В данной заявке испрашивается преимущество приоритета от корейской патентной заявки №10-2021-0012615, поданной 28 января 2021 г., полное раскрытие которой включается сюда как часть настоящего раскрытия.
Настоящее раскрытие относится к новому варианту белка, штамму Corynebacterium glutamicum, содержащему данный вариант, и к способу продуцирования L-валина с использованием данного штамма.
ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Проводят различные исследования для разработки высокоэффективных микроорганизмов и технологий способов ферментации для производства L-аминокислот и других полезных веществ. Например, главным образом, используют специфичный подход в отношении целевого вещества, при котором увеличивают экспрессию гена, кодирующего фермент, участвующий в биосинтезе L-валина, или при котором удаляют гены, не являющиеся необходимыми для биосинтеза (US 8465962 В2).
Однако все еще необходимо проводить исследования для эффективного увеличения способности к продуцированию L-валина, так как возрастает спрос на L-валин.
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Техническая проблема
Целью настоящего раскрытия является предоставление варианта белка, состоящего из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 1, в котором глутаминовая кислота (Glu, Е), которая представляет собой аминокислоту, соответствующую положению 253 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3, заменена лизином (Lys, K).
Другой целью настоящего раскрытия является предоставление полинуклеотида, кодирующего вариант по настоящему раскрытию.
Еще одной другой целью настоящего раскрытия является предоставление штамма Corynebacterium glutamicum, который содержит вариант по настоящему раскрытию, или полинуклеотид, кодирующий данный вариант, и имеет способность к продуцированию L-валина.
Еще одной другой целью настоящего раскрытия является предоставление способа продуцирования L-валина, который включает культивирование в среде штамма Corynebacterium glutamicum, который содержит вариант по настоящему раскрытию или полинуклеотид, кодирующий данный вариант, и имеет способность к продуцированию L-валина.
Наилучший способ воплощения изобретения
Настоящее раскрытие будет подробно описано следующим образом. Тем временем, каждое из описаний и воплощений, раскрытых в настоящем раскрытии, можно применять к другим описаниям и воплощениям. Другими словами, все комбинации разных элементов, раскрытых в настоящем раскрытии, принадлежат к объему настоящего раскрытия. Кроме того, нельзя считать, что объем настоящего раскрытия ограничивается конкретным описанием, приведенным ниже. Кроме того, во всем настоящем описании изобретения приводятся ссылки целого ряда статей и патентных документов, и указываются их цитирования. Вся полнота содержания, раскрытого в процитированных статьях и патентных документах, включается в настоящее описание изобретения посредством ссылки для того, чтобы более ясно описать уровень технической области, к которой принадлежит настоящее изобретение, и содержание настоящего изобретения.
Согласно одному аспекту настоящего раскрытия предложен вариант белка, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 1, в котором глутаминовая кислота (Glu, Е), которая представляет собой аминокислоту, соответствующую положению 253 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3, заменена лизином (Lys, K).
Вариант по настоящему раскрытию может иметь, содержать или по существу состоять из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 1.
В варианте по настоящему раскрытию аминокислота, соответствующая положению 253 на основе аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3 в аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 1, представляет собой лизин, и данный вариант может содержать аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 70%-ную, 75%-ную, 80%-ную, 85%-ную, 90%-ную, 95%-ную, 96%-ную, 97%-ную, 98%-ную, 99%-ную, 99,5%-ную, 99,7%-ную или 99,9%-ную или большую гомологию или идентичность с аминокислотной последовательностью, представленной SEQ ID NO: 1. Очевидно то, что варианты, имеющие аминокислотные последовательности, в которых некоторые последовательности удалены, модифицированы, заменены, консервативно заменены или добавлены, также включаются в объем настоящего раскрытия, при условии, что аминокислотные последовательности имеют такую гомологию или идентичность и демонстрируют эффективность, соответствующую эффективности варианта по настоящему раскрытию.
Его примеры включают варианты, имеющие присоединение или делецию последовательности, которые не изменяют функцию варианта по настоящему раскрытию, на N-конце, С-конце аминокислотной последовательности и/или внутри данной аминокислотной последовательности, встречающуюся в природе мутацию, молчащую мутацию или консервативную замену.
