN) (и ее аналогами) (Fairhurst et al., Synlett, 2001, 4, 467-472; Kappler et al., J. Med. Chem., 1986, 29, 1030-1038; Kappler et al., J. Med. Chem., 1982, 25, 1179-1184; Vrudhula et al., J. Med. Chem., 1987, 30, 888-894; Hampton et al., J. Med. Chem., 1976, 19, 1371-1377; Geze et al., J. Am. Chem. Soc, 1983, 105(26), 7638-7640 и Hampton et al., J. Am. Chem. Soc, 1973, 95(13), 4404-4414).

[300] Согласно некоторым вариантам осуществления неприродные нуклеиновые кислоты также включают в себя модификации фрагмента сахара. В некоторых случаях нуклеиновые кислоты содержат один или несколько нуклеозидов, в которых группа сахара была модифицирована. Такие нуклеозиды с модифицированным сахаром могут придавать повышенную стабильность к нуклеазам, повышенную аффинность связывания или некоторые другие полезные биологические свойства. Согласно некоторым вариантам осуществления нуклеиновые кислоты содержат химически модифицированный фрагмент рибофуранозного кольца. Примеры химически модифицированных рибофуранозных колец включают в себя, без ограничения, добавление групп заместителей (включая в себя 5' и/или 2' группы заместителей, мостик двух атомов кольца с образованием бициклических нуклеиновых кислот (BNA), замену атома кислорода рибозильного кольца на S, N(R) или C(R₁)(R₂) (R=H, С₁-С₁₂ алкил или защитная группа) и их комбинации. Примеры химически модифицированных Сахаров можно найти в WO 2008/101157, US 2005/0130923 и WO 2007/134181.

[301] В некоторых случаях модифицированная нуклеиновая кислота содержит модифицированные сахара или аналоги сахара. Таким образом, в дополнение к рибозе и дезоксирибозе группа сахара может представлять собой пентозу, дезоксипентозу, гексозу, дезоксигексозу, глюкозу, арабинозу, ксилозу, ликсозу или «аналог» циклопентильной группы сахара. Сахар может быть в пиранозильной или фуранозильной форме. Фрагмент сахара может представлять собой фуранозид рибозы, дезоксирибозы, арабинозы или 2'-O-алкилрибозы, и сахар может быть присоединен к соответствующим гетероциклическим основаниям либо в [альфа], либо в [бета] аномерной конфигурации. Модификации сахара включают в себя, без ограничения, 2'-алкокси-РНК-аналоги, 2'-амино-РНК-аналоги, 2'-фтор-ДНК и 2'-алкокси- или амино-РНК/ДНК-химеры. Например, модификация сахара может включать в себя 2'-O-метилуридин или 2'-O-метилцитидин. Модификации сахара включают в себя 2'-O-алкилзамещенные дезоксирибонуклеозиды и 2'-O-этиленгликоль-подобные рибонуклеозиды. Получение этих Сахаров или аналогов сахара и соответствующих «нуклеозидов», в которых такие сахара или аналоги присоединены к гетероциклическому основанию (основанию нуклеиновой кислоты), известно. Модификации сахара также могут быть сделаны и объединены с другими модификациями.

[302] Модификации фрагмента сахара включают в себя природные модификации рибозы и дезоксирибозы, а также неприродные модификации. Модификации сахара включают в себя, без ограничения, следующие модификации в положении 2': ОН; F; О-, S- или N-алкил; О-, S- или N-алкенил; О-, S- или N-алкинил или О-алкил-О-алкил, причем алкил, алкенил и алкинил могут представлять собой замещенный или незамещенный C₁-С₁₀ алкил или С₂-С₁₀ алкенил и алкинил. 2' модификации сахара также включают в себя, без ограничения, -O[(CH₂)_nO]_m CH₃, -O(CH₂)_nOCH₃, -O(CH₂)_nNH₂, -O(CH₂)_nCH₃, -O(CH₂)_nONH₂ и -O(CH₂)_nON[(CH₂)_nCH₃)]₂, где n и m составляют от 1 до около 10.

[303] Другие модификации в положении 2' включают в себя, без ограничения: C₁-С₁₀ низший алкил, замещенный низший алкил, алкарил, аралкил, О-алкарил, О-аралкил, SH, SCH₃, OCN, Cl, Br, CN, CF₃, OCF₃, SOCH₃, SO₂ CH₃, ONO₂, NO₂, N₃, NH₂, гетероциклоалкил, гетероциклоалкарил, аминоалкиламино, полиалкиламино, замещенный силил, группу расщепления РНК, репортерную группу, интеркалятор, группу для улучшения фармакокинетических свойств олигонуклеотида или группу для улучшения фармакодинамических свойств олигонуклеотида и других заместителей, имеющих сходные свойства. Аналогичные модификации могут быть также сделаны в других положениях на сахаре, в частности в положении 3' сахара на 3'-концевом нуклеотиде или в 2'-5' связанных олигонуклеотидах и в положении 5' 5'-концевого нуклеотида. Модифицированные сахара также включают в себя те, которые содержат модификации в кислороде мостикового кольца, такие как СН2 и S. Аналоги сахара нуклеотида также могут включать в себя миметики сахара, такие как циклобутильные фрагменты, вместо пентофуранозилового сахара. Существуют многочисленные патенты Соединенных Штатов, в которых описывается получение таких модифицированных структур сахара и которые подробно описывают ряд модификаций оснований, такие как патенты США №4981957; 5118800; 5319080; 5359044; 5393878; 5446137; 5466786; 5514785; 5519134; 5567811; 5576427; 5591722; 5597909; 5610300; 5627053; 5639873; 5646265; 5658873; 5670633; 4845205; 5130302; 5134066; 5175273; 5367066; 5432272; 5457187; 5459255; 5484908; 5502177; 5525711; 5552540; 5587469; 5594121, 5596091; 5614617; 5681941 и 5700920, каждый из которых полностью включен в настоящий документ посредством ссылки.

[304] Примеры нуклеиновых кислот, содержащих модифицированные фрагменты сахара, включают в себя, без ограничения, нуклеиновые кислоты, содержащие замещающие группы 5'-винил, 5'-метил (R или S), 4'-S, 2'-F, 2'-ОСН₃ и 2'-O(СН₂)₂OCH₃. Заместитель в положении 2' также может быть выбран из аллила, амино, азидо, тио, О-аллила, O-(C₁-C₁₀ алкила), OCF₃, O(CH₂)₂SCH₃, O(CH₂)₂-O-N(R_m)(R_n) и O-СН₂-С(=O)-N(R_m)(R_n), где каждый R_m и R_n независимо представляет собой H или замещенный или незамещенный C₁-С₁₀ алкил.

[305] Согласно определенным вариантам осуществления описанные в настоящем документе нуклеиновые кислоты включают в себя одну или несколько бициклических нуклеиновых кислот. Согласно некоторым таким вариантам осуществления бициклическая нуклеиновая кислота содержит мостик между 4' и 2' атомами рибозильного кольца. Согласно определенным вариантам осуществления представленные в настоящем документе нуклеиновые кислоты включают в себя одну или несколько бициклических нуклеиновых кислот, причем мостик содержит 4'-2' бициклическую нуклеиновую кислоту. Примеры таких 4'-2' бициклических нуклеиновых кислот включают в себя, без ограничения, одну из формул: 4'-(СН₂)-O-2' (LNA); 4'-(CH₂)-S-2'; 4'-(СН₂)₂-O-2' (ENA); 4'-СН(СН₃)-O-2' и 4'-СН(СН₂ОСН₃)-O-2' и их аналоги (смотрите патент США №7399845); 4'-С(СН₃)(СН₃)-O-2' и его аналоги (смотрите WO 2009/006478, WO 2008/150729, US 2004/0171570, патент США №7427672, Chattopadhyaya et al., J. Org. Chem., 209, 74, 118-134 и WO 2008/154401). Также смотрите, например: Singh et al., Chem. Commun, 1998, 4, 455-456; Koshkin et al., Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630; Wahlestedt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 2000, 97, 5633-5638; Kumar et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1998, 8, 2219-2222; Singh et al., J. Org. Chem., 1998, 63, 10035-10039; Srivastava et al., J. Am. Chem. Soc, 2007, 129(26) 8362-8379; Elayadi et al., Curr. Opinion Invens. Drugs, 2001, 2, 558-561; Braasch et al., Chem. Biol, 2001, 8, 1-7; Oram et al., Curr. Opinion Mol. Ther., 2001, 3, 239-243; патенты США №4849513; 5015733; 5118800; 5118802; 7053207; 6268490; 6770748; 6794499; 7034133; 6525191; 6670461 и 7399845; международные публикации № WO 2004/106356, WO 1994/14226, WO 2005/021570, WO 2007/090071 и WO 2007/134181; патенты США № US 2004/0171570, US 2007/0287831 и US 2008/0039618; предварительные заявки США №60/989574, 61/026995, 61/026998, 61/056564, 61/086231, 61/097787 и 61/099844 и международные заявки № PCT/US 2008/064591, РСТ US 2008/066154, РСТ US 2008/068922 и PCT/DK 98/00393.

[306] Согласно определенным вариантам осуществления нуклеиновые кислоты включают в себя связанные нуклеиновые кислоты. Нуклеиновые кислоты могут быть связаны вместе с использованием любой связи между нуклеиновыми кислотами. Два основных класса связывающих нуклеиновые кислоты групп определяются наличием или отсутствием атома фосфора. Иллюстративные фосфорсодержащие связи между нуклеиновыми кислотами включают в себя, без ограничения, фосфодиэфиры, фосфотриэфиры, метилфосфонаты, фосфорамидат и фосфоротиоаты (P=S). Иллюстративные нефосфорсодержащие связывающие группы между нуклеиновыми кислотами включают в себя, без ограничения, метиленметилимино (-СН₂-N(СН₃)-O-СН₂-), тиодиэфир (-O-C(O)-S-), тионокарбамат (-O-C(O)(NH)-S-); силоксан (-O-Si(H)₂-O-) и N,N*-диметилгидразин (-СН₂-N(СН₃)-N(СН₃)). Согласно некоторым вариантам осуществления связи между нуклеиновыми кислотами, содержащие хиральный атом, могут быть получены в виде рацемической смеси, в виде отдельных энантиомеров, например, алкилфосфонатов и фосфоротиоатов. Неприродные нуклеиновые кислоты могут содержать одну модификацию. Неприродные нуклеиновые кислоты могут содержать несколько модификаций в пределах одной из групп или между различными фрагментами.

[307] Модификации фосфатов основной цепи нуклеиновой кислоты включают в себя, без ограничения, метилфосфонат, фосфоротиоат, фосфорамидат (мостиковый или не мостиковый), фосфотриэфир, фосфородитиоат, фосфодитиоат и боранофосфат и могут использоваться в любой комбинации. Другие нефосфатные связи также могут быть использованы.

