ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

[0001] Данная заявка испрашивает преимущество по приоритету предварительной заявки на патент США № 62/357,623, поданной 1 июля 2016 г., и предварительной заявки на патент США № 62/437,592, поданной 21 декабря 2016 г., каждая из которых включена посредством ссылки в данный документ во всей своей полноте для любой цели.

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

[0002] Данная заявка содержит перечень последовательностей, который был подан в электронном виде в формате ASCII и тем самым включен посредством ссылки во всей своей полноте. Указанная копия в формате ASCII, созданная 15 июня 2017 г., называется 01137-0020-00PCT_SL.txt и имеет размер 21863 байта.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

[0003] Настоящее изобретение в общем относится к области олигонуклеотидов, содержащих модифицированные нуклеозиды, таких как аптамеры, которые способны к связыванию с молекулами-мишенями. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к олигонуклеотидам, таким как аптамеры, которые содержат более чем один тип модифицированного по основанию нуклеозида, а также к способам получения и применения таких аптамеров.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[0004] Модифицированные нуклеозиды применяли в качестве терапевтических средств, диагностических средств и для внедрения в олигонуклеотиды для улучшения их свойств (например, стабильности).

[0005] SELEX (систематическая эволюция лигандов при экспоненциальном обогащении) представляет собой способ идентификации олигонуклеотидов (называемых «аптамерами»), которые селективно связывают молекулы-мишени. Способ SELEX описан, например, в патенте США № 5270163. Способ SELEX включает отбор и идентификацию олигонуклеотидов из случайной смешанной выборки олигонуклеотидов для достижения практически любого желаемого критерия аффинности связывания и селективности. Посредством введения модифицированных нуклеозидов конкретных типов в олигонуклеотиды, идентифицированные в ходе осуществления способа SELEX, могут быть изменены стабильность в присутствии нуклеаз, суммарный заряд, гидрофильность или липофильность для обеспечения отличий в трехмерной структуре и показателей способности связывания с мишенью олигонуклеотидов.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0006] В некоторых вариантах осуществления представлен аптамер, содержащий по меньшей мере один первый модифицированный в 5-положении пиримидин и по меньшей мере один второй модифицированный в 5-положении пиримидин, где первый модифицированный в 5-положении пиримидин и второй модифицированный в 5-положении пиримидин являются различными. В некоторых вариантах осуществления первый модифицированный в 5-положении пиримидин представляет собой модифицированный в 5-положении уридин, и при этом второй модифицированный в 5-положении пиримидин представляет собой модифицированный в 5-положении цитидин. В некоторых вариантах осуществления первый модифицированный в 5-положении пиримидин представляет собой модифицированный в 5-положении цитидин, и при этом второй модифицированный в 5-положении пиримидин представляет собой модифицированный в 5-положении уридин. В некоторых вариантах осуществления модифицированный в 5-положении уридин содержит фрагмент в 5-положении, выбранный из нафтильного фрагмента, бензильного фрагмента, тирозильного фрагмента, индольного фрагмента и фрагмента морфолинo. В некоторых вариантах осуществления модифицированный в 5-положении цитидин содержит фрагмент в 5-положении, выбранный из нафтильного фрагмента, бензильного фрагмента, тирозильного фрагмента и фрагмента морфолинo. В некоторых вариантах осуществления фрагмент ковалентно связан с 5-положением основания посредством линкера, предусматривающего группу, выбранную из амидного линкера, карбонильного линкера, пропинильного линкера, алкинового линкера, сложноэфирного линкера, мочевинного линкера, карбаматного линкера, гуанидинового линкера, амидинового линкера, сульфоксидного линкера и сульфонового линкера. В некоторых вариантах осуществления модифицированный в 5-положении цитидин выбран из NapdC, 2NapdC, TyrdC и PPdC. В некоторых вариантах осуществления модифицированный в 5-положении уридин выбран из NapdU, 2NapdU, PPdU, MOEdU, TyrdU, TrpdU и ThrdU. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один первый модифицированный в 5-положении пиримидин представляет собой NapdC, и по меньшей мере один второй модифицированный в 5-положении пиримидин выбран из NapdU, 2NapdU, PPdU, MOEdU, TyrdU и ThrdU. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один первый модифицированный в 5-положении пиримидин представляет собой PPdC, и по меньшей мере один второй модифицированный в 5-положении пиримидин выбран из NapdU, 2NapdU, PPdU, MOEdU, TyrdU, TrpdU и ThrdU. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один второй модифицированный в 5-положении пиримидин представляет собой TyrdU. В некоторых вариантах осуществления первый модифицированный в 5-положении пиримидин и второй модифицированный в 5-положении пиримидин способны к встраиванию посредством фермента полимеразы. В некоторых вариантах осуществления первый модифицированный в 5-положении пиримидин и второй модифицированный в 5-положении пиримидин способны к встраиванию посредством ДНК-полимеразы из KOD.

[0007] В некоторых вариантах осуществления аптамер связывает белок-мишень, выбранный из PCSK9, PSMA, ErbBl, ErbB2, FXN, KDM2A, IGF1R, pIGF1R, a1-антитрипсина, CD99, MMP28 и PPIB.

[0008] В некоторых вариантах осуществления аптамер содержит участок на 5'-конце аптамера, который составляет по меньшей мере 10, по меньшей мере 15, по меньшей мере 20, по меньшей мере 25 или по меньшей мере 30 нуклеотидов в длину,

или от 5 до 30, от 10 до 30, от 15 до 30, от 5 до 20 или от 10 до 20 нуклеотидов в длину, где участок на 5'-конце аптамера не содержит модифицированных в 5-положении пиримидинов. В некоторых вариантах осуществления аптамер содержит участок на 3'-конце аптамера, который составляет по меньшей мере 10, по меньшей мере 15, по меньшей мере 20, по меньшей мере 25 или по меньшей мере 30 нуклеотидов в длину, или от 5 до 30, от 10 до 30, от 15 до 30, от 5 до 20 или от 10 до 20 нуклеотидов в длину, где участок на 3'-конце аптамера не содержит модифицированных в 5-положении пиримидинов. В некоторых вариантах осуществления аптамер составляет от 20 до 100, или от 20 до 90, или от 20 до 80, или от 20 до 70, или от 20 до 60, или от 20 до 50, или от 30 до 100, или от 30 до 90, или от 30 до 80, или от 30 до 70, или от 30 до 60, или от 30 до 50, или от 40 до 100, или от 40 до 90, или от 40 до 80, или от 40 до 70, или от 40 до 60, или от 40 до 50 нуклеотидов в длину.

[0009] В некоторых вариантах осуществления аптамер характеризуется улучшенной стабильностью в присутствии нуклеаз по сравнению с аптамером такой же длины и с нуклеотидной последовательностью, которая содержит немодифицированный пиримидин вместо каждого из первых модифицированных в 5-положении пиримидинов и/или немодифицированный пиримидин вместо каждого из второго модифицированного в 5-положении пиримидина. В некоторых вариантах осуществления аптамер характеризуется более длительным периодом полувыведения из сыворотки человека по сравнению с аптамером такой же длины и с нуклеотидной последовательностью, которая содержит немодифицированный пиримидин вместо каждого из первых модифицированных в 5-положении пиримидинов или немодифицированный пиримидин вместо каждого из второго модифицированного в 5-положении пиримидина.

[0010] В некоторых вариантах осуществления представлена композиция, содержащая множество полинуклеотидов, где каждый полинуклеотид содержит по меньшей мере один первый модифицированный в 5-положении пиримидин и по меньшей мере один второй модифицированный в 5-положении пиримидин, где первый модифицированный в 5-положении пиримидин и второй модифицированный в 5-положении пиримидин являются различными. В некоторых вариантах осуществления каждый полинуклеотид содержит фиксированный участок на 5'-конце полинуклеотида. В некоторых вариантах осуществления фиксированный участок на 5'-конце каждого полинуклеотида составляет по меньшей мере 10, по меньшей мере 15, по меньшей мере 20, по меньшей мере 25 или по меньшей мере 30 нуклеотидов в длину, или от 5 до 30, от 10 до 30, от 15 до 30, от 5 до 20 или от 10 до 20 нуклеотидов в длину. В некоторых вариантах осуществления каждый полинуклеотид содержит фиксированный участок на 3'-конце полинуклеотида. В некоторых вариантах осуществления фиксированный участок на 3'-конце полинуклеотида составляет по меньшей мере 10, по меньшей мере 15, по меньшей мере 20, по меньшей мере 25 или по меньшей мере 30 нуклеотидов в длину, или от 5 до 30, от 10 до 30, от 15 до 30, от 5 до 20 или от 10 до 20 нуклеотидов в длину. В некоторых вариантах осуществления первый модифицированный в 5-положении пиримидин представляет собой модифицированный в 5-положении уридин, и при этом второй модифицированный в 5-положении пиримидин представляет собой модифицированный в 5-положении цитидин. В некоторых вариантах осуществления первый модифицированный в 5-положении пиримидин представляет собой модифицированный в 5-положении цитидин, и при этом второй модифицированный в 5-положении пиримидин представляет собой модифицированный в 5-положении уридин. В некоторых вариантах осуществления модифицированный в 5-положении уридин содержит фрагмент в 5-положении, выбранный из нафтильного фрагмента, бензильного фрагмента, тирозильного фрагмента, триптофанильного фрагмента, индольного фрагмента и фрагмента морфолинo. В некоторых вариантах осуществления модифицированный в 5-положении цитидин содержит фрагмент в 5-положении, выбранный из нафтильного фрагмента, бензильного фрагмента, тирозильного фрагмента и фрагмента морфолинo. В некоторых вариантах осуществления фрагмент ковалентно связан с 5-положением основания посредством линкера, предусматривающего группу, выбранную из амидного линкера, карбонильного линкера, пропинильного линкера, алкинового линкера, сложноэфирного линкера, мочевинного линкера, карбаматного линкера, гуанидинового линкера, амидинового линкера, сульфоксидного линкера и сульфонового линкера. В некоторых вариантах осуществления модифицированный в 5-положении цитидин выбран из NapdC, 2NapdC, TyrdC и PPdC. В некоторых вариантах осуществления модифицированный в 5-положении уридин выбран из NapdU, PPdU, MOEdU, TyrdU, TrpdU и ThrdU. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один первый модифицированный в 5-положении пиримидин представляет собой NapdC, и по меньшей мере один второй модифицированный в 5-положении пиримидин выбран из NapdU, 2NapdU, PPdU, MOEdU, TyrdU, TrpdU и ThrdU. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один первый модифицированный в 5-положении пиримидин представляет собой PPdC, и по меньшей мере один второй модифицированный в 5-положении пиримидин выбран из NapdU, 2NapdU, PPdU, MOEdU, TrydU, TrpdU и ThrdU. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один второй модифицированный в 5-положении пиримидин представляет собой TyrdU. В некоторых вариантах осуществления первый модифицированный в 5-положении пиримидин и второй модифицированный в 5-положении пиримидин способны к встраиванию посредством фермента полимеразы. В некоторых вариантах осуществления первый модифицированный в 5-положении пиримидин и второй модифицированный в 5-положении пиримидин способны к встраиванию посредством ДНК-полимеразы из KOD.

[0011] В некоторых вариантах осуществления каждый полинуклеотид композиции содержит произвольный участок. В некоторых вариантах осуществления произвольный участок составляет от 20 до 100, или от 20 до 90, или от 20 до 80, или от 20 до 70, или от 20 до 60, или от 20 до 50, или от 20 до 40, или от 30 до 100, или от 30 до 90, или от 30 до 70, или от 30 до 60, или от 30 до 50, или от 30 до 40 нуклеотидов в длину. В некоторых вариантах осуществления каждый полинуклеотид составляет от 20 до 100, или от 20 до 90, или от 20 до 80, или от 20 до 70, или от 20 до 60, или от 20 до 50, или от 30 до 100, или от 30 до 90, или от 30 до 80, или от 30 до 70, или от 30 до 60, или от 30 до 50, или от 40 до 100, или от 40 до 90, или от 40 до 80, или от 40 до 70, или от 40 до 60, или от 40 до 50 нуклеотидов в длину.

[0012] В некоторых вариантах осуществления представлена композиция, содержащая первый аптамер, второй аптамер и мишень, где первый аптамер содержит по меньшей мере один первый модифицированный в 5-положении пиримидин и по меньшей мере один второй модифицированный в 5-положении пиримидин; при этом второй аптамер содержит по меньшей мере один третий модифицированный в 5-положении пиримидин или где второй аптамер содержит по меньшей мере один третий модифицированный в 5-положении пиримидин и по меньшей мере один четвертый модифицированный в 5-положении пиримидин; где первый аптамер, второй аптамер и мишень способны к образованию тримерного комплекса; и где первый модифицированный в 5-положении пиримидин и второй модифицированный в 5-положении пиримидин являются различными модифицированными в 5-положении пиримидинами.

[0013] В некоторых вариантах осуществления первый модифицированный в 5-положении пиримидин представляет собой модифицированный в 5-положении уридин, и при этом второй модифицированный в 5-положении пиримидин представляет собой модифицированный в 5-положении цитидин. В некоторых вариантах осуществления первый модифицированный в 5-положении пиримидин представляет собой модифицированный в 5-положении цитидин, и при этом второй модифицированный в 5-положении пиримидин представляет собой модифицированный в 5-положении уридин. В некоторых вариантах осуществления модифицированный в 5-положении уридин содержит фрагмент в 5-положении, выбранный из нафтильного фрагмента, бензильного фрагмента, тирозильного фрагмента, индольного фрагмента и фрагмента морфолинo. В некоторых вариантах осуществления модифицированный в 5-положении цитидин содержит фрагмент в 5-положении, выбранный из нафтильного фрагмента, бензильного фрагмента, тирозильного фрагмента и фрагмента морфолинo. В некоторых вариантах осуществления фрагмент ковалентно связан с 5-положением основания посредством линкера, предусматривающего группу, выбранную из амидного линкера, карбонильного линкера, пропинильного линкера, алкинового линкера, сложноэфирного линкера, мочевинного линкера, карбаматного линкера, гуанидинового линкера, амидинового линкера, сульфоксидного линкера и сульфонового линкера. В некоторых вариантах осуществления модифицированный в 5-положении цитидин выбран из NapdC, 2NapdC, TyrdC и PPdC. В некоторых вариантах осуществления модифицированный в 5-положении уридин выбран из NapdU, 2NapdU, PPdU, MOEdU, TyrdU, TrpdU и ThrdU. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один первый модифицированный в 5-положении пиримидин представляет собой NapdC, и по меньшей мере один второй модифицированный в 5-положении пиримидин выбран из NapdU, 2NapdU, PPdU, MOEdU, TyrdU, TrpdU и ThrdU. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один первый модифицированный в 5-положении пиримидин представляет собой PPdC, и по меньшей мере один второй модифицированный в 5-положении пиримидин выбран из NapdU, 2NapdU, PPdU, MOEdU, TyrdU, TrpdU и ThrdU. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один второй модифицированный в 5-положении пиримидин представляет собой TyrdU. В некоторых вариантах осуществления первый модифицированный в 5-положении пиримидин и второй модифицированный в 5-положении пиримидин способны к встраиванию посредством фермента полимеразы. В некоторых вариантах осуществления первый модифицированный в 5-положении пиримидин и второй модифицированный в 5-положении пиримидин способны к встраиванию посредством ДНК-полимеразы из KOD.

[0014] В некоторых вариантах осуществления третий модифицированный в 5-положении пиримидин выбран из модифицированного в 5-положении цитидина и модифицированного в 5-положении пиримидина. В некоторых вариантах осуществления третий модифицированный в 5-положении пиримидин и четвертый модифицированный в 5-положении пиримидин являются различными модифицированными в 5-положении пиримидинами. В некоторых вариантах осуществления третий модифицированный в 5-положении пиримидин представляет собой модифицированный в 5-положении цитидин, и четвертый модифицированный в 5-положении пиримидин представляет собой модифицированный в 5-положении уридин. В некоторых вариантах осуществления третий модифицированный в 5-положении цитидин выбран из BndC, PEdC, PPdC, NapdC, 2NapdC, NEdC, 2NEdC и TyrdC. В некоторых вариантах осуществления модифицированный в 5-положении уридин выбран из BNdU, NapdU, PEdU, IbdU, FBndU, 2NapdU, NEdU, MBndU, BFdU, BTdU, PPdU, MOEdU, TyrdU, TrpdU и ThrdU.

[0015] В некоторых вариантах осуществления мишень выбрана из белка, пептида, углевода, малой молекулы, клетки и ткани.

[0016] В некоторых вариантах осуществления представлен способ, включающий:

(a) приведение в контакт аптамера, способного к связыванию с молекулой-мишенью в образце;

(b) инкубирование аптамера с образцом с обеспечением образования комплекса аптамер-мишень;

(c) обогащение в отношении комплекса аптамер-мишень в образце и

(c) выявление наличия аптамера, комплекса аптамер-мишень или молекулы-мишени, где обнаружение аптамера, комплекса аптамер-мишень или молекулы-мишени указывает на то, что молекула-мишень присутствует в образце, и при этом отсутствие обнаружения аптамера, комплекса аптамер-мишень или молекулы-мишени указывает на то, что молекула-мишень отсутствует в образце;

где аптамер представляет собой аптамер с двойной модификацией, представленный в данном документе. В некоторых вариантах осуществления способ включает по меньшей мере одну дополнительную стадию, выбранную из: добавления молекулы конкурента к образцу; захвата комплекса аптамер-мишень на твердую подложку и добавления молекулы конкурента и разбавления образца; где по меньшей мере одну дополнительную стадию проводят после стадии (a) или стадии (b). В некоторых вариантах осуществления молекула конкурента выбрана из полианионного конкурента. В некоторых вариантах осуществления полианионный конкурент выбран из олигонуклеотида, полидекстрана, ДНК, гепарина и дНТФ. В некоторых вариантах осуществления полидекстран представляет собой сульфат декстрана; и ДНК представляет собой ДНК молок сельди или ДНК молок лосося. В некоторых вариантах осуществления молекула-мишень выбрана из белка, пептида, углевода, малой молекулы, клетки и ткани. В некоторых вариантах осуществления образец выбран из цельной крови, лейкоцитов, мононуклеарных клеток периферической крови, плазмы, сыворотки, мокроты, выдыхаемого воздуха, мочи, семенной жидкости, слюны, менингеальной жидкости, околоплодной жидкости, жидкости из желез, лимфатической жидкости, аспирата из сосков, бронхиального аспирата, синовиальной жидкости, суставного аспирата, клеток, клеточной вытяжки, кала, ткани, тканевого биопсийного материала и спинномозговой жидкости.

[0017] В некоторых вариантах осуществления представлен способ выявления мишени в образце, включающий

a) приведение в контакт образца с первым аптамером с образованием смеси, где первый аптамер способен к связыванию с мишенью с образованием первого комплекса;

b) инкубирование смеси в условиях, которые обеспечивают образование первого комплекса;

c) приведение в контакт смеси со вторым аптамером, где второй аптамер способен к связыванию с первым комплексом с образованием второго комплекса;

d) инкубирование смеси в условиях, которые обеспечивают образование второго комплекса;

e) выявление наличия или отсутствия первого аптамера, второго аптамера, мишени, первого комплекса или второго комплекса в смеси, где присутствие первого аптамера, второго аптамера, мишени, первого комплекса или второго комплекса указывает на то, что мишень присутствует в образце;

где первый аптамер содержит по меньшей мере один первый модифицированный в 5-положении пиримидин и по меньшей мере один второй модифицированный в 5-положении пиримидин;

где второй аптамер содержит по меньшей мере один третий модифицированный в 5-положении пиримидин или где второй аптамер содержит по меньшей мере один третий модифицированный в 5-положении пиримидин и по меньшей мере один четвертый модифицированный в 5-положении пиримидин;

где первый модифицированный в 5-положении пиримидин и второй модифицированный в 5-положении пиримидин являются различными модифицированными в 5-положении пиримидинами.

[0018] В некоторых вариантах осуществления первый модифицированный в 5-положении пиримидин представляет собой модифицированный в 5-положении уридин, и при этом второй модифицированный в 5-положении пиримидин представляет собой модифицированный в 5-положении цитидин. В некоторых вариантах осуществления первый модифицированный в 5-положении пиримидин представляет собой модифицированный в 5-положении цитидин, и при этом второй модифицированный в 5-положении пиримидин представляет собой модифицированный в 5-положении уридин. В некоторых вариантах осуществления модифицированный в 5-положении уридин содержит фрагмент в 5-положении, выбранный из нафтильного фрагмента, бензильного фрагмента, тирозильного фрагмента, индольного фрагмента и фрагмента морфолинo. В некоторых вариантах осуществления модифицированный в 5-положении цитидин содержит фрагмент в 5-положении, выбранный из нафтильного фрагмента, бензильного фрагмента, тирозильного фрагмента и фрагмента морфолинo. В некоторых вариантах осуществления фрагмент ковалентно связан с 5-положением основания посредством линкера, предусматривающего группу, выбранную из амидного линкера, карбонильного линкера, пропинильного линкера, алкинового линкера, сложноэфирного линкера, мочевинного линкера, карбаматного линкера, гуанидинового линкера, амидинового линкера, сульфоксидного линкера и сульфонового линкера. В некоторых вариантах осуществления модифицированный в 5-положении цитидин выбран из NapdC, 2NapdC, TyrdC и PPdC. В некоторых вариантах осуществления модифицированный в 5-положении уридин выбран из NapdU, 2NapdU, PPdU, MOEdU, TyrdU, TrpdU и ThrdU. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один первый модифицированный в 5-положении пиримидин представляет собой NapdC, и по меньшей мере один второй модифицированный в 5-положении пиримидин выбран из NapdU, 2NapdU, PPdU, MOEdU, TyrdU и ThrdU. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один первый модифицированный в 5-положении пиримидин представляет собой PPdC, и по меньшей мере один второй модифицированный в 5-положении пиримидин выбран из NapdU, 2NapdU, PPdU, MOEdU, TyrdU, TrpdU и ThrdU. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один второй модифицированный в 5-положении пиримидин представляет собой TyrdU. В некоторых вариантах осуществления первый модифицированный в 5-положении пиримидин и второй модифицированный в 5-положении пиримидин способны к встраиванию посредством фермента полимеразы. В некоторых вариантах осуществления первый модифицированный в 5-положении пиримидин и второй модифицированный в 5-положении пиримидин способны к встраиванию посредством ДНК-полимеразы из KOD.

[0019] В некоторых вариантах осуществления третий модифицированный в 5-положении пиримидин выбран из модифицированного в 5-положении цитидина и модифицированного в 5-положении пиримидина. В некоторых вариантах осуществления третий модифицированный в 5-положении пиримидин и четвертый модифицированный в 5-положении пиримидин являются различными модифицированными в 5-положении пиримидинами. В некоторых вариантах осуществления третий модифицированный в 5-положении пиримидин представляет собой модифицированный в 5-положении цитидин, и четвертый модифицированный в 5-положении пиримидин представляет собой модифицированный в 5-положении уридин. В некоторых вариантах осуществления третий модифицированный в 5-положении цитидин выбран из BndC, PEdC, PPdC, NapdC, 2NapdC, NEdC, 2NEdC и TyrdC. В некоторых вариантах осуществления модифицированный в 5-положении уридин выбран из BNdU, NapdU, PedU, IbdU, FbndU, 2NapdU, NedU, MbndU, BfdU, BtdU, PpdU, MOEdU, TyrdU, TrpdU и ThrdU.

[0020] В некоторых вариантах осуществления молекула-мишень выбрана из белка, пептида, углевода, малой молекулы, клетки и ткани. В некоторых вариантах осуществления первый аптамер, второй аптамер и мишень способны к образованию тримерного комплекса.

[0021] В некоторых вариантах осуществления представлен способ идентификации одного или нескольких аптамеров, способных к связыванию с молекулой-мишенью, включающий:

(a) приведение в контакт библиотеки аптамеров с молекулой-мишенью с образованием смеси и обеспечение образования комплекса аптамер-мишень, где комплекс аптамер-мишень образуется, когда аптамер обладает аффинностью по отношению к молекуле-мишени;

(b) отделение комплекса аптамер-мишень от остальной части смеси (или обогащение в отношении комплекса аптамер-мишень);

(c) диссоциацию комплекса аптамер-мишень и

(d) идентификацию одного или нескольких аптамеров, способных к связыванию с молекулой-мишенью;

где библиотека аптамеров содержит множество полинуклеотидов, где каждый полинуклеотид содержит по меньшей мере один первый модифицированный в 5-положении пиримидин и по меньшей мере один второй модифицированный в 5-положении пиримидин, где первый модифицированный в 5-положении пиримидин и второй модифицированный в 5-положении пиримидин являются различными модифицированными в 5-положении пиримидинами. В некоторых вариантах осуществления стадии (a), (b) и/или (c) повторяют по меньшей мере один раз, два раза, три раза, четыре раза, пять раз, шесть раз, семь раз, восемь раз, девять или десять раз.

[0022] В некоторых вариантах осуществления один или несколько аптамеров, способных к связыванию с молекулой-мишенью, являются амплифицированными. В некоторых вариантах осуществления смесь содержит молекулу полианионного конкурента. В некоторых вариантах осуществления полианионный конкурент выбран из олигонуклеотида, полидекстрана, ДНК, гепарина и дНТФ. В некоторых вариантах осуществления полидекстран представляет собой сульфат декстрана; и ДНК представляет собой ДНК молок сельди или ДНК молок лосося.

[0023] В некоторых вариантах осуществления молекула-мишень выбрана из белка, пептида, углевода, малой молекулы, клетки и ткани.

[0024] В некоторых вариантах осуществления каждый полинуклеотид содержит фиксированный участок на 5'-конце полинуклеотида. В некоторых вариантах осуществления фиксированный участок на 5'-конце каждого полинуклеотида составляет по меньшей мере 10, по меньшей мере 15, по меньшей мере 20, по меньшей мере 25 или по меньшей мере 30 нуклеотидов в длину, или от 5 до 30, от 10 до 30, от 15 до 30, от 5 до 20 или от 10 до 20 нуклеотидов в длину. В некоторых вариантах осуществления каждый полинуклеотид содержит фиксированный участок на 3'-конце полинуклеотида. В некоторых вариантах осуществления фиксированный участок на 3'-конце полинуклеотида составляет по меньшей мере 10, по меньшей мере 15, по меньшей мере 20, по меньшей мере 25 или по меньшей мере 30 нуклеотидов в длину, или от 5 до 30, от 10 до 30, от 15 до 30, от 5 до 20 или от 10 до 20 нуклеотидов в длину.

[0025] В некоторых вариантах осуществления первый модифицированный в 5-положении пиримидин представляет собой модифицированный в 5-положении уридин, и при этом второй модифицированный в 5-положении пиримидин представляет собой модифицированный в 5-положении цитидин. В некоторых вариантах осуществления первый модифицированный в 5-положении пиримидин представляет собой модифицированный в 5-положении цитидин, и при этом второй модифицированный в 5-положении пиримидин представляет собой модифицированный в 5-положении уридин. В некоторых вариантах осуществления модифицированный в 5-положении уридин содержит фрагмент в 5-положении, выбранный из нафтильного фрагмента, бензильного фрагмента, тирозильного фрагмента, индольного фрагмента и фрагмента морфолинo. В некоторых вариантах осуществления модифицированный в 5-положении цитидин содержит фрагмент в 5-положении, выбранный из нафтильного фрагмента, бензильного фрагмента, тирозильного фрагмента и фрагмента морфолинo. В некоторых вариантах осуществления фрагмент ковалентно связан с 5-положением основания посредством линкера, предусматривающего группу, выбранную из амидного линкера, карбонильного линкера, пропинильного линкера, алкинового линкера, сложноэфирного линкера, мочевинного линкера, карбаматного линкера, гуанидинового линкера, амидинового линкера, сульфоксидного линкера и сульфонового линкера. В некоторых вариантах осуществления модифицированный в 5-положении цитидин выбран из NapdC, 2NapdC, TyrdC и PPdC. В некоторых вариантах осуществления модифицированный в 5-положении уридин выбран из NapdU, PPdU, MOEdU, TyrdU, TrpdU и ThrdU. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один первый модифицированный в 5-положении пиримидин представляет собой NapdC, и по меньшей мере один второй модифицированный в 5-положении пиримидин выбран из NapdU, 2NapdU, PPdU, MOEdU, TrydU, TrpdU и ThrdU. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один первый модифицированный в 5-положении пиримидин представляет собой PPdC, и по меньшей мере один второй модифицированный в 5-положении пиримидин выбран из NapdU, 2NapdU, PPdU, MOEdU, TyrdU, TrpdU и ThrdU. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один второй модифицированный в 5-положении пиримидин представляет собой TyrdU. В некоторых вариантах осуществления первый модифицированный в 5-положении пиримидин и второй модифицированный в 5-положении пиримидин способны к встраиванию посредством фермента полимеразы. В некоторых вариантах осуществления первый модифицированный в 5-положении пиримидин и второй модифицированный в 5-положении пиримидин способны к встраиванию посредством ДНК-полимеразы из KOD.

[0026] В некоторых вариантах осуществления каждый полинуклеотид содержит произвольный участок. В некоторых вариантах осуществления произвольный участок составляет от 20 до 100, или от 20 до 90, или от 20 до 80, или от 20 до 70, или от 20 до 60, или от 20 до 50, или от 20 до 40, или от 30 до 100, или от 30 до 90, или от 30 до 70, или от 30 до 60, или от 30 до 50, или от 30 до 40 нуклеотидов в длину. В некоторых вариантах осуществления каждый полинуклеотид составляет от 20 до 100, или от 20 до 90, или от 20 до 80, или от 20 до 70, или от 20 до 60, или от 20 до 50, или от 30 до 100, или от 30 до 90, или от 30 до 80, или от 30 до 70, или от 30 до 60, или от 30 до 50, или от 40 до 100, или от 40 до 90, или от 40 до 80, или от 40 до 70, или от 40 до 60, или от 40 до 50 нуклеотидов в длину.

[0027] В некоторых вариантах осуществления каждый полинуклеотид представляет собой аптамер, который связывает мишень, и при этом библиотека содержит по меньшей мере 1000 аптамеров, где каждый аптамер содержит различные нуклеотидные последовательности.

[0028] В некоторых вариантах осуществления представлен аптамер, который связывает белок PCSK9. В некоторых таких вариантах осуществления аптамер содержит последовательность 5'-yGpppG-3', где каждый у представляет собой TyrdU, и каждый p представляет собой NapdC. В некоторых вариантах осуществления аптамер дополнительно содержит последовательность 5'-yEAyGA_npAp-3', где E выбран из y, A и G; и n равняется 0 или 1. В некоторых вариантах осуществления n равняется 0. В некоторых вариантах осуществления последовательность 5'-yEAyGA_npAp-3' расположена на 5'-конце последовательности 5'-yGpppG-3'. В некоторых вариантах осуществления E представляет собой y.

[0029] В некоторых вариантах осуществления представлен аптамер, который связывает PCSK9, где аптамер содержит последовательность 5'-F_npppAAGRJrpRppWm-3' (SEQ ID NO: 81), где F выбран из r и G; каждый R независимо выбран из G и A; J выбран из r и A; W выбран из r, G и A; n равняется 0 или 1; m равняется 0 или 1; r представляет собой PpdC; и p представляет собой NapdU. В некоторых вариантах осуществления m равняется 1. В некоторых вариантах осуществления F представляет собой r. В некоторых вариантах осуществления J представляет собой r. В некоторых вариантах осуществления W представляет собой G.

[0030] В некоторых вариантах осуществления представлен аптамер, который связывает PCSK9, где аптамер содержит последовательность 5'-TTppGGpp-3', где каждый p представляет собой NapdC.

[0031] В некоторых вариантах осуществления аптамер, который связывает PCSK9, составляет от 20 до 100, или от 20 до 90, или от 20 до 80, или от 20 до 70, или от 20 до 60, или от 20 до 50, или от 30 до 100, или от 30 до 90, или от 30 до 80, или от 30 до 70, или от 30 до 60, или от 30 до 50, или от 40 до 100, или от 40 до 90, или от 40 до 80, или от 40 до 70, или от 40 до 60, или от 40 до 50 нуклеотидов в длину.

[0032] В некоторых вариантах осуществления аптамер ингибирует связывание PCSK9 с LDL-R. В некоторых вариантах осуществления аптамер ингибирует связывание PCSK9 с LDL-R при IC₅₀ менее 30 нМ, менее 20 нМ или менее 15 нМ.

[0033] В некоторых вариантах осуществления представлен способ снижения уровня холестерина у субъекта, включающий введение субъекту, нуждающемуся в нем, аптамера, который связывает PCSK9. В некоторых вариантах осуществления аптамер, который связывает PCSK9, представляет собой аптамер, представленный в данном документе. В некоторых вариантах осуществления холестерин представляет собой холестерин (LDL-C) липопротеинов низкой плотности (LDL). В некоторых вариантах осуществления у субъекта имеется гетерозиготная семейная гиперхолестеринемия или клиническое атеросклеротическое сердечно-сосудистое заболевание (CVD).

[0034] Вышеуказанные и другие цели, признаки и преимущества настоящего изобретения станут более очевидными из следующего подробного описания, которое следует далее со ссылкой на прилагаемые графические материалы.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

[0035] Фиг. 1. Отбор аптамеров нуклеиновых кислот, модифицированных с помощью библиотек ДНК, содержащих модифицированный в C5-положении уридин и цитидинтрифосфаты. Схематические изображения отбора с применением двух модифицированных оснований. Схема способа отбора, при которой применяли библиотеку на основе 30N рандомизированных химически синтезированных эталонных антисмысловых биотинилированных шаблонов для ферментативного синтеза различных модифицированных и немодифицированный библиотек посредством реакций удлинения праймера.

[0036] Фиг. 2. Значения аффинности связывания 40-мерных (30N+5+5) аптамеров с PCSK9, полученных с применением различных модифицированных библиотек. Аптамеры со значениями аффинности ≥ 1 нМ выделены оттенком серого цвета, и при этом аптамеры, показанные при аффинности 320 нМ, представляют отсутствие выявляемого связывания при верхнем значении концентрации 32 нМ на кривой связывания. Черная линия на каждой из библиотек указывает на медианное значение для всех аптамеров в такой библиотеке.

[0037] Фиг. 3. Аффинность и число копий в процентах для одной модификации, либо dU, либо dC, по сравнению с двумя модификациями, dC с dU. Каждая точка представляет один из аптамеров при значениях аффинности, показанных по оси Y, и число их копий в процентах по оси X. Красные точки представляют аптамеры с одной модификацией, а зеленые точки (незаштрихованные и заштрихованные) представляют аптамеры с двумя модификациями. Заштрихованные зеленые точки представляют некоторые аптамеры Nap-dC/Tyr-dU и PP-dC/Tyr-dU.

[0038] фиг. 4A-B. Возможность укорачивания аптамеров с модификацией по одному основанию и аптамеров с модификацией по двум основаниям. (A) Все 40-мерные последовательности с высокой аффинностью дополнительно укорачивали до 30-мерных, до длины их произвольного участка с удалением лишь 5 нуклеотидов с каждого из 5'- и 3'-концов. Доля в процентах аптамеров, которые сохраняют аффинность связывания или имеют улучшенную аффинность связывания с PCSK9, нанесены на ось Y. (B) Сравнения аффинности и возможности укорачивания аптамеров с модификацией по одному основанию и аптамеров с модификацией по двум основаниям из каждой отдельной библиотеки. Аптамеры со значениями аффинности ≥ 1 нМ выделены оттенком серого цвета, при этом наивысшие средние значения аффинности были для аптамеров с комбинациями двух модифицированных оснований PP-dC с PP-dU, Nap-dU и Tyr-dU.

[0039] Фиг. 5. Специфичность связывания мишени для трех аптамеров с высокой аффинностью из каждой библиотеки с другими пропротеинконвертазами (PC). Измерения аффинности в растворе проводили всего для тридцати трех аптамеров (40-мерных), причем одиннадцать аптамеров с одним модифицированным основанием (т. е. три аптамера с Nap-dC/dT; три аптамера с dC/Nap-dU; три аптамера с dC/Pp-dU и два аптамера с dC/Ty-dU) и двадцать два аптамера с двумя модифицированными основаниями (т. е. три аптамера с Nap-dC/Nap-dU; три аптамера с Nap-dC/Pp-dU; три аптамера с Nap-dC/Moe-dU; три аптамера с Nap- dC/Tyr-dU; три аптамера с Pp-dC/Pp-dU; три аптамера с Pp-dC/Nap-dU; три аптамера с Pp-Ty-dU и один аптамер с Pp-dC/Moe-dU). Аптамеры, которые находятся ниже пунктирной линии при аффинности 100 нМ, указывают на отсутствие выявляемого связывания при концентрации 100 нМ. Значения аффинности для остальных PC (PCSK5, PCSK6 и PCSK8) не проверяли.

[0040] Фиг. 6. Межвидовая перекрестная реактивность аптамеров с модификацией по одному основанию и с модификацией по двум основаниям. Аффинность укороченных 30-мерных аптамеров с одной модификацией (три аптамера) и с двумя модификациями (38 аптамеров) (величина K_d ≤ 1 нМ) к PCSK9 человека, обезьяны, мыши и крысы. Аптамеры с одной модификацией связываются с PSCKS9 человека и обезьяны, но не связываются с PSKC9 мыши или крысы. Напротив, аптамеры с двумя модификациями связываются с белками человека, обезьяны, мыши и крысы. Процент идентичности белка PCSK9 от каждого вида представлен относительно PSCK9 человека.

[0041] Фиг. 7A-C. Скрининг сэндвич-пар в анализе с применением частиц Luminex®. (A) Схематические изображения скрининга сэндвич-пар аптамеров. (B) Сэндвич-пары, демонстрирующие сигнал, который равняется 50-кратному или больше него при концентрации PCSK9 10 нМ, сравнивали с буфером без белка. Все аптамеры, тестируемые в сэндвич-анализе, были 40-мерными с Kd ≤ 1 нМ. Всего 70 пар продемонстрировали значения сигнала ≥ 50-кратного. Идентифицировали три сэндвич-пары, когда каждый аптамер из пары выбирали из библиотек с одной модификацией (3 сэндвич пары аптамеров/3 библиотеки с модификацией по одному основанию). Напротив, идентифицировали 22 сэндвич-пары, когда один аптамер из пары выбирали из трех библиотек с модификацией по одному основанию, а другой аптамер из пары выбирали из четырех библиотек с модификацией по двум основаниям (т. е. 22 сэндвич-пары аптамеров/3 библиотеки с модификацией по одному основанию, и 4 библиотеки с модификацией по двум основаниям), и 45 сэндвич-пар идентифицировали, когда оба аптамера из пары выбирали из библиотек с двумя модификациями (45 сэндвич-пар аптамеров/5 библиотек с модификацией по двум основаниям). (C) Сравнение числа сэндвич-пар для белка-мишени PCSK9, полученного из библиотеки аптамеров для захвата с аптамером с модификацией по одному основанию и библиотеки аптамеров для обнаружения с аптамером с модификацией по одному основанию; библиотеки аптамеров для захвата с аптамером с модификацией по одному основанию и библиотеки аптамеров для обнаружения с аптамером с модификацией по двум основаниям; и библиотеки аптамеров для захвата с аптамером с модификацией по двум основаниям и библиотеки аптамеров для обнаружения с аптамером с модификацией по двум основаниям.

[0042] Фиг. 8A-D. Сэндвич-пары, демонстрирующие зависимые от концентрации PCSK9 сигналы в анализах с применением частиц Luminex®. (A) Зависимые от концентрации сигналы наблюдали при наилучшей эффективности аптамера для захвата или первичного аптамера в паре с выбранными вторичным аптамером или аптамером для обнаружения. (B) Зависимые от концентрации сигналы наблюдали при наилучшей эффективности вторичного аптамера или аптамера для обнаружения с выбранными первичным аптамером или аптамером для захвата. (C) Ведущая сэндвич-пара, аптамер (первичный) с dC/PP-dU и аптамер (вторичный) с Nap-dC/Nap-dU, демонстрирующая сигналы при изменении ориентация аптамеров. (D) Стандартная кривая, полученная с применением рекомбинантного PCSK9 дикого типа и мутантного PCSK9 D374Y с новыми патологическими функциями. Линейные зависимые от концентрации сигналы получали с сэндвич-парой для выявления PCSK9 дикого типа (кольца) и мутантного белка PCSK9 D374Y с новыми патологическими функциями (треугольники).

[0043] Фиг. 9A-B. Чувствительность сэндвич-анализа: показатели сэндвич-анализа с применением аптамеров (аптамер (первичный) с dC/PP-dU и аптамер (вторичный) с Nap-dC/Nap-dU), демонстрирующие пределы обнаружения концентраций PCSK9 в буфере. (A) Линейные зависимые от концентрации сигналы наблюдали с применением сэндвич-анализа с применением аптамеров с нижним пределом количественного определения ~80 пг/мл (LLOQ) (B) Линейные зависимые от концентрации сигналы наблюдали с помощью сэндвич-анализа с применением аптамеров при верхнем пределе количественного определения ~10 нг/мл (ULOQ).

[0044] Фиг. 10. Линейность разбавления при сэндвич-анализе с применением аптамера (первичного) с dC/PP-dU и аптамера (вторичного) с Nap-dC/Nap-dU.

[0045] Фиг. 11. Сэндвич-анализ, включающий первичный аптамер с модификацией по одному основанию и вторичный аптамер с модификацией по двум основаниям (аптамер (первичный) с dC/PP-dU и аптамер (вторичный) с Nap-dC/Nap-dU).

[0046] Фиг. 12. Сверхэкспрессия PCSK9 в клетках HepG2 дикого типа.

[0047] Фиг. 13. Анализы ингибирования PCSK9 in vitro с применением планшетов: схематические изображения ингибирования PCSK9 аптамерами.

[0048] Фиг. 14. Скрининг ингибирования для аптамеров с модификацией по одному основанию или двум основаниям.

[0049] Фиг. 15A-B. Потенциальные терапевтические аптамеры с межвидовой перекрестной реактивностью с модификацией по двум основаниям. (A) Значения аффинности 30-мерного аптамера грызуна с модификацией по двум основаниям (PP-dC/Nap-dU) с межвидовой перекрестной реактивностью (11733-44, SEQ ID NO: 44) по отношению к PCSK9 человека (заштрихованное синее кольцо), мутантному PCSK9 D374Y человека с новыми патологическими функциями (заштрихованное красное кольцо), PCSK9 макака-резус (заштрихованный зеленый квадрат), PCSK9 крысы (заштрихованный розовый шестиугольник), PCSK9 мыши (заштрихованный перевернутый треугольник) и зашифрованного контрольного аптамера (незаштрихованный черный ромб). (B) Потенциальный терапевтический аптамер с межвидовой перекрестной реактивностью с модификацией по двум основаниям, демонстрирующий ингибирование взаимодействия PCSK9 с LDL-R. Аптамер, потенциально ингибирующий взаимодействие PCSK9 с LDL-R при величине EC₅₀ 2,1 нМ (синее заштрихованное кольцо) и PCSK9 D374Y при величине EC₅₀ 3,6 нМ (красный заштрихованный треугольник), и зашифрованный контрольный аптамер, демонстрирующий отсутствие ингибирования PCSK9 дикого типа (зеленые заштрихованные квадраты) и мутантного PCSK9 D374Y с новыми патологическими функциями (незаштрихованные черные квадраты).

[0050] Фиг. 16. Схематические изображения анализа обратимого поглощения LDL.

[0051] Фиг. 17. Ингибирование аптамера с PP-dC/Nap-DU с межвидовой перекрестной реактивностью разложения LDL-R посредством блокирования взаимодействия PCSK9 с LDL-R и повышение уровней LDL-R на поверхности клеток HepG2. Величина EC₅₀ для обратимого поглощения LDL составляет 13,5 нМ для активного SOMAmer (красное кольцо), которую наблюдали с зашифрованным контролем с такой же последовательностью (синий треугольник).

[0052] Фиг. 18. Стабильность аптамеров с одной модификацией и с двумя модификациями в 90% сыворотке человека с течением времени. Распределение модификаций аптамеров с одной модификацией по C-5 или с двумя модификациями по C-5 представлены на легенде фигуры (например, X/Y где X представляет собой dC (немодифицированный нуклеотид), NapdC (Nap) или PPdC (PP); и Y представляет собой dU или dT (немодифицированный нуклеотид, TyrdU (Tyr), NapdU (Nap), PPdU (PP) или MOEdU (MOE)).

[0053] Фиг. 19A-C. Значения аффинности связывания для 40-мерных (30N+5+5) аптамеров с ErbB2 (A), ЕгЬВЗ (В) и PSMA (C), полученных с применением различных модифицированных библиотек. Аптамеры со значениями аффинности ≥ 1 нМ выделены оттенком серого цвета, и при этом аптамеры, показанные при аффинности 320 нМ, представляют отсутствие выявляемого связывания при верхнем значении концентрации 32 нМ на кривой связывания. Черная линия на каждой из библиотек указывает на медианное значение для всех аптамеров в такой библиотеке.

[0054] Фиг. 20. Некоторые иллюстративные модифицированные в 5-положении уридины и цитидины, которые могут быть встроены в аптамеры.

[0055] Фиг. 21. Некоторые иллюстративные модификации, которые могут находиться в 5-положении уридина. Химическая структура модификации по C-5 включает иллюстративный амидный мостик, который соединяет модификацию с 5-положением уридина. Показанные фрагменты в 5-положении включают бензильный фрагмент (например, Bn, PE и PP), нафтильный фрагмент (например, Nap, 2Nap, NE), бутильный фрагмент (например, iBu), фторбензильный фрагмент (например, FBn), тирозильный фрагмент (например, Tyr), 3,4-метилендиоксибензил (например, MBn), фрагмент морфолинo (например, MOE), бензофуранильный фрагмент (например, BF), индольный фрагмент (например, Trp) и гидроксипропильный фрагмент (например, Thr).

[0056] Фиг. 22. Некоторые иллюстративные модификации, которые могут находиться в 5-положении цитидина. Химическая структура модификации по C-5 включает иллюстративный амидный мостик, который соединяет модификацию с 5-положением цитидина. Показанные фрагменты в 5-положении включают бензильный фрагмент (например, Bn, PE и PP), нафтильный фрагмент (например, Nap, 2Nap, NE и 2NE) и тирозильный фрагмент (например, Tyr).

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

[0057] Если не указано иное, технические термины употребляются в соответствии с общепринятым использованием. Определения часто используемых терминов в области молекулярной биологии могут быть найдены в Benjamin Lewin, Genes V, опубликованном Oxford University Press, 1994 (ISBN 0-19-854287-9); Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, опубликованной Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); и Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, опубликованном VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081- 569-8).

[0058] Если не указано иное, все технические и научные термины, приведенные в данном документе, имеют то же значение, обычно понимаемое специалистом в области техники, к которой относится настоящее изобретение. Термины в единственном числе включают в себя определяемые объекты во множественном числе, если из контекста явно не следует иное. «Содержащий A или B» подразумевает включающий A, или B, или A и B. Дополнительно следует понимать, что все размеры оснований или размеры аминокислот и все значения молекулярного веса или молекулярной массы, приведенные для нуклеиновых кислот или полипептидов, являются приблизительными и предназначены для описания.

[0059] Кроме того, диапазоны, представленные в данном документе, подразумевают все значения в пределах данного диапазона. Например, понятно, что диапазон от 1 до 50 включает любое число, комбинацию чисел или поддиапазон из группы, состоящей из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 или 50 (а также их долей, если контекст явно не предусматривает иное). Следует понимать, что любой диапазон концентраций, диапазон долей в процентах, диапазон соотношений или диапазон целых чисел включает значение в виде любого целого числа в пределах указанного диапазона и, когда это целесообразно, его доли (например, одну десятую и одну сотую целого числа), если не указано иное. Также, следует понимать, что любой числовой диапазон, приведенный в данном документе, относящийся к любому физическому признаку, такому как полимерные субъединицы, размер или толщина, включает любое целое число в пределах приведенного диапазона, если не указано иное. Применяемые в данном документе выражения «приблизительно» или «по сути состоящий из» означают ± 20% от указанного диапазона, величины или структуры, если не указано иное. Применяемые в данном документе термины «включает» и «содержит» предусматривают открытость списка и применяются синонимически.

[0060] Хотя способы и материалы аналогичные или эквивалентные описанным в данном документе могут быть использованы на практике или при испытании настоящего изобретения, подходящие способы и материалы описаны ниже. Все публикации, заявки на патенты, патенты и другие ссылки, упоминаемые в данном документе, включены посредством ссылки во всей своей полноте. В случае конфликта настоящее описание, включая разъяснения терминов, будет преобладать. Кроме того, материалы, способы и примеры являются лишь иллюстративными и не предназначены для ограничения.

[0061] Применяемый в данном документе термин «нуклеотид» относится к рибонуклеотиду, или дезоксирибонуклеотиду, или их модифицированной форме, а также их аналогам. Нуклеотиды включают соединения, которые включают пурины (например, аденин, гипоксантин, гуанин, а также их производные и аналоги), а также пиримидины (например, цитозин, урацил, тимин, а также их производные и аналоги). Применяемый в данном документе термин «цитидин» применяют в общем по отношению к рибонуклеотиду, дезоксирибонуклеотиду или модифицированному рибонуклеотиду, содержащим основание цитозин, если конкретно не указано иное. Термин «цитидин» включает 2'-модифицированные цитидины, такие как 2'-фтор, 2'-метокси и т. д. Подобным образом, термин «модифицированный цитидин» или конкретный модифицированный цитидин также относится к рибонуклеотиду, дезоксирибонуклеотиду или модифицированному рибонуклеотиду (такому как 2'-фтор, 2'-метокси и т. д.), содержащим модифицированное основание цитозин, если конкретно не указано иное. Термин «уридин» применяют в общем по отношению к рибонуклеотиду, дезоксирибонуклеотиду или модифицированному рибонуклеотиду, содержащим основание урацил, если конкретно не указано иное. Термин «уридин» включает 2'-модифицированные уридины, такие как 2'-фтор, 2'-метокси и т. д. Подобным образом, термин «модифицированный уридин» или конкретный модифицированный уридин также относится к рибонуклеотиду, дезоксирибонуклеотиду или модифицированному рибонуклеотиду (такому как 2'-фтор, 2'-метокси и т. д.), содержащим модифицированное основание урацил, если конкретно не указано иное.

[0062] Применяемый в данном документе термин «модифицированный в 5-положении цитидин» или «C-5-модифицированный цитидин» относится к цитидину с модификацией в C-5-положении цитидина, например, как показано на фигуре 20. Не имеющие ограничительного характера иллюстративные модифицированные в 5-положении цитидины включают таковые, показанные на фигуре 22. Не имеющий ограничительного характера иллюстративные модифицированные в 5-положении цитидины включают без ограничения 5-(N-бензилкарбоксамид)-2'-дезоксицитидин (называемый «BndC» и показанный на фигуре 21); 5-(N-2-фенилэтилкарбоксамид)-2'-дезоксицитидин (называемый «PEdC» и показанный на фигуре 21); 5-(N-3-фенилпропилкарбоксамид)-2'-дезоксицитидин (называемый «PPdC» и показанный на фигуре 21); 5-(N-1-нафтилметилкарбоксамид)-2'-дезоксицитидин (называемый «NapdC» и показанный на фигуре 21); 5-(N-2-нафтилметилкарбоксамид)-2'-дезоксицитидин (называемый «2NapdC» и показанный на фигуре 21); 5-(N-1-нафтил-2-этилкарбоксамид)-2'-дезоксицитидин (называемый «NEdC» и показанный на фигуре 21); 5-(N-2-нафтил-2-этилкарбоксамид)-2'-дезоксицитидин (называемый «2NEdC» и показанный на фигуре 21); и 5-(N-тирозилкарбоксамид)-2'-дезоксицитидин (называемый TyrdC и показанный на фигуре 21). В некоторых вариантах осуществления C5-модифицированные цитидины, например, в их трифосфатной форме, способны к встраиванию в олигонуклеотид посредством полимеразы (например, ДНК-полимеразы из KOD).

[0063] Химические модификации C-5-модифицированных цитидинов, описанные в настоящем документе, также могут быть объединены, по отдельности или в любой комбинации, с модификациями в 2'-положении сахара (например, 2'-O-метил или 2'-фтор), модификациями при экзоциклических аминах, и замещениях 4-тиоцитидина, и т. п.

[0064] Применяемый в данном документе термин «C-5-модифицированный уридин» или «модифицированный в 5-положении уридин» относится к уридину (как, правило дезоксиуридину) с модификацией в C-5-положении уридина, например, как показано на фигуре 20. В некоторых вариантах осуществления C5-модифицированные уридины, например, в их трифосфатной форме, способны к встраиванию в олигонуклеотид посредством полимеразы (например, ДНК-полимеразы из KOD). Не имеющие ограничительного характера иллюстративные модифицированные в 5-положении уридины включают таковые, показанные на фигуре 21. Не имеющий ограничительного характера иллюстративные модифицированные в 5-положении уридины включают:

5-(N-бензилкарбоксамид)-2'-дезоксиуридин (BndU),

5-(N-фенэтилкарбоксамид)-2'-дезоксиуридин (PEdU),

5-(N-тиофенилметилкарбоксамид)-2'-дезоксиуридин (ThdU),

5-(N-изобутилкарбоксамид)-2'-дезоксиуридин (iBudU),

5-(N-тирозилкарбоксамид)-2'-дезоксиуридин (TyrdU),

5-(N-3,4-метилендиоксибензилкарбоксамид)-2'-дезоксиуридин (MBndU),

5-(N-4-фторбензилкарбоксамид)-2'-дезоксиуридин (FBndU),

5-(N-3-фенилпропилкарбоксамид)-2'-дезоксиуридин (PPdU),

5-(N-имидизолилэтилкарбоксамид)-2'-дезоксиуридин (ImdU),

5-(N-триптаминокарбоксамид)-2'-дезоксиуридин (TrpdU),

5-(N-R-треонинилкарбоксамид)-2'-дезоксиуридин (ThrdU),

5-(N-[1-(3-триметиламмоний)пропил]карбоксамид)-2'-дезоксиуридина хлорид,

5-(N-нафтилметилкарбоксамид)-2'-дезоксиуридин (NapdU),

5-(N-[1-(2,3-дигидроксипропил)]карбоксамид)-2'-дезоксиуридин),

5-(N-2-нафтилметилкарбоксамид)-2'-дезоксиуридин (2NapdU),

5-(N-1-нафтилэтилкарбоксамид)-2'-дезоксиуридин (NEdU),

5-(N-2-нафтилэтилкарбоксамид)-2'-дезоксиуридин (2NEdU),

5-(N-3-бензофуранилэтилкарбоксамид)-2'-дезоксиуридин (BFdU),

5-(N-3-бензотиофенилэтилкарбоксамид)-2'-дезоксиуридин (BTdU).

[0065] Химические модификации C-5-модифицированных уридинов, описанные в настоящем документе, также могут быть объединены, по отдельности или в любой комбинации, с модификациями в 2'-положении сахара (например, 2'-O-метил или 2'-фтор), модификациями при экзоциклических аминах, и замещениях 4-тиоуридина, и т. п.

[0066] Применяемые в данном документе термины «модифицировать», «модифицированный», «модификация» и любые их вариации, в случае применения в отношении олигонуклеотида, означают, что по меньшей мере одно из четырех составляющих нуклеотидных оснований (то есть A, G, T/U и C) олигонуклеотида представляет собой аналог или сложный эфир встречающегося в природе нуклеотида. В некоторых вариантах осуществления модифицированный нуклеотид придает олигонуклеотиду устойчивость к нуклеазам. Дополнительные модификации могут включать модификации главной цепи, метилирования, комбинации при спаривании нестандартных оснований, таких как изоснования изоцитидин и изогуанидин, и т. п. Модификации также могут включать 3'- и 5'-модификации, такие как кэппирование. Другие модификации могут включать замещение по одному или нескольким из встречающихся в природе нуклеотидам аналогами, межнуклеотидные модификации, такие как, например, таковые с незаряженными мостиками (например, метилфосфонаты, фосфотриэфиры, фосфоамидаты, карбаматы и т. д.) и таковые с заряженными мостиками (например, фосфотиоаты, фосфодитиоаты и т. д.), таковые с интеркаляторами (например, акридин, псорален и т. д.), таковые, содержащие хелатирующие средства (например, металлы, радиоактивные металлы, бор, окислительные металлы и т. д.), таковые, содержащие алкилирующие средства, и таковые с модифицированными мостиками (например, альфа-аномерные нуклеиновые кислоты и т. д.). Дополнительно, любые из гидроксильных групп, обычно находящихся в сахаре нуклеотида, могут быть заменены фосфонатной группой или фосфатной группой; защищены стандартных ми защитными группами или активированы для получения дополнительных мостиков с дополнительными нуклеотидами или с твердой подложкой. 5'- и 3'-концевые группы OH могут быть фосфорилированы или замещены аминами, фрагментами органических кэппирующих групп из от приблизительно 1 до приблизительно 20 атомов углерода, полимерами на основе полиэтиленгликоля (PEG), которые в одном варианте осуществления составляют от приблизительно 10 до приблизительно 80 кДа, полимерами на основе PEG, которые в другом варианте осуществления составляют от приблизительно 20 до приблизительно 60 кДа, или другими гидрофильными или гидрофобными биологическими или синтетическими полимерами.

[0067] Применяемые в данном документе «нуклеиновая кислота», «олигонуклеотид» и «полинуклеотид» применяют взаимозаменяемо по отношению к полимеру из нуклеотидов, и при этом они включают ДНК, РНК, гибриды ДНК/РНК и модификации таких видов нуклеиновых кислот, олигонуклеотидов и полинуклеотидов, причем включено присоединение различных частиц или фрагментов к нуклеотидным звеньям в любом положении. Термины «полинуклеотид», «олигонуклеотид» и «нуклеиновая кислота» включают двух- или однонитевые молекулы, а также тройные спиральные молекулы. Нуклеиновая кислота, олигонуклеотид и полинуклеотид представляют собой более широкие термины, чем термин аптамер и, таким образом, термины нуклеиновая кислота, олигонуклеотид и полинуклеотид включают полимеры из нуклеотидов, которые представляют собой аптамеры, но при этом термины нуклеиновая кислота, олигонуклеотид и полинуклеотид не ограничены аптамерами.

[0068] Полинуклеотиды также могут содержать аналоговые формы сахаров рибозы или дезоксирибозы, которые в общем известны из уровня техники, включая 2'-O-метил, 2'-O-аллил, 2'-O-этил, 2'-O- пропил, 2'-О-СН₂СН₂ОСН₃, 2'-фтор, 2'-NH₂ или 2'-азидо, аналоги карбоциклических сахаров, α-аномерные сахара, эпимерные сахара, такие как арабиноза, ксилозы или ликсозы, пиранозные сахара, фуранозные сахара, седогептулозы, ациклические аналоги и абазические аналоги нуклеозидов, такие как метилрибозид. Как отмечено в данном документе, один или несколько фосфодиэфирных мостиков могут быть заменены альтернативными линкерными группами. Такие альтернативные линкерные группы включают варианты осуществления, где фосфат заменен P(O)S («тиоатом»), P(S)S («дитиоатом»), (O)NR^X ₂ («амидатом»), P(O) R^X, P(O)OR^X', CO или CH2 («формацеталем»), в которых каждый R^X или R^X1 независимо представляет собой H или замещенный или незамещенный алкил (C1-C20), необязательно содержащий эфирный (-O-) мостик, арил, алкенил, циклоалкил, циклоалкенил или аралкил. Не все мостики в полинуклеотиде должны быть одинаковыми. Замещение аналоговыми формами сахаров, пуринов и пиримидинов может быть выгодным при разработке конечного продукта, поскольку возможны альтернативные структуры главной цепи, например, подобные полиамидной главной цепи.

[0069] Полинуклеотиды также могут содержать аналоговые формы аналогов карбоциклических сахаров, α-аномерные сахара, эпимерные сахара, такие как арабиноза, ксилозы или ликсозы, пиранозные сахара, фуранозные сахара, седогептулозы, ациклические аналоги и абазические аналоги нуклеозидов, такие как метилрибозид.

[0070] Если она присутствует, модификация нуклеотидной структуры может быть обеспечена до или после сборки полимера. Последовательность нуклеотидов может быть прервана компонентами, не относящимися к нуклеотидам. Полинуклеотид может быть дополнительно модифицирован после полимеризации, например, путем конъюгации с компонентом для введения метки.

[0071] Применяемый в данном документе термин «по меньшей мере один нуклеотид» по отношению к модификациям нуклеиновой кислоты относится к одному, нескольким или всем нуклеотидам в нуклеиновой кислоте, указывая на то, что любой или все случаи любого или всех из A, C, T, G или U в нуклеиновой кислоте могут быть модифицированы или не модифицированы.

[0072] Применяемые в данном документе «лиганд на основе нуклеиновой кислоты», «аптамер», «SOMAmer» и «клон» применяют взаимозаменяемо по отношению к не встречающейся в природе нуклеиновой кислоте, которая характеризуется необходимым действием в отношении молекулы-мишени. Необходимое действие включает без ограничения связывание мишени, каталитическое изменение мишени, вступление в реакцию с мишенью по пути, при котором происходит модификация или изменение мишени или функциональной активности мишени, ковалентное присоединение к мишени (как в суицидном ингибиторе) и способствование протеканию реакции мишени с другой молекулой. В одном варианте осуществления действие представляет собой аффинность специфического связывания с молекулой-мишенью, причем такая молекула-мишень имеет трехмерную химическую структуру, отличную от таковой для полинуклеотида, который связывается с аптамером посредством механизма, который является независимым от спаривание оснований по Уотсону/Крику или образования тройной спирали, где аптамер не является нуклеиновой кислотой, обладающей известной физиологической функцией связывания молекулой-мишенью. Аптамеры для заданной мишени включают нуклеиновые кислоты, которые идентифицируют из смеси кандидатов нуклеиновых кислот, где аптамер представляет собой лиганд мишени, с помощью способа, включающего: (a) приведение в контакт смеси кандидатов с мишенью, где нуклеиновые кислоты, обладающие повышенной аффинностью к мишени относительно других нуклеиновых кислот в смеси кандидатов, могут быть отделены от остальной части смеси кандидатов; (b) отделение нуклеиновых кислот с повышенной аффинностью от остальной части смеси кандидатов и (c) проведение амплификации нуклеиновых кислот с повышенной аффинностью с получением обогащенной лигандами смеси нуклеиновых кислот, посредством чего идентифицируют аптамеры для молекулы-мишени. Следует признать, в отношении аффинных взаимодействий имеет место вопрос степени; однако в данном контексте «аффинность специфического связывания» аптамера в отношении его мишени означает, что аптамер связывается со своей мишенью в целом с гораздо более высокой степенью аффинности относительно того, как он связывается с другими, не относящимися к мишени, компонентами в смеси или в образце. «Аптамер», «SOMAmer» или «лиганд на основе нуклеиновой кислоты» представляет собой набор копий молекулы нуклеиновой кислоты одного типа или вида, который имеет определенную нуклеотидную последовательность. Аптамер может включать любое подходящее число нуклеотидов. «Аптамеры» относятся к более чем одному такому набору молекул. Различные аптамеры могут иметь либо одинаковые, либо различные числа нуклеотидов. Аптамеры могут представлять собой ДНК или РНК и могут быть однонитевыми, двунитевыми или могут содержать двунитевые или трехнитевые участки. В некоторых вариантах осуществления аптамеры получают с применением способа SELEX, описанного в настоящем документе или известного из уровня техники.

[0073] Применяемый в данном документе «SOMAmer» или модифицированный аптамер с замедленной скоростью диссоциации относится к аптамеру с улучшенными характеристиками в отношении скорости диссоциации. SOMAmer могут быть образованы с применением улучшенных способов SELEX, описанных в патенте США № 7947447 под названием "Method for Generating Aptamers with Improved Off-Rates".

[0074] Применяемый в данном документе аптамер, содержащий два модифицированных в 5-положении пиримидина или C-5-модифицированных пиримидины различного типа, может называться «аптамерами с двумя модификациями», аптамерами, содержащими «два модифицированных основания», аптамерами, имеющими «модификации по двум основаниям» или «модифицированными по двум основаниям», аптамерами, содержащими «два модифицированных основания», все из которых могут применяться взаимозаменяемо. В библиотеке аптамеров или аптамерной библиотеке также может применяться такая же терминология. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления аптамер содержит два различных модифицированных в 5-положении пиримидина, где два различных модифицированных в 5-положении пиримидина выбраны из NapdC и NapdU, NapdC и PPdU, NapdC и MOEdU, NapdC и TyrdU, NapdC и ThrdU, PPdC и PPdU, PPdC и NapdU, PPdC и MOEdU, PPdC и TyrdU, PPdC и ThrdU, NapdC и 2NapdU, NapdC и TrpdU, 2NapdC и NapdU, и 2NapdC и 2NapdU, 2NapdC и PPdU, 2NapdC и TrpdU, 2NapdC и TyrdU, PPdC и 2NapdU, PPdC и TrpdU, PPdC и TyrdU, TyrdC и TyrdU, TrydC и 2NapdU, TyrdC и PPdU, TyrdC и TrpdU, TyrdC и TyrdU, и TyrdC и TyrdU. В некоторых вариантах осуществления аптамер содержит по меньшей мере один модифицированный уридин и/или тимидин и по меньшей мере один модифицированный цитидин, где по меньшей мере один модифицированный уридин и/или тимидин модифицированы в 5-положении фрагментом, выбранным из нафтильного фрагмента, бензильного фрагмента, фторбензильного фрагмента, тирозильного фрагмента, индольного фрагмента, фрагмента морфолинo, изобутильного фрагмента, 3,4-метилендиоксибензильного фрагмента, бензотиофенильного фрагмента и бензофуранильного фрагмента, и при этом по меньшей мере один модифицированный цитидин модифицирован в 5-положении фрагментом, выбранным из нафтильного фрагмента, тирозильного фрагмента и бензильного фрагмента. В некоторых вариантах осуществления фрагмент ковалентно связан с 5-положением основания посредством линкера, предусматривающего группу, выбранную из амидного линкера, карбонильного линкера, пропинильного линкера, алкинового линкера, сложноэфирного линкера, мочевинного линкера, карбаматного линкера, гуанидинового линкера, амидинового линкера, сульфоксидного линкера и сульфонового линкера.

[0075] Применяемый в данном документе аптамер, содержащий один модифицированный в 5-положении пиримидин или C-5-модифицированный пиримидин одного типа, может называться «аптамерами с одной модификацией», аптамерами, содержащими «одно модифицированное основание», аптамерами, имеющими «модификацию по одному основанию» или «модифицированными по одному основанию», все из которых могут применяться взаимозаменяемо. В библиотеке аптамеров или аптамерной библиотеке также может применяться такая же терминология. Применяемый в данном документе «белок» применяют синонимически с «пептидом», «полипептидом» или «пептидным фрагментом». «Очищенные» полипептид, белок, пептид или пептидный фрагмент практически не содержат материала клетки или другие загрязняющие белки из клетки, ткани или бесклеточного источника, из которого получают аминокислотную последовательность, или практически не содержат химических предшественников или других химических веществ в случае химического синтеза.

[0076] В некоторых вариантах осуществления аптамер содержит первый модифицированный в 5-положении пиримидин и второй модифицированный в 5-положении пиримидин, где первый модифицированный в 5-положении пиримидин содержит тирозильный фрагмент в 5-положении первого модифицированного в 5-положении пиримидина, а второй модифицированный в 5-положении пиримидин содержит нафтильный фрагмент или бензильный фрагмент в 5-положении второго модифицированного в 5-положении пиримидина. В соответствующем варианте осуществления первый модифицированный в 5-положении пиримидин представляет собой урацил. В соответствующем варианте осуществления второй модифицированный в 5-положении пиримидин представляет собой цитозин. В соответствующем варианте осуществления по меньшей мере 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 100% урацилов в аптамере модифицированы в 5-положении. В соответствующем варианте осуществления по меньшей мере 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 100% цитозинов в аптамере модифицированы в 5-положении.

Модифицированные нуклеотиды

[0077] В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение предусматривает олигонуклеотиды, такие как аптамеры, которые содержат модифицированные по основанию нуклеотиды двух различных типов. В некоторых вариантах осуществления олигонуклеотиды содержат модифицированные в 5-положении пиримидины двух различных типов. В некоторых вариантах осуществления олигонуклеотид содержит по меньшей мере один C5-модифицированный цитидин и по меньшей мере один C5-модифицированный уридин. В некоторых вариантах осуществления олигонуклеотид содержит два различных C5-модифицированных цитидина. В некоторых вариантах осуществления олигонуклеотид содержит два различных C5-модифицированных уридина. Не имеющие ограничительного характера иллюстративные C5-модифицированные уридины и цитидины показаны, например, в формуле I ниже и на фигуре 20. Некоторые не имеющие ограничительного характера иллюстративные C5-модифицированные уридины показаны на фигуре 21, и некоторые не имеющие ограничительного характера иллюстративные C5-модифицированные цитидины показаны на фигуре 22.

[0078] В некоторых вариантах осуществления олигонуклеотид содержит по меньшей мере один пиримидин формулы I:

Формула I,

где

R независимо представляет собой -(CH₂)_n-, где n представляет собой целое число, выбранное из 0, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10;

R^X1 независимо выбран из группы, состоящей из

где * обозначает точку присоединения группы R^X1 к группе -(CH₂)_n-; и где

R^X4 независимо выбран из группы, состоящей из разветвленного или линейного низшего алкила (C1-C20); гидроксильной группы; галогена (F, Cl, Br, I); нитрила (CN); бороновой кислоты (BO₂H₂); карбоновой кислоты (COOH); сложного эфира карбоновой кислоты (COOR^X2); первичного амида (CONH₂); вторичного амида (CONHR^X2); третичного амида (CONR^X2R^X3); сульфонамида (SO₂NH₂); N-алкилсульфонамида (SONHR^X2);

R^X2 и R^X3 независимо, для каждого случая, выбраны из группы, состоящей из разветвленного или линейного низшего алкила (C1-C20); фенила (C₆H₅); замещенного R^X4 фенильного кольца (R^X4C₆H₄), где R^X4 определен выше; карбоновой кислоты (COOH); сложного эфира карбоновой кислоты (COOR^X5), где R^X5 представляет собой разветвленный или линейный низший алкил (C1-C20) и циклоалкил, где R^X2 и R^X3 вместе образуют замещенное или незамещенное 5- или 6-членное кольцо;

X независимо выбран из группы, состоящей из -H, -OH, -OMe, -O-аллил, -F, -OEt, -OPr, -OCH₂CH₂OCH₃, NH₂ и -азидо;

R' независимо выбран из группы, состоящей из -H, -OAc; -OBz; -P(NiPr₂)(OCH₂CH₂CN) и -OSiMe₂tBu;

R'' независимо выбран из группы, состоящей из водорода, 4,4'-диметокситритила (DMT) и трифосфата (-Р(О)(ОН)-О-Р(О)(ОН)-О-Р(О)(ОН)₂) или их соли;

Z независимо выбран из группы, состоящей из -H, замещенного или незамещенного C(1-4)алкила и его солей.

[0079] В некоторых вариантах осуществления олигонуклеотид содержит по меньшей мере один модифицированный пиримидин, показанный на фигуре 21, где каждый X независимо выбран из -H, -OH, - OMe, -O-аллила, -F, -OEt, -OPr, -OCH₂CH₂OCH₃, NH₂ и -азидо.

[0080] В некоторых вариантах осуществления олигонуклеотид содержит по меньшей мере один модифицированный пиримидин, показанный на фигуре 22, где каждый X независимо выбран из -H, -OH, - OMe, -O-аллила, -F, -OEt, -OPr, -OCH₂CH₂OCH₃, NH₂ и -азидо.

[0081] В некоторых вариантах осуществления олигонуклеотид содержит по меньшей мере один модифицированный пиримидин, показанный на фигуре 21, и по меньшей мере один модифицированный пиримидин, показанный на фигуре 22, где каждый X независимо выбран из -H, -OH, -OMe, -O-аллила, -F, -OEt, -OPr, -OCH₂CH₂OCH₃, NH₂ и -азидо. Некоторые не имеющие ограничительного характера иллюстративные пары модифицированных пиримидинов показаны в примерах, описанных в настоящем документе.

[0082] В некоторых вариантах осуществления олигонуклеотид содержит по меньшей мере один модифицированный пиримидин, показанный на фигуре 20, где 2'-положение рибозы независимо выбрано из -H, -OH, -OMe, -O-аллила, -F, -OEt, -OPr, -OCH₂CH₂OCH₃, NH₂ и -азидо. В некоторых вариантах осуществления олигонуклеотид содержит по меньшей мере два модифицированных пиримидина, показанных на фигуре 20, где 2'-положение рибозы независимо выбрано из -H, -OH, -OMe, -O-аллила, -F, -OEt, -OPr, -OCH₂CH₂OCH₃, NH₂ и -азидо.

[0083] В некоторых вариантах осуществления олигонуклеотид содержит по меньшей мере один модифицированный пиримидин, показанный на фигуре 20, и по меньшей мере один модифицированный пиримидин, показанный на фигуре 21 или фигуре 22, где 2'-положение рибозы независимо выбрано из -H, -OH, -OMe, -O-аллила, -F, -OEt, -OPr, -OCH₂CH₂OCH₃, NH₂ и -азидо. Некоторые не имеющие ограничительного характера иллюстративные пары модифицированных пиримидинов показаны в примерах, описанных в настоящем документе.

[0084] В любом из вариантов осуществления, описанных в настоящем документе, олигонуклеотид может представлять собой аптамер. В некоторых таких вариантах осуществления олигонуклеотид представляет собой аптамер, который специфически связывает полипептид-мишень.

Получение олигонуклеотидов

[0085] Автоматизированный синтез олигодезоксинуклеозидов является обычной практикой во множестве лабораторий (см., например, Matteucci, M. D. and Caruthers, M. H., (1990) J. Am. Chem. Soc., 103:3185-3191, содержания которых включены в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте). Синтез олигорибонуклеозидов также широко известен (см., например, Scaringe, S. A., et al., (1990) Nucleic Acids Res. 18:5433-5441, содержания которых включены в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте). Как отмечено в данном документе, фосфоамидиты являются применимыми для внедрения модифицированного нуклеозида в олигонуклеотид посредством химического синтеза, и при этом трифосфаты являются применимыми для внедрения модифицированного нуклеозида в олигонуклеотид посредством ферментативного синтеза. (См., например, Vaught, J. D. et al. (2004) J. Am. Chem. Soc., 126:11231-11237: Vaught, J. V., et al. (2010) J. Am. Chem. Soc. 132, 4141-4151; Gait, M. J. "Oligonucleotide Synthesis a practical approach" (1984) IRL Press (Оксфорд, Великобритания); Herdewijn, P. "Oligonucleotide Synthesis" (2005) (Humana Press, Тотова, Нью-Джерси (каждый из которых включен в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте).

Способ SELEX

[0086] Термины «SELEX» и «способ SELEX» применяют взаимозаменяемо в данном документе для общего наименования комбинации (1) отбора нуклеиновых кислот, которые взаимодействуют с молекулой-мишенью желательным образом, например, путем связывания с высокой аффинностью к белку, с (2) амплификацией таких выбранных нуклеиновых кислот. Способ SELEX может использоваться для идентификации аптамеров с высокой аффинностью к конкретной молекуле-мишени или биомаркеру.

[0087] SELEX в общем включает получение смеси кандидатов нуклеиновых кислот, связывание смеси кандидатов с желаемой молекулой-мишенью с образованием комплекса с аффинностью, отделение комплексов с аффинностью от несвязанных кандидатных нуклеиновых кислот, отделение и выделение нуклеиновой кислоты из комплекса с аффинностью, проведение очистки нуклеиновой кислоты и идентификацию конкретной последовательности аптамера. Способ может включать множество раундов для дополнительного улучшения аффинности отобранного аптамера. Способ может включать стадии амплификации в одной или нескольких точках способа. См., например, патент США № 5475096 под названием "Nucleic Acid Ligands". Способ SELEX может использоваться для генерации аптамера, который ковалентно связывает свою мишень, а также аптамера, который ковалентно не связывает свою мишень. См., например, патент США № 5705337 под названием "Systematic Evolution of Nucleic Acid Ligands by Exponential Enrichment: Chemi-SELEX".

[0088] Способ SELEX может использоваться для идентификации аптамеров с высокой аффинностью, содержащих модифицированные нуклеотиды, которые придают улучшенные характеристики аптамеру, такие как, например, улучшенная стабильность in vivo или улучшенные характеристики доставки. Примеры таких модификаций включают химические замещения по положениям в рибозе, и/или фосфате, и/или основании. Идентифицированные с помощью способа SELEX аптамеры, содержащие модифицированные нуклеотиды, описаны в патенте США № 5660985 под названием "High Affinity Nucleic Acid Ligands Containing Modified Nucleotides", в котором описаны олигонуклеотиды, содержащие производные нуклеотидов, химически модифицированные в 5'- и 2'-положениях пиримидинов. В патенте США № 5580737, см. выше, описываются высоко специфичные аптамеры, содержащие один или несколько нуклеотидов, модифицированных посредством 2'-амино (2'-NH₂), 2'-фтор (2'-F) и/или 2'-O-метил (2'-OMe). См. также публикацию заявки на патент США № 20090098549, под названием "SELEX and PHOTOSELEX", в которой описывается библиотека нуклеиновых кислот, обладающая расширенными физическими и химическими свойствами, и ее применение в способах SELEX и photoSELEX.

[0089] SELEX также может применяться для идентификации аптамеров, которые характеризуются необходимыми характеристиками в отношении скорости диссоциации. См. патент США № 7947447 под названием "Method for Generating Aptamers with Improved Off-Rates", который включен в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте, в нем описываются улучшенные способы SELEX для генерации аптамеров, которые могут связываться с молекулами-мишенями. Описаны способы получения аптамеров и фотоаптамеров, характеризующихся более низкими скоростями диссоциации относительно их соответствующих молекул-мишеней. Способы включают приведение в контакт смеси кандидатов с молекулой-мишенью, обеспечение образования комплексов нуклеиновая кислота-мишень и осуществление процесса обогащения по низкой скорости диссоциации, где комплексы нуклеиновая кислота-мишень с высокими значениями скорости диссоциации диссоциируют и не преобразуются, при этом комплексы с низкими значениями скоростей диссоциации остаются в неизменном виде. Дополнительно, способы включают применение модифицированных нуклеотидов при получении смесей кандидатных нуклеиновых кислот для генерации аптамеров с улучшенной характеристикой в отношении скорости диссоциации (см. патент США № 8409795 под названием "SELEX and PhotoSELEX"). (См. также патент США № 7855054 и публикацию патента США № 20070166740). Каждая из таких заявок включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.

[0090] «Мишенью», или «молекулой-мишенью», или «мишенью» в данном документе называется любое соединение, в присутствии которого нуклеиновая кислота может действовать необходимым образом. Молекула-мишень может представлять собой без ограничения белок, пептид, нуклеиновую кислоту, углевод, липид, полисахарид, гликопротеин, гормон, рецептор, антиген, антитело, вирус, патоген, токсичное вещество, субстрат, метаболит, аналог в переходном состоянии, кофактор, ингибитор, лекарственное средство, краситель, питательное вещество, фактор роста, клетку, ткань, любую часть или фрагмент любого из вышеуказанного и т. д. Фактически любой химический или биологический эффектор может представлять собой подходящую мишень. В качестве мишеней могут выступать молекулы любого размера. Мишень также может быть модифицирована посредством некоторых способов для улучшения вероятности или эффективности взаимодействия мишени с нуклеиновой кислотой. Мишень также может включать любую незначительную вариацию относительно определенного соединения или молекулы, такую как, в случае белка, например, незначительные вариации в аминокислотной последовательности, образование дисульфидной связи, гликозилирование, липидизация, ацетилирование, фосфорилирование, или любые другие манипуляцию или модификацию, такие как конъюгация с компонентом для введения метки, который практически не изменяет идентичность молекулы. «Молекула-мишень» или «мишень» представляет собой набор копий молекулы или мультимолекулярной структуры одного типа или вида, который способен к связыванию с аптамером. «Молекулы-мишени » или «мишени» относятся к более чем одному такому набору молекул. Варианты осуществления способа SELEX, в которых мишень представляет собой пептид, описаны в патенте США № 6376190, под названием "Modified SELEX Processes Without Purified Protein". В некоторых вариантах осуществления мишень представляет собой белок.

[0091] Применяемые в данном документе «молекула конкурента» и «конкурент» применяют взаимозаменяемо для обозначения любой молекулы, которая может образовывать неспецифический комплекс с молекулой, не являющейся мишенью. В данном контексте молекулы, не являющиеся мишенями, включают свободные аптамеры, где, например, конкурент может использоваться для ингибирования связывания аптамера (повторного связывания), неспецифического, с другой молекулой, не являющейся мишенью. «Молекула конкурента» или «конкурент» представляет собой набор копий молекулы одного типа или вида. «Молекулы конкурентов» или «конкуренты» относятся к более чем одному такому набору молекул. Молекулы конкурентов включают без ограничения олигонуклеотиды, полианионы (например, гепарин, ДНК молок сельди, ДНК молок лосося, тРНК, сульфат декстрана, полидекстран, абазические фосфодиэфирные полимеры, дНТФ и пирофосфат). В различных вариантах осуществления может использоваться комбинация одного или нескольких конкурентов.

[0092] Применяемый в данном документе «неспецифический комплекс» относится к нековалентной связи между двумя или более молекулами, отличными от аптамера и его молекулы-мишени. Неспецифический комплекс представляет взаимодействие между классами молекул. Неспецифические комплексы включают комплексы образованные между аптамером и молекулой, не являющейся мишенью, конкурентом и молекулой, не являющейся мишенью, конкурентом и молекулой-мишенью, и молекулой-мишенью и молекулой, не являющейся мишенью.

[0093] Применяемый в данном документе термин «процесс обогащения по низкой скорости диссоциации» относится к процессу изменения относительных концентраций некоторых компонентов смеси кандидатов так, чтобы относительная концентрация аптамерных комплексов с аффинностью, характеризующихся низкими значениями скорости диссоциации, повышалась относительно концентрации аптамерных комплексов с аффинностью, характеризующихся более высокими, менее желательными значениями скорости диссоциации. В одном варианте осуществления процесс обогащения по низкой скорости диссоциации представляет собой процесс обогащения в растворе по низкой скорости диссоциации. В данном варианте осуществления процесс обогащения в растворе по низкой скорости диссоциации происходит в растворе так, чтобы ни мишень, ни нуклеиновые кислоты, образующие аптамерные комплексы с аффинностью в смеси, не иммоблизировались на твердой подложке во время процесса обогащения по низкой скорости диссоциации. В различных вариантах осуществления процесс обогащения по низкой скорости диссоциации может включать одну или несколько стадий, включающих добавление молекулы конкурента и инкубацию с ней, разбавление смеси или комбинацию таковых (например, разбавление смеси в присутствии молекулы конкурента). Поскольку эффект процесса обогащения по низкой скорости диссоциации в общем зависит от отличающихся значений скорости диссоциации различных аптамерных комплексов с аффинностью (т. е. аптамерных комплексов с аффинностью, образованных молекулой-мишенью и различными нуклеиновыми кислотами в смеси кандидатов), продолжительность процесса обогащения по низкой скорости диссоциации выбирают так, чтобы сохранять высокую долю аптамерных комплексов с аффинностью, характеризующихся низкими значениями скорости диссоциации, при этом с существенным уменьшением числа аптамерных комплексов с аффинностью, характеризующихся высокими значениями скорости диссоциации. Процесс обогащения по низкой скорости диссоциации может применяться за один или несколько циклов во время осуществления способа SELEX. Когда разбавление и добавление конкурента применяют в комбинации, они могут осуществляться одновременно или последовательно в любом порядке. Процесс обогащения по низкой скорости диссоциации может использоваться, когда общая концентрация мишени (белка) в смеси является низкой. В одном варианте осуществления, когда процесс обогащения по низкой скорости диссоциации включает разбавление, смесь может быть разбавлена настолько, насколько это практически возможно, учитывая, что удерживаемые аптамером нуклеиновые кислоты извлекают на последующих раундах в способе SELEX. В одном варианте осуществления процесс обогащения по низкой скорости диссоциации включает применение конкурента, а также разбавление, позволяющее разбавлять смесь в меньшей степени, чем это может потребоваться, без применения конкурента.

[0094] В одном варианте осуществления процесс обогащения по низкой скорости диссоциации включает добавление конкурента, и при этом конкурент представляет собой полианион (например, гепарин или сульфат декстрана (декстран)). Гепарин или декстран применяли при идентификации конкретных аптамеров в предыдущих отборах SELEX. Однако в таких способах гепарин или декстран присутствуют во время стадии установления равновесия, на которой мишень и аптамер связываются с образованием комплексов. В таких способах, поскольку концентрация гепарина или декстрана повышается, соотношение комплексов мишень/аптамер с высокой аффинностью и комплексов мишень/аптамер с низкой аффинностью повышается. Однако высокая концентрация гепарина или декстрана может привести к снижению числа комплексов мишень/аптамер с высокой аффинностью при равновесии за счет конкуренции в отношении связывания мишени между нуклеиновой кислотой и конкурентом. Напротив, в описанных в данном случае способах конкурента добавляют после обеспечения образования комплексов мишень/аптамер и поэтому не влияют на число образованных комплексов. Добавление конкурента после равновесного связывания мишени и аптамера приводит к неравновесному состоянию, которое переходит в новое равновесие с течением времени с меньшим количеством комплексов мишень/аптамер. Захват комплексов мишень/аптамер до достижения нового равновесия

приводит к обогащению образца по аптамерам с низкой скоростью диссоциации, поскольку комплексы с высокой скоростью диссоциации, будут диссоциировать первыми.

[0095] В другом варианте осуществления применяют полианионный конкурент (например, сульфат декстрана или другой полианионный материал) в процессе обогащения по низкой скорости диссоциации для облегчения идентификации аптамера, который невосприимчив к присутствию полианиона. В данном контексте «невосприимчивый к присутствию полианиона аптамер» представляет собой аптамер, который способен к образованию комплекса аптамер/мишень, который с меньшей вероятностью диссоциирует в растворе, который также содержит невосприимчивый к присутствию полианиона материал, отличный от комплекса аптамер/мишень, который включает восприимчивый к присутствию полианиона аптамер. Таким образом, невосприимчивые к присутствию полианиона аптамеры могут использоваться при осуществлении аналитических способов для определения наличия, или количества, или концентрации мишени в образце, где способ определения включает применение полианионного материала (например, сульфата декстрана), к присутствию которого аптамер не восприимчив.

[0096] Таким образом, в одном варианте осуществления представлен способ получения невосприимчивого к присутствию полианиона аптамера. В данном варианте осуществления после приведения в контакт смеси кандидатов нуклеиновых кислот с мишенью. Обеспечивают установления равновесия между мишенью и нуклеиновыми кислотами в смеси кандидатов. Полианионный конкурент вводят и оставляют инкубироваться в растворе в течение периода времени, достаточного для обеспечения того, чтобы аптамеры с самой высокой скоростью диссоциации в смеси кандидатов диссоциировали из молекулы-мишени. Также аптамеры в смеси кандидатов, которые могут диссоциировать в присутствии полианионного конкурента, будут высвобождаться из молекулы-мишени. Смесь разделяют для выделения аптамеров с высокой аффинностью, низкой скоростью диссоциации, которые остались связанными с молекулой-мишенью, и удаления любых несвязанных в комплекс материалов из раствора. Затем аптамер может быть высвобожден из молекулы-мишени и выделен. Выделенный аптамер также может быть амплифицирован и по отношению к нему могут быть применены дополнительные раунды отбора для повышения общей характеристики отобранных аптамеров. Данный способ также может применяться с минимальным временем инкубации, если отбор аптамеров с низкой скоростью диссоциации не предназначена для специфической области применения.

[0097] Таким образом, в одном варианте осуществления представлен модифицированный способ SELEX для идентификации или получения аптамеров, характеризующихся низкими (длительными) значениями скорости диссоциации, где молекула-мишень и смесь кандидатов приводят в контакт и инкубируют вместе в течение периода времени, достаточного для обеспечения равновесного связывания молекулы-мишени с нуклеиновыми кислотами, содержащимися в смеси кандидатов. После равновесного связывания к смеси добавляют избыток молекулы конкурента, например, полианионного конкурента, и смесь инкубируют вместе с избытком молекулы конкурента в течение предварительно определенного периода времени. Значительная доля аптамеров, характеризующихся значениями скорости диссоциации, которые меньше данного предварительно определенного периода инкубации, будут диссоциировать из мишени в течение предварительно определенного периода инкубации. Реассоциация таких аптамеров с «быстрой» скоростью диссоциации с мишенью минимизируется из-за избытка молекулы конкурента, которая может неспецифически связываться с мишенью и занимать сайты связывания мишени. Значительная доля аптамеров, характеризующихся более длительными значениями скорости диссоциации, будет оставаться связанной в комплексе с мишенью в течение предварительно определенного периода инкубации. В конце периода инкубации отделение комплексов нуклеиновая кислота-мишень от остальной части смеси обеспечивает отделение популяции аптамеров с низкой скоростью диссоциации от таковых, характеризующихся высокими значениями скорости диссоциации. Стадия диссоциации может использоваться для диссоциации аптамеров с низкой скоростью диссоциации из их мишени и обеспечивает выделение, идентификацию, секвенирование, синтез и амплификацию аптамеров с низкой скоростью диссоциации (либо отдельных аптамеров, либо группы аптамеров с низкой скоростью диссоциации), которые характеризуются высокой аффинностью и специфичностью в отношении молекулы-мишени. Как и в случае традиционного SELEX, последовательности аптамеров, идентифицированные в результате одного раунда модифицированного способа SELEX, могут использоваться в синтезе новой смеси кандидатов так, что стадии приведения в контакт, равновесного связывания, добавления молекулы конкурента, инкубации с молекулой конкурента и отделения аптамеров с низкой скоростью диссоциации при необходимости могут выполняться итеративно/повторяться многократно.

[0098] Комбинация обеспечения равновесного связывания смеси кандидатов с мишенью перед добавлением конкурента с последующим добавлением избытка конкурента и инкубации с конкурентом в течение предварительно определенного периода времени обеспечивает отбор популяции аптамеров, характеризующихся значениями скорости диссоциации, которые в значительной степени выше таковых, достигаемых ранее.

[0099] С целью достижения равновесного связывания смесь кандидатов может инкубироваться с мишенью в течение по меньшей мере приблизительно 5 минут, или по меньшей мере приблизительно 15 минут, приблизительно 30 минут, приблизительно 45 минут, приблизительно 1 часа, приблизительно 2 часов, приблизительно 3 часов, приблизительно 4 часов, приблизительно 5 часов или приблизительно 6 часов.

[00100] Предварительно определенный период инкубации молекулы конкурента со смесью из смеси кандидатов и молекулы-мишени может быть выбран по необходимости с учетом факторов, таких как природа мишени и известные значения скорости диссоциации (если требуется) известных аптамеров для мишени. Предварительно определенные периоды инкубации могут быть выбраны из: по меньшей мере приблизительно 5 минут, по меньшей мере приблизительно 10 минут, по меньшей мере приблизительно 20 минут, по меньшей мере приблизительно 30 минут, по меньшей мере приблизительно 45 минут, по меньшей мере приблизительно 1 часа, по меньшей мере приблизительно 2 часов, по меньшей мере приблизительно 3 часов, по меньшей мере приблизительно 4 часов, по меньшей мере приблизительно 5 часов, по меньшей мере приблизительно 6 часов.

[00101] В других вариантах осуществления разбавление применяют в качестве способа повышения скорости диссоциации, и при этом инкубация разбавленной смеси кандидатов, комплекса молекула-мишень/аптамер может быть проведена в течение предварительно определенного периода времени, который может быть выбран из: по меньшей мере приблизительно 5 минут, по меньшей мере приблизительно 10 минут, по меньшей мере приблизительно 20 минут, по меньшей мере приблизительно 30 минут, по меньшей мере приблизительно 45 минут, по меньшей мере приблизительно 1 часа, по меньшей мере приблизительно 2 часов, по меньшей мере приблизительно 3 часов, по меньшей мере приблизительно 4 часов, по меньшей мере приблизительно 5 часов, по меньшей мере приблизительно 6 часов.

[00102] Варианты осуществления настоящего изобретения касаются идентификации, получения, синтеза и применения аптамеров с низкой скоростью диссоциации. Таковые представляют собой аптамеры, которые характеризуются скоростью диссоциации (t1/2) из нековалентного комплекса аптамер-мишень, которая выше таковой для аптамеров, обычно получаемых посредством традиционного SELEX. Для смеси, содержащей нековалентные комплексы аптамера и мишени, t1/2 представляет собой время, затрачиваемое половиной аптамеров для диссоциации из комплексов аптамер-мишень. t1/2 для аптамеров с низкой скоростью диссоциации в соответствии с настоящим изобретением выбрано из одного из: больше приблизительно 30 минут или равняется; от приблизительно 30 минут до приблизительно 240 минут; от приблизительно 30 минут до приблизительно 60 минут; от приблизительно 60 минут до приблизительно 90 минут, от приблизительно 90 минут до приблизительно 120 минут; от приблизительно 120 минут до приблизительно 150 минут; от приблизительно 150 минут до приблизительно 180 минут; от приблизительно 180 минут до приблизительно 210 минут; от приблизительно 210 минут до приблизительно 240 минут.

[00103] Характеристическим признаком аптамера, идентифицированного посредством процедуры SELEX, является его высокая аффинность по отношению к его мишени. Аптамер будет характеризоваться константой диссоциации (k_d) в отношении его мишени, которая выбрана из одного из: менее приблизительно 1 мкМ, менее приблизительно 100 нМ, менее приблизительно 10 нМ, менее приблизительно 1 нМ, менее приблизительно 100пМ, менее приблизительно 10 пМ, менее приблизительно 1 пМ.

Библиотеки олигонуклеотидов

[00104] В некоторых вариантах осуществления представлены библиотеки олигонуклеотидов, содержащие произвольные последовательности. Такие библиотеки могут быть применимыми в некоторых вариантах осуществления для осуществления SELEX. В некоторых вариантах осуществления каждый олигонуклеотид в библиотеке олигонуклеотидов характеризуется числом рандомизированных положений, таким как по меньшей мере 20, 25, 30, 35, 40, 45 или 50 или 20-100, 20-80, 20-70, 20-60, 20-50, 20-40 или 30-40 рандомизированных положений. В некоторых вариантах осуществления каждый олигонуклеотид в библиотеке олигонуклеотидов содержит фиксированные последовательности, фланкирующие рандомизированные положения. Такие фиксированные фланкирующие последовательности могут быть одинаковыми или отличными друг от друга (т. е. 5'-фланкирующая последовательность и 3'-фланкирующая последовательность могут быть одинаковыми или различными) и могут в некоторых вариантах осуществления быть одинаковыми для всех членов библиотеки (т. е. все члены библиотеки могут содержать одинаковую 5'-фланкирующую последовательность и/или все члены библиотеки могут содержать одинаковую 3'-фланкирующую последовательность).

[00105] В некоторых вариантах осуществления рандомизированные положения могут быть представлены четырьмя или более различными нуклеотидными основаниями, одно или несколько из которых являются модифицированными. В некоторых вариантах осуществления все нуклеотидные основания одного типа являются модифицированными или немодифицированными (например, либо все цитидины в рандомизированном участке являются модифицированными, либо все являются немодифицированными). В некоторых вариантах осуществления нуклеотидное основание одного типа в рандомизированном участке присутствует как в модифицированной, так и в немодифицированной формах. В некоторых таких вариантах осуществления рандомизированные положения представлены двумя модифицированными и двумя немодифицированными нуклеотидными основаниями. В некоторых таких вариантах осуществления рандомизированные положения представлены аденином, гуанином, C5-модифицированным цитидином и C5-модифицированным уридином. Не имеющие ограничительного характера иллюстративные C5-модифицированные цитидины и C5-модифицированные уридины показаны на фигурах 19-21. Библиотеки олигонуклеотидов и способы получения таковых дополнительно описаны, например, в примерах в данном документе.

Иллюстративные аптамеры

[00106] В некоторых вариантах осуществления представлены аптамеры, которые связывают молекулу-мишень. В некоторых вариантах осуществления молекула-мишень представляет собой белок-мишень. В некоторых вариантах осуществления представлены аптамеры, которые связывают PCSK9. В некоторых вариантах осуществления аптамер, который связывает PCSK9, ингибирует связывание PCSK9 с LDL-R. В некоторых таких вариантах осуществления аптамер содержит последовательность 5'-yGpppG-3', где каждый у представляет собой TyrdU, и каждый p представляет собой NapdC. В некоторых вариантах осуществления аптамер дополнительно содержит последовательность 5'-yEAyGA_npAp-3', где E выбран из y, A и G; и n равняется 0 или 1. В некоторых вариантах осуществления n равняется 0. В некоторых вариантах осуществления последовательность 5'-yEAyGA_npAp-3' расположена на 5'-конце последовательности 5'-yGpppG-3'. В некоторых вариантах осуществления E представляет собой y.

[00107] В некоторых вариантах осуществления представлен аптамер, который связывает PCSK9, где аптамер содержит последовательность 5'-F_npppAAGRJrpRppW_m-3' (SEQ ID NO: 81), где F выбран из r и G; каждый R независимо выбран из G и A; J выбран из r и A; W выбран из r, G и A; n равняется 0 или 1; m равняется 0 или 1; r представляет собой PpdC; и p представляет собой NapdU. В некоторых вариантах осуществления m равняется 1. В некоторых вариантах осуществления F представляет собой r. В некоторых вариантах осуществления J представляет собой r. В некоторых вариантах осуществления W представляет собой G.

[00108] В некоторых вариантах осуществления представлен аптамер, который связывает PCSK9, где аптамер содержит последовательность 5'-TTppGGpp-3', где каждый p представляет собой NapdC.

[00109] В некоторых вариантах осуществления аптамер, который связывает PCSK9, составляет от 20 до 100, или от 20 до 90, или от 20 до 80, или от 20 до 70, или от 20 до 60, или от 20 до 50, или от 30 до 100, или от 30 до 90, или от 30 до 80, или от 30 до 70, или от 30 до 60, или от 30 до 50, или от 40 до 100, или от 40 до 90, или от 40 до 80, или от 40 до 70, или от 40 до 60, или от 40 до 50 нуклеотидов в длину.

[00110] В некоторых вариантах осуществления аптамер ингибирует PCSK9 связывание с LDL-R. В некоторых вариантах осуществления аптамер ингибирует связывание PCSK9 с LDL-R при IC₅₀ менее 30 нМ, менее 20 нМ или менее 15 нМ.

[00111] В некоторых вариантах осуществления представлен способ снижения уровня холестерина у субъекта, включающий введение субъекту, нуждающемуся в нем, аптамера, который связывает PCSK9. В некоторых вариантах осуществления аптамер, который связывает PCSK9, представляет собой аптамер, представленный в данном документе. В некоторых вариантах осуществления холестерин представляет собой холестерин (LDL-C) липопротеинов низкой плотности (LDL). В некоторых вариантах осуществления у субъекта имеется гетерозиготная семейная гиперхолестеринемия или клиническое атеросклеротическое сердечно-сосудистое заболевание (CVD).

Соли

[00112] Может быть удобно или желательно получить, очистить и/или обработать соответствующую соль соединения, например, фармацевтически приемлемую соль. Примеры фармацевтически приемлемых солей рассмотрены в Berge et al. (1977) "Pharmaceutically Acceptable Salts" J. Pharm. Sci. 66:1-19.

[00113] Например, если соединение является анионным или содержит функциональную группу, которая может быть анионной (например, -COOH может быть -COO^-), то соль может быть образована с применением подходящего катиона. Примеры подходящих неорганических катионов включают без ограничения ионы щелочных металлов, такие как Na⁺ и K⁺, щелочноземельные катионы, такие как Ca²⁺ и Mg²⁺, и другие катионы, такие как Al⁺³. Примеры подходящих органических катионов включают без ограничения ион аммония (т. е., NH₄ ⁺) и замещенные ионы аммония (например, NH₃LR^X+, NH₂R^X 2⁺, NHR^X₃ ⁺, NR^X ₄ ⁺). Примеры некоторых подходящих замещенных ионов аммония представляют собой таковые, полученные из: этиламина, диэтиламина, дициклогексиламина, триэтиламина, бутиламина, этилендиамина, этаноламина, диэтаноламина, пиперизина, бензиламина, фенилбензиламина, холина, меглюмина и трометамина, а также аминокислот, таких как лизин и аргинин. Примером обычного иона четвертичного аммония является N(CH₃)4 ⁺.

[00114] Если соединение является катионным или содержит функциональную группу, которая может быть катионной (например, -NH₂ может быть -NH₃⁺), то соль может быть образована с применением подходящего аниона. Примеры подходящих неорганических анионов включают без ограничения таковые, полученные из следующих неорганических кислот: хлористоводородной, бромистоводородной, йодистоводородной, серной, сернистой, азотной, азотистой, фосфорной и фосфористой.

[00115] Примеры подходящих органических анионов включают без ограничения таковые, полученные из следующих органических кислот: 2-ацетоксибензойной, уксусной, аскорбиновой, аспарагиновой, бензойной, камфорсульфоновой, коричной, лимонной, эдетовой, этансульфоновой, этансульфоновой, фумаровой, глюкогептоновой, глюконовой, глутаминовой, гликолевой, гидроксималеиновой, гидроксинафталинкарбоновой, изэтиновой, молочной, лактобионовой, лауриновой, малеиновой, яблочной, метансульфоновой, муциновой, олеиновой, щавелевой, пальмитиновой, памовой, пантотеновой, фенилуксусной, фенилсульфоновой, пропионовой, пировиноградной, салициловой, стеариновой, янтарной, сульфаниловой, винной, толуолсульфоновой и валериановой. Примеры подходящих полимерных органических анионов включают без ограничения таковые, полученные из следующих полимерных кислот: дубильной кислоты, карбоксиметилцеллюлозы.

[00116] Если не указано иное, ссылка на конкретное соединение также включает его солевые формы.

НЕКОТОРЫЕ НЕ ИМЕЮЩИЕ ОГРАНИЧИТЕЛЬНОГО ХАРАКТЕРА ИЛЛЮСТРАТИВНЫЕ ВАРИАНТЫ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ

Вариант осуществления 1. Аптамер, содержащий по меньшей мере один первый модифицированный в 5-положении пиримидин и по меньшей мере один второй модифицированный в 5-положении пиримидин, где первый модифицированный в 5-положении пиримидин и второй модифицированный в 5-положении пиримидин являются различными модифицированными в 5-положении пиримидинами.

Вариант осуществления 2. Аптамер в соответствии с вариантом осуществления 1, где первый модифицированный в 5-положении пиримидин представляет собой модифицированный в 5-положении уридин, и при этом второй модифицированный в 5-положении пиримидин представляет собой модифицированный в 5-положении цитидин.

Вариант осуществления 3. Аптамер в соответствии с вариантом осуществления 1, где первый модифицированный в 5-положении пиримидин представляет собой модифицированный в 5-положении цитидин, и при этом второй модифицированный в 5-положении пиримидин представляет собой модифицированный в 5-положении уридин.

Вариант осуществления 4. Аптамер в соответствии с вариантом осуществления 2 или вариантом осуществления 3, где модифицированный в 5-положении уридин содержит фрагмент в 5-положении, выбранный из нафтильного фрагмента, бензильного фрагмента, тирозильного фрагмента, индольного фрагмента и фрагмента морфолинo.

Вариант осуществления 5. Аптамер в соответствии с любым из вариантов осуществления 2-4, где модифицированный в 5-положении цитидин содержит фрагмент в 5-положении, выбранный из нафтильного фрагмента, бензильного фрагмента, тирозильного фрагмента и фрагмента морфолинo.

Вариант осуществления 6. Аптамер в соответствии с любым из вариантов осуществления 2-5, где модифицированный в 5-положении цитидин выбран из NapdC, 2NapdC, TyrdC и PPdC.

Вариант осуществления 7. Аптамер в соответствии с любым из вариантов осуществления 2-6, где модифицированный в 5-положении уридин выбран из NapdU, 2NapdU, PPdU, MOEdU, TyrdU, TrpdU и ThrdU.

Вариант осуществления 8. Аптамер в соответствии с вариантом осуществления 1, где по меньшей мере один первый модифицированный в 5-положении пиримидин представляет собой NapdC, и по меньшей мере один второй модифицированный в 5-положении пиримидин выбран из NapdU, 2NapdU, PPdU, MOEdU, TyrdU и ThrdU.

Вариант осуществления 9. Аптамер в соответствии с вариантом осуществления 1, где по меньшей мере один первый модифицированный в 5-положении пиримидин представляет собой PPdC, и по меньшей мере один второй модифицированный в 5-положении пиримидин выбран из NapdU, 2NapdU, PPdU, MOEdU, TyrdU и ThrdU.

Вариант осуществления 10. Аптамер в соответствии с вариантом осуществления 8 или вариантом осуществления 9, где по меньшей мере один второй модифицированный в 5-положении пиримидин представляет собой TyrdU.

Вариант осуществления 11. Аптамер в соответствии с любым из вариантов осуществления 1-10, где аптамер связывает белок-мишень, выбранный из PCSK9, PSMA, ErbBl, ErbB2, FXN, KDM2A, IGF1R, pIGFIR, a1-антитрипсина, CD99, MMP28 и PPIB.

Вариант осуществления 12. Аптамер в соответствии с любым из вариантов осуществления 1-11, где аптамер содержит участок на 5'-конце аптамера, который составляет по меньшей мере 10, по меньшей мере 15, по меньшей мере 20, по меньшей мере 25 или по меньшей мере 30 нуклеотидов в длину, или от 5 до 30, от 10 до 30, от 15 до 30, от 5 до 20 или от 10 до 20 нуклеотидов в длину, где участок на 5'-конце аптамера не содержит модифицированных в 5-положении пиримидинов.

Вариант осуществления 13. Аптамер в соответствии с любым из вариантов осуществления 1-12, где аптамер содержит участок на 3'-конце аптамера, который составляет по меньшей мере 10, по меньшей мере 15, по меньшей мере 20, по меньшей мере 25 или по меньшей мере 30 нуклеотидов в длину, или от 5 до 30, от 10 до 30, от 15 до 30, от 5 до 20 или от 10 до 20 нуклеотидов в длину, где участок на 3'-конце аптамера не содержит модифицированных в 5-положении пиримидинов.

Вариант осуществления 14. Аптамер в соответствии с любым из вариантов осуществления 1-13, где аптамер составляет от 20 до 100, или от 20 до 90, или от 20 до 80, или от 20 до 70, или от 20 до 60, или от 20 до 50, или от 30 до 100, или от 30 до 90, или от 30 до 80, или от 30 до 70, или от 30 до 60, или от 30 до 50, или от 40 до 100, или от 40 до 90, или от 40 до 80, или от 40 до 70, или от 40 до 60, или от 40 до 50 нуклеотидов в длину.

Вариант осуществления 15. Композиция, содержащая множество полинуклеотидов, где каждый полинуклеотид содержит по меньшей мере один первый модифицированный в 5-положении пиримидин и по меньшей мере один второй модифицированный в 5-положении пиримидин, где первый модифицированный в 5-положении пиримидин и второй модифицированный в 5-положении пиримидин являются различными модифицированными в 5-положении пиримидинами.

Вариант осуществления 16. Композиция в соответствии с вариантом осуществления 15, где каждый полинуклеотид содержит фиксированный участок на 5'-конце полинуклеотида.

Вариант осуществления 17. Композиция в соответствии с вариантом осуществления 16, где фиксированный участок на 5'-конце каждого полинуклеотида составляет по меньшей мере 10, по меньшей мере 15, по меньшей мере 20, по меньшей мере 25 или по меньшей мере 30 нуклеотидов в длину, или от 5 до 30, от 10 до 30, от 15 до 30, от 5 до 20 или от 10 до 20 нуклеотидов в длину.

Вариант осуществления 18. Композиция в соответствии с любым из вариантов осуществления 15-17, где каждый полинуклеотид содержит фиксированный участок на 3'-конце полинуклеотида.

Вариант осуществления 19. Композиция в соответствии с вариантом осуществления 18, где фиксированный участок на 3'-конце полинуклеотида составляет по меньшей мере 10, по меньшей мере 15, по меньшей мере 20, по меньшей мере 25 или по меньшей мере 30 нуклеотидов в длину, или от 5 до 30, от 10 до 30, от 15 до 30, от 5 до 20 или от 10 до 20 нуклеотидов в длину.

Вариант осуществления 20. Композиция в соответствии с любым из вариантов осуществления 15-19, где первый модифицированный в 5-положении пиримидин представляет собой модифицированный в 5-положении уридин, и при этом второй модифицированный в 5-положении пиримидин представляет собой модифицированный в 5-положении цитидин.

Вариант осуществления 21. Композиция в соответствии с любым из вариантов осуществления 15-19, где первый модифицированный в 5-положении пиримидин представляет собой модифицированный в 5-положении цитидин, и при этом второй модифицированный в 5-положении пиримидин представляет собой модифицированный в 5-положении уридин.

Вариант осуществления 22. Композиция в соответствии с вариантом осуществления 20 или вариантом осуществления 21, где модифицированный в 5-положении уридин содержит фрагмент в 5-положении, выбранный из нафтильного фрагмента, бензильного фрагмента, тирозильного фрагмента, индольного фрагмента и фрагмента морфолинo.

Вариант осуществления 23. Композиция в соответствии с любым из вариантов осуществления 20-22, где модифицированный в 5-положении цитидин содержит фрагмент в 5-положении, выбранный из нафтильного фрагмента, бензильного фрагмента, тирозильного фрагмента и фрагмента морфолинo.

Вариант осуществления 24. Композиция в соответствии с любым из вариантов осуществления 20-23, где модифицированный в 5-положении цитидин выбран из NapdC, 2NapdC, TyrdC и PPdC.

Вариант осуществления 25. Композиция в соответствии с любым из вариантов осуществления 20-24, где модифицированный в 5-положении уридин выбран из NapdU, 2NapdU, PPdU, MOEdU, TyrdU, TrpdU и ThrdU.

Вариант осуществления 26. Композиция в соответствии с вариантом осуществления 15, где по меньшей мере один первый модифицированный в 5-положении пиримидин представляет собой NapdC, и по меньшей мере один второй модифицированный в 5-положении пиримидин выбран из NapdU, 2NapdU, PPdU, MOEdU, TyrdU, TrpdU и ThrdU.

Вариант осуществления 27. Композиция в соответствии с вариантом осуществления 15, где по меньшей мере один первый модифицированный в 5-положении пиримидин представляет собой PPdC, и по меньшей мере один второй модифицированный в 5-положении пиримидин выбран из NapdU, 2NapdU, PPdU, MOEdU, TrydU, TrpdU и ThrdU.

Вариант осуществления 28. Композиция в соответствии с вариантом осуществления 26 или вариантом осуществления 27, где по меньшей мере один второй модифицированный в 5-положении пиримидин представляет собой TyrdU.

Вариант осуществления 29. Композиция в соответствии с любым из вариантов осуществления 15-28, где каждый полинуклеотид содержит произвольный участок.

Вариант осуществления 30. Композиция в соответствии с вариантом осуществления 29, где произвольный участок составляет от 20 до 100, или от 20 до 90, или от 20 до 80, или от 20 до 70, или от 20 до 60, или от 20 до 50, или от 20 до 40, или от 30 до 100, или от 30 до 90, или от 30 до 70, или от 30 до 60, или от 30 до 50, или от 30 до 40 нуклеотидов в длину.

Вариант осуществления 31. Композиция в соответствии с любым из вариантов осуществления 15-29, где каждый полинуклеотид составляет от 20 до 100, или от 20 до 90, или от 20 до 80, или от 20 до 70, или от 20 до 60, или от 20 до 50, или от 30 до 100, или от 30 до 90, или от 30 до 80, или от 30 до 70, или от 30 до 60, или от 30 до 50, или от 40 до 100, или от 40 до 90, или от 40 до 80, или от 40 до 70, или от 40 до 60, или от 40 до 50 нуклеотидов в длину.

Вариант осуществления 32. Композиция, содержащая первый аптамер, второй аптамер и мишень,

где первый аптамер содержит по меньшей мере один первый модифицированный в 5-положении пиримидин и по меньшей мере один второй модифицированный в 5-положении пиримидин;

где второй аптамер содержит по меньшей мере один третий модифицированный в 5-положении пиримидин;

где первый аптамер, второй аптамер и мишень способны к образованию тримерного комплекса; и

где первый модифицированный в 5-положении пиримидин и второй модифицированный в 5-положении пиримидин являются различными модифицированными в 5-положении пиримидинами.

Вариант осуществления 33. Композиция в соответствии с вариантом осуществления 32, где первый модифицированный в 5-положении пиримидин представляет собой модифицированный в 5-положении уридин, и при этом второй модифицированный в 5-положении пиримидин представляет собой модифицированный в 5-положении цитидин.

Вариант осуществления 34. Композиция в соответствии с вариантом осуществления 32, где первый модифицированный в 5-положении пиримидин представляет собой модифицированный в 5-положении цитидин, и при этом второй модифицированный в 5-положении пиримидин представляет собой модифицированный в 5-положении уридин.

Вариант осуществления 35. Композиция в соответствии с вариантом осуществления 33 или вариантом осуществления 34, где модифицированный в 5-положении уридин содержит фрагмент в 5-положении, выбранный из нафтильного фрагмента, бензильного фрагмента, тирозильного фрагмента, индольного фрагмента и фрагмента морфолинo.

Вариант осуществления 36. Композиция в соответствии с любым из вариантов осуществления 33-35, где модифицированный в 5-положении цитидин содержит фрагмент в 5-положении, выбранный из нафтильного фрагмента, бензильного фрагмента, тирозильного фрагмента и фрагмента морфолинo.

Вариант осуществления 37. Композиция в соответствии с любым из вариантов осуществления 33-36, где модифицированный в 5-положении цитидин выбран из NapdC, 2NapdC, TyrdC и PPdC.

Вариант осуществления 38. Композиция в соответствии с любым из вариантов осуществления 33-37, где модифицированный в 5-положении уридин выбран из NapdU, 2NapdU, PPdU, MOEdU, TyrdU, TrpdU и ThrdU.

Вариант осуществления 39. Композиция в соответствии с вариантом осуществления 32, где по меньшей мере один первый модифицированный в 5-положении пиримидин представляет собой NapdC, и по меньшей мере один второй модифицированный в 5-положении пиримидин выбран из NapdU, 2NapdU, PPdU, MOEdU, TyrdU, TrpdU и ThrdU.

Вариант осуществления 40. Композиция в соответствии с вариантом осуществления 32, где по меньшей мере один первый модифицированный в 5-положении пиримидин представляет собой PPdC, и по меньшей мере один второй модифицированный в 5-положении пиримидин выбран из NapdU, 2NapdU, PPdU, MOEdU, TyrdU, TrpdU и ThrdU.

Вариант осуществления 41. Композиция в соответствии с вариантом осуществления 39 или вариантом осуществления 40, где по меньшей мере один второй модифицированный в 5-положении пиримидин представляет собой TyrdU.

Вариант осуществления 42. Композиция в соответствии с любым из вариантов осуществления 32-41, где третий модифицированный в 5-положении пиримидин выбран из модифицированного в 5-положении цитидина и модифицированного в 5-положении пиримидина.

Вариант осуществления 43. Композиция в соответствии с вариантом осуществления 42, где третий модифицированный в 5-положении пиримидин выбран из BndC, PEdC, PPdC, NapdC, 2NapdC, NEdC, 2NEdC, TyrdC, BndU, NapdU, PEdU, IbdU, FBndU, 2NapdU, NEdU, MBndU, BFdU, BTdU, PPdU, MOEdU, TyrdU, TrpdU и ThrdU.

Вариант осуществления 44. Композиция в соответствии с любым из вариантов осуществления 32-43, где мишень выбрана из белка, пептида, углевода, малой молекулы, клетки и ткани.

Вариант осуществления 45. Способ, включающий:

(a) приведение в контакт аптамера, способного к связыванию с молекулой-мишенью в образце;

(b) инкубирование аптамера с образцом с обеспечением образования комплекса аптамер-мишень;

(c) обогащение в отношении комплекса аптамер-мишень в образце и

(c) выявление наличия аптамера, комплекса аптамер-мишень или молекулы-мишени, где обнаружение аптамера, комплекса аптамер-мишень или молекулы-мишени указывает на то, что молекула-мишень присутствует в образце, и при этом отсутствие обнаружения аптамера, комплекса аптамер-мишень или молекулы-мишени указывает на то, что молекула-мишень отсутствует в образце;

где аптамер представляет собой аптамер в соответствии с любым из вариантов осуществления 1-14.

Вариант осуществления 46. Способ в соответствии с вариантом осуществления 45, где способ включает по меньшей мере одну дополнительную стадию, выбранную из: добавления молекулы конкурента к образцу; захвата комплекса аптамер-мишень на твердую подложку и добавления молекулы конкурента и разбавления образца; где по меньшей мере одну дополнительную стадию проводят после стадии (a) или стадии (b).

Вариант осуществления 47. Способ в соответствии с вариантом осуществления 46, где молекула конкурента выбрана из полианионного конкурента.

Вариант осуществления 48. Способ в соответствии с вариантом осуществления 47, где полианионный конкурент выбран из олигонуклеотида, полидекстрана, ДНК, гепарина и дНТФ.

Вариант осуществления 49. Способ в соответствии с вариантом осуществления 48, где полидекстран представляет собой сульфат декстрана; и ДНК представляет собой ДНК молок сельди или ДНК молок лосося.

Вариант осуществления 50. Способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 45-49, где молекула-мишень выбрана из белка, пептида, углевода, малой молекулы, клетки и ткани.

Вариант осуществления 51. Способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 45-50, где образец выбран из цельной крови, лейкоцитов, мононуклеарных клеток периферической крови, плазмы, сыворотки, мокроты, выдыхаемого воздуха, мочи, семенной жидкости, слюны, менингеальной жидкости, околоплодной жидкости, жидкости из желез, лимфатической жидкости, аспирата из сосков, бронхиального аспирата, синовиальной жидкости, суставного аспирата, клеток, клеточной вытяжки, кала, ткани, тканевого биопсийного материала и спинномозговой жидкости.

Вариант осуществления 52. Способ выявления мишени в образце, включающий