Термин «консервативная замена» означает замену одной аминокислоты другой аминокислотой, имеющей аналогичные структурные и/или химические свойства. Такая аминокислотная замена обычно может существовать на основе сходства в полярности, заряде, растворимости, гидрофобности, гидрофильно ста и/или амфипатической природе остатков. Обычно консервативная замена может слегка влиять или не влияет на активность белков или полипептидов.
В настоящем раскрытии термин «вариант» относится к полипептиду, который имеет аминокислотную последовательность, отличную от аминокислотной последовательности данного варианта перед модификацией посредством консервативной замены и/или модификации одной или более чем одной аминокислоты, но сохраняет функции или свойства. Такой вариант обычно может быть идентифицирован посредством модифицирования одной или более чем одной аминокислоты аминокислотной последовательности данного полипептида и осуществления оценки свойств данного модифицированного полипептида. Другими словами, способность данного варианта может быть увеличена, оставлена неизменной или снижена по сравнению со способностью полипептида перед изменением. Некоторые варианты могут включать варианты, в которых одна или более чем одна часть, такая как N-концевая лидерная последовательность или трансмембранный домен, были удалены. Другие варианты могут включать варианты, в которых была удалена часть N- и/или С-конца от зрелого белка. Термин «вариант» можно использовать взаимозаменяемо с такими терминами, как модификация, модифицированный полипептид, модифицированный белок, мутант, мутеин и дивергент, и не ограничивается ими, при условии, что он представляет собой термин, используемый со значением вариации. В целях настоящего раскрытия данный вариант может представлять собой полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 1, в которой глутаминовая кислота, которая представляет собой аминокислоту, соответствующую положению 253 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3, заменена лизином.
Данный вариант может содержать делеции или присоединения аминокислот, которые имеют минимальное влияние на свойства и вторичную структуру полипептида. Например, с N-концом данного варианта может быть конъюгирована сигнальная (или лидерная) последовательность, которая котрансляционно или посттрансляционно участвует в транслокации белка. Данный вариант может быть конъюгирован с другими последовательностями или линкерами таким образом, чтобы его идентифицировать, очистить или синтезировать.
В настоящем раскрытии термин «гомология» или «идентичность» означает степень сходства между двумя данными аминокислотными последовательностями или последовательностями оснований и может быть выражена в виде процентной доли. Термины «гомология» и «идентичность» часто можно использовать взаимозаменяемо.
Гомологию или идентичность последовательности консервативного полинуклеотид а или полипептида определяют стандартными алгоритмами выравнивания, и можно совместно использовать штраф за пропуск по умолчанию, установленный применяемой программой. По существу гомологичные или идентичные последовательности обычно способны к гибридизации со всей или с частью последовательности при условиях умеренной или высокой жесткости. Очевидно, что гибридизация также включает гибридизацию полинуклеотид а с полинуклеотидом, содержащим кодон общего типа или вырожденный кодон.
Имеют ли любые две последовательности полинуклеотида или полипептида гомологию, сходство или идентичность, можно определять с использованием известных компьютерных алгоритмов, таких как программа «FASTA», например, с использованием параметров по умолчанию как в Pearson et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444. В качестве альтернативы, гомология, сходство или идентичность могут быть определены с использованием алгоритма Нидлмана-Вунша (Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48:443-453), как осуществляется в программе Нидлмана пакета EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et at, 2000, Trends Genet. 16:276-277) (версия 5.0.0 или более поздняя) (включая программный пакет GCG (Devereux, J., et at, Nucleic Acids Research 12:387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, S. F., et at, JMOLEC BIOL 215:403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, ed., Academic Press, San Diego, 1994; и CARILLO et at (1988) SIAM J Applied Math 48:1073). Например, для определения гомологии, сходства или идентичности можно использовать BLAST Национального центра биотехнологической информации или ClustalW.
Гомологию, сходство или идентичность полинуклеотидов или полипептидов можно определять посредством сравнения информации по последовательности с использованием, например, компьютерной программы GAP, как, например, Needleman et at (1970), J Mol Biol. 48:443, как анонсировано, например, в Smith and Waterman, Adv. Appl. Math (1981) 2:482. В заключение, результат программы GAP может быть определен как значение, полученное делением числа аналогичных выровненных символов (а именно: нуклеотидов или аминокислот) на общее число символов в более короткой из двух последовательностей. Параметры по умолчанию программы GAP могут включать (1) матрицу двоичных сравнений (включающую значения 1 для идентичности и 0 для неидентичности) и матрицу взвешенных сравнений Gribskov et at, (1986) Nucl. Acids Res. 14:6745 (или матрицу замен EDNAFULL (EMBOSS версии NCBI NUC4.4)), как раскрыто в Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979); (2) штраф 3,0 для каждого пропуска и дополнительный штраф 0,10 для каждого символа в каждом пропуске (или штраф 10 за открытие пропуска, штраф 0,5 за удлинение пропуска); и (3) отсутствие штрафа за концевые пропуски.
В качестве примера по настоящему раскрытию, вариант по настоящему раскрытию может демонстрировать активность таким образом, что он имеет повышенную способность к продукции L-валина по сравнению с полипептидом дикого типа.
В настоящем раскрытии термин «соответствующий» относится к аминокислотным остаткам в положениях, перечисленных в полипептиде, или к аминокислотным остаткам, которые являются аналогичными, идентичными или гомологичными остаткам, перечисленным в данном полипептиде. Идентификация аминокислоты в соответствующем положении может определяться специфической аминокислотой в последовательности, которая относится к специфической последовательности. Термин «соответствующая область» в том виде, в котором он здесь используется, обычно относится к аналогичному или соответствующему положению в родственном белке или эталонном белке.
Например, произвольную аминокислотную последовательность выравнивают с SEQ ID NO: 3, и, на основе этого, каждый аминокислотный остаток данной аминокислотной последовательности может быть пронумерован по отношению к аминокислотному остатку SEQ ID NO: 3 и числовому положению соответствующего аминокислотного остатка. Например, алгоритм выравнивания последовательности, как описано в настоящем описании, может определять положение аминокислоты или положение, в котором происходит модификация, такая как замена, вставка или делеция, посредством сравнения с положением в запрашиваемой последовательности (также именуемой «эталонная последовательность»).
Для таких выравниваний, например, можно использовать алгоритм Нидлмана-Вунша (Needleman and Wunsch, 1970, J. Mot Biol. 48:443-453), программу Нидлмана пакета EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et at, 2000, Trends Genet. 16:276-277) и тому подобные, но программа и алгоритм не ограничиваются ими, и подходящим образом можно использовать программу выравнивания последовательностей, алгоритм попарного сравнения последовательностей и тому подобное, известные в данной области.
Другим аспектом настоящего раскрытия является предоставление полинуклеотид а, кодирующего вариант по настоящему раскрытию.
В настоящем раскрытии термин «полинуклеотид» представляет собой нить ДНК или РНК, имеющую определенную или большую длину, в качестве полимера нуклеотидов, в котором нуклеотидные мономеры соединяются в длинную цепь ковалентными связями, и, более конкретно, означает фрагмент полинуклеотида, кодирующий данный вариант.
Полинуклеотид, кодирующий вариант по настоящему раскрытию, может содержать последовательность оснований, кодирующую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 1. В качестве примера по настоящему раскрытию полинуклеотид по настоящему раскрытию может иметь или содержать последовательность SEQ ID NO: 2. Полинуклеотид по настоящему раскрытию может состоять или по существу состоит из последовательности SEQ ID NO: 2.
В другом воплощении в полинуклеотиде по настоящему раскрытию основание, соответствующее положению 757 на основе последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 4 в последовательности нуклеиновой кислоты, представленной SEQ ID NO: 2, представляет собой А, и данный полинуклеотид может содержать последовательность нуклеиновой кислоты, имеющую по меньшей мере 70%-ную, 75%-ную, 80%-ную, 85%-ную, 90%-ную, 95%-ную, 96%-ную, 97%-ную, 98%-ную, 99%-ную, 99,5%-ную, 99,7%-ную или 99,9%-ную или большую гомологию или идентичность с последовательностью нуклеиновой кислоты, представленной SEQ ID NO: 2. Очевидно, что полинуклеотиды, имеющие аминокислотные последовательности, в которых некоторые последовательности удалены, модифицированы, заменены, консервативно заменены или добавлены, также включены в объем настоящего раскрытия, при условии, что данные последовательности нуклеиновой кислоты имеют такую гомологию или идентичность и кодируют полипептид или белок, демонстрирующий эффективность, соответствующую эффективности варианта по настоящему раскрытию.
В полинуклеотиде по настоящему раскрытию могут быть сделаны разные модификации в кодирующей области при условии, что аминокислотная последовательность варианта по настоящему раскрытию не изменяется при рассмотрении вырожденности кодонов или предпочтительных кодонов в организмах, которые предназначены для экспрессии варианта по настоящему раскрытию. В частности, полинуклеотид по настоящему раскрытию имеет или содержит последовательность оснований, имеющую 70%-ную или большую, 75%-ную или большую, 80%-ную или большую, 85%-ную или большую, 90%-ную или большую, 95%-ную или большую, 96%-ную или большую, 97%-ную или большую, 98%-ную или большую, но менее, чем 100%-ную гомологию или идентичность с последовательностью SEQ ID NO: 2 или может состоять или по существу состоит из последовательности оснований, имеющей 70%-ную или большую, 75%-ную или большую, 80%-ную или большую, 85%-ную или большую, 90%-ную или большую, 95%-ную или большую, 96%-ную или большую, 97%-ную или большую, 98%-ную или большую, но менее, чем 100%-ную гомологию или идентичность с последовательностью SEQ ID NO: 2, но не ограничиваясь ей. Здесь в последовательности, имеющей гомологию или идентичность, кодон, кодирующий аминокислоту, соответствующую положению 253 SEQ ID NO: 1, может представлять собой один из кодонов, кодирующих лизин.
Полинуклеотид по настоящему раскрытию может содержать зонд, который может быть получен из последовательности известного гена, например, последовательности без ограничения при условии, что она представляет собой последовательность, которая может гибридизоваться с комплементарной последовательностью всей или части последовательности полинуклеотида по настоящему раскрытию при жестких условиях. «Жесткие условия» означают условия, которые обеспечивают специфичную гибридизацию между полинуклеотидами. Данные условия конкретно описаны в документах (см. J. Sambrook et at, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et at, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York, 9.50 9.51, 11.7 11.8). Их примеры включают условия, при которых полинуклеотиды, имеющие более высокую гомологию или идентичность, а именно: полинуклеотиды, имеющие 70%-ную или большую, 75%-ную или большую, 80%-ную или большую, 85%-ную или большую, 90%-ную или большую, 95%-ную или большую, 96%-ную или большую, 97%-ную или большую, 98%-ную или большую, или 99%-ную или большую гомологию или идентичность, гибридизуются друг с другом, тогда как полинуклеотиды, имеющие меньшую гомологию или идентичность, не гибридизуются друг с другом, или условия, при которых промывка осуществляется один раз, в частности, от двух до трех раз при концентрации соли и температуре, эквивалентных 60°С, 1×SSC (раствор цитрата и хлорида натрия), 0,1% SDS (додецилсульфат натрия), в частности, при 60°С, 0,1×SSC, 0,1% SDS, более конкретно, при 68°С, 0,1×SSC, 0,1% SDS, которые представляют собой условия промывки для обычной гибридизации по Саузерну.
Для гибридизации требуется то, чтобы две нуклеиновые кислоты имели комплементарные последовательности, хотя и допускаются несоответствия между основаниями, в зависимости от жесткости гибридизации. Термин «комплементарный» используется для описания связи между нуклеотидными основаниями, способными к гибридизации друг с другом. Например, в отношении ДНК, аденин является комплементарным тимину, а цитозин является комплементарным гуанину. Следовательно, полинуклеотид по настоящему раскрытию также может содержать по существу аналогичные последовательности нуклеиновой кислоты, а также фрагменты выделенной нуклеиновой кислоты, которые являются комплементарными всей последовательности.
В частности, полинуклеотид, имеющий гомологию или идентичность с полинуклеотидом по настоящему раскрытию, может быть выявлен с использованием условий гибридизации, включая стадию гибридизации при значении Тm 55°С и вышеописанных условиях. Значение Тm может составлять 60°С, 63°С или 65°С, но не ограничивается ими, и его могут подходящим образом корректировать специалисты в данной области согласно цели.
Подходящая жесткость для гибридизации полинуклеотида зависит от длины и степени комплементарности данного полинуклеотида, и переменные хорошо известны в данной области (например, J. Sambrook et at, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989).
Другим аспектом настоящего раскрытия является предложение вектора, содержащего полинуклеотид по настоящему раскрытию. Данный вектор может представлять собой экспрессионный вектор для осуществления экспрессии полинуклеотида в клетке-хозяине, но не ограничивается им.
Вектор по настоящему раскрытию может включать ДНК-конструкцию, содержащую последовательность полинуклеотида, кодирующую интересующий полипептид, связанный функциональным образом с подходящей регуляторной областью экспрессии (или регуляторной последовательностью экспрессии) таким образом, что интересующий полипептид может экспрессироваться в подходящем хозяине. Регуляторная область экспрессии может содержать промотор, способный инициировать транскрипцию, любую последовательность оператора для осуществления регуляции транскрипции, последовательность, кодирующую подходящий сайт связывания мРНК с рибосомой, и последовательность, регулирующую терминацию транскрипции и трансляции. Данный вектор можно трансформировать в подходящую клетку-хозяина, и затем он может реплицироваться или функционировать независимо от генома хозяина, или может сам интегрироваться в геном.
Вектор, используемый в настоящем раскрытии, конкретно не ограничивается, но можно использовать любой вектор, известный в данной области. Примеры обычно используемых векторов включают природные или рекомбинантные плазмиды, космиды, вирусы и бактериофаги. Например, в качестве фагового вектора или космидного вектора можно использовать pWE15, М13, MBL3, MBL4, IХII, ASHII, АРII, t10, t11, Charon4A, Charon21A и тому подобные, и в качестве плазмидного вектора можно использовать систему pDZ, систему pBR, систему pUC, систему pBluescript II, систему pGEM, систему pTZ, систему pCL, систему рЕТ и тому подобные. В частности, можно использовать векторы pDZ, pDC, pDCM2, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118 и pCC1BAC, и тому подобные.
Например, полинуклеотид, кодирующий интересующий полипептид, можно вставлять в хромосому посредством вектора для внутриклеточной хромосомной вставки. Вставку данного полинуклеотида в хромосому можно осуществлять любым способом, известным в данной области, например, гомологичной рекомбинацией, но не ограничиваясь ей. Данный вектор может дополнительно содержать селективный маркер для подтверждения вставки в хромосому. Данный селективный маркер служит для отбора клеток, трансформированных векторами, то есть, для подтверждения вставки интересующей молекулы нуклеиновой кислоты, и можно использовать маркеры, которые придают селектируемые фенотипы, такие как устойчивость к лекарственным средствам, ауксотрофия, устойчивость к цитотоксическим агентам или экспрессия поверхностных полипептидов. В среде при обработке селективным агентом выживают или демонстрируют другие фенотипические признаки только клетки, экспрессирующие селективный маркер, и, таким образом, могут быть отобраны трансформированные клетки.
В настоящем раскрытии термин «трансформация» означает то, что вектор, содержащий полинуклеотид, кодирующий целевой полипептид, вводится в клетку-хозяина или микроорганизм таким образом, что полипептид, кодируемый данным полинуклеотидом, может экспрессироваться в клетке-хозяине. Трансформированный полинуклеотид может локализоваться посредством вставки в хромосому клетки-хозяина или локализоваться вне хромосомы, при условии, что он может экспрессироваться в данной клетке-хозяине. Данный полинуклеотид содержит ДНК и/или РНК, кодирующую интересующий полипептид. Данный полинуклеотид может быть вставлен в любой форме, при условии, что он может быть введен в клетку-хозяина и может экспрессироваться. Например, данный полинуклеотид может быть введен в клетку-хозяина в виде экспрессионной кассеты, которая представляет собой генетическую конструкцию, содержащую все элементы, требующиеся для автономной экспрессии. Данная экспрессионная кассета обычно может содержать промотор, связанный функциональным образом с полинуклеотидом, сигнал терминации транскрипции, сайт связывания рибосомы и сигнал терминации трансляции. Данная экспрессионная кассета может находиться в виде экспрессионного вектора, способного к автономной репликации. Полинуклеотид может быть введен в клетку-хозяина сам по себе и связан функциональным образом с последовательностью, требующейся для экспрессии в клетке-хозяине, но не ограничиваясь ей.
В приведенном выше термин «связанный функциональным образом» означает то, что последовательность полинуклеотида функционально связана с последовательностью промотора, которая инициирует и опосредует транскрипцию полинуклеотида, кодирующего интересующий вариант по настоящему раскрытию.
Еще одним другим аспектом настоящего раскрытия является предложение штамма Corynebacterium glutamicum, который содержит вариант по настоящему раскрытию или полинуклеотид по настоящему раскрытию.
Штамм по настоящему раскрытию может содержать модифицированный полипептид по настоящему раскрытию, полинуклеотид, кодирующий данный полипептид, или вектор, содержащий полинуклеотид по настоящему раскрытию.
В настоящем раскрытии «штамм (или микроорганизм)» включает все микроорганизмы дикого типа или естественно или искусственно генетически модифицированные микроорганизмы, и он может представлять собой микроорганизм, в котором ослаблен или усилен специфический механизм из-за вставки внешнего гена или усиления активности, или инактивации эндогенного гена, и он может представлять собой микроорганизм, содержащий генетическую модификацию для продуцирования интересующего полипептида, белка или продукта.
Штамм по настоящему раскрытию может представлять собой штамм, содержащий любой один или более чем один вариант по настоящему раскрытию, полинуклеотид по настоящему раскрытию или вектор, содержащий полинуклеотид по настоящему раскрытию; штамм, модифицированный для экспрессии варианта по настоящему раскрытию или полинуклеотида по настоящему раскрытию; штамм (например, рекомбинантный штамм), экспрессирующий вариант по настоящему раскрытию или полинуклеотид по настоящему раскрытию; или штамм (например, рекомбинантный штамм), демонстрирующий активность варианта по настоящему раскрытию, но не ограничивается ими.
Штамм по настоящему раскрытию может представлять собой штамм, имеющий способность к продуцированию L-валина.
Штамм по настоящему раскрытию может представлять собой микроорганизм, имеющий в природе способность к продуцированию L-валина, или микроорганизм, в котором вариант по настоящему раскрытию или полинуклеотид, кодирующий данный вариант (или вектор, содержащий данный полинуклеотид), вводят в родительский штамм, который не имеет способности к продуцированию L-валина, и/или в котором способность к продуцированию L-валина придается родительскому штамму, но не ограничивается им.
Например, штамм по настоящему раскрытию представляет собой клетку или микроорганизм, который трансформирован вектором, содержащим полинуклеотид по настоящему раскрытию, или полинуклеотидом, кодирующим вариант по настоящему раскрытию, и экспрессирует вариант по настоящему раскрытию. В целях настоящего раскрытия штамм по настоящему раскрытию может включать все микроорганизмы, которые содержат вариант по настоящему раскрытию и могут продуцировать L-валин. Например, штамм по настоящему раскрытию может представлять собой рекомбинантный штамм, в котором полинуклеотид, кодирующий вариант по настоящему раскрытию, вводят в природный микроорганизм дикого типа или микроорганизм, продуцирующий L-валин, для того, чтобы, таким образом, экспрессировать вариант белка и иметь повышенную способность к продуцированию L-валина. Рекомбинантный штамм, имеющий повышенную способность к продуцированию L-валина, может представлять собой микроорганизм, имеющий повышенную способность к продуцированию L-валина по сравнению с природным микроорганизмом дикого типа или немодифицированным микроорганизмом (а именно: микроорганизмом, экспрессирующим белок дикого типа (SEQ ID NO: 3) или микроорганизмом, который не экспрессирует модифицированный (SEQ ID NO: 1) белок), но не ограничивается им. Например, штамм, имеющий повышенную способность к продуцированию L-валина по настоящему раскрытию может представлять микроорганизм, имеющий повышенную способность к продуцированию L-валина по сравнению с Corynebaterium glutamicum, который содержит полипептид SEQ ID NO: 3 или полинуклеотид, кодирующий данный полипептид, но не ограничивается им. В качестве примера, данный немодифицированный микроорганизм, который представляет собой целевой штамм для сравнения увеличения способности к продуцированию L-валина, может представлять собой штамм АТСС14067 или штамм СА08-0072 Corynebaterium glutamicum (KССМ11201P), но не ограничивается им.
Например, рекомбинантный штамм, имеющий повышенную способность к продуцированию, может иметь способность к продуцированию L-валина, повышенную примерно на 1% или более, примерно на 2,5% или более, примерно на 5% или более, примерно на 6% или более, примерно на 7% или более, примерно на 8% или более, примерно на 9% или более, примерно на 10% или более, примерно на 10,5% или более, примерно на 11% или более, примерно на 11,5% или более, примерно на 12% или более, примерно на 12,5% или более, примерно на 13% или более, примерно на 13,5% или более, примерно на 14% или более, примерно на 14,5% или более, примерно на 14,6% или более, примерно на 14,7% или более, примерно на 14,8% или более, примерно на 14,9% или более, или примерно на 15% или более (верхняя граница конкретно не ограничивается и может составлять, например, примерно 200% или менее, примерно 150% или менее, примерно 100% или менее, примерно 50% или менее, примерно 45% или менее, примерно 40% или менее, примерно 35% или менее, примерно 30% или менее, примерно 25% или менее, или примерно 20% или менее) по сравнению со способностью к продуцированию L-валина родительского штамма перед изменением или с немодифицированным микроорганизмом, но увеличенное значение не ограничивается ими, при условии, что способность к продуцированию имеет повышенный уровень по сравнению со способностью к продуцированию родительского штамма перед изменением или с немодифицированным микроорганизмом. В другом примере рекомбинантный штамм, имеющий повышенную способность к продуцированию, может иметь способность к продуцированию L-валина, увеличенную примерно в 1,1 раза или более, примерно в 1,12 раза или более, примерно в 1,13 раза или более, или примерно в 1,15 раза или более (верхняя граница конкретно не ограничивается и может, например, быть примерно в 10 раз или менее, примерно в 5 раз или менее, примерно в 3 раза или менее, или примерно в 2 раза или менее) по сравнению со способностью к продуцированию L-валина родительского штамма перед изменением или с немодифицированным микроорганизмом.
Более конкретно, рекомбинантный штамм, имеющий повышенную способность к продуцированию, может иметь способность к продуцированию L-валина, повышенную примерно на 15% (или примерно в 1,15 раза) по сравнению со способностью к продуцированию L-валина родительского штамма перед изменением или с немодифицированным микроорганизмом, но показатель увеличения не ограничивается им. Термин «примерно» представляет собой интервал, включающий все из плюс/минус 0,5; плюс/минус 0,4; плюс/минус 0,3; плюс/минус 0,2; плюс/минус 0,1 и тому подобных, и включает все значения в интервале, равные или аналогичные значению после термина «примерно», но не ограничивается ими.
В настоящем раскрытии «немодифицированный микроорганизм» не исключает штаммы, содержащие мутацию, которая может случаться у микроорганизмов в природе, и может представлять собой штамм дикого типа или сам природный штамм, или может представлять собой штамм перед изменением признака посредством генетической вариации из-за природных или искусственных факторов. Например, данный немодифицированный микроорганизм может представлять собой штамм, в который не вводится или еще не был введен вариант белка, описанный в настоящем описании изобретения. Термин «немодифицированный микроорганизм» можно использовать взаимозаменяемо с фразами «штамм перед модификацией», «микроорганизм перед модификацией», «неизмененный штамм»,
«немодифицированный штамм», «неизмененный микроорганизм» или «эталонный микроорганизм».
В другом примере настоящего раскрытия микроорганизм по настоящему раскрытию может представлять собой Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium crudilactis, Corynebacterium deserti, Corynebacterium effwiens, Corynebacterium callunae, Corynebacterium stationis, Corynebacterium singulare, Corynebacterium halotoleram, Corynebacterium striatum, Corynebacterium ammoniagenes, Corynebacterium pollutisoli, Corynebacterium imitans, Corynebacterium testudinoris или Corynebacterium flavescens.
В настоящем раскрытии «ослабление» активности полипептида включает оба случая, где активность снижена по сравнению с эндогенной активностью или отсутствует. Термин «ослабление» можно использовать взаимозаменяемо с такими терминами, как инактивация, недостаточность, понижающая регуляция, снижение, уменьшение и аттенюация.
Ослабление также может включать случай, когда активность самого полипептида снижена или устранена по сравнению с активностью полипептида, которым исходно обладал микроорганизм, посредством изменения полинуклеотида, кодирующего данный полипептид, и тому подобного, случай, где общие уровень активности и/или концентрация (уровень экспрессии) полипептида в клетке ниже по сравнению с уровнем активности или концентрацией природного штамма посредством ингибирования экспрессии гена полинуклеотида, кодирующего полипептид, или ингибирования трансляции в полипептид, случай, где данный полинуклеотид совсем не экспрессируется, и/или случай, где активность полипептида не проявляется даже при экспрессии полинуклеотида. Термин «эндогенная активность» означает активность конкретного полипептида, которой исходно обладал родительский штамм перед изменением признака, или микроорганизм дикого типа, или немодифицированный микроорганизм при изменении признака генетической вариацией из-за природных или искусственных факторов. Фразу «эндогенная активность» можно использовать взаимозаменяемо с фразой «активность перед модификацией». Тот факт, что активность полипептида является «инактивированной, недостаточной, пониженной, подвергнувшейся понижающей регуляции, сниженной или ослабленной» по сравнению с эндогенной активностью означает то, что активность полипептида снижается по сравнению с активностью конкретного полипептида, которой исходно обладал родительский штамм перед изменением признака или микроорганизм дикого типа, или немодифицированный микроорганизм.
Такое ослабление активности полипептида можно осуществлять любым способом, известным в данной области, но данный способ не ограничивается им, и ослабления можно достигнуть применением разных способов, хорошо известных в данной области (например, Nakashima N. et at, Bacterial cellular engineering by genome editing and gene silencing. Int J Mol Sci. 2014; 15(2):2773-2793, Sambrook et at, Molecular Cloning 2012, и тому подобные).
В частности, ослабление активности полипептида в настоящем раскрытии может представлять собой:
1) делецию всего или части гена, кодирующего полипептид;
2) модификацию регуляторной области экспрессии (или регуляторной последовательности экспрессии) для уменьшения экспрессии гена, кодирующего полипептид;
3) модификацию аминокислотной последовательности, составляющей полипептид, для устранения или ослабления активности полипептида (например, делеция/замена/присоединение одной или более чем одной аминокислоты в аминокислотной последовательности);
4) модификацию последовательности гена, кодирующей полипептид, для устранения или ослабления активности данного полипептида (например, делеция/замена/присоединение одного или более чем одного основания нуклеиновой кислоты в последовательности оснований нуклеиновой кислоты гена полипептида для кодирования полипептида, который был модифицирован для устранения или ослабления активности данного полипептида);
5) модификацию инициирующего кодона транскрипта гена, кодирующего полипептид, или последовательности оснований, кодирующей 5'-UTR (5'-нетранслируемая область) область;
6) введение антисмыслового олигонуклеотида (например, антисмысловой РНК), который комплементарно связывается с транскриптом гена, кодирующего полипептид;
7) добавление последовательности, комплементарной последовательности Шайна-Дальгарно, перед последовательностью Шайна-Дальгарно гена, кодирующего полипептид, для того, чтобы образовать вторичную структуру, к которой не может присоединяться рибосома;
8) добавление промотора, подлежащего транскрипции в противоположном направлении относительно 3'-конца открытой рамки считывания (ORF) последовательности гена, кодирующего полипептид (инженерия обратной транскрипции, RTE); или
9) комбинацию двух или более чем двух, выбранных из (1) - (8), но, в частности, не ограничивается ими.
Например:
1) Делецией части или всего гена, кодирующего полипептид, может быть удаление всего полинуклеотида, кодирующего интересующий эндогенный полипептид в хромосоме, или замена полинуклеотидом, в котором некоторые нуклеотиды делетированы, или замена маркерным геном.
2) Модификацией регуляторной области экспрессии (или регуляторной последовательности экспрессии) может быть делеция, вставка, неконсервативная или консервативная замена, или появление изменения в регуляторной области экспрессии (или регуляторной последовательности экспрессии) из-за их комбинации, или замена последовательностью, демонстрирующей более слабую активность. Регуляторная область экспрессии содержит промотор, последовательность оператора, последовательность, кодирующую сайт связывания рибосомы, и последовательность, регулирующую терминацию транскрипции и трансляции, но не ограничивается ими.
3) Модификацией инициирующего кодона транскрипта гена, