ЦИТИДИН-5-КАРБОКСАМИД МОДИФИЦИРОВАННЫЕ НУКЛЕОТИДНЫЕ КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ, ОТНОСЯЩИЕСЯ К НИМ Российский патент 2020 года по МПК C07H19/06 C07H21/00 

РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

Данная заявка заявляет приоритет согласно 35 U.S.C. §119(e) предварительной заявки США серийный номер 61/907274, поданной 21 ноября 2013 г., включенной в данную заявку путем ссылки во всей ее полноте.

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Данная заявка в общем относится к области химии нуклеиновых кислот, конкретно к модифицированному в 5-положении цитозину, а также к его фосфорамидитным и трифосфатным производным. Данная заявка также относится к способам их получения и применения. Данная заявка включает использование модифицированных нуклеозидов как части олигонуклеотида или аптамера.

В данную заявку включен, во всей своей полноте, Перечень последовательностей под названием "Последовательности 0057.65PCT_ST25", созданный 2 октября 2014 г., размер 2 килобайта.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Модифицированные нуклеозиды использовали в качестве терапевтических агентов, диагностических агентов и для введения в олигонуклеотиды для улучшения их свойств (например, стабильности).

SELEX (Систематическая эволюция лигандов экспоненциальным обогащением) представляет собой способ идентификации олигонуклеотидов (имеющих название "аптамеры"), которые селективно связывают молекулы-мишени. Процесс SELEX описан в патенте США № 5270163, содержание которого включено в данную заявку путем ссылки по всей его полноте. Способ SELEX включает отбор и идентификацию олигонуклотидов из статистической смеси олигонуклеотидов для получения виртуально любого желаемого критерия афинности связывания и селективности. Путем введения конкретных типов нуклеозидов в олигонуклеотиды, идентифицированные в ходе SELEX, нуклеазная стабильность, суммарный заряд, гидрофильность или липофильность могут быть изменены для обеспечения различий в трехмерной структуре и способностей олигонуклеотидов к связыванию мишеней. Таким образом, различные модифицированные нуклеозиды обеспечивают способность "настраивать" желательные свойства олигонуклеотида, выбранного в ходе SELEX.

Модифицированные дезоксиуридиновые нуклеотиды, имеющие N-замещенную-карбоксамидную группу в 5-положении, как было доказано, являются ценными инструментами для улучшения отбора in vitro протеин-связывающих аптамеров (SELEX процесс) (см., например, Gold et al., 2010; Hollenstein, 2012; и Imaizumi et al., 2013) и для пост-SELEX оптимизации связующих и фармакокинетических свойств выбранных аптамеров (см., например, Davies, et al., 2012; Lee et al., 2010; Kerr et al., 2000; и Gaballah et al., 2002). Общий синтез уридин-5-карбоксамидов на основе обычного активированного сложноэфирного промежуточного соединения, 5-(2,2,2-трифтороэтоксикарбонил)-2'-дезоксиуридина (1), был первоначально сообщен Matsuda и соавторами (см., например Nomura et al., 1997). Обработка этого активированного сложного эфира различными первичными аминами (1,2 экв., 60°C, 4 часа) приводит к получению соответствующих 5-(N-замещенных-карбоксамидов). Matsuda также описал аналогичный активированный сложный эфир в цитидиновом ряду, N-ацетил-5-(2,2,2-трифтороэтоксикарбонил)-2'-дезоксицитидин (см., например Nomura et al., 1996). Однако, данное промежуточное соединение было менее практически полезным для синтеза цитидин-5-карбоксамидов ввиду лабильности N-ацетил защитной группы и нестабильности N-ацетил-5-йодо-цитидиновых синтетических предшественников.

Все еще существует потребность в альтернативной композиции для усовершенствования агентов, связывающих олигонуклеотиды, и в дополнительных способах синтеза таких композиций. Данная заявка удовлетворяет данные потребности путем представления новых цитидин-5-карбоксамид модифицированных композиций.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Данная заявка описывает модифицированный в 5-положении цитозин, а также его фосфорамидитные и трифосфатные производные, и способы их получения и применения.

В одном аспекте, данная заявка представляет соединение, имеющее структуру, показанную на Формуле I:

Формула I

где

R независимо представляет собой -(CH₂)_n-, где n представляет собой целое число, выбранное из 0, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10;

R^X1 независимо выбран из группы, состоящей из:

где * означает место присоединения R^X1 группы к -(CH₂)_n- группе; и где

R^X4 независимо выбран из группы, состоящей из замещенных или незамещенных разветвленного или линейного низшего алкила (C1-C20); гидроксильной группы; галогена (F, Cl, Br, I); нитрила (CN); бороновой кислоты (BO₂H₂); карбоновой кислоты (COOH); сложного эфира карбоновой кислоты (COOR^X2); первичного амида (CONH₂); вторичного амида (CONHR^X2); третичного амида (CONR^X2R^X3); сульфонамида (SO₂NH₂); N-алкилсульфонамида (SONHR^X2);

R^X2 и R^X3 независимо, в каждом случае, выбраны из группы, состоящей из замещенных или незамещенных разветвленного или линейного низшего алкила (C1-C20); фенила (C₆H₅); R^X4 замещенного фенильного кольца (R^X4C₆H₄), где R^X4 определен выше; карбоновой кислоты (COOH); сложного эфира карбоновой кислоты (COOR^X5), где R^X5 представляет собой разветвленный или линейный низший алкил (C1-C20); и циклоалкила, где R^X2 и R^X3 вместе образуют замещенное или незамещенное 5 или 6-членное кольцо;

X независимо выбран из группы, состоящей из -H, -OH, -OMe, -O-аллила, -F, -OEt, -OPr, -ОСН₂СН₂ОСН₃, -NH₂ и -азидо;

R' независимо выбран из группы, состоящей из -H, -OAc; -OBz; -P(NiPr₂)(OCH₂CH₂CN); и -OSiMe₂tBu;

R" независимо выбран из группы, состоящей из водорода, 4,4'-диметокситритила (DMT) и трифосфата (-P(O)(OH)-O-P(O)(OH)-O-P(O)(OH)₂) или его соли;

Z независимо выбран из группы, состоящей из -H, замещенных или незамещенных разветвленного или линейного низшего алкила (C1-C4);

и их солей;

со следующими исключениями:

если n = 4, то R^X1 не может представлять собой H;

если n = 3, то R^X1 не может представлять собой СН₃;

если n =0, то R^X1 не может представлять собой -CH(CH₃)₂; и если n = 2, и R^X1 представляет собой и R^X4 представляет собой гидроксил, то R^X1 не может представлять собой

В связанном аспекте n представляет собой целое число, выбранное из 1, 2 или 3.

В связанном аспекте, R^X1 выбран из группы, состоящей из:

и

где

* означает место присоединения R^X1 группы к -(CH₂)_n- группы; и

Z независимо выбран из группы, состоящей из -H, замещенного или незамещенного разветвленного или линейного низшего алкила (C1-C4).

В связанном аспекте, R^X4 независимо выбран из группы, состоящей из разветвленного или линейного низшего алкила (C1-C6); -OH; -F и карбоновой кислоты (COOH).

В связанном аспекте, X независимо выбран из группы, состоящей из -H, -OH, -OMe и -F.

В связанном аспекте, R' выбран из группы, состоящей из -H, -OAc и -P(NiPr₂)(OCH₂CH₂CN).

В связанном аспекте, R'' представляет собой трифосфат (-P(O)(OH)-O-P(O)(OH)-O-P(O)(OH)₂).

В другом аспекте, данная заявка представляет соединение, имеющее структуру, выбранную из группы, состоящей из Формул II (BndC), III (PEdC), IV (PPdC), V (NapdC), VI (2NapdC), VII (NEdC) и VIII (2NEdC):

где

X независимо выбран из группы, состоящей из-H, -OH, -OMe, -O-аллила, -F, -OEt, -OPr, -OCH₂CH₂OCH₃, -NH₂ и -азидо.

В другом аспекте, данная заявка представляет молекулу нуклеиновой кислоты, содержащей любое из соединений, описанных выше.

В связанном аспекте, молекула нуклеиновой кислоты содержит РНК, ДНК или их комбинацию.

В связанном аспекте, молекула нуклеиновой кислоты имеет от 15 до 100 нуклеотидов в длину.

В связанном аспекте, молекула нуклеиновой кислоты представляет собой аптамер.

В связанном аспекте, по меньшей мере один дополнительный нуклеотид молекулы нуклеиновой кислоты содержит химическую модификацию, выбранную из группы, состоящей из модификации сахара в 2'-положении включая, но не ограничиваясь приведенным, 2'-амино (2'-NH₂), 2'-фторо (2'-F), 2'-O-метил (2'-OMe), 2'-O-этил (2'-OEt), 2'-O-пропил (2'-OPr), 2'-O-CH₂CH₂OCH₃ и азидо.

В другом аспекте, данная заявка представляет молекулу нуклеиновой кислоты, содержащей соединение, имеющее структуру, показанную на Формуле IA:

Формула IA,

где

R независимо представляет собой -(CH₂)_n-, где n представляет собой целое число, выбранное из 0, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10;

R^X1 независимо выбран из группы, состоящей из:

где * означает место присоединения R^X1 группы к -(CH₂)_n- группе; и где,

R^X4 независимо выбран из группы, состоящей из разветвленного или линейного низшего алкила (C1-C20); гидроксильной группы; галогена (F, Cl, Br, I); нитрила (CN); бороновой кислоты (BO₂H₂); карбоновой кислоты (COOH); сложного эфира карбоновой кислоты (COOR^X2); первичного амида (CONH₂); вторичного амида (CONHR^X2); третичного амида (CONR^X2R^X3); сульфонамида (SO₂NH₂); N-алкилсульфонамида (SONHR^X2);

R^X2 и R^X3 независимо, в каждом случае, выбраны из группы, состоящей из разветвленного или линейного низшего алкила (C1-C20); фенила (С₆Н₅); R^X4 замещенного фенильного кольца (R^X4C₆H₄), где R^X4 определен выше; карбоновой кислоты (COOH); сложного эфира карбоновой кислоты (COOR^X5), где R^X5 представляет собой разветвленный или линейный низший алкил (C1-C20); и циклоалкила, где R^X2 и R^X3 вместе образуют замещенное или незамещенное 5 или 6-членное кольцо;

X независимо выбран из группы, состоящей из -H, -OH, -OMe, -O-аллила, -F, -OEt, -OPr, -ОСН₂СН₂ОСН₃, NH₂ и -азидо;

Z независимо выбран из группы, состоящей из -H, замещенного или незамещенного C(1-4)алкила;

и его солей;

со следующими исключениями:

если n = 4, то R^X1 не может представлять собой H;

если n = 3, то R^X1 не может представлять собой СН₃;

если n =0, то R^X1 не может представлять собой -CH(CH₃)₂; и

если n = 2, и R^X1 представляет собой и R^X4 представляет собой гидроксил то R^X1 не может представлять собой

В связанном аспекте, n представляет собой 1, 2 или 3.

В связанном аспекте, R^X1 выбран из группы, состоящей из:

и

где* означает место присоединения R^X1 группы к -(CH₂)_n- группе; и

Z независимо выбран из группы, состоящей из -H, замещенного или незамещенного C(1-4)алкила.

В связанном аспекте, R^X4 независимо выбран из группы, состоящей из разветвленного или линейного низшего алкила (C1-C6); -OH; -F и карбоновой кислоты (COOH).

В связанном аспекте, X независимо выбран из группы, состоящей из -H, -OH, -OMe и -F.

В связанном аспекте, R' выбран из группы, состоящей из -H, -OAc и -P(NiPr₂)(OCH₂CH₂CN).

В связанном аспекте, R" представляет собой трифосфат (-P(O)(OH)-O-P(O)(OH)-O-P(O)(OH)₂).

В связанном аспекте, молекула нуклеиновой кислоты содержит ДНК, РНК или их комбинацию.

В связанном аспекте, молекула нуклеиновой кислоты составляет от 15 до 100 нуклеотидов в длину.

В связанном аспекте, молекула нуклеиновой кислоты представляет собой аптамер.

В связанном аспекте, по меньшей мере один дополнительный нуклеотид молекулы нуклеиновой кислоты содержит химическую модификацию, выбранную из группы, состоящей из модификации сахара в 2'-положении, независимо выбранную из группы, состоящей из 2'-амино (2'-NH₂), 2'-фторо (2'-F), 2'-O-метила (2'-OMe), 2'-O-этила (2'-OEt), 2'-O-пропила (2'-OPr), 2'-О-СН₂СН₂ОСН₃ и азидо.

В связанном аспекте, молекула нуклеиновой кислоты дополнительно содержит модификацию, выбранную из группы, состоящей из модификации каркаса, 3' конца, 5' конца и их комбинации.

В связанном аспекте, соединение имеет структуру, выбранную из группы, состоящей из Формул IIA, IIIA, IVA, VA, VIA, VIIA и VIIIA:

где

X независимо выбран из группы, состоящей из -H, -OH, -OMe, -O-аллила, -F, -OEt, -OPr, -OCH₂CH₂OCH₃, NH₂ и -азидо.

В другом аспекте, данная заявка представляет способ получения соединения, формулы I:

Формула I

где

R независимо представляет собой -(CH₂)_n-, где n представляет собой целое число, выбранное из 0, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10;

R^X1 независимо выбран из группы, состоящей из:

где, * означает место присоединения R^X1 группы к -(CH₂)_n- группы; и где,

R^X4 независимо выбран из группы, состоящей из разветвленного или линейного низшего алкила (C1-C20); гидроксильной группы; галогена (F, Cl, Br, I); нитрила (CN); бороновой кислоты (BO₂H₂); карбоновой кислоты (COOH); сложного эфира карбоновой кислоты (COOR^X2); первичного амида (CONH₂); вторичного амида (CONHR^X2); третичного амида (CONR^X2R^X3); сульфонамида (SO₂NH₂); N-алкилсульфонамида (SONHR^X2);

R^X2 и R^X3 независимо , в каждом случае, выбраны из группы, состоящей из разветвленного или линейного низшего алкила (C1-C20); фенила (С₆Н₅); R^X4 замещенного фенильного кольца (R^X4C₆H₄), где R^X4 определен выше; карбоновой кислоты (COOH); сложного эфира карбоновой кислоты (COOR^X5), где R^X5 представляет собой разветвленный или линейный низший алкил (C1-C20); и циклоалкила, где R^X2 и R^X3 вместе образуют замещенное или незамещенное 5 или 6-членное кольцо;

X независимо выбран из группы, состоящей из-H, -OH, -OMe, -O-аллила, -F, -OEt, -OPr, -OCH₂CH₂OCH₃, NH₂ и -азидо;

Z независимо выбран из группы, состоящей из -H, замещенного или незамещенного C(1-4)алкила;

способ включает обеспечение соединения, Формулы IX

Формула IX

где

R^X6 представляет собой группу йода или брома;

R^X7 и R^X8 независимо представляют собой, в каждом случае, водород или защитную группу;

X независимо выбран из группы, состоящей из -H, -OH, -OMe, -O-аллила, -F, -OEt, -OPr, -OCH₂CH₂OCH₃, NH₂ и -азидо; и

превращение соединения Формулы IX реакцией, катализируемой палладием(0) в присутствии R^X1-R-NH₂, монооксида углерода и растворителя; и

выделение соединения Формулы I.

В связанном аспекте, R^X6 представляет собой группу йода.

В связанном аспекте, R^X7 и R^X8 представляют собой водород.

В связанном аспекте, X выбран из группы, состоящей из -H, -OMe и -F.

В связанном аспекте, n представляет собой 1, 2 или 3.

В связанном аспекте, R^X1 выбран из группы, состоящей из:

и

где

* означает место присоединения R^X1 группы к -(CH₂)_n- группе; и

Z независимо выбран из группы, состоящей из -H, замещенного или незамещенного C(1-4)алкила.

В связанном аспекте, R^X4 независимо выбран из группы, состоящей из a разветвленного или линейного низшего алкила (C1-C6); -OH; -F и карбоновой кислоты (COOH).

В связанном аспекте, R' выбран из группы, состоящей из -H, -OAc и -P(NiPr₂)(OCH₂CH₂CN).

В связанном аспекте, R" представляет собой водород или трифосфат (-P(O)(OH)-O-P(O)(OH)-O-P(O)(OH)₂).

В связанном аспекте, защитную группу выбран из группы, состоящей из трифенилметила, п-анизилдифенилметила, ди-п-анизилдифенилметила, п-диметокситритилтритила, формила, трет-бутилоксикарбонила, бензилоксикарбонила, 2-хлоробензилоксикарбонила, 4-хлоробензоилоксикарбонила, 2,4-дихлоробензоилоксакарбонила, фурфурилкарбонила, трет-амилоксикарбонила, адамантилоксикарбонила, 2-фенилпропил-(2)-оксикарбонила, 2-(4-бифенил)пропил-(2)-оксикарбонила, 2-нитрофенилсульфенила и дифенилфосфинила.

В связанном аспекте, растворитель выбран из группы, состоящей из диметилформамида (ДМФ), дихлорметана (ДХМ), тетрагидрофурана (ТГФ), этил ацетата, ацетона, ацетонитрила (MeCN), диметилсульфоксида (ДМСО) и пропилен карбоната.

В другом аспекте, данная заявка представляет способ получения соединения, Формулы, выбранную из группы, состоящей из Формул II, III, IV, V, VI, VII и VIII

где

X независимо выбран из группы, состоящей из -H, -OH, -OMe, -O-аллила, -F, -OEt, -OPr, -OCH₂CH₂OCH₃, NH₂ и -азидо;

способ включает обеспечение соединения, Формулы IX

Формула IX

где

R^X6 представляет собой группу йода или брома;

R^X7 и R^X8 независимо представляют собой, в каждом случае, водород или защитную группу;

X независимо выбран из группы, состоящей из -H, -OH, -OMe, -O-аллила, -F, -OEt, -OPr, -OCH₂CH₂OCH₃ и -азидо; и

превращение соединения Формулы IX реакцией, катализируемой палладием(0) в присутствии R^X1-R-NH₂, монооксида углерода и растворителя; и

выделение соединения, Формулы, выбранную из группы, состоящей из Формул II, III и IV.

В связанном аспекте, R^X6 представляет собой группу йода.

В связанном аспекте, R^X7 и R^X8 представляют собой водород.

В связанном аспекте, X выбран из группы, состоящей из -H, -OMe и -F.