[308] Согласно некоторым вариантам осуществления модификации основной цепи (например, метилфосфонатные, фосфоротиоатные, фосфороамидатные и фосфородитиоатные межнуклеотидные связи) могут придавать иммуномодулирующую активность модифицированной нуклеиновой кислоте и/или повышать их стабильность in vivo.

[309] В некоторых случаях производное фосфора (или модифицированная фосфатная группа) присоединяется к сахару или аналогу сахара и может представлять собой монофосфат, дифосфат, трифосфат, алкилфосфонат, фосфоротиоат, фосфородитиоат, фосфорамидат или т.п. Иллюстративные полинуклеотиды, содержащие модифицированные фосфатные связи или нефосфатные связи, можно найти в Peyrottes et al., 1996, Nucleic Acids Res. 24: 1841-1848; Chaturvedi et al., 1996, Nucleic Acids Res. 24:2318-2323 и Schultz et al., (1996) Nucleic Acids Res. 24:2966-2973; Matteucci, 1997, "Oligonucleotide Analogs: an Overview" in Oligonucleotides as Therapeutic Agents, (Chadwick and Cardew, ed.) John Wiley and Sons, New York, NY; Zon, 1993, "Oligonucleoside Phosphorothioates" in Protocols for Oligonucleotides and Analogs, Synthesis and Properties, Humana Press, pp. 165-190; Miller et al., 1971, JACS 93:6657-6665; Jager et al., 1988, Biochem. 27:7247-7246; Nelson et al., 1997, JOC 62:7278-7287; патенте США №5453496 и Micklefield, 2001, Curr. Med. Chem. 8: 1157-1179.

[310] В некоторых случаях модификация основной цепи включает в себя замену фосфодиэфирной связи альтернативным фрагментом, таким как анионная, нейтральная или катионная группа. Примеры таких модификаций включают в себя: анионную межнуклеозидную связь; модификацию фосфорамидата с N3' по Р5'; боранофосфатную ДНК; проолигонуклеотиды; нейтральные межнуклеозидные связи, такие как метилфосфонаты; ДНК с амидной связью; метиленовые (метилимино) связи; формацетальные и тиоформацетальные связи; основные цепи, содержащие сульфонильные группы; морфолино олигонуклеотиды; пептидные нуклеиновые кислоты (PNA) и положительно заряженные олигонуклеотиды дезоксирибонуклеинового гуанидина (DNG) (Micklefield, 2001, Current Medicinal Chemistry 8: 1157-1179). Модифицированная нуклеиновая кислота может содержать химерный или смешанный остов, содержащий одну или несколько модификаций, например, комбинацию фосфатных связей, такую как комбинация фосфодиэфирных и фосфоротиоатных связей.

[311] Заместители для фосфата включают в себя, например, короткоцепочечные алкильные или циклоалкильные межнуклеозидные связи, смешанные гетероатомные и алкильные или циклоалкильные межнуклеозидные связи или одну или несколько короткоцепочечных гетероатомных или гетероциклических межнуклеозидных связей. К ним относятся те, которые содержат морфолино-связи (образованные частично из части сахара нуклеозида); силоксановые основные цепи; сульфидные, сульфоксидные и сульфоновые основные цепи; формацетильные и тиоформацетильные основные цепи; метиленформацетильные и тиоформацетильные основные цепи; алкенсодержащие основные цепи; сульфаматные основные цепи; метиленимино и метиленгидразино основные цепи; сульфонатные и сульфонамидные основные цепи; амидные основные цепи и другие, содержащие смешанные N, О, S и CH₃ составные части. Многочисленные патенты США раскрывают, как производить и использовать эти типы заменителей фосфатов, и включают в себя, без ограничения, патенты США №5034506; 5166315; 5185444; 5214134; 5216141; 5235033; 5264562; 5264564; 5405938; 5434257; 5466677; 5470967; 5489677; 5541307; 5561225; 5596086; 5602240; 5610289; 5602240; 5608046; 5610289; 5618704; 5623070; 5663312; 5633360; 5677437 и 5677439. Понятно также, что при замене нуклеотида можно заменить как сахарную, так и фосфатную части нуклеотида, например, с помощью связи амидного типа (аминоэтилглицин) (PNA). Патенты США №5539082; 5714331 и 5719262 описывают, как создавать и использовать молекулы PNA, каждая из которых включена в настоящий документ посредством ссылки. Смотрите также Nielsen et al., Science, 1991, 254, 1497-1500. Также возможно связать другие типы молекул (конъюгатов) с нуклеотидами или аналогами нуклеотидов, чтобы усилить, например, клеточное поглощение. Конъюгаты могут быть химически связаны с нуклеотидами или аналогами нуклеотидов. Такие конъюгаты включают в себя, без ограничения, липидные фрагменты, такие как холестериновая группа (Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86, 6553-6556), желчная кислота (Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1994, 4, 1053-1060), тиоэфир, например, гексил-S-тритилтиол (Manoharan et al., Ann. KY. Acad. Sci., 1992, 660, 306-309; Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1993, 3, 2765-2770), тиохолестерин (Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20, 533-538), алифатическая цепь, например, додекандиол или ундецильные остатки (Saison-Behmoaras et al., EM5OJ, 1991, 10, 1111-1118; Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259, 327-330; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75, 49-54), фосфолипид, например, дигексадецил-рац-глицерин или триэтиламмоний-1-ди-O-гексадецил-рац-глицеро-SH-фосфонат (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654; Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18, 3777-3783), полиаминовая или полиэтиленгликолевая цепь (Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14, 969-973) или адамантановая уксусная кислота (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654), пальмитильный фрагмент (Mishra et al., Biochem. Biophys. Acta, 1995, 1264, 229-237) или октадециламиновый или гексиламинокарбонил-оксихолестериновый фрагмент (Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277, 923-937). Многочисленные патенты США описывают получение таких конъюгатов и включают в себя, без ограничения, патенты США №4828979; 4948882; 5218105; 5525465; 5541313; 5545730; 5552538; 5578717, 5580731; 5580731; 5591584; 5109124; 5118802; 5138045; 5414077; 5486603; 5512439; 5578718; 5608046; 4587044; 4605735; 4667025; 4762779; 4789737; 4824941; 4835263; 4876335; 4904582; 4958013; 5082830; 5112963; 5214136; 5082830; 5112963; 5214136; 5245022; 5254469; 5258506; 5262536; 5272250; 5292873; 5317098; 5,371,241, 5,391,723; 5,416,203, 5,451,463; 5510475; 5512667; 5514785; 5565552; 5567810; 5574142; 5585481; 5587371; 5595726; 5597696; 5599923; 5599928 и 5688941.

[312] В некоторых случаях неприродные нуклеиновые кислоты дополнительно образуют неприродные пары оснований. Иллюстративные неприродные нуклеотиды, способные образовывать неприродную пару оснований ДНК или РНК (UBP) в условиях in vivo, включают в себя, без ограничения, 5SICS, d5SICS, NAM, dNaM и их комбинации. Согласно некоторым вариантам осуществления неприродные нуклеотиды включают в себя:

[313] Согласно некоторым вариантам осуществления неприродная пара оснований производит неприродную аминокислоту, описанную в Dumas et al., "Designing logical codon reassignment - Expanding the chemistry in biology," Chemical Science, 6: 50-69 (2015).

[314] Клетка-хозяин, в которую вводятся конструкции или векторы, раскрытые в настоящем документе, культивируется или поддерживается в подходящей среде, так что получают тРНК, тРНК-синтетазу и представляющий интерес белок. Среда также содержит неприродную аминокислоту(ы), так что представляющий интерес белок включает в себя неприродную аминокислоту(ы).

[315] Ортогональная пара тРНК-синтетаза/тРНК заряжает тРНК неприродной аминокислотой и встраивает неприродную аминокислоту в полипептидную цепь в ответ на кодон. Иллюстративные пары aaRS-тРНК включают в себя, без ограничения, пары aaRS/тРНК Methanococcus jannaschii (Mj-Tyr), пары E. coli TyrRS (Ec-Tyr)/B. stearothermophilus tRNA_CUA, пары E. coli LeuRS (Ec-Leu)/B. stearothermophilus tRNA_CUA и пары пирролизил-тРНК.

[316] Полипептид цитокин (например, IL-2), содержащий неприродную аминокислоту(ы), получают введением описанных в настоящем документе конструкций нуклеиновых кислот, содержащих тРНК и тРНК-синтетазу и содержащих представляющую интерес последовательность нуклеиновой кислоты с одной или несколькими ортогональными (стоп) кодонами в рамке, в клетку-хозяина. Клетка-хозяин подвергается воздействию физиологического раствора, содержащего неприродную аминокислоту(ы), и клетки-хозяева затем поддерживаются в условиях, которые позволяют экспрессию кодирующей последовательности представляющего интерес белка. Неприродная аминокислота(ы) встраивается в полипептидную цепь в ответ на кодон. Например, одна или несколько неприродных аминокислот включаются в полипептид цитокин (например, IL-2). Альтернативно, две или более неприродные аминокислоты могут быть включены в полипептид цитокин (например, IL-2) в двух или более сайтах в белке.

[317] Когда необходимо включить несколько неприродных аминокислот в полипептид цитокин (например, IL-2), следует понимать, что в кодирующую последовательность нуклеиновой кислоты должны быть включены несколько кодонов в желаемых положениях, так что пары тРНК-синтетазы/тРНК могут направлять включение неприродных аминокислот в ответ на кодон(ы). По меньшей мере 1, 2, 3, 4 или более кодирующих кодонов нуклеиновых кислот могут быть включены в представляющую интерес последовательность нуклеиновой кислоты.

[318] Когда желательно включить более одного типа неприродной аминокислоты в представляющий интерес белок, в один белок, вторая или дополнительная ортогональная пара тРНК-тРНК-синтетазы может быть использована для включения второй или дополнительной неприродной аминокислоты; соответственно, указанная вторая или дополнительная ортогональная пара тРНК-тРНК-синтетазы распознает другой кодон в нуклеиновой кислоте, кодирующей представляющий интерес белок, так что две или более неприродные аминокислоты могут быть специфически включены в разные определенные сайты в белке за одну стадию производства. Согласно некоторым вариантам осуществления могут быть использованы две или более ортогональных пар тРНК-тРНК-синтетазы.

[319] Как только в клетке-хозяине производится полипептид цитокин (например, IL-2), включающий не встречающуюся в природе аминокислоту(ы), он может быть извлечен из нее различными способами, известными в настоящей области техники, включая в себя ферментативный, химический и/или осмотический лизис и физическое разрушение. Полипептид цитокин (например, IL-2) может быть очищен стандартными способами, известными в настоящей области техники, такими как препаративная хроматография, аффинная очистка или любой другой подходящий способ.

