УСОВЕРШЕНСТВОВАННЫЕ ПРОТЕОМНЫЕ МУЛЬТИПЛЕКСНЫЕ АНАЛИЗЫ Российский патент 2023 года по МПК G01N33/50 C07B61/00 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

[0001] Настоящее изобретение в целом относится к области протеомных анализов, а также к способам, устройствам, реагентам и наборам, разработанным для улучшения характеристик анализов. Такие методы широко используются при проведении протеомных анализов для исследований и разработок, диагностики и терапии. В частности, представлены материалы и способы для уменьшения или устранения фонового сигнала и повышения специфичности реагентов, связывающих белок, в формате мультиплексного анализа.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[0002] Анализы, направленные на обнаружение и количественную оценку физиологически значимых молекул в биологических образцах и других типах образцов, являются важными инструментами в научных исследованиях и в области здравоохранения. Например, в мультиплексных матричных анализах для обнаружения молекул-мишеней в образце используются зонды, связанные с поверхностью. Зонды, связанные с поверхностью, могут представлять собой олигонуклеотиды, пептиды, полипептиды, белки, антитела, аффитела, аптамеры или другие молекулы (в совокупности называются биополимерами), способные связываться с молекулами-мишенями из образца. Эти взаимодействия связывания лежат в основе многих способов и устройств, используемых в самых разных областях, например, геномике, транскриптомике и протеомике.

[0003] Анализы обеспечивают взаимодействие с мишенью в растворе и стадии разделения, предназначенные для удаления определенных компонентов из аналитической смеси. Однако чувствительность и специфичность многих форматов анализа ограничены способностью метода обнаружения отделять истинный сигнал от сигнала, который возникает во время анализа из-за неспецифических связей и приводит к ложному обнаружению сигнала. Это особенно верно для мультиплексных анализов, независимо от используемого захватывающего реагента (например, антитела или аптамеров). Одним из ключевых источников неспецифического связывания являются непредвиденные неспецифические взаимодействия захватывающего реагента с молекулами-мишенями или неспецифические взаимодействия связывания. В этом изобретении описаны способы устранения или уменьшения фонового сигнала, наблюдаемого в мультиплексном протеомном анализе, при сохранении взаимодействий, специфичных для мишени/захватывающего реагента.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0004] В некоторых вариантах осуществления раскрыт способ, который включает: a) приведение в контакт первого разведения образца с первым аптамером, причем первый аптамерный аффинный комплекс образуется посредством взаимодействия первого аптамера с его молекулой-мишенью при наличии молекулы-мишени в первом разведении образца; b) приведение в контакт второго разведения образца со вторым аптамером, причем второй аптамерный аффинный комплекс образуется посредством взаимодействия второго аптамера с его молекулой-мишенью при наличии молекулы-мишени во втором разведении образца; c) инкубацию первого и второго разведений образцов по отдельности, с обеспечением возможности образования аптамерного аффинного комплекса; d) перенос первого разведения образца с первым аптамерным аффинным комплексом в первую смесь, при этом первый аптамерный аффинный комплекс захватывается на твердой подложке в первой смеси; e) после стадии d), перенос второго разведения образца в первую смесь с образованием второй смеси, при этом второй аптамерный аффинный комплекс второго разведения захватывается на твердой подложке во второй смеси; f) обнаружение наличия или определение уровня первого аптамера и второго аптамера первого и второго аптамерных аффинных комплексов, или наличия или количества одного или более из первого и второго аптамерных аффинных комплексов; при этом первое разведение и второе разведение представляют собой разные разведения одного и того же тестируемого образца.

[0005] В одном аспекте тестируемый образец выбран из плазмы, сыворотки, мочи, цельной крови, лейкоцитов, мононуклеарных клеток периферической крови, лейкоцитарной пленки, мокроты, слез, слизи, носовых промывных вод, назального аспирата, спермы, слюны, промывных вод брюшины, асцитной жидкости, кистозной жидкости, менингеальной жидкости, амниотической жидкости, жидкости, вырабатываемой железами, лимфатической жидкости, аспирата из сосков, бронхиального аспирата, материала бронхов, взятого с помощью щеточки, синовиальной жидкости, аспирата суставной жидкости, секретов органов, клеток, экстракта клеток и спинномозговой жидкости.

[0006] В другом аспекте первый и второй аффинные комплексы из аптамера и молекулы-мишени являются нековалентными комплексами.

[0007] В другом аспекте молекула-мишень выбрана из белка, пептида, углевода, полисахарида, гликопротеина, гормона, рецептора, антигена, антитела, вируса, бактерии, метаболита, кофактора, ингибитора, лекарственного средства, красителя, питательного вещества, фактора роста, клетки и ткани.

[0008] В другом аспекте первое разведение представляет собой разведение тестируемого образца от 0,001% до 0,009% (или составляет 0,001%, 0,002%, 0,003%, 0,004%, 0,005%, 0,006%, 0,007%, 0,008% или 0,009%), или от 0,002% до 0,008%, или от 0,003% до 0,007%, или составляет приблизительно 0,005%, а второе разведение представляет собой разведение тестируемого образца от 0,01% до 1% (или составляет при этом 0,01%, 0,02%, 0,03%, 0,04%, 0,05%, 0,06%, 0,07%, 0,08%, 0,09%, 0,1%, 0,15%, 0,2%, 0,25%, 0,3%, 0,35%, 0,4%, 0,45%, 0,5%, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9% или 1%), или от 0,1% до 0,8%, или от 0,2% до 0,75%, или составляет приблизительно 0,5%.

[0009] В другом аспекте первое разведение представляет собой разведение тестируемого образца от 0,001% до 0,009% (или 0,001%, 0,002%, 0,003%, 0,004%, 0,005%, 0,006%, 0,007%, 0,008% или 0,009%), или от 0,002% до 0,008%, или от 0,003% до 0,007% или составляет приблизительно 0,005%; а второе разведение представляет собой разведение тестируемого образца от 5% до 39% (или составляет 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38% или 39%), или от 15% до 30%, или от 15% до 25%, или составляет приблизительно 20%.

[0010] В другом аспекте первое разведение представляет собой разведение тестируемого образца от 0,01% до 1% (или составляет 0,01%, 0,02%, 0,03%, 0,04%, 0,05%, 0,06%, 0,07%, 0,08%, 0,09%, 0,1%, 0,15%, 0,2%, 0,25%, 0,3%, 0,35%, 0,4%, 0,45%, 0,5%, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9% или 1%), или от 0,1% до 0,8%, или от 0,2% до 0,75%, или составляет приблизительно 0,5%; а второе разведение представляет собой разведение тестируемого образца от 5% до 39% (или составляет 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38% или 39%), или от 15% до 30%, или от 15% до 25%, или составляет приблизительно 20%.

[0011] В другом аспекте первое разведение представляет собой разведение тестируемого образца от 0,01% до 1% (или составляет 0,01%, 0,02%, 0,03%, 0,04%, 0,05%, 0,06%, 0,07%, 0,08%, 0,09%, 0,1%, 0,15%, 0,2%, 0,25%, 0,3%, 0,35%, 0,4%, 0,45%, 0,5%, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9% или 1%), или от 0,1% до 0,8%, или от 0,2% до 0,75%, или составляет приблизительно 0,5%; а второе разведение представляет собой разведение тестируемого образца от 0,001% до 0,009% (или составляет 0,001%, 0,002%, 0,003%, 0,004%, 0,005%, 0,006%, 0,007%, 0,008% или 0,009%), или от 0,002% до 0,008%, или от 0,003% до 0,007%, или составляет приблизительно 0,005%.

[0012] В другом аспекте первое разведение представляет собой разведение тестируемого образца от 5% до 39% (или составляет 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38% или 39%), или от 15% до 30%, или от 15% до 25%, или составляет приблизительно 20%, а второе разведение представляет собой разведение тестируемого образца от 0,01% до 1% (или составляет 0,01%, 0,02%, 0,03%, 0,04%, 0,05%, 0,06%, 0,07%, 0,08%, 0,09%, 0,1%, 0,15%, 0,2%, 0,25%, 0,3%, 0,35%, 0,4%, 0,45%, 0,5%, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9% или 1%), или от 0,1% до 0,8%, или от 0,2% до 0,75%, или составляет приблизительно 0,5%.

[0013] В другом аспекте первое разведение представляет собой разведение тестируемого образца от 5% до 39% (или составляет 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38% или 39%), или от 15% до 30%, или от 15% до 25%, или составляет приблизительно 20%, а второе разведение представляет собой разведение тестируемого образца от 0,001% до 0,009% (или составляет 0,001%, 0,002%, 0,003%, 0,004%, 0,005%, 0,006%, 0,007%, 0,008% или 0,009%), или от 0,002% до 0,008%, или от 0,003% до 0,007%, или составляет приблизительно 0,005%.

[0014] В другом аспекте обнаружение наличия или определение уровня диссоциированных первого и второго захватывающих реагентов выполняется с помощью ПЦР, масс-спектрометрии, секвенирования нуклеиновых кислот, секвенирования нового поколения (NGS) или гибридизации.

[0015] В другом аспекте первый аптамер и/или второй аптамер независимо содержит по меньшей мере один пиримидин, модифицированный в положении 5.

[0016] В другом аспекте по меньшей мере один пиримидин, модифицированный в положении 5, содержит в положении 5 пиримидина линкер и присоединенный к линкеру фрагмент.

[0017] В другом аспекте линкер выбран из амидного линкера, карбонильного линкера, пропинильного линкера, алкинового линкера, сложноэфирного линкера, мочевинного линкера, карбаматного линкера, гуанидинового линкера, амидинового линкера, сульфоксидного линкера и сульфонового линкера.

[0018] При этом в другом аспекте фрагмент представляет собой гидрофобный фрагмент.

[0019] В другом аспекте фрагмент выбран из фрагментов, представленных в группах I, II, III, IV, V, VII, VIII, IX, XI, XII, XIII, XV и XVI на Фиг. 1.

[0020] В другом аспекте фрагмент выбран из нафтильного фрагмента, бензильного фрагмента, фторбензильного фрагмента, тирозильного фрагмента, индольного фрагмента, морфолинового фрагмента, изобутильного фрагмента, 3,4-метилендиоксибензильного фрагмента, бензотиофенильного фрагмента и бензофуранильного фрагмента.

[0021] В другом аспекте пиримидин модифицированного в положении 5 пиримидина представляет собой уридин, цитидин или тимидин.

[0022] В другом аспекте способы, раскрытые в настоящем документе, дополнительно включают приведение в контакт третьего разведения образца с третьим аптамером, причем третий аптамерный аффинный комплекс образуется посредством взаимодействия третьего аптамера с его молекулой-мишенью при наличии молекулы-мишени в третьем разведении образца.

[0023] В другом аспекте третье разведение образца инкубируют отдельно от первого и второго разведений образцов с обеспечением возможности образования аптамерного аффинного комплекса из третьего аптамера и его молекулы-мишени.

[0024] В другом аспекте способы, раскрытые в настоящем документе, дополнительно включают перенос третьего разведения образца во вторую смесь с образованием третьей смеси, причем третий аптамерный аффинный комплекс третьего разведения захватывается на твердой подложке в третьей смеси.

[0025] В другом аспекте способы, раскрытые в настоящем документе, дополнительно включают обнаружение наличия или определение уровня третьего аптамера третьего аптамерного аффинного комплекса, или наличия или количества третьего аптамерного аффинного комплекса.

[0026] В другом аспекте третье разведение представляет собой разведение, отличное от первого разведения и второго разведения одного и того же тестируемого образца.

[0027] В другом аспекте третье разведение представляет собой разведение тестируемого образца, выбранное в диапазоне от 5% до 39% (или составляет 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38% или 39%), от 15% до 30%, от 15% до 25%, приблизительно 20%; от 0,01% до 1% (или 0,01%, 0,02%, 0,03%, 0,04%, 0,05%, 0,06%, 0,07%, 0,08%, 0,09%, 0,1%, 0,15%, 0,2%, 0,25%, 0,3%, 0,35%, 0,4%, 0,45%, 0,5%, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9% или 1%), от 0,1% до 0,8%, от 0,2% до 0,75%, приблизительно 0,5%; и от 0,001% до 0,009% (или 0,001%, 0,002%, 0,003%, 0,004%, 0,005%, 0,006%, 0,007%, 0,008% или 0,009%), или от 0,002% до 0,008%, от 0,003% до 0,007%, приблизительно 0,005%.

[0028] В другом аспекте третий аптамер содержит по меньшей мере один модифицированный в положении 5 пиримидин.

[0029] В другом аспекте по меньшей мере один пиримидин, модифицированный в положении 5, содержит в положении 5 пиримидина линкер и присоединенный к линкеру фрагмент.

[0030] В другом аспекте линкер выбран из амидного линкера, карбонильного линкера, пропинильного линкера, алкинового линкера, сложноэфирного линкера, мочевинного линкера, карбаматного линкера, гуанидинового линкера, амидинового линкера, сульфоксидного линкера и сульфонового линкера.

[0031] В другом аспекте фрагмент представляет собой гидрофобный фрагмент.

[0032] В другом аспекте фрагмент выбран из фрагментов, представленных в группах I, II, III, IV, V, VII, VIII, IX, XI, XII, XIII, XV и XVI на Фиг. 1.

[0033] В другом аспекте фрагмент выбран из нафтильного фрагмента, бензильного фрагмента, фторбензильного фрагмента, тирозильного фрагмента, индольного фрагмента, морфолинового фрагмента, изобутильного фрагмента, 3,4-метилендиоксибензильного фрагмента, бензотиофенильного фрагмента и бензофуранильного фрагмента.

[0034] В другом аспекте пиримидин модифицированного в положении 5 пиримидина представляет собой уридин, цитидин или тимидин.

[0035] В некоторых вариантах осуществления раскрыт способ, который включает: a) приведение в контакт первого захватывающего реагента с первым разведением с образованием первой смеси и второго захватывающего реагента со вторым разведением с образованием второй смеси, причем каждый из первого и второго захватывающих реагентов иммобилизован на твердой подложке, и при этом каждый из первого и второго захватывающих реагентов обладает аффинностью к разным молекулам-мишеням; b) инкубацию первой смеси и второй смеси отдельно, при этом аффинный комплекс из первого захватывающего реагента и молекулы-мишени образуется в первой смеси в том случае, если в первой смеси присутствует молекула-мишень, к которой обладает аффинностью первый захватывающий реагент, при этом аффинный комплекс из второго захватывающего реагента и молекулы-мишени образуется во второй смеси в том случае, если во второй смеси присутствует молекула-мишень, к которой обладает аффинностью второй захватывающий реагент; c) последовательное высвобождение и объединение аффинных комплексов в четвертой смеси в порядке, выбранном из (i) аффинный комплекс из первого захватывающего реагента и молекулы-мишени, а затем аффинный комплекс из второго захватывающего реагента и молекулы-мишени и (ii) аффинный комплекс из второго захватывающего реагента и молекулы-мишени, а затем аффинный комплекс из первого захватывающего реагента и молекулы-мишени; d) присоединение первого тега к молекуле-мишени аффинных комплексов из первого и второго захватывающего реагента и молекулы-мишени; e) приведение в контакт содержащих тег аффинных комплексов из первого и второго захватывающего реагента и молекулы-мишени с одной или более твердыми подложками таким образом, что тег иммобилизует аффинные комплексы из первого и второго захватывающего реагента и молекулы-мишени на одной или более твердых подложках; f) диссоциацию захватывающих реагентов из аффинных комплексов из захватывающего реагента и молекулы-мишени; g) обнаружение наличия или определение уровня диссоциированных захватывающих реагентов; при этом первое разведение и второе разведение представляют собой разные разведения одного и того же тестируемого образца.

[0036] В одном аспекте тестируемый образец выбран из плазмы, сыворотки, мочи, цельной крови, лейкоцитов, мононуклеарных клеток периферической крови, лейкоцитарной пленки, мокроты, слез, слизи, носовых промывных вод, назального аспирата, спермы, слюны, промывных вод брюшины, асцитной жидкости, кистозной жидкости, менингеальной жидкости, амниотической жидкости, жидкости, вырабатываемой железами, лимфатической жидкости, аспирата из сосков, бронхиального аспирата, материала бронхов, взятого с помощью щеточки, синовиальной жидкости, аспирата суставной жидкости, секретов органов, клеток, экстракта клеток и спинномозговой жидкости.

[0037] В одном аспекте аффинные комплексы из первого и второго захватывающего реагента и белка-мишени являются нековалентными комплексами.

[0038] В одном аспекте первый захватывающий реагент и второй захватывающий реагент независимо выбраны из аптамера или антитела.

[0039] В одном аспекте молекула-мишень выбрана из белка, пептида, углевода, полисахарида, гликопротеина, гормона, рецептора, антигена, антитела, вируса, бактерии, метаболита, кофактора, ингибитора, лекарственного средства, красителя, питательного вещества, фактора роста, клетки и ткани.

[0040] В одном аспекте первое разведение представляет собой разведение тестируемого образца от 0,001% до 0,009% (или составляет 0,001%, 0,002%, 0,003%, 0,004%, 0,005%, 0,006%, 0,007%, 0,008% или 0,009%), или от 0,002% до 0,008%, или от 0,003% до 0,007%, или составляет приблизительно 0,005%, а второе разведение представляет собой разведение тестируемого образца от 0,01% до 1% (или составляет 0,01%, 0,02%, 0,03%, 0,04%, 0,05%, 0,06%, 0,07%, 0,08%, 0,09%, 0,1%, 0,15%, 0,2%, 0,25%, 0,3%, 0,35%, 0,4%, 0,45%, 0,5%, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9% или 1%), или от 0,1% до 0,8%, или от 0,2% до 0,75%, или составляет приблизительно 0,5%.

[0041] В одном аспекте первое разведение представляет собой разведение тестируемого образца от 0,001% до 0,009% (или 0,001%, 0,002%, 0,003%, 0,004%, 0,005%, 0,006%, 0,007%, 0,008% или 0,009%), или от 0,002% до 0,008%, или от 0,003% до 0,007% или составляет приблизительно 0,005%; а второе разведение представляет собой разведение тестируемого образца от 5% до 39% (или составляет 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38% или 39%), или от 15% до 30%, или от 15% до 25%, или составляет приблизительно 20%.

[0042] В одном аспекте первое разведение представляет собой разведение тестируемого образца от 0,01% до 1% (или составляет 0,01%, 0,02%, 0,03%, 0,04%, 0,05%, 0,06%, 0,07%, 0,08%, 0,09%, 0,1%, 0,15%, 0,2%, 0,25%, 0,3%, 0,35%, 0,4%, 0,45%, 0,5%, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9% или 1%), или от 0,1% до 0,8%, или от 0,2% до 0,75%, или составляет приблизительно 0,5%; а второе разведение представляет собой разведение тестируемого образца от 5% до 39% (или составляет 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38% или 39%), или от 15% до 30%, или от 15% до 25%, или составляет приблизительно 20%.

[0043] В одном аспекте первое разведение представляет собой разведение тестируемого образца от 0,01% до 1% (или составляет 0,01%, 0,02%, 0,03%, 0,04%, 0,05%, 0,06%, 0,07%, 0,08%, 0,09%, 0,1%, 0,15%, 0,2%, 0,25%, 0,3%, 0,35%, 0,4%, 0,45%, 0,5%, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9% или 1%), или от 0,1% до 0,8%, или от 0,2% до 0,75%, или составляет приблизительно 0,5%; а второе разведение представляет собой разведение тестируемого образца от 0,001% до 0,009% (или составляет 0,001%, 0,002%, 0,003%, 0,004%, 0,005%, 0,006%, 0,007%, 0,008% или 0,009%), или от 0,002% до 0,008%, или от 0,003% до 0,007%, или составляет приблизительно 0,005%.

[0044] В одном аспекте первое разведение представляет собой разведение тестируемого образца от 5% до 39% (или составляет 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38% или 39%), или от 15% до 30%, или от 15% до 25%, или составляет приблизительно 20%, а второе разведение представляет собой разведение тестируемого образца от 0,01% до 1% (или составляет 0,01%, 0,02%, 0,03%, 0,04%, 0,05%, 0,06%, 0,07%, 0,08%, 0,09%, 0,1%, 0,15%, 0,2%, 0,25%, 0,3%, 0,35%, 0,4%, 0,45%, 0,5%, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9% или 1%), или от 0,1% до 0,8%, или от 0,2% до 0,75%, или составляет приблизительно 0,5%.

[0045] В одном аспекте первое разведение представляет собой разведение тестируемого образца от 5% до 39% (или составляет 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38% или 39%), или от 15% до 30%, или от 15% до 25%, или составляет приблизительно 20%, а второе разведение представляет собой разведение тестируемого образца от 0,001% до 0,009% (или составляет 0,001%, 0,002%, 0,003%, 0,004%, 0,005%, 0,006%, 0,007%, 0,008% или 0,009%), или от 0,002% до 0,008%, или от 0,003% до 0,007%, или составляет приблизительно 0,005%.

[0046] В одном аспекте обнаружение наличия или определение уровня диссоциированных первого и второго захватывающих реагентов выполняется с помощью ПЦР, масс-спектрометрии, секвенирования нуклеиновых кислот, секвенирования нового поколения (NGS) или гибридизации.

[0047] В другом аспекте способы, раскрытые в настоящем документе, дополнительно включают приведение в контакт третьего захватывающего реагента с третьим разведением с образованием третьей смеси, причем третий захватывающий реагент иммобилизован на твердой подложке, и при этом третий захватывающий реагент обладает аффинностью к молекуле-мишени, отличной от молекул-мишеней первого и второго захватывающих реагентов.

[0048] В другом аспекте способы, раскрытые в настоящем документе, дополнительно включают инкубацию третьей смеси отдельно от первой смеси и второй смеси, причем аффинный комплекс из третьего захватывающего реагента и молекулы-мишени образуется в третьей смеси в том случае, если в третьей смеси присутствует молекула-мишень, к которой обладает аффинностью третий захватывающий реагент.

[0049] В другом аспекте способы, раскрытые в настоящем документе, дополнительно включают последовательное высвобождение и объединение аффинного комплекса из третьего захватывающего реагента и молекулы-мишени с аффинными комплексами из первого и второго захватывающего реагента и молекулы-мишени в четвертую смесь в порядке, выбранном из (i) аффинный комплекс из первого захватывающего реагента и молекулы-мишени, затем аффинный комплекс из второго захватывающего реагента и молекулы-мишени, а затем аффинный комплекс из третьего захватывающего реагента и молекулы-мишени; (ii) аффинный комплекс из первого захватывающего реагента и молекулы-мишени, затем аффинный комплекс из третьего захватывающего реагента и молекулы-мишени, а затем аффинный комплекс из второго захватывающего реагента и молекулы-мишени; (iii) аффинный комплекс из второго захватывающего реагента и молекулы-мишени, затем аффинный комплекс из третьего захватывающего реагента и молекулы-мишени, а затем аффинный комплекс из первого захватывающего реагента и молекулы-мишени; (iv) аффинный комплекс из второго захватывающего реагента и молекулы-мишени, затем аффинный комплекс из первого захватывающего реагента и молекулы-мишени, а затем аффинный комплекс из третьего захватывающего реагента и молекулы-мишени; (v) аффинный комплекс из третьего захватывающего реагента и молекулы-мишени, затем аффинный комплекс из первого захватывающего реагента и молекулы-мишени, а затем аффинный комплекс из второго захватывающего реагента и молекулы-мишени; и (vi) аффинный комплекс из третьего захватывающего реагента и молекулы-мишени, затем аффинный комплекс из второго захватывающего реагента и молекулы-мишени, а затем аффинный комплекс из первого захватывающего реагента и молекулы-мишени.

[0050] В одном аспекте третье разведение представляет собой разведение, отличное от первого разведения и второго разведения одного и того же тестируемого образца.

[0051] В одном аспекте третье разведение представляет собой разведение тестируемого образца, выбранное в диапазоне от 5% до 39% (или составляет 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38% или 39%), от 15% до 30%, от 15% до 25%, приблизительно 20%; от 0,01% до 1% (или 0,01%, 0,02%, 0,03%, 0,04%, 0,05%, 0,06%, 0,07%, 0,08%, 0,09%, 0,1%, 0,15%, 0,2%, 0,25%, 0,3%, 0,35%, 0,4%, 0,45%, 0,5%, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9% или 1%), от 0,1% до 0,8%, от 0,2% до 0,75%, приблизительно 0,5%; и от 0,001% до 0,009% (или 0,001%, 0,002%, 0,003%, 0,004%, 0,005%, 0,006%, 0,007%, 0,008% или 0,009%), или от 0,002% до 0,008%, от 0,003% до 0,007%, приблизительно 0,005%.

[0052] В другом аспекте способы, раскрытые в настоящем документе, дополнительно включают обнаружение наличия или определение уровня третьего аптамера третьего аптамерного аффинного комплекса, или наличия или количества третьего аптамерного аффинного комплекса.

[0053] В одном аспекте аптамер содержит по меньшей мере один модифицированный в положении 5 пиримидин.

[0054] В одном аспекте по меньшей мере один пиримидин, модифицированный в положении 5, содержит в положении 5 пиримидина линкер и присоединенный к линкеру фрагмент.

[0055] В одном аспекте линкер выбран из амидного линкера, карбонильного линкера, пропинильного линкера, алкинового линкера, сложноэфирного линкера, мочевинного линкера, карбаматного линкера, гуанидинового линкера, амидинового линкера, сульфоксидного линкера и сульфонового линкера.

[0056] В одном аспекте фрагмент представляет собой гидрофобный фрагмент.

[0057] В одном аспекте фрагмент выбран из фрагментов, представленных в группах I, II, III, IV, V, VII, VIII, IX, XI, XII, XIII, XV и XVI на Фиг. 1.

[0058] В одном аспекте фрагмент выбран из нафтильного фрагмента, бензильного фрагмента, фторбензильного фрагмента, тирозильного фрагмента, индольного фрагмента, морфолинового фрагмента, изобутильного фрагмента, 3,4-метилендиоксибензильного фрагмента, бензотиофенильного фрагмента и бензофуранильного фрагмента.

[0059] В одном аспекте пиримидин модифицированного в положении 5 пиримидина представляет собой уридин, цитидин или тимидин.

[0060] В некоторых вариантах осуществления раскрыт способ, который включает: a) приведение в контакт первого захватывающего реагента с первым разведением с образованием первой смеси, второго захватывающего реагента со вторым разведением с образованием второй смеси и третьего захватывающего реагента с третьим разведением с образованием смеси третьего разведения, причем каждый из первого, второго и третьего захватывающих реагентов иммобилизован на твердой подложке, и при этом каждый из первого, второго и третьего захватывающих реагентов обладает аффинностью к разным молекулам-мишеням; b) инкубацию первой смеси, второй смеси и третьей смеси отдельно, при этом аффинный комплекс из первого захватывающего реагента и молекулы-мишени образуется в первой смеси в том случае, если в первой смеси присутствует молекула-мишень, к которой обладает аффинностью первый захватывающий реагент, при этом аффинный комплекс из второго захватывающего реагента и молекулы-мишени образуется во второй смеси в том случае, если во второй смеси присутствует молекула-мишень, к которой обладает аффинностью второй захватывающий реагент, и при этом аффинный комплекс из третьего захватывающего реагента и молекулы-мишени образуется в третьей смеси в том случае, если в третьей смеси присутствует молекула-мишень, к которой обладает аффинностью третий захватывающий реагент; c) последовательное высвобождение и объединение аффинных комплексов в четвертой смеси в порядке, выбранном из: (i) аффинный комплекс из первого захватывающего реагента и молекулы-мишени, затем аффинный комплекс из второго захватывающего реагента и молекулы-мишени, а затем аффинный комплекс из третьего захватывающего реагента и молекулы-мишени; (ii) аффинный комплекс из первого захватывающего реагента и молекулы-мишени, затем аффинный комплекс из третьего захватывающего реагента и молекулы-мишени, а затем аффинный комплекс из второго захватывающего реагента и молекулы-мишени; (iii) аффинный комплекс из второго захватывающего реагента и молекулы-мишени, затем аффинный комплекс из третьего захватывающего реагента и молекулы-мишени, а затем аффинный комплекс из первого захватывающего реагента и молекулы-мишени; (iv) аффинный комплекс из второго захватывающего реагента и молекулы-мишени, затем аффинный комплекс из первого захватывающего реагента и молекулы-мишени, а затем аффинный комплекс из третьего захватывающего реагента и молекулы-мишени; (v) аффинный комплекс из третьего захватывающего реагента и молекулы-мишени, затем аффинный комплекс из первого захватывающего реагента и молекулы-мишени, а затем аффинный комплекс из второго захватывающего реагента и молекулы-мишени; и (vi) аффинный комплекс из третьего захватывающего реагента и молекулы-мишени, затем аффинный комплекс из второго захватывающего реагента и молекулы-мишени, а затем аффинный комплекс из первого захватывающего реагента и молекулы-мишени; d) присоединение первого тега к молекуле-мишени аффинных комплексов из первого, второго и третьего захватывающего реагента и молекулы-мишени; e) приведение в контакт содержащих тег аффинных комплексов из первого, второго и третьего захватывающего реагента и молекулы-мишени с одной или более твердыми подложками таким образом, что тег иммобилизует аффинные комплексы из первого, второго и третьего захватывающего реагента и молекулы-мишени на одной или более твердых подложках; f) диссоциацию захватывающих реагентов из аффинных комплексов из захватывающего реагента и молекулы-мишени; g) обнаружение наличия или определение уровня диссоциированных захватывающих реагентов; при этом первое разведение, второе разведение и третье разведение представляют собой разные разведения одного и того же тестируемого образца.

[0061] В одном аспекте тестируемый образец выбран из плазмы, сыворотки, мочи, цельной крови, лейкоцитов, мононуклеарных клеток периферической крови, лейкоцитарной пленки, мокроты, слез, слизи, носовых промывных вод, назального аспирата, спермы, слюны, промывных вод брюшины, асцитной жидкости, кистозной жидкости, менингеальной жидкости, амниотической жидкости, жидкости, вырабатываемой железами, лимфатической жидкости, аспирата из сосков, бронхиального аспирата, материала бронхов, взятого с помощью щеточки, синовиальной жидкости, аспирата суставной жидкости, секретов органов, клеток, экстракта клеток и спинномозговой жидкости.

[0062] В одном аспекте аффинные комплексы из первого, второго и третьего захватывающего реагента и белка-мишени являются нековалентными комплексами.

[0063] В одном аспекте первый захватывающий реагент, второй захватывающий реагент и третий захватывающий реагент независимо выбраны из аптамера или антитела.

[0064] В одном аспекте молекула-мишень выбрана из белка, пептида, углевода, полисахарида, гликопротеина, гормона, рецептора, антигена, антитела, вируса, бактерии, метаболита, кофактора, ингибитора, лекарственного средства, красителя, питательного вещества, фактора роста, клетки и ткани.

[0065] В одном аспекте обнаружение наличия или определение уровня диссоциированных первого и второго захватывающих реагентов выполняется с помощью ПЦР, масс-спектрометрии, секвенирования нуклеиновых кислот, секвенирования нового поколения (NGS) или гибридизации.

[0066] В одном аспекте аптамер содержит по меньшей мере один модифицированный в положении 5 пиримидин.

[0067] В одном аспекте по меньшей мере один пиримидин, модифицированный в положении 5, содержит в положении 5 пиримидина линкер и присоединенный к линкеру фрагмент.