В связанном аспекте, защитную группу выбран из группы, состоящей из трифенилметила, п-анизилдифенилметила, ди-п-анизилдифенилметила, п-диметокситритилтритила, формила, трет-бутилоксикарбонила, бензилоксикарбонила, 2-хлоробензилоксикарбонила, 4-хлоробензоилоксикарбонила, 2,4-дихлоробензоилоксакарбонила, фурфурилкарбонила, трет-амилоксикарбонила, адамантилоксикарбонила, 2-фенилпропил-(2)-оксикарбонила, 2-(4-бифенил)пропил-(2)-оксикарбонила, 2-нитрофенилсульфенила и дифенилфосфинила.

В связанном аспекте, растворитель выбран из группы, состоящей из диметилформамида (ДМФ), дихлорметана (ДХМ), тетрагидрофурана (ТГФ), этил ацетата, ацетона, ацетонитрила (MeCN), диметилсульфоксида (ДМСО) и пропилен карбоната.

Данная заявка дополнительно представляет способ выбора аптамера нуклеиновой кислоты, имеющего афинность связывания с молекулой-мишенью, включающий: (a) приведение в контакт кандидатной смеси и мишени, где кандидатная смесь содержит модифицированные нуклеиновые аптамеры, в которых один, несколько или все из пиримидинов в по меньшей мере одном, или каждом, аптамере нуклеиновой кислоты кандидатной смеси содержат соединение, описанное в данном документе (цитозин, модифицированный в 5-положении), и где аптамеры нуклеиновой кислоты, имеющие афинность связывания с молекулой-мишенью, образуют комплексы аптамеров нуклеиновой кислоты и молекул-мишеней; (b) разделение комплексов аптамеров нуклеиновой кислоты и молекул-мишеней из кандидатной смеси; (c) диссоциацию комплексов аптамеров нуклеиновой кислоты и молекул-мишеней с получением несвязанных аптамеров нуклеиновой кислоты; (d) амплификацию несвязанных аптамеров нуклеиновой кислоты с получением аптамеров нуклеиновой кислоты, имеющих увеличенный полупериод диссоциации, из молекулы-мишени относительно других нуклеиновых кислот в кандидатной смеси; (e) идентификацию по меньшей мере одного аптамера нуклеиновой кислоты, где аптамер нуклеиновой кислоты имеет афинность связывания с молекулой-мишенью.

В другом аспекте, стадии a) - d) повторяют со смесью аптамеров нуклеиновой кислоты, обогащенных последовательностями нуклеиновых кислот, способных связывать молекулу-мишень и имеющих низкую скорость диссоциации при связывании с молекулой-мишенью для дополнительного обогащения последовательностями нуклеиновых кислот, способных связывать молекулу-мишень и имеющих низкую скорость диссоциации при связывании с молекулой-мишенью.

В другом аспекте, скорость диссоциации медленной диссоциации аптамера нуклеиновой кислоты составляет от приблизительно 2 минут до приблизительно 360 минут (или приблизительно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 45, 60, 75, 90, 105, 120, 150, 180, 210, 240, 270, 300, 330 или 360 минут).

В другом аспекте скорость диссоциации медленной диссоциации аптамера нуклеиновой кислоты превышает или равна приблизительно 2 минутам (или более чем приблизительно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 45, 60, 75, 90, 105, 120, 150, 180, 210, 240, 270, 300, 330 или 360 минут). В другом аспекте молекула-мишень представляет собой белок или пептид. В другом аспекте молекулу-мишень выбран из группы, состоящей из PSCK9 белка, PSMA белка, ERBB2 белка и ERBB3 белка.

В другом аспекте по меньшей мере один аптамер нуклеиновой кислоты способен связывать молекулу-мишень с константой равновесного связывания (K_d) менее чем 100 нМ, или от приблизительно 0,1 нМ до приблизительно 100 нМ (или от 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100 нМ).

В другом аспекте, способы, описанные в данном документе, дополнительно включают воздействие на кандидатную смесь медленного диссоциативного процесса обогащения.

В другом аспекте, медленный диссоциативный процесс обогащения с низкой скоростью диссоциации выполняют перед стадией (b). В связанном аспекте, медленный диссоциативный процесс обогащения выбран из группы, состоящей из добавления конкурентной молекулы, стадии разбавления, комбинации добавления конкурентной молекулы с последующей стадией разбавления, комбинации стадии разбавления с последующим добавлением конкурентной молекулы, и комбинации одновременного добавления конкурентной молекулы и стадии разбавления.

В еще одном связанном аспекте, конкурентная молекула представляет собой полианион. В другом аспекте, конкурентную молекулу выбран из группы, состоящей из олигонуклеотида, dNTPs, гепарина и декстран сульфата.

Описанные выше и другие объекты, признаки и преимущества данного изобретения станут более очевидными из приведенного ниже подробного описания, в котором приведены ссылки на фигуры, которые прилагаются.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фигура 1 иллюстрирует изображение на полиакриламидном геле анализа удлинения праймера при помощи DNTP, как описано в разделе Материалы и Методы Примеров. Полоса 1: dAdGdT (5% полноразмерный); Полоса 2: dAdGdTdC (100% полноразмерный); Полоса 3: dAdGdT + 9a (119% полноразмерный); Полоса 4: dAdGdT + 9b (113% полноразмерный); Полоса 5: dAdGdT + 9c (120% полноразмерный); Полоса 6: 20/200 ДНК лэддер. Обращаясь к данной фигуре, можно увидеть, что все три модифицированных цитидин трифосфата были включены по меньшей мере так же эффективно, как природный немодифицированный 2'-дезоксицитидин в данном анализе.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Если не указано иное, технические термины используются в соответствии с обычной практикой применения. Определения общих терминов в области молекулярной биологии может быть найдено в Benjamin Lewin, Genes V, опубликована Oxford University Press, 1994 (ISBN 0-632-02182-9); и Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, опубликована VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8).

Если не объяснено иным образом, все технические и научные термины, используемые в данном документе, имеют такое же значение, которое обычно понимает любой специалист в данной области техники, к которой относится данная заявка. Термины единственного числа, где * означает место присоединения R^X1 группы к -(CH₂)_n- группе; и где * означает место присоединения R^X1 группы к -(CH₂)_n- группе; и формы единственного числа, включают ссылки на множественное число, если из контекста явно не следует иное. "Содержащий А или В" означает содержащий А, или В, или А и В. Дополнительно должно быть понятно, что все размеры оснований или размеры аминокислот, и все значения молекулярного веса или молекулярной массы, приведенные для нуклеиновых кислот или полипептидов, являются приблизительными и приведены для описания.

Дополнительно, диапазоны, представленные в данном документе, понимаются как сокращенный вариант для всех значений в пределах данного диапазона. Например, диапазон от 1 до 50 следует понимать как включающий любое число, комбинацию чисел, или поддиапазон группы, состоящей из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, или 50 (а также их дробных значений, если из контекста явно не следует иное). Любой диапазон концентраций, диапазон процентов, диапазон соотношений, или диапазон целых чисел следует понимать как включающий значение любого целого числа внутри указанного диапазона и, если необходимо, его дробного значения (например, от одной десятой до одной сотой целого числа), если не указано иное. Также, любой числовой диапазон, приведенный в данном документе, относящийся к любому физическому признаку, такому как полимерные субъзвенья, размер или толщина, следует понимать, как включающий любое целое число в указанном диапазоне, если не указано иное. Как используют в данном документе, "приблизительно" или "состоящий в основном из» означает ± 20% от указанного диапазона, значения или структуры, если не указано иное. Как используют в данном документе, термины" включать "и" содержать "являются не ограничивающими (допускающими включения) и используются как синонимы. Следует понимать, что термины, указывающие на единственное число, как используют в данном документе, относятся к «одному или более» вышеперечисленных компонентов. Использование альтернативы (например, "или") должно пониматься как обозначение одной, двух, или любой их комбинаций альтернатив.

Хотя способы и материалы, аналогичные или эквивалентные описанным в данном документе, могут быть использованы на практике или при тестировании данного изобретения, подходящие способы и материалы описаны ниже. Все публикации, патентные заявки, патенты и другие ссылки, упомянутые в данном документе, включены в качестве ссылки во всей их полноте. В случае конфликта, настоящее описание, включая разъяснения терминов, будет превалировать. Дополнительно, материалы, способы и примеры являются только иллюстративными и не предназначены для ограничения.

Как используют в данном документе, термин "нуклеотид" относится к рибонуклеотиду или дезоксирибонуклеотиду или их модифицированным формам, а также их аналогам. Нуклеотиды включают виды, которые включают пурины (например, аденин, гуанин гипоксантин, и их производные и аналоги), а также пиримидины (например, цитозин, урацил, тимин и их производные и аналоги).

Как используют в данном документе, термин "C-5 модифицированный карбоксамидцитидин" или "цитидин-5-карбоксамид" относится к цитидину с карбоксамидной (-C(O)NH-) модификацией в положении С-5 цитидина включая, но не ограничиваясь ими, фрагменты (R^x1), проиллюстрированные в данном документе. Примеры C-5 модифицированного карбоксамидцитидина включают, но не ограничивается ими, 5-(N-бензилкарбоксамид)-2'-дезоксицитидин (под названием "BndC" и показанный ниже, как Формула (II), 5-(N-2-фенилэтилкарбоксамид)-2'-дезоксицитидин (под названием"PEdC" и показанный ниже, как Формула (III), 5-(N-3-фенилпропилкарбоксамид) -2'-дезоксицитидин (под названием "PPdC" и показанный ниже, как Формула (IV); 5-(N-1-нафтилметилкарбоксамид)-2'-дезоксицитидин (под названием "NapdC" и показанный ниже, как Формула (V); 5-(N-2-нафтилметилкарбоксамид)-2'-дезоксицитидин (под названием "2NapdC "и показанный ниже, как Формула (VI); 5-(N-1-нафтил-2-этилкарбоксамид)-2'-дезоксицитидин (под названием "NEDC" и показанный ниже, как Формула (VII); и 5-(N-2-нафтил-2-этилкарбоксамид)-2'-дезоксицитидин (под названием "2NEdC" и показанный ниже, как Формула (VIII):

Химические модификации С-5 модифицированных цитидинов, описанные в данном документе, также могут быть объединены с, по отдельности или в любой комбинации, модификациями сахарами в 2'-положении, модификациями в экзоциклических аминах и замещением 4-тиоцитидина и тому подобное.

Соли

Может быть удобным или желательным получить, очистить и/или обработать соответствующую соль соединения, например, фармацевтически приемлемую соль. Примеры фармацевтически приемлемых солей описаны в Berge et al. (1977) "Pharmaceutically Acceptable Salts" J. Pharm. Sci. 66:1-19.

Например, если соединение является анионным или имеет функциональную группу, которая может быть анионной (например, -СООН, может быть -СОО^-), то соль может быть образована с подходящим катионом. Примеры подходящих неорганических катионов включают, но не ограничиваются ими, ионы щелочных металлов, таких как Na⁺ и K⁺, щелочноземельных катионов, таких как Ca²⁺ и Mg²⁺, и другие катионы, такие как Al⁺³. Примеры подходящих органических катионов включают, но не ограничиваются ими, ион аммония (т.е. NH₄ ⁺) и замещенные ионы аммония (например, NH₃R^X+, NH₂R^X₂⁺, NHR^X₃⁺, NR^X₄⁺). Примерами некоторых подходящих замещенных аммониевых ионов являются те, которые получают из: этиламина, диэтиламина, дициклогексиламина, триэтиламина, бутиламина, этилендиамина, этаноламина, диэтаноламина, пиперизина, бензиламина, фенилбензиламина, холина, меглумина, и трометамина, также аминокислот, таких как лизин и аргинин. Пример общего четвертичного аммониевого иона представляет собой N(СН₃)₄⁺.

Если соединение является катионным или имеет функциональную группу, которая может быть катионной (например, -NH₂ может быть -СН₃⁺), то соль может быть образована с помощью подходящего аниона. Примеры подходящих неорганических анионов включают, но не ограничиваются ими, соли, полученные из следующих неорганических кислот: соляной, бромистоводородной, йодистоводородной, серной, сернистой, азотной, азотистой, фосфорной и фосфористой.

Примеры подходящих органических анионов включают, но не ограничиваются ими, соли, полученные из следующих органических кислот: 2-ацетилоксибензойной, уксусной, аскорбиновой, аспарагиновой, бензойной, камфорсульфоновой, коричной, лимонной, эдетовой, этандисульфоновой, этансульфоновой, фумаровой, глицефтоновой, глюконовой, глутаминовой, гликолевой, гидроксималеиновой, гидроксинафталин карбоновой, изэтионовой, молочной, лактобионовой, лауриновой, малеиновой, яблочной, метансульфоновой, слизевой, олеиновой, щавелевой, пальмитиновой, памоиновой, пантотеновой, фенилуксусной, фенилсульфоновой, пропионовой, пировиноградной, салициловой, стеариновой, янтарной, сульфаниловой, винной, толуолсульфоновой, и валериановой. Примеры подходящих полимерных органических анионов включают, но не ограничиваются ими, соли, полученные из следующих полимерных кислот: дубильной кислоты, карбоксиметил целлюлозы.

Если не указано иное, то ссылка на конкретное соединение также включает его солевые формы.

Получение олигонуклеотидов

В одном аспекте, настоящее изобретение относится к способам с использованием модифицированных нуклеозидов, описанных в данном документе, отдельно или в комбинации с другими модифицированными нуклеозидами и/или природными нуклеозидами, чтобы получить модифицированные олигонуклеотиды. Автоматизированный синтез олигодезоксинуклеозидов является рутинной практикой во многих лабораториях (см например, Matteucci, M. D. and Caruthers, M. H., (1990) J. Am. Chem. Soc, 103:3185-3191, содержание которой полностью включено в данный документ посредством ссылки). Синтез олигорибонуклеозидов также хорошо известен (см. например Scaringe, S. A., et al., (1990) Nucleic Acids Res. 18:5433-5441, содержание которой полностью включено в данный документ посредством ссылки). Как отмечалось в данном документе, фосфорамидиты полезны для включения модифицированного нуклеозида в олигонуклеотид путем химического синтеза, а трифосфаты полезны для включения модифицированного нуклеозида в олигонуклеотид путем ферментативного синтеза. (См например, Vaught, J. D. et al. (2004) J. Am. Chem. Soc, 126:11231-11237; Vaught, J. V., et al. (2010) J. Am. Chem. Soc. 132,4141-4151; Gait, M. J. "Oligonucleotide Synthesis a practical approach" (1984) IRL Press (Oxford, UK); Herdewijn, P. "Oligonucleotide Synthesis" (2005) (Humana Press, Totowa, N.J. (каждая из которых полностью включена в данный документ в качестве ссылки).

Как используют в данном документе, термины "модифицировать", "модифицированный", "модификация", и любые их вариации, когда используются по отношению к олигонуклеотиду, означаютт, что по меньшей мере одно из четырех составных нуклеотидных оснований (т.е., A, G, T/U, и C) олигонуклеотида представляет собой аналог или сложный эфир природного нуклеотида. В некоторых вариантах реализации изобретения модифицированный нуклеотид придает устойчивость олигонуклеотиду к действию нуклеаз. Дополнительные модификации могут включать модификации каркаса, метилирования, необычные комбинации спаривания оснований, такие как изооснования изоцитидина и изогуанидина и тому подобное. Модификации могут также включать 3'- и 5' модификации, такие как кэппинг. Другие модификации могут включать замещение одного или более из природных нуклеотидов аналогом, межнуклеотидные модификации, такие как, например, модификации незаряженными связями (например, метил фосфонаты, сложные фосфотриэфиры, фосфороамидаты, карбаматы и т.д.), и модификации заряженными связями (например, фосфоротиоаты, фосфородитиоаты и т.д.), модификации интеркаляторами (например, акридином, псораленом и т.д.), модификации, содержащие комплексоны (например, металлы, радиоактивные металлы, бор, окислительные металлы и т.д.), модификации, содержащие алкилирующие агенты, и модификации модифицированными связями (например, альфа-аномерными нуклеиновыми кислотами и т.д.). Дополнительно, любая из гидроксильных групп, обычно присутствующих на сахаре нуклеотида, может быть замещена фосфонатной группой или фосфатной группой; защищенными стандартными защитными группами; или активирована для получения дополнительных связей с дополнительными нуклеотидами или на твердой подложке. 5' и 3' концевые ОН-группы могут быть фосфорилированными или замещенным аминами, органическими фрагментами кэппинг-групп от приблизительно 1 до приблизительно 20 атомов углерода, полиэтиленгликолевыми (ПЭГ) полимерами в одном варианте реализации изобретения в диапазоне от приблизительно 10 до приблизительно 80 кДа, ПЭГ полимерами в другом варианте реализации изобретения, начиная от приблизительно 20 до приблизительно 60 кДа или другими гидрофильными или гидрофобными биологическими или синтетическими полимерами.

Полинуклеотиды могут также содержать аналогичные формы рибозных или дезоксирибозных сахаров, которые обычно известны в данной области, в том числе 2'-O-метил, 2'-O-аллил, 2'-O-этил, 2'-О-пропил, 2'-O-CH₂CH₂OCH₃, 2'-фторо, 2'-NH₂ или 2'-азидо, карбоциклические аналоги сахара, α-аномерные сахара, эпимерные сахара, такие как арабиноза, ксилозы или ликмсозы, пиранозные сахара, фуранозные сахара, седогептулозы, ациклические аналоги и лишенные оснований аналоги нуклеозидов, такие как метил рибозид. Как отмечалось в настоящем документе, одна или несколько сложных фосфодиэфирных связей могут быть заменены альтернативными связывающими группами. Эти альтернативные связывающие группы включают варианты, где фосфат замещен на P(O)S ("тиоат"), P(S)S ("дитиоат"), (O)NR^X₂ ("амидат"), P(O)R^x, P(O)OR^X1, CO или CH₂ ("формацеталь"), где каждый R^x или R^X1 независимо представляют собой Н или замещенный или незамещенный алкил (С1-С20), необязательно содержащий эфирную (-O-) связь, арил, алкенил, циклоалкил, циклоалкенил или аральдил. Не все связи в полинуклеотиде должны быть идентичными. Замещение аналогичных форм сахаров, пуринов и пиримидинов может быть полезным при разработке конечного продукта, и может быть альтернативой каркасным структурам, таким как полиамидный каркас, например.