[320] Подходящие клетки-хозяева могут включать в себя бактериальные клетки (например, Е. coli), но наиболее подходящими клетками-хозяевами являются эукариотические клетки, например, клетки насекомых (например, Drosophila, такие как Drosophila melanogaster), дрожжевые клетки, нематоды (например, Celegans), мыши (например, Mus musculus) или клетки млекопитающих (такие как клетки яичника китайского хомячка (СНО) или клетки COS, клетки 293Т человека, клетки HeLa, клетки NIH 3Т3 и клетки эритролейкемии мыши (MEL)) или клетки человека или другие эукариотические клетки. Другие подходящие клетки-хозяева известны специалистам в настоящей области техники. Соответственно, клетка-хозяин представляет собой клетку млекопитающего, такую как клетка человека или клетка насекомого.

[321] Другими подходящими клетками-хозяевами, которые обычно могут использоваться в вариантах осуществления настоящего изобретения, являются те, которые указаны в разделе примеров. Векторная ДНК может быть введена в клетки-хозяева с помощью традиционных способов трансформации или трансфекции. Используемые в настоящем документе термины «трансформация» и «трансфекция» предназначены для обозначения множества общепризнанных способов введения молекулы чужеродной нуклеиновой кислоты (например, ДНК) в клетку-хозяина, включая в себя копреципитацию фосфата кальция или хлорида кальция, опосредованную DEAE-декстран трансфекцию, липофекцию или электропорацию. Подходящие способы трансформации или трансфекции клеток-хозяев хорошо известны в настоящей области техники.

[322] При создании клеточных линий, как правило, предпочтительно, чтобы получали стабильные клеточные линии. Например, для стабильной трансфекции клеток млекопитающих известно, что в зависимости от вектора экспрессии и используемого способа трансфекции только небольшая часть клеток может интегрировать чужеродную ДНК в свой геном. Чтобы идентифицировать и выбрать эти интегранты, ген, который кодирует селектируемый маркер (например, для устойчивости к антибиотикам), как правило, вводят в клетки-хозяев а вместе с представляющим интерес геном. Предпочтительные селектируемые маркеры включают в себя маркеры, которые придают устойчивость к лекарственным средствам, таким как G418, гигромицин или метотрексат. Молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие селектируемый маркер, могут быть введены в клетку-хозяина на одном и том же векторе или могут быть введены на отдельном векторе. Клетки, стабильно трансфицированные введенной молекулой нуклеиновой кислоты, могут быть идентифицированы путем отбора лекарственного средства (например, клетки, которые включили ген селектируемого маркера, выживут, в то время как другие клетки погибнут).

[323] Согласно одному варианту осуществления описанные в настоящем документе конструкции интегрированы в геном клетки-хозяина. Преимущество стабильной интеграции состоит в том, что достигается однородность между отдельными клетками или клонами. Еще одним преимуществом является то, что может быть проведен выбор лучших производителей. Соответственно, желательно создавать стабильные клеточные линии. Согласно другому варианту осуществления описанные в настоящем документе конструкции трансфицируют в клетку-хозяина. Преимущество трансфекции конструкций в клетку-хозяина заключается в том, что выход белка может быть максимальным. Согласно одному аспекту описана клетка, содержащая конструкцию нуклеиновой кислоты или описанный в настоящем документе вектор.

Фармацевтические композиции и составы

[324] Согласно некоторым вариантам осуществления фармацевтическую композицию и составы, описанные в настоящем документе, вводят субъекту множественными путями введения, включая в себя, без ограничения, парентеральный, пероральный, буккальный, ректальный, подъязычный или трансдермальный способы введения. В некоторых случаях парентеральное введение включает в себя внутривенную, подкожную, внутримышечную, интрацеребральную, интраназальную, внутриартериальную, внутрисуставную, внутрикожную, интравитреальную, внутрикостную инфузию, внутрибрюшинное или интратекальное введение. В некоторых случаях фармацевтическая композиция составлена для местного применения. В других случаях фармацевтическая композиция составлена для системного введения..

[325] Согласно некоторым вариантам осуществления фармацевтические составы включают в себя, без ограничения, водные жидкие дисперсии, самоэмульгирующие дисперсии, твердые растворы, липосомальные дисперсии, аэрозоли, твердые лекарственные формы, порошки, составы с немедленным высвобождением, составы с контролируемым высвобождением, быстроплавящиеся составы, таблетки, капсулы, пилюли, составы с отсроченным высвобождением, составы с пролонгированным высвобождением, составы с импульсным высвобождением, составы с множественными частицами (например, составы с наночастицами) и смешанные составы с немедленным и контролируемым высвобождением.

[326] Согласно некоторым вариантам осуществления фармацевтические составы включают в себя носитель или материалы носителя, выбранные на основе совместимости с раскрытой в настоящем документе композицией, и свойств профиля высвобождения желаемой лекарственной формы. Иллюстративные материалы носителей включают в себя, например, связующие вещества, суспендирующие средства, разрыхлители, наполнители, поверхностно-активные вещества, солюбилизаторы, стабилизаторы, смазывающие вещества, смачивающие средства, разбавители и т.п. Фармацевтически совместимые носители включают в себя, без ограничения, камедь, желатин, коллоидный диоксид кремния, глицерофосфат кальция, лактат кальция, мальтодекстрин, глицерин, силикат магния, поливинилпирролидон (PVP), холестерин, сложные эфиры холестерина, казеинат натрия, соевый лецитин, таурохолевую кислоту, фосфотидилхолин, хлорид натрия, трикальцийфосфат, дикалийфосфат, целлюлозу и конъюгаты целлюлозы, сахара стеароиллактилата натрия, каррагинан, моноглицерид, диглицерид, прежелатинизированный крахмал и т.п. Смотрите, например, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Nineteenth Ed (Easton, Pa.: Mack Publishing Company, 1995), Hoover, John E., Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania 1975, Liberman, H.A. and Lachman, L., Eds., Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Decker, New York, N.Y., 1980 и Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Seventh Ed. (Lippincott Williams & Wilkinsl999).

[327] В некоторых случаях фармацевтическая композиция составлена в виде иммунолипосомы, которая содержит множество конъюгатов IL-2, связанных прямо или опосредованно с липидным бислоем липосом. Иллюстративные липиды включают в себя, без ограничения, жирные кислоты; фосфолипиды; такие стерины, как холестерины; такие сфинголипиды, как сфингомиелин; такие гликосфинголипиды, как ганглиозиды, глобоциды и цереброзиды; такие амины поверхностно-активного вещества, как стеарил, олеил и линолеиламины. В некоторых случаях липид содержит катионный липид. В некоторых случаях липид содержит фосфолипид. Иллюстративные фосфолипиды включают в себя, без ограничения, фосфатидную кислоту («РА»), фосфатидилхолин («РС»), фосфатидилглицерин («PG»), фосфатидилэтаноламин («РЕ»), фосфатидилинозитол («PI») и фосфатидилсерин («PS»), сфингомиелин (в том числе сфингомиелин головного мозга), лецитин, лизолецитин, лизофосфатидилэтаноламин, цереброзиды, диарахидоилфосфатидилхолин («DAPC»), дидеканоил-L-альфа-фосфатидилхолин («DDPC»), диэладоилфосфатидилхолин («DEPC»), дилауроилфосфатидилхолин («DLPC»), дилинолеоилфосфатидилхолин, димиристоилфосфатидилхолин («DMPC»), диолеоилфосфатидилхолин («DOPC»), дипальмитоилфосфатидилхолин («DPPC»), дистеароилфосфатидилхолин («DSPC»), 1-пальмитоил-2-олеоилфосфатидилхолин («РОРС»), диарахидоилфосфатидилглицерин («DAPG»), дидеканоил-L-альфа-фосфатидилглицерин («DDPG»), диэлаидоилфосфатидилглицерин («DEPG»), дилауроилфосфатидилглицерин («DLPG»), дилинолеоилфосфатидилглицерин, димиристоилфосфатидилглицерин («DMPG»), диолеоилфосфатидилглицерин («DOPG»), дипальмитоилфосфатидилглицерин («DPPG»), дистеароилфосфатидилглицерин («DSPG»), 1-пальмитоил-2-олеоилфосфатидилглицерин («POPG»), диарахидоилфосфатидилэтаноламин («DAPE»), дидеканоил-L-альфа-фосфатидилэтаноламин («DDPE»), диэлаидоилфосфатидилэтаноламин («DEPE»), дилауроилфосфатидилэтаноламин («DLPE»), дилинолеоилфосфатидилэтаноламин, димиристоилфосфатидилэтаноламин («DMPE»), диолеоилфосфатидилэтаноламин («DOPE»), дипальмитоилфосфатидилэтаноламин («DPPE»), дистеароилфосфатидилэтаноламин («DSPE»), 1-пальмитоил-2-олеоилфосфатидилэтаноламин («РОРЕ»), диарахидоилфосфатидилинозитол («DAPI»), дидеканоил-L-альфа-фосфатидилинозитол («DDPI»), диэлаидоилфосфатидилинозитол («DEPI»), дилауроилфосфатидилинозитол («DLPI»), дилинолеоилфосфатидилинозитол, димиристоилфосфатидилинозитол («DMPI»), диолеоилфосфатидилинозитол («DOPI»), дипальмитоилфосфатидилинозитол («DPPI»), дистеароилфосфатидилинозитол («DSPI»), 1 -пальмитоил-2-олеоил-фосфатидилинозитол («POPI»), диарахидоилфосфатидилсерин («DAPS»), дидеканоил-L-альфа-фосфатидилсерин («DDPS»), диэлаидоилфосфатидилсерин («DEPS»), дилауроилфосфатидилсерин («DLPS»), дилинолеоилфосфатидилсерин, димиристоилфосфатидилсерин («DMPS»), диолеоилфосфатидилсерин («DOPS»), дипальмитоилфосфатидилсерин («DPPS»), дистеароилфосфатидилсерин («DSPS»), 1-пальмитоил-2-олеоилфосфатидилсерин («POPS»), диарахидоилсфингомиелин, дидеканоилсфингомиелин, диэлаидоилсфингомиелин, дилауроилсфингомиелин, дилинолеоилсфингомиелин, димиристоилсфингомиелин, сфингомиелин, диолеоилсфингомиелин, дипальмитоилсфингомиелин, дистеароилсфингомиелин и 1-пальмитоил-2-олеоилсфингомиелин.

[328] В некоторых случаях фармацевтические составы дополнительно включают в себя регуляторы рН или буферные средства, которые включают в себя такие кислоты, как уксусная, борная, лимонная, молочная, фосфорная и соляная кислоты, такие основания, как гидроксид натрия, фосфат натрия, борат натрия, цитрат натрия, ацетат натрия, лактат натрия и трис-гидроксиметиламинометан и такие буферы, как цитрат/декстроза, бикарбонат натрия и хлорид аммония. Такие кислоты, основания и буферы включены в количестве, необходимом для поддержания рН композиции в приемлемом диапазоне.

[329] В некоторых случаях фармацевтическая композиция включает в себя одну или несколько солей в количестве, необходимом для доведения осмоляльности композиции до приемлемого диапазона. Такие соли включают в себя соли, содержащие катионы натрия, калия или аммония и анионы хлоридов, цитратов, аскорбатов, боратов, фосфатов, бикарбонатов, сульфатов, тиосульфатов или бисульфитов, подходящие соли включают в себя хлорид натрия, хлорид калия, тиосульфат натрия, бисульфит натрия и сульфат аммония.