[0068] В одном аспекте линкер выбран из амидного линкера, карбонильного линкера, пропинильного линкера, алкинового линкера, сложноэфирного линкера, мочевинного линкера, карбаматного линкера, гуанидинового линкера, амидинового линкера, сульфоксидного линкера и сульфонового линкера.

[0069] В одном аспекте фрагмент представляет собой гидрофобный фрагмент.

[0070] В одном аспекте фрагмент выбран из фрагментов, представленных в группах I, II, III, IV, V, VII, VIII, IX, XI, XII, XIII, XV и XVI на Фиг. 1.

[0071] В одном аспекте фрагмент выбран из нафтильного фрагмента, бензильного фрагмента, фторбензильного фрагмента, тирозильного фрагмента, индольного фрагмента, морфолинового фрагмента, изобутильного фрагмента, 3,4-метилендиоксибензильного фрагмента, бензотиофенильного фрагмента и бензофуранильного фрагмента.

[0072] В одном аспекте пиримидин модифицированного в положении 5 пиримидина представляет собой уридин, цитидин или тимидин.

[0073] В одном аспекте первое разведение представляет собой разведение тестируемого образца от 0,001% до 0,009% (или составляет 0,001%, 0,002%, 0,003%, 0,004%, 0,005%, 0,006%, 0,007%, 0,008% или 0,009%), или от 0,002% до 0,008%, или от 0,003% до 0,007%, или составляет приблизительно 0,005%, второе разведение представляет собой разведение тестируемого образца от 0,01% до 1% (или составляет 0,01%, 0,02%, 0,03%, 0,04%, 0,05%, 0,06%, 0,07%, 0,08%, 0,09%, 0,1%, 0,15%, 0,2%, 0,25%, 0,3%, 0,35%, 0,4%, 0,45%, 0,5%, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9% или 1%), или от 0,1% до 0,8%, или от 0,2% до 0,75%, или составляет приблизительно 0,5%; и третье разведение представляет собой разведение тестируемого образца от 5% до 39% (или составляет 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38% или 39%), или от 15% до 30%, или от 15% до 25%, или составляет приблизительно 20%.

[0074] В одном аспекте первое разведение представляет собой разведение тестируемого образца от 0,001% до 0,009% (или 0,001%, 0,002%, 0,003%, 0,004%, 0,005%, 0,006%, 0,007%, 0,008% или 0,009%), или от 0,002% до 0,008%, или от 0,003% до 0,007% или составляет приблизительно 0,005%; второе разведение представляет собой разведение тестируемого образца от 5% до 39% (или составляет 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38% или 39%), или от 15% до 30%, или от 15% до 25%, или составляет приблизительно 20%; и третье разведение представляет собой разведение тестируемого образца от 0,01% до 1% (или составляет 0,01%, 0,02%, 0,03%, 0,04%, 0,05%, 0,06%, 0,07%, 0,08%, 0,09%, 0,1%, 0,15%, 0,2%, 0,25%, 0,3%, 0,35%, 0,4%, 0,45%, 0,5%, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9% или 1%), или от 0,1% до 0,8%, или от 0,2% до 0,75%, или составляет приблизительно 0,5%.

[0075] В одном аспекте первое разведение представляет собой разведение тестируемого образца от 0,01% до 1% (или составляет 0,01%, 0,02%, 0,03%, 0,04%, 0,05%, 0,06%, 0,07%, 0,08%, 0,09%, 0,1%, 0,15%, 0,2%, 0,25%, 0,3%, 0,35%, 0,4%, 0,45%, 0,5%, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9% или 1%), или от 0,1% до 0,8%, или от 0,2% до 0,75%, или составляет приблизительно 0,5%; второе разведение представляет собой разведение тестируемого образца от 5% до 39% (или составляет 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38% или 39%), или от 15% до 30%, или от 15% до 25%, или составляет приблизительно 20%; и третье разведение представляет собой разведение тестируемого образца от 0,001% до 0,009% (или 0,001%, 0,002%, 0,003%, 0,004%, 0,005%, 0,006%, 0,007%, 0,008% или 0,009%), или от 0,002% до 0,008%, или от 0,003% до 0,007%, или составляет приблизительно 0,005%.

[0076] В одном аспекте первое разведение представляет собой разведение тестируемого образца от 0,01% до 1% (или составляет 0,01%, 0,02%, 0,03%, 0,04%, 0,05%, 0,06%, 0,07%, 0,08%, 0,09%, 0,1%, 0,15%, 0,2%, 0,25%, 0,3%, 0,35%, 0,4%, 0,45%, 0,5%, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9% или 1%), или от 0,1% до 0,8%, или от 0,2% до 0,75%, или составляет приблизительно 0,5%; второе разведение представляет собой разведение тестируемого образца от 0,001% до 0,009% (или составляет 0,001%, 0,002%, 0,003%, 0,004%, 0,005%, 0,006%, 0,007%, 0,008% или 0,009%), или от 0,002% до 0,008%, или от 0,003% до 0,007%, или составляет приблизительно 0,005%; и третье разведение представляет собой разведение тестируемого образца от 5% до 39% (или составляет 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38% или 39%), или от 15% до 30%, или от 15% до 25%, или составляет приблизительно 20%.

[0077] В одном аспекте первое разведение представляет собой разведение тестируемого образца от 5% до 39% (или составляет 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38% или 39%), или от 15% до 30%, или от 15% до 25%, или составляет приблизительно 20%, второе разведение представляет собой разведение тестируемого образца от 0,01% до 1% (или составляет 0,01%, 0,02%, 0,03%, 0,04%, 0,05%, 0,06%, 0,07%, 0,08%, 0,09%, 0,1%, 0,15%, 0,2%, 0,25%, 0,3%, 0,35%, 0,4%, 0,45%, 0,5%, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9% или 1%), или от 0,1% до 0,8%, или от 0,2% до 0,75%, или составляет приблизительно 0,5%; и третье разведение представляет собой разведение тестируемого образца от 0,001% до 0,009% (или 0,001%, 0,002%, 0,003%, 0,004%, 0,005%, 0,006%, 0,007%, 0,008% или 0,009%), или от 0,002% до 0,008%, или от 0,003% до 0,007%, или составляет приблизительно 0,005%.

[0078] В одном аспекте первое разведение представляет собой разведение тестируемого образца от 5% до 39% (или составляет 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38% или 39%), или от 15% до 30%, или от 15% до 25%, или составляет приблизительно 20%; второе разведение представляет собой разведение тестируемого образца от 0,001% до 0,009% (или составляет 0,001%, 0,002%, 0,003%, 0,004%, 0,005%, 0,006%, 0,007%, 0,008% или 0,009%), или от 0,002% до 0,008%, или от 0,003% до 0,007%, или составляет приблизительно 0,005%; и третье разведение представляет собой разведение тестируемого образца от 0,01% до 1% (или составляет 0,01%, 0,02%, 0,03%, 0,04%, 0,05%, 0,06%, 0,07%, 0,08%, 0,09%, 0,1%, 0,15%, 0,2%, 0,25%, 0,3%, 0,35%, 0,4%, 0,45%, 0,5%, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9% или 1%), или от 0,1% до 0,8%, или от 0,2% до 0,75%, или составляет приблизительно 0,5%.

[0079] Вышеупомянутые и другие цели, элементы и преимущества изобретения станут более очевидными из следующего подробного описания, которое представлено далее со ссылкой на прилагаемые фигуры.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

[0080] Фиг. 1. Некоторые примеры модифицированных в положении 5 нуклеозидов уридина и цитидина, которые могут быть включены в аптамеры.

[0081] Фиг. 2. Некоторые примеры модификаций, которые могут присутствовать в положении 5 уридина. Химическая структура модификации C-5 включает иллюстративную амидную связь, которая связывает модификацию с положением 5 уридина. Представленные фрагменты в положении 5 включают бензильный фрагмент (например, Bn, PE и PP), нафтильный фрагмент (например, Nap, 2Nap, NE), бутильный фрагмент (например, iBu), фторбензильный фрагмент (например, FBn), тирозильный фрагмент (например, Tyr), 3,4-метилендиоксибензил (например, MBn), фрагмент морфолино (например, MOE), бензофуранильный фрагмент (например, BF), индольный фрагмент (например, Trp) и гидроксипропильный фрагмент (например, Thr).

[0082] Фиг. 3. Некоторые примеры модификаций, которые могут присутствовать в положении 5 цитидина. Химическая структура модификации C-5 включает иллюстративную амидную связь, которая связывает модификацию с положением 5 цитидина. Представленные фрагменты в положении 5 включают бензильный фрагмент (например, Bn, PE и PP), нафтильный фрагмент (например, Nap, 2Nap, NE и 2NE) и тирозильный фрагмент (например, Tyr).

[0083] Фиг. 4. Предоставляет иллюстративный обзор наборов разведений биологического образца, соответствующих наборов захватывающих реагентов для соответствующих им разведений, а также общий обзор двузахватной системы («захват-1» и «захват-2»). Из биологического образца могут быть созданы две разные группы разведений, включая Z% разведение биологического образца или РАЗВ. 4, и X% разведение биологического образца или РАЗВ. 1, где Z больше X (или Z является большим разведением, чем разведение X). Каждое разведение имеет свой собственный набор соответствующих захватывающих реагентов (A3 для РАЗВ. 1 и A1 для РАЗВ. 4), которые связываются с определенным набором белков. Два разных набора разведений были перенесены вместе со стадии анализа «захват-1» на стадию «захват-2».

[0084] Фиг. 5. Предоставляет иллюстративный обзор наборов разведений биологического образца, соответствующих наборов захватывающих реагентов для соответствующих им разведений, а также общий обзор двузахватной системы («захват-1» и «захват-2»). Из биологического образца могут быть созданы три разные группы разведений, включая Z% разведение биологического образца или РАЗВ. 3, Y% разведение биологического образца или РАЗВ. 2 и X% разведение биологического образца или РАЗВ. 1, где Z больше Y, а Y больше X (или Z является большим разведением, чем разведение Y, а Y является большим разведением, чем разведение X). Каждое разведение имеет свой собственный набор соответствующих захватывающих реагентов (A3 для РАЗВ. 1, A2 для РАЗВ. 2 и A1 для РАЗВ. 3), которые связываются с определенным набором белков.

[0085] Фиг. 6. Предоставляет обзор трех различных групп приготовленных разведений плазмы: 0,005% разведение (РАЗВ. 1), 0,5% разведение (РАЗВ. 2) и 20% разведение (РАЗВ. 3), в которых проводили измерение уровня белков с высоким, средним и низким относительным содержанием соответственно. Дополнительно показаны наборы аптамеров для каждого РАЗВ. 1, РАЗВ. 2 и РАЗВ. 3 - A1, A2 и A3 соответственно. Группа аптамеров A3 содержала 4271 различный аптамер (или ~ 81% от общего количества аптамеров), группа A2 содержала 828 различных аптамеров (или ~ 16% от общего количества аптамеров), а группа A1 содержала 173 различных аптамера ( ~ 3% от общего количества аптамеров), в общей сложности 5272 различных аптамера. Три разных набора разведений были перенесены вместе со стадии анализа «захват-1» на стадию «захват-2».

[0086] Фиг. 7. Предоставляет иллюстративный обзор наборов разведений биологического образца, соответствующих наборов захватывающих реагентов для соответствующих им разведений, а также общий обзор последовательной двузахватной системы («захват-1» и «захват-2»). Из биологического образца могут быть созданы три разные группы разведений, включая Z% разведение биологического образца или РАЗВ. 3, Y% разведение биологического образца или РАЗВ. 2 и X% разведение биологического образца или РАЗВ. 1, где Z больше Y, а Y больше X (или Z является большим разведением, чем разведение Y, а Y является большим разведением, чем разведение X). Каждое разведение имеет свой собственный набор соответствующих захватывающих реагентов (A3 для РАЗВ. 1, A2 для РАЗВ. 2 и A1 для РАЗВ. 3), которые связываются с определенным набором белков.

[0087] Фиг. 8. Предоставляет обзор трех различных групп приготовленных разведений плазмы: 0,005% разведение (РАЗВ. 1), 0,5% разведение (РАЗВ. 2) и 20% разведение (РАЗВ. 3), в которых проводили измерение уровня белков с высоким, средним и низким относительным содержанием соответственно. Дополнительно показаны наборы аптамеров для каждого РАЗВ. 1, РАЗВ. 2 и РАЗВ. 3 - A1, A2 и A3 соответственно. Группа аптамеров A3 содержала 4271 различный аптамер (или ~ 81% от общего количества аптамеров), группа A2 содержала 828 различных аптамеров (или ~ 16% от общего количества аптамеров), а группа A1 содержала 173 различных аптамера ( ~ 3% от общего количества аптамеров), в общей сложности 5272 различных аптамера. Три разных набора разведений были перенесены последовательно со стадии анализа «захват-1» на стадию «захват-2».

[0088] Фиг. 9. Предоставляет иллюстративный обзор наборов разведений биологического образца, соответствующих наборов захватывающих реагентов для соответствующих им разведений, а также общий обзор двузахватной системы («захват-1» и «захват-2»). Из биологического образца могут быть созданы две разные группы разведений, включая Z% разведение биологического образца или РАЗВ. 4, и X% разведение биологического образца или РАЗВ. 1, где Z больше X (или Z является большим разведением, чем разведение X). Каждое разведение имеет свой собственный набор соответствующих захватывающих реагентов (A3 для РАЗВ. 1 и A1 для РАЗВ. 4), которые связываются с определенным набором белков. Два разных набора разведений были перенесены последовательно со стадии анализа «захват-1» на стадию «захват-2».

[0089] Фиг. 10. По мере проведения анализа, когда все три набора разведений были перенесены вместе из части анализа «захват-1» в часть анализа «захват-2», был построен график кумулятивной функции распределения (CDF) соотношения сигнала аптамера для условия 1 (т. е. всех трех групп разведений РАЗВ. 1, РАЗВ. 2 и РАЗВ. 3) и сигнала аптамера для каждого из условий 2, 3 и 4 (таблица 2; где представлена только одна из групп разведений вместе с холостыми пробами). Соотношение сигналов аптамера представлено в относительных единицах флуоресценции (ОЕФ), полученных с использованием гибридизации на матрицах.

[0090] Фиг. 11. По мере проведения анализа, когда три набора разведений были перенесены последовательно из части анализа «захват-1» в часть анализа «захват-2», был построен график кумулятивной функции распределения (CDF) соотношения сигнала аптамера для условия 1 (т. е. всех трех групп разведений РАЗВ. 1, РАЗВ. 2 и РАЗВ. 3) и сигнала аптамера для каждого из условий 2, 3 и 4 (была представлена только одна из групп разведений вместе с холостыми пробами). Соотношение сигналов аптамера представлено в относительных единицах флуоресценции (ОЕФ), полученных с использованием гибридизации на матрицах.

[0091] Фиг. 12. Графическое представление количества аналитов в линейном диапазоне (ось Y; слева) вместе с соотношением медианного С/Ф (ось Y; справа) для каждого из 40%, 20%, 10% и 5% разведения (ось X). При 20% разведении биологического образца наблюдается максимальное количество аналитов в линейном диапазоне, имеющих наибольшее значение соотношения медианного С/Ф (где пересекаются две линии).

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЕ

[0092] Если не указано иное, технические термины используются в соответствии с их общепринятым использованием. Определения общих терминов из области молекулярной биологии представлены в публикациях Benjamin Lewin, Genes V, опубликованной Oxford University Press, 1994 (ISBN 0-19-854287-9); Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, опубликованной Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); и Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, опубликованной VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8).

[0093] Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в данном документе, имеют то же значение, которое обычно понимает обычный специалист в той области техники, к которой относится это изобретение. Формы единственного числа включают ссылки на формы множественного числа, если в контексте явно не указано иное. Фраза «содержащий А или В» означает включающий А, или В, или А и В. Кроме того, следует понимать, что все размеры оснований или размеры аминокислот и все значения молекулярного веса или молекулярной массы, приведенные для нуклеиновых кислот или полипептидов, являются приблизительными и представлены для описания.

[0094] Кроме того, считается, что диапазоны, приведенные в данном документе, являются сокращением для всех значений в пределах диапазона. Например, подразумевается, что диапазон от 1 до 50 включает любое число, комбинацию чисел или поддиапазон из группы, состоящей из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 или 50 (а также их дробные значения, если из контекста явно следует иное). Любой диапазон концентрации, процентный диапазон, диапазон соотношения или целочисленный диапазон следует понимать как включающий значение любого целого числа в указанном диапазоне и, при необходимости, части целого числа (например, одна десятая и одна сотая часть целого числа), если не указано иное. Кроме того, любой диапазон чисел, приведенный в данном документе в отношении любого физического признака, такого как полимерные субъединицы, размер или толщина, следует понимать как включающий любое целое число в указанном диапазоне, если не указано иное. Используемый в данном документе термин «приблизительно» или «по существу состоящий из» означает ± 20% от указанного диапазона, значения или структуры, если не указано иное. Используемые в данном описании, термины «включать» и «содержать» являются неограничивающими и используются как синонимы.

[0095] Хотя способы и материалы, подобные или эквивалентные тем, которые описаны в данном документе, могут использоваться на практике или при тестировании настоящего изобретения, подходящие способы и материалы описаны ниже. Все публикации, патентные заявки, патенты и другие ссылки, упомянутые в данном документе, включены в него в полном объеме посредством ссылки. В случае конфликта приоритет будет иметь данное описание, включая объяснения терминов. Кроме того, материалы, способы и примеры являются иллюстративными и не носят ограничительного характера.

[0096] В контексте настоящего документа термин «нуклеотид» относится к рибонуклеотиду или дезоксирибонуклеотиду, или их модифицированной форме, а также к их аналогу. Нуклеотиды включают в себя виды, включающие пурины (например, аденин, гипоксантин, гуанин и их производные и аналоги), а также пиримидины (например, цитозин, урацил, тимин и их производные и аналоги). В контексте данного документа термин «цитидин» используется в общем для обозначения рибонуклеотида, дезоксирибонуклеотида или модифицированного рибонуклеотида, содержащего цитозиновое основание, если конкретно не указано иное. Термин «цитидин» включает 2’-модифицированные цитидины, такие как 2’-фтор, 2’-метокси и т. п. Аналогично, термин «модифицированный цитидин» или конкретный модифицированный цитидин также относится к рибонуклеотиду, дезоксирибонуклеотиду или модифицированному рибонуклеотиду (такому как 2’-фтор, 2’-метокси и т. п.), содержащему модифицированное основание цитозина, если конкретно не указано иное. Термин «уридин» используется в общем для обозначения рибонуклеотида, дезоксирибонуклеотида или модифицированного рибонуклеотида, содержащего урациловое основание, если конкретно не указано иное. Термин «уридин» включает 2’-модифицированные уридины, такие как 2’-фтор, 2’-метокси и т. п. Аналогично, термин «модифицированный уридин» или конкретный модифицированный уридин также относится к рибонуклеотиду, дезоксирибонуклеотиду или модифицированному рибонуклеотиду (такому как 2’-фтор, 2’-метокси и т. п.), содержащему модифицированное основание урацила, если конкретно не указано иное.

[0097] В контексте настоящего документа термин «C-5 модифицированный карбоксамидцитидин», или «цитидин-5-карбоксамид», или «цитидин, модифицированный в положении 5», или «C-5 модифицированный цитидин» относится к цитидину с модификацией карбоксамида (-C(O)NH-) в положении C-5 цитидина, включая, без ограничений, фрагменты (R^X1), проиллюстрированные в настоящем документе. Примеры C-5 модифицированных карбоксамидцитидинов включают, без ограничений: 5-(N-бензилкарбоксамид)-2'-дезоксицитидин (далее упоминается как «BndC» и показан на Фиг. 3); 5-(N-2-фенилэтилкарбоксамид)-2'-дезоксицитидин (далее упоминается как «PEdC» и показан на Фиг. 3); 5-(N-3-фенилпропилкарбоксамид)-2'-дезоксицитидин (далее упоминается как «PPdC» и показан на Фиг. 3); 5-(N-1-нафтилметилкарбоксамид)-2'-дезоксицитидин (далее упоминается как «NapdC» и показан на Фиг. 3); 5-(N-2-нафтилметилкарбоксамид)-2'-дезоксицитидин (далее упоминается как «2NapdC» и показан на Фиг. 3); 5-(N-1-нафтил-2-этилкарбоксамид)-2'-дезоксицитидин (далее упоминается как «NEdC» и показан на Фиг. 3); 5-(N-2-нафтил-2-этилкарбоксамид)-2'-дезоксицитидин (далее упоминается как «2NEdC» и показан на Фиг. 3); и 5-(N- тирозилкарбоксамид)-2'-дезоксицитидин (далее упоминается как «TyrdC» и показан на Фиг. 3). В некоторых вариантах осуществления C5-модифицированные цитидины, например, в их трифосфатной форме, способны встраиваться в олигонуклеотид с помощью полимеразы (например, ДНК-полимеразы KOD).

[0098] Химические модификации C-5-модифицированных цитидинов, описанных в настоящем документе, также можно комбинировать, по отдельности или в любой комбинации, с модификациями сахара в 2'-положении, модификациями экзоциклических аминов и замещением 4-тиоцитидина и т. п.

[0099] В контексте настоящего документа термин «C-5 модифицированный карбоксамидцитозин», или «цитозин-5-карбоксамид», или «цитозин, модифицированный в положении 5», или «C-5 модифицированный цитозин» относится к цитозиновому основанию с модификацией карбоксамида (-C(O)NH-) в положении C-5 цитозина, включая, без ограничений, фрагменты (R^X1), проиллюстрированные в настоящем документе. Примеры модифицированных C-5 карбоксамидцитозинов включают, без ограничений, модифицированные цитидины, показанные на Фиг. 3.

[00100] В контексте настоящего документа термин «C-5 модифицированный уридин» или «уридин, модифицированный в положении 5» относится к уридину (обычно дезоксиуридину) с модификацией карбоксиамида (-C(O)NH-) в положении C-5 уридин, например, как показано на Фиг. 1. В некоторых вариантах осуществления C5-модифицированные уридины, например, в их трифосфатной форме, способны встраиваться в олигонуклеотид с помощью полимеразы (например, ДНК-полимеразы KOD). Неограничивающие примеры модифицированных в положении 5 уридинов включают:

5-(N-бензилкарбоксамид)-2'-дезоксиуридин (BndU),

5-(N-бензилкарбоксамид)-2'-O-метилуридин,

5-(N-бензилкарбоксамид)-2'-фторуридин,

5-(N-фенэтилкарбоксамид)-2'-дезоксиуридин (PEdU),

5-(N-тиофенилметилкарбоксамид)-2'-дезоксиуридин (ThdU),

5-(N-изобутилкарбоксамид)-2'-дезоксиуридин (iBudU),

5-(N-тирозилкарбоксамид)-2'-дезоксиуридин (TyrdU),

5-(N-3,4-метилендиоксибензилкарбоксамид)-2'-дезоксиуридин (MBndU),

5-(N-4-фторбензилкарбоксамид)-2'-дезоксиуридин (FBndU),

5-(N-3-фенилпропилкарбоксамид)-2'-дезоксиуридин (PPdU),

5-(N-имидизолилэтилкарбоксамид)-2'-дезоксиуридин (ImdU),

5-(N-изобутилкарбоксамид)-2'-O-метилуридин,

5-(N-изобутилкарбоксамид)-2'-фторуридин,

5-(N-триптаминокарбоксамид)-2'-дезоксиуридин (TrpdU),

5-(N-R-треонинилкарбоксамид)-2'-дезоксиуридин (ThrdU),

5-(N-триптаминокарбоксамид)-2'-O-метилуридин,

5-(N-триптаминокарбоксамид)-2'-фторуридин,

5-(N-[1-(3-триметиламмоний) пропил]карбоксамид)-2'-дезоксиуридина хлорид,

5-(N-нафтилметилкарбоксамид)-2'-дезоксиуридин (NapdU),

5-(N-нафтилметилкарбоксамид)-2'-O-метилуридин,

5-(N-нафтилметилкарбоксамид)-2'-фторуридин,

5-(N-[1-(2,3-дигидроксипропил)]карбоксамид)-2'-дезоксиуридин),

5-(N-2-нафтилметилкарбоксамид)-2'-дезоксиуридин (2NapdU),

5-(N-2-нафтилметилкарбоксамид)-2'-O-метилуридин,

5-(N-2-нафтилметилкарбоксамид)-2'-фторуридин,

5-(N-1-нафтилэтилкарбоксамид)-2'-дезоксиуридин (NEdU),

5-(N-1-нафтилэтилкарбоксамид)-2'-O-метилуридин,

5-(N-1-нафтилэтилкарбоксамид)-2'-фторуридин,

5-(N-2-нафтилэтилкарбоксамид)-2'-дезоксиуридин (2NEdU),

5-(N-2-нафтилэтилкарбоксамид)-2'-O-метилуридин,

5-(N-2-нафтилэтилкарбоксамид)-2'-фторуридин,

5-(N-3-бензофуранилэтилкарбоксамид)-2’-дезоксиуридин (BFdU),

5-(N-3-бензофуранилэтилкарбоксамид)-2'-O-метилуридин,

5-(N-3-бензофуранилэтилкарбоксамид)-2’-фторуридин,

5-(N-3-бензотиофенилэтилкарбоксамид)-2’-дезоксиуридин (BTdU),

5-(N-3-бензотиофенилэтилкарбоксамид)-2'-O-метилуридин и

5-(N-3-бензотиофенилэтилкарбоксамид)-2’-фторуридин.

[00101] В контексте настоящего документа, термины «модифицировать», «модифицированный», «модификация» и любые их варианты при использовании по отношению к олигонуклеотиду означают, что по меньшей мере одно из четырех составляющих нуклеотидных оснований (т. е. A, G, T/U и C) олигонуклеотида представляет собой аналог или сложный эфир встречающегося в природе нуклеотида. В некоторых вариантах осуществления модифицированный нуклеотид придает олигонуклеотиду резистентность к нуклеазе. Дополнительные модификации могут включать модификации основной цепи, метилирование, необычные комбинации спаривания оснований, такие как изомерные основания изоцитидина и изогуанидина и т. п. Модификации могут также включать 3'- и 5'-модификации, такие как кэппинг. Другие модификации могут включать замену одного или более встречающихся в природе нуклеотидов аналогом, межнуклеотидные модификации, такие как, например, модификации с незаряженными связями (например, метилфосфонаты, сложные фосфотриэфиры, фосфоамидаты, карбаматы и т. д.) и модификации с заряженными связями (например, фосфоротиоаты, фосфородитиоаты и т. д.), модификации с интеркаляторами (например, акридин, псорален и т. д.), модификации, содержащие хелатообразующие соединения (например, металлы, радиоактивные металлы, бор, окислительные металлы и т. д.), модификации, содержащие алкилирующие вещества, и модификации с модифицированными связями (например, альфа-аномерные нуклеиновые кислоты и т. д.). Кроме того, любая из гидроксильных групп, обычно присутствующих на сахаре нуклеотида, может быть заменена на фосфонатную группу или фосфатную группу; защищена стандартными защитными группами или активирована с целью получения дополнительных связей с добавочными нуклеотидами или с твердой подложкой. 5'- и 3'-Концевые ОН-группы могут быть фосфорилированы или замещены аминами, фрагментами органических кэппинг-групп, содержащими от приблизительно 1 до приблизительно 20 атомов углерода, согласно одному из вариантов осуществления полимерами полиэтиленгликоля (ПЭГ) с массой от приблизительно 10 до приблизительно 80 кДа, согласно другому варианту осуществления полимерами ПЭГ с массой от приблизительно 20 до приблизительно 60 кДа, или другими гидрофильными или гидрофобными полимерами.

[00102] В контексте настоящего документа «нуклеиновая кислота», «олигонуклеотид» и «полинуклеотид» используются взаимозаменяемо для обозначения полимера из нуклеотидов и включают ДНК, РНК, гибриды ДНК/РНК, а также модификации указанных разновидностей нуклеиновых кислот, олигонуклеотидов и полинуклеотидов, при этом сюда входит также присоединение разных элементов или фрагментов к нуклеотидному соединению в любом положении. Термины «полинуклеотид», «олигонуклеотид» и «нуклеиновая кислота» включают двух- или одноцепочечные молекулы, а также молекулы, образующие тройную спираль. «Нуклеиновая кислота», «олигонуклеотид» и «полинуклеотид» являются более широкими терминами, чем термин аптамер, и, таким образом, термины «нуклеиновая кислота», «олигонуклеотид» и «полинуклеотид» включают полимеры нуклеотидов, которые являются аптамерами, однако термины «нуклеиновая кислота», «олигонуклеотид» и «полинуклеотид» не ограничены аптамерами.

[00103] Полинуклеотиды могут содержать также аналогичные формы сахаров рибозы или дезоксирибозы, которые в общем известны в данной области, включая 2'-O-метил-, 2'-O-аллил, 2'-O-этил, 2'-O-пропил, 2'-O-CH₂CH₂OCH₃, 2'-фтор, 2'-NH₂ или 2'-азидо, аналоги карбоциклических сахаров, α-аномерные сахара, эпимерные сахара, такие как арабиноза, ксилозы или ликсозы, пиранозные сахара, фуранозные сахара, седогептулозы, ациклические аналоги и абазические нуклеозидные аналоги, такие как метилрибозид. Как было указано выше, одна или более фосфодиэфирных связей могут быть заменены альтернативными связывающими группами. Указанные альтернативные связывающие группы включают варианты осуществления, в которых фосфат заменен на P(O)S («тиоат»), P(S)S («дитиоат»), (O)NR^X ₂ («амидат»), P(O) R^X, P(O)OR^X', CO или CH₂ («формацеталь»), где каждый R^X или R^X' независимо представляет собой Н или замещенный или незамещенный алкил (C1-C20), необязательно содержащий простую эфирную (-O-) связь, арил, алкенил, циклоалкил, циклоалкенил или аралдил. Необязательно, чтобы все связи в полинуклеотиде были идентичными. Замена аналогичных форм сахаров, пуринов и пиримидинов может оказаться благоприятной в создании конечного продукта, поскольку могут образоваться альтернативные структуры основной цепи, например, наподобие полиамидной основной цепи.

[00104] Полинуклеотиды могут содержать также аналогичные формы аналогов карбоциклических сахаров, α-аномерные сахара, эпимерные сахара, такие как арабиноза, ксилозы или ликсозы, пиранозные сахара, фуранозные сахара, седогептулозы, ациклические аналоги и абазические нуклеозидные аналоги, такие как метилрибозид.

[00105] Модификация нуклеотидной структуры, если таковая имеет место, может быть осуществлена до или после сборки полимера. Последовательность нуклеотидов может быть прервана ненуклеотидными компонентами. Кроме того, полинуклеотид может быть модифицирован после полимеризации, например, путем конъюгации с компонентом для мечения.

[00106] В контексте настоящего документа термин «по меньшей мере один нуклеотид», когда он относится к модификациям нуклеиновой кислоты, относится к одному, нескольким или же всем нуклеотидам в нуклеиновой кислоте, что указывает на то, что любой или все из числа A, C, T, G или U в нуклеиновой кислоте могут быть модифицированы или не модифицированы.