Полинуклеотиды могут также содержать аналогичные формы карбоциклических аналогов сахара, α-аномерных сахаров, эпимерных сахаров, таких как арабиноза, ксилозы или ликсозы, пиранозных сахаров, фуранозных сахаров, седогептулоз, ациклических аналогов и лишенных оснований аналогов нуклеозида, таких как метил рибозид.

Если присутствует, модификация нуклеотидной структуры может быть придана до или после сборки полимера. Последовательность нуклеотидов может быть прервана ненуклеотидными компонентами. Полинуклеотид может быть дополнительно модифицирован после полимеризации, например, путем конъюгации с компонентом маркировки.

Как используют в данном документе, "нуклеиновая кислота", "олигонуклеотид" и "полинуклеотид" используются как взаимозаменяемые для обозначения полимера нуклеотидов и включают ДНК, РНК, ДНК/РНК гибриды и модификации этих видов нуклеиновых кислот, олигонуклеотидов и полинуклеотидов, где включено присоединение различных групп или фрагментов к нуклеотидным звеньям в любом положении. Термины "полинуклеотид", "олигонуклеотид," и "нуклеиновая кислота "включают двух- или одноцепочечные молекулы, а также молекулы с тройными спиралями. Нуклеиновые кислоты, олигонуклеотид, и полинуклеотид представляют собой более широкие термины, чем термин аптамеры и, таким образом, термины нуклеиновая кислота, олигонуклеотид, и полинуклеотид включают полимеры нуклеотидов, которые являются аптамерами, но термины нуклеиновая кислота, олигонуклеотид, и полинуклеотид не ограничиваются аптамерами.

В определенных вариантах реализации изобретения, данная заявка представляет способ получения молекулы нуклеиновой кислоты, содержащей соединение, имеющее Формулу I:

Формула I

где

R независимо представляет собой -(CH₂)_n-, где n представляет собой целое число, выбранное из 0, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10;

R^X1 независимо выбран из группы, состоящей из

где

* означает место присоединения R^X1 группы к -(CH₂)_n- группе; и где,

R^X4 независимо выбран из группы, состоящей из разветвленного или линейного низшего алкила (C1-C20); гидроксильной группы; галогена (F, Cl, Br, I); нитрила (CN); бороновой кислоты (BO₂H₂); карбоновой кислоты (COOH); сложного эфира карбоновой кислоты (COOR^X2); первичного амида (CONH₂); вторичного амида (CONHR^X2); третичного амида (CONR^X2R^X3); сульфонамида (SO₂NH₂); N-алкилсульфонамида (SONHR^X2);

R^X2 и R^X3 независимо, в каждом случае, выбраны из группы, состоящей из разветвленного или линейного низшего алкила (C1-C20); фенила (С₆Н₅); R^X4 замещенного фенильного кольца (R^X4C₆H₄), где R^X4 определен выше; карбоновой кислоты (COOH); сложного эфира карбоновой кислоты (COOR^X5), где R^X5 представляет собой разветвленный или линейный низший алкил (C1-C20); и циклоалкила, где R^X2 и R^X3 вместе образуют замещенное или незамещенное 5 или 6-членное кольцо;

X независимо выбран из группы, состоящей из-H, -OH, -OMe, -O-аллила, -F, -OEt, -OPr, -OCH₂CH₂OCH₃, NH₂ и -азидо;

R' независимо выбран из группы, состоящей из -H, -OAc; -OBz; -P(NiPr₂)(OCH₂CH₂CN); и -OSiMe₂tBu;

R" независимо выбран из группы, состоящей из водорода, 4,4'-диметокситритила (DMT) и трифосфата (-P(O)(OH)-O-P(O)(OH)-O-P(O)(OH)₂) или его соли;

Z независимо выбран из группы, состоящей из -H, замещенного или незамещенного C(1-4)алкила; и его солей,

способ включает синтез молекулы нуклеиновой кислоты имеющей несколько нуклеотидов и по меньшей мере одно соединение Формулы I.

В определенных вариантах реализации изобретения, данная заявка представляет способ получения молекулы нуклеиновой кислоты, содержащей соединения, имеющие формулу, выбранную из группы, состоящей из Формул II, III, IV, V, VI, VII и VIII:

где X независимо выбран из группы, состоящей из-H, -OH, -OMe, -O-аллила, -F, -OEt, -OPr, -OCH₂CH₂OCH₃, NH₂ и -азидо;

где способ включает синтез молекулы нуклеиновой кислоты, имеющей несколько нуклеотидов, и по меньшей мере одно соединение Формулы, выбранной из группы, состоящей из Формул II, III и IV.

Как используют в данном документе, термин "по меньшей мере один нуклеотид", когда речь идет о модификациях нуклеиновой кислоты, относится к одному, нескольким или всем нуклеотидам в нуклеиновой кислоте, указывая, что любой или все случаи появления любого или всех А, С, Т, G или U в нуклеиновой кислоте могут быть модифицированы или не модифицированы.

В других аспектах, в данном документе описаны способы использования модифицированных нуклеозидов, описанных в данном документе, отдельно или в комбинации с другими модифицированными нуклеозидами и/или природными нуклеозидами, чтобы получить аптамеры и SOMAмеры (описаны в данном документе). В конкретных вариантах реализации изобретения, аптамеры и SOMмеры получают в соответствии с общим SELEX или усовершенствованным SELEX способом, как описано ниже.

Как используют в данном документе, "лиганд нуклеиновой кислоты", "аптамер", "SOMAМЕР," и "клон" используются взаимозаменяемо для обозначения неприродной нуклеиновой кислоты, которая имеет желаемое действие на молекулы-мишени. Желаемое действие включает, но не ограничивается приведенным, связывание мишени, каталитическое изменение мишени, реакцию с мишенью таким образом, который модифицирует или изменяет мишень или функциональную активность мишени, ковалентное присоединение к мишени (как ингибитора самоубийства), и облегчение протекания реакции между мишенью и другой молекулой. В одном варианте реализации изобретения действие является специфической аффинностью связывания с молекулой-мишенью, например молекула-мишень имеет трехмерную химическую структуру, отличную от полинуклеотида, который связывается с лигандом нуклеиновой кислоты с помощью механизма, который не зависит от спаривания оснований по Уотсону/Крику или формирования тройной спирали, где аптамер не является нуклеиновой кислотой, имеющей известную физиологическую функцию, будучи связанным с молекулой-мишенью. Аптамеры к данной мишени включают нуклеиновые кислоты, которые определены из кандидатной смеси нуклеиновых кислот, где аптамер представляет собой лиганд мишени, способом, включающим: (а) приведение в контакт кандидатной смеси и мишени, где нуклеиновые кислоты, имеющие повышенную афинность к мишени относительно других нуклеиновых кислот в кандидатной смеси, могут быть отделена от остальной кандидатной смеси; (b) отделение нуклеиновых кислот с повышенной афинностью от остатка кандидатной смеси; и (с) амплификацию нуклеиновых кислот с повышенной афинностью с получением лиганд-обогащенной смеси нуклеиновых кислот, в результате чего будут определены аптамеры молекулы-мишени. Следует признать, что афинные взаимодействия - вопрос степени; однако, в этом контексте, "афинность специфического связывания" аптамера с его мишенью означает, что аптамер связывается со своей мишенью в целом с гораздо более высокой степенью афинности, чем он связывается с другим, не являющимся мишенью, компонентом в смеси или образце. "Аптамер", "SOMAмер," или "нуклеиново-кислотный лиганд" представляет собой набор копий одного типа или вида молекулы нуклеиновой кислоты, которая имеет определенную нуклеотидную последовательность. Аптамер может содержать любое требуемое количество нуклеотидов. "Аптамеры" относятся к более чем одному такому набору молекул. Различные аптамеры могут иметь одинаковые или различные количества нуклеотидов. Аптамеры могут быть ДНК или РНК и могут быть одноцепочечными, двухцепочечными, или содержать двухцепочечные или трехцепочечные участки.

Как используют в данном документе, "SOMAмер" или модифицированный аптамер с низкой скоростью диссоциации, относится к аптамерам с улучшенными характеристиками скорости диссоциации. SOMAмеры могут быть созданы с помощью улучшенных способов SELEX, описанных в патенте США № 7947447, под названием "Способ генерации аптамеров с улучшенными скоростями диссоциации".

Как используют в данном документе, "белок" используют как синоним "пептида", "полипептида" или "пептидного фрагмента." "Очищенный" полипептид, белок, пептид, или пептидный фрагмент по существу не содержит клеточного материала или других загрязняющих белков из клеток, тканей или бесклеточного источника, из которых получена аминокислотная последовательность, или по существу не содержит химических предшественников или других химических веществ при химическом синтезе.

Способ SELEX

Термины "SELEX" и "способ SELEX" используют в данном документе взаимозаменяемо для обозначения в общем комбинации (1) выделения нуклеиновых кислот, которые взаимодействуют с молекулой-мишенью желательным образом, например связыванием с высокой аффинностью к белку, и (2) амплификации этих выбранных нуклеиновых кислот. Способ SELEX может быть использован для идентификации аптамеров с высокой афинностью к конкретной молекуле-мишени или биомаркеру.

SELEX, как правило, включает получение кандидатной смеси нуклеиновых кислот, связывание кандидатной смеси с желаемой молекулой-мишенью с образованием аффинного комплекса, отделение афинных комплексов от несвязанных кандидатных нуклеиновых кислот, отделение и выделение нуклеиновой кислоты из аффинного комплекса, очищение нуклеиновых кислот и идентификацию определенной аптамерной последовательности. Способ может включать несколько раундов, чтобы дополнительно улучшить афинность выбранного аптамера. Способ может включать стадии амплификации в одном или нескольких моментах времени в процессе. См., например, патент США № 5475096, под названием "Лиганды нуклеиновых кислот." Способ SELEX можно использовать для генерации аптамера, который ковалентно связывается его мишенью, а также аптамера, который нековалентно связывается с его мишенью. См., например, патент США № 5705337 под названием " Систематическая эволюция лигандов экспоненциальным обогащением: Chemi-SELEX".

Способ SELEX может быть использован для идентификации аптамеров с высокой афинностью, содержащих модифицированные нуклеотиды, придающие улучшенные характеристики аптамерам, такие как, например, улучшенная in vivo стабильность или улучшенные характеристики доставки. Примеры таких модификаций включают химические замещения в рибозных и/или фосфатных положениях, и/или положениях оснований. Идентифицированные при помощи способа SELEX аптамеры, содержащие модифицированные нуклеотиды, описаны в патенте США № 5660985, под названием "Высокоафинные лиганды нуклеиновых кислот, содержащие модифицированные нуклеотиды", который описывает олигонуклеотиды, содержащие производные нуклеотидов, химически модифицированные в 5'- и 2'-положениях пиримидинов. Патент США № 5580737, см. выше, описывает весьма специфические аптамеры, содержащие один или более нуклеотидов, модифицированных 2'-амино (2'-NH₂), 2'-фторо (2'-F), и/или 2'-O-метил (2'-OMe). См. также публикацию заявки на патент США № 20090098549, под названием "SELEX и ФОТОSELEX", которая описывает библиотеки нуклеиновых кислот, имеющие улучшенные физические и химические свойства, и их использование в SELEX и фотоSELEX.

SELEX могут быть также использован для идентификации аптамеров, которые имеют желаемые характеристики скорости диссоциации. См. патент США № 7947447, под названием "Способ генерации аптамеров с улучшенными скоростями диссоциации», который включен в данный документ в качестве ссылки во всей своей полноте, и описывает улучшенные способы SELEX для генерирования аптамеров, которые могут связываться с молекулами-мишенями. Описаны способы получения аптамеров и фотоаптамеров, имеющих более низкие скорости диссоциации, из их молекул-мишеней. Способы включают приведение в контакт кандидатной смеси с молекулой-мишенью, позволяя образование комплексов нуклеиновых кислот-мишеней, а также выполнение медленного диссоциативного процесса обогащения, где комплексы нуклеиновых кислот-мишеней с быстрыми скоростями диссоциации диссоциируют и не образуются повторно, а комплексы с медленной скоростью диссоциации остаются интактными. Дополнительно, эти способы включают использование модифицированных нуклеотидов в производстве кандидатных смесей нуклеиновых кислот, чтобы генерировать аптамеры с улучшенной скоростью диссоциации (см. патент США № 8409795, под названием "SELEX и фотоSELEX"). (См. также патент США № 7855054 и патентную публикацию США № 20070166740). Каждая из этих заявок включена в данный документ в качестве ссылки во всей своей полноте.

"Мишень" или "молекула-мишень" или "мишень" относится в данном документе к любому соединению, на которое нуклеиновая кислота может действовать желательным образом. Молекула-мишень может быть белком, пептидом, нуклеиновой кислотой, углеводом, липидом, полисахаридом, гликопротеином, гормоном, рецептором, антигеном, антителом, вирусом, возбудителем, токсичным веществом, субстратом, метаболитом, аналогом в переходном состоянии, кофактором, ингибитором, лекарственным средством, красителем, питательным веществом, фактором роста, клеткой, тканью, любой частью или фрагментом любого из вышеперечисленных и т.п., без ограничений. Практически любой химический или биологический эффектор может быть подходящей мишенью. Молекулы любого размера могут служить в качестве мишеней. Мишень может быть также модифицирована определенными способами повышения вероятности или силы взаимодействия между мишенью и нуклеиновой кислотой. Мишень может также включать любое незначительное изменение конкретного соединения или молекулы, такое как, в случае белка, например, незначительные вариации аминокислотной последовательности, образование дисульфидной связи, гликозилирование, липидизацию, ацетилирование, фосфорилирование, или любое другое использование или изменение, такие как сопряжение с компонентом маркировки, которые по существу не изменяют идентичность молекулы. "Молекула-мишень" или "мишень" представляет собой набор копий одного типа или вида молекулы или многомолекулярной структуры, который способен связывать с аптамером. «Молекулы-мишени" или "мишени" относятся к более чем одному из такого набора молекул. Варианты реализации способа SELEX, где мишень представляет собой пептид, описаны в патенте США № 6376190 под названием "Модифицированные процессы SELEX без очищенного белка".

Как используют в данном документе, "конкурентная молекула" и "конкурент" используются как взаимозаменяемые для обозначения любой молекулы, которая может образовывать неспецифический комплекс с молекулой, которая не является мишенью. В этом контексте, молекула, которая не является мишенью, включает свободные аптамеры, где, например, конкурент может быть использован для связывания ингибирования аптамера (повторного связывания), не-специфично, к другой молекуле, которая не является мишенью. "Конкурентная молекула" или "конкурент" представляет собой набор копий одного типа или вида молекулы. "Конкурентные молекулы" или "конкуренты" относятся к более чем одному из такого набора молекул. Конкурентные молекулы включают, но не ограничиваются ими, олигонуклеотиды, полианионы (например, гепарин, ДНК спермы сельди, ДНК спермы лосося, тРНК, декстран сульфат, полидекстран, лишенные оснований сложные фосфодиэфирные полимеры, дНТФ, и пирофосфат). В различных вариантах реализации изобретения может быть использована комбинация одного или более конкурентов.

Как используют в данном документе, "неспецифический комплекс" относится к нековалентной ассоциации между двумя или несколькими молекулами, другими, чем аптамеры и его молекула-мишень. Неспецифический комплекс представляет собой взаимодействие между классами молекул. Неспецифические комплексы включают комплексы, образованные между аптамером и молекулой, которая не является мишенью, конкурентом и молекулой, которая не является мишенью, конкурентом и молекулой-мишенью, и молекулой-мишенью и молекулой, которая не является мишенью.

Как используют в данном документе, термин "медленный диссоциативный процесс обогащения» относится к процессу изменения относительных концентраций определенных компонентов кандидатной смеси таким образом, что относительная концентрация афинных комплексов аптамеров, имеющих медленные скорости диссоциации, увеличивается по отношению к концентрации афинных комплексов аптамеров, имеющих более быстрые, менее желательные скорости диссоциации. В одном варианте реализации изобретения медленный диссоциативный процесс обогащения является медленным диссоциативным процессом обогащения в растворе. В этом варианте реализации изобретения, медленный диссоциативный процесс обогащения в растворе происходит в растворе, так что ни мишень, ни нуклеиновые кислоты, образующие афинные аптамерные комплексы в смеси, не иммобилизованы на твердой подложке во время медленного диссоциативного процесса обогащения. В различных вариантах реализации изобретения, медленный диссоциативный процесс обогащения может включать одну или несколько стадий, в том числе добавление и инкубацию с конкурентной молекулой, разбавление смеси, или их комбинацию (например, разбавление смеси в присутствии конкурентной молекулы). Поскольку эффект медленного диссоциативного процесса обогащения, как правило, зависит от различных скоростей диссоциации различных аптамерных афинных комплексов (т.е. аптамерных афинных комплексов, образованных между молекулой-мишенью и разными нуклеиновыми кислотами в кандидатной смеси), продолжительность медленного диссоциативного процесса обогащения выбран таким образом, чтобы сохранить высокую пропорцию аффинных аптамерных комплексов, имеющих низкие скорости диссоциации, при этом значительно снизив количество аффинных аптамерных комплексов, имеющих высокие скорости диссоциации. Медленный диссоциативный процесс обогащения может быть использован в одном или нескольких циклах в способе SELEX. Если разбавление и добавление конкурента используют в комбинации, они могут быть выполнены одновременно или последовательно, в любом порядке. Медленный диссоциативный процесс обогащения может быть использован, когда общая концентрация мишени (белка) в смеси является низкой. В одном варианте реализации изобретения, когда медленный диссоциативный процесс обогащения включает разбавление, то смесь может быть разбавлена настолько, насколько это практически возможно, имея в виду, что сохранившие аптамеры нуклеиновые кислоты восстанавливают для последующих раундов в способе SELEX. В одном варианте исполнения изобретения медленный диссоциативный процесс обогащения включает использование конкурента, а также разбавление, позволяя меньшее разбавление смеси, чем может быть необходимо, без использования конкурента.

В одном варианте реализации изобретения, медленный диссоциативный процесс обогащения включает добавление конкурента, а конкурент представляет собой полианион (например, гепарин или декстран сульфат (декстран)). Гепарин и декстран были использованы при идентификации конкретных аптамеров в предыдущих отборах SELEX. В таких способах, однако, гепарин или декстран присутствуют в течение стадии уравновешивания, на которой мишень и аптамеры связываются с образованием комплексов. В таких способах, по мере возрастания концентрации гепарина или декстрана, соотношение комплексов высокоаффинных мишеней/аптамеров и комплексов низкоаффинных мишеней/аптамеров возрастает. Тем не менее, высокая концентрация гепарина или декстрана может уменьшить количество комплексов высокоаффинных мишеней/аптамеров при равновесии из-за конкуренции связывания мишени между нуклеиновой кислотой и конкурентом. В отличие от этого, описываемые способы добавляют конкурент после того как было позволено образование комплексов мишень/аптамер, и, следовательно, он не влияет на количество образующихся комплексов. Добавление конкурента после равновесного связывания происходило между мишенью и аптамерами и создавало неравновесное состояние, которое развивалось во времени до установления нового равновесия с меньшим количеством комплексов мишени/аптамеры. Захват комплексов мишени/аптамеры до установления нового равновесия обогащает образец аптамерами с низкой скоростью диссоциации, поскольку комплексы с высокой скоростью диссоциации будут диссоциировать первым.

В другом варианте реализации изобретения полианионный конкурент (например, декстран сульфат или другой полианионный материал) используют в медленном диссоциативном процессе обогащения для облегчения идентификации аптамера, который поддается воздействию полианиона. В этом контексте, "стойкий к полианиону аптамер" представляет собой аптамер, который способен образовывать комплекс аптамер/мишень, который с меньшей вероятностью диссоциирует в растворе, который также содержит стойкий к полианиону материал, чем комплекс аптамер/мишень, который содержит не стойкий к полианиону аптамер. Таким образом, стойкие к полианиону аптамеры могут быть использованы при выполнении аналитических методов для обнаружения присутствия или количества или концентрации мишени в образце, где способ детектирования включает использование полианионного материала (например декстран сульфата), к которому аптамер является стойким.

Таким образом, в одном варианте реализации изобретения, представлен способ получения стойкого к полианиону аптамера. В этом варианте реализации изобретения после приведения в контакт кандидатной смеси нуклеиновых кислот и мишени, мишени и нуклеиновым кислотам в кандидатной смеси позволяли прийти к равновесию. Полианионный конкурент вводили и инкубировали в растворе в течение периода времени, достаточного, чтобы обеспечить диссоцииацию из молекулы-мишени большинства аптамеров с высокой скоростью диссоциации в кандидатной смеси. Также, аптамеры в кандидатной смеси, которые могут диссоциировать в присутствии полианионного конкурента, высвобождаются из молекулы-мишени. Смесь разделяют, чтобы выделить аптамеры с высокой афинностью, медленной скоростью диссоциации, которые остались в ассоциации с молекулой-мишенью, и удалить любые несвязанные в комплекс материалы из раствора. Аптамер затем может быть высвобожден из молекулы-мишени и выделен. Выделенный аптамер также может быть амплифицирован и дополнительный раунд отбора применен для увеличения общей производительности выбранных аптамеров. Этот процесс также может быть использован с минимальным временем инкубации, если выбор аптамеров с низкой скоростью диссоциации не требуется для конкретного применения.

Таким образом, в одном варианте реализации изобретения модифицированный способ SELEX предназначен для идентификации или производства аптамеров, имеющих низкие (медленные) скорости диссоциации, где молекулу-мишень и кандидатную смесь приводят в контакт и инкубируют вместе в течение периода времени, достаточного для равновесного связывания между молекулой-мишенью и нуклеиновыми кислотами, содержащимися в кандидатной смеси. После равновесного связывания избыток конкурирующей молекулы, например, полианионного конкурента, добавляют к смеси и смесь инкубируют вместе с избытком конкурентной молекулы в течение заданного периода времени. Значительная часть аптамеров, имеющих скорости диссоциации, меньшие этого заданного периода инкубации, будет диссоциировать из мишени в течение заданного периода инкубации. Повторная ассоциация этих аптамеров с "быстрой" диссоциацией и мишеней сведена к минимуму из-за избытка конкурентной молекулы, которая может неспецифично связываться с мишенью и занимать целевые сайты связывания. Значительная часть аптамеров с более низкими скоростями диссоциации останется связанной в комплекс с мишенью в течение заданного периода инкубации. В конце инкубационного периода, разделение комплексов нуклеиновых кислот и мишеней из оставшейся части смеси позволяет отделить популяцию аптамеров с низкими скоростями диссоциации от аптамеров с высокими скоростями диссоциации. Стадия диссоциации может быть использована для диссоциации аптамеров с низкими скоростями диссоциации из их мишеней и позволяет выделение, идентификацию, секвенирование, синтез и амплификацию аптамеров с низкой скоростью диссоциации (либо отдельных аптамеров, либо из группы аптамеров с низкой скоростью диссоциации), которые имеют высокую афинность и специфичность в отношении молекулы-мишени. Как и в обычном SELEX, аптамерные последовательности, идентифицированные из одного раунда модифицированного способа SELEX, могут быть использованы в синтезе новой кандидатной смеси таким образом, что стадии контактирования, равновесного связывания, добавления конкурирующей молекулы, инкубации с конкурентной молекулой и разделения аптамеров с низкой скоростью диссоциации могут повторяться (иметь несколько итераций) столько раз, сколько требуется.

Комбинация позволения равновесного связывания кандидатной смеси и мишени перед добавлением конкурента, с последующим добавлением избытка конкурента и инкубацией с конкурентом в течение заданного периода времени, позволяет выбрать популяцию аптамеров, имеющих скорости диссоциации, которые значительно превышают те, которые были ранее достигнуты.

Для достижения равновесного связывания, кандидатную смесь можно инкубировать с мишенью в течение по меньшей мере приблизительно 5 минут, или по меньшей мере приблизительно 15 минут, приблизительно 30 минут, приблизительно 45 минут, приблизительно 1 часа, приблизительно 2 часов, приблизительно 3 часов, приблизительно 4 часов, приблизительно 5 часов или приблизительно 6 часов.

Заданный инкубационный период конкурентной молекулы со смесью кандидатной смеси и молекулы-мишени может быть выбран по желанию с учетом таких факторов, как природа мишени и известные скорости диссоциации (если таковые имеются) известных аптамеров для мишени. Заданные инкубационные периоды могут быть выбраны из: по меньшей мере приблизительно 5 минут, по меньшей мере приблизительно 10 минут, по меньшей мере приблизительно 20 минут, по меньшей мере приблизительно 30 минут, по меньшей мере 45 приблизительно минут, по меньшей мере приблизительно 1 часа, по меньшей мере приблизительно 2 часов, по меньшей мере приблизительно 3 часов, по меньшей мере приблизительно 4 часов, по меньшей мере приблизительно 5 часов, по меньшей мере приблизительно 6 часов.

В других вариантах реализации изобретения разбавление используют в качестве процесса увеличения скорости диссоциации и инкубации разбавленной кандидатной смеси, комплекс молекула-мишень/аптамер может быть получен в течение заданного периода времени, который может быть выбран из: по меньшей мере приблизительно 5 минут, по меньшей мере приблизительно 10 минут, по меньшей мере приблизительно 20 минут, по меньшей мере приблизительно 30 минут, по меньшей мере приблизительно 45 минут, по меньшей мере приблизительно 1 часа, по меньшей мере приблизительно 2 часов, по меньшей мере приблизительно 3 часов, по меньшей мере приблизительно 4 часов, по меньшей мере приблизительно 5 часов, по меньшей мере приблизительно 6 часов.

Варианты реализации данного изобретения касаются идентификации, производства, синтеза и использования аптамеров с низкой скоростью диссоциации. Они представляют собой аптамеры, которые имеют скорость диссоциации (t_1/2) из нековалентного комплекс аптамер-мишень, которая выше, чем у аптамеров, которые обычно получают с помощью обычного SELEX. Для смеси, содержащей нековалентные комплексы аптамеров и мишени, t_1/2 представляет собой время, необходимое для того, чтобы половина аптамеров диссоциировала из комплексов аптамер-мишень. t_1/2 аптамеров с низкой скоростью диссоциации в соответствии с данным изобретением выбрана из одного из: более или равной приблизительно 30 минут; от приблизительно 30 минут и приблизительно 240 минут; от приблизительно 30 минут до приблизительно 60 минут; от приблизительно 60 минут до приблизительно 90 минут, от приблизительно 90 минут до приблизительно 120 минут; от приблизительно 120 минут до приблизительно 150 минут; от приблизительно 150 минут до приблизительно 180 минут; от приблизительно 180 минут до приблизительно 210 минут; от приблизительно 210 минут до приблизительно 240 минут.

Отличительным признаком аптамера, идентифицированного с помощью процедуры SELEX, является его высокая афинность к его мишени. Аптамер будет иметь константу диссоциации (k_d) для его мишени, которая выбрана из одного из: менее чем приблизительно 1 мкм, менее чем приблизительно 100 нМ, менее чем приблизительно 10 нМ, менее чем приблизительно 1 нМ, менее чем приблизительно 100 пМ, менее чем приблизительно 10 пМ, менее чем приблизительно 1пМ.

Химический синтез

Способы химического синтеза соединений, предусмотренных в данном изобретении, описаны в данном документе. Эти и/или другие известные способы могут быть изменены и/или адаптированы известными способами, чтобы облегчить синтез дополнительных соединений, предусмотренных в данном изобретении.

Со ссылкой на Схему 1, данная заявка также относится к способу синтеза 3'-фосфорамидита из С-5 модифицированного аминокарбонилпиримидина. Со ссылкой на Схему 1, стоит отметить, что катализируемую палладием реакцию монооксида углерода и основания с 5-замещенным нуклеозидом осуществляют при давлениях монооксида углерода, меньших или равных 2 атмосферам; более конкретно от 0,1 до 2 атмосфер (или 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9 или 2 атмосфер), а еще более конкретно при 1 атмосфере. Реакция при этих пониженных давлениях приводит к повышению выходов и получению более чистого продукта, чем предыдущие способы, которые были выполнены при давлениях между 3 и 4 атмосфер [50 фунтов на кв.дюйм].

Со ссылкой на Схему 2, данная заявка также относится к способу синтеза 5'-трифосфата C-5 модифицированного аминокарбонилпиримидина, включающему:

В определенных вариантах реализации изобретения защитную группу выбран из группы, состоящей из трифенилметила, п-анизилдифенилметила, ди-п-анизилдифенилметила, п-диметокситритилтритила, формила, трет-бутилоксикарбонила, бензилоксикарбонила, 2-хлоробензилоксикарбонила, 4-хлоробензоилоксикарбонила, 2,4-дихлоробензоилоксакарбонила, фурфурилкарбонила, трет-амилоксикарбонила, адамантилоксикарбонила, 2-фенилпропил- (2)-оксикарбонила, 2-(4-бифенил) пропил-(2) -оксикарбонила, 2-нитрофенилсульфенила и дифенилфосфинила.

Следующие примеры приведены для иллюстрации определенных конкретных признаков и/или вариантов реализации изобретения. Эти примеры не следует рассматривать как ограничивающие данное изобретение конкретными признаками или описанными вариантами реализации данного изобретения.

ПРИМЕРЫ

Пример 1: Синтез 5-(N-бензилкарбоксамид)-2'-дезоксицитидина

Данный пример представляет способы получения 5-(N-бензилкарбоксамид)-2'-дезоксицитидина (или BndC; см. Схему 1 (4a) ниже). Кратко, коммерчески доступный 5-йодо-2'-дезоксицитидин (3) превращали в соответствующий N-замещенный карбоксамид (4a-c) путем обработки необходимым ароматическим первичным амином RCH₂NH₂ (5-10 экв.), монооксидом углерода (</= 1 атм.), и (Ph₃P)₄Pd (2 мол %) в N,N-диметилформамиде (ДМФ) при комнатной температуре в течение 24-48 часов (Схема 1). Избыток первичного амина и ограниченное количество монооксида углерода были необходимы для ограничения образования 2-кетокарбоксамидных побочных продуктов (см., например, Uozumi, Y. et al. (2001) и Takacs et al. 2008). Модифицированные нуклеозидные продукты (4a-c) были легко очищены путем перекристаллизации из спирта.

Исходные вещества: 5-йодо-2'-дезоксицитидин; 5-йодо-2'-O-метил-цитидин; 5-йодо-2'-дезокси-2'-флуроцитидин были приобретены у ChemGenes Corporation (Уилмингтон, Массачусетс 01887, США) или Thermo Fisher Scientific Inc. (Уолтем, Массачусетс 02454, США). Монооксид углерода (безопасность: ядовитый газ) 99,9% чистоты был приобретен у Specialty Gases of America (Толедо, Огайо 43611, США). Все остальные реагенты были приобретены у Sigma-Aldrich (Милоуоки, Висконсин 53201, США) и использованы в том виде, в котором получены.

5-(N-бензилкарбоксамид)-2'-дезоксицитидин (4a): Наполненную аргоном 1-литровую колбу с круглым дном загружали: 5-йодо-2'-дезоксицитидином (30 грамм, 85 ммоль); бензиламином (109,3 грамм, 1020 ммоль, 12 экв.); и безводным N,N-диметилформамидом (ДМФ, 205 мл). Смесь быстро перемешивали на магнитной мешалке до растворения всех твердых веществ. Полученный в результате раствор дегазировали двумя циклами вакуумирования до 50 мм и повторно наполняли аргоном. Смесь бис(дибензилиденацетон)палладия(0) (978 мграмм, 1,7 ммоль, 0,02 экв.) и трифенилрфосфина (1,92 грамм, 7,3 ммоль, 0,086 экв.) добавляли и полученную в результате тонкодисперсную черную суспензию быстро перемешивали, вакуумировали до 50 мм и заполняли монооксидом углерода (1 атм) из резинового баллона. Смесь перемешивали при комнатной температуре (~20°С) и периодически повторно заполняли монооксидом углерода. Через 26 часа, завершение реакции было подтверждено при помощи ТСХ анализа (силикагель, элюент: 15% метанол/85% дихлорметан (об./об.), R_f(SM) = 0,3, R_f(4a) = 0,4). Реакционную смесь разбавляли этилацетатом (205 мл), фильтровали, и промывали 65% этилацетат/35% ДМФ (100 мл). Прозрачный зеленый фильтрат концентрировали на роторном испарителе (50-80°С, 1-2 мм) до отгонки растворителей и большей части бензиламина. Темно-оранжевый остаток (~75 грамм) растворяли в горячем абсолютном этаноле (650 мл) и быстро фильтровали в горячем состоянии для удаления небольшого количества нерастворимых хлопьев (~2 грамма). Прозрачный фильтрат оставляли охлаждаться при медленном перемешивании и продукт кристаллизовался в виде иголок. После перемешивания в течение ночи, суспензию фильтровали и остаток на фильтре промывали ледяным этанолом (100 мл). После высушивания в вакууме, продукт (4a) получали в виде белого кристаллического твердого вещества: 22,0 грамма, 72% выход. ¹H ЯМР (500 МГц, d6-ДМСО): δ = 8,73 (т, J=5,8 Гц, 1H), 8,42 (c, 1H), 8,06 (уш.с., 1H), 7,75 (уш.с., 1H), 7,32 (м, 4H), 7,25 (м, 1H), 6,14 (т, J=6,5 Гц, 1H), 5,24 (д, J=4,4 Гц, 1H), 5,03 (т, J=5,5 Гц, 1H), 4,42 (дд, J=15,4, 7,2 Гц, 1H), 4,41 (дд, J=15,4, 7,3 Гц, 1H), 4,26 (м, J=4,3 Гц, 1H), 3,83 (дд, J=7,9, 4,3 Гц, 1H), 3,64 (м, 1H), 3,58 (м, 1H), 2,19 (м, 2H), ¹³C ЯМР (500 МГц, d6-ДМСО): δ = 165,88 (1С), 163,97 (1С), 153,99 (1С), 144,26 (1С), 139,64 (1С), 128,80 (2C), 127,60 (2C), 127,30 (1С), 99,20 (1С), 88,08 (1С), 86,29 (1С), 70,44 (1С), 61,50 (1С), 42,72 (1С), 40,62 (1С). МС m/z: [M^-] рассч. для C₁₇H₁₉N₄O₅,359,36; найдено, 359,1 (ESI^-).

4-N-Ацетил-5-(N-бензилкарбоксамид)-2'-дезоксицитидин (5a): В 1 литровую колбу с круглым дном загружали (4a) (20,0 грамм, 55,4 ммоль), и безв. тетрагидрофуран (ТГФ, 500 мл). Тщательно перемешанную смесь обрабатывали уксусным ангидридом (26,4 мл, 277 ммоль, 5 экв.) и смесь нагревали при 50°С в течение 20 часов. ТСХ анализ аликвоты (гомогенизированной путем растворения в 50% метанол/50% дихлорметан) показал завершение реакции (силикагель, элюент: 15% метанол/85% дихлорметан (об./об.), R_f(4a) = 0,4, R_f(5a) = 0,6). Суспензию охлаждали до 5-10°С в течение 1 часа, фильтровали, и промывали холодным ТГФ (40 мл). Высушивание в вакууме приводило к получению продукта (5a) в виде белых кристаллических игл, 20,4 грамма, 91% выход. ¹H ЯМР (500 МГц, d6-ДМСО): δ =11,35 (c, 1Н), 8,98 (т, J=5,7 Гц, 1H), 8,73 (c, 1H), 7,34 (д, J=4,4 Гц, 4H), 7,26 (м, J=4,3 Гц, 1H), 6,10 (т, J=6,1 Гц, 1H), 5,28 (д, J=4,4 Гц, 1H), 5,09 (т, J=5,4 Гц, 1H), 4,44 (дд, J=15,3, 8,1 Гц, 1H), 4,43 (дд, J=15,2, 8,1 Гц, 1H), 4,28 (д.т., J=9,8, 4,0 Гц, 1H), 3,91 (дд, J=7,9, 4,0 Гц, 1H), 3,68 (м, 1H), 3,60 (м, 1H), 2,41 (c, 3H), 2,34 (м, 1H), 2,22 (м, 1H), ¹³C ЯМР (500 МГц, d6-ДМСО): δ = 171,27 (1С), 165,49 (1С), 159,77 (1С), 153,19 (1С), 146,24 (1С), 139,16 (1С), 128,82 (2C), 127,76 (2C), 127,41 (1С), 100,32 (1С), 88,67 (1С), 87,50 (1С), 70,11 (1С), 61,17 (1С), 43,00 (1С), 40,78 (1С), 26,70 (1С). МС m/z: [M^-] рассч. для C₁₉H₂₁N₄O₆,401,40; найдено, 401,1 (ESI^-).

5'-O-(4,4'-Диметокситритил)-4-N-ацетил-5-(N-бензилкарбоксамид)-2'-дезоксицитидин (6a): В 250 мл колбу с круглым дном загружали (5a) (4,82 грамма, 12 ммоль) и безводный пиридин (40 мл). Полученный в результате бесцветный раствор перемешивали при помощи магнитной мешалки и 4,4'-диметокситритил хлорид (4,47 грамма, 13,2 ммоль, 1,1 экв.) добавляли пятью порциями в течение одного часа. Оранжево-желтый раствор перемешивали в течение еще 30 минут, гасили этанолом (4,2 мл, 72 ммоль), и концентрировали на роторном испарителе (1-2 мм, <35°С). Полученный в результате липкий оранжевый остаток (~13 грамм) разделяли этилацетатом (100 мл) и охлажденным, насыщенным водным бикарбонатом натрия (50 мл). Органический слой высушивали сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали, оставляя желтую пену. Очисткой флэш-хроматографией (силикагель, элюент: 1% триэтиламин/99% этилацетат, R_f(6a) = 0,4) получали (6a) как белую пену, 6,1 грамм, 72% выход. ¹H ЯМР(500 МГц, d6-ДМСО): δ = 11,44 (c, 1H), 9,12 (т, J=5,5 Гц, 1H), 8,46 (c, 1H), 7,38 (д, J=7,4 Гц, 2H), 7,25 (м, 12H), 6,84 (м, 4H), 6,10 (т, J=6,1 Гц, 1H), 5,34 (д, J=4,7 Гц, 1H), 4,20 (м, 3H), 4,05 (м, 1H), 3,72 (д, J=1,7 Гц, 6H), 3,41 (дд, J=10,5, 6,0 Гц, 1H), 3,20 (дд, J=10,4, 3,5 Гц,1H), 2,44 (c, 3H), 2,39 (м, 1H), 2,25 (м, 1H), ¹³C ЯМР (500 МГц, d6-ДМСО): δ = 171,28 (1С), 165,38 (1С), 159,88 (1С), 158,53 (2C), 153,07 (1С), 146,13 (1С), 145,26 (1С), 138,91 (1С), 136,00 (1С), 135,98 (1С), 130,16 (2C), 130,11 (2C), 128,78 (2C), 128,28 (2C), 128,13 (2C), 127,84 (2C), 127,46 (1С), 127,14 (1С), 113,60 (4C), 100,32 (1С), 88,04 (1С), 86,86 (1С), 86,19 (1С), 70,69 (1С), 60,22 (1С), 55,43 (1С), 55,42 (1С), 43,03 (1С), 40,70 (1С), 26,76 (1С). MC m/z: [M^-] рассч. для C₄₀H₃₉N₄O₈, 703,77; найдено, 703,2 (ESI^-).

5'-O-(4,4'-Диметокситритил)-4-N-ацетил-5-(N-бензилкарбоксамид)-2'-дезоксицитидин- '-O-(N,N-диизопропил-O-2-цианоэтилфосфорамидит) (7a). В 250 мл колбу с круглым дном загружали: (6a) (11,0 грамм, 15,6 ммоль); безводный дихлорметана (40 мл); 2-цианоэтил-N,N,N',N'-тетраизопропилфосфордиамидит (5,9 мл, 18,7 ммоль, 1,2 экв.); и наконец, пиридин трифторацетатом (3,61 грамм, 18,7 ммоль, 1,2 экв.). Через 30 мин., анализ ТСХ показал завершение реакции (силикагель, 75% этилацетат/25% гексан (об./об.), R_f(6a) = 0,2, R_f(7a) = 0,7/0,8 [два изомера]). Всю реакционную смесь наносили на силикагелевую колонку для отгонки легких фракций, предварительно обработанную 1% триэтиламин/64% этилацетат/35% гексаном (пока элюент основный), затем элюировали 65% этилацетат/35% гексан (продувка аргоном). Фракции, содержащие продукт, защищали от воздействия воздуха в герметично закрытых сосудах под аргоном и концентрировали с получением (7a) в виде бесцветной пены, 10,8 грамм, 76% выход. ¹H ЯМР (500 МГц, d6-ДМСО): δ = 11,47 (c, 1H), 9,11 (уш.с., 1H), 8,57/8,54 (c, 1H), 7,37 (м, 2H), 7,24 (м, 12H), 6,84 (м, 4H), 6,10 (м, 1H), 4,40 (м, 1H), 4,21 (м, 3H), 3,70 (м, 8H), 3,55 (м, 2H), 3,28 (м, 2Н), 2,75 (т, J=5,9 Гц, 1H), 2,64 (т, J=5,9 Гц, 1H), 2,55 (м, 1H), 2,42 (м, 4H), 1,11 (м, 9H), 0,98 (д, J=6,8 Гц, 3H). ³¹P ЯМР (500 МГц, d6-ДМСО): δ = 147,55/147,37 (c, 1P). МС m/z: [M^-] рассч. для C₄₅H₅₆N₆O₉P, 903,99; найдено, 903,3 (ESI^-).

Схема 1

Для получения 2-цианоэтилфосфорамидитных реагентов (CEP реагенты), 5-N-бензилкарбоксамы (4a-c) были селективно N-защищены путем перемешивания с уксусным ангидридом (без основания) в тетрагидрофуране (ТГФ), и затем 5'-О-защищены как производные (4,4'-диметокситритила) (6a-c) реакцией с 4,4'-диметокситритил хлоридом в пиридине (см., например, Ross et al., 2006). Синтез высокочистых (>98,0%) CEP реагентов (7a-c) завершали путем катализируемой пиридиний трифторацетатом конденсации 3'-спирта с 2-цианоэтил-N,N,N',N'-тетраизопропил фосфорамидитом (см., например, Sanghvi, et al., 2000) и конечной очисткой при помощи силикагелевой флеш-хроматографии с дегазированными растворителями (см., например, Still et al., 1978).

Для получения 5'-трифосфатных реагентов (TPP реагент; Схема 2), 5'-O-DMT-защищенные нуклеозиды (6a-c) были перацителированы уксусным ангидридом в пиридине, с последующим расщеплением DMT и 4-N-ацетил защитных групп 1,1,1,3,3,3-гексафторо-2-пропанолом (см., например, Leonard and Neelima, 1995). Полученные в результате кристаллические 3'-O-ацетатные нуклеозиды (8a-c) превращали в неочищенные 5'-O-трифосфаты при помощи процесса Людвиг- Экстайна. Эти химически модифицированные нуклеозиды в общем требуют двухстадийного процесса очистки: анионнообменной хроматографии (АОХ), с последующей обращеннофазной препаративной ВЭЖХ для получения высокой чистоты (> %90).

Схема 2

Ludwig, J. and Eckstein, F. (1989) Rapid and Efficient Synthesis of Nucleoside 5'-O-(1-Thiotriphosphates), 5'-Triphosphates and 2',3'-Cyclophosphorothioates Using 2-Chloro-4H-1,3,2-benzodioxaphophorin-4-one. J. Org. Chem., 54, 631-635, которая этим полностью включена в данную заявку путем ссылки.

Реакция карбоксиамидирования также подходит для получения резистентных к нуклеазам рибо-сахарных аналогов (см., например, Ito et al., 2003) (Схема 4), например, 5-(N-бензилкарбоксамид)-2'-О-метил-цитидин (12) и -5-(N-3-фенилпропилкарбоксамид)-2'-дезокси-2'-фторо-цитидин (13).

5-(N-Бензилкарбоксамид)-2'-O-метил-цитидин (12): Получен из 5-йодо-2'-O-метилцитидина, как описано для (4a), за исключением того, что продукт был кристаллизован из горячего 2-пропанола (12 мл/г) с получением (12) в виде войлочного белого твердого вещества, 79% выход. ¹H ЯМР (500 МГц, d6-ДМСО): δ = 8,57 (т, J=5,9 Гц, 1H), 8,57 (c, 1H), 8,05 (уш.с., 1H), 7,85 (уш.с., 1H), 7,33 (м, 4H), 7,25 (м, 1H), 5,85 (д, J=3,1 Гц, 1H), 5,27 (т, J=5,4 Гц, 1H), 5,11 (д, J=6,8 Гц, 1H), 4,43 (дд, J=15,4, 10,4 Гц, 1H),4,40 (дд, J=15,3, 10,4 Гц, 1H), 4,17 (дд, J=6,7, 5,2 Гц, 1H), 3,87 (д.т., J=6,8, 3,2 Гц, 1H), 3,80 (дд, J=5,0, 3,2Гц, 1H), 3,77 (м, 1H), 3,61 (ддд, J=12,2, 5,3, 3,4 Гц, 1H), 3,44 (c, 3H), ¹³C ЯМР (500 МГц, d6-ДМСО): δ = 165,43 (1С), 163,57 (1С), 153,49 (1С), 143,99 (1С), 139,16 (1С), 128,40 (2C), 127,22 (2C), 126,90 (1С), 98,97 (1С), 87,95 (1С), 84,28 (1С), 83,05 (1С), 67,67 (1С), 59,92 (1С), 57,70 (1С), 42,40 (1С), МС m/z: [M^-] рассч. для C₁₈H₂₁N₄O₆,389,39; найдено, 389,1 (ESI^-).

5- (N-3-Фенилпропил)-2'-дезокси-2'-фторо-цитидин (13): Получен из 5-йодо-2'-дезокси-2'-фторо-цитидина, как описано для (4c) в виде войлочного белого твердого вещества (53% выход). ¹H ЯМР (500 МГц, d6-ДМСО): δ = 8,52 (c, 1H), 8,07 (уш.с., 1H), 7,95 (т, J=5,4 Гц, 1H), 7,85 (уш.с., 1H), 7,22 (т, J=7,4, 5H), 5,91 (д, J=17,6 Гц, Ш), 5,58 (д, J=6,6 Гц, 1H), 5,32 (т, J=5,3 Гц, 1H), 4,99 (дд, J=53,2, 3,9 Гц, 1H), 4,27 (м, 1H), 3,92 (д, J=8,3 Гц, 1H), 3,86 (м, 1H), 3,58 (ддд, J=12,5, 5,4, 2,9 Гц, 1H), 3,19 (дд, J=12,7, 5,3 Гц, 2H), 2,61 (т, J=7,5 Гц, 2H), 1,78 (м, J=7,3 Гц, 2H), ¹³C ЯМР (500 МГц, d6-ДМСО): δ = 165,22 (c, 1С), 163,74 (c, 1С), 153,34 (c, 1С), 143,82 (c, 1С), 141,73 (c, 1С), 128,42 (c, 2C), 128,35 (c, 2C), 125,81 (c, 1С), 99,26 (1С), 94,02 (д, J=736,6 Гц, 1С), 88,65 (д, J=134,7 Гц, 1С), 83,07 (c, 1С), 67,00 (д, J=65 Гц, 1С), 59,24 (c, 1С), 38,65 (c, 1С), 32,64 (c, 1С), 30,73 (c, 1С), ¹⁹F ЯМР (400 МГц, d6-ДМСО): δ = -200,82 (ддд, J=19,0, 6,2, 56,6 Гц, IF), МС m/z: [M^-] рассч. для C₁₉H₂₂N₄O₅,405,41; найдено, 405,1 (ESI^-).

Схема 3

Процесс Людвиг-Экстайна использовали для превращения 3'-O-ацетил-защищенных промежуточных продуктов (8a-c) в неочищенные 5'-O-трифосфаты (9a-c). Альтернативную двухстадийную очистку при помощи препаративной ВЭЖХ использовали для данных химически модифицированных нуклеотидов.

3'-O-Ацетил-5-(N-1-бензилкарбоксамид)-2'-дезоксицитидин (8a). В продутую аргоном 50 мл круглодонную колбу загружали (6a) (900 мграмм, 1,35 ммоль), безв. пиридин (9 мл) и уксусный ангидрид (0,63 мл, 6,75 ммоль). Через 18 часов при комнатной температуре, растворитель испаряли в вакууме (1мм, 30°C) с получением желтовато-коричневой пены, которую растворяли в 1,1,1,3,3,3-гексафтор-2-пропаноле (9 мл) и нагревали при 50°C под аргоном. Через 6 часов, реакционную смесь выливали в смесь метанола (15 мл) и толуола (10 мл) при быстром перемешивании.

Полученный в результате оранжевый раствор концентрировали (l мм, 30°C) с получением красного маслянистого остатка который, после смешивания с этилацетатом (6 мл), давал кристаллическую суспензию. Кристаллизацию дополнительно усиливали путем добавления гексана (1 мл). Смесь перемешивали всю ночь и фильтровали, промывая остаток на фильтре 50:50 этилацетат:гексан. Продукт (8a) выделяли, после высушивания, как бледно-серое твердое вещество (405 мг), 75% выход: ¹Н ЯМР (500 МГц, d6-ДМСО): δ - 8,82 (т, J=5,8 Гц, 1H), 8,41 (c, 1H), 8,09 (уш.с., 1H), 7,81 (уш.с., 1H), 7,33 (м, 4H), 7,25 (м, 1H), 6,17 (дд, J=8,0, 6,0 Гц, 1H), 5,24 (д.т., J=6,2, 1,8 Гц, 1H), 5,13 (т, J=5,6 Гц, 1H),4,43 (дд, J=15,4, 13,3 Гц, 1H),4,19 (дд, J=15,3, 13,2 Гц, 1H), 4,06 (дд, J=5,9, 3,7 Гц, 1H), 3,65 (м, 2H), 2,45 (м, 1H), 2,34 (ддд, J=14,2, 5,9, 1,5 Гц, 1H), 2,07 (c, 3H), ¹³C ЯМР (500 МГц, d6-ДМСО): δ = 170,05 (1С), 165,34 (1С), 163,54 (1С), 153,44 (1С), 143,94 (1С), 139,20 (1С), 128,34 (2C), 127,16 (2C), 126,85 (1С), 99,06 (1С), 85,96 (1С), 85,06 (1С), 74,63 (1С), 61,18 (1С), 42,28 (1С), 37,31 (1С), 20,85 (1С), МС m/z: [M^-] рассч. для C₁₉H₂₁N₄O₆, 401,40; найдено, 401,1 [M]^-_.

3'-O-Ацетил-5-(N-1-нафтилметилкарбоксамид)-2'-дезоксицитидин (8b). Получен из (6b), как описано для (8a), как бледно-серое твердое вещество, 54% выход: ¹Н ЯМР (500 МГц, d6-ДМСО): δ = 8,89(т, J=5,8 Гц, 1H), 8,44 (c, 1H), 8,14 (д , J=8,4 Гц, 1H), 8,11 (уш.с., 1H), 7,96 (дд, J=8,6, 1,3 Гц, 1H), 7,86 (дд, J=6,6, 2,8 Гц, 1H), 7,84 (уш.с., 1H), 7,57 (м, 2H), 7,49 (м, 2H), 6,15 (дд, J=8,2, 6,0 Гц, 1H), 5,23 (д.т., J=6,2, 1,9 Гц, 1H), 5,13 (т, J=5,8 Гц, 1H), 4,94 (дд, J=15,5, 5,8 Гц, 1H), 4,86 (дд, J=15,7, 5,4 Гц, 1H), 4,05 (д.т., J=8,1, 1,8 Гц, 1H), 3,62 (м, 2H), 2,45 (м, 1H), 2,33 (ддд, J=12,6, 6,1, 1,8 Гц, 1H), 2,06 (c, 3H), ¹³C ЯМР (500 МГц, d6-ДМСО): δ = 170,51 (1С), 165,78 (1С), 164,02 (1С), 153,90 (1С), 144,52 (1С), 134,57 (1С), 133,74 (1С), 131,27 (1С), 129,02 (1С), 128,03 (1С), 126,80 (1С), 126,31 (1С), 125,94 (1С), 125,54 (1С), 123,78 (1С), 99,52 (1С), 86,60 (1С), 85,55 (1С), 70,12 (1С), 61,67 (1С), 40,80 (1С), 37,75 (1С), 21,32 (1С), МС m/z: [M^-] рассч. для C₂₃H₂₃N₄O₆,451,46; найдено, 451,1 (ESI^-).

3'-O-Ацетил-5-(N-3-фенилпропилкарбоксамид)-2'-дезоксицитидин (8c). Получен из (6c), как описано для (8a), как белое твердое вещество, 74% выход: ¹Н ЯМР (500 МГц, d6-ДМСО): δ = 8,37 (c, 1H), 8,26 (т, J=5,3 Гц, 1H), 8,06 (уш.с., 1H), 7,79 (уш.с., 1H), 7,23 (м, 5H), 6,16 (дд, J=7,9, 6,1 Гц, 1H), 5,24 (д.т., J=4,2, 2,1 Гц, 1H), 5,18 (т, J=5,6 Гц, 1H), 4,06 (дд, J=5,7, 3,6 Гц, 1H), 3,65 (м, 2H), 3,19 (дд, J=12,8, 6,2 Гц, 2H), 2,62 (т, J=7,5 Гц, 2H), 2,43 (м, 1H), 2,34 (м, 1H), 2,06 (c, 3H), 1,78 (м, J=7,4 Гц, 2H). ¹³C ЯМР (500 МГц, d6-ДМСО): δ = 170,52 (1С), 165,68 (1С), 164,00 (1С), 153,94 (1С), 144,09 (1С), 142,13 (1С), 128,80 (2C), 127,75 (2C), 126,21 (1С), 99,80 (1С), 86,42 (1С), 85,06 (1С), 75,07 (1С), 61,63 (1С), 39,12(1C), 37,91 (1С), 33,04 (1С), 31,18 (1С), 21,31 (1С). МС m/z: [M^-] рассч. для C₂₁H₂₅N₄O₆,429,45; найдено, 429,1 (ESI^-).

Пример 2: Синтез 5-(N-1-нафтилметил)-2'-дезоксицитидин-5-карбоксамида

Данный пример представляет способы получения 5-(N-1-нафтилметил)-2'-дезоксицитидин-5-карбоксамида (или NapdC; см. Схему 1 (4b) в Примере 1).

Исходные вещества: 5-йодо-2'-дезоксицитидин; 5-йодо-2'-O-метил-цитидин; 5-йодо-2'-дезокси-2'-флуроцитидин были приобретены у ChemGenes Corporation (Уилмингтон, Массачусетс 01887, США) или Thermo Fisher Scientific Inc. (Уолтем, Массачусетс 02454, США). Монооксид углерода (безопасность: ядовитый газ) с 99,9% чистотой был приобретен у Specialty Gases of America (Толедо, Огайо 43611, США). Все остальные реагенты были приобретены у Sigma-Aldrich (Милоуоки, Висконсин 53201, США) и использованы в том виде, в котором получены.

5-(N-1-нафтилметил)-2'-дезоксицитидин-5-карбоксамид (4b): Получен, как описано для (4a), с использованием 1-нафтилметиламина (6 экв.) вместо бензиламина, время реакции составляло 48 часов при комнатной температуре. После концентрирования реакционной смеси, остаток экстрагировали диизопропиловым эфиром (~40 мл/г) для удаления большей части избытка 1-нафтилметиламина. Остаток кристаллизовали из горячего метанола (50 мл/г), с горячим фильтрованием, с получением продукта (4b; Схема 1; Пример 1) как белого твердого вещества, 40% выход. ¹H ЯМР(500 МГц, d6-ДМСО): δ = 8,81 (т, J=5,5 Гц, 1H), 8,43 (c, 1H), 8,14 (д, J=4,4, 1H), 8,09 (уш.с., 1H), 7,96 (м, 1H), 7,79 (м, 1H), 7,75 (уш.с., 1H), 7,53 (м, 4H), 6,14 (т, J=6,6 Гц, 1H), 5,24 (д, J=4,3 Гц, 1H), 5,01 (т, J=5,6 Гц, 1H), 4,90 (дд, J=15,6, 13,4 Гц, 1H), 4,89 (дд, J=15,5, 13,2 Гц, 1H), 4,26 (м, J=4,1 Гц, 1H), 3,84 (дд, J=8,4, 4,4 Гц, 1H), 3,58 (м, 2H), 2,20 (м, 2H), ¹³C ЯМР (500 МГц, d6-ДМСО): δ = 165,45 (1С), 163,58 (1С), 153,57 (1С), 143,93 (1С), 136,07 (1С), 134,20 (1С), 133,32 (1С), 128,61 (1С), 127,59 (1С), 126,34 (1С), 125,89 (1С), 125,53 (1С), 125,07 (1С), 123,36 (1С), 98,82 (1С), 87,71 (1С), 85,99 (1С), 70,13 (1С), 61,16 (1С), 42,42 (1С), 40,14 (1С), МС m/z: [M^-] рассч. для C₂₁H₂₁N₄O₅, 409,42; найдено, 409,1 (ESI^-).

4-N-Ацетил-5-(N-1-нафтилметилкарбоксамид)-2'-дезоксицитидин (5b): В 100 мл круглодонную колбу загружали (4b) (1,17 грамм, 2,85 ммоль) и безв. тетрагидрофуран (26 мл) и перемешивали с образованием серо-белой суспензии. Уксусный ангидрид (1,4 мл, 14,3 ммоль, 5 экв.) добавляли к смеси по каплям при перемешивании при комнатной температуре. Реакционную смесь перемешивали и нагревали до 50°C в течение 21 часа. Аликвоту отбирали для ТСХ анализа (силикагель, элюент: 10% метанол/90% дихлорметан (об./об.), R_f(4b) = 0,61, R_f(5b) = 0,12) который указывал на то, что реакция завершена. Реакционную колбу затем переносили на ледяную баню и перемешивали в течение >1 часа. Смесь затем фильтровали и остаток на фильтре промывали охлажденным изопропиловым эфиром. Полученные в результате твердые вещества собирали и дополнительно испаряли в вакууме с получением мелких серо-белых кристаллов (1,01 грамма, 78,2% выход). ¹H ЯМР (500 МГц, d6-ДМСО): δ = 11,35 (c, 1H), 9,07 (т, J=4,6 Гц, 1H), 8,74 (c, 1H), 8,15 (д, J=8,7 Гц, 1H), 7,96 (м, 1H), 7,87 (м, 1H), 7,53 (м, 4H), 6,11 (т, J=6,2 Гц, 1H), 5,29 (д, J=4,2 Гц, 1H), 5,08 (т, J=5,4 Гц, 1H), 4,92 (дд, J=15,5, 10,1 Гц, 1H), 4,91 (дд, J=15,7, 9,7 Гц, 1H), 4,28 (д.т., J=9,4, 3,8 Гц, 1H), 3,92 (дд, J=7,6, 3,9 Гц, 1H), 3,64 (м, 1H), 3,58 (м, 1H), 2,42 (c, 3H), 2,35 (м, 1H), 2,22 (м, 1H), ¹³C ЯМР (500 МГц, d6-ДМСО): δ = 171,27 (1С), 165,53 (1С), 159,77 (1С), 153,20 (1С), 146,30 (1С), 136,48 (1С), 134,17 (1С), 133,74 (1С), 131,26 (1С), 129,02 (1С), 128,12 (1С), 126,83 (1С), 126,33 (1С), 125,95 (1С), 123,80 (1С), 100,38 (1С), 88,74 (1С), 87,63 (1С), 70,25 (1С), 61,29 (1С), 41,13 (1С), 40,92 (1С), 26,71 (1С), МС m/z: [M^-] рассч. для C₂₃H₂₃N₄O₆, 451,46; найдено, 451,1 (ESI^-).

5'-O-(4,4'-Диметокситритил)-4-N-ацетил-5-(N-1-нафтилметилкарбоксамид)-2'-дезоксицитидин (6b): Получен, как описано для 6b) как бесцветное твердое вещество с 59% выходом. ¹H ЯМР (500 МГц, d6-ДМСО): δ = 11,40 (c, 1H), 9,35 (уш.т., 1H), 8,48 (c, 1H), 8,02 (м, 1H), 7,96 (м, 1H), 7,86 (д, J=8,4 Гц, 1H), 7,54 (м, 2H), 7,40 (м, 2H), 7,35 (м, 1H), 7,25 (м, 8H), 6,85 (д, J=8,9 Гц, 4H), 6,09 (т, J=6,1 Гц, 1H), 5,32 (д, J=3,7 Гц, 1H), 4,72 (дд, J=14,9, 4,8 Гц, 1H), 4,60 (дд, J=15,1, 3,4 Гц, 1H), 4,16 (д.т., J=10,9, 4,7 Гц, 1H), 4,04 (м, 1H), 3,70 (c, 6H), 3,29 (дд, J=10,5, 6,4 Гц, 1H), 3,18 (дд, J=10,4, 7,0 Гц, 1H), 2,43 (c, 3H), 2,38 (м, lH),2,26(м, 1H), ¹³C ЯМР (500 МГц, d6-ДМСО): δ = 171,25 (1С), 165,37 (1С), 159,88 (1С), 158,52 (1С), 158,54 (1С), 153,03 (1С), 146,32 (1С), 145,31 (1С), 136,05 (1С), 135,97 (1С), 133,92 (1С), 133,74 (1С), 131,22 (1С), 130,20 (2C), 130,11 (2C), 129,05 (1С), 128,30 (2C), 128,15 (2C), 127,16 (1С), 126,81 (1С), 126,33 (1С), 125,85 (1С), 125,80 (1С), 123,65 (1С), 113,61 (4C), 100,49 (1С), 88,12 (1С), 86,79 (1С), 86,17 (1С), 70,59 (1С), 64,40 (1С), 55,41 (2C), 41,01 (1С), 40,70 (1С), 40,82 (1С), 26,76 (1С), МС m/z: [М^-] рассч. для C₄₄H₄₁N₄O₈,753,83; найдено, 753,21 (ESI^-).

5'-О-(4,4'-диметокситритил)-4-N-Ацетил-5-(N-1-нафтилметилкарбоксамид)-2-дезоксицитидин-3'-O-(N,N-диизопропил-O-2-цианоэтилфосфорамидит) (7b): Получен, как описано для (7a) как белая пена (88% выход). ¹Н ЯМР (500 МГц, d6-ДМСО): δ = 11,41 (c, 1H), 9,13 (уш.с., 1H), 8,56/8,54 (c, 1H), 8,01 (м, 1H), 7,95 (м, 1H), 7,85 (м, 1H), 7,53 (м, 2H), 7,37 (м, 2H), 7,24 (м, 9H), 6,83 (м, 4H), 6,06 (м, 1H), 4,66 (м, 2H), 4,39 (м, 1H), 4,16 (м, 1H), 3,68 (м, 8H), 3,52 (м, 2H), 3,28 (м, 1H), 3,20 (м, 1H), 2,74 (т, J=5,8 Гц, 1H), 2,63 (т, J=5,9 Гц, 1H), 2,45 (м, 5H), 1,09 (м, 9H), 0,96 (д, J=6,8 Гц, 3H), ³¹P ЯМР (500 МГц, d6-ДМСО): δ = 146,93/146,69 (c, 1P), МС m/z: [М^-] рассч. для C₅₃H₅₈N₆O₉P, 954,05; найдено, 953,3 (ESI^-).

Пример 3: Синтез 5-(N-3-фенилпропилкарбоксамид)-2'-дезоксицитидина

Данный пример представляет способы получения 5-(N-3-фенилпропилкарбоксамид)-2'-дезоксицитидина (или PPdC; см. Схему 1 (4c) в Примере 1).

Исходные вещества: 5-йодо-2'-дезоксицитидин; 5-йодо-2'-O-метил-цитидин; 5-йодо-2'-дезокси-2'-флуроцитидин были приобретены у ChemGenes Corporation (Уилмингтон, Массачусетс 01887, США) или Thermo Fisher Scientific Inc. (Уолтем, Массачусетс 02454, США). Монооксид углерода (безопасность: ядовитый газ) с 99,9% чистотой был приобретен от Specialty Gases of America (Толедо, Огайо 43611, США). Все остальные реагенты были приобретены у Sigma-Aldrich (Милоуоки, WI 53201, США) и использованы в том виде, в котором получены.

5-(N-3-фенилпропилкарбоксамид)-2'-дезоксицитидин (4c): Получен, как описано для (4a) (40 нмоль шкала), с использованием 3-фенилпропиламина (6 экв.) вместо бензиламина, и временем реакции 48 часов при комнатной температуре. После удаления растворителей на роторном испарителе, остаток перетирали с диэтиловым эфиром (~30 мл/г) для экстрагирования избытка 3-фенилпропиламина и смолистый осадок растворяли в горячем этаноле, перемешивали при комнатной температуре в течение 18 часов, с последующим перемешиванием при 0°C в течение 1 часа. Полученную в результате смесь фильтровали и маточный раствор испаряли с получением коричневой смолы. Ее растворяли в теплой смеси дихлорметана и воды. После отстаивания и перемешивания при комнатной температуре в органическом слое, а также в водном слое образовывались перьевидные кристаллы. Трехфазную смесь фильтровали и остаток на фильтре промывали диэтиловым эфиром с получением (4c) в виде рыхлого белого твердого вещества (10,78 грамм, 69,5% выход). ¹H ЯМР (500 МГц, d6-ДМСО): δ = 8,39 (c, 1H), 8,13 (т, J=5,3 Гц, 1H), 8,05 (уш.с., 1H), 7,71 (уш.с., 1H), 7,28 (т, J=7,4, 2H), 7,22 (д, J=7,0, 2H), 7,17 (т, J=7,4, 1H), 6,13 (т, J=6,4 Гц, 1H), 5,22 (д, J=4,3 Гц, 1H), 5,07 (т, J=5,5 Гц, 1H), 4,26 (д.т. J=9,4, 4,1 Гц, 1H), 3,83 (дд, J=7,8, 3,9 Гц, 1H), 3,66 (м, 1H), 3,58 (м, 1H), 3,19 (дд, J=12,9, 6,7 Гц, 2H), 2,61 (т, J=7,5 Гц, 2H), 2,19 (м, 2H), 1,78 (м, J=7,4 Гц, 2H), ¹³C ЯМР(500 МГц, d6-ДМСО): δ = 165,34 (1С), 163,56 (1С), 153,60 (1С), 143,53 (1С), 141,70 (1С), 128,38 (2C), 128,33 (2C), 125,78 (1С), 98,99 (1С), 87,63 (1С), 85,86 (1С), 69,82 (1С), 60,96 (1С), 40,36 (1С), 38,58 (1С), 32,63 (1С), 32,63 (1С), МС m/z: [M^-] рассч. Для C₁₉H₂₃N₄O₅,387,42; найдено, 387,1 (ESI^-).

4-N-Ацетил-5-(N-3-фенилпропил)карбоксамид-2'-дезоксицитидин (5c): Раствор (4c) (10,8 грамм, 28 ммоль) в безв. ТГФ (100 мл) перемешивали и по каплям обрабатывали уксусным ангидридом (3 экв.). Раствор перемешивали в течение 18 часов при комнатной температуре с получением текучей суспензии. Смесь медленно разбавляли путем добавления по каплям диизопропилового эфира (35 мл). Твердые вещества выделяли путем фильтрования и сушили в вакууме с получением (5c) в виде белого твердого вещества (8,44 грамм, 70,5% выход). ¹Н ЯМР (400 МГц, d6-ДМСО): δ = 11,34 (c, 1H), 8,69 (c, 1H), 8,41 (т, J=5,2 Гц, 1H), 7,23 (м, 5H), 6,09 (т, J=6,0 Гц, 1H), 5,15 (уш.с., 2H), 4,27 (м, 1H), 3,90 (дд, J=9,6, 3,8 Гц, 1Η), 3,68 (м, 1H), 3,59 (м, 1H), 3,21 (дд, J=12,3, 7,0 Гц 2H), 2,62 (м, 2H), 2,40 (c, 3H), 2,33 (м, 1H), 2,21 (м, 1H), 1,79 (м, 2H), ¹³C ЯМР (400 МГц, d6-ДМСО): δ = 171,21 (1С), 165,34(1C), 159,73 (1С), 153,21 (1С), 146,01 (1С), 142,08 (1С), 128,80 (2C), 128,75 (2C), 126,22 (1С), 99,14 (1С), 88,61 (1С), 87,41 (1С), 69,88 (1С), 61,05 (1С), 41,04 (1С), 39,22 (1С), 33,01 (1С), 30,97 (1С), 26,67 (1С), МС m/z: : [M^-] рассч. для C₂₁H₂₅N₄O₆,429,45; найдено, 429,1 (ESI^-).

5'-O-(4,4'-Диметокситритил)-4-N-ацетил-5-(N-3-фенилпропил)карбоксамид-2-дезоксицитидин (6c): Получен из (5c; Схема 1; Пример 1), как описано для (6a) в Примере 1 как белая пена (64,6% выход). ¹H ЯМР (500 МГц, d6-ДМСО): δ = 11,38 (c, 1H), 8,56 (т, J=5,2 Гц, 1H), 8,37 (c, 1H), 7,35 (д, J=7,4 Гц, 2H), 7,21 (м, 12H), 6,80 (м, 4H),6,11 (т, J=6,0Гц, 1H), 5,32 (д, J=4,8 Гц, 1H), 4,16 (д.т., J=10,8, 4,7 Гц, 1H), 4,04 (м, 1H), 3,70 (д, J=2,2 Гц, 6H), 3,26 (дд, J=10,6, 6,1 Гц, 1H), 3,21 (дд, J=10,5, 3,3 Гц, 1H), 3,03 (м, 1H), 2,95 (м, 1H), 2,49 (c, 2H), 2,43 (c, 3H), 2,39 (м, 1H), 2,23 (м, 1H), 1,57 (м, 2H), ¹³C ЯМР (500 МГц, d6-ДМСО): δ = 170,77 (1С), 164,81 (1С), 159,41 (1С), 158,07 (1С), 158,06 (1С), 152,69 (1С), 145,18 (1С), 144,81 (1С), 141,53 (1С), 135,51 (1С), 135,50 (1С), 129,70 (2C), 129,61 (2C), 128,32 (2C), 128,29 (2C), 127,81 (2C), 127,66 (2C), 126,66 (1С), 125,79 (1С), 113,13 (4C), 100,37 (1С), 87,47 (1С), 86,40 (1С), 85,72 (1С), 70,03 (1С), 59,80 (1С), 54,99 (1С), 54,97 (1С), 40,48 (1С), 38,92 (1С), 32,64 (1С) 32,29 (1С), 26,27 (1С), МС m/z: [M^-] рассч. для C₄₂H₄₃N₄O₈,731,83; найдено, 731,2 (ESI^-).

5'-O-(4,4'-Диметокситритил)-4-N-ацетил-5-(N-3-фенилпропилкарбоксамид)-2'-дезоксицитидин-3'-O-(N,N-диизопропил-O-2-цианоэтилфосфорамидит) (7c): Получен из (6c; Схема 1; Пример 1), как описано для (7a) в Примере 1. В 500 мл круглодонную колбу, содержавшую 6c (7,11 грамм, 9,70 ммоль) в атмосфере аргона загружали безв. дихлорметан (97 мл). Безводный N, N-диизопропилэтиламин (3,4 мл, 19,4 ммоль) добавляли в колбу, и смесь охлаждали до 0°C при перемешивании. Через полчаса, 2-цианоэтилдиизопропил хлорофосфорамидит (2,6 мл, 11,6 ммоль) добавляли по каплям к смеси при быстром перемешивании. Смесь оставляли медленно нагреваться до комнатной температуры при перемешивании. Через 17 часов, реакционную смесь отбирали для ТСХ, которая показала завершение реакции (силикагель; элюент 75% этилацетат/25% гексан (об./об.), R_f(6c) = 0,10, R_f(7b) = 0,46/0,56 [два изомера]). Реакционную смесь переносили в 250 мл разделительную воронку при помощи толуола и гасили путем промывания холодным продутым аргоном 2% раствором бикарбоната натрия (2x, 400 мл/промывание). Органический слой собирали и испаряли до удаления большей части дихлорметана. Органический слой возвращали в разделительную воронку при помощи охлажденного продутого аргоном толуола и промывали охлажденной продутой аргоном деионизированной водой (2x, 400 мл/промывание). Органический слой затем разбавляли охлажденным продутым аргоном этилацетатом и промывали солевым раствором (1x, 400 мл). Органический слой собирали, сушили над сульфатом натрия, фильтровали и испаряли. Подготовленную реакционную смесь растворяли в дихлорметане и загружали в предварительно обработанную колонку (получена как (6b)) и элюировали с охлажденной продутой аргоном подвижной фазой (80% этилацетат/20% гексан) и фракции, содержавшие продукт, собирали в герметично закрытые продутые аргоном бутыли, чтобы ограничить контакт продукта с воздухом. Фракции, содержавшие продукт, испаряли при <40°C с получением белой пены (6,16 грамм, 68,0% выход). ¹H ЯМР (500 МГц, d6-ДМСО): δ = 11,40 (c, 1Н), 8,56 (м, 1H), 8,47/8,43 (c, 1H), 7,35 (м, 2H), 7,20 (м, 12H), 6,80 (м, 4H), 6,08 (м, 1H), 4,40 (м, 1H), 4,18 (м, 1H), 3,70 (м, 8H), 3,53 (м, 2H), 3,30 (м, 2H), 3,00 (м, 2H), 2,75 (т, J=5,9 Гц, 1H), 2,63 (т, J=5,9 Гц, 1H), 2,56 (м, 1H), 2,50 (м, 2H), 2,40 (м, 4H), 1,59 (м, 2H), 1,11 (м, 9H), 0,97 (д, J=6,8 Гц, 3H), ³¹P ЯМР (500 МГц, d6-ДМСО): δ = 147,60/147,43 (с, 1P) МС m/z: [М^-] рассч, для C₅₁H₆₀N₆O₉P, 932,05; найдено, 931,4 (ESI^-).

Пример 4: Очистка нуклеозид трифосфата при помощи двухстадийной препаративной ВЭЖХ

Данный пример представляет способы очистки нуклеозид трифосфатов.

Неочищенные трифосфаты (9a-c) очищали посредством двух ортогональных препаративных ВЭЖХ методов: анионнообменной хроматографии для разделения нуклеозид трифосфата и других нуклеозидных побочных продуктов (таких как дифосфат и монофосфат) и обращеннофазной хроматографии для удаления остаточных побочных продуктов реагентов реакции.

Анионнообменную хроматографию выполняли как два впрыскивания на каждые 0,5 ммоль реакции с использованием ВЭЖХ колонки, упакованной смолой Source 15Q, с элюированием с линейным градиентом элюирования двух триэтиламмоний бикарбонатных буферов (Таблица 1). Желательный трифосфат обычно представлял собой целевое вещество для элюирования из колонки, как широкий пик с шириной 10-12 минут на ВЭЖХ хроматограмме. Фракции были проанализированы и фракции, содержавшие продукт, объединяли и испаряли в испарителе Genevac VC 3000D с получением бесцветной или слегка бронзовой смолы. Ее восстанавливали в деионизированной воде и применяли в однократном впрыскивании для обращеннофазной очистки на Novapak HRC18 препаративной колонке, с элюированием с линейным градиентом ацетонитрила в триэтиламмоний ацетатном буфере (Таблица 2). Фракции, содержавшие очищенный трифосфат. Объединяли и испаряли с получением бесцветной или слегка бронзовой смолы.

Целевые очищенные трифосфаты (9a-c) восстанавливали в деионизированной воде для анализа и количественно определяли при помощи диодного матричного спектрофотометра Hewlett Packard 8452A при 240 нм (Таблица 3).

Таблица 1
Условия очистки AOX Система ВЭЖХ Детектор Waters 625HPLC/486 @ 240 или 278 нм Колонка Источник 15Q 196 мл (GE Healthcare PN: 17-1947-05) Подвижная фаза A: 10 мМ триэтиламмоний бикарбонат/10% ацетонитрил, B: 1M триэтиламмоний бикарбонат/10% Ацетонитрила Градиент (% буфер B) 5%-70% Время работы; скорость потока; размер фракции 50 мин; 35 мл/мин; 50 мл Аналитическая колонка Dionex ДНК-Рас PA 100 колонка (Thermo Scientific, PN: 043010)

Таблица 2
Условия очистки ОФ-ВЭЖХ Система ВЭЖХ Waters 625HPLC/486 детектор @ 240 нм Колонка Waters Novapak HRC18, 19 мм × 300 мм (PN WAT025822) Подвижная фаза A: 100 мМ триэтиламмоний ацетат B: 100% ацетонитрил Градиент (% буфер B) 0%-50% Время работы; скорость потока; размер фракции 30 мин; 12 мл/мин; 25 мл Аналитическая колонка Waters Symmetry колонка (PN: WAT054215)

Таблица 3
Выходы и чистоты трифосфатов Трифосфат Коэффициент экстинкции (est3b) Выход мкмоль Выход проценты Чистота: Аналитическая ОФ-ВЭЖХ Чистота: Аналитическая ОФ-ВЭЖХ (9a) 13,700 см^-1 M^-1 43 9% Нет данных 92,6% (9b) 20,000 см^-1 M^-1 121 24% 95,5% 98,2% (9c) 13,700 см^-1 M^-1 92 18% 98,3% 98,2%

5-(N-1-Бензилкарбоксамид)-2'-дезоксицитидин-5'-O-трифосфат (9a). ¹H ЯМР (300 МГц, D₂O): δ = 8,45 (c, 1H), 7,25 (м, 5H), 6,14 (т, J=6,9 Гц, 1H), 4,57 (м, J=2,9 Гц, 1H), 4,43 (дд, J=20,2, 15,4 Гц, 2H), 4,17 (м, 3H), 2,39 (м, 1H), 2,27 (м, 1H), ¹³C ЯМР ³¹P ЯМР (300 МГц, D₂O): δ = -9,96 (д, J=50,0 Гц, 1P), -11,43 (д, J=50,8 Гц, 1P), -23,24(т, J=50,5Гц, 1P МС m/z: [M^-] рассч. для C₁₇H₂₁N₄O₁₄P₃, 599,04; найдено, 599,1 [M^-]

5-(N-1-Нафтилметилкарбоксамид)-2'-дезоксицитидин-5'-O-трифосфат (9b): ¹H ЯМР (500 МГц, D₂O): δ = 8,12 (c, 1H), 7,98 (д, J=8,5 Гц, 1H), 7,69 (д, J=8,1 Гц, 1H), 7,58 (м, 1H), 7,40 (м, 1H), 7,33 (м, 1H), 7,24 (м, 1H), 5,87 (т, J=6,7 Гц, 1H), 4,66 (д, J=8,1 Гц, 2H), 4,40 (м, J=3,0 Гц, 1H), 4,04 (м, 3H), 2,21 (ддд, J=14,1, 6,0, 3,4 Гц, 1H), 2,06 (м, 1H), ¹³C ЯМР (500 МГц, D₂O): δ = 165,95 (c, 1С), 163,15 (c, 1С), 155,22 (c, 1С), 143,33 (c, 1С), 133,35 (c, 1С), 133,17 (c, 2C), 130,55 (c, 2C), 128,66 (c, 1С), 127,84 (c, 1С), 126,65 (c, 1С), 126,13 (c, 1С), 125,64 (c, 1С), 125,12 (c, 1С), 123,11 (c, 1С), 100,55 (c, 1С), 86,88 (c, 1С), 85,87 (д, J=55,95 Гц, 1С), 70,76 (c, 1С), 65,38 (д, J=36 Гц, 1С), 41,19 (c, 1С), 39,61 (м, 1С), ³¹P ЯМР (500 МГц, D₂O): δ = -10,99 (д, J=82,4 Гц, 1P), -11,61 (д, J=84,9 Гц, 1P), -23,47 (т, J=83,5 Гц, 1P), МС m/z: [M^-] рассч. для C₂₁H₂₄N₄O₁₄P₃,649,36; найдено, 649,0 (ESI^-).

5-(N-3-Фенилпропилкарбоксамид)-2'-дезоксицитидин-5'-O-трифосфат (9c). ¹H ЯМР (500 МГц, D₂O): δ = 8,07 (c, 1H), 7,11 (м, 4H), 6,98 (м, 1H), 6,00 (т, J=6,5 Гц, 1H), 4,44 (м, J=3,0 Гц, 1H), 4,06 (м, 3H), 3,21 (м, 1H), 3,13 (м, 1H), 2,50 (т, J=7,5 Гц, 2H), 3,13 (ддд, J=14,1, 10,9, 3,1 Гц, 1H), 2,13 (м, 1H), 1,76 (м, 2H), ¹³C ЯМР (500 МГц, D₂O): δ = 165,85 (c, 1С), 163,50 (c, 1С), 155,73 (c, 1С), 142,94 (c, 1С), 142,40 (c, 1С), 128,55 (c, 2C), 128,40 (c, 2C), 125,72 (c, 1С), 101,15 (c, 1С), 86,93 (c, 1С), 85,96 (д, J=55,2 Гц, 1С), 70,90 (c, 1С), 65,38 (д, J=37,6 Гц, 1С), 39,88 (c, 1С), 39,55 (c, 1С), 32,74 (c, 1С), 26,68 (c, 1С), ³¹P ЯМР(500 МГц,D₂O): δ = -11,00 (д, J=82,7 Гц, IP), -11,09 (д, J=85,7 Гц, IP), -23,53 (т, J=84,3 Гц, 1P), МС m/z: [M^-] рассч. для C₁₉H₂₅N₄O₁₄P₃, 627,35; найдено, 627,0 (ESI^-).

Пример 5: Твердофазный синтез олигонуклеотидов

ABI 3900 автоматизированную установку для синтеза ДНК (Applied Biosystems, Фостер Сити, Калифорния) использовали с обычными фосфорамидитными способами с незначительными изменениями для условий связывания для модифицированных фосфорамидитов (7a-c) (Таблица 4). Реагент (7a) использовали как 0,1 M раствор в дихлорметане/ацетонитриле (1/1) и реагенты (7b) и (7c) использовали как 0,1 M растворы в ацетонитриле. В качестве твердой подложки использовали колонку ABI стиля с фриттами, упакованную стеклом с контролируемым размером пор (CPG, Prime Synthesis, Астон, Пенсильвания) загруженную 3'-DMT-dT сукцинатом с 1000 Å размером пор. Снятие защитной группы производили путем обработки 20% диэтиламином в ацетонитриле с последующим расщеплением газообразного метиламина и снятием защитной группы в течение 2 часов при 35°C. Идентичность и процент полноразмерности (%FL) продукта определяли на Agilent 1290 Infinity с одинарным квадрупольным масс-спектрометрическим детектором Agilent 6130B с использованием колонки Acquity OST C18 1,7 мкм 21×100 мм (Waters Corp., Милфорд, Массачусетс), с использованием градиента от 0 до 25 процентов В за 11 минут (Буфер A: 100 мМ 1,1,1,3,3,3-гексафторо-2-пропанол, 8,6 мМ триэтиламин, pH 8.25; Буфер B: 10% Буфер A в 90% ацетонитриле).

Таблица 4
ABI 3900 параметры цикла связывания (50 нмоль шкала) Стадия Операция Цель повт Реагент Объем, мкл Ожидание, сек Подг. подложки промывание 3 ACN 200 0 пре Подг. подложки детритилирование 2 деблокатор 50 0 1 Цикл связывания детритилирование 3 деблокатор 50 3 2 Цикл связывания промывание 1 ACN 195 0 3 (ATG) Цикл связывания связывание 2 активатор, амидит 36+19 30+175 3 (7a-c) Цикл связывания связывание 3 активатор, амидит 36+19 60+250 4 Цикл связывания кэппинг 1 кэп A, B 15+15 5 5 Цикл связывания окисление 1 окислитель 35 3 8 Цикл связывания промывание 1 ACN 190 0 пост Завершение олиго детритилирование 2 деблокатор 140 0 Завершение олиго промывание 4 ACN 199 0 Завершение олиго сухая подложка 1 ACN; Ar 199 0

Ключ: ACN Ацетонитрил деблокатор 10% дихлоруксусная кислота в толуоле Активатор 0,3 M 5-Бензилмеркаптотетразол и 0,5% N-метилимидазол в ACN Окислитель 0,025 M йод в 44,9% ACN/45% пиридин/10,1% воде кэп A Уксусный ангидрид в пиридине и тетрагидрофуране кэп В 1-Метилимидазол в тетрагидрофуране Ar Промывание сухим аргоном в течение 20 секунд

Анализ удлинения праймера: Модифицированные нуклеозид трифосфаты оценивали в качестве подложек для KOD экзонуклеаза-минус ДНК полимераза в анализе удлинения праймера при помощи стандартной темплаты, содержавшей все возможные тройные нуклеотидные комбинации. Темплатная последовательность представляла собой:

5'-TTTTTTTTCTTCTTCTCCTTTCTCTTCCCAAAATCACACGGACCCAGGGCATTCT AGATATGGTTTACGCTCAAGCGAACTTGCCGTCCTGAGTGTAAAGAGGGAAAgag

ggcagggtgtggcatatatat-3' (RC70X27.37, TriLink Biotechnologies) (SEQ ID №: 1).

Праймерная последовательность представляла собой:

5'-atatatatgccacaccctgccctc-3' ((AT)4-5P27, IDT Technologies) (SEQ ID №: 2).

Кратко, 10 пмоль праймера помечали 10 пмоль ³²P-ATP при 37°C в течение 30 минут 3' фосфатазой минус T4 полинуклеотид киназа (New England Biolabs) в 7 мМ трис-HCl, pH 7,6 @ 25°C, 10 мМ MgCl₂, 5 мМ дитиотреитола, и очищали путем пропускания через два картриджа Sephadex G-50 (GE Healthcare). 30 мкл реакции удлинения праймеров содержали 120 мМ Трис-HCl, pH 7,8, 10 мМ KCl, 7 мМ MgSO₄, 6 мМ (NH₄)₂SO₄, 0,001% BSA, 0,1% Тритон X-100, 3 пмоль темплаты, 6 пмоль праймера, и 7,5 единиц KOD экзонуклеаза-минус ДНК полимераза (EMD Novagen). Реакции инкубировали при 96°С в течение 30 секунд и при 65°С в течение 1 часа в планшете на 96 лунок в MJ термоциклере (Bio-Rad).

Пять мкл образцов анализировали на 8% акриламиде, 7 M мочевине, lx TBE гелях (Life Technologies) и выдерживали в течение 1 часа на экспонирующей планшете перед сканированием на устройстве формирования изображения на люминесцентном фосфорном покрытии FujiFilm FLA3000 (GE Healthcare).

Пример 6: Синтез молекул нуклеиновой кислоты с цитидин-5-карбоксамид модифицированными нуклеотидами

Данный пример представляет способы получения молекул нуклеиновой кислоты, имеющих цитидин-5-карбоксамид модифицированные нуклеотиды.

CEP (фосфорамидитные) реагенты (7a-c; Схема 1, Пример 1) были протестированы на предмет их применения в твердофазном олигонуклеотидном синтезе в автоматизированном устройстве для синтеза. Для каждого нового амидитного реагента, шесть различных олигонуклеотидов, которые различались по длине от 34 до 39 нуклеотидов в длину (или 34, 35, 36, 37, 38 или 39 нуклеотидов в длину) синтезировали с инсерцией от 0, 1, 2, 3, 4 или 5 цитидин-5-карбоксамид модифицированных нуклеотидов в последовательных внутренних положениях, исходя из модельной последовательности, показанной ниже. "X" в последовательности указывает на положение цитидин-5-карбоксамид модифицированных нуклеотидов внутри последовательности.

5'- GAGTGACCGTCTGCCTGX_0-5CAGACGACGAGCGGGA-3' (SEQ ID №: 3)

Таблица 5 ниже кратко описывает процентный выход олигонуклеотидов, синтезированных с 0-5 цитидин-5-карбоксамид модифицированными нуклеотидами.

Таблица 5
Синтетические ДНК последовательности, содержащие модифицированные 2'-дезоксицитидины Последовательность Данные ВЭЖХ Данные ЖХ/МС Цитидин мод/ (Фосфорамидит) X_n
n= %FL FL ожидаемая масса (amu) FL наблюдаемая масса (amu) Δ (amu) Бензил/
(7a) 0 65 10533,8 10531,2 2,6 1 60 10955,1 10953,6 1,5 2 64 11376,4 11375,4 1,0 3 65 11797,7 11797,9 0,2 4 52 12219,0 12220,2 1,2 5 52 12640,4 12642,5 2,1 0 60 10533,8 10531,3 2,5 1-Нафтилметил/
(7b) 1 67 11005,1 11003,3 1,7 2 64 11476,4 11475,8 0,6 3 54 11947,7 11948,2 0,5 4 47 12419,0 12420,2 1,2 5 49 12890,3 12892,9 2,6 3-Фенилпропил/
(7c) 0 69 10533,8 10531,3 2,4 1 59 10983,1 10981,3 1,8 2 68 11432,5 11431,6 0,9 3 41 11881,9 11882,0 0,1 4 42 12331,2 12332,2 1,0 5 49 12780,6 12782,8 2,2

Данные результаты указывают на то, что полноразмерные синтетические выходы для 1-3 последовательных связываний модифицированных цитидин фосфорамидитов (7a-c) были сравнимы с немодифицированными ДНК фосфорамидитами. Некоторая потеря выходов наблюдалась для 4 или 5 последовательных связываний немодифицированных цитидинов; однако значительные количества полноразмерного продукта были получены и подтверждены во всех случаях.

Пример 7: Включение трифосфатных реагентов (TPP реагент) цитидин-5-карбоксамид модифицированных нуклеотидов при помощи KOD ДНК полимеразы

Данный пример показывает, что цитидин-5-карбоксамид модифицированные нуклеотиды (9a, 9b и 9c Схемы 2) могут быть использованы в качестве субстратов KOD экзонуклеазы-минус ДНК полимеразы.

Фигура 1 ниже показывает результаты анализа удлинения праймеров. Все три модифицированных цитидин трифосфата были включены по меньшей мере настолько же эффективно, как и природный немодифицированный 2'-дезоксицитидин в данном анализе.

В целом, практический процесс синтеза цитидин-5-карбоксамид модифицированных нуклеотидов как 5'-О-трифосфатов, так и 3'-О-CEP фосфорамидитов педставляет ценные новые реагенты для in vitro выбора пост-SELEX оптимизации аптамеров.

Пример 8: Выбор цитидин-5-карбоксамид модифицированных нуклеотидных аптамеров при помощи SELEX

Данный пример показывает, что цитидин-5-карбоксамид модифицированные нуклеотидные аптамеры могут быть выбраны для связывания белка-мишени при помощи SELEX. Дополнительно, данный пример показывает сравнение цитидин-5-карбоксамид модифицированных нуклеотидных аптамеров, полученных из SELEX к конкретной мишени-белку, и уридин-5-карбоксамид модифицированных нуклеотидных аптамеров, полученных из SELEX к той же самой мишени-белку.

Четыре различные белка использовали в качестве мишеней для SELEX: PCSK9, PSMA, ERBB2 и ERBB3.

Модифицированные статистические библиотеки ферментно синтезированы при помощи KOD ДНК полимеразы с использованием стандартного протокола олигонуклеотидного синтеза. Статистические библиотеки включали контрольную библиотеку, помеченую как "dC/dT" и не содержавшую C-5 модифицированных нуклеотидов; NapdC библиотеку, NapdU (5-[N-(1-нафтилметил)карбоксамид]-2'-дезоксиуридиновую) библиотеку, PPdC библиотеку и PPdU (5-[N-(фенил-3-пропил)карбоксамид]-2'-дезоксиуридиновую) библиотеку. Все статистические библиотеки ферментно синтезированы с использованием тех же самых условий, направленных на по меньшей мере 5 нмоль конечный продукт на библиотеку (50-60% выход из исходной антисмысловой темплаты). Неочищенные библиотеки концентрировали при помощи 10 кДа HMW обрезающих ультрафильтрационных центрифугирующих устройств. Вращение концентрированногопродукта замедляли для удаления любых стрептавидиновых (SA) агарозных подложек с использованием SPIN-X микроцентрифужых пробирок, и количественно определяли путем измерения поглощения при 260 нм и при помощи предварительно рассчитанного коэффициента поглощения. Каждую модифицированную смысловую библиотеку качественно контролировали на предмет ее неспособности к сдвигу несвязанных SA для загрязнения биотинилированных антисмысловых нитей и также стандартных условий ПЦР амплификации (данные не показаны).

Рекомбинатнтный человеческий PCSK9 белок Gln31-Gln692 (75.1 кДа) с C-концевой поли His меткой и полученный в человеческих 293 (HEK293) клетках получали от ACRO Biosystems (Кат. № PC9-H5223). Этот белок гликозилировали и ауто-протеолитически расщепленный DTT-восстановленный белок исследовали использовали как 20 КДа (продомен) и 62 кДа (зрелый секретированный белок) полипептиды на SDS-PAGE геле.

Рекомбинантный человеческий PSMA (-110 кДа) получали от R&D Systems (Кат. № 4234-ZN-010) который был CHO-производным Lys44-Ala750 с N-концевой 6Xhis меткой.

Рекомбинантный человеческий ErbB2 белок Thr23-Thr652 (72,4 кДа) с C-концевой поли His меткой и полученный в человеческих 293 (HEK293) клетках, получали от ACRO Biosystems (Кат. № HE2-H5225). В результате гликозилирования, DTT-восстановленный белок мигрировал при 90-110 кДа диапазоне на SDS-PAGE для данной мишени.

Рекомбинантный человеческий ЕгЬВЗ белок Ser20 - Thr643 (71,5 кДа) с C-концевой 6XHis t меткой и полученный в человеческих 293 (HEK293) клетках, получали от ACRO Biosystems (Кат. № ER3-H5223). результате гликозилирования, DTT-восстановленный белок мигрировал при 100-110 кДа диапазоне на SDS-PAGE f для данной мишени.

Все мишени, которые были использованы в SELEX, проверяли на чистоту и эффективность захвата при разделении при помощи магнитных Dynabcads® His-Tag улавливающих подложек Life technologies (Кат. № 10104D). Все мишени эффективно улавливались с использованием His меченых улавливающих подложек.

SELEX протоколу (начальный раунд 25 мМ DxSO4 Kinetic Challenge) следовали для всех стадий отбора. Для первого раунда, использовали 1000 пмоль (~10¹⁵ последовательностей) статистическую библиотеку для каждого SELEX эксперимента. Мишени использовали при концентрации 50 пмоль (улавливали на 500 мгк His улавливающих подложках) и комплексы уравновешивали при 37C в течение 1 часа и затем несколько раз промывали 1XSB18, 0,05% TWEEN20. Выбранные последовательности элюировали 20 мМ NaOH, нейтрализовали и ПЦР амплифицировали при помощи 5' OH праймера и 3' биотинилированного праймера. Амплифицированную с двойной спиралью немодифицированную ДНК захватывали на SA магнитные подложки, промывали и смысловую ДНК элюировали и удлиняли праймер при помощи модифицированных нуклеотидов для регенерации обогащенного модифицированного пула для использования в следующем раунде SELEX экспериментов.

Всего завершили шесть раундов отбора. В общем, пробы находились при 1 нМ концентрациях белка как C_t разности для +/- образцы отбора белков, которые не улучшались, что указывало на вероятность отутствия дополнительного обогащения последовательностей, SELEX останавливали на Раунде 6, модифицированную смысловую еДНК получали для всех образцов и выполняли афинности пулов к соответствующим мишеням. Необходимо отметить, что немодифицированные контрольные ДНК обогащенные библиотеки обрабатывали аналогично модифицированным библиотекам, несмотря на то, что ПЦР амплифицированная и элюированная смысловая ДНК нить может быть непосредственно использована в следующих раундах SELEX.

еДНК метили радиоизотопом и анализы связывания на фильтре проводили для обогащенных пулов и сравнивали с соответствующими исходными статистическими библиотеками. Статистические библиотеки не связывали четыре белка. Таблица 6 показывает результаты для данных афинности для четырех белков-мишеней PCSK9, PSMA, ERBB2 и ERBB3.

Таблица 6
Данные афинности пула мишеней через 6 раундов SELEX Белок-мишень Афинность пула (нМ) NapdC NapdU PPdC PPdU PCSK9 1,57 нМ 0,72 в отношении того же самого белка 2,44 нМ 1,02 нМ PSMA 0,86 нМ 7,8 нМ 6,32 нМ 6,79 нМ ERBB2 11,4 нМ 10,2 нМ 71,3 нМ 6,57 нМ ERBB3 0,25 нМ 0,38 нМ 15,9 нМ 0,3 нМ

Как показано в Таблице 6, средняя афинность связывания (K_d) для пула аптамеров нуклеиновых кислот, имеющих по меньшей мере один C-5 модифицированный цитодиновый нуклеотид, обогащенный для связывания с PSMA белком-мишенью посредством SELEX, составляла 0,86 нМ (NapdC), по сравнению с 7,8 нМ для пула аптамеров нуклеиновых кислот, имеющих NapdU в отношении того же самого белка; и 6,32 нМ (PPdC), по сравнению с 6,79 нМ для пула аптамеров нуклеиновых кислот, имеющих PpdU в отношении того же самого белка. Средняя афинность связывания (K_d) для пула аптамеров нуклеиновых кислот, имеющих по меньшей мере один C-5 модифицированный цитодиновый нуклеотид, обогащенный для связывания ERBB3 белка-мишени посредством SELEX. составляла 0,25 нМ (NapdC), по сравнению с 0,38 нМ для пула аптамеров нуклеиновых кислот, имеющих NapdU в отношении того же самого белка.

Дополнительный анализ SELEX пулов аптамеров нуклеиновых кислот, обогащенных для связывания с белками PSCK9, PSMA, ERBB2 и ERBB3, показал, что SELEX, выполненный с аптамерами нуклеиновых кислот, имеющих по меньшей мере один C-5 модифицированный цитодиновый нуклеотид, обеспечивал большее количество последовательностей нуклеиновых кислот с несколькими копиями (более чем две (2) копии) по сравнению с SELEX, выполненным с аптамерами нуклеиновых кислот, имеющих по меньшей мере один C-5 модифицированный уридиновый нуклеотид. Таблица 7 ниже подытоживает различия SELEX, выполненных с NapdC, NapdU, PPdC и PPdU.

Таблица 7
Количество последовательностей с несколькими копиями (>2) после 6 раундов SELEX Белок-мишень Количество последовательностей с несколькими копиями (>2) NapdC NapdU PPdC PPdU PCSK9 151 78 302 46 PSMA 187 143 251 58 ERBB2 52 65 85 40 ERBB3 144 160 94 30

В общем, Таблица 7 показывает, что C-5 модифицированный цитодиновый нуклеотид представляет большее количество последовательностей, имеющих более двух копий в пуле аптамерных последовательностей нуклеиновой кислоты, обогащенных белком-мишенью, связанным посредством SELEX. Таким образом, в общем, C-5 модифицированный цитодиновый нуклеотид в SELEX по сравнению с белком-мишенью представляет большее разнообразие последовательностей нуклеиновых кислот с несколькими копиями, что, соответственно представляет большее количество аптамеров нуклеиновой кислоты для выбора для дополнительной характеристики и разработки в качестве реагента связывания белков и/или терапевтического агента. Эти полезные C-5 модифицированные цитодиновые нуклеотиды лучше реализованы с учетом проблем, связанных с разработкой аптамера нуклеиновой кислоты с конкретной целью (например, анализы связывания белков - анализы афинной адсорбции, очистка белка, масс-спектрометрия; инструмент-реагент и/или агонисты или антагонисты лечебных белков). Большее количество аптамера нуклеиновой кислоты с несколькими копиями представляет большее количество последовательностей, которые могут быть подвергнуты скринингу и дополнительно разработаны с конкретной целью и уменьшают частоту неудач такой разработки.

ССЫЛКИ

Gold, L. et al. (2010) Aptamer-based proteomic technology for biomarker discovery. PLoS ONE, 5(12), е15004.

Hollenstein, M. (2012) Synthesis of Deoxynucleoside Triphosphates that Include Praline, Urea, or Sulfonamide Groups and Their Polymerase Incorporation into DNA. Chemistry, A European Journal, 18, 13320-13330.

Imaizumi, Y. et al. (2013) Efficacy of Base-Modification on Target Binding of Small Molecule DNA Aptamers. J. Am. Chem. Soc, 135(25), 9412-9419.

Davies, D. R. et al. (2012) Unique motifs and hydrophobic interactions shape the binding of modified DANN ligands to protein targets. PNAS, 1 90(49), 19971-19976.

Lee, K. Y. et al. (2010) Bioimaging of Nucleolin Aptamer-Containing 5-(N-benzylcarboxamide)-2'-deoxyuridine More Capable of Specific Binding to Targets in Cancer Cells. J. Biomedicine and Biotechnology, article ID 168306, 9 pages.

Kerr, C. E. et al. Synthesis of N,N-Dialkylaniline-2'-deoxyuridine Conjugates for DNA-Mediated Electron Transfer Studies. Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids, 19(5&6), 851-866.

Gaballah, S. T.et al. (2002) Synthesis of 5-(2,2'-Bipyridyl- and 2,2'-Bipyridinediiumyl)-2'-deoxyuridine Nucleosides: Precursors to Metallo-DNA Conjugates. Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids 21(8&9), 547-560.

Vaught, J. D. et al.. (2004) T7 RNA Polymerase Transcription with 5-Position Modified UTP Derivatives. J. Am. Chem. Soc, 126, 11231-11237.

Vaught, J. D.; et al. (2010) Expanding the chemistry of DNA for in vitro selection. J. Am. Chem. Soc, 132(12), 4141-4151.

Nomura, Y. et al. (1997) Site-specific introduction of functional groups into phosphodiester oligodeoxynucleotides and their thermal stability and nuclease-resistance properties. Nucleic Acids Res., 25(14), 2784-2791.

Nomura, Y. et al. (1996) Nucleosides and Nucleotides. 161. Incorporation of 5-(N-aminoalkyl)carbamoyl-2'-deoxycytidines into oligodeoxynucleotides by a convenient post-synthetic modification method. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 6(23), 2811-2816.

Uozumi, Y. et al. (2001) Double Carbonylation of Aryl Iodides with Primary Amines under Atmospheric Pressure Conditions Using the Pd/Ph₃P/DABCO/THF System. J. Org. Chem. 66, 5272-5274.

Takacs, A. et al. (2008) Palladium-catalyzed Aminocarbonylation of Iodoarenes and Iodoalkenes with Aminophosphonate as N-Nucleophile. Tetrahedron. 64, 8726-8730.

Ross, B. S. et al. (2006) Efficient Large-Scale Synthesis of 5'-O-Dimethoxytrityl-N4-Benzoyl-5-methyl-2'-deoxycytidine. Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids, 25, 765-770.

Sanghvi, Y. S. et al. (2000) Improved Process for the Preparation of Nucleosidic Phosphoramidites Using a Safer and Cheaper Activator. Organic Process Research & Development, 4, 175-181.

Still, W. С et al. (1978) Rapid Chromatographie Technique for Preparative Separations with Moderate Resolution. J. Org. Chem., 43, 2923-2925.

Leonard, N. J. and Neelima (1995) 1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol for the Removal of the 4,4'-Dimethoxytrytil Protecting Group from the 5'-Hydroxyl of Acid-Sensitive Nucleosides and Nucleotides. Tetrahedron Letters, 36(43), 7833-7836.

Ludwig, J. and Eckstein, F. (1989) Rapid and Efficient Synthesis of Nucleoside 5'-O-(1-Thiotriphosphates), 5'-Triphosphates and 2',3'-Cyclophosphorothioates Using 2-Chloro-4H-1,3,2-benzodioxaphophorin-4-one. J. Org. Chem., 54, 631-635.

Ito, T. et al. (2003) Synthesis, thermal stability и Resistance to enzymatic hydrolysis of the oligonucleotides containing 5-(N-aminohexyl)carbamoyl-2'-O-methyluridines. Nucleic Acids Res., 31(10), 2514-2523.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> SomaLogic, Inc.

<120> Цитидин-5-карбокасамид модифицированные нуклеотидные композиции и

способы, относящиеся к ним

<130> 0057.65PCT

<150> US 61/907,274

<151> 2013-11-21

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 131

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетическая

<400> 1

ttttttttct tcttctcctt tctcttccca aaatcacacg gacccagggc attctagata 60

tggtttacgc tcaagcgaac ttgccgtcct gagtgtaaag agggaaagag ggcagggtgt 120

ggcatatata t 131

<210> 2

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> праймер

<400> 2

atatatatgc cacaccctgc cctc 24

<210> 3

<211> 38

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетическая

<220>

<221> misc_feature

<222> (18)..(22)

<223> Цитидин-5-карбокасамид модифицированные нуклеотиды, эти нуклеотиды могут отсутствовать.

<400> 3

gagtgaccgt ctgcctgnnn nncagacgac gagcggga 38

<---

Настоящее изобретение может быть применено в химической промышленности и относится к соединению формул I, IV или V, способу их получения и молекуле ДНК на их основе для использования в способе выбора аптамера нуклеиновой кислоты:

где X выбран из -H; и соединение формулы I выбрано из 5-(N-1-бензилкарбоксамид)-2'-дезоксицитидин-5'-O-трифосфата, 5-(N-1-нафтилметилкарбоксамид)-2'-дезоксицитидин-5'-O-трифосфата, 5-(N-3-Фенилпропилкарбоксамид)-2'-дезоксицитидин-5'-O-трифосфата; их триэтиламмониевых солей. Способ получения указанного соединения включает превращение соединения Формулы IX, где R^X6 представляет собой I или Br; R^X7 и R^X8 представляют собой водород или защитную группу, реакцией, катализируемой палладием(0) в присутствии соответствующего амина, монооксида углерода и растворителя. Предложено новое соединение и новый эффективный способ его получения, а также новая молекула ДНК на его основе и эффективный способ выбора аптамера нуклеиновой кислоты с ее использованием. 4 н.п. ф-лы, 8 пр., 7 табл., 1 ил.

1.Соединение, представленное Формулой I

где R независимо представляет собой -(CH₂)_n-, где n представляет собой 1, 3;

R^X1 независимо выбирают из радикалов

где означает место присоединения группы R^X1 к группе -(CH₂)_n-; и

X и R' выбирают из -H;

R'' выбирают из водорода и трифосфата (-P(O)(OH)-O-P(O)(OH)-O-P(O)(OH)₂); где соединение, представленное Формулой I, выбрано из 5-(N-1-Бензилкарбоксамид)-2'-дезоксицитидин-5'-O-трифосфата, 5-(N-1-Нафтилметилкарбоксамид)-2'-дезоксицитидин-5'-O-трифосфата, 5-(N-3-Фенилпропилкарбоксамид)-2'-дезоксицитидин-5'-O-трифосфат; их триэтиламмониевых солей и соединений, представленных Формулой IV или V

где X выбирают из H.

2. Молекула ДНК для применения в способе выбора аптамера нуклеиновой кислоты, имеющего аффинность связывания с молекулой-мишенью, где молекула ДНК соответствует SEQ ID NO: 1-3 и содержит соединение, представленное Формулой IA

где X выбирают из -H, и структура фрагмента R-R^Х1 является той же, что и структура этого фрагмента, указанного в п. 1.

3. Способ получения соединения, имеющего Формулу I согласно п. 1, включающий предоставление соединения, имеющего Формулу IX

где R^X6 представляет собой группу йода или брома;

R^X7 и R^X8 в каждом случае независимо представляют собой водород или защитную группу;

X выбирают из -H; и

превращение соединения Формулы IX реакцией, катализируемой палладием(0) в присутствии R^X1-R-NH₂, монооксида углерода и растворителя; где R^X1-R как представлен в п. 1, таким образом, получая соединение по п. 1; и

выделение соединения Формулы I.

4. Способ выбора аптамера нуклеиновой кислоты, имеющего аффинность связывания с молекулой-мишенью, включающий:

приведение в контакт кандидатной смеси и мишени, причем кандидатная смесь содержит модифицированные нуклеиновые аптамеры, в которых один, несколько или все пиримидины в по меньшей мере одном или каждом аптамере нуклеиновой кислоты содержат структуру, представленную Формулой IA, как указано в п. 2, для образования комплексов аптамеров нуклеиновой кислоты и молекул-мишеней;

отделение комплексов аптамеров нуклеиновой кислоты и молекул-мишеней от кандидатной смеси;

диссоциацию комплексов аптамеров нуклеиновой кислоты и молекул-мишеней с получением несвязанных аптамеров нуклеиновой кислоты;

амплификацию несвязанных аптамеров нуклеиновой кислоты с получением аптамеров нуклеиновой кислоты, имеющих увеличенный полупериод диссоциации из молекулы-мишени относительно других нуклеиновых кислот в кандидатной смеси;

идентификацию по меньшей мере одного аптамера нуклеиновой кислоты, в котором один, несколько или все пиримидины содержат структуру, представленную Формулой IA, как указано в п. 2, причем аптамер нуклеиновой кислоты имеет аффинность связывания с молекулой-мишенью.