[330] Согласно некоторым вариантам осуществления фармацевтические композиции включают в себя, без ограничения, такие сахара, как трегалоза, сахароза, маннит, мальтоза, глюкоза, или такие соли, как фосфат калия, цитрат натрия, сульфат аммония, и/или другие такие средства, как гепарин для увеличить растворимость и стабильности полипептидов in vivo.

[331] В некоторых случаях фармацевтические составы дополнительно включают в себя разбавитель, который используется для стабилизации соединений, поскольку они могут обеспечить более стабильную среду. Соли, растворенные в забуференных растворах (которые также могут обеспечивать контроль или поддержание рН), используются в настоящей области техники в качестве разбавителей, включая в себя, без ограничения, забуференный фосфатом физиологический раствор. В некоторых случаях разбавители увеличивают объем композиции для облегчения прессования или создают достаточный объем для гомогенной смеси для наполнения капсул. Такие соединения могут включать в себя, например, лактозу, крахмал, маннит, сорбит, декстрозу, микрокристаллическую целлюлозу, такую как Avicel^®, двухосновный фосфат кальция, дигидрат дикальцийфосфата, трикальцийфосфат, фосфат кальция, безводную лактозу, высушенную распылением лактозу, пр еже латинизированный крахмал, прессованный сахар, такой как Di-Pac^® (Amstar), маннит, гидроксипропилметилцеллюлозу, ацетатстеарат гидроксипропилметилцеллюлозы, разбавители на основе сахарозы, кондитерский сахар, моногидрат моноосновного сульфата кальция, дигидрат сульфата кальция, тригидрат лактата кальция, декстраты, гидролизованную злаковую сыворотку, амилозу, порошковую целлюлозу, карбонат кальция, глицин, каолин, маннит, хлорид натрия, инозит, бентонит и т.п.

[332] В некоторых случаях фармацевтические составы включают в себя разрыхляющие средства или разрыхлители для облегчения разрушения или разрыхления вещества. Термин «разрыхление» включает в себя как растворение, так и дисперсию лекарственной формы при контакте с желудочно-кишечной жидкостью. Примеры разрыхляющих средств включают в себя крахмал, например, природный крахмал, такой как кукурузный крахмал или картофельный крахмал, прежелатинизированный крахмал, такой как National 1551 или Amijel^®, или натрия крахмала гликолят, такой как Promogel^® или Explotab^®, целлюлозу, такую как продукт древесины, метилкристаллическая целлюлоза, например, Avicel^®, Avicel^® РН101, Avicel^® PH102, Avicel^® PH105, Elcema^® P100, Emcocel^®, Vivacel^®, Ming Tia^® и Solka-Floc^®, метил целлюлоз а, кроскармеллоза или кросс-связанная целлюлоза, такая как сшитая карбоксиметилцеллюлоза натрия (Ac-Di-Sol^®), сшитая карбоксиметилцеллюлоза или сшитая кроскармеллоза, сшитый крахмал, такой как натрия крахмала гликолят, сшитый полимер, такой как кросповидон, сшитый поливинилпирролидон, альгинат, такой как альгиновая кислота, или соль альгиновой кислоты, такая как альгинат натрия, глина, такая как Veegum^® HV (силикат магния и алюминия), камедь, такая как агар, гуар, плоды рожкового дерева, карая, пектин или трагакант, натрия крахмала гликолят, бентонит, натуральную губку, поверхностно-активное вещество, смолу, такую как катионит, смола цитрусовых, лаурилсульфат натрия, лаурилсульфат натрия в сочетании с крахмалом и т.п.

[333] В некоторых случаях фармацевтические составы включают в себя такие наполнители, как лактоза, карбонат кальция, фосфат кальция, двухосновный фосфат кальция, сульфат кальция, микрокристаллическая целлюлоза, порошок целлюлозы, декстроза, декстраты, декстран, крахмалы, прежелатинизированный крахмал, сахароза, ксилит, лактит, маннит, сорбит, хлорид натрия, полиэтиленгликоль и т.п.[334] Смазывающие вещества и глиданты также необязательно включены в описанные в настоящем документе фармацевтические составы для предотвращения, уменьшения или ингибирования адгезии или трения материалов. Иллюстративные смазывающие вещества включают в себя, например, стеариновую кислоту, гидроксид кальция, тальк, стеарилфумарат натрия, такой углеводород, как минеральное масло, или такое гидрогенизированное растительное масло, как гидрогенизированное соевое масло (Sterotex^®), высшие жирные кислоты и их соли щелочных металлов и щелочноземельных металлов, такие как алюминий, кальций, магний, цинк, стеариновая кислота, стеараты натрия, глицерин, тальк, воски, Stearowet^®, борная кислота, бензоат натрия, ацетат натрия, хлорид натрия, лейцин, полиэтиленгликоль (например, PEG-4000) или метоксиполиэтиленгликоль, такой как Carbowax™, олеат натрия, бензоат натрия, глицерилбегенат, полиэтиленгликоль, лаурилсульфат магния или натрия, коллоидный диоксид кремния, такой как Syloid™, Cab-O-Sil^®, крахмал, такой как кукурузный крахмал, силиконовое масло, поверхностно-активное вещество и т.п.

[335] Пластификаторы включают в себя соединения, используемые для смягчения материала микрокапсулирования или пленочных покрытий, чтобы сделать их менее хрупкими. Подходящие пластификаторы включают в себя, например, полиэтиленгликоли, такие как PEG 300, PEG 400, PEG 600, PEG 1450, PEG 3350 и PEG 800, стеариновую кислоту, пропиленгликоль, олеиновую кислоту, триэтилцеллюлозу и триацетин. Пластификаторы также могут действовать как диспергирующие средства или смачивающие средства.

[336] Солюбилизаторы включают в себя такие соединения, как триацетин, триэтилцитрат, этилолеат, этилкаприлат, лаурилсульфат натрия, докузат натрия, витамин E TPGS, диметилацетамид, N-метилпирролидон, N-гидроксиэтилпирролидон, поливинилпирролидон, гидроксипропилметилцеллюлоза, гидроксипропилциклодекстрины, этанол, н-бутанол, изопропиловый спирт, холестерин, соли желчных кислот, полиэтиленгликоль 200-600, гликофурол, транскутол, пропиленгликоль и диметилизосорбид и т.п.

[337] Стабилизаторы включают в себя такие соединения, как любые антиоксиданты, буферы, кислоты, консерванты и т.п. Иллюстративные стабилизаторы включают в себя L-аргинина гидрохлорид, трометамин, альбумин (человека), лимонную кислоту, бензиловый спирт, фенол, динатрийдифосфатдегидрат, пропиленгликоль, метакрезол или м-крезол, ацетат цинка, полисорбат-20 или Tween® 20 или трометамол.

[338] Суспендирующие средства включают в себя такие соединения, как поливинилпирролидон, например, поливинилпирролидон К12, поливинилпирролидон К17, поливинилпирролидон К25 или поливинилпирролидон К30, сополимер винилпирролидона/винилацетата (S630), полиэтиленгликоль, например, полиэтиленгликоль может иметь молекулярную массу от около 300 до около 6000, или от около 3350 до около 4000, или от около 7000 до около 5400, натрий-карбоксиметилцеллюлоза, метилцеллюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза, ацетатстеарат гидроксиметилцеллюлозы, полисорбат-80, гидроксиэтилцеллюлоза, альгинат натрия, такие камеди, как, например, трагакантовая камедь и аравийская камедь, гуаровая камедь, ксантаны, включая в себя ксантановую камедь, сахара, такие целлюлозы, как, например, натриевая соль карбоксиметилцеллюлозы, метилцеллюлоза, натриевая соль карбоксиметилцеллюлозы, гидроксипропилметилцеллюлоза, гидроксиэтилцеллюлоза, полисорбат-80, альгинат натрия, полиэтоксилированный сорбитанмонолаурат, повидон и т.п.

[339] Поверхностно-активные вещества включают в себя такие соединения, как лаурилсульфат натрия, докузат натрия, Твин 60 или 80, триацетин, витамин Е TPGS, сорбитанмоноолеат, полиоксиэтиленсорбитанмоноолеат, полисорбаты, полаксомеры, желчные соли, глицерилмоностеарат, сополимеры этиленоксида и пропиленоксида, например, Pluronic® (BASF) и т.п. Дополнительные поверхностно-активные вещества включают в себя полиоксиэтиленглицериды жирных кислот и растительные масла, например, полиоксиэтиленовое (60) гидрогенизированное касторовое масло и полиоксиэтиленалкиловые эфиры и алкилфениловые эфиры, например, октоксинол 10, октоксинол 40. Иногда поверхностно-активные вещества включают для повышения физической стабильности или для других целей.

[340] Усиливающие вязкость средства включают в себя, например, метилцеллюлозу, ксантановую камедь, карбоксиметилцеллюлозу, гидроксипропилцеллюлозу, гидроксипропилметилцеллюлозу, ацетатстеарат гидроксипропил метил целлюлозы, гидроксипропилметилцеллюлозу, фталат, карбомер, поливиниловый спирт, альгинаты, камедь, хитозаны и их комбинации.

[341] Смачивающие средства включают в себя такие соединения, как олеиновая кислота, глицерилмоностеарат, сорбитанмоноолеат, сорбитанмонолаурат, триэтаноламиноолеат, полиоксиэтиленсорбитанмоноолеат, полиоксиэтиленсорбитанмонолаурат, докузат натрия, олеат натрия, лаурилсульфат натрия, докузат натрия, триацетин, Твин 80, витамин Е TPGS, соли аммония и т.п.

Схемы лечения

[342] Согласно некоторым вариантам осуществления описанные в настоящем документе фармацевтические композиции вводят для терапевтических применений. Согласно некоторым вариантам осуществления фармацевтическую композицию вводят один раз в день, два раза в день, три раза в день или более. Фармацевтическую композицию вводят ежедневно, каждый день, через каждый день, пять дней в неделю, один раз в неделю, каждую вторую неделю, две недели в месяц, три недели в месяц, один раз в месяц, два раза в месяц, три раза в месяц или более. Фармацевтическую композицию вводят в течение по меньшей мере 1 месяца, 2 месяцев, 3 месяцев, 4 месяцев, 5 месяцев, 6 месяцев, 7 месяцев, 8 месяцев, 9 месяцев, 10 месяцев, 11 месяцев, 12 месяцев, 18 месяцев, 2 лет, 3 лет или более.

[343] В случае, когда состояние пациента действительно улучшается, по усмотрению врача композицию вводят непрерывно, в качестве альтернативы, дозу вводимой композиции временно уменьшают или временно приостанавливают на определенный период времени (т.е. «отдых от лекарств»). В некоторых случаях продолжительность отдыха от лекарств варьирует от 2 дней до 1 года, в том числе только в качестве примера: 2 дня, 3 дня, 4 дня, 5 дней, 6 дней, 7 дней, 10 дней, 12 дней, 15 дней, 20 дней, 28 дней, 35 дней, 50 дней, 70 дней, 100 дней, 120 дней, 150 дней, 180 дней, 200 дней, 250 дней, 280 дней, 300 дней, 320 дней, 350 дней или 365 дней. Снижение дозы во время отдыха от лекарств составляет от 10% до 100%, включая в себя только в качестве примера 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 100%.

[344] После улучшения состояния пациента при необходимости назначают поддерживающую дозу. Впоследствии, дозировка или частота введения, или и то и другое, могут быть уменьшены, в зависимости от симптомов, до уровня, при котором сохраняется улучшенное заболевание, нарушение или состояние.

[345] Согласно некоторым вариантам осуществления количество данного средства, которое соответствует такому количеству, варьирует в зависимости от таких факторов, как конкретное соединение, серьезность заболевания, идентичность (например, масса) нуждающегося в лечении субъекта или хозяина, но, тем не менее, как правило, определяют способом, известным в настоящей области техники, в соответствии с конкретными обстоятельствами, связанными с этим случаем, включая в себя, например, конкретное вводимое средство, путь введения и подвергаемый лечению субъект или хозяин. В некоторых случаях желаемую дозу удобно представлять в виде одной дозы или в виде разделенных доз, вводимых одновременно (или в течение короткого периода времени) или через соответствующие интервалы, например, в виде двух, трех, четырех или более субдоз в день.

[346] Вышеуказанные диапазоны являются просто наводящими на размышления, поскольку число переменных в отношении индивидуальной схемы лечения велико, и значительные отклонения от этих рекомендуемых значений не являются редкостью. Такие дозы изменяются в зависимости от ряда переменных, не ограничиваясь активностью используемого соединения, подлежащим лечению заболеванием или состоянием, способом введения, требованиями индивидуального субъекта, тяжестью подлежащего лечению заболевания или состояния и мнением лечащего врача.

[347] Согласно некоторым вариантам осуществления токсичность и терапевтическую эффективность таких схем лечения определяют стандартными фармацевтическими процедурами на клеточных культурах или экспериментальных животных, включая в себя, без ограничения, определение LD50 (дозы, летальной для 50% популяции) и ED50 (дозы терапевтически эффективной у 50% популяции). Соотношение доз между токсическим и терапевтическим эффектами является терапевтическим показателем, и оно выражается как соотношение между LD50 и ED50. Соединения, демонстрирующие высокие терапевтические показатели, являются предпочтительными. Данные, полученные из анализов клеточных культур и исследований на животных, используются при составлении диапазона дозировок для применения у человека. Дозировка таких соединений предпочтительно находится в диапазоне циркулирующих концентраций, которые включают в себя ED50 с минимальной токсичностью. Дозировка варьирует в этом диапазоне в зависимости от применяемой лекарственной формы и применяемого пути введения.

Наборы/изделие

[348] В настоящем документе согласно некоторым вариантам осуществления раскрыты наборы и изделия для применения с одним или несколькими описанными в настоящем документе способами и композициями. Такие наборы включают в себя носитель, упаковку или контейнер, который разделен на части для приема одного или нескольких контейнеров, таких как флаконы, пробирки и т.п., каждый из которых содержит один или несколько отдельных элементов, которые должны использоваться в описанном в настоящем документе способе. Подходящие контейнеры включают в себя, например, бутылки, флаконы, шприцы и пробирки. Согласно одному варианту осуществления контейнеры изготавливают из различных материалов, таких как стекло или пластик.

[349] Изделия, представленные в настоящем документе, содержат упаковочные материалы. Примеры фармацевтических упаковочных материалов включают в себя, без ограничения, блистерные упаковки, бутылки, тюбики, пакеты, контейнеры, флаконы и любой упаковочный материал, подходящий для выбранной композиции и предполагаемого способа введения и обработки.

[350] Например, контейнер(ы) содержит один или несколько полипептидов цитокинов (например, IL-2) или конъюгатов цитокинов (например, IL-2), описанных в настоящем документе, и, необязательно, один или несколько фармацевтических вспомогательных веществ, описанных в настоящем документе, для облегчения доставки полипептидов цитокинов (например, IL-2) или конъюгатов цитокинов (например, IL-2). Такие наборы дополнительно необязательно содержат идентифицирующее описание или этикетку или инструкции, относящиеся к его применению в описанных в настоящем документе способах.

[351] Набор, как правило, содержит этикетки с перечнем содержимого и/или инструкции по применению, а также вкладыши с инструкциями по применению. Набор инструкций также, как правило, включается.

[352] Согласно одному варианту осуществления этикетка находится на контейнере или связана с ним. Согласно одному варианту осуществления этикетка находится на контейнере, когда буквы, цифры или другие символы, образующие этикетку, прикреплены, отлиты или вытравлены в самом контейнере, этикетка связана с контейнером, когда она присутствует внутри емкости или держателя, который также содержит контейнер, например, как вкладыш в упаковку. Согласно одному варианту осуществления этикетка используется для указания того, что содержимое должно использоваться для конкретного терапевтического применения. На этикетке также указаны указания по применению содержимого, например, в описанных в настоящем документе способах.

[353] Согласно определенным вариантам осуществления фармацевтические композиции представлены в упаковке или дозирующем устройстве, которое содержит одну или несколько стандартных дозированных форм, содержащих представленное в настоящем документе соединение. Упаковка, например, содержит металлическую или пластиковую фольгу, такую как блистерная упаковка. Согласно одному варианту осуществления упаковка или дозирующее устройство сопровождаются инструкциями по введению. Согласно одному варианту осуществления упаковка или дозатор также сопровождаются уведомлением, связанным с контейнером, в форме, предписанной правительственным агентством, регулирующим производство, использование или продажу фармацевтических препаратов, причем это уведомление отражает одобрение агентством формы лекарственного средства для применения у людей или животных. Например, таким уведомлением является маркировка, одобренная Управлением по контролю за продуктами и лекарствами США для лекарств, или утвержденный вкладыш продукта. Согласно одному варианту осуществления композиции, содержащие представленное в настоящем документе соединение, составленное в совместимом фармацевтическом носителе, также готовят, помещают в соответствующий контейнер и маркируют для лечения указанного состояния.

Определенные термины

[354] Если не определено иначе, все технические и научные термины, используемые в настоящем документе, характеризуются тем же значением, которое обычно понимается специалистом в области техники, к которой относится заявленный объект изобретения. Следует понимать, что подробное описание является только иллюстративным и пояснительным и не ограничивает любой заявленный предмет. В настоящей заявке использование единственного числа включает в себя множественное число, если специально не указано иное. Следует отметить, что, как используется в настоящем документе, формы единственного числа включают в себя множественные объекты, если контекст явно не предписывает иное. В настоящей заявке использование «или» означает «и/или», если не указано иное. Кроме того, использование термина «включающий в себя», а также других форм, таких как «включают в себя», «включает в себя» и «включенный», не является ограничивающим.

[355] Хотя различные особенности настоящего изобретения могут быть описаны в контексте одного варианта осуществления, особенности также могут быть представлены отдельно или в любой подходящей комбинации. И наоборот, хотя настоящее изобретение может быть описано в настоящем документе в контексте отдельных вариантов осуществления для ясности, настоящее изобретение также может быть реализовано согласно одному варианту осуществления.

[356] Ссылка в описании на «некоторые варианты осуществления», «вариант осуществления», «один вариант осуществления» или «другие варианты осуществления» означает, что конкретная особенность, структура или характеристика, описанные в связи с вариантами осуществления, включена по меньшей мере в некоторые варианты осуществления, но не обязательно все варианты осуществления настоящего изобретения.

[357] Как используется в настоящем документе, диапазоны и количества могут быть выражены как «приблизительно» конкретное значения или диапазон. Около также включает в себя точное количество. Следовательно, «около 5 мкл» означает «около 5 мкл», а также «5 мкл». Как правило, термин «приблизительно» включает в себя количество, которое, как ожидается, будет находиться в пределах ошибки эксперимента, такой как, например, в пределах 15%, 10% или 5%.

[358] Заголовки разделов, используемые в настоящем документе, предназначены только для организационных целей и не должны рассматриваться как ограничивающие предмет описания.

[359] Используемые в настоящем документе термины «индивидуум(ы)», «субъект(ы)» и «пациент(ы)» означают любое млекопитающее. Согласно некоторым вариантам осуществления млекопитающее является человеком. Согласно некоторым вариантам осуществления млекопитающее не является человеком. Ни один из терминов не требует и не ограничивается ситуациями, характеризуемыми наблюдением (например, постоянным или прерывистым) работника здравоохранения (например, врача, дипломированной медсестры, практикующей медсестры, помощника врача, санитара или работника хосписа).

[360] Используемый в настоящем документе термин «значительный» или «значительно» в отношении аффинности связывания означает изменение аффинности связывания цитокина (например, полипептида IL-2), достаточное для воздействия на связывание цитокина (например, полипептида IL-2) с целевым рецептором. В некоторых случаях термин относится к изменению по меньшей мере на 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% или более. В некоторых случаях термин означает изменение, составляющее по меньшей мере 2-кратное, 3-кратное, 4-кратное, 5-кратное, 6-кратное, 7-кратное, 8-кратное, 9-кратное, 10-кратное, 50-кратное, 100-кратное, 500-кратное, 1000-кратное или более.

[361] В некоторых случаях термин «значительный» или «значительно» в отношении активации одной или нескольких клеточных популяций посредством сигнального комплекса цитокинов означает изменение, достаточное для активации клеточной популяции. В некоторых случаях изменение активации клеточной популяции измеряется как сигнальная активность рецептора. В таких случаях может быть указано значение ЕС50. В других случаях может быть указано значение ED50. В дополнительных случаях может быть предусмотрена концентрация или дозировка цитокина.

[362] Используемый в настоящем документе термин «активность» относится к количеству цитокина (например, полипептида IL-2), необходимому для получения целевого эффекта. В некоторых случаях термин «активность» относится к количеству цитокина (например, полипептида IL-2), необходимому для активации целевого рецептора цитокинов (например, рецептора IL-2). В других случаях термин «активность» относится к количеству цитокина (например, полипептида IL-2), необходимому для активации популяции целевых клеток. В некоторых случаях активность измеряется как ED50 (эффективная доза 50), или доза, необходимая для получения 50% максимального эффекта. В других случаях активность измеряется как ЕС50 (эффективная концентрация 50) или доза, необходимая для достижения целевого эффекта у 50% популяции.

ПРИМЕРЫ

[363] Эти примеры приведены только для иллюстративных целей, а не для ограничения объема формулы изобретения, представленной в настоящем документе.

ПРИМЕР 1

[364] Анализы димеризации киназы и цитокиновых рецепторов.

[365] Подготовка клеток

[366] Клеточные линии PathHunter подвергали экспансии из запасов морозильника в соответствии со стандартными процедурами. Клетки высевали в общем объеме 20 мкл в 384-луночные микропланшеты с белыми стенками и инкубировали в течение соответствующего времени перед испытанием.

[367] Формат агониста

[368] Для определения агониста клетки инкубировали с образцом для индукции ответа. Промежуточное разбавление запасов образцов выполняли для получения образца 5Х в буфере для анализа. Около 5 мкл образца 5Х добавляли к клеткам и инкубировали при температуре 37°С в течение 6-16 часов в зависимости от анализа. Концентрация наполнителя составляла 1%.

[369] Обнаружение сигнала

[370] Сигнал анализа производили путем однократного добавления 12,5 или 15 мкл (50% по объему) набора реагентов PathHunter Detection для анализов на агонист и антагонист, соответственно, с последующей инкубацией в течение одного часа при комнатной температуре. В некоторых анализах активность обнаруживали с использованием высокочувствительного реагента для обнаружения (PathHunter Flash Kit) для повышения эффективности анализа. В этих анализах в лунки добавляли равный объем реагента для обнаружения (25 или 30 мкл) с последующей инкубацией в течение одного часа при комнатной температуре. Микропланшеты считывали после получения сигнала с помощью прибора PerkinElmer EnvisionTM для обнаружения сигнала хемилюминесцеции.

[371] Анализ данных

[372] Активность соединения анализировали с использованием набора для анализа данных CBIS (ChemInnovation, СА). Для анализов в режиме агониста процентную активность рассчитывали по следующей формуле:

% активности = 100% × (среднее значение RLU исследуемого образца - среднее значение RLU контроля наполнителя)/(среднее значение MAX RLU контрольного лиганда - среднее значение RLU контроля наполнителя).

[373] Для анализов в режиме антагониста процент ингибирования рассчитывали по следующей формуле:

% ингибирования = 100% × (1 - (среднее значение RLU исследуемого образца - среднее значение RLU контроля наполнителя)/(среднее значение RLU контроля ЕС80 - среднее значение RLU контроля наполнителя)).

ПРИМЕР 2

[374] Клеточный скрининг для идентификации пегилированных соединений IL-2 без вовлечения IL-2Rα

[375] Структурные данные сигнального комплекса IL-2/гетеротримерный рецептор (PDB:2ERJ) использовали для направленного дизайна сайтов nAA-пегилирования для специфического аннулирования взаимодействия IL-2 и α-субъединицы рецептора IL-2 (IL-2Rα). Иллюстративные конъюгаты IL-2 подвергали функциональному анализу: K35, F42, K43, Е62 и Р65. Конъюгаты IL-2 экспрессировали в виде телец включения в Е. coli, очищали и повторно сворачивали с использованием стандартных процедур перед специфическим пегилированием продукта IL-2 с использованием DBCO-опосредованной клик-химии без меди для присоединения стабильных ковалентных фрагментов mPEG к AzK.

[376] Конъюгаты IL-2 подвергали скринингу на функциональную активность в Discoverx (Fremont СА) с использованием анализа рецептора цитокинов IL-2 PathHunter. В этом анализе используют рекомбинантную клеточную линию U2OS человека, которая экспрессирует субъединицы β (IL-2Rβ) и γ (IL-2Rγ) рецептора IL-2, каждая из которых слита с половиной расщепленного репортерного фермента β-галактозидазы. Вторую клеточную линию дополнительно конструировали для экспрессии субъединицы IL-2Rα. Параллельное исследование с этими двумя клеточными линиями позволяет оценить вариант активации рецептора αβγ IL-2, а также базального комплекса βγ. Активность агониста IL-2 на рецепторном комплексе βγ IL-2 стимулирует димеризацию рецептора и восстановление репортерной β-галактозидазы, что приводит к хемилюминесцентному сигналу. Анализ проводили в режиме агониста для определения ЕС-50 каждого исследуемого изделия, и сравнение профилей кривой доза-ответ между IL2Rα-положительными и отрицательными типами клеток позволяет определить вклад IL2Rα в наблюдаемую активность.

[377] В таблице 1 приведены данные ЕС50 для агонизма рецептора IL-2 при клеточном скрининге для пегилированных конъюгатов IL-2 размером 30 кДа.

[378] Биохимические взаимодействия пегилированного IL-2 с субъединицами рецептора IL-2 человека.

[379] Кинетику взаимодействий пегилированного соединения IL-2 с субъединицами рецептора IL-2 человека измеряли с использованием поверхностного плазмонного резонанса (SPR) в Biosensor Tools LLC (Солт-Лейк-Сити, Юта). В этих исследованиях слитые с Fc IgG1 человека внеклеточные домены Rα (Sino Biological #10165-Н02Н) и β (Sino Biological #10696-Н02Н) IL-2 захватывали на поверхности сенсорного чипа СМ4, покрытого белком A Biacore. Эти поверхности исследовали в двух экземплярах, с сериями двукратного разбавления, начиная с 2 мкМ либо нативного IL-2 (IL-2 дикого типа; Thermo # РНС0021), P65_30kD, Р65_5kD, E62_30kD или E62_5kD с использованием прибора Biacore 2000 SPR. Исследуемые образцы вводили в течение 60 с, чтобы можно было измерить ассоциацию, а затем только буфер (промывку) в течение 30 с, чтобы измерить диссоциацию. Единицы ответа (RU, ось Y) отображают в зависимости от времени (с, ось X).

[380] Чтобы оценить влияние субъединицы α рецептора IL-2 на связывание IL-2 с β, α захватывали около в двухкратном избытке относительно β. На эти поверхности наносили нативный IL-2 (IL-2 дикого типа), Р65_30kD, Р65_5kD, Е62_30kD или Е62_5kD в серии трехкратного разбавления, начиная с 2,5 мкМ. Данные связывания соответствовали модели взаимодействия 1:1, которая включала в себя сдвиг массива, и извлеченные кинетические параметры суммированы в таблице 2А и таблице 2В.

[381] На сенсорных поверхностях, содержащих иммобилизованный IL-2Rα, нативный IL-2 демонстрировал быструю кинетику ассоциации и медленную кинетику диссоциации, демонстрируя высокоаффинное связывание (фиг. 4А). Напротив, ни Р65 30kD, ни E62_30kD не взаимодействуют с поверхностью IL-2Rα даже при самой высокой исследуемой концентрации 2 мкМ (фиг. 4А). Поверхности, содержащие иммобилизованный IL-2Rβ, демонстрировали сопоставимые реакции ассоциации и диссоциации как с нативным IL-2 (IL-2 дикого типа), так и с IL-2 Р65_30kD (фиг. 4В). Небольшое различие в K-D, наблюдаемое между соединениями для субъединицы β, обусловлено снижением скорости ассоциации IL-2 P65_30kD по сравнению с нативным IL-2, ожидаемое из-за изменения гидродинамического радиуса этого пегилированного соединения (более низкий коэффициент диффузии), а также неспецифического экранирующего воздействия большого фрагмента PEG на отдаленные поверхности связывания. Эти результаты предполагают, что P65_30kD и E62_30kD являются дефектными во взаимодействиях IL-2Rα, в то же время в значительной степени сохраняя связывание с IL-2Rβ.

[382] Профилирование иммунного ответа ex-vivo IL-2 P65_30kD и E62_kD в образцах РВМС, полученных из первичной системы снижения лейкоцитов человека (LRS)

[383] Чтобы определить, как дифференциальная рецепторная специфичность IL-2 Р65_30kD и Е62_30kD влияет на активацию субпопуляций первичных иммунных клеток, профилирование концентрации-ответа активации лимфоцитов в образцах мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС) человека, полученных из LRS, выполняли с использованием многоцветной проточной цитометрии. Эти исследования выполняли в PrimityBio LLC (Fremont, СА). Свежие полученные из LRS образцы обрабатывали либо нативным IL-2, Р65_30kD, либо Е62_30kD в серии 5-кратных разведений, начиная с максимальной концентрации 30 мкг/мл. После 45-минутной инкубации образцы фиксировали и окрашивали антителами для выявления фосфорилированной формы фактора транскрипции STAT5 (pSTAT5), маркера предшествующего вовлечения и активации сигнальных комплексов рецептора IL-2 и панели поверхностных маркеров (таблица 3) для отслеживания образования pSTAT5 в специфических субпопуляциях Т-клеток и клеток естественных киллеров (NK).

[384] Данные проточной цитометрии анализировали для активации различных подмножеств Т- и NK-клеток в режиме концентрация-ответ, считывая накопления pSTAT5 после обработки нативным IL-2 (фиг. 5А), Е62_30kD (фиг. 5В) и Р65_30kD (фиг. 5С). В популяциях NK- и эффекторных Т-клеток (CD3+ CD8+) IL-2 Р65_30kD и IL-2 E62_30kD сохраняли активность относительно нативного IL-2, при этом значения ЕС-50 для производства pSTAT5 в 4-5 раз превышали нативный IL-2 (фиг. 5А). Напротив, значения ЕС-50 для индукции pSTAT5 для IL-2 Р65_30kD в субпопуляции Treg (CD3+ CD4+ IL-2Rα+ CD127-) были снижены в 900 раз по сравнению с нативным IL-2, но оставались сходными с ЕС50 для популяции NK- и Teff-клеток (фиг. 5С). Это существенное увеличение ЕС-50 для IL-2 P65_30kD конкретно в популяции Treg указывает на то, что пегилирование IL-2 в этих положениях делает возможным агонизм рецепторов IL-2, но устраняет смещение IL-2 для стимуляции Treg относительно эффекторных Т-клеток.

[385] Значения ЕС50 (пг/мл) рассчитывали по кривым доза-ответ, полученным из графиков MFI.

ПРИМЕР 3

[386] Исследования PK/PD на интактных (Е3826-U1704) и несущих опухоль В16-F10 (Е3826-U1803) мышах C57BL/6

[387] Дизайны исследования суммированы в таблицах 5 и 6. Терминальные образцы крови брали с помощью пункции сердца в указанные точки времени. Исследование E3826-U1704, включающее 13 временных точек (0,13, 0,25, 0,5, 1, 2, 4, 8, 12, 24, 48, 72, 96 и 120 ч), включало в себя 3 мыши на каждую временную точку, и исследование Е3826-U1803 включало в себя 9 временных точек (2, 8, 12, 24, 48, 72, 120, 168 и 240 ч) по 4-7 мышей на каждую временную точку. Плазму и клетки крови (в обоих исследованиях) и опухоли в исследовании E3826-U1803 собирали для анализа PK и PD.

[388] Биоанализ образцов плазмы проводили с использованием квалифицированного анализа ELISA IL-2 человека (Abeam, Cambridge, UK). Концентрации альдеслейкина, Е62_30kD и Р65_30kD и внутреннего стандарта в образцах, полученных из плазмы, определяли с помощью анализа ELISA. Анализ данных PK выполняли в NW Solutions (Сиэтл, штат Вашингтон). Данные PK импортировали в Phoenix WinNonlin v6.4 (Certara/Pharsight, Princeton, NJ) для анализа. Данные о средней концентрации в плазме в зависимости от времени анализировали некоммерческими способами с использованием внутривенной болюсной модели.

[389] Профили концентрации в плазме P65_30kD, E62_30kD, E62_5kD и альдеслейкина в 0,3 мг/кг представлены на фиг. 6.

[390] В исследовании E3826-U1704 как Р65_30kD, так и Е62_30kD демонстрируют превосходный профиль PK по сравнению с альдеслейкином, как показано в таблице 3. После однократной внутривенной болюсной дозы альдеслейкина, Tmax наблюдали через 0,03 ч после введения дозы (временная точка первого измерения после введения дозы) и средние концентрации в плазме измеряли до 4 ч после введения дозы. После однократной внутривенной болюсной дозы Р65_30 кДа и Е62_30 кДа Tmax наблюдали через 0,03 ч после введения дозы, а средние концентрации в плазме измеряли до 120 ч после введения дозы (последняя измеренная временная точка). В отдельном исследовании после внутривенного введения дозы Е625 кДа Tmax наблюдали через 0,133 часа после введения дозы, а средние концентрации в плазме измеряли до 12 часов после введения дозы.

[391] Воздействие, основанное На С-max и AUC-0-t, было следующим: Р65_30kD>>Е62_30kD>>Е62_5kD>альдеслейкин. Е62_5kD с меньшим PEG характеризовался профилем PK ближе к rIL-2. Воздействие P65_30kD было в 5,5 и 200 раз выше, чем у альдеслейкина на основе Cmax и AUC0-t, соответственно. Кроме того, P65_30kD продемонстрировал 23-кратное увеличение t1/2 (13,3 ч против 0,57 ч) и около 198-кратное снижение CL (6,58 против 1300 мл/ч/кг) по сравнению с альдеслейкином. Как для Р65_30kD, так и для Е62_30kD объем распределения (82,4 и 92,3 мл/кг, соответственно) уменьшился около в 4,2-4,7 раза по сравнению с альдеслейкином и аналогичен объему крови у мыши (85 мл/кг; [Boersen 2013]). Это говорит о том, что P65_30kD и E62_30kD в основном распределены внутри системной циркуляции.

ПРИМЕР 4

[392] Фармакодинамические наблюдения в компартменте периферической крови

[393] Фосфорилирование STAT5 и индукция пролиферации клеток (ранний молекулярный маркер Ki-67 и количество клеток) использовали в качестве фармакодинамических показаний для оценки фармакологического профиля Р65_30kD относительно его фармакокинетики. Маркер pSTAT5 PD показал хорошую корреляцию с PK как для P65_30kD, так и для альдеслейкина в CD8+ эффекторных Т-клетках (таблица 7). Постоянное повышение pSTAT5 наблюдалось как в NK-, так и в CD8+ Т-клетках до 72 часов и до 24 часов в Tregs. Индукция pSTAT5 возвращалась к исходному уровню только через 2 часа у мышей, которым вводили альдеслейкин (фиг. 7). Фосфорилирование STAT5 транслировалось в отсроченные пролиферативные ответы (72-120 часов) CD8+ эффекторных Т-клеток и NK-клеток, но не с Т regs (фиг. 8А-8С). Фенотипический анализ эффекторных CD8+ Т-клеток выявил значительную экспансию CD44+ клеток памяти в этой популяции (фиг. 9А-9В).

[394] Фармакодинамические наблюдения в опухолевом компартменте у несущих опухоль B16-F10 (Е3826-U1803) мышей C57BL/6

[395] В таблице 8 показана концентрация лекарственного средства в плазме и опухоли после однократного введения дозы Р65_30kD в дозе 3 мг/кг мышам с опухолями B16-F10. Время полужизни в опухоли было в два раза больше времени полужизни в плазме (24,4 против 12,6), что указывает на то, что P65_30kD проникает в опухоль и сохраняется в опухоли. Хвостовой конец кривых пересекается, показывая, что элиминация из плазмы происходит быстрее, чем из опухоли. Соотношение AUC опухоль:плазма составляло 9,7% и 8,4% для доз 1 и 3 мг/кг, соответственно.

[396] На фиг. 10А - фиг. 10В показана экспансия NK- и CD+ Т-клеток под действием Р65_30kD в опухолях B16F10. На фиг. 10А показан процент NK-клеток, CD8+ -клеток и Tregs в популяции опухолевых CD3+ Т-клеток после лечения однократной внутривенной болюсной дозой P65_30kD при 3 мг/кг. Образцы опухолей анализировали на популяции иммунных клеток через 5 дней после воздействия способом проточной цитометрии. Каждая точка данных представляет собой среднее из трех повторений в каждый момент времени ± SEM. Представленные данные о клеточной популяции взяты из образцов опухоли на 5-й день, а отношение CD8/Treg рассчитывали на основе образцов на 7-й день. На фиг. 10В показано соотношение CD8+ эффекторных к CD4+ регуляторным Т-клеткам через 7 дней после лечения однократной внутривенной болюсной дозой Р65_30kD в дозе 3 мг/кг. Каждая точка данных представляет собой среднее из трех повторений в каждую временную точку ± SEM.

[397] Исследование MTD на мышах Balb/c Е3826-U1802

[398] Исследование диапазона дозирования Р65_30kD проводили на интактных самках мышей Balb/c в Crown Biosciences, Inc. (Сан-Диего, Калифорния). Дизайн исследования показан в таблице 9. Образцы крови отбирали через нижнечелюстную вену в 7 временных точках (0,25, 1, 4, 12, 24, 34, 48 и 72 ч). И плазму, и клетки крови собирали для анализа PK и PD.

[399] Все образцы плазмы анализированы на человеческий IL-2, а также на мышиные цитокины IL-2, TNF-α, IFNγ, IL-5 и IL-6 с использованием коммерчески доступных наборов ELISA.

[400] Токсикологические наблюдения в исследовании MTD с использованием мышей Balb/c

[401] Основной токсичностью, связанной с высокими дозами IL-2, является синдром пропотевания жидкости из сосудов и связанный с ним синдром высвобождения цитокинов (CRS). Чтобы оценить это у мышей, выполняли однократное внутривенное введение P65_30kD в дозах в диапазоне от 0,01 до 5,0 мг/кг (таблица 10). Проведенный анализ представлял собой гематологию, гистопатологию, анализ массы тела и анализ цитокинов. Нарушения не наблюдались в гематологии, гистопатологии или массе тела по сравнению с получавшими контрольный наполнитель мышами как с P65_30kD, так и с альдеслейкином. Что касается анализа цитокинов, было отмечено, что альдеслейкин повышал содержание IL-5 в плазме, начиная с 1 мг/кг до 5 мг/кг (фиг. 11А). С Р65_30kD умеренное увеличение IL-5 наблюдалось только при дозе 5 мг/кг, и это было меньше по сравнению с альдеслейкином (фиг. 11В). Временное повышение системного содержания IFNγ наблюдалось как для альдеслейкина, так и для Р65_30kD.

ПРИМЕР 5

[402] PK/PD у яванских макаков - исследование №20157276

[403] Фармакокинетический и фармакодинамический профиль Р65_30kD оценивали у подвергнутых воздействию яванских макаков после введения однократной внутривенной дозы 0,3 мг/кг. Исследование проводили в Charles River Laboratories, Inc. (Reno, NV), a анализ данных PK проводили в NW Solutions (Seattle, WA). Образцы крови собирали до введения дозы и в 21 временную точку (0,5, 1, 2, 4, 8, 12, 24, 36, 48, 72, 120, 144, 168, 192 и 240 ч после введения дозы). И плазму, и клетки крови собирали для анализа PK и PD. Выбранные временные точки использовали для анализа PK, PD, клеточной популяции и гематологического анализа.

[404] Все образцы плазмы анализировали на человеческий IL-2 (считывание PK) с использованием коммерчески доступных наборов ELISA.

[405] В таблице 10 приведены параметры PK P65_30kD у яванских макаков.

[406] После однократного внутривенного болюсного введения Tmax наблюдали через 0,5 ч после введения дозы (первая измеренная временная точка после введения дозы), а средние концентрации в плазме измеряли до 168 ч после введения дозы (последнее измерение), t-1/2 и AUC для Р65_30kD составляли 13,6 ч и 121000 ч×нг/мл, соответственно.

[407] Гематологические показатели - яванские макаки - исследование №20157276

[408] Для гематологических параметров временные точки оценки соответствуют предварительной дозе в день -1 и 1, 3, 6, 8, 10, 12, 14, 17, 19, 21 после введения дозы.

[409] На фиг. 12 показано абсолютное содержание лейкоцитов и дифференциальные показатели. Данные представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение (N=2 животных/группа дозы).

[410] Анализ субпопуляций лейкоцитов (WBC) показал, что значительное увеличение количества лейкоцитов было вызвано увеличением популяции лимфоцитов, что согласуется с механизмом Р65_30kD. Не наблюдается повышения эозинофилов.

ПРИМЕР 6

[411] В таблице 11 показаны последовательности IL-2, описанные в настоящем документе.

[412] Хотя предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения были показаны и описаны в настоящем документе, специалистам в настоящей области техники будет очевидно, что такие варианты осуществления представлены только в качестве примера. Специалистам в настоящей области техники понятно, что будут происходить многочисленные вариации, изменения и замены без отступления от настоящего изобретения. Следует понимать, что различные альтернативы описанным в настоящем документе вариантам осуществления настоящего изобретения могут быть использованы при практическом применении настоящего изобретения. Предполагается, что нижеследующая формула изобретения определяет объем настоящего изобретения и что таким образом охватываются способы и структуры в пределах объема формулы изобретения и их эквивалентов.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> СИНТОРКС ИНК.

<120> КОНЪЮГАТЫ ЦИТОКИНОВ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ПРОЛИФЕРАТИВНЫХ И ИНФЕКЦИОННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ

<130> 46085-710.601

<140>

<141>

<150> 62/540,781

<151> 2017-08-03

<160> 5

<170> PatentIn версия 3.5

<210> 1

<211> 133

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His

1 5 10 15

Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys

20 25 30

Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys

35 40 45

Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys

50 55 60

Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu

65 70 75 80

Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu

85 90 95

Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala

100 105 110

Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile

115 120 125

Ile Ser Thr Leu Thr

130

<210> 2

<211> 153

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2

Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu

1 5 10 15

Val Thr Asn Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu

20 25 30

Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile

35 40 45

Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe

50 55 60

Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu

65 70 75 80

Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys

85 90 95

Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile

100 105 110

Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala

115 120 125

Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe

130 135 140

Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr

145 150

<210> 3

<211> 5

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 3

Gly Gly Gly Gly Ser

1 5

<210> 4

<211> 5

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<220>

<221> MOD_RES

<222> (4)..(4)

<223> Любая аминокислота, кроме пролина

<400> 4

Val Pro Gly Xaa Gly

1 5

<210> 5

<211> 30

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полипептид

<400> 5

Phe Gln Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro

1 5 10 15

Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln

20 25 30

<---

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к конъюгатам интерлейкина-2, и может быть использовано медицине. Изобретение раскрывает конъюгат варианта пептида IL-2 c водорастворимым полимером. Такой конъюгат обладает увеличенным временем действия в сравнении с немодифицированным природным пептидом. Кроме того, конъюгирующий фрагмент в составе молекулы заявленного конъюгата также ослабляет или блокирует связывание IL-2 с IL-2Ra. Изобретение может быть применимо в медицинской практике в качестве иммуномодулирующего терапевтического средства при лечении ряда пролиферативных заболеваний. 4 н. и 24 з.п. ф-лы, 6 пр., 11 табл., 12 ил.

1. Конъюгат интерлейкина-2 (IL-2) для лечения пролиферативного заболевания или инфекции, содержащий:

a) модифицированный полипептид интерлейкина-2 (IL-2), содержащий по меньшей мере одну неприродную аминокислоту, где модифицированный полипептид интерлейкина-2 (IL-2) включает по меньшей мере 80% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 1,

где положение по меньшей мере одной неприродной аминокислоты выбрано из К35, Т37, R38, Т41, F42, К43, F44, Y45, Е60, Е61, E62, K64, P65, E68, V69, N71, L72, M104, C105 и Y107, и

причем положения остатков соответствуют положениям 35, 37, 38, 41, 42, 43, 44, 45, 60, 61, 62, 64, 65, 68, 69, 71, 72, 104, 105 и 107, как представлено в SEQ ID NO: 1;

b) конъюгирующий фрагмент, ковалентно присоединенный через линкер к по меньшей мере одной неприродной аминокислоте;

причем конъюгирующий фрагмент представляет собой водорастворимый полимер, включающий полиэтиленгликоль (PEG), поли(пропиленгликоль) (PPG), сополимеры этиленгликоля и пропиленгликоля, поли(оксиэтилированный полиол), поли(олефиновый спирт), поли(винилпирролидон), поли(гидроксиалкилметакриламид), поли(гидроксиалкилметакрилат), поли(сахариды), поли(альфа-гидроксикислоту), поли(виниловый спирт), полифосфазен, полиоксазолины (POZ), поли(N-акрилоилморфолин), поли[олиго(этиленгликоль)метилметакрилат] (POEGMA) или их комбинацию.

2. Конъюгат интерлейкина-2 (IL-2) по п. 1, отличающийся тем, что конъюгат модифицированный полипептид интерлейкина-2 (IL-2) включает по меньшей мере 90% идентичность последовательности к SEQ ID NO: 1.

3. Конъюгат интерлейкина-2 (IL-2) по п. 1, в котором положение по меньшей мере одной неприродной аминокислоты выбрано из F42, K43, F44, E62 и P65, причем положения остатков соответствуют положениям 42, 43, 44, 62 и 65, как представлено в SEQ ID NO: 1.

4. Конъюгат интерлейкина-2 (IL-2) по п. 3, в котором положение по меньшей мере одной неприродной аминокислоты представляет собой E62, причем положения остатков соответствуют положению 62, как представлено в SEQ ID NO: 1.

5. Конъюгат интерлейкина-2 (IL-2) по п. 3, в котором положение по меньшей мере одной неприродной аминокислоты представляет собой P65, причем положения остатков соответствуют положению 65, как представлено в SEQ ID NO: 1.

6. Конъюгат интерлейкина-2 (IL-2) по п. 1, в котором по меньшей мере одна неприродная аминокислота представляет собой аналог лизина или содержит ароматическую боковую цепь.

7. Конъюгат интерлейкина-2 (IL-2) по п. 1, в котором водорастворимый полимер содержит полиэтиленгликоль (PEG).

8. Конъюгат интерлейкина-2 (IL-2) по п. 7, в котором полиэтиленгликоль (PEG) имеет средневесовую молекулярную массу от около 10 кДа до около 85 кДа.

9. Конъюгат интерлейкина-2 (IL-2) по п. 8, в котором полиэтиленгликоль (PEG) имеет средневесовую молекулярную массу, выбранную из около 20 кД, около 25 кДа, около 30 кДа, около 35 кДа, около 40 кДа, около 45 кДа или около 50 кДа.

10. Конъюгат интерлейкина-2 (IL-2) по п. 1, в котором:

a) положение по меньшей мере одной неприродной аминокислоты выбрано из F42, K43, F44, Y45, E62 и P65, причем положения остатков соответствуют положениям 42, 43, 44, 45, 62 и 65, как представлено в SEQ ID NO: 1;

b) модифицированный полипептид интерлейкина-2 (IL-2) содержит N-концевую делецию, включающую делецию первых 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 остатков с N-конца, причем положения остатков относятся к положениям в SEQ ID NO: 1;

c) конъюгирующий фрагмент представляет собой полиэтиленгликоль (PEG), имеющий средневесовую молекулярную массу от около 20 кДа до около 85 кДа; и

d) модифицированный полипептид интерлейкина-2 (IL-2) включает по меньшей мере 90% идентичность последовательности к SEQ ID NO: 1.

11. Конъюгат интерлейкина-2 (IL-2) по п. 10, отличающийся тем, что модифицированный полипептид интерлейкина-2 (IL-2) содержит N-концевую делецию, включающую делецию первых 1, 2, 3, 4 или 5 остатков с N-конца, причем положения остатков относятся к положениям в SEQ ID NO: 1.

12. Конъюгат интерлейкина-2 (IL-2) по п. 11, в котором полиэтиленгликоль (PEG) имеет средневесовую молекулярную массу, выбранную из около 20 кДа, около 25 кДа, около 30 кДа, около 35 кДа, около 40 кДа, около 45 кДа или около 50 кДа.

13. Конъюгат интерлейкина-2 (IL-2) по любому из пп. 1-12, в котором по меньшей мере одна неприродная аминокислота включает в себя N6-азидоэтокси-L-лизин (AzK), N6-пропаргилэтокси-L-лизин (PraK), BCN-L-лизин, норборнен-лизин, TCO-лизин, метилтетразин-лизин, аллилоксикарбониллизин, 2-амино-8-оксононановую кислоту, 2-амино-8-оксооктановую кислоту, п-ацетил-L-фенилаланин, п-азидометил-L-фенилаланин (pAM), п-йод-L-фенилаланин, м-ацетилфенилаланин, 2-амино-8-оксононановую кислоту, п-пропаргилоксифенилаланин, п-пропаргилфенилаланин, 3-метилфенилаланин, L-ДОФА, фторированный фенилаланин, изопропил-L-фенилаланин, п-азидо-L-фенилаланин, п-ацил-L-фенилаланин, п-бензоил-L-фенилаланин, п-бромфенилаланин, п-амино-L-фенилаланин, изопропил-L-фенилаланин, O-аллилтирозин, O-метил-L-тирозин, O-4-аллил-L-тирозин, 4-пропил-L-тирозин, фосфонотирозин, три-O-ацетил-GlcNAcp-серин, L-фосфосерин, фосфоносерин, L-3-(2-нафтил)аланин, 2-амино-3-((2-((3-(бензилокси)-3-оксопропил)амино)этил)селанил)пропановую кислоту, 2-амино-3-(фенилселанил)пропановую кислоту или селеноцистеин.

14. Фармацевтическая композиция для лечения пролиферативного заболевания или инфекции, содержащая эффективное количество конъюгата интерлейкина-2 (IL-2) по любому из пп. 1-13 и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество.

15. Фармацевтическая композиция по п. 14, отличающаяся тем, что фармацевтическая композиция составлена для системной или парентеральной доставки.

16. Способ лечения пролиферативного заболевания или состояния у нуждающегося в этом субъекта, включающий введение субъекту конъюгата интерлейкина-2 (IL-2) по любому из пп. 1-13 или фармацевтической композиции по п. 14 или 15.

17. Способ по п. 16, при котором пролиферативное заболевание или состояние представляет собой рак.

18. Способ по п. 17, в котором рак представляет собой солидную опухоль.

19. Способ по п. 18, в котором солидная опухоль представляет собой рак мочевого пузыря, рак кости, рак головного мозга, рак молочной железы, колоректальный рак, рак пищевода, рак глаза, рак головы и шеи, рак почки, рак легкого, меланому, рак яичников, рак поджелудочной железы или рак предстательной железы.

20. Способ по п. 17, в котором рак представляет собой гематологическое злокачественное новообразование.

21. Способ по п. 20, в котором гематологическое злокачественное новообразование представляет собой хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL), мелкоклеточную лимфоцитарную лимфому (SLL), фолликулярную лимфому (FL), диффузную B-крупноклеточную лимфому (DLBCL), мантийноклеточную лимфому (MCL), макроглобулинемию Вальденстрема, множественную миелому, экстранодальную В-клеточную лимфому из клеток маргинальной зоны, нодальную В-клеточную лимфому из клеток маргинальной зоны, лимфому Беркитта, В-крупноклеточную лимфому не Беркитта, первичную медиастинальную В-клеточную лимфому (PMBL), иммунобластную крупноклеточную лимфому, В-лимфобластную лимфому из клеток-предшественников, пролимфоцитарный лейкоз В-клеток, лимфоплазмоцитарную лимфому, лимфому маргинальной зоны селезенки, миелому плазматических клеток, плазмоцитому, В-крупноклеточную лимфому средостения (тимуса), внутрисосудистую В-крупноклеточную лимфому, первичную выпотную лимфому или лимфоматоидный гранулематоз.

22. Способ экспансии популяции CD4+ хелперных клеток, CD8+ эффекторных наивных клеток, CD8+ эффекторных клеток памяти, клеток естественных киллеров (NK) или Т-клеток естественных киллеров (NKT), включающий приведение клеточной популяции в контакт с конъюгатом интерлейкина-2 (IL-2) по любому из пп. 1-13 или фармацевтической композицией по п. 14 или 15 в течение времени, достаточного для индукции образования комплекса c IL-2, стимулируя тем самым экспансию популяции Teff и/или NK-клеток.

23. Способ по п. 22, в котором конъюгат интерлейкина-2 (IL-2) вызывает экспансию CD4+ T-регуляторных (Treg) клеток менее чем на 20%, 15% 10%, 5% или 1% в популяции CD3+ клеток по сравнению с экспансией CD4+ Treg-клеток в популяции CD3+ клеток, контактирующих с полипептидом IL-2 дикого типа.

24. Способ по п. 22, в котором конъюгат интерлейкина-2 (IL-2) не вызывает экспансию CD4+ Treg-клеток в популяции клеток.

25. Способ по п. 22, в котором отношение Teff-клеток к Treg-клеткам в клеточной популяции после инкубации с конъюгатом интерлейкина-2 (IL-2) составляет приблизительно или по меньшей мере 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 20:1, 50:1 или 100:1.

26. Способ по п. 22, отличающийся тем, что способ представляет собой способ in vivo.

27. Способ по п. 22, отличающийся тем, что способ представляет собой способ in vitro.

28. Способ по п. 22, отличающийся тем, что способ представляет собой способ ex vivo.