[00107] В контексте настоящего документа термины «нуклеиново-кислотный лиганд», «аптамер», «SOMAмер» «модифицированный аптамер» и «клон» используются взаимозаменяемо для обозначения не встречающейся в природе нуклеиновой кислоты, которая оказывает требуемое воздействие на молекулу-мишень. Требуемое воздействие включает, но не ограничено связыванием с мишенью, каталитическим изменением мишени, реагированием с мишенью таким образом, чтобы модифицировалась или изменялась мишень или функциональная активность мишени, ковалентным прикреплением к мишени (как в случае суицидного ингибитора) и облегчением реакции между мишенью и другой молекулой. В одном из вариантов осуществления указанное воздействие представляет собой специфическую аффинность связывания с молекулой-мишенью, при этом такая молекула-мишень представляет собой трехмерную химическую структуру, отличную от полинуклеотида, который связывается с нуклеиново-кислотным лигандом посредством механизма, который не зависит от спаривания оснований по Уотсону/Крику или образования тройной спирали, где указанный аптамер не является нуклеиновой кислотой, имеющей известную физиологическую функцию при связывании с молекулой-мишенью. Аптамеры к данной мишени включают нуклеиновые кислоты, которые идентифицируют из смеси нуклеиновых кислот-кандидатов, где аптамер является лигандом мишени, посредством способа, включающего: (а) приведение смеси молекул-кандидатов в контакт с мишенью, при этом нуклеиновые кислоты, имеющие повышенную аффинность в отношении мишени, по сравнению с другими нуклеиновыми кислотами в смеси молекул-кандидатов, могут быть отделены от остальных молекул-кандидатов в смеси; (b) отделение нуклеиновых кислот с повышенной аффинностью от остальной смеси молекул-кандидатов и (с) амплификацию нуклеиновых кислот с повышенной аффинностью с получением лигандобогащенной смеси нуклеиновых кислот, посредством чего идентифицируют аптамеры молекулы-мишени. Считается, что аффинность взаимодействий является понятием, характеризующимся степенью выраженности; однако в данном контексте «специфическая аффинность связывания» аптамера с его мишенью означает, что указанный аптамер связывается со своей мишенью обычно со значительно более высокой степенью аффинности, чем он связывается с другими компонентами, не являющимися мишенями, в смеси или в образце. «Аптамер», «SOMAмер» или «нуклеиново-кислотный лиганд» представляет собой набор копий одного типа или вида молекулы нуклеиновой кислоты, которая имеет конкретную нуклеотидную последовательность. Аптамер может включать в себя любое подходящее количество нуклеотидов. «Аптамеры» относятся к более чем одному такому набору молекул. Различные аптамеры могут иметь либо одинаковое либо разное количество нуклеотидов. Аптамеры могут представлять собой ДНК или РНК и могут быть одноцепочечными, двухцепочечными или содержать двухцепочечные или трехцепочечные участки. В некоторых вариантах осуществления аптамеры получают с использованием способа SELEX, как описано в настоящем документе или известного в данной области.

[00108] В контексте настоящего документа «SOMAмер» или модифицированный аптамер с низкой скоростью диссоциации, относится к аптамеру, имеющему улучшенные характеристики скорости диссоциации. SOMAмеры можно получить с использованием усовершенствованных методов SELEX, описанных в патенте США № 7,947,447, озаглавленном «Method for Generating Aptamers with Improved Off-Rates».

[00109] В контексте настоящего документа аптамеры, содержащие два различных типа пиримидинов, модифицированных в положении 5, или С-5 модифицированных пиримидинов, могут называться «двойными модифицированными аптамеры», аптамерами, имеющими «два модифицированных основания», аптамерами, имеющими «две модификации оснований» или «основания с двумя модифицикациями», аптамеры, имеющие «дважды модифицированные основания », причем все эти названия могут использоваться взаимозаменяемо. Термины «библиотека аптамеров» или «аптамерная библиотека» также можно использовать как одинаковую терминологию. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления аптамер содержит два разных пиримидина, модифицированных в положении 5, где два разных пиримидина, модифицированных в положении 5, выбраны из NapdC и NapdU, NapdC и PPdU, NapdC и MOEdU, NapdC и TyrdU, NapdC и ThrdU, PPdC и PPdU, PPdC и NapdU, PPdC и MOEdU, PPdC и TyrdU, PPdC и ThrdU, NapdC и 2NapdU, NapdC и TrpdU, 2NapdC и NapdU, 2NapdC и 2NapdU, 2NapdC и PPdU, 2NapdC и TrpdU, 2NapdC и TyrdU, PPdC и 2NapdU, PPdC и TrpdU, PPdC и TyrdU, TyrdC и TyrdU, TrydC и 2NapdU, TyrdC и PPdU, TyrdC и TrpdU, TyrdC и TyrdU и TyrdC и TyrdU. В некоторых вариантах осуществления аптамер содержит по меньшей мере один модифицированный уридин и/или тимидин и по меньшей мере один модифицированный цитидин, причем по меньшей мере один модифицированный уридин и/или тимидин модифицирован в положении 5 фрагментом, выбранным из нафтильного фрагмента, бензильного фрагмента, фторбензильного фрагмента, тирозильного фрагмента, индольного фрагмента, морфолинового фрагмента, изобутильного фрагмента, 3,4-метилендиоксибензильного фрагмента, бензотиофенильного фрагмента и бензофуранильного фрагмента, и при этом по меньшей мере один модифицированный цитидин модифицирован в положении 5 фрагментом, выбранным из нафтильного фрагмента, тирозильного фрагмента и бензильного фрагмента. В определенных вариантах осуществления фрагмент ковалентно связан с положением 5 основания через линкер, содержащий группу, выбранную из амидного линкера, карбонильного линкера, пропинильного линкера, алкинового линкера, сложноэфирного линкера, мочевинного линкера, карбаматного линкера, гуанидинового линкера, амидинового линкера, сульфоксидного линкера и сульфонового линкера. Дополнительные примеры типичных линкеров, которые могут быть использованы для ковалентного связывания фрагмента с положением 5 пиримидина, приведены на Фиг. 1.

[00110] В контексте настоящего документа термины «гидрофобная группа» и «гидрофобный фрагмент» используются взаимозаменяемо и относятся к любой группе или фрагменту, который не является заряженным, причем большинство атомов группы или фрагмента представляют собой водород и углерод, при этом группа или фрагмент имеют небольшую совокупность двух близко расположенных разноименных электрических зарядов и/или группа или фрагмент имеет тенденцию отталкиваться от воды. Эти группы или фрагменты могут содержать ароматический углеводород или планарный ароматический углеводород. Способы определения гидрофобности или того, является ли молекула (или группа, или фрагмент) гидрофобной, хорошо известны в данной области и включают методы, полученные эмпирическим путем, а также методы с использованием расчетов. Примеры методов описаны в публикации Zhu Chongqin et al. (2016) Characterizing hydrophobicity of amino acid side chains in a protein environment via measuring contact angle of a water nanodroplet on planar peptide network. Proc. Natl. Acad. Sci., 113(46) стр. 12946-12951. Как описано в настоящем документе, иллюстративные гидрофобные фрагменты включают, без ограничений, группы I, II, III, IV, V, VII, VIII, IX, XI, XII, XIII, XV и XVI на Фиг. 1. Дополнительные примеры гидрофобных фрагментов включают фрагменты, представленные на Фиг. 3 (например, Bn, Nap, PE, PP, iBu, 2Nap, Try, NE, MBn, BF, BT, Trp).

[00111] В контексте настоящего документа аптамеры, содержащие один тип пиримидина, модифицированного в положении 5, или С-5 модифицированного пиримидина, могут называться «одиночными модифицированными аптамерами», аптамерами, имеющими «одно модифицированное основание», аптамерами, имеющими «одну модификацию основания». или «модифицированные отдельные основания», причем все эти названия могут использоваться взаимозаменяемо. Термины «библиотека аптамеров» или «аптамерная библиотека» также можно использовать как одинаковую терминологию. В контексте настоящего документа термин «белок» используется как синоним термина «пептид», «полипептид» или «пептидный фрагмент». «Очищенный» полипептид, белок, пептид или пептидный фрагмент по существу не содержит клеточного материала или других загрязняющих белков из клетки, ткани или бесклеточного источника, из которого получена аминокислотная последовательность, или по существу не содержит химических предшественников или других химических веществ в случае химического синтеза.

[00112] В определенных вариантах осуществления аптамер содержит первый пиримидин, модифицированный в положении 5, и второй пиримидин, модифицированный в положении 5, причем первый пиримидин, модифицированный в положении 5, содержит тирозильный фрагмент в положении 5 первого пиримидина, модифицированного в положении 5, а второй пиримидин, модифицированный в положении 5, содержит нафтильный фрагмент или бензильный фрагмент в положении 5 второго пиримидина, модифицированного в положении 5. В родственном варианте осуществления первый пиримидин, модифицированный в положении 5, представляет собой урацил. В родственном варианте осуществления второй пиримидин, модифицированный в положении 5, представляет собой цитозин. В родственном варианте осуществления в аптамере в положении 5 модифицированы по меньшей мере 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 100% урацилов. В родственном варианте осуществления в аптамере в положении 5 модифицированы по меньшей мере 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 100% цитозинов.

[00113] Специалисты в области гибридизации нуклеиновых кислот поймут, что факторы, обычно используемые для установления или контроля строгости гибридизации, включают концентрацию формамида (или другого химического денатурирующего реагента), концентрацию соли (то есть ионную силу), температуру гибридизации, концентрацию детергента, pH и наличие или отсутствие хаотропов. Оптимальную строгость условий для комбинации зонд/последовательность-мишень часто находят с помощью хорошо известного метода фиксации нескольких из вышеупомянутых факторов строгости и последующего определения эффекта изменения одного фактора строгости. Одни и те же факторы строгости можно модулировать, чтобы таким образом контролировать строгость гибридизации ПНК с нуклеиновой кислотой, с учетом того, что гибридизация ПНК практически не зависит от ионной силы. Оптимальная строгость анализа может быть определена экспериментально путем изучения каждого фактора строгости до тех пор, пока не будет достигнута желаемая степень разграничения.

[00114] В контексте настоящего документа термины «гибридизация», «гибридизирование», «связывание» и подобные в контексте нуклеотидных последовательностей могут использоваться взаимозаменяемо. Способность двух нуклеотидных последовательностей гибридизоваться друг с другом основана на степени комплементарности двух последовательностей, которая, в свою очередь, основана на доле комплементарно соответствующих пар нуклеотидов. Чем больше нуклеотидов в данной последовательности комплементарно другой последовательности, тем более строгими могут быть условия гибридизации и тем более специфичным будет связывание двух последовательностей. Повышенная строгость достигается за счет повышения температуры, увеличения соотношения сорастворителей, снижения концентрации соли и т. п. Гибридизация комплементарных в соответствии с правилами Уотсона/Крика пар оснований зондов на микроматрице и целевого материала обычно является предпочтительной, но во время гибридизации также может происходить спаривание оснований не в соответствии с правилами Уотсона/Крика.

[00115] Стандартные растворы для осуществления гибридизации и процессы гибридизации описаны в работе J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (выше), которая включена в данный документ посредством ссылки. Условия для гибридизации обычно включают (1) раствор с высокой ионной силой, (2) при контролируемой температуре и (3) в присутствии ДНК-носителя и поверхностно-активных веществ и хелатообразующих соединений двухвалентных катионов, все из которых известны в данной области.

[00116] В контексте настоящего документа термин «биополимер» означает полимер из одного или более типов повторяющихся звеньев. Биополимеры обычно встречаются в биологических системах и, в частности, включают полисахариды (такие как углеводы), пептиды (этот термин используется для включения полипептидов и белков, независимо от того, присоединены они к полисахариду или нет) и полинуклеотиды, а также их аналоги, такие как соединения, состоящие из аналогов аминокислот или неаминокислотных групп, или аналогов нуклеотидов, или ненуклеотидных группы или содержащие перечисленное. Таким образом, этот термин включает полинуклеотиды, в которых обычная основная цепь заменена не встречающейся в природе или синтетической основной цепью, и нуклеиновые кислоты (или синтетические или встречающиеся в природе аналоги), в которых одно или несколько обычных оснований заменены на группу (встречающуюся в природе или синтетическую), способную участвовать во взаимодействиях водородных связей в соответствии с правилами Уотсона-Крика. Полинуклеотиды включают одно- или многоцепочечные конфигурации, в которых одна или больше цепей могут быть полностью выровнены или не выровнены с другой цепью. В частности, «биополимер» включает дезоксирибонуклеиновую кислоту или ДНК (включая кДНК), рибонуклеиновую кислоту или РНК и олигонуклеотиды, независимо от источника.

[00117] В контексте настоящего документа термин «матрица» включает любое одно-, двух- или трехмерное расположение доступных участков, несущих конкретный химический фрагмент или фрагменты (например, биополимеры, такие как молекулы пептидных нуклеиновых кислот, пептиды или полинуклеотидные последовательности), связанные с этим участком, где химический фрагмент или фрагменты иммобилизованы на поверхности этого участка. Под «иммобилизованным» подразумевается, что фрагмент или фрагменты стабильно связаны с поверхностью субстрата в определенном участке таким образом, что они не отделяются от этого участка в условиях использования матрицы, например, в условиях гибридизации, промывки и отгона. Как известно в данной области, фрагмент или фрагменты могут быть ковалентно или нековалентно связаны с поверхностью на участке. Например, каждый участок может простираться в третье измерение в случае, когда субстрат является пористым, и не иметь какого-либо существенного размера третьего измерения (толщины) в случае, когда субстрат непористый. Матрица может содержать более десяти, более ста, более одной тысячи, более десяти тысяч элементов или даже более ста тысяч элементов на площади менее 20 см или даже менее 10 см. Например, элементы могут иметь ширину (т. е. диаметр для круглого пятна) в диапазоне от приблизительно 10 мкм до приблизительно 1,0 см. В других вариантах осуществления каждый элемент может иметь ширину в диапазоне от приблизительно 1,0 мкм до приблизительно 1,0 мм, например, от приблизительно 5,0 мкм до приблизительно 500 мкм, включая от приблизительно 10 мкм до приблизительно 200 мкм. Некруглые элементы могут иметь диапазоны площадей, эквивалентные диапазонам площадей круглых элементов с указанными выше диапазонами ширины (диаметра). Данный элемент состоит из химических фрагментов, например молекул пептидных нуклеиновых кислот, пептидов, нуклеиновых кислот, которые связываются (например, гибридизуются) с молекулой-мишенью (например, целевой нуклеиновой кислотой или аптамером) таким образом, что данный элемент соответствует конкретной мишени.

[00118] В случае матрицы «мишень» будет обозначаться как фрагмент в подвижной фазе (обычно жидкости), который должен быть обнаружен зондами («зондами-мишенями»), которые связаны с субстратом в различных участках. Однако либо «мишень», либо «зонд-мишень» могут быть такими, которые должны обнаруживаться другим. В некоторых вариантах осуществления мишень представляет собой олигонуклеотид или аптамер. В некоторых вариантах осуществления зонд представляет собой молекулу пептидной нуклеиновой кислоты, пептид, белок, олигонуклеотид или аптамер.

[00119] Термины «биологический образец», «образец» и «тестируемый образец» используются в настоящем документе взаимозаменяемо для обозначения любого материала, биологической жидкости, ткани или клетки, полученных или иным образом извлеченных из организма человека, а также образца окружающей среды, организма животного или пищевого продукта. Такой образец включает кровь (включая цельную кровь, лейкоциты, мононуклеарные клетки периферической крови, лейкоцитную пленку, плазму и сыворотку), мокроту, слезы, слизь, носовые промывные воды, назальный аспират, выдыхаемый воздух, мочу, сперму, слюну, промывных вод брюшины, асцитную жидкость, кистозную жидкость, менингеальную жидкость, амниотическую жидкость, жидкость, вырабатываемую железами, лимфатическую жидкость, аспират из сосков, бронхиальный аспират (например, бронхоальвеолярный лаваж), материал бронхов, взятый с помощью щеточки, синовиальную жидкость, аспират суставной жидкости, секреты органов, клетки, экстракт клеток и спинномозговую жидкость. Он также включает экспериментально разделенные фракции всех перечисленных материалов. Например, образец крови может быть фракционирован на сыворотку, плазму или на фракции, содержащие определенные типы клеток крови, такие как эритроциты или лейкоциты. В некоторых вариантах осуществления образец может представлять собой комбинацию образцов от индивидуума, такую как комбинация образца ткани и жидкости. Термин «биологический образец» также включает материалы, содержащие гомогенизированный твердый материал, например, полученный из образца кала, образца ткани или биоптата ткани. Термин «биологический образец» также включает культуры ткани или культуры клеток. Для получения биологического образца могут быть использованы любые подходящие способы; иллюстративные способы включают, например, флеботомию, мазок (например, буккальный мазок) и процедуру тонкоигольной аспирационной биопсии. Примеры тканей, подвергаемых тонкоигольной аспирационной биопсии, включают лимфатический узел, легкое, легочные смывы, БАЛ (бронхоальвеолярный лаваж), щитовидную железу, молочную железу, поджелудочную железу и печень. Образцы также можно брать, например, посредством микродиссекции (например, лазерной связывающей микродиссекции (LCM) или лазерной микродиссекции (LMD)), промывания мочевого пузыря, мазка (например, мазка по Папаниколау) или протокового лаважа. «Биологический образец», полученный или происходящий от индивида, включает любой такой образец, который был обработан любым подходящим образом после получения от индивида.

[00120] Фраза «олигонуклеотид, связанный с поверхностью твердой подложки» или «зонд, связанный с твердой подложкой», или «мишень, связанная с твердой подложкой» относится к молекулам пептидной нуклеиновой кислоты, олигонуклеотиду, аптамеру, например, молекуле ПНК (пептидной нуклеиновой кислоты), ЗНК (заблокированной нуклеиновой кислоты) или ОНК (открытой нуклеиновой кислоты), которая иммобилизована на поверхности твердого субстрата, где субстрат может иметь множество конфигураций, например, листа, гранулы, частицы, предметного стекла, пластины, полотна, волокна, трубки, капилляра, микрожидкостного канала или резервуара или другую структуру. В определенных вариантах осуществления набор используемых здесь олигонуклеотидов или элементов-мишеней присутствует на поверхности одной и той же плоской подложки, например, в форме матрицы. Следует понимать, что термины «зонд» и «мишень» являются взаимосвязанными терминами и что молекула, рассматриваемая в некоторых анализах как зонд, в других анализах может функционировать как мишень. Иммобилизация олигонуклеотидов на субстрате или поверхности может выполняться с помощью хорошо известных способов, обычно описанных в литературе. См., например, публикации A. C. Pease, et al., Proc. Nat. Acad. Sci, USA, 91:5022-5026 (1994); Z. Guo, et al., Nucleic Acids Res, 22, 5456-65 (1994); и M. Schena, et al., Science, 270, 467-70 (1995), каждая из которых включена в настоящий документ путем ссылки.

[00121] Вышеупомянутая химия синтеза полинуклеотидов подробно описана, например, в публикации Caruthers, Science 230: 281-285, 1985; Itakura et al., Ann. Rev. Biochem. 53: 323-356; Hunkapillar et al., Nature 310: 105-110, 1984; и в “Synthesis of Oligonucleotide Derivatives in Design and Targeted Reaction of Oligonucleotide Derivatives”, CRC Press, Boca Raton, Fla., pages 100 et seq., патентах США Под номерами 4,458,066, 4,500,707, 5,153,319, 5,869,643, EP 0294196, и в других источниках. Наиболее широко используются подходы с использованием фосфорамидита и сложного триэфира фосфита, а другие подходы включают использование сложного фосфодиэфира, подход фосфотриэфира и H-фосфоната. Субстраты обычно функционализированы для связывания с первым нанесенным мономером. Подходящие способы функционализации субстратов такими связывающими фрагментами описаны, например, в Southern, E. M., Maskos, U. and Elder, J. K., Genomics, 13, 1007-1017, 1992. В случае изготовления матрицы различные мономеры и активатор могут быть нанесены на субстрат в разные доступные участки в течение любого одного цикла таким образом, что различные элементы завершенной матрицы будут иметь разные желаемые последовательности биополимеров. В каждом цикле может потребоваться одна или несколько дополнительных промежуточных стадий, таких как обычные стадии окисления, кэппинга и промывки в случае изготовления полинуклеотидных матриц in situ (опять же, эти стадии могут выполняться в процедуре погружения).

Мультиплексный анализ

[00122] Мультиплексные аптамерные анализы на стадиях взаимодействия и разделения мишеней в растворе описаны, например в патентах США №№ 7,855,054 и 7,964,356 и PCT-заявке PCT/US2013/044792. В одном варианте осуществления мультиплексный анализ описан в настоящем документа в примере 1.

[00123] В формате мультиплексного анализа, когда проводят измерения нескольких белков-мишеней с помощью нескольких захватывающих реагентов, естественное изменение количества различных белков-мишеней может ограничивать способность определенных захватывающих реагентов измерять определенные белки-мишени (например, белки-мишени с высоким содержанием могут насыщать анализ и препятствовать или уменьшать способность анализа измерять белки-мишени с низким содержанием). Для решения проблем такого изменения в биологическом образце, в зависимости от количества соответствующих белков-мишеней в биологическом образце реагенты аптамеров могут быть разделены по меньшей мере на две разные группы (захватывающие реагенты для РАЗВ. 1 и захватывающие реагенты для РАЗВ. 2), предпочтительно на три разные группы (A3 - захватывающие реагенты для РАЗВ. 1; A2 - захватывающие реагенты для РАЗВ. 2 и A1 - захватывающие реагенты для РАЗВ. 3). Каждая из групп захватывающих реагентов: A1, A2 и A3, имеет свой отличный набор аптамеров, причем аптамеры обладают специфической аффинностью к белку-мишени. Для создания отдельных тестовых образцов на основе относительных концентраций белков-мишеней, которые будут обнаружены их соответствующими захватывающими реагентами, выполняют разведение биологических образцов в двух (разведение 1 или РАЗВ. 1 и разведение 2 или РАЗВ. 2), предпочтительно трех различных группах разведения (разведение 1 или РАЗВ. 1; разведение 2 или РАЗВ. 2 и разведение 3 или РАЗВ. 3). Таким образом, проводят разведение биологического образца в группах разведения с высоким, средним и низким содержанием белка-мишени, где белки-мишени с наименьшим содержанием измеряются в группе с наименьшим разведением, а белки-мишени с наибольшим содержанием измеряются в группе с наибольшим разведением. Захватывающие реагенты для соответствующих им групп разведения инкубируют вместе (например, набор аптамеров A3 инкубируют с тестируемым образцом в разведении 1 или РАЗВ. 1; набор аптамеров A2 инкубируют с тестируемым образцом в разведении 2 или РАЗВ. 2 и набор аптамеров A1 инкубируют с тестируемым образцом в разведении 3 или РАЗВ. 3). Общее количество аптамеров для A1, A2 и A3 может составлять 4000; 4500; 5000 или более аптамеров.

[00124] На Фиг. 5 предоставлен иллюстративный обзор наборов разведений биологического образца, соответствующих наборов захватывающих реагентов для соответствующих им разведений, а также общий обзор двузахватной системы («захват-1» и «захват-2»). Из биологического образца могут быть созданы три разные группы разведений, включая Z% разведение биологического образца или РАЗВ. 3, Y% разведение биологического образца или РАЗВ. 2 и X% разведение биологического образца или РАЗВ. 1, где Z больше Y, а Y больше X (или Z является большим разведением, чем разведение Y, а Y является большим разведением, чем разведение X). Каждое разведение имеет свой собственный набор соответствующих захватывающих реагентов (A3 для РАЗВ. 1, A2 для РАЗВ. 2 и A1 для РАЗВ. 3), которые связываются с определенным набором белков.

[00125] На Фиг. 4 предоставлен иллюстративный обзор наборов разведений биологического образца, соответствующих наборов захватывающих реагентов для соответствующих им разведений, а также общий обзор двузахватной системы («захват-1» и «захват-2»). Из биологического образца могут быть созданы две разные группы разведений, включая Z% разведение биологического образца или РАЗВ. 4, и X% разведение биологического образца или РАЗВ. 1, где Z больше X (или Z является большим разведением, чем разведение X). Каждое разведение имеет свой собственный набор соответствующих захватывающих реагентов (A3 для РАЗВ. 1 и A1 для РАЗВ. 4), которые связываются с определенным набором белков.

[00126] На Фиг. 7 предоставлен иллюстративный обзор наборов разведений биологического образца, соответствующих наборов захватывающих реагентов для соответствующих им разведений, а также общий обзор последовательной двузахватной системы («захват-1» и «захват-2»). Из биологического образца могут быть созданы три разные группы разведений, включая Z% разведение биологического образца или РАЗВ. 3, Y% разведение биологического образца или РАЗВ. 2 и X% разведение биологического образца или РАЗВ. 1, где Z больше Y, а Y больше X (или Z является большим разведением, чем разведение Y, а Y является большим разведением, чем разведение X). Каждое разведение имеет свой собственный набор соответствующих захватывающих реагентов (A3 для РАЗВ. 1, A2 для РАЗВ. 2 и A1 для РАЗВ. 3), которые связываются с определенным набором белков.

[00127] В настоящем изобретении описаны усовершенствованные способы осуществления мультиплексных анализов на основе аптамеров и фотоаптамеров для количественного определения одной или более молекул-мишеней, которые могут присутствовать в тестируемом образце, в которых аптамер (или фотоаптамер) можно отделить от аффинного комплекса из аптамера и мишени (или ковалентного комплекса из фотоаптамера и мишени) для окончательного обнаружения с использованием любого подходящего способа обнаружения нуклеиновых кислот, в виду того, что материалы и способы, описанные в данном документе, можно использовать для повышения общей эффективности данного анализа. Фотоаптамеры представляют собой аптамеры, которые содержат фотореактивные функциональные группы, которые обеспечивают возможность образования ковалентной связи или «фотосшивки» между аптамерами и молекулами-мишенями.

[00128] Усовершенствованные мультиплексные анализы на основе аптамеров и фотоаптамеров, описанные в настоящем документе, можно выполнять с использованием аптамеров и фотоаптамеров, включая, без ограничений те аптамеры и фотоаптамеры, которые описаны в публикациях, перечисленных в таблице 1.

Таблица 1

№ заявки Дата подачи Название Публикация WO № PCT/US2016/050908 09 сентября 2016 г. Methods for Developing Personalized Drug Treatment Plans and Targeted Drug Development Based on Proteomic Profiles WO/2017/044715 PCT/US2016/16712 05 февраля 2016 г. Nucleic Acid Compounds for Binding Growth Differentiation Factor 8 WO/2016/130414 PCT/US2015/62155 23 ноября 2015 г. Nucleic Acid Compounds for Binding Growth Differentiation Factor 11 WO/2016/085860 PCT/US2015/33355 29 мая 2015 г. Nucleic Acid Compounds for Binding to Complement Component 3 Protein WO/2015/184372 PCT/US2014/054561 08 сентября 2014 г. PDGF and VEGF Aptamers Having Improved Stability and Their Use in Treating PDGF and VEGF Mediated Diseases and Disorders WO/2015/035305 PCT/US2014/024669 12 марта 2014 г. Aptamers That Bind to Il-6 and Their Use in Treating or Diagnosing Il-6 Mediated Conditions WO/2014/159669 PCT/US2013/034493 28 марта 2013 г. Aptamers to PDGF and VEGF and Their Use in Treating PDGF and VEGF Mediated Conditions WO/2013/149086 PCT/US2012/72094 28 декабря 2012 г. Aptamers and Diagnostic Methods for Detecting the EGF Receptor WO/2013/102096 PCT/US2012/072101 28 декабря 2012 г. Aptamers and Diagnostic Methods for Detecting the EGF Receptor WO/2013/102101 PCT/US2012/028632 09 марта 2012 г. Aptamers for Clostridium Difficile Diagnostics WO/2012/122540 PCT/US2011/032017 12 апреля 2011 г. Aptamers to β-NGF and Their Use in Treating β-NGF Mediated Diseases and Disorders WO/2011/130195 PCT/US2011/027064 03 марта 2011 г. Aptamers to 4-1BB and Their Use in Treating Diseases and Disorders WO/2011/109642

[00129] Исторически было выявлено два непредусмотренных ограничения в осуществлении одно- и мультиплексных аптамерных анализов, включая мультиплексные анализы аффинности аптамеров методами протеомики. Во-первых, было установлено, что взаимодействия типа аптамер/аптамер являются главным источником фона анализа и потенциального ограничения возможности мультиплексной детекции. Во-вторых, было обнаружено, что матрицы образцов (в первую очередь сыворотки крови и плазмы крови) препятствуют иммобилизации биотинилированных аптамеров на матрицах, замещенных стрептавидином.

[00130] Первое усовершенствование анализа, которое описано в работе Gold et al. (PLoS One (2010) 5(12):el5005), заключалось в использовании органических растворителей в некоторых промывочных буферах стадии «захват-2» для уменьшения диэлектрической константы среды. Добавление этих промывочных буферов эффективно акцентирует отталкивание одноименных зарядов соседних фосфодиэфирных основных цепей аптамеров, таким образом, содействуя диссоциации взаимодействующих аптамеров, вызывающих появление фона.

[00131] Другое усовершенствование процесса включает добавление органических растворителей в некоторые из промывочных буферов, используемых на стадии анализа «захват-2», оно также противодействует склонности аптамеров к взаимодействию и, таким образом, снижает фон и улучшает способность мультиплексирования. Однако его главное преимущество заключается в противодействии зависящему от матриц ингибированию, адсорбции биотинилированных аптамеров на стрептавидиновых матрицах. Такое ингибирование легко обнаруживается даже при 5% об./об. плазмы крови или сыворотки крови и ограничивает рабочие анализируемые концентрации до 5-10% концентраций плазмы крови или сыворотки крови. Это ограничение в свою очередь ограничивает чувствительность анализа.

[00132] Еще одно усовершенствование мультиплексного анализа заключается в предварительной иммобилизации аптамеров, содержащих тег, на твердых подложках матриц до инкубации (называется «захват-0») с тестируемым раствором. Инкубацию с исследуемым раствором затем проводят со связанными аптамерами в самих по себе сосудах для обработки. Как описано в настоящем документе исключительно в целях иллюстрации, биотинилированные аптамеры предварительно иммобилизировали на матрицах, содержащих стрептавидиновые гранулы, а инкубацию с тестируемым раствором проводили с аптамерами, связанными гранулами. Эта стадия предварительной иммобилизации обеспечивает возможность иммобилизации в условиях, которых у аптамеров уменьшается склонность к взаимодействию, а также обеспечивает возможность очень строгих промывок (с использованием основных или хаотропных солей) до инкубации, нарушая взаимодействие аптамеров и удаление всех аптамеров, несвязанных посредством очень сильного взаимодействия биотина-стрептавидина. Этот снижает количество аптамерных «агрегатов», выявляемых в процессе анализа - агрегатов, которые с некоторой обнаруживаемой частотой удерживают фрагмент биотина или подвергаются биотинилированию в процессе анализа. Стоит отметить, что облучение отщепляет большинство, но не все фотоотщепляемые биотиновые фрагменты от аптамеров, тогда как некоторые аптамеры подвергаются биотинилированию посредством обработки NHS-биотином, предназначенной для белков, содержащих «тег». Биотинилированный аптамер, который захватывается на стадии «захват-2», создает фон за счет взаимодействия с большим количеством фотоотщепленного аптамера, который затем высвобождается при элюировании. Также следует отметить, что формат с предварительной иммобилизацией вероятно будет поддерживать очень большую возможность мультиплексного обнаружения, поскольку можно отдельно иммобилизировать панели аптамеров, затем объединить в форме, связанной с гранулами, таким образом, обходя условия, при которых аптамеры могу взаимодействовать и образовывать агрегаты.

[00133] Таким образом, предварительная иммобилизации позволяет обходить потребность в адсорбции аптамеров в присутствии раствора аналита, таким образом обеспечивая количественную иммобилизацию даже при анализе ингибирующих концентраций растворов аналитов. Это обеспечивает возможность использования более высоких концентраций включительно по меньшей мере до 40% об./об. плазмы крови или сыворотки крови, в отличие от самой высокой концентрации 10%, характерной для способа, который был ранее описан (Gold et al. (Dec. 2010) PLoS One 5(12):el5005), или самой высокой концентрации 5%, используемой в более поздних вариантах способа, вследствие чего увеличивается чувствительность примерно в 4-8 раз, а также увеличивается общая надежность анализа.

[00134] Еще одно усовершенствование общего процесса заключается в использовании хаотропной соли при приблизительно нейтральном рН для элюирования в ходе стадии «захват-2», которая подробно описана ниже. Предшествующие способы заключалось в использовании хлорида натрия при высоком уровне рН (10), который нарушает ДНК-гибридизацию и взаимодействие типа аптамер/аптамер, а также взаимодействие типа белок/аптамер. Как отмечалось выше, ДНК-гибридизация и взаимодействия типа аптамер/аптамер способствуют появлению фона анализа. Хаотропные соли, включающие, без ограничений, перхлорат натрия, хлорид лития, хлорид натрия и хлорид магния при нейтральном уровне рН поддерживают ДНК-гибридизацию и взаимодействия типа аптамер/аптамер, при этом нарушая взаимодействия типа аптамер/белок. Конечный результат заключается в значительном снижении (приблизительно в 10 раз) фона с одновременным повышением чувствительности анализа.

[00135] В контексте настоящего документа «захват- 1» относится к разделению аффинного комплекса из аптамера и мишени или ковалентного комплекса из аптамера и мишени. Целью стадии «захват-1» является удаление из тестируемого образца по существу всех компонентов , которые не соединены с аптамером. Удаление большинства таких компонентов, в целом, будет улучшать эффективность введения тега в мишень за счет удаления молекул, не являющихся мишенями, на стадии введения тега в мишень, использованной в случае «захвата-2», и может приводить к снижению фона анализа. В одном варианте осуществления тег присоединяют к аптамеру либо перед проведением анализа, в ходе подготовки анализа или в ходе анализа путем добавления тега к аптамеру. В одном варианте осуществления тег представляет собой высвобождаемый тег. В одном варианте осуществления высвобождаемый тег содержит расщепляемый линкер и тег. Как было описано выше, аптамер, содержащий тег, может захватываться на твердой подложке, если эта твердая подложка содержит захватывающий элемент, подходящий для этого тега. Затем твердую подложку можно промыть, как описано в настоящем документе, до уравновешивания с тестируемым образцом для удаления любых нежелательных материалов («захват-0»).

[00136] В контексте настоящего документа «захват -2» относится к разделению аффинного комплекса из аптамера и мишени или ковалентного комплекса из аптамера и мишени на основе захвата молекулы-мишени. Целью стадии «захват-2» является удаление свободного или несвязанного аптамера из тестируемого образца до проведения обнаружения и необязательного количественного определения. Удаление свободного аптамера из образца делает возможным обнаружение аффинных комплексов аптамера и мишени или ковалентных комплексов аптамера и мишени с помощью любого подходящего метода обнаружения нуклеиновых кислот. При использовании для обнаружения и необязательного количественного определения количественной ПЦР, для точного обнаружения и количественного определения молекулы-мишени необходимо удаление свободного аптамера.

[00137] В одном варианте осуществления я в качестве молекулы-мишени выступает белок или пептид, а свободный аптамер отделен от аффинного (или ковалентного) комплекса аптамера и мишени (и остальной части тестируемого образца) с использованием реагентов, которые могут встраиваться в белки (и пептиды) и комплексы, включающие белки (или пептиды), такие как, например, аффинный (или ковалентный) комплекс аптамера и мишени. Белок (или пептид), содержащий тег, и аффинный (или ковалентный) комплекс аптамера и мишени можно иммобилизировать на твердой подложке, обеспечивая отделение белка (или пептида) и аффинного (или ковалентного) комплекса аптамера и мишени от свободного аптамера. Такое введение тега может включать, например, встраивание биотинового фрагмента в белок или пептид.

[00138] В одном варианте осуществления тег для стадии «захват-2» присоединяют к белку (или пептиду) либо перед проведением анализа, в ходе подготовки анализа, или в ходе анализа путем химического присоединения тега к мишеням. В одном варианте осуществления тег для стадии «захват-2» представляет собой высвобождаемый тег. В одном варианте осуществления высвобождаемый тег содержит расщепляемый линкер и тег. В целом, однако нет необходимости в высвобождении белка (или пептида) от твердой подложки «захват-2». Как было описано выше, мишени, содержащие тег, могут захватываться на второй твердой подложке, если эта твердая подложка содержит захватывающий элемент, подходящий для этого тега мишени. Твердую подложку затем промывают различными буферными растворами, включая буферные растворы, содержащие органические растворители и буферные растворы, содержащие соли и/или поверхностно-активные вещества.

[00139] После промывки второй твердой подложки аффинные комплексы из аптамера и мишени затем подвергают стадии диссоциации, на которой данные комплексы разрушаются с получением свободного аптамера, тогда как молекулы-мишени, в целом, остаются связанными с твердой подложкой за счет связывающего взаимодействия захватывающего элемента и тега, захватывающего мишень. Высвобождение аптамера из аффинного комплекса из аптамера и мишени можно выполнять любым способом, который разрушает структуру либо аптамера, либо мишени. Этого можно достичь посредством промывки аффинных комплексов из аптамера и мишени, связанных на подложке, в буфере с высоким содержанием солей, что приводит к диссоциации нековалентно связанных комплексов из аптамера и мишени. Собирают элюированные свободные аптамеры и проводят их определение. В другом варианте осуществления для разрушения аффинных комплексов из аптамера и мишени используют высокий или низкий уровень рН. В другом варианте осуществления для диссоциации аффинных комплексов из аптамера и мишени используют высокую температуру. В другом варианте осуществления можно использовать комбинацию любых из вышеприведенных способов. В другом варианте осуществления для высвобождения аптамерного компонента из аффинного комплекса из аптамера и мишени использовано протеолитическое расщепление белкового фрагмента.

[00140] В случае ковалентных комплексов аптамера и мишени высвобождение аптамера для последующего количественного определения выполняют с использованием расщепляемого линкера в составе конструкции аптамера. В другом варианте осуществления расщепляемый линкер в составе тега мишени будет приводить к высвобождению ковалентного комплекса аптамера и мишени.

[00141] В качестве примера, анализ аффинности методами протеомики (мультиплексный анализ) может осуществляться на практике так, как описано ниже.

[00142] Захват-0. В лунки фильтровального планшета (планшеты Millipore HV 0,45 мкм (каталожный номер Durapore MAHVN4550) добавляли 133 мкл 7,5% стрептавидин-агарозной суспензии в буфере 1 × SB17-твин (40 мМ ГЕПЕС, 102 мМ NaCl, 1 мМ EDTA, 5 мМ MgCl2, 5 мМ KCl, 0,05% твин-20)). Размораживали соответствующую 1,1-кратную смесь аптамеров (все аптамеры содержат флуорофор Cy3 и фотоотщепляемый биотиновый фрагмент на 5'-конце) с последующим перемешиванием в вихревом смесителе. Затем 1,1-кратную смесь аптамеров кипятили в течение 10 минут, перемешивали в вихревом смесителе в течение 30 с и охлаждали до 20 °C на водяной бани в течение 20 минут. После этого путем центрифугирования (1000 × g в течение 1 минуты) удаляли из фильтровальных планшетов жидкость, содержащую стрептавидин-агарозную суспензию. В лунки фильтровального планшета добавляли (с помощью автоматизированного устройства) 100 мкл смеси аптамеров. Смесь инкубировали при 25 °C в течение 20 мин на шейкере, установленном на 850 об/мин, с защитой от света.

[00143] Промывания стадии «захват-0». Через 20 минут после инкубации раствор удаляли посредством вакуумной фильтрации. Добавляли 190 мкл 1× буфера CAPS для предварительной промывки аптамеров (50 мМ CAPS, 1 мМ EDTA, 0,05% твин-20, рН 11,0), и смесь инкубировали в течение 1 минуты со встряхиванием. Промывочный раствор CAPS затем удаляли посредством вакуумной фильтрации. После этого промывку CAPS повторяли один раз. Добавляли 190 мкл буфера 1 × SB17-твин, и смесь инкубировали в течение 1 мин со встряхиванием. После этого удаляли 1 × SB17-твин посредством вакуумной фильтрации. Дополнительно добавляли 190 мкл буфера 1 × SB17-твин, и смесь инкубировали в течение 1 мин со встряхиванием. Затем удаляли 1 × SB17-твин путем центрифугирования (1 мин при 1000 × g). После удаления 1 × SB17-твин, добавляли 150 мкл буфера для хранения со стадии «захват-0» (150 мМ NaCl, 40 мМ ГЕПЕС, 1 мМ EDTA, 0,02% азида натрия, 0,05% твин-20), и фильтровальный планшет осторожно герметизировали только по периметру планшета и хранили при 4 °C в темноте до использования.

[00144] Подготовка образцов. Семьдесят пять (75) микролитров образца с 40% разбавителем вносили в планшет с 40% образцом (конечный 40% образец содержит: 20 мкМ Z-блок, 1 мМ бензамидина, 1 мМ EGTA, 40 мМ ГЕПЕС, 5 мМ MgCl2 , 5 мМ KCl, 1% твин-20). Сто девяносто пять (195) микролитров буфера 1 × SB17-твин вносили в планшет с 1% образцом. Девяносто (90) микролитров 1 × SB17-твин вносили в планшет для разведения 1 к 10. Сто тридцать три (133) микролитра буфера 1 × SB17-твин вносили в планшет с 0,005% образцом. Образцы размораживали в инкубаторе в течение 10 минут на устройстве для размораживания пробирок в штативе при 25 °C, затем перемешивали в вихревом смесителе и осаждали при 1000 × g в течение 1 минуты. С пробирок снимали крышки. Образцы перемешивали (5 раз по 50 мкл), и переносили 50 мкл 100% образца в содержащий разведенные образцы планшет с 40% образцом. Затем 40% образец перемешивали на планшете для образцов посредством пипетирования (110 мкл 10 раз). Затем пять (5) мкл 40% образца переносили в планшет с 1% образцом, содержащий буфер 1×SB17-твин. Этот образец снова перемешивали пипетированием (120 мкл 10 раз). После перемешивания в планшет для разведения 1 к 10, содержащий буфер 1 × SB17-твин, переносили 10 мкл 1% образца, который перемешивали пипетированием (75 мкл 10 раз). Семь (7) микролитров 0,1% образца из планшета для разведения 1 к 10 переносили в планшет с 0,005% образцом, содержащий буфер 1 × SB17-твин, и перемешивали пипетированием (110 мкл 10 раз).

[00145] Подготовка планшета перед инкубацией. Раствор для хранения со стадии «захват-0» удаляли из фильтровальных планшетов посредством вакуумной фильтрации. Затем добавляли сто девяносто (190) микролитров буфера 1 × SB17-твин с последующим удалением из фильтровальных планшетов посредством вакуумной фильтрации. После этого в фильтровальные планшеты добавляли дополнительные 190 мкл буфера 1 × Sb17-твин.

[00146] Инкубация. Буфер 1×SB17-твин удаляли из фильтровальных планшетов путем центрифугирования (1 минута при 1000 × g). Сто (100) микролитров образца с соответствующим разведением добавляли в фильтровальные планшеты (три фильтровальных планшета, по одному для каждого разведения образца: 40% или 20%, 1% или 0,005%). Фильтровальные планшеты осторожно герметизировали только по периметру, избегая повышенного давления на лунки. Давление вызывает утечку в ходе инкубации. Планшеты затем инкубировали в течение 3,5 часа при 28 °C на термошейкере, установленном на 850 об/мин, с защитой от света.

[00147] Обработка фильтровальных планшетов. После инкубации фильтровальные планшеты помещали в вакуумные коллекторы, и образец удаляли посредством вакуумной фильтрации. Добавляли сто девяносто (190) микролитров промывочного раствора, содержащего биотин (100 мкМ биотина в буфере 1 × SB17-твин), и жидкость удаляли посредством вакуумной фильтрации. Образец затем промывали 5 раз с использованием 190 мкл 1×SB17-твин (вакуумная фильтрация). Добавляли сто (100) микролитров 1 мМ NHS-биотина в буфере 1 × SB17-твин (свежеприготовленный), и фильтровальные планшеты промокали на абсорбирующих прокладках, и смесь инкубировали в течение 5 минут со встряхиванием. Жидкость удаляли посредством вакуумной фильтрации. Добавляли сто двадцать пять (125) микролитров 20 мМ глицина в буфере 1 × SB17-твин, и удаляли жидкость посредством вакуумной фильтрации. Снова добавляли 125 мкл 20 мМ глицина в буфере 1 × SB17-твин, и удаляли жидкость посредством вакуумной фильтрации.

[00148] Образцы последовательно промывали 6 раз с использованием 190 мкл буфера 1 × SB17-твин, причем жидкость удаляли посредством вакуумной фильтрации. В каждый из фильтровальных планшетов затем добавляли восемьдесят пять (85) микролитров буфера для проведения реакции фотоощепления (2 мкм Z-блок в 1 × SB17-твин).

[00149] Фотоотщепление. Фильтровальные планшеты промокали на абсорбирующих прокладках и облучали в течение 6 мин с использованием УФ-лампы BlackRay со встряхиванием (800 об/мин, 25 °C). Планшеты поворачивали на 180 градусов и облучали в течение дополнительных 6 минут под источником света BlackRay. Фильтровальный планшет, содержащий образцы с 40% разведением, помещали на пустой 96-луночный планшет. Фильтровальный планшет, содержащий образцы с 1% разведением, ставили поверх фильтровального планшета, содержащего образцы с 40% разведением, и фильтровальный планшет, содержащий образцы с 0,005% разведением, ставили поверх фильтровального планшета, содержащего образцы с 1%-ным разведением. Сборку планшетов центрифугировали в течение 1 мин при 1000 × g. 96-луночный планшет с элюированным образцом помещали на автоматизированную станцию. Шестидесяти (60) процентный глицерин в буфере 1 × Sb17-твин из инкубатора с 37 °C помещали на автоматизированную станцию.

[00150] Захват-2. В ходе установки анализа 50 мкл 10 мг/мл гранул MyOne SA (500 мкг) добавляли в 96-луночный планшет ABgene Omni-tube для захвата-2 и помещали в инкубатор Cytomat. 96-луночный планшет с гранулами для захвата-2 суспендировали в течение 90 с, помещали на магнитный блок на 60 с и удаляли супернатант. Одновременно или последовательно переносили весь элюат «захват-1» из каждой группы разведения в планшет с гранулами для стадии «захват-2» и инкубировали на термошейкере Пельтье (1350 об/мин, 5 мин, 25 °C). Планшет переносили на магнитный блок при 25 °C на 2 минуты, и удаляли супернатант. Добавляли следующие 75 мкл буфера 1 × SB17-твин, и образец инкубировали на шейкере Пельтье при 1350 об/мин в течение 1 минуты при 37 °C. Затем добавляли 75 мкл 60% глицерина в буфере 1 × SB17-твин (подогретом до 37 °C), и образец снова инкубировали шейкере Пельтье при 1350 об/мин в течение 1 минуты при 37 °C. Планшет переносили на магнитный блок, нагретый до 37 °C, и инкубировали в течение 2 мин с последующим удалением супернатанта. Цикл промывки при 37 °C буфером 1 × SB17-твин и глицерином повторяли еще два раза. Образец затем промывали для удаления остаточного глицерина с использованием 150 мкл буфера 1 × Sb17-твин на шейкере Пельтье (1350 об/мин, 1 минута, 25 °C) с последующим помещением на 1 минуту при 25 °C на магнитный блок. Супернатант удаляли, и добавляли 150 мкл 1 × SB17-твин с заменой на 0,5 M NaCl, и инкубировали при 1350 об/мин в течение 1 минуты (25 °C) последующим помещением на 1 минуту при 25 °C на магнитный блок. Супернатант удаляли, добавляли 75 мкл перхлоратного элюирующего буфера (1,8 M NaClO4, 40 мМ PIPES, 1 мМ EDTA, 0,05% тритон Х-100, 1 × контроли для проведения гибридизации, рН=6,8) с последующей 10-минутной инкубацией на шейкере Пельтье (25 °C, 1350 об/мин). После этого планшет переносили в магнитный сепаратор, инкубировали в течение 90 с и извлекали супернатант.

[00151] Гибридизация. Двадцать (20) микролитров элюированного образца добавляли с помощью автоматизированного устройства в пустой 96-луночный планшет. К элюированным образцам с помощью автоматизированного устройства добавляли пять (5) микролитров 10 × блокирующего буфера Agilent, содержащего второй набор контролей для проведения гибридизации. Затем в лунки вручную добавляли 25 мкл 2 × буфера для гибридизации Agilent HiRPM. На стеклянные подложки Agilent загружали сорок (40) микролитров гибридизационной смеси. Матрицу Agilent 8 на 15k помещали на стеклянную подложку, и закрепляли сэндвич с помощью зажима. Затем сэндвич инкубировали с вращением (20 об/мин) в течение 19 часов при 55 °C.

[00152] Промывка после гибридизации. Обработку стекол после гибридизации осуществляли на устройстве для обработки препаратов Little Dipper (SciGene, каталожный номер 1080-40-1). Приблизительно 750 мл промывочного буфера 1 (промывочного буфера 1 Oligo aCGH/ChIP-on-chip, Agilent Technologies) вносили в один стеклянный сосуд для окрашивания. Приблизительно 750 мл промывочного буфера 1 (промывочного буфера 1 Oligo aCGH/ChlP-on-chip, Agilent Technologies) вносили в баню № 1 устройства для обработки препаратов Little Dipper. Приблизительно 750 мл промывочного буфера 2 (промывочного буфера 1 OligoaCGH/ChlP-on-chip, Agilent Technologies), нагретого до 37 °C, вносили в баню № 2 устройства для обработки препаратов Little Dipper. Скорость магнитной мешалки для обеих бань устанавливали на 5. Температурный регулятор для бани № 1 не включали, тогда как температурный регулятор для бани № 2 устанавливали на 37 °C. До двенадцати сборок, состоящих стекол/уплотняющих прокладок, последовательно разбирали в первом сосуде для окрашивания, содержащем промывочный буфер 1, и помещали стекла в штатив для стекол, в то время как они все еще были погруженными в промывочный буфер 1. По мере разборки всех сборок, состоящих из стекол/уплотняющих прокладок, штатив для стекол быстро переносили в баню № 1 устройства для обработки препаратов Little Dipper, и запускали программу автоматической промывки. Стекла инкубировали в устройстве для обработки препаратов Little Dipper в течение 300 с в бане № 1 со скоростью 250 с последующим переносом в баню № 2 с температурой 37 °C, содержащую промывочный раствор 2 Agilent (промывочный буфер 2 Oligo aCGH/ChlP-on-chip, Agilent Technologies), и инкубировали в течение 300 с со скоростью 100. После этого устройство для обработки препаратов Little Dipper переносило штатив для стекол во встроенную центрифугу, где стекла центрифугировали в течение 300 с со скоростью 690.

[00153] Визуализация микроматрицы. Стеклянные подложки для микроматриц визуализировали с помощью сканера для микроматриц (Agilent G2565CA Microarray Scanner System, Agilent Technologies) в канале Cy3 с разрешением 5 мкм с параметром 100% РМТ и опцией дифракционного рентгеновского анализа, разрешенного при 0,05. Полученные в результате изображения в формате tiff обрабатывали с использованием программного обеспечения Agilent для выделения характерных признаков версии 10.7.3.1 с использованием протокола GEl_107_Sep09.

[00154] В контексте настоящего документа «высвобождаемый» или «расщепляемый» элемент, фрагмент или линкер относится к молекулярной структуре, которая может быть разрушена с получением двух отдельных компонентов. Высвобождаемый (или расщепляемый) элемент может содержать одну молекулу, в которой может быть разрушена химическая связь (обозначен в данном документе как «встроенный расщепляемый линкер»), или он может содержать две или больше молекул, в которых нековалентное взаимодействие может быть разрушено или нарушено (обозначен в данном документе как «гибридизационный линкер»).

[00155] В некоторых вариантах осуществления необходимо пространственно отделять определенные функциональные группы от других для того, чтобы предотвратить перекрестное влияние отдельных функциональных групп. Например, присутствие рядом с фотоотщепляемой группой метки, которая поглощает определенные длины волн светового излучения, может перекрестно влиять на эффективность фотоотщепления. Поэтому желательно разделять такие группы невзаимодействующим фрагментом, например таким, который обеспечивает достаточное пространственное разделение для получения полного эффекта фотоотщепления. В некоторых вариантах осуществления в аптамер был введен «спейсерный линкер» с меткой и с фотоотщепляемой функциональной группой.

[00156] «Твердая подложка» относится к любому субстрату, имеющему поверхность, к которой могут быть присоединены молекулы, прямо или опосредованно, либо посредством ковалентных, либо нековалентных связей. Твердая подложка может включать любой субстратный материал, который способен обеспечивать физическую поддержку для захватывающих элементов или зондов, которые присоединены к поверхности. Материал, в целом, может выдерживать условия, связанные с присоединением захватывающих элементов или зондов к данной поверхности, и любую последующую подготовку, манипуляции или обработку, встречающиеся в ходе проведения анализа. В качестве материалов могут выступать материалы природного происхождения, синтетические материалы или модифицированный материал природного происхождения. Подходящая твердая подложка материалы может включать кремний, чип из кремниевых пластин, графит, поверхности с зеркальным покрытием, слоистые материалы, мембраны, керамику, пластмассу (включая полимеры, такие как, например, поли(винилхлорид), циклоолефиновые сополимеры, агарозные гели или гранулы, полиакриламид, полиакрилат, полиэтилен, полипропилен, поли(4-метилбутен), полистирол, полиметакрилат, поли(этилентерефталат), политетрафторэтилен (ПТФЭ или Тефлон®), нейлон, поли(винилбутират)), германий, арсенид галлия, золото, серебро, пленки Лэнгмюра - Блоджета, проточный чип и т. п., либо используемые отдельно, либо совместно с другими материалами. Могут быть рассмотрены дополнительные жесткие материалы, такие как стекло, которое включает диоксид кремния и дополнительно включает, например, стекла, доступные в виде биостекла. Другие материалы, которые можно использовать, включают пористые материалы, такие как, например, стеклянные гранулы с контролируемым размером пор, сшитую гранулированную смолу Сефароза® или агарозные смолы, или сополимеры сшитых бисакриламида и азалактона. Другие гранулы включают наночастицы, полимерные гранулы, сплошные гранулы, парамагнитные гранулы или микрогранулы. Также предусмотрены любые другие материалы, известные в данной области, которые могут содержать одну или более функциональных групп, таких как любая из аминной, карбоксильной, тиольной или гидроксильной функциональной группы, например, расположенные на поверхности.

[00157] Материал, используемый для твердой подложки, может принимать любую конфигурацию из множества конфигураций, от простой до сложной. Твердая подложка может иметь любую форму из целого ряда форм, включая полоску, пластину, диск, палочку, частицу, гранулу, трубку, лунку (микротитр) и т. п. Твердая подложка может быть пористой или непористой, магнитной, парамагнитной или немагнитной, полидисперсной или монодисперсной, гидрофильной или гидрофобной. Твердая подложка также может быть в форме геля или суспензии плотноупакованных (как в столбцовой матрице) или неплотно упакованных частиц.

[00158] В одном варианте осуществления для захвата из тестируемой смеси аффинных комплексов из аптамера и мишени или ковалентных комплексов из аптамера и мишени, содержащих тег, используется твердая подложка с прикрепленным захватывающим элементом. В одном конкретном примере, когда в качестве тега выступает биотиновый фрагмент, в качестве твердой подложки могут выступать гранулы или смола, покрытая стрептавидином, например Dynabeads М-280 Streptavidin, Dynabeads MyOne Streptavidin, Dynabeads M-270 Streptavidin (Invitrogen), стрептавидин-агарозная смола (Pierce), смола Ultralink, содержащая стрептавидин, стрептавидиновые гранулы MagnaBind (ThermoFisher Scientific), BioMag Streptavidin, ProMag Streptavidin, диоксид кремния с поверхностью, покрытой стрептавидином (Bangs Laboratories), Streptavidin Sepharose High Performance (GE Healthcare),

[00159] стрептавидин-полистирольные микросферы (Microspheres-Nanospheres), полистирольные частицы, покрытые стрептавидином (Spherotech), или любая другая гранула, покрытая стрептавидином, или смола, широко используемая специалистами в данной области для захвата молекул, содержащих биотиновый тег.

[00160] Как было описано выше, одной целью настоящего изобретения является превращение сигнала, обусловленного белком, в сигнал, обусловленный аптамером. В результате этого количество собранных/обнаруженных аптамеров является показательным и может быть прямо пропорциональным количеству связанных молекул-мишеней и количеству молекул-мишеней в образце. Можно применить ряд схем обнаружения без элюирования аффинного комплекса аптамера и мишени или ковалентного комплекса аптамера и мишени из второй твердой подложки после разделения на стадии «захват-2». В дополнение к следующим вариантам осуществления способов обнаружения, специалистам в данной области известны другие способы обнаружения.

[00161] Многие способы обнаружения требуют встраивания в аптамер обнаруживаемой метки перед обнаружением. В этих вариантах осуществления метки, такие как, например, флуоресцентные или хемилюминесцентные красители, можно встроить в аптамеры либо в ходе синтеза, либо после синтеза с использованием стандартных методов синтеза нуклеиновых кислот. Радиоактивные метки можно встроить либо в ходе синтеза, либо после синтеза с использованием стандартных ферментативных реакций с соответствующими реагентами. Мечение также может происходить после разделения на стадии «захват-2» и элюирования за счет использования подходящих ферментативных методов. Например, использование в ПЦР праймера с вышеупомянутыми метками обеспечит включение метки в продукт амплификации элюированных аптамеров. При использовании метода гель-электрофореза для количественного определения также можно встроить массовые метки разных размеров с использованием ПЦР. Эти массовые метки также могут включать разные флуоресцентные или хемилюминесцентные красители для дополнительной возможности мультиплексирования. Метки можно присоединять к аптамерам опосредованно за счет использования специфического тега, встроенного в аптамер, либо в ходе синтеза, либо после синтеза, и затем за счет присоединения зонда, который ассоциирует с тегом и несет метку. Метки включают описанные выше метки, а также ферменты, используемые, например, в стандартных анализах для колориметрических считываний данных. Эти ферменты работают в комбинации с субстратами ферментов и включают ферменты, такие как, например, пероксидаза хрена (ПХ) и щелочная фосфатаза (ЩФ). Метки также могут включать вещества или соединения, которые являются электрохимическими функциональными группами для электрохимического обнаружения.

[00162] Например, аптамер можно пометить, как было описано выше, радиоактивным изотопом, таким как 32 Р, до взаимодействия с исследуемым образцом. Используя какой-либо из четырех основных анализов и их вариантов, которые обсуждались выше, обнаружение аптамеров становится возможным просто благодаря количественному определению радиоактивности на второй твердой подложке в конце анализа. Уровень радиоактивности будет прямо пропорционален количеству молекул-мишеней в первоначальном тестируемом образце. Подобным образом, мечение аптамера флуоресцентным красителем перед взаимодействием с тестируемым образцом, как было описано выше, обеспечивает простое считывание показателя флуоресценции непосредственно на второй твердой подложке. Для непосредственного считывания показателей второй твердой подложки подобным образом можно использовать хемилюминесцентную метку или квантовую точку, не требующие элюирования аптамера.

[00163] Элюирование аптамера или высвобождение ковалентного комплекса фотоаптамера и мишени из второй твердой подложки дает возможность использовать дополнительные схемы обнаружения в дополнение к схемам, описанным выше. Например, можно провести электрофорез в полиакриламидном геле (ПАГЭ) высвобождаемого аптамера, фотоаптамера или ковалентного комплекса фотоаптамера и мишени и выполнить обнаружение и, необязательно, количественное определение с помощью красителя нуклеиновых кислот, такого как SYBR Gold. Альтернативно, можно провести обнаружение и количественное определение высвобождаемого аптамера, фотоаптамера или ковалентного комплекса фотоаптамера посредством капиллярного гель-электрофореза (КГЭ) с использованием флуоресцентной метки, встроенной в аптамер, как было описано выше. В другой схеме обнаружения используется количественная ПЦР для обнаружения и количественного определения элюированного аптамера, например, с использованием SYBR Green. Альтернативно, для обнаружения и количественного определения элюированного аптамера можно использовать ДНК анализ Invader®. В другой альтернативной схеме обнаружения используется секвенирование нового поколения.

[00164] В другом варианте осуществления количество или концентрация аффинного комплекса из аптамера и мишени (или ковалентного комплекса из аптамера и мишени) определена с использованием «молекулярного маяка» в ходе процесса репликации (см., например, Tyagi et ah, Nat. Biotech. J_6:49 53, 1998; патент США № 5,925,517). Молекулярный маяк представляет собой специфический зонд из нуклеиновой кислоты, который свертывается в петлеобразную шпильку и содержит флуорофор на одном конце и гаситель на другом конце шпилечной структуры таким образом, что при образовании шпильки флуорофор генерирует слабый сигнал или не генерирует никакого сигнала. Последовательность петли обладает специфичностью к полинуклеотидной последовательности-мишени, и при гибридизации с последовательностью аптамера шпилька развертывается и вследствие этого генерирует флуоресцентный сигнал.

[00165] Для мультиплексного обнаружения небольшого количества аптамеров, все еще связанных на второй твердой подложке, можно использовать флуоресцентные красители с разными спектрами возбуждения/испускания для обнаружения и количественного определения двух, или трех, или пяти, или до десяти отдельных аптамеров.

[00166] Подобным образом для мультиплексных считываний данных можно использовать разновеликие квантовые точки. Квантовые точки могут быть введены после отделения свободного аптамера от второй твердой подложки. За счет использования гибридизируемых последовательностей, обладающих специфичностью к аптамерам, прикрепленных к уникальным квантовым точкам, можно осуществлять мультиплексированное считывание данных для 2, 3, 5 и до 10 аптамеров. Мечение разных аптамеров разными радиоактивными изотопами, которые можно обнаруживать по отдельности, такими как 32 P, 3 H, 13C и 35S, также можно использовать для ограниченного количества мультиплексных считываний данных.

[00167] Для мультиплексной детекции аптамеров, отделенных от второй твердой подложки для стадии «захват-2», можно использовать один флуоресцентный краситель, встроенный в каждый аптамер, как было описано выше, вместе со способом количественного определения, который позволяет идентифицировать последовательность аптамера наряду с количественным определением уровня аптамера. Способы включают, среди прочего, гибридизацию на ДНК-чипе, гибридизацию на микрогранулах, секвенирование нового поколения и анализ КГЭ.

[00168] В одном варианте осуществления используется стандартная матрица для ДНК-гибридизации или чип для гибридизации каждого аптамера или фотоаптамера с уникальными зондами или рядом уникальных зондов, иммобилизированных на стеклянной подложке или чипе, такие как матрицы Agilent, матрицы Illumina BeadChip, матрицы NimbleGen или напечатанные по заказу матрицы. Каждый уникальный зонд комплементарен последовательности аптамера. В качестве комплементарной последовательности может выступать уникальный гибридизационный тег, встроенный в аптамер, или часть последовательности аптамера, или вся последовательность аптамера. Аптамеры, высвобождаемые из твердой подложки для стадии «захват-2», добавляют в соответствующий буфер для гибридизации и обрабатывают с использованием стандартных способов гибридизации. Например, раствор аптамеров инкубируют в течение 12 часов на матрице для ДНК-гибридизации приблизительно при 60 °C для обеспечения точности гибридизации. Матрицы промывают и затем сканируют во флуоресцентном сканере для стеклянных подложек с получением изображения интенсивности гибридизации аптамера на каждом элементе матрицы. Сегментацию и количественный анализ изображений выполняют с использованием программного обеспечения для обработки изображений, такого как ArrayVision. В одном варианте осуществления в мультиплексных анализах на основе аптамеров обнаружение может осуществляться с использованием до 25 аптамеров, до 50 аптамеров, до 100 аптамеров, до 200 аптамеров, до 500 аптамеров, до 1000 аптамеры и до 10 000 аптамеров.

[00169] В одном варианте реализации изобретения для гибридизации использованы доступные микрогранулы, имеющие уникальные ДНК-зонды, комплементарные аптамеру, как было описано выше. Могут быть доступны микрогранулы с уникальными флуоресцентными красителями, такими как в технологии Luminex beads, или можно использовать метку в виде штрихового кода, как в технологии Illumina VeraCode или активируемых лазером транспондерных метках. В одном варианте осуществления аптамеры, высвобождаемые из твердой подложки для стадии «захват-2», добавляют в соответствующий буфер для гибридизации и обрабатывают с использованием стандартных способов гибридизации на микрогранулах. Например, раствор аптамеров инкубируют в течение двух часов с набором микрогранул приблизительно при 60 °C для обеспечения точности гибридизации. Растворы затем анализируют на приборе Luminex, который считает отдельные типы гранул и определяет количественно сигнал флуоресценции аптамеров. В другом варианте осуществления гранулы VeraCode вносят в раствор аптамеров и подвергают гибридизации в течение двух часов приблизительно при 60 °C, и затем наносят на сетчатую поверхность, и сканируют с использованием сканера для стеклянных подложек для идентификации и количественного определения флуоресценции. В другом варианте осуществления транспондерные микрогранулы инкубируют с образцом аптамеров приблизительно при 60 °C и затем определяют количественно с использованием соответствующего устройства для транспондерных микрогранул. В одном варианте осуществления в мультиплексных анализах аптамеров обнаружение может осуществляться путем гибридизации с микрогранулами с использованием до 25 аптамеров, до 50 аптамеров, до 100 аптамеров, до 200 аптамеров и до 500 аптамеров.

[00170] Образец, содержащий элюированные аптамеры, можно обработать для включения в его состав тегов с уникальной массой наряду с флуоресцентными метками, как было описано выше. Аптамеры с массовой меткой затем вводят в прибор для КГЭ, по существу ДНК-секвенатор, и идентифицируют аптамеры по их уникальным массам и определяют количественно с использованием флуоресценции от красителя, встроенного в ходе реакции введения метки. Один иллюстративный пример этого метода был разработан Althea Technologies.

[00171] Во многих способах, описанных выше, аптамеры, находящиеся в растворе, можно амплифицировать и необязательно пометить до количественного определения. Можно использовать стандартную ПЦР-амплификацию с раствором аптамеров, элюированных из твердой подложки стадии «захват-2». Такую амплификацию можно использовать до гибридизации на ДНК-матрице, гибридизации на микрогранулах и регистрации данных КГЭ.

[00172] В другом варианте осуществления аффинный комплекс из аптамера и мишени (или ковалентный комплекс из аптамера и мишени) обнаруживают и/или определяют количественно с использованием количественной ПЦР. В контексте настоящего документа «количественная ПЦР» относится к ПЦР-реакции, осуществляемой таким образом и в таких контролируемых условиях, что результаты анализа являются количественными, то есть анализ позволяет определить количество или концентрацию аптамера, присутствующего в тестируемом образце.

[00173] В одном варианте осуществления количество или концентрация аффинного комплекса из аптамера и мишени (или ковалентного комплекса из аптамера и мишени) в тестируемом образце определена с использованием TaqMan® ПЦР. Этот метод по существу основан на 5'-3' экзонуклеазной активности фермента, обеспечивающего репликацию олигонуклеотидов, с получением сигнала от последовательности-мишени. Зонд TaqMan выбирают, исходя из последовательности аптамера, который определяют количественно, и, в целом, он включает 5'-концевой флуорофор, такой как, например, 6-карбоксифлуоресцеин и 3'-концевой гаситель, такой как, например, 6-карбокситетраметилфлуоресцеин, для генерации сигнала по мере амплификации последовательности аптамера с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР). По мере того как полимераза копирует последовательность аптамера, экзонуклеазная активность способствует отделению флуорофора от зонда, отжиг которого происходит в нисходящем направлении от ПЦР-праймеров, вследствие чего генерируется сигнал. Сигнал усиливается по мере образования продукта репликации. Количество ПЦР-продукта зависит как от количества осуществляемых циклов репликации, так и от начальной концентрации аптамера.

[00174] В другом варианте осуществления количество или концентрацию аффинного комплекса из аптамера и мишени (или ковалентного комплекса из аптамера и мишени) определяют в ходе репликационного процесса с использованием интеркалирующего флуоресцентного красителя. Интеркалирующий краситель, такой как, например, SYBR® green, генерирует сильный сигнал флуоресценции в присутствии двухцепочечной ДНК по сравнению с сигналом флуоресценции, генерированным в присутствии одноцепочечной ДНК. По мере образования в ходе ПЦР продукта двухцепочечной ДНК усиливается сигнал, производимый красителем. Величина производимого сигнала зависит и от количества циклов ПЦР, и от начальной концентрации аптамера.

[00175] В другом варианте осуществления аффинный комплекс из аптамера и мишени (или ковалентный комплекс из аптамера и мишени) обнаруживают и/или определяют количественно с использованием масс-спектрометрии. Теги с уникальной массой могут быть введены с использованием ферментативных методов, описанных выше. Для считывания данных масс-спектроскопии не требуется никакая обнаруживаемая метка, скорее используется масса, как таковая, и для идентификации, и количественного определения с использованием методов, широко используемых специалистами в данной области, на основе местоположения и площади под пиками масс-спектра, образованными в ходе масс-спектроскопического анализа. Примером использования масс-спектроскопии является система MassARRAY®, разработанная Sequenom.

[00176] Можно использовать компьютерную программу для проведения одной или нескольких стадий любого из способов, раскрытых в настоящем документе. Другим аспектом настоящего изобретения является компьютерный программный продукт, содержащий машиночитаемый носитель данных, имеющий компьютерную программу, хранящуюся на нем, которая, при загрузке в компьютер, осуществляет или способствует осуществлению любого из способов, раскрытых в настоящем документе.

[00177] Одним аспектом раскрытия является продукт любого из способов, раскрытых в данном документе, а именно, результат анализа, который можно оценить на месте исследования или можно отправить в другое место для оценки и передачи заинтересованной стороне в удаленное местоположение (при желании). В контексте настоящего документа «удаленное местоположение» относится к местоположению, которое в физическом смысле отличается от местоположения, в котором получают результаты. Соответственно, результаты можно направить в другую комнату, другое здание, другую часть города, другой город и т. п. Данные можно передать с помощью любых подходящих средств, таких как, например, факс, почта, экспресс-доставка на следующий день, электронная почта, передача файла по сети, голосовая почта и т. п.

[00178] «Передача» информации относится к передаче данных, представляющих эту информацию в виде электрических сигналов, через подходящий канал связи (например, частную сеть или сеть общего пользования). «Переадресация» элемента относится к любому способу доставки этого элемента от одного местоположения к следующему, будь-то путем физического транспорта этого элемента или иным способом (где это возможно), и включает, по меньшей мере в случае данных, физический транспорт средства-носителя данных или средства для передачи данных.

Модифицированные нуклеотиды

[00179] В определенных вариантах осуществления в описании представлены олигонуклеотиды, такие как аптамеры, которые содержат два разных типа нуклеотидов с модифицированным основанием. В некоторых вариантах осуществления олигонуклеотиды содержат два разных типа пиримидина, модифицированного в положении 5. В некоторых вариантах осуществления олигонуклеотид содержит по меньшей мере один C5-модифицированный цитидин и по меньшей мере один C5-модифицированный уридин. В некоторых вариантах осуществления олигонуклеотид содержит два разных C5-модифицированных цитидина. В некоторых вариантах осуществления олигонуклеотид содержит два разных C5-модифицированных уридина. Неограничивающие примеры C5-модифицированных уридинов и цитидинов показаны, например, на Фиг. 1. Некоторые неограничивающие примеры C5-модифицированных уридинов показаны на Фиг. 2, а некоторые неограничивающие апимеры C5-модифицированных цитидинов показаны на Фиг. 3.

Подготовка олигонуклеотидов

[00180] Автоматический синтез олигодезоксинуклеозидов является стандартной практикой во многих лабораториях (см., например, Matteucci, M. D. and Caruthers, M. H., (1990) J. Am. Chem. Soc., 103:3185-3191, содержание которой полностью включено в настоящее описание посредством ссылки). Синтез олигорибонуклеозидов также хорошо известен (см, например, Scaringe, S. A., et al., (1990) Nucleic Acids Res. 18:5433-5441, содержание которой полностью включено в настоящее описание посредством ссылки). Как отмечено в настоящем документе, фосфорамидиты используются для встраивания модифицированного нуклеозида в олигонуклеотид путем химического синтеза, а трифосфаты используются для встраивания модифицированного нуклеозида в олигонуклеотид путем ферментативного синтеза. См., например, Vaught, J. D. et al. (2004) J. Am. Chem. Soc., 126:11231-11237; Vaught, J. V., et al. (2010) J. Am. Chem. Soc. 132, 4141-4151; Gait, M. J. “Oligonucleotide Synthesis a practical approach” (1984) IRL Press (Oxford, UK); Herdewijn, P. “Oligonucleotide Synthesis” (2005) Humana Press, Totowa, N.J. (каждая из которых полностью включена в настоящий документ посредством ссылки).

[00181] «Мишень», или «молекула-мишень» относится в данном документе к любому соединению, на которое нуклеиновая кислота может действовать желаемым или предполагаемым образом. Молекула-мишень может представлять собой белок, пептид, нуклеиновую кислоту, углевод, липид, полисахарид, гликопротеин, гормон, рецептор, антиген, антитело, вирус, патогенный микроорганизм, токсичное вещество, субстрат, метаболит, аналог переходного состояния, кофактор, ингибитор, лекарственное средство, краситель, питательное вещество, фактор роста, клетку, ткань, любую часть или фрагмент любого из вышеперечисленного и т. д. без ограничения. В действительности, подходящей мишенью может быть любой химический или биологический эффекторный фактор. В качестве мишеней могут служить молекулы любого размера. Мишень также может быть модифицирована определенными путями с целью повышения вероятности или силы взаимодействия между мишенью и нуклеиновой кислотой. Мишень может также включать, например, любое незначительное изменение конкретного соединения или молекулы, например в случае белка незначительные изменения в аминокислотной последовательности, в образовании дисульфидных связей, в гликозилировании, липидизации, ацетилировании, фосфорилировании или в любой другой манипуляции или модификации, такой как конъюгация с меченым компонентом, которая, по существу, не изменяет идентичности молекулы. «Молекула-мишень» или «мишень» представляет собой набор копий одного типа или вида молекул или мультимолекулярную структуру, которая способна связываться с аптамером. «Молекулы-мишени» или «мишени» относятся более чем к одному такому набору молекул. Варианты осуществления способа SELEX, в котором мишенью является пептид, описаны в патенте США № 6,376,190, озаглавленном “Modified SELEX Processes Without Purified Protein.” В некоторых вариантах осуществления мишенью является белок.

[00182] В контексте настоящего документа термины «конкурентная молекула» и «конкурент» используют взаимозаменяемо для обозначения любой молекулы, которая может образовывать неспецифический комплекс с молекулой, не являющейся мишенью. В этом контексте молекулы, не являющиеся мишенью, включают свободные аптамеры, где, например, конкурент может быть использован для ингибирования неспецифического связывания (повторного связывания) аптамера с другой молекулой, не являющейся мишенью. «Конкурентная молекула» или «конкурент» - это набор копий одного типа или вида молекул. «Конкурентные молекулы» или «конкуренты» относятся к нескольким таким группам молекул. Конкурентные молекулы включают, без ограничений, олигонуклеотиды, полианионы (например, гепарин, ДНК сперматозоида сельди, ДНК сперматозоида лосося, тРНК, сульфат декстрана, полидекстран, полимеры с фосфодиэфирной связью с удаленными азотистыми основаниями, дНТФ и пирофосфат). В различных вариантах осуществления может использоваться комбинация одного или более конкурентов.

[00183] В контексте настоящего документа термин «неспецифический комплекс» относится к нековалентной ассоциации между двумя или более молекулами, отличными от аптамера, и его молекулой-мишенью. Неспецифический комплекс представляет взаимодействие между классами молекул. Неспецифические комплексы включают комплексы, образованные между аптамером и молекулой, не являющейся мишенью, конкурентом и молекулой, не являющейся мишенью, конкурентом и молекулой-мишенью, а также молекулой-мишенью и молекулой, не являющейся мишенью.

[00184] В другом варианте осуществления полианионный конкурент (например, сульфат декстрана или другой полианионный материал) используется в процессе обогащения с низкой скоростью диссоциации для облегчения идентификации аптамера, рефрактерного к присутствию полианиона. В этом контексте «рефрактерный к полианионам аптамер» представляет собой аптамер, способный образовывать комплекс аптамер/мишень, который с меньшей вероятностью диссоциирует в растворе, также содержащем рефрактерный к проианиону материал, чем комплекс аптамер/мишень, который включает в себя аптамер не рефрактерный к полианионам. Таким образом, рефрактерные к полианионам аптамеры можно использовать при осуществлении аналитических методов для обнаружения присутствия или определения количества или концентрации мишени в образце, где метод обнаружения включает использование полианионного материала (например, сульфата декстрана), к которому аптамер рефрактерен.

[00185] Таким образом, в одном варианте осуществления предоставляется способ получения рефрактерного к полианионам аптамера. В этом варианте осуществления после контактирования смеси кандидатов нуклеиновых кислот с мишенью, мишени и нуклеиновым кислотам в смеси кандидатов предоставляют возможность уравновешивания. Вводят полианионный конкурент, и дают возможность инкубации в растворе в течение периода времени, достаточного для гарантии того, что большинство быстродиссоциирующих аптамеров в смеси кандидатов диссоциируют из молекулы-мишени. Кроме того, аптамеры в смеси кандидатов, которые могут диссоциировать в присутствии полианионного конкурента, будут высвобождаться из молекулы-мишени. Смесь разделяют для выделения аптамеров с высокой аффинностью и медленной скоростью диссоциации, которые остались в ассоциации с молекулой -мишенью, и для удаления из раствора любых материалов, не входящих в состав комплексов. Затем аптамер можно высвободить из молекулы-мишени и выделить. Выделенный аптамер также может быть амплифицирован, и для повышения общей эффективности выбранных аптамеров могут быть применены дополнительные раунды отбора. Этот процесс также можно использовать с минимальным временем инкубации, если для конкретного применения не требуется выбор аптамеров с низкой скоростью диссоциации.

Соли

[00186] Может быть удобным или желательным получить, очистить и/или использовать соответствующую соль соединения, например фармацевтически приемлемую соль. Примеры фармацевтически приемлемых солей описаны в публикации Berge et al. (1977) “Pharmaceutically Acceptable Salts” J. Pharm. Sci. 66:1-19.

[00187] Например, если соединение является анионным или имеет функциональную группу, которая может быть анионной (например, -COOH может представлять собой -COO⁻), то соль может быть образована с подходящим катионом. Примеры подходящих неорганических катионов включают, без ограничений, ионы щелочных металлов, такие как Na⁺ и K⁺, катионы щелочноземельных металлов, такие как Ca²⁺ и Mg²⁺ и другие катионы, такие как Al³⁺. Примеры подходящих органических катионов включают, без ограничений, ион аммония (т. е. NH₄ ⁺) и замещенные ионы аммония (например, NH₃R^X+, NH₂R^X ₂ ⁺, NHR^X ₃ ⁺, NR^X ₄ ⁺). Примерами некоторых подходящих замещенных ионов аммония являются ионы, полученные из: этиламина, диэтиламина, дициклогексиламина, триэтиламина, бутиламина, этилендиамина, этаноламина, диэтаноламина, пиперазина, бензиламина, фенилбензиламина, холина, меглумина и трометамина, а также аминокислот, таких как лизин и аргинин. Примером обычного иона четвертичного аммония является N(CH₃)₄ ⁺.

[00188] Если соединение является катионным или имеет функциональную группу, которая может быть катионной (например, -NH₂ может представлять -NH₃⁺), то соль может быть образована с подходящим анионом. Примеры подходящих неорганических анионов включают, без ограничений, анионы, полученные из следующих неорганических кислот: хлористоводородная, бромистоводородная, йодистоводородная, серная, сернистая, азотная, азотистая, фосфорная и фосфористая.

[00189] Примеры подходящих органических анионов включают, без ограничений, соли, полученные из следующих органические кислот: 2-ацетоксибензойной, уксусной, аскорбиновой, аспарагиновой, бензойной, камфорсульфоновой, коричной, лимонной, эдетовой, этандисульфоновой, этансульфоновой, фумаровой, глюкогептоновой, глюконовой, глутаминовой, гликолевой, гидроксималеиновой, гидроксинафталинкарбоновой, изэтионовой, молочной, лактобионовой, лауриновой, малеиновой, яблочной, метансульфоновой, муциновой, олеиновой, щавелевой, пальмитиновой, памовой, пантотеновой, фенилуксусной, фенилсульфоновой, пропионовой, пировиноградной, салициловой, стеариновой, янтарной, сульфаниловой, винной, толуолсульфоновой и валериановой. Примеры подходящих полимерных органических анионов включают, без ограничений, полученные из следующих полимерных кислот: дубильной кислоты, карбоксиметилцеллюлозы.

[00190] Если не указано иное, ссылка на конкретное соединение также включает его солевые формы.

Другие варианты осуществления

[00191] В некоторых вариантах осуществления раскрыт способ, включающий: a) приведение в контакт первого тестируемого образца с первым набором аптамеров с образованием первой смеси, где первый тестируемый образец представляет Z% разведение биологического образца, причем Z представляет разведение биологического образца от 5% до 39% (или 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38 или 39) , и при этом в первом наборе аптамеров содержится не менее A₃ различных аптамеров; b) приведение в контакт второго тестируемого образца со вторым набором аптамеров с образованием второй смеси, где второй тестируемый образец представляет Y% разведение биологического образца, причем Y меньше Z, и при этом во втором наборе аптамеров содержится не менее A₂ различных аптамеров; c) приведение в контакт третьего тестируемого образца с третьим набором аптамеров с образованием третьей смеси, где третий тестируемый образец представляет X% разведение биологического образца, причем X меньше Y, и при этом в третьем наборе аптамеров содержится не менее A₁ различных аптамеров; d) инкубацию первой, второй и третьей смеси, чтобы обеспечить образование комплексов аптамера и белка, и удаление большинства аптамеров, которые не образовывали комплексы аптамера и белка; e) сбор аптамеров из комплексов аптамера и белка посредством диссоциации комплексов аптамера и белка; f) обнаружение или количественное определение собранных аптамеров; причем большинство аптамеров из первого набора аптамеров, второго набора аптамеров и третьего набора аптамеров обладают аффинностью к разным белкам-мишеням в тестируемом образце и способны образовывать комплекс аптамера и белка со своим белком-мишенью, и при этом A₃ больше A₂, и A₂ больше A₁; и при этом сумма A₁, A₂ и A₃ составляет по меньшей мере 4000.

[00192] В одном аспекте Z находится в диапазоне от 10% до 30%, или от 15% до 25%, или составляет приблизительно 20%.

[00193] В одном аспекте Y находится в диапазоне от 0,01% до 1% (или равен 0,01, 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1, 0,15, 0,2, 0,25, 0,3, 0,35, 0,4, 0,45, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 или 1), или от 0,1% до 0,8%, или от 0,2% до 0,75% или составляет приблизительно 0,5%.

[00194] В одном аспекте X находится в диапазоне от 0,001% до 0,009% (или равен 0,001, 0,002, 0,003, 0,004, 0,005, 0,006, 0,007, 0,008 или 0,009), или от 0,002% до 0,008%, или от 0,003% до 0,007% или составляет приблизительно 0,005%.

[00195] В одном аспекте сумма A₁, A₂ и A₃ составляет по меньшей мере 4500 или 5000.

[00196] В одном аспекте A₃ находится в диапазоне от 50% до 90% (или составляет 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85% или 90%) от суммы A₁, A₂ и A₃; или находится в диапазоне от 60% до 85% от суммы A₁, A₂ и A3; или составляет приблизительно 80% или 81% от суммы A₁, A₂ и A₃.

[00197] В одном аспекте A₂ находится в диапазоне от 10% до 49% (или составляет 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45% или 49%) от суммы A₁, A₂ и A₃; или находится в диапазоне от 12% до 35% от суммы A₁, A₂ и A3; или находится в диапазоне от 15% до 30% от суммы A₁, A₂ и A3; или составляет приблизительно 15% или 16% от суммы A₁, A₂ и A₃.

[00198] В одном аспекте A₁ находится в диапазоне от 1% до 9% (или составляет 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8% или 9%) от суммы A₁, A₂ и A₃; или находится в диапазоне от 2% до 7% от суммы A₁, A₂ и A3; или находится в диапазоне от 3% до 6% от суммы A₁, A₂ и A3; или составляет приблизительно 3% или 4% от суммы A₁, A₂ и A₃.

[00199] В одном аспекте A₃ составляет по меньшей мере 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4200, 4270, 4500, 5000 (или от 900 до 16 500, или от 2000 до 15 000, или от 3000 до 12 000, или от 4000 до 10 000).

[00200] В одном аспекте A₂ составляет по меньшей мере 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 820, 900 (или от 500 до 3500, или от 700 до 2500, или от 800 до 2000).

[00201] В одном аспекте A₁ составляет по меньшей мере 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 173 (или от 100 до 700, или от 100 до 650).

[00202] В одном аспекте первую смесь, вторую смесь и третью смесь инкубируют отдельно друг от друга.

[00203] В одном аспекте способы, описанные в настоящем документе, дополнительно включают объединение первой смеси, второй смеси и третьей смеси вместе после инкубации, чтобы обеспечить образование комплекса аптамера и белка.

[00204] В одном аспекте способы, описанные в настоящем документе, дополнительно включают последовательное объединение первой смеси, второй и третьей смеси вместе после инкубации, чтобы обеспечить образование комплекса аптамера и белка.

[00205] В одном аспекте последовательное объединение выполняется в порядке, выбранном из: i) первая смесь, затем вторая смесь, затем третья смесь; ii) первая смесь, затем третья смесь, затем вторая смесь; iii) вторая смесь, затем первая смесь, затем третья смесь; iv) вторая смесь, затем третья смесь, затем первая смесь; v) третья смесь, затем вторая смесь, затем первая смесь; и vi) третья смесь, затем первая смесь, затем вторая смесь.

[00206] В одном аспекте тестируемый образец выбран из крови, плазмы, сыворотки, мокроты, выдыхаемого воздуха, мочи, спермы, слюны, менингеальной жидкости, амниотической жидкости, жидкости, вырабатываемой железами, лимфатической жидкости, аспирата из сосков, бронхиального аспирата, синовиальной жидкости, аспирата суставной жидкости, клеток, экстракта клеток и спинномозговой жидкости.

[00207] В одном аспекте обнаружение или количественное определение выполняется с помощью ПЦР, масс-спектрометрии, секвенирования нуклеиновых кислот, секвенирования нового поколения (NGS) или гибридизации.

[00208] В одном аспекте по меньшей мере A₃ различных аптамеров отличаются друг от друга различиями по меньшей мере в одном нуклеотиде и/или модификацией по меньшей мере одного нуклеотида.

[00209] В одном аспекте по меньшей мере A₂ различных аптамеров отличаются друг от друга различиями по меньшей мере в одном нуклеотиде и/или модификацией по меньшей мере одного нуклеотида.

[00210] В одном аспекте по меньшей мере A₁ различных аптамеров отличаются друг от друга различиями по меньшей мере в одном нуклеотиде и/или модификацией по меньшей мере одного нуклеотида.

[00211] В одном аспекте по меньшей мере A₃ различных аптамеров, по меньшей мере A₂ различных аптамеров и по меньшей мере A₁ различных аптамеров отличаются друг от друга различиями по меньшей мере в одном нуклеотиде и/или модификацией по меньшей мере одного нуклеотида.

[00212] Способы по любому из предшествующих параграфов, в которых один или более аптамеров из первого набора, второго набора и третьего набора аптамеров содержат по меньшей мере один модифицированный в положении 5 пиримидин.

[00213] В одном аспекте по меньшей мере один пиримидин, модифицированный в положении 5, содержит в положении 5 пиримидина линкер и присоединенный к линкеру фрагмент.

[00214] В одном аспекте линкер выбран из амидного линкера, карбонильного линкера, пропинильного линкера, алкинового линкера, сложноэфирного линкера, мочевинного линкера, карбаматного линкера, гуанидинового линкера, амидинового линкера, сульфоксидного линкера и сульфонового линкера.

[00215] В одном аспекте фрагмент представляет собой гидрофобный фрагмент.

[00216] В одном аспекте фрагмент выбран из фрагментов, представленных в группах I, II, III, IV, V, VII, VIII, IX, XI, XII, XIII, XV и XVI на Фиг. 1.

[00217] В одном аспекте фрагмент выбран из нафтильного фрагмента, бензильного фрагмента, фторбензильного фрагмента, тирозильного фрагмента, индольного фрагмента, морфолинового фрагмента, изобутильного фрагмента, 3,4-метилендиоксибензильного фрагмента, бензотиофенильного фрагмента и бензофуранильного фрагмента.

[00218] В одном аспекте пиримидин модифицированного в положении 5 пиримидина представляет собой уридин, цитидин или тимидин.

[00219] В некоторых вариантах осуществления раскрыт способ, включающий: a) приведение в контакт первого тестируемого образца с по меньшей мере одним первым аптамером с образованием первой смеси, где первый тестируемый образец представляет по меньшей мере X% разведение тестируемого образца; b) приведение в контакт второго тестируемого образца с по меньшей мере одним вторым аптамером с образованием второй смеси, где второй тестируемый образец представляет по меньшей мере Y% разведение тестируемого образца, причем X меньше Y; c) приведение в контакт третьего тестируемого образца с по меньшей мере одним третьим аптамером с образованием третьей смеси, где третий тестируемый образец представляет по меньшей мере Z% разведение тестируемого образца, причем Y меньше Z; d) инкубацию первой, второй и третьей смесей, чтобы обеспечить образование комплексов аптамера и белка, и удаление большинства аптамеров, которые не образовывали комплексы аптамера и белка; e) сбор аптамеров из комплексов аптамера и белка посредством диссоциации комплексов аптамера и белка; f) обнаружение или количественное определение собранных аптамеров; причем каждый из по меньшей мере одного первого аптамера, по меньшей мере одного второго аптамера и по меньшей мере одного третьего аптамера обладает аффинностью к разным белкам, и при этом они способны образовывать комплекс аптамера и белка при наличии белка в соответствующем тестируемом образце; при этом, первый, второй и третий тестируемые образцы представляют собой разные разведения одного и того же тестируемого образца.

[00220] В одном аспекте Z% находится в диапазоне от 5% до 39% (или составляет 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38 или 39%), или от 10% до 30%, или от 15% до 25%, или составляет приблизительно 20%.

[00221] В одном аспекте Y% находится в диапазоне от 0,01% до 1% (или равен 0,01, 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1, 0,15, 0,2, 0,25, 0,3, 0,35, 0,4, 0,45, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 или 1%), или от 0,1% до 0,8%, или от 0,2% до 0,7% или составляет приблизительно 0,5%.

[00222] В одном аспекте X% находится в диапазоне от 0,001% до 0,009% (или равен 0,001, 0,002, 0,003, 0,004, 0,005, 0,006, 0,007, 0,008 или 0,009), или от 0,002% до 0,008%, или от 0,003% до 0,007% или составляет приблизительно 0,005%.

[00223] В одном аспекте первая смесь содержит множество аптамеров.

[00224] В одном аспекте первая смесь содержит по меньшей мере 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 173 (или от 100 до 700, или от 100 до 650) различных аптамеров.

[00225] В одном аспекте вторая смесь содержит множество аптамеров.

[00226] В одном аспекте вторая смесь содержит по меньшей мере 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 820, 900 (или от 500 до 3500, или от 700 до 2500, или от 800 до 2000) различных аптамеров.

[00227] В одном аспекте третья смесь содержит множество аптамеров.

[00228] В одном аспекте третья смесь содержит по меньшей мере 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4200, 4270, 4500, 5000 (или от 900 до 16 500, или от 2000 до 15 000, или от 3000 до 12 000, или от 4000 до 10 000) различных аптамеров.

[00229] В одном аспекте первую смесь, вторую смесь и третью смесь инкубируют отдельно друг от друга.

[00230] В одном аспекте способы, раскрытые в настоящем документе, дополнительно включают объединение первой смеси, второй смеси и третьей смеси вместе после инкубации, чтобы обеспечить образование комплекса аптамера и белка.

[00231] В одном аспекте способы, раскрытые в настоящем документе, дополнительно включают последовательное объединение первой смеси, второй и третьей смеси вместе после инкубации, чтобы обеспечить образование комплекса аптамера и белка.

[00232] В одном аспекте последовательное объединение выполняется в порядке, выбранном из: i) первая смесь, затем вторая смесь, затем третья смесь; ii) первая смесь, затем третья смесь, затем вторая смесь; iii) вторая смесь, затем первая смесь, затем третья смесь; iv) вторая смесь, затем третья смесь, затем первая смесь; v) третья смесь, затем вторая смесь, затем первая смесь; и vi) третья смесь, затем первая смесь, затем вторая смесь.

[00233] В одном аспекте тестируемый образец выбран из крови, плазмы, сыворотки, мокроты, выдыхаемого воздуха, мочи, спермы, слюны, менингеальной жидкости, амниотической жидкости, жидкости, вырабатываемой железами, лимфатической жидкости, аспирата из сосков, бронхиального аспирата, синовиальной жидкости, аспирата суставной жидкости, клеток, экстракта клеток и спинномозговой жидкости.

[00234] В одном аспекте обнаружение или количественное определение выполняется с помощью ПЦР, масс-спектрометрии, секвенирования нуклеиновых кислот, секвенирования нового поколения (NGS) или гибридизации.

[00235] Способ по любому из предшествующих параграфов, в котором по меньшей мере один первый аптамер, по меньшей мере один второй аптамер, по меньшей мере один третий аптамер и множество аптамеров содержат по меньшей мере один пиримидин, модифицированный в положении 5.

[00236] При этом в одном аспекте по меньшей мере один пиримидин, модифицированный в положении 5, содержит в положении 5 пиримидина линкер и присоединенный к линкеру фрагмент.

[00237] При этом в одном аспекте линкер выбран из амидного линкера, карбонильного линкера, пропинильного линкера, алкинового линкера, сложноэфирного линкера, мочевинного линкера, карбаматного линкера, гуанидинового линкера, амидинового линкера, сульфоксидного линкера и сульфонового линкера.

[00238] При этом в одном аспекте фрагмент представляет собой гидрофобный фрагмент.

[00239] При этом в одном аспекте фрагмент выбран из фрагментов, представленных в группах I, II, III, IV, V, VII, VIII, IX, XI, XII, XIII, XV и XVI на Фиг. 1.

[00240] При этом в одном аспекте фрагмент выбран из нафтильного фрагмента, бензильного фрагмента, фторбензильного фрагмента, тирозильного фрагмента, индольного фрагмента, морфолинового фрагмента, изобутильного фрагмента, 3,4-метилендиоксибензильного фрагмента, бензотиофенильного фрагмента и бензофуранильного фрагмента.

[00241] В одном аспекте пиримидин модифицированного в положении 5 пиримидина представляет собой уридин, цитидин или тимидин.

[00242] Способы по любому из предшествующих параграфов, в которых аптамеры отличаются друг от друга различиями по меньшей мере в одном нуклеотиде и/или модификацией по меньшей мере одного нуклеотида.

[00243] В некоторых вариантах осуществления раскрыта система, которая содержит a) первый резервуар, в котором находится первая смесь, содержащая первый тестируемый образец с первым набором аптамеров, где первый тестируемый образец представляет собой Z% разведение тестируемого образца, и при этом в первом наборе аптамеров имеется A₃ различных аптамеров; b) второй резервуар, в котором находится вторая смесь, содержащая второй тестируемый образец со вторым набором аптамеров, где второй тестируемый образец представляет собой Y% разведение тестируемого образца, причем Y меньше Z, и при этом во втором наборе аптамеров имеется A₂ различных аптамеров; c) третий резервуар, в котором находится третья смесь, содержащая третий тестируемый образец с третьим набором аптамеров, где третий тестируемый образец представляет собой X% разведение тестируемого образца, причем X меньше Y, и при этом в третьем наборе аптамеров имеется A₁ различных аптамеров; и при этом большинство аптамеров из первого набора аптамеров, второго набора аптамеров и третьего набора аптамеров обладают аффинностью к белку в тестируемом образце и способны образовывать комплекс аптамера и белка, и при этом A₃ больше A₂ и A₂ больше A₁; и при этом сумма A₁, A₂ и A₃ составляет по меньшей мере 4000; и при этом систему используют для обнаружения белков в тестируемом образе, и при этом первый, второй и третий тестируемые образцы представляют собой разные разведения одного и того же тестируемого образца.

[00244] В одном аспекте Z% находится в диапазоне от 5% до 39% (или составляет 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38 или 39%), или от 10% до 30%, или от 15% до 25%, или составляет приблизительно 20%.

[00245] В одном аспекте Y% находится в диапазоне от 0,01% до 1% (или равен 0,01, 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1, 0,15, 0,2, 0,25, 0,3, 0,35, 0,4, 0,45, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 или 1%), или от 0,1% до 0,8%, или от 0,2% до 0,7% или составляет приблизительно 0,5%.

[00246] В одном аспекте X% находится в диапазоне от 0,001 до 0,009% (или равен 0,001, 0,002, 0,003, 0,004, 0,005, 0,006, 0,007, 0,008 или 0,009%), или от 0,002% до 0,008%, или от 0,003% до 0,007% или составляет приблизительно 0,005%.

[00247] В некоторых вариантах осуществления раскрыта система, которая содержит: a) первый резервуар, в котором находится первая смесь, содержащая первый тестируемый образец с по меньшей мере одним первым аптамером, где первый тестируемый образец представляет собой Z% разведение тестируемого образца; b) второй резервуар, в котором находится вторая смесь, содержащая второй тестируемый образец с по меньшей мере одним вторым аптамером, где второй тестируемый образец представляет собой Y% разведение тестируемого образца, причем Y меньше Z; c) третий резервуар, в котором находится третья смесь, содержащая третий тестируемый образец с по меньшей мере одним третьим аптамером, где третий тестируемый образец представляет собой X% разведение тестируемого образца, причем X меньше Y; при этом каждый из по меньшей мере одного первого аптамера, по меньшей мере одного второго аптамера и по меньшей мере одного третьего аптамера обладают аффинностью к другому белку, и при этом они способны образовывать комплекс аптамера и белка при наличии в биологическом образце белка; и при этом систему используют для обнаружения белков в тестируемом образе, и при этом первый, второй и третий тестируемые образцы представляют собой разные разведения одного и того же тестируемого образца.

[00248] В одном аспекте Z% находится в диапазоне от 5% до 39% (или составляет 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38 или 39%), или от 10% до 30%, или от 15% до 25%, или составляет приблизительно 20%.

[00249] В одном аспекте Y% находится в диапазоне от 0,01% до 1% (или равен 0,01, 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1, 0,15, 0,2, 0,25, 0,3, 0,35, 0,4, 0,45, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 или 1%), или от 0,1% до 0,8%, или от 0,2% до 0,7% или составляет приблизительно 0,5%.

[00250] В одном аспекте X% находится в диапазоне от 0,001 до 0,009% (или равен 0,001, 0,002, 0,003, 0,004, 0,005, 0,006, 0,007, 0,008 или 0,009%), или от 0,002% до 0,008%, или от 0,003% до 0,007% или составляет приблизительно 0,005%.

[00251] В некоторых вариантах осуществления раскрыта композиция, содержащая аффинный комплекс из первого захватывающего реагента и молекулы-мишени, аффинный комплекс из второго захватывающего реагента и молекулы-мишени и аффинный комплекс из третьего захватывающего реагента и молекулы-мишени, причем аффинный комплекс из первого захватывающего реагента и молекулы-мишени образуется при приблизительно 0,005% разведении тестируемого образца, аффинный комплекс из второго захватывающего реагента и молекулы-мишени образуется при приблизительно 0,5% разведении тестируемого образца, а аффинный комплекс из третьего захватывающего реагента и молекулы-мишени образуется при приблизительно 20% разведении тестируемого образца.

[00252] В одном аспекте, независимо, первый захватывающий реагент аффинного комплекса из первого захватывающего реагента и молекулы-мишени, второй захватывающий реагент аффинного комплекса из второго захватывающего реагента и молекулы-мишени и третий захватывающий реагент аффинного комплекса из третьего захватывающего реагента и молекулы-мишени выбраны из аптамера или антитела.

[00253] В одном аспекте тестируемый образец выбран из плазмы, сыворотки, мочи, цельной крови, лейкоцитов, мононуклеарных клеток периферической крови, лейкоцитарной пленки, мокроты, слез, слизи, носовых промывных вод, назального аспирата, спермы, слюны, промывных вод брюшины, асцитной жидкости, кистозной жидкости, менингеальной жидкости, амниотической жидкости, жидкости, вырабатываемой железами, лимфатической жидкости, аспирата из сосков, бронхиального аспирата, материала бронхов, взятого с помощью щеточки, синовиальной жидкости, аспирата суставной жидкости, секретов органов, клеток, экстракта клеток и спинномозговой жидкости.

[00254] В одном аспекте молекула-мишень каждого из аффинного комплекса из первого захватывающего реагента и молекулы-мишени, аффинного комплекса из второго захватывающего реагента и молекулы-мишени и аффинного комплекса из третьего захватывающего реагента и молекулы-мишени выбрана из белка, пептида, углевода, полисахарида, гликопротеина, гормона, рецептора, антигена, антитела, вируса, бактерии, метаболита, кофактора, ингибитора, лекарственного средства, красителя, питательного вещества, фактора роста, клетки и ткани.

[00255] В одном аспекте аффинный комплекс из первого захватывающего реагента и молекулы-мишени, аффинный комплекс из второго захватывающего реагента и молекулы-мишени и аффинный комплекс из третьего захватывающего реагента и молекулы-мишени являются нековалентными комплексами.

[00256] В одном аспекте каждый из аффинного комплекса из первого захватывающего реагента и молекулы-мишени, аффинного комплекса из второго захватывающего реагента и молекулы-мишени и аффинного комплекса из третьего захватывающего реагента и молекулы-мишени образуются в своих соответствующих разведениях тестируемого образца перед объединением в композицию.

[00257] В одном аспекте аптамер содержит по меньшей мере один модифицированный в положении 5 пиримидин.

[00258] В одном аспекте по меньшей мере один пиримидин, модифицированный в положении 5, содержит в положении 5 пиримидина линкер и присоединенный к линкеру фрагмент.

[00259] В одном аспекте линкер выбран из амидного линкера, карбонильного линкера, пропинильного линкера, алкинового линкера, сложноэфирного линкера, мочевинного линкера, карбаматного линкера, гуанидинового линкера, амидинового линкера, сульфоксидного линкера и сульфонового линкера.

[00260] В одном аспекте фрагмент представляет собой гидрофобный фрагмент.

[00261] В одном аспекте фрагмент выбран из фрагментов, представленных в группах I, II, III, IV, V, VII, VIII, IX, XI, XII, XIII, XV и XVI на Фиг. 1.

[00262] В одном аспекте фрагмент выбран из нафтильного фрагмента, бензильного фрагмента, фторбензильного фрагмента, тирозильного фрагмента, индольного фрагмента, морфолинового фрагмента, изобутильного фрагмента, 3,4-метилендиоксибензильного фрагмента, бензотиофенильного фрагмента и бензофуранильного фрагмента.

[00263] В одном аспекте пиримидин модифицированного в положении 5 пиримидина представляет собой уридин, цитидин или тимидин.

[00264] В некоторых вариантах осуществления раскрыта композиция, которая содержит множество аффинных комплексов из первого захватывающего реагента и молекулы-мишени, множество аффинных комплексов из второго захватывающего реагента и молекулы-мишени и множество аффинных комплексов из третьего захватывающего реагента и молекулы-мишени, причем множество аффинных комплексов из первого захватывающего реагента и молекулы-мишени образуются приблизительно при 0,005% разведении тестируемого образца, множество аффинных комплексов из второго захватывающего реагента и молекулы-мишени образуются приблизительно при 0,5% разведении тестируемого образца и множество аффинных комплексов из третьего захватывающего реагента и молекулы-мишени образуются приблизительно при 20% разведении тестируемого образца.

[00265] В одном аспекте, независимо, множество первых захватывающих реагентов множества аффинных комплексов из первого захватывающего реагента и молекулы-мишени, множество вторых захватывающих реагентов множества аффинных комплексов из второго захватывающего реагента и молекулы-мишени и множество третьих захватывающих реагентов множества аффинных комплексов из третьего захватывающего реагента и молекулы-мишени выбраны из аптамера или антитела.

[00266] В одном аспекте тестируемый образец выбран из плазмы, сыворотки, мочи, цельной крови, лейкоцитов, мононуклеарных клеток периферической крови, лейкоцитарной пленки, мокроты, слез, слизи, носовых промывных вод, назального аспирата, спермы, слюны, промывных вод брюшины, асцитной жидкости, кистозной жидкости, менингеальной жидкости, амниотической жидкости, жидкости, вырабатываемой железами, лимфатической жидкости, аспирата из сосков, бронхиального аспирата, материала бронхов, взятого с помощью щеточки, синовиальной жидкости, аспирата суставной жидкости, секретов органов, клеток, экстракта клеток и спинномозговой жидкости.

[00267] В одном аспекте молекула-мишень каждого из аффинного комплекса из первого захватывающего реагента и молекулы-мишени, аффинного комплекса из второго захватывающего реагента и молекулы-мишени и аффинного комплекса из третьего захватывающего реагента и молекулы-мишени выбрана из белка, пептида, углевода, полисахарида, гликопротеина, гормона, рецептора, антигена, антитела, вируса, бактерии, метаболита, кофактора, ингибитора, лекарственного средства, красителя, питательного вещества, фактора роста, клетки и ткани.

[00268] В одном аспекте множество аффинных комплексов из первого захватывающего реагента и молекулы-мишени, множество аффинных комплексов из второго захватывающего реагента и молекулы-мишени и множество аффинных комплексов из третьего захватывающего реагента и молекулы-мишени являются нековалентными комплексами.

[00269] В одном аспекте каждый из множества аффинных комплексов из первого захватывающего реагента и молекулы-мишени, множества аффинных комплексов из второго захватывающего реагента и молекулы-мишени и множества аффинных комплексов из третьего захватывающего реагента и молекулы-мишени образуются в своих соответствующих разведениях тестируемого образца перед объединением в композицию.

[00270] В одном аспекте аптамер содержит по меньшей мере один модифицированный в положении 5 пиримидин.

[00271] В одном аспекте по меньшей мере один пиримидин, модифицированный в положении 5, содержит в положении 5 пиримидина линкер и присоединенный к линкеру фрагмент.

[00272] В одном аспекте линкер выбран из амидного линкера, карбонильного линкера, пропинильного линкера, алкинового линкера, сложноэфирного линкера, мочевинного линкера, карбаматного линкера, гуанидинового линкера, амидинового линкера, сульфоксидного линкера и сульфонового линкера.

[00273] В одном аспекте фрагмент представляет собой гидрофобный фрагмент.

[00274] В одном аспекте фрагмент выбран из фрагментов, представленных в группах I, II, III, IV, V, VII, VIII, IX, XI, XII, XIII, XV и XVI на Фиг. 1.

[00275] В одном аспекте фрагмент выбран из нафтильного фрагмента, бензильного фрагмента, фторбензильного фрагмента, тирозильного фрагмента, индольного фрагмента, морфолинового фрагмента, изобутильного фрагмента, 3,4-метилендиоксибензильного фрагмента, бензотиофенильного фрагмента и бензофуранильного фрагмента.

[00276] В одном аспекте пиримидин модифицированного в положении 5 пиримидина представляет собой уридин, цитидин или тимидин.

[00277] В одном аспекте множество первых захватывающих реагентов множества аффинных комплексов из первого захватывающего реагента и молекулы-мишени составляет приблизительно 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170 или 173; или от 100 до 700; или от 100 до 650 захватывающих реагентов.

[00278] В одном аспекте множество вторых захватывающих реагентов множества аффинных комплексов из второго захватывающего реагента и молекулы-мишени составляет приблизительно 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 820 или 900; или от 500 до 3500; или от приблизительно 700 до 2500; или от 800 до 2000; или приблизительно 828 захватывающих реагентов.

[00279] В одном аспекте множество третьих захватывающих реагентов множества аффинных комплексов из третьего захватывающего реагента и молекулы-мишени составляет приблизительно 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4200, 4270, 4500 или 5000; или от приблизительно 900 до 16 500; или от приблизительно 2000 до 15 000; или от приблизительно 3000 до 12 000; или от приблизительно 4000 до 10 000; или приблизительно 4271 захватывающий реагент.

[00280] В некоторых вариантах осуществления раскрыт метод, который включает: a) последовательное объединение группы первого разведения с группой второго разведения, причем группа первого разведения представляет X% разведение тестируемого образца и содержит первый захватывающий реагент, связанный с первым белком-мишенью с образованием аффинного комплекса из первого захватывающего реагента и белка-мишени, причем группа второго разведения представляет Y% разведение тестируемого образца и содержит второй захватывающий реагент, связанный со вторым белком-мишенью с образованием аффинного комплекса из второго захватывающего реагента и белка-мишени, причем первый и второй белки-мишени являются разными белками, и при этом X меньше Y; b) диссоциацию захватывающих реагентов из их соответствующих аффинных комплексов захватывающего реагента и белка-мишени; и c) обнаружение наличия или определение уровня диссоциированных захватывающих реагентов.

[00281] В некотором аспекте способов, раскрытых в настоящем документе, способы дополнительно включают последовательное объединение группы третьего разведения с группами первого и второго разведения, причем группа третьего разведения представляет Z% разведение тестируемого образца и содержит третий захватывающий реагент, связанный с третьим белком-мишенью с образованием аффинного комплекса из третьего захватывающего реагента и белка-мишени, при этом третий белок-мишень отличается от первого и второго белков-мишеней, при этом Y меньше Z.

[00282] В одном аспекте первый захватывающий реагент и второй захватывающий реагент представляют собой аптамер или антитело.

[00283] В одном аспекте группы первого разведения и второго разведения представляют собой разведения одного и того же тестируемого образца.

[00284] В одном аспекте тестируемый образец выбран из плазмы, сыворотки, мочи, цельной крови, лейкоцитов, мононуклеарных клеток периферической крови, лейкоцитарной пленки, мокроты, слез, слизи, носовых промывных вод, назального аспирата, спермы, слюны, промывных вод брюшины, асцитной жидкости, кистозной жидкости, менингеальной жидкости, амниотической жидкости, жидкости, вырабатываемой железами, лимфатической жидкости, аспирата из сосков, бронхиального аспирата, материала бронхов, взятого с помощью щеточки, синовиальной жидкости, аспирата суставной жидкости, секретов органов, клеток, экстракта клеток и спинномозговой жидкости.

[00285] В одном аспекте группа третьего разведения представляет другое разведение того же тестируемого образца и/или при этом третий захватывающий реагент представляет собой аптамер или антитело.

[00286] В одном аспекте аффинные комплексы из первого и второго захватывающего реагента и белка-мишени являются нековалентными комплексами.

[00287] В одном аспекте группа первого разведения представляет собой разведение тестируемого образца от 0,001% до 0,009% (или при этом X% равен 0,001%, 0,002%, 0,003%, 0,004%, 0,005%, 0,006%, 0,007%, 0,008% или 0,009%), или X% находится в диапазоне от 0,002% до 0,008%, или X% находится в диапазоне от 0,003% до 0,007%, или X% составляет приблизительно 0,005%.

[00288] В одном аспекте группа второго разведения представляет собой разведение тестируемого образца от 0,01% до 1% (или при этом Y% равен 0,01%, 0,02%, 0,03%, 0,04%, 0,05%, 0,06%, 0,07%, 0,08%, 0,09%, 0,1%, 0,15%, 0,2%, 0,25%, 0,3%, 0,35%, 0,4%, 0,45%, 0,5%, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9% или 1%), или Y% находится в диапазоне от 0,1% до 0,8%, или Y% находится в диапазоне от 0,2% до 0,75%, или Y% составляет приблизительно 0,5%.

[00289] В одном аспекте группа третьего разведения представляет собой разведение тестируемого образца от 5% до 39% (или Z% равен 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38% или 39%), или Z% находится в диапазоне от 15% до 30%, или Z% находится в диапазоне от 15% до 25%, или Z% составляет приблизительно 20%.

[00290] В одном аспекте группа первого разведения дополнительно содержит множество первых захватывающих реагентов.

[00291] В одном аспекте группа второго разведения дополнительно содержит множество вторых захватывающих реагентов.

[00292] В одном аспекте группа третьего разведения дополнительно содержит множество третьих захватывающих реагентов.

[00293] В одном аспекте группа первого разведения дополнительно содержит множество аффинных комплексов из первого захватывающего реагента и белка-мишени.

[00294] В одном аспекте группа второго разведения дополнительно содержит множество аффинных комплексов из второго захватывающего реагента и белка-мишени.

[00295] В одном аспекте группа третьего разведения дополнительно содержит множество аффинных комплексов из третьего захватывающего реагента и белка-мишени.

[00296] В одном аспекте последовательное объединение группы первого разведения с группой второго разведения дополнительно включает стадию промывки после объединение групп первого и второго разведений.

[00297] В одном аспекте последовательное объединение группы третьего разведения с группами первого и второго разведения дополнительно включает стадию промывки после объединение групп первого, второго и третьего разведений.

[00298] В одном аспекте множество первых захватывающих реагентов составляет приблизительно 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170 или 173; или от 100 до 700; или от 100 до 650 захватывающих реагентов.

[00299] В одном аспекте множество вторых захватывающих реагентов составляет приблизительно 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 820 или 900; или от 500 до 3500; или от приблизительно 700 до 2500; или от 800 до 2000; от приблизительно 828 захватывающих реагентов.

[00300] В одном аспекте множество третьих захватывающих реагентов составляет приблизительно 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4200, 4270, 4500 или 5000; или от приблизительно 900 до 16 500; или от приблизительно 2000 до 15 000; или от приблизительно 3000 до 12 000; или от приблизительно 4000 до 10 000; или приблизительно 4271 захватывающий реагент.

[00301] В одном аспекте перед последовательным объединением групп первого и второго разведения каждый из аффинного комплекса из первого захватывающего реагента и белка-мишени группы первого разведения и аффинного комплекса из второго захватывающего реагента и белка-мишени группы второго разведения иммобилизуют на первой твердой подложке в их соответствующих группах разведения и проводят высвобождением из первой твердой подложки с последовательным объединением.

[00302] В одном аспекте перед последовательным объединением групп третьего разведения с группами первого и второго разведения, аффинный комплекс из третьего захватывающего реагента и белка-мишени группы третьего разведения иммобилизуют на первой твердой подложке в соответствующей группе разведения и проводят высвобождением из первой твердой подложки с последовательным объединением.

[00303] В одном аспекте аффинный комплекс из первого захватывающего реагента и белка-мишени иммобилизовали на первой твердой подложке посредством связывания захватывающего реагента с твердой подложкой.

[00304] В одном аспекте аффинный комплекс из второго захватывающего реагента и белка-мишени иммобилизовали на первой твердой подложке посредством связывания захватывающего реагента с твердой подложкой.

[00305] В одном аспекте аффинный комплекс из третьего захватывающего реагента и белка-мишени иммобилизовали на первой твердой подложке посредством связывания захватывающего реагента с твердой подложкой.

[00306] В одном аспекте обнаружение наличия или определение уровня диссоциированных первого и второго захватывающих реагентов выполняется с помощью ПЦР, масс-спектрометрии, секвенирования нуклеиновых кислот, секвенирования нового поколения (NGS) или гибридизации.

[00307] В одном аспекте аптамер содержит по меньшей мере один модифицированный в положении 5 пиримидин.

[00308] В одном аспекте по меньшей мере один пиримидин, модифицированный в положении 5, содержит в положении 5 пиримидина линкер и присоединенный к линкеру фрагмент.

[00309] В одном аспекте линкер выбран из амидного линкера, карбонильного линкера, пропинильного линкера, алкинового линкера, сложноэфирного линкера, мочевинного линкера, карбаматного линкера, гуанидинового линкера, амидинового линкера, сульфоксидного линкера и сульфонового линкера.

[00310] В одном аспекте фрагмент представляет собой гидрофобный фрагмент.

[00311] В одном аспекте фрагмент выбран из фрагментов, представленных в группах I, II, III, IV, V, VII, VIII, IX, XI, XII, XIII, XV и XVI на Фиг. 1.

[00312] В одном аспекте фрагмент выбран из нафтильного фрагмента, бензильного фрагмента, фторбензильного фрагмента, тирозильного фрагмента, индольного фрагмента, морфолинового фрагмента, изобутильного фрагмента, 3,4-метилендиоксибензильного фрагмента, бензотиофенильного фрагмента и бензофуранильного фрагмента.

[00313] В одном аспекте пиримидин модифицированного в положении 5 пиримидина представляет собой уридин, цитидин или тимидин.

[00314] В одном аспекте длина аптамера составляет 35-100 нуклеотидов.

[00315] В одном аспекте аптамер содержит консенсусный домен связывания белка.

[00316] В одном аспекте аптамер содержит пиримидины, модифицированные в положениях 5, в количестве 3-20.

[00317] В одном аспекте порядок последовательного объединения групп разведений выбран из объединения группы первого разведения с группой второго разведения и затем с группой третьего разведения; объединения группы первого разведения с группой третьего разведения и затем с группой второго разведения; объединения группы второго разведения с группой третьего разведения и затем с группой первого разведения; объединения группы второго разведения с группой первого разведения и затем с группой третьего разведения; объединения группы третьего разведения с группой первого разведения и затем с группой второго разведения; и объединения группы третьего разведения с группой второго разведения и затем с группой первого разведения.

[00318] В одном аспекте порядок последовательного объединения групп разведений выбран из объединения группы первого разведения с группой второго разведения и объединения группы второго разведения с группой первого разведения.

[00319] В одном аспекте обнаружение наличия или определение уровня диссоциированных захватывающих реагентов заменяет обнаружение наличия или определение уровня белка-мишени.

[00320] В некоторых вариантах осуществления раскрытый способ включает: a) высвобождение аффинного комплекса из первого захватывающего реагента и молекулы-мишени из первой твердой подложки и перенос аффинного комплекса из первого захватывающего реагента и молекулы-мишени в первую смесь; b) высвобождение аффинного комплекса из второго захватывающего реагента и молекулы-мишени из второй твердой подложки и перенос аффинного комплекса из второго захватывающего реагента и молекулы-мишени в первую смесь, объединяя таким образом аффинные комплексы из первого и второго захватывающего реагента и молекулы-мишени в первой смеси; c) присоединение первого тега к молекуле-мишени аффинных комплексов из первого и второго захватывающего реагента и молекулы-мишени; d) приведение в контакт содержащих тег аффинных комплексов из первого и второго захватывающего реагента и молекулы-мишени с одной или более третьими твердыми подложками таким образом, что тег иммобилизует аффинные комплексы из первого и второго захватывающего реагента и молекулы-мишени на одной или более третьих твердых подложках; e) диссоциацию захватывающих реагентов из аффинных комплексов из первого и второго захватывающего реагента и молекулы-мишени; и f) обнаружение наличия или определение уровня диссоциированных захватывающих реагентов; причем каждый из аффинного комплекса из первого захватывающего реагента и молекулы-мишени и аффинного комплекса из второго захватывающего реагента и молекулы-мишени образуется в другом разведении одного и того же тестируемого образца.

[00321] В некоторых вариантах осуществления раскрыт способ, который включает: a) приведение в контакт первого захватывающего реагента, иммобилизованного на первой твердой подложке, с первым разведением с образованием первой смеси и приведение в контакт второго захватывающего реагента, иммобилизованного на второй твердой подложке, со вторым разведением с образованием второй смеси, причем каждый из первого и второго захватывающих реагентов способен связывать молекулу-мишень; b) инкубацию первой смеси и второй смеси отдельно, при этом аффинный комплекс из первого захватывающего реагента и молекулы-мишени образуется в первой смеси в том случае, если в первой смеси присутствует молекула-мишень, к которой обладает аффинностью первый захватывающий реагент, при этом аффинный комплекс из второго захватывающего реагента и молекулы-мишени образуется во второй смеси в том случае, если во второй смеси присутствует молекула-мишень, к которой обладает аффинностью второй захватывающий реагент; c) высвобождение аффинного комплекса из первого захватывающего реагента и молекулы-мишени из первой твердой подложки и перенос аффинного комплекса из первого захватывающего реагента и молекулы-мишени в третью смесь; d) высвобождение аффинного комплекса из второго захватывающего реагента и молекулы-мишени из второй твердой подложки; e) после стадии c) перенос аффинного комплекса из второго захватывающего реагента и молекулы-мишени в третью смесь, объединяя таким образом аффинные комплексы из первого и второго захватывающего реагента и молекулы-мишени в третьей смеси; f) присоединение первого тега к молекуле-мишени аффинных комплексов из первого и второго захватывающего реагента и молекулы-мишени; g) приведение в контакт содержащих тег аффинных комплексов из первого и второго захватывающего реагента и молекулы-мишени с третьей твердой подложкой таким образом, что тег иммобилизует аффинные комплексы из первого и второго захватывающего реагента и молекулы-мишени на третьей твердой подложке; h) диссоциацию захватывающих реагентов из их соответствующих аффинных комплексов из захватывающего реагента и молекулы-мишени и i) обнаружение наличия или определение уровня диссоциированных захватывающих реагентов; при этом первое разведение и второе разведение представляют собой разные разведения одного и того же тестируемого образца.

[00322] В некоторых вариантах осуществления раскрыт способ, который включает: a) высвобождение аффинного комплекса из первого захватывающего реагента и молекулы-мишени из первой твердой подложки и перенос аффинного комплекса из первого захватывающего реагента и молекулы-мишени в первую смесь; b) высвобождение аффинного комплекса из второго захватывающего реагента и молекулы-мишени из второй твердой подложки и перенос аффинного комплекса из второго захватывающего реагента и молекулы-мишени в первую смесь, объединяя таким образом аффинные комплексы из первого и второго захватывающего реагента и молекулы-мишени в первой смеси; c) высвобождение аффинного комплекса из третьего захватывающего реагента и молекулы-мишени из третьей твердой подложки и перенос аффинного комплекса из третьего захватывающего реагента и молекулы-мишени в первую смесь, объединяя таким образом аффинные комплексы из первого, второго и третьего захватывающего реагента и молекулы-мишени; d) присоединение первого тега к молекуле-мишени аффинных комплексов из первого, второго и третьего захватывающего реагента и молекулы-мишени; e) приведение в контакт содержащих тег аффинных комплексов из первого, второго и третьего захватывающего реагента и молекулы-мишени с одной или более четвертыми твердыми подложками таким образом, что тег иммобилизует аффинные комплексы из первого, второго и третьего захватывающего реагента и молекулы-мишени на одной или более четвертых твердых подложках; f) диссоциацию захватывающих реагентов из аффинных комплексов из первого, второго и третьего захватывающего реагента и молекулы-мишени; и g) обнаружение наличия или определение уровня диссоциированных захватывающих реагентов; причем каждый из аффинного комплекса из первого захватывающего реагента и молекулы-мишени, аффинного комплекса из второго захватывающего реагента и молекулы-мишени и аффинного комплекса из третьего захватывающего реагента и молекулы-мишени образуется в другом разведении одного и того же тестируемого образца.

[00323] В некоторых вариантах осуществления раскрытый способ включает: a) высвобождение аффинного комплекса из первого захватывающего реагента и молекулы-мишени из первой твердой подложки и перенос аффинного комплекса из первого захватывающего реагента и молекулы-мишени в первую смесь; b) высвобождение аффинного комплекса из второго захватывающего реагента и молекулы-мишени из второй твердой подложки и перенос аффинного комплекса из второго захватывающего реагента и молекулы-мишени в первую смесь, объединяя таким образом аффинные комплексы из первого и второго захватывающего реагента и молекулы-мишени в первой смеси; c) диссоциацию захватывающих реагентов из аффинных комплексов из первого и второго захватывающего реагента и молекулы-мишени; и f) обнаружение наличия или определение уровня диссоциированных захватывающих реагентов; причем каждый из аффинного комплекса из первого захватывающего реагента и молекулы-мишени и аффинного комплекса из второго захватывающего реагента и молекулы-мишени образуется в другом разведении одного и того же тестируемого образца.

[00324] В некоторых вариантах осуществления раскрытый способ включает: a) высвобождение аффинного комплекса из первого захватывающего реагента и молекулы-мишени из первой твердой подложки и перенос аффинного комплекса из первого захватывающего реагента и молекулы-мишени в первую смесь; b) высвобождение аффинного комплекса из второго захватывающего реагента и молекулы-мишени из второй твердой подложки и перенос аффинного комплекса из второго захватывающего реагента и молекулы-мишени в первую смесь, объединяя таким образом аффинные комплексы из первого и второго захватывающего реагента и молекулы-мишени в первой смеси; c) высвобождение аффинного комплекса из третьего захватывающего реагента и молекулы-мишени из третьей твердой подложки и перенос аффинного комплекса из третьего захватывающего реагента и молекулы-мишени в первую смесь, объединяя таким образом аффинные комплексы из первого, второго и третьего захватывающего реагента и молекулы-мишени в первой смеси; e) диссоциацию захватывающих реагентов из аффинных комплексов из первого, второго и третьего захватывающего реагента и молекулы-мишени; и f) обнаружение наличия или определение уровня диссоциированных захватывающих реагентов; при этом каждый из аффинного комплекса из первого захватывающего реагента и молекулы-мишени, аффинного комплекса из второго захватывающего реагента и молекулы-мишени и аффинного комплекса из третьего захватывающего реагента и молекулы-мишени образуется в другом разведении одного и того же тестируемого образца.

[00325] В любом из способов, композиций и систем, описанных в настоящем документе, способы, композиции и/или системы дополнительно содержат молекулу-конкурент.

[00326] В любом из способов, композиций и систем, описанных в настоящем документе, в способах, композициях и/или системах молекула-конкурент находится в концентрации от приблизительно 10 мкМ до приблизительно 120 мкМ (или 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115 или 120 мкМ); или от приблизительно 15 мкМ до приблизительно 80 мкМ; или приблизительно 20 мкМ; или приблизительно 30 мкМ или приблизительно 60 мкМ.

[00327] В любом из способов, композиций и систем, описанных в настоящем документе, в способах, композициях и/или системах молекула-конкурент выбрана из олигонуклеотидов, полианионов, гепарина, ДНК сперматозоида сельди, ДНК сперматозоида лосося, тРНК, сульфата декстрана, полидекстрана, полимеров с фосфодиэфирной связью с удаленными азотистыми основаниями, дНТФ и пирофосфата.

[00328] В любом из способов, композиций и систем, описанных в настоящем документе, в способах, композициях и/или системах молекула-конкурент представляет собой олигонуклеотид, содержащий последовательность нуклеотидов (A-C-BndU-BndU)₇AC.

[00329] В любом из способов, композиций и систем, описанных в настоящем документе, в способах, композициях и/или системах молекула-конкурент находится в тестируемом образце в концентрации 30 мкМ, причем тестируемый образец представляет собой плазму крови.

[00330] В любом из способов, композиций и систем, описанных в настоящем документе, в способах, композициях и/или системах молекула-конкурент находится в тестируемом образце в концентрации 60 мкМ, причем тестируемый образец представляет собой сыворотку крови.

ПРИМЕРЫ

[00331] Следующие примеры представлены для более полной иллюстрации некоторых вариантов осуществления изобретения. Однако их никоим образом не следует истолковывать как ограничивающие широкий объем изобретения. Специалисты в данной области могут легко принять принципы, лежащие в основе этого открытия, для создания различных соединений, не отступая от сущности настоящего изобретения.

Пример 1. Мультиплексный аптамерный анализ образцов

[00332] В этом примере описывается мультиплексный аптамерный анализ, используемый для анализа образцов и контролей.

Способ мультиплексного аптамерного анализа

[00333] Все этапы мультиплексного аптамерного анализа выполняли при комнатной температуре, если не указано иное.

Приготовление растворов мастер-смеси аптамеров.

[00334] 5272 аптамера были сгруппированы в три уникальные смеси: Разв. 1, Разв. 2 и Разв. 3, соответствующие разведения образцов плазмы или сыворотки 20%, 0,5% и 0,005% соответственно. Распределение аптамера в смесь было определено эмпирически посредством анализа серии разведений соответствующих образцов плазмы и сыворотки крови с каждым аптамером и определения разведения образца, которое обеспечило наибольший линейный диапазон сигнала. Разделение аптамеров и смешивание с различными разведениями образца плазмы или сыворотки крови (20%, 0,5% или 0,005%) позволяет анализу охватывать диапазон концентраций белка, кратный 10⁷. Исходные растворы для мастер-смеси аптамеров готовили в буфере HE-твин (10 мМ гепес, pH 7,5, 1 мМ EDTA, 0,05% твин 20) с использованием 4 нМ каждого аптамера и хранили в замороженном виде при -20 °C. В смеси Разв. 1 смешивали 4271 аптамер, в смеси Разв. 2-828 аптамеров и в смеси Разв. 3-173 аптамера. Перед использованием исходные растворы разбавляли в буфере HE-твин до рабочей концентрации 0,55 нМ каждого аптамера и делили на аликвоты для индивидуального использования. Перед использованием мастер-смесей аптамеров для подготовки планшетов для стадии «захват-0» рабочие растворы нагревали с последующим охлаждением для повторной укладки аптамеров, для чего их перед использованием инкубировали при 95 °C в течение 10 минут, а затем при 25 °C в течение не менее 30 минут.

Подготовка планшета для стадии «захват-0».

[00335] 60 мкл 10% суспензии покрытых стрептавидином магнитных гранул и сефарозы (Streptavidin Mag Sepharose, GE Healthcare, 28-9857) объединяли со 100 мкл нагретой с последующим охлаждением мастер-смеси аптамеров. Смесь один раз промывали 175 мкл буфера для анализа (40 мМ ГЕПЕС, pH 7,5, 100 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 5 мМ MgCl₂, 1 мМ EDTA, 0,05% твин-20), и затем вносили в каждую лунку 96-луночного планшета (Thermo Scientific, AB-0769). Планшеты инкубировали в течение 30 минут при 25 °C со встряхиванием при 850 об/мин на шейкере ThermoMixer C (Eppendorf). После 30 мин инкубации в каждую лунку планшета добавляли 6 мкл блокирующего буфера MB Block (50 мМ D-биотина в 50 мМ трис-HCl, pH 8, 0,01% твин), и планшеты дополнительно инкубировали в течение 2 минут при встряхивании. Затем планшеты промывали 175 мкл буфера для анализа с циклом промывки продолжительностью 1 мин, встряхивали на шейкере ThermoMixer C при 850 об/мин, с последующим разделением на магните в течение 30 секунд. После удаления промывочного раствора гранулы повторно суспендировали в 175 мкл буфера для анализа и хранили при -20 °C до использования.

Подготовка гранул для стадии «захват-2».

[00336] Перед началом автоматизированного процесса анализа промывали полный объем 10 мг/мл суспензии гранул MyOne Streptavidin C1 (Dynabeads, номер по каталогу 35002D, Thermo Scientific), используемой для стадии «захват-2» мультиплексного аптамерного анализа, после чего проводили промывку подготовительным буфером MB Prep (10 мМ трис-HCl, pH 8, 1 мМ EDTA, 0,4% ДСН) в течение 5 мин с последующими двумя промывками буфером для анализа. После последней промывки гранулы повторно суспендировали при концентрации 10 мг/мл, и в каждую лунку планшета стадии «захват-2» вносили по 75 мкл суспензии гранул. В начале анализа планшет стадии «захват-2» помещали в алюминиевый адаптер и устанавливали в соответствующем положении на платформу автоматизированной станции Fluent.

Размораживание и разведение образцов.

[00337] Аликвоты по 65 мкл 100% образцов плазмы или сыворотки крови, хранящиеся в пробирках Matrix при -80 °C, размораживали путем инкубирования при комнатной температуре в течение десяти минут. Для облегчения оттаивания пробирки помещали наверху блока вентилятора, который обеспечивал циркуляцию воздуха через штатив для пробирок Matrix. После размораживания образцы центрифугировали при 1000 × g в течение 1 мин и помещали на автоматизированную станцию Fluent для разведения образцов. 20% раствор образца готовили посредством переноса 35 мкл размороженного образца в 96-луночные планшеты, содержащие 140 мкл соответствующего разбавителя для образца. Разбавитель образца плазмы крови содержал 50 мМ гепес, pH 7,5, 100 мМ NaCl, 8 мМ MgCl2, 5 мМ KCl, 1,25 мМ EGTA, 1,2 мМ бензамидина, 37,5 мкМ Z-блок и 1,2% твин-20. Разбавитель образца сыворотки содержал 75 мкМ Z-блок, остальные компоненты имели ту же концентрацию, что и в разбавителе образца плазмы крови. Последующие разведения для получения 0,5% и 0,005% разведенных образцов проводили в буфере для анализа с использованием серийных разведений на автоматизированной станции Fluent. Для получения 0,5% разведения образца проводили промежуточное разведение 20% образца до 4% путем смешивания 45 мкл 20% образца со 180 мкл буфера для анализа, после чего готовили 0,5% образец путем смешивания 25 мкл 4% разбавленного образца со 175 мкл буфера для анализа. Для получения 0,005% образца проводили промежуточное разведение образца 0,05% путем смешивания 20 мкл 0,5% образца со 180 мкл буфера для анализа, после чего готовили 0,005% образец путем смешивания 20 мкл 0,05% образца со 180 мкл буфера для анализа.

Стадия связывания образца.

[00338] Планшеты для стадии «захват-0» готовили посредством иммобилизации смесей аптамеров на покрытых стрептавидином магнитных гранулах с сефарозой, как описано выше. Замороженные планшеты размораживали в течение 30 мин при 25 °C и промывали один раз 175 мкл буфера для анализа. 100 мкл каждого разведения образца (20%, 0,5% и 0,005%) добавляли в планшеты, содержащие гранулы с тремя различными мастер-смесями аптамеров (Разв 1, Разв 2 и Разв 3 соответственно). Затем планшеты стадии «захват-0» герметизировали алюминиевой фольгой (Microseal ‘F’ Foil, Bio-Rad) и помещали во вращающиеся шейкеры на 4 планшета (PHMP-4, Grant Bio), установленные на 850 об/мин, 28 °C. Стадию связывания образца проводили в течение 3,5 часа.

Проведение мультиплексного аптамерного анализа с использованием автоматизированной станции Fluent.

[00339] После завершения стадии связывания образца планшеты «захват-0» помещали в алюминиевые адаптеры для планшетов и устанавливали на платформу автоматизированной станции. Стадии промывки магнитных гранул выполняли с использованием планшета с регулируемой температурой. Для всех стадий автоматизированного процесса устанавливали температуру планшетов 25 °C, за исключением промывок стадии «захват-2», как описано ниже. Планшеты промывали 4 раза с использованием 175 мкл буфера для анализа, каждый цикл промывки был запрограммирован на встряхивание планшетов при 1000 об/мин в течение по меньшей мере 1 мин с последующим отделением магнитных гранул в течение по меньшей мере 30 секунд, после чего проводили аспирацию буфера. Во время последнего цикла промывки готовили тег-реагент путем разбавления 100x тег-реагента (EZ-Link NHS-PEG₄-биотин, номер по каталогу 21363, Thermo, 100 мМ раствор, приготовленный в безводном ДМСО) в соотношении 1:100 в буфере для анализа и выливали в желоб на платформе автоматизированной станции. В каждую лунку планшета добавляли 100 мкл тег-реагента и инкубировали при встряхивании при 1200 об/мин в течение 5 минут для биотинилирования белков, захваченных на поверхности гранул. Реакции биотинилирования гасили добавлением в каждую лунку 175 мкл буфера для гашения (20 мМ глицина в буфере для анализа). Планшеты инкубировали в статичном состоянии в течение 3 минут, затем промывали 4 раза с использованием 175 мкл буфера для анализа, причем промывания выполняли в тех же условиях, что описаны выше.

Фотоотщепление и кинетическое испытание.

[00340] После последнего промывания планшетов в каждую лунку добавляли 90 мкл буфера для фотоотщепления (2 мкМ олигонуклеотида-конкурента в буфере для аналза; конкурент имеет последовательность нуклеотидов 5′- (AC-Bn-Bn)₇-AC-3′, где Bn указывает на остаток бензилзамещенного дезоксиуридина в положении 5). Планшеты перемещали на подстанцию фотоотщепления на платформе автоматизированной станции Fluent. Подстанция состоит из источника света BlackRay (настольные лампы серии UVP XX, 365 нм) и трех шейкеров Bioshake 3000-T (Q Instruments). Планшеты облучали в течение 20 мин при одновременном встряхивании при 1000 об/мин.

Захват на гранулах на стадии «захват-2».

[00341] В конце процесса фотоотщепления из планшета стадии «захват-2» с помощью магнитного разделения удаляли буфер, планшет промывали один раз с использованием 100 мкл буфера для анализа. Элюат после фотоотщепления, содержащий комплексы из аптамера и белка, удаляли из каждого планшета стадии «захват-0», начиная с планшета для разведения 3. Все 90 мкл раствора сначала переносили в планшет с элюатом стадии «захват-1», размещенный на шейкере с приподнятыми магнитами, чтобы улавливать любые покрытые стрептавидином магнитные гранулы с сефарозой, которые должны быть аспирированы. После этого раствор переносили в планшет «захват-2» и инкубировали планшет в течение 3 мин со встряхиванием при 1400 об/мин при 25 °C. После инкубации в течение 3 мин проводили отделение магнитных гранул в течение 90 секунд, удаляли из планшета раствор и добавляли раствор Разв 2 с планшета после фотоотщепленния. Следуя аналогичному процессу, добавляли раствор из планшета Разв 1 и инкубировали в течение 3 мин. В конце 3-минутной инкубации к суспензии магнитных гранул добавляли 6 мкл блокирующего буфера MB и инкубировали гранулы в течение 2 мин со встряхиванием при 1200 об/мин при 25 °C. После этой инкубации планшет переносили в другой шейкер, в котором была предварительно установлена температура 38 °C. Проводили отделение магнитных гранул в течение 2 минут, а затем удаляли раствор. После этого 4 раза промывали планшет «захват-2» с использованием 175 мкл промывочного буфера MB (20% глицерин в буфере для анализа), при этом каждый цикл промывки был запрограммирован на встряхивание гранул при 1200 об/мин в течение 1 мин и обеспечение возможности отделения гранул на магните в течение 3,5 минуты. На последнем этапе отделения гранул температуру шейкера устанавливали на 25 °C. После этого гранулы промывали один раз с использованием 175 мкл буфера для анализа. На этой стадии промывки гранулы встряхивали при 1200 об/мин в течение 1 мин, а затем обеспечивали возможность отделения на магните в течение 2 минут. После стадии промывания из очищенных комплексов из аптамера и белка элюировали аптамеры с использованием буфера для элюирования (1,8 М NaClO₄, 40 мМ PIPES, pH 6,8, 1 мМ EDTA, 0,05% тритон Х-100). Элюирование проводили с использованием 75 мкл буфера для элюирования в течение 10 мин при 25 °C, встряхивая гранулы при 1250 об/мин. 70 мкл элюата переносили на архивный планшет и разделяли на магните для отделения всех магнитных гранул, которые могли быть аспирированы. 10 мкл элюированного материала переносили на черный планшет с половинной площадью, разбавляли в соотношении 1:5 буфером для анализа и использовали для измерения сигналов флуоресценции цианина 3, которые отслеживались как внутренний анализ КК. 20 мкл элюированного материала переносили в планшет, содержащий 5 мкл раствора для блокирования гибридизации (набор Oligo aCGH/ChIP-on-chip Hybridization, большой объем, Agilent Technologies 5188-5380, содержащий добавленную последовательность ДНК, меченную цианином 3, комплементарную угловым маркерам зондов на матрицах Agilent). Этот планшет убирали с платформы автоматизированной станции и дополнительно обрабатывали для гибридизации (см. ниже). Архивный планшет с оставшимся элюированным раствором герметично закрывали алюминиевой фольгой и хранили при -20 °C.

Гибридизация.

[00342] 25 мкл 2× буфера для гибридизации Agilent (набор Oligo aCGH/ChIP-on-chip Hybridization, Agilent Technologies, номер по каталогу 5188-5380) вносили вручную пипеткой в каждую лунку планшета, содержащего элюированные образцы и блокирующий буфер. 40 мкл этого раствора вручную вносили пипеткой в каждую «лунку» стеклянной подложки для гибридизации (стеклянная подложка для гибридизации - формат из 8 микроматриц на стекле, Agilent Technologies). Пользовательские стекла с микроматрицами SurePrint G3 8×60k Agilent, содержащие 10 зондов на матрицу, комплементарных каждому аптамеру, помещали на стеклянные подложки в соответствии с протоколом производителя. Каждую сборку (Hybridization Chamber Kit - SureHyb enabled, Agilent Technologies) плотно закрепляли и загружали в печь для гибридизации на 19 часов при 55°C и при вращении со скоростью 20 об/мин.

Промывка после гибридизации.

[00343] Промывку стекол выполняли на устройстве для обработки препаратов Little Dipper (модель 650C, Scigene). Приблизительно 700 мл промывочного буфера 1 (промывочного буфера 1 Oligo aCGH/ChIP-on-chip, Agilent Technologies) наливали в стеклянный сосуд для окрашивания и использовали для отделения стекол с микроматрицами от стеклянных подложек. После разборки стекла быстро переносили в штатив для стекол в баню устройства для обработки препаратов Little Dipper, содержащую промывочный буфер 1. Стекла промывали в течение пяти минут в промывочном буфере 1 при перемешивании с помощью магнитной мешалки. Затем штатив со стеклами переносили в баню с промывочным буфером 2 при 37 °C (промывочным буфером 2 Oligo aCGH/ChIP-onchip, Agilent Technologies) и оставляли для инкубации в течение пяти минут при перемешивании. Штатив со стеклами медленно вынимали из второй бани, а затем переносили в баню, содержащую ацетонитрил, и инкубировали в течение пяти минут при перемешивании. Визуализация микроматрицы.

[00344] Стеклянные подложки для микроматриц визуализировали с помощью сканера для микроматриц (Agilent G4900DA Microarray Scanner System, Agilent Technologies) в канале цианин-3 с разрешением 3 мкм с параметром 100% РМТ и включенной 20-битной опцией. Полученные в результате изображения в формате tiff обрабатывали с использованием программного обеспечения Agilent для выделения характерных признаков (версии 10.7.3.1 или более поздней) с использованием протокола GE1_1200_Jun14.

Пример 2. Неспецифический захват молекулы-мишени в мультиплексном анализе

[00345] В этом примере представлено описание неспецифического захвата и переноса молекулы-мишени в мультиплексном анализе с множественным захватом.

[00346] Обычно на чувствительность и специфичность многих форматов анализа влияет способность метода обнаружения отделять истинный сигнал от сигнала, который возникает во время анализа из-за неспецифических связей и приводит к нежелательному обнаружению сигнала (ложноположительный результат анализа или «шум»). Это особенно верно для мультиплексных анализов. Было замечено, что одним из основных источников неспецифического связывания является функция непредвиденных взаимодействий захватывающего реагента и молекулы-мишени. В этом примере описано, как неспецифические взаимодействия захватывающего реагента и молекулы-мишени могут создавать в ходе анализа нежелательный сигнал или «шум».

[00347] В этом примере аптамерный мультиплексный анализ с двузахватной системой и множественные разведения тестируемого образца были использованы для моделирования неспецифического захвата молекулы-мишени (например, белка) и переноса из-за непредвиденных взаимодействий аптамера и молекулы-мишени, приводящих к возникновению в ходе анализа сигналов, которые выходят за пределы динамического диапазона анализа, что снижает чувствительность и специфичность анализа.

[00348] Вкратце, аптамерный анализ выполняли путем инкубации аптамерного реагента, который был иммобилизован на первой твердой подложке (например, гранулах со стрептавидином с использованием в реагенте биотина), с биологическим образцом (например, сывороткой или плазмой крови) с обеспечением возможности связывания белков в биологическом образце с родственным им аптамером (стадия, называемая «захват-1»). Затем к белку прикрепляли тег, после чего из первой твердой подложки высвобождали комплексы из аптамера и белка-мишени и подвергали воздействию на второй твердой подложке, в результате чего происходила иммобилизация комплекса из аптамера и белка-мишени через тег на белке (стадия, называемая «захват-2»). Затем комплексы промывали для удаления любых несвязанных аптамеров и белков из «захвата-2». После промывания аптамер высвобождался из комплекса из аптамера и целевого белка на второй твердой подложке и захватывался для целей обнаружения (например, в матрице для гибридизации). Количественный анализ аптамера использовали в качестве заменителя количества белка в биологическом образце. Аптамерный анализ можно проводить с использованием одного аптамерного реагента или множества аптамерных реагентов (или в мультиплексном формате).

[00349] Для этого примера были приготовлены три разные группы разведений образца плазмы (также параллельно проводили подобное исследование переноса белка в сыворотке, результаты которого были сопоставимыми; данные не показаны). На Фиг. 6 представлен обзор трех различных групп приготовленных разведений плазмы: 0,005% разведение (РАЗВ. 1), 0,5% разведение (РАЗВ. 2) и 20% разведение (РАЗВ. 3), в которых проводили измерение уровня белков с высоким, средним и низким относительным содержанием соответственно. Дополнительно показаны наборы аптамеров для каждого РАЗВ. 1, РАЗВ. 2 и РАЗВ. 3 - A1, A2 и A3 соответственно. Группа аптамеров A3 содержала 4271 различный аптамер (или ~ 81% от общего количества аптамеров), группа A2 содержала 828 различных аптамеров (или ~ 16% от общего количества аптамеров), а группа A1 содержала 173 различных аптамера ( ~ 3% от общего количества аптамеров), в общей сложности 5272 различных аптамера.

[00350] Было протестировано пять различных условий, чтобы определить, имеется ли в мультиплексном анализе эффект переноса белка. Эти условия показаны в таблице 2 ниже.

Таблица 2.

Условие РАЗВ. 1 (0,005%) или холостая проба 1 РАЗВ. 2 (0,5%)
или холостая проба 2 РАЗВ. 3 (20%)
или холостая проба 3 1 плазма плазма плазма 2 плазма холостая проба холостая проба 3 холостая проба плазма холостая проба 4 холостая проба холостая проба плазма 5 холостая проба холостая проба холостая проба

[00351] Для каждого условия проводили аптамерный мультиплексный анализ с использованием двузахватной системы, как описано выше. Условия различаются в зависимости от того, проводили ли анализ биологического образца (например, плазмы) или холостой пробы, которая представляла собой буфер для анализа без биологического образца и, следовательно, без белка. Каждую группу разведения, независимо от того, присутствовал ли в ней разбавленный биологический образец или холостая проба, инкубировали с соответствующей группой аптамеров (A1 с РАЗВ. 1 или холостой пробой 1; A2 с РАЗВ. 2 или холостой пробой 2 и A3 с РАЗВ. 3 или холостой пробой 3). В каждом случае аптамеры из каждой группы аптамеров были предварительно иммобилизованы на первой твердой подложке, после чего их инкубировали с их соответствующим разведением или холостой пробой («захват-1»). После инкубации к белку (при наличии) прикрепляли тег, после чего из первой твердой подложки высвобождали комплексы из аптамера и белка-мишени (при наличии) в трех отдельных разведениях и/или холостых пробах и в то же время объединяли в одну смесь и подвергали воздействию на второй твердой подложке, в результате чего происходила иммобилизация комплекса из аптамера и белка-мишени (при наличии) через тег на белке (стадия, называемая «захват-2»). Затем комплексы промывали для удаления любых несвязанных аптамеров и белков из «захвата-2». После промывания аптамер высвобождался из комплекса из аптамера и целевого белка на второй твердой подложке и захватывался для целей обнаружения в матрице для гибридизации. Количественный анализ аптамера с результатом в относительных единицах флуоресценции (ОЕФ) использовали в качестве заменителя количества белка в биологическом образце.

[00352] Условие 1 представляло собой разведение плазмы в трех группах разведения (РАЗВ. 1-0,005% разведение; РАЗВ. 2-0,5% разведение и РАЗВ. 3-20% разведение), которые инкубировали с соответствующими группами аптамеров (A1, A2 и A3). Для условия 2 использовали разведение плазмы РАЗВ. 1 (0,005%), а вместо РАЗВ. 2 и РАЗВ. 3 использовали холостую пробу 2 и холостую пробу 3, соответственно, которые инкубировали с соответствующими группами аптамеров (A1, A2 и A3). Для условия 3 использовали разведение плазмы РАЗВ. 2 (0,5%), а вместо РАЗВ. 1 и РАЗВ. 3 использовали холостую пробу 1 и холостую пробу 3, соответственно, которые инкубировали с соответствующими группами аптамеров (A1, A2 и A3). Для условия 4 использовали разведение плазмы РАЗВ. 3 (20%), а вместо РАЗВ. 1 и РАЗВ. 2 использовали холостую пробу 1 и холостую пробу 2, соответственно, которые инкубировали с соответствующими группами аптамеров (A1, A2 и A3). И наконец, для условия 5 не использовали разведения плазмы, а использовали только холостые пробы (холостую пробу 1, холостую пробу 2 и холостую пробу 3), которые инкубировали с соответствующими группами аптамеров (A1, A2 и A3). Для каждого условия проводили анализы «захват-1» и «захват-2», описанные в примере 1, в которых после высвобождения из «захвата-1» объединяли разведение и/или холостые пробы, чтобы перейти к части анализа «захват-2».

[00353] Чтобы количественно оценить любой перенос белка, на график наносили данные кумулятивной функции распределения (CDF) соотношения сигнала аптамера для условия 1 (т. е. для всех трех групп разведений: РАЗВ. 1, РАЗВ. 2 и РАЗВ. 3) в зависимости от сигнала аптамера для каждого из условий 2, 3 и 4 (где присутствовала только одна из групп разведений вместе с холостыми пробами) (см. Фиг. 10). Соотношение сигналов аптамера представлено в относительных единицах флуоресценции (ОЕФ), полученных с использованием гибридизации на матрицах. На Фиг. 10 показано, что для условия 4, где присутствует только 20% разведение (РАЗВ. 3) образца плазмы, соотношение значений ОЕФ для аптамеров из условия 1 к тем же аптамерам в условии 4 составляет около 1. Напротив, для условия 3, где присутствует только 0,5% разведение (РАЗВ. 2) образца плазмы, соотношение значений ОЕФ для аптамеров из условия 1 к тем же аптамерам в условии 3 составляет приблизительно 1-6, причем сигнал у приблизительно 45% или более аптамеров из условия 1 приблизительно в 2-6 раз выше, чем у тех же аптамеров из условия 3. При рассмотрении сигналов одиночного аптамера в условии 3 (например, аптамера, который связывает белок ASM3A и является частью группы аптамеров А2, и который инкубируют с разведением РАЗВ. 2) в сравнении с условием 1, сигналы аптамера ASM3A в условии 1 в 5-раз выше по сравнению с условием 3. Для условия 2, где присутствует только 0,005% разведение (РАЗВ. 1) образца плазмы, соотношение значения ОЕФ для аптамеров из условия 1 к тем же аптамерам в условии 2 также выше приблизительно в 1-6 раз, причем сигнал у приблизительно 20% или более аптамеров из условия 1 приблизительно в 2-6 раз выше, чем у тех же аптамеров из условия 2. При сравнении аптамера, который связывается с белком ApoE и является частью группы аптамеров A1, и который инкубируют с разведением РАЗВ. 1, этот аптамер имел в 200 раз большее значение ОЕФ в условии 1 по сравнению с условием 2, в 80 раз большее значение ОЕФ в условии 1 по сравнению с условием 4 и в 600 раз большее значение ОЕФ в условии 1 по сравнению с условием 3.

[00354] Эти данные показывают, что сигнал, обнаруживаемый в анализе, когда все три образца разведений объединяются одновременно на фазе анализа «захват-2», для образца с 0,5% разведением плазмы (РАЗВ. 2) и образца с 0,005% разведением плазмы. (РАЗВ. 1) возникал в результате переноса белка из образца с 20% разведением плазмы (РАЗВ. 3). Этот перенос белка, вероятно, связан с тем, что белки в образце с 20% разведением плазмы (РАЗВ. 3) неспецифически связываются с аптамером в группе аптамеров A3 во время фазы анализа «захват-1», высвобождаясь в раствор, например, посредством фотоотщепления из первой твердой подложки (захват-1) с переносом в фазу анализа «захват-2», в которой одновременно объединяются все три группы разведения и группы аптамеров. На этой фазе анализа, когда добавляется конкурент для предотвращения неспецифических взаимодействий аптамера и белка, белки, которые неспецифически переносятся из 20% разведения плазмы, могут взаимодействовать с несвязанными аптамерами из групп аптамеров A2 и аптамеров A1, и впоследствии встречаются со своим родственным аптамером с образованием стабильных комплексов. Эти комплексы из перенесенного белка и аптамера затем разрушаются, и аптамер обнаруживается на матрице гибридизации как положительный сигнал, который технически является ложноположительным сигналом или «шумом». Те же самые данные наблюдались с использованием в качестве биологического образца сыворотки крови (данные не показаны).

[00355] Эти данные указывают на то, что необходима стратегия уменьшения переноса белка, чтобы гарантировать, что мультиплексный анализ не выходит за пределы динамического диапазона анализа, и что чувствительность и специфичность анализа являются максимальными.

Пример 3. Стратегии компенсации для уменьшения неспецифического захвата молекулы-мишени в мультиплексном анализе

[00356] В этом примере представлено описание стратегии компенсации для уменьшения неспецифического захвата молекулы-мишени в мультиплексном анализе с множественным захватом.

[00357] В примере 1 представлено описание того, как в мультиплексном анализе с множественным захватом из захвата и переноса неспецифического молекулы-мишени могут быть получены положительные сигналы, а также их происхождение в анализе. Чтобы уменьшить нежелательный перенос белка в этом мультиплексном анализе с множественным захватом, в ходе переноса из фазы «захват 1» на фазу «захват-2» анализа выполняли последовательное высвобождение и улавливание разбавленных образцов биологического образца вместе с соответствующей группой аптамеров. Общий обзор формата последовательного захвата с двумя и тремя разведениями показан на Фиг. 9 и 7, соответственно.

[00358] Для этого примера были приготовлены те же три группы разведения плазмы (РАЗВ. 3, РАЗВ. 2 и РАЗВ. 1) вместе с теми же группами аптамеров (A1, A2 и A3), как описано в примере 1 (см. Фиг. 8). Кроме того, использовали такие же условия, что описаны в таблице 2 в примере 1. В примере 1 применяли тот же подход, что и для фазы анализа «захват-1»; однако для этого примера проводили высвобождение по отдельности различных группы разведения или холостых проб и переносили на фазу анализа «захват-2» последовательно, а не одновременно, как в примере 1 (см. Фиг. 8). Более конкретно для условия 1, группу РАЗВ. 1, которую инкубировали с группой аптамеров A1 (группа РАЗВ. 1-A1), высвобождали из «захвата-1», иммобилизовали на второй твердой подложке («захват-2») и промывали. Затем группу РАЗВ. 2, которую инкубировали с группой аптамеров A2, высвобождали из «захвата-1», объединяли с группой РАЗВ. 1-A1, которая уже была иммобилизована на «захвате-2», а затем иммобилизовали на второй твердой подложке («захват-2»). И группу РАЗВ. 3, которую инкубировали с группой аптамеров A3, высвобождали из «захвата-1», иммобилизовали на второй твердой подложке («захват-1») и промывали. Остальные условия (условия 2, 3, 4 и 5), которые включали холостую пробу (холостая проба 1, 2 и/или 3) вместо разведенной биологической пробы, как указано в таблице 2, подвергали тому же подходу последовательного захвата.

[00359] Чтобы количественно оценить любой перенос белка, на график наносили данные кумулятивной функции распределения (CDF) соотношения сигнала аптамера для условия 1 (т. е. для всех трех групп разведений РАЗВ. 1, РАЗВ. 2 и РАЗВ. 3) в зависимости от сигнала аптамера для каждого из условий 2, 3 и 4 (где присутствовала только одна из групп разведений вместе с холостыми пробами) (см. Фиг. 11). Соотношение сигналов аптамера представлено в относительных единицах флуоресценции (ОЕФ), полученных с использованием гибридизации на матрицах. Аналогично непоследовательной версии мультиплексного анализа, на Фиг. 11 показано, что для условия 4, где присутствует только 20% разведение (РАЗВ. 3) образца плазмы, соотношение значений ОЕФ для аптамеров из условия 1 к тем же аптамерам в условии 4 составляет около 1. Для условия 3, где присутствует только 0,5% разведение (РАЗВ. 2) образца плазмы, соотношение значений ОЕФ для аптамеров из условия 1 к тем же аптамерам в условии 3 составляет приблизительно 1-6; однако только у менее чем приблизительно 5% аптамеров из условия 1 сигнал приблизительно в 2-6 раз выше, чем у тех же аптамеров из условия 3 (в сравнении с 45% в версии анализа с непоследовательным «захватом-2»). Кроме того, для условия 2, где присутствует только 0,005% разведение (РАЗВ. 1) образца плазмы, соотношение значения ОЕФ для аптамеров из условия 1 к тем же аптамерам в условии 2 также выше приблизительно в 1-6 раз; однако только у менее чем приблизительно 10% аптамеров из условия 1 сигнал приблизительно в 2-6 раз выше, чем у тех же аптамеров из условия 2 (в сравнении с 20% в версии анализа с непоследовательным «захватом-2»). Те же самые данные наблюдались с использованием в качестве биологического образца сыворотки крови (данные не показаны).

[00360] Эти данные показывают, что в двузахватном мультиплексном анализе, включающем два или более наборов разведений образцов, перенос белка может быть уменьшен путем последовательного переноса из первой фазы захвата анализа на вторую фазу захвата анализа двух или более наборов разбавленных биологических образцов с соответствующими инкубированными реагентами захвата. Такой подход с последовательным переносом гарантирует, что мультиплексный анализ остается в пределах динамического диапазона анализа, что чувствительность и специфичность анализа максимизируются, а также снижает вероятность ложноположительных сигналов или «шума» в анализе.

Пример 4. Выбор разведения биологического образца для максимального увеличения количества аналитов в линейном диапазоне, имеющих наибольшее соотношение медианного сигнала к фону в мультиплексном анализе

[00361] В этом примере представлено описание выбора уровня разведения биологического образца, который максимально увеличивает количество аналитов в линейном диапазоне, сохраняя при этом наибольшее соотношение медианного показателя сигнала к фоновому показателю сигнала в мультиплексном анализе.

[00362] В формате мультиплексного анализа, когда проводят измерения нескольких белков-мишеней с помощью нескольких захватывающих реагентов, естественное изменение количества различных белков-мишеней может ограничивать способность определенных захватывающих реагентов измерять определенные белки-мишени (например, белки-мишени с высоким содержанием могут насыщать анализ и препятствовать или уменьшать способность анализа измерять белки-мишени с низким содержанием). Чтобы устранить эти вариации в биологическом образце, реагенты аптамеров разделяют по меньшей мере на две разные группы, предпочтительно на три разные группы, в зависимости от содержания их соответствующего белка-мишени в биологическом образце. Биологический образец разводят по меньшей с получением двух, предпочтительно трех разных группах разведения, чтобы создать отдельные тестируемые образцы на основе относительных концентраций белков-мишеней, которые должны быть обнаружены их захватывающими реагентами. Таким образом, проводят разведение биологического образца в группах разведения с высоким, средним и низким содержанием белка-мишени, где белки-мишени с наименьшим содержанием измеряются в группе с наименьшим разведением, а белки-мишени с наибольшим содержанием измеряются в группе с наибольшим разведением. Исторически сложилось так, что для аптамерного мультиплексного анализа с множественным захватом тремя группами разведений биологического образца были 40% разведение, 1% разведение и 0,005% разведение.

[00363] В этом примере была пересмотрена группа с 40% разведением, чтобы определить, принесет ли другое разведение большую пользу в мультиплексном анализе с множественным захватом (например, максимальное увеличение количества аналитов в линейном диапазоне анализа и/или улучшение соотношения медианного сигнала к фоновому сигналу). Эта группа разведения демонстрирует некоторое неспецифическое связывание, нелинейность сигнала и более высокие сигналы от отрицательных контролей по сравнению с использованием только буфера.

[00364] Вкратце, из плазмы, полученной от трех разных субъектов, были приготовлены несколько групп разведений (группы разведений 40%, 20%, 10% и 5%). Пул из 903 аптамеров инкубировали с различными группами разведений образцов, полученных от всех трех субъектов, и использовали в описанном в настоящем документе двузахватном мультиплексном анализе.

[00365] Определяли количество аналитов в линейном диапазоне для каждого из разведений (40%, 20%, 10% и 5%) по результатам измерений с использованием аптамеров в матрице гибридизации. Для 40% разведения 246 аналитов находились в линейном диапазоне, для 20% разведения 388 аналитов находились в линейном диапазоне, для 10% разведения 517 аналитов находились в линейном диапазоне, а для 5% разведения 585 аналитов находились в линейном диапазоне. Остальные 259 из 903 аналитов не имели линейного диапазона. Таким образом, эти данные показывают, что по мере увеличения разведения образца количество аналитов в линейном диапазоне увеличивается (т. е. более разведенный образец обеспечивает большее количество аналитов в линейном диапазоне).

[00366] Каждое разведение (40%, 20%, 10% и 5%) демонстрировало различное соотношение медианного сигнала к фоновому сигналу (или значение соотношения медианного С/Ф). Для 40% разведения медианный С/Ф составлял 10, для 20% разведения медианный С/Ф составлял 7,8, для 10% разведения медианный С/Ф составлял 5,4 и для 5% разведения медианный С/Ф составлял 3,7. Таким образом, эти данные указывают на то, что медианный С/Ф уменьшается по мере дальнейшего разбавления образца.

[00367] Приведенные выше данные показывают, что существует противоречие между количеством аналитов в линейном диапазоне и медианным С/Ф, связанным со степенью разведения образца. Уравновешивая наблюдаемые улучшения количества аналитов в линейном диапазоне с большими разведениями наряду с большим отношением медианный С/Ф при меньшем разведении, был выбран «компромисс» для «оптимального» разведения биологического образца для двузахватного мультиплексного аптамерного анализа. На Фиг. 12 показано графическое представление количества аналитов в линейном диапазоне вместе с соотношением медианного С/Ф для каждого из 40%, 20%, 10% и 5% разведения. Как показано на Фиг. 12, при 20% разведении биологического образца наблюдается максимальное количество аналитов в линейном диапазоне, имеющих наибольшее значение отношения медианного С/Ф (где пересекаются две линии). Таким образом, из трех разведений, используемых в аптамерном мультиплексном анализе с множественным захватом, аптамеры, нацеленные на белки, имеющие «низкое содержание», лучше подходят для инкубации с 20% разведением биологического образца, а не с 40% разведением.

[00368] Таким образом, в мультиплексном анализе, описанном в разделе «Примеры» настоящего документа, используются форматы разбавления образца 20%, 0,5% и 0,005%. Кроме того, более высокая концентрация молекулы-конкурента в сыворотке приводила к лучшей корреляции между измерениями в сыворотке и плазме одного и того же индивидуума (данные не показаны). В дополнение, более высокая концентрация молекулы-конкурента (30 мкМ или 60 мкМ по сравнению с 20 мкМ) при более низкой концентрации образца (например, от 40% до 20%) приводила к увеличению пика и восстановления, увеличению количества аналитов в линейном диапазоне и уменьшению неспецифического связывания. Концентрация молекулы-конкурента (Z-блок; олигонуклеотид с последовательностью ((A-C-BndU-BndU)₇AC) в разбавителях образцов составляла 60 мкМ для образцов сыворотки крови и 30 мкМ для образцов плазмы. В предыдущих форматах анализа использовали 20 мкМ Z-блок для сыворотки и плазмы крови. Более высокая концентрация молекулы-конкурента в сыворотке приводила к лучшей корреляции между измерениями в сыворотке и плазме одного и того же индивидуума (данные не показаны). Уменьшение неспецифического связывания должно приводить к меньшему количеству белков, доступных для образования комплекса после фотоотщепления.

Группа изобретений относится к области протеомных анализов. Раскрыты способы повышения эффективности протеомных анализов (варианты), включающие приведение в контакт разведений образца с захватывающими реагентами, инкубацию полученных смесей с обеспечением возможности образования аффинных комплексов, последовательные высвобождение и захват аффинных комплексов на твердых подложках; обнаружение наличия или определение уровня захватывающих реагентов. Группа изобретений обеспечивает, что мультиплексный анализ остается в пределах динамического диапазона анализа, что чувствительность и специфичность анализа максимизируются, а также снижает вероятность ложноположительных сигналов или «шума» в анализе. 2 н. и 37 з.п. ф-лы, 12 ил., 2 табл., 4 пр.

1. Способ повышения эффективности протеомных анализов, включающий:

a) приведение в контакт первого разведения образца с первым аптамером, причем первый аптамерный аффинный комплекс образуется посредством взаимодействия первого аптамера с его молекулой-мишенью при наличии молекулы-мишени в первом разведении образца;

b) приведение в контакт второго разведения образца со вторым аптамером, причем второй аптамерный аффинный комплекс образуется посредством взаимодействия второго аптамера с его молекулой-мишенью при наличии молекулы-мишени во втором разведении образца;

c) приведение в контакт третьего разведения образца с третьим аптамером, причем третий аптамерный аффинный комплекс образуется посредством взаимодействия третьего аптамера с его молекулой-мишенью при наличии молекулы-мишени в третьем разведении образца;

d) инкубацию первого, второго и третьего разведений образцов по отдельности с обеспечением возможности образования аптамерного аффинного комплекса, где первый аптамерный аффинный комплекс иммобилизован на его первой твердой подложке, второй аптамерный аффинный комплекс иммобилизован на его первой твердой подложке и третий аптамерный аффинный комплекс иммобилизован на его первой твердой подложке;

e) высвобождение и захват первого аптамерного аффинного комплекса на второй твердой подложке;

f) после стадии e), высвобождение и захват второго аптамерного аффинного комплекса на второй твердой подложке;

g) после стадии f), высвобождение и захват третьего аптамерного аффинного комплекса на второй твердой подложке;

h) обнаружение наличия или определение уровня первого аптамера, второго аптамера и третьего аптамера первого, второго и третьего аптамерных аффинных комплексов или наличия или количества первого, второго и третьего аптамерных аффинных комплексов;

причем первое разведение и второе разведение представляют собой разные разведения одного и того же тестируемого образца.

2. Способ по п.1, в котором тестируемый образец выбран из плазмы, сыворотки, мочи, цельной крови, лейкоцитов, мононуклеарных клеток периферической крови, лейкоцитарной пленки, мокроты, слез, слизи, носовых промывных вод, назального аспирата, спермы, слюны, промывных вод брюшины, асцитной жидкости, кистозной жидкости, менингеальной жидкости, амниотической жидкости, жидкости, вырабатываемой железами, лимфатической жидкости, аспирата из сосков, бронхиального аспирата, материала бронхов, взятого с помощью щеточки, синовиальной жидкости, аспирата суставной жидкости, секретов органов, клеток, экстракта клеток и спинномозговой жидкости.

3. Способ по п.1, в котором первый и второй аффинные комплексы из аптамера и молекулы-мишени являются нековалентными комплексами.

4. Способ по п.1, в котором молекула-мишень выбрана из белка, пептида, углевода, полисахарида, гликопротеина, гормона, рецептора, антигена, антитела, метаболита, кофактора, ингибитора, лекарственного средства, красителя, питательного вещества и фактора роста.

5. Способ по п.1, в котором первое разведение представляет собой разведение тестируемого образца от 0,001% до 0,009% или составляет 0,001%, 0,002%, 0,003%, 0,004%, 0,005%, 0,006%, 0,007%, 0,008% или 0,009%, или от 0,002% до 0,008%, или от 0,003% до 0,007%, или составляет 0,005%, а второе разведение представляет собой разведение тестируемого образца от 0,01% до 1% или составляет 0,01%, 0,02%, 0,03%, 0,04%, 0,05%, 0,06%, 0,07%, 0,08%, 0,09%, 0,1%, 0,15%, 0,2%, 0,25%, 0,3%, 0,35%, 0,4%, 0,45%, 0,5%, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9% или 1%, или от 0,1% до 0,8%, или от 0,2% до 0,75%, или составляет 0,5%.

6. Способ по п.1, в котором первое разведение представляет собой разведение тестируемого образца от 0,001% до 0,009% или 0,001%, 0,002%, 0,003%, 0,004%, 0,005%, 0,006%, 0,007%, 0,008% или 0,009%, или от 0,002% до 0,008%, или от 0,003% до 0,007%, или составляет 0,005%; а второе разведение представляет собой разведение тестируемого образца от 5% до 39% или составляет 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38% или 39%, или от 15% до 30%, или от 15% до 25%, или составляет 20%.

7. Способ по п.1, в котором первое разведение представляет собой разведение тестируемого образца от 0,01% до 1% или составляет 0,01%, 0,02%, 0,03%, 0,04%, 0,05%, 0,06%, 0,07%, 0,08%, 0,09%, 0,1%, 0,15%, 0,2%, 0,25%, 0,3%, 0,35%, 0,4%, 0,45%, 0,5%, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9% или 1%, или от 0,1% до 0,8%, или от 0,2% до 0,75%, или составляет 0,5%; а второе разведение представляет собой разведение тестируемого образца от 5% до 39% или составляет 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38% или 39%, или от 15% до 30%, или от 15% до 25%, или составляет 20%.

8. Способ по п.1, в котором первое разведение представляет собой разведение тестируемого образца от 0,01% до 1% или составляет 0,01%, 0,02%, 0,03%, 0,04%, 0,05%, 0,06%, 0,07%, 0,08%, 0,09%, 0,1%, 0,15%, 0,2%, 0,25%, 0,3%, 0,35%, 0,4%, 0,45%, 0,5%, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9% или 1%, или от 0,1% до 0,8%, или от 0,2% до 0,75%, или составляет 0,5%; а второе разведение представляет собой разведение тестируемого образца от 0,001% до 0,009% или составляет 0,001%, 0,002%, 0,003%, 0,004%, 0,005%, 0,006%, 0,007%, 0,008% или 0,009%, или от 0,002% до 0,008%, или от 0,003% до 0,007%, или составляет 0,005%.

9. Способ по п.1, в котором первое разведение представляет собой разведение тестируемого образца от 5% до 39% или составляет 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38% или 39%, или от 15% до 30%, или от 15% до 25%, или составляет 20%, а второе разведение представляет собой разведение тестируемого образца от 0,01% до 1% или составляет 0,01%, 0,02%, 0,03%, 0,04%, 0,05%, 0,06%, 0,07%, 0,08%, 0,09%, 0,1%, 0,15%, 0,2%, 0,25%, 0,3%, 0,35%, 0,4%, 0,45%, 0,5%, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9% или 1%, или от 0,1% до 0,8%, или от 0,2% до 0,75%, или составляет 0,5%.

10. Способ по п.1, в котором первое разведение представляет собой разведение тестируемого образца от 5% до 39% или составляет 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38% или 39%, или от 15% до 30%, или от 15% до 25%, или составляет 20%, а второе разведение представляет собой разведение тестируемого образца от 0,001% до 0,009% или составляет 0,001%, 0,002%, 0,003%, 0,004%, 0,005%, 0,006%, 0,007%, 0,008% или 0,009%, или от 0,002% до 0,008%, или от 0,003% до 0,007%, или составляет 0,005%.

11. Способ по п.1, в котором обнаружение наличия или определение уровня диссоциированных первого, второго и третьего захватывающих реагентов выполняется с помощью ПЦР, масс-спектрометрии, секвенирования нуклеиновых кислот, секвенирования нового поколения (NGS) или гибридизации.

12. Способ по п.1, в котором первый аптамер, и/или второй аптамер, и/или третий аптамер независимо содержит по меньшей мере один пиримидин, модифицированный в положении 5.

13. Способ по п.12, в котором по меньшей мере один пиримидин, модифицированный в положении 5, содержит в положении 5 пиримидина линкер и присоединенный к линкеру фрагмент.

14. Способ по п.13, в котором линкер выбран из амидного линкера, карбонильного линкера, пропинильного линкера, алкинового линкера, сложноэфирного линкера, мочевинного линкера, карбаматного линкера, гуанидинового линкера, амидинового линкера, сульфоксидного линкера и сульфонового линкера.

15. Способ по п.13, в котором фрагмент представляет собой гидрофобный фрагмент.

16. Способ по п.15, в котором фрагмент представляет собой группу R’, выбранную из фрагментов:

, , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , и ,

где * обозначает точку присоединения группы R’ к линкеру и где R” и R”” независимо выбраны из галогена (-F, -Cl, -Br, -I); нитрила (-CN); -NH₂; -OH; разветвленного низшего алкила (C1-C20); прямого низшего алкила (C1-C20); первичного амида; вторичного амида; третичного амида; и алкоксигруппы.

17. Способ по п.15, в котором фрагмент выбран из нафтильного фрагмента, бензильного фрагмента, фторбензильного фрагмента, тирозильного фрагмента, индольного фрагмента, морфолинового фрагмента, изобутильного фрагмента, 3,4-метилендиоксибензильного фрагмента, бензотиофенильного фрагмента и бензофуранильного фрагмента.

18. Способ по п.12, в котором по меньшей мере один модифицированный в положении 5 пиримидин представляет собой модифицированный в положении 5 уридин, цитидин или тимидин.

19. Способ по п.1, в котором третье разведение представляет собой разведение, отличное от первого разведения и второго разведения одного и того же тестируемого образца.

20. Способ по п.1, в котором третье разведение представляет собой разведение тестируемого образца, выбранное в диапазоне от 5% до 39%, или составляет 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38% или 39%, от 15% до 30%, от 15% до 25%, 20%; от 0,01% до 1% или 0,01%, 0,02%, 0,03%, 0,04%, 0,05%, 0,06%, 0,07%, 0,08%, 0,09%, 0,1%, 0,15%, 0,2%, 0,25%, 0,3%, 0,35%, 0,4%, 0,45%, 0,5%, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9% или 1%, от 0,1% до 0,8%, от 0,2% до 0,75%, 0,5%; и от 0,001% до 0,009% или 0,001%, 0,002%, 0,003%, 0,004%, 0,005%, 0,006%, 0,007%, 0,008% или 0,009%, или от 0,002% до 0,008%, от 0,003% до 0,007%, 0,005%.

21. Способ повышения эффективности протеомных анализов, включающий:

a) приведение в контакт первого захватывающего реагента с первым разведением с образованием первой смеси, второго захватывающего реагента со вторым разведением с образованием второй смеси и третьего захватывающего реагента с третьим разведением с образованием смеси третьего разведения, причем каждый из первого, второго и третьего захватывающих реагентов иммобилизован на твердой подложке, и при этом каждый из первого, второго и третьего захватывающих реагентов обладает аффинностью к разным молекулам-мишеням;

b) инкубацию первой смеси, второй смеси и третьей смеси отдельно, причем аффинный комплекс из первого захватывающего реагента и молекулы-мишени образуется в первой смеси в том случае, если в первой смеси присутствует молекула-мишень, к которой обладает аффинностью первый захватывающий реагент, причем аффинный комплекс из второго захватывающего реагента и молекулы-мишени образуется во второй смеси в том случае, если во второй смеси присутствует молекула-мишень, к которой обладает аффинностью второй захватывающий реагент, и причем аффинный комплекс из третьего захватывающего реагента и молекулы-мишени образуется в третьей смеси в том случае, если в третьей смеси присутствует молекула-мишень, к которой обладает аффинностью третий захватывающий реагент;

c) последовательное высвобождение и объединение аффинных комплексов в четвертой смеси в порядке, выбранном из: (i) аффинный комплекс из первого захватывающего реагента и молекулы-мишени, затем аффинный комплекс из второго захватывающего реагента и молекулы-мишени, а затем аффинный комплекс из третьего захватывающего реагента и молекулы-мишени; (ii) аффинный комплекс из первого захватывающего реагента и молекулы-мишени, затем аффинный комплекс из третьего захватывающего реагента и молекулы-мишени, а затем аффинный комплекс из второго захватывающего реагента и молекулы-мишени; (iii) аффинный комплекс из второго захватывающего реагента и молекулы-мишени, затем аффинный комплекс из третьего захватывающего реагента и молекулы-мишени, а затем аффинный комплекс из первого захватывающего реагента и молекулы-мишени; (iv) аффинный комплекс из второго захватывающего реагента и молекулы-мишени, затем аффинный комплекс из первого захватывающего реагента и молекулы-мишени, а затем аффинный комплекс из третьего захватывающего реагента и молекулы-мишени; (v) аффинный комплекс из третьего захватывающего реагента и молекулы-мишени, затем аффинный комплекс из первого захватывающего реагента и молекулы-мишени, а затем аффинный комплекс из второго захватывающего реагента и молекулы-мишени; и (vi) аффинный комплекс из третьего захватывающего реагента и молекулы-мишени, затем аффинный комплекс из второго захватывающего реагента и молекулы-мишени, а затем аффинный комплекс из первого захватывающего реагента и молекулы-мишени;

d) присоединение первой метки к молекуле-мишени аффинных комплексов из первого, второго и третьего захватывающего реагента и молекулы-мишени;

e) приведение в контакт содержащих метку аффинных комплексов из первого, второго и третьего захватывающего реагента и молекулы-мишени с одной или более твердыми подложками таким образом, что метка иммобилизует аффинные комплексы из первого, второго и третьего захватывающего реагента и молекулы-мишени на одной или более твердых подложках;

f) диссоциацию захватывающих реагентов из аффинных комплексов из захватывающего реагента и молекулы-мишени;

g) обнаружение наличия или определение уровня диссоциированных захватывающих реагентов;

причем первое разведение, второе разведение и третье разведение представляют собой разные разведения одного тестируемого образца.

22. Способ по п.21, в котором тестируемый образец выбран из плазмы, сыворотки, мочи, цельной крови, лейкоцитов, мононуклеарных клеток периферической крови, лейкоцитарной пленки, мокроты, слез, слизи, носовых промывных вод, назального аспирата, спермы, слюны, промывных вод брюшины, асцитной жидкости, кистозной жидкости, менингеальной жидкости, амниотической жидкости, жидкости, вырабатываемой железами, лимфатической жидкости, аспирата из сосков, бронхиального аспирата, материала бронхов, взятого с помощью щеточки, синовиальной жидкости, аспирата суставной жидкости, секретов органов, клеток, экстракта клеток и спинномозговой жидкости.

23. Способ по п.21, в котором аффинные комплексы из первого, второго и третьего захватывающего реагента и молекулы-мишени являются нековалентными комплексами.

24. Способ по п.21, в котором первый захватывающий реагент, второй захватывающий реагент и третий захватывающий реагент независимо выбраны из аптамера или антитела.

25. Способ по п.21, в котором молекула-мишень выбрана из белка, пептида, углевода, полисахарида, гликопротеина, гормона, рецептора, антигена, антитела, метаболита, кофактора, ингибитора, лекарственного средства, красителя, питательного вещества и фактора роста.

26. Способ по п.21, в котором обнаружение наличия или определение уровня диссоциированных первого и второго захватывающих реагентов выполняется с помощью ПЦР, масс-спектрометрии, секвенирования нуклеиновых кислот, секвенирования нового поколения (NGS) или гибридизации.

27. Способ по п.24, в котором аптамер содержит по меньшей мере один модифицированный в положении 5 пиримидин.

28. Способ по п.27, в котором по меньшей мере один пиримидин, модифицированный в положении 5, содержит в положении 5 пиримидина линкер и присоединенный к линкеру фрагмент.

29. Способ по п.28, в котором линкер выбран из амидного линкера, карбонильного линкера, пропинильного линкера, алкинового линкера, сложноэфирного линкера, мочевинного линкера, карбаматного линкера, гуанидинового линкера, амидинового линкера, сульфоксидного линкера и сульфонового линкера.

30. Способ по п.28, в котором фрагмент представляет собой гидрофобный фрагмент.

31. Способ по п.30, в котором фрагмент представляет собой группу R’, выбранную из фрагментов:

, , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , и ,

где * обозначает точку присоединения группы R’ к линкеру и где R” и R”” независимо выбраны из галогена (-F, -Cl, -Br, -I); нитрила (-CN); -NH₂; -OH; разветвленного низшего алкила (C1-C20); прямого низшего алкила (C1-C20); первичного амида; вторичного амида; третичного амида; и алкоксигруппы.

32. Способ по п.30, в котором фрагмент выбран из нафтильного фрагмента, бензильного фрагмента, фторбензильного фрагмента, тирозильного фрагмента, индольного фрагмента, морфолинового фрагмента, изобутильного фрагмента, 3,4-метилендиоксибензильного фрагмента, бензотиофенильного фрагмента и бензофуранильного фрагмента.

33. Способ по п.27, в котором по меньшей мере один модифицированный в положении 5 пиримидин представляет собой модифицированный в положении 5 уридин, цитидин или тимидин.

34. Способ по п.21, в котором первое разведение представляет собой разведение тестируемого образца от 0,001% до 0,009% или составляет 0,001%, 0,002%, 0,003%, 0,004%, 0,005%, 0,006%, 0,007%, 0,008% или 0,009%, или от 0,002% до 0,008%, или от 0,003% до 0,007%, или составляет 0,005%, второе разведение представляет собой разведение тестируемого образца от 0,01% до 1% или составляет 0,01%, 0,02%, 0,03%, 0,04%, 0,05%, 0,06%, 0,07%, 0,08%, 0,09%, 0,1%, 0,15%, 0,2%, 0,25%, 0,3%, 0,35%, 0,4%, 0,45%, 0,5%, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9% или 1%, или от 0,1% до 0,8%, или от 0,2% до 0,75%, или составляет 0,5%; и третье разведение представляет собой разведение тестируемого образца от 5% до 39% или составляет 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38% или 39%, или от 15% до 30%, или от 15% до 25%, или составляет 20%.

35. Способ по п.21, в котором первое разведение представляет собой разведение тестируемого образца от 0,001% до 0,009% или 0,001%, 0,002%, 0,003%, 0,004%, 0,005%, 0,006%, 0,007%, 0,008% или 0,009%, или от 0,002% до 0,008%, или от 0,003% до 0,007% или составляет 0,005%; второе разведение представляет собой разведение тестируемого образца от 5% до 39% или составляет 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38% или 39%, или от 15% до 30%, или от 15% до 25%, или составляет 20%; и третье разведение представляет собой разведение тестируемого образца от 0,01% до 1% или составляет 0,01%, 0,02%, 0,03%, 0,04%, 0,05%, 0,06%, 0,07%, 0,08%, 0,09%, 0,1%, 0,15%, 0,2%, 0,25%, 0,3%, 0,35%, 0,4%, 0,45%, 0,5%, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9% или 1%, или от 0,1% до 0,8%, или от 0,2% до 0,75%, или составляет 0,5%.

36. Способ по п.21, в котором первое разведение представляет собой разведение тестируемого образца от 0,01% до 1% или составляет 0,01%, 0,02%, 0,03%, 0,04%, 0,05%, 0,06%, 0,07%, 0,08%, 0,09%, 0,1%, 0,15%, 0,2%, 0,25%, 0,3%, 0,35%, 0,4%, 0,45%, 0,5%, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9% или 1%, или от 0,1% до 0,8%, или от 0,2% до 0,75%, или составляет 0,5%; второе разведение представляет собой разведение тестируемого образца от 5% до 39% или составляет 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38% или 39%, или от 15% до 30%, или от 15% до 25%, или составляет 20%; и третье разведение представляет собой разведение тестируемого образца от 0,001% до 0,009% или 0,001%, 0,002%, 0,003%, 0,004%, 0,005%, 0,006%, 0,007%, 0,008% или 0,009%, или от 0,002% до 0,008%, или от 0,003% до 0,007%, или составляет 0,005%.

37. Способ по п.21, в котором первое разведение представляет собой разведение тестируемого образца от 0,01% до 1% или составляет 0,01%, 0,02%, 0,03%, 0,04%, 0,05%, 0,06%, 0,07%, 0,08%, 0,09%, 0,1%, 0,15%, 0,2%, 0,25%, 0,3%, 0,35%, 0,4%, 0,45%, 0,5%, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9% или 1%, или от 0,1% до 0,8%, или от 0,2% до 0,75%, или составляет 0,5%; второе разведение представляет собой разведение тестируемого образца от 0,001% до 0,009% или составляет 0,001%, 0,002%, 0,003%, 0,004%, 0,005%, 0,006%, 0,007%, 0,008% или 0,009%, или от 0,002% до 0,008%, или от 0,003% до 0,007%, или составляет 0,005%; и третье разведение представляет собой разведение тестируемого образца от 5% до 39% или составляет 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38% или 39%, или от 15% до 30%, или от 15% до 25%, или составляет 20%.

38. Способ по п.21, в котором первое разведение представляет собой разведение тестируемого образца от 5% до 39% или составляет 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38% или 39%, или от 15% до 30%, или от 15% до 25%, или составляет 20%, второе разведение представляет собой разведение тестируемого образца от 0,01% до 1% или составляет 0,01%, 0,02%, 0,03%, 0,04%, 0,05%, 0,06%, 0,07%, 0,08%, 0,09%, 0,1%, 0,15%, 0,2%, 0,25%, 0,3%, 0,35%, 0,4%, 0,45%, 0,5%, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9% или 1%, или от 0,1% до 0,8%, или от 0,2% до 0,75%, или составляет 0,5%; и третье разведение представляет собой разведение тестируемого образца от 0,001% до 0,009% или 0,001%, 0,002%, 0,003%, 0,004%, 0,005%, 0,006%, 0,007%, 0,008% или 0,009%, или от 0,002% до 0,008%, или от 0,003% до 0,007%, или составляет 0,005%.

39. Способ по п.21, в котором первое разведение представляет собой разведение тестируемого образца от 5% до 39% или составляет 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38% или 39%, или от 15% до 30%, или от 15% до 25%, или составляет 20%; второе разведение представляет собой разведение тестируемого образца от 0,001% до 0,009% или составляет 0,001%, 0,002%, 0,003%, 0,004%, 0,005%, 0,006%, 0,007%, 0,008% или 0,009%, или от 0,002% до 0,008%, или от 0,003% до 0,007%, или составляет 0,005%; и третье разведение представляет собой разведение тестируемого образца от 0,01% до 1% или составляет 0,01%, 0,02%, 0,03%, 0,04%, 0,05%, 0,06%, 0,07%, 0,08%, 0,09%, 0,1%, 0,15%, 0,2%, 0,25%, 0,3%, 0,35%, 0,4%, 0,45%, 0,5%, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9% или 1%, или от 0,1% до 0,8%, или от 0,2% до 0,75%, или составляет 0,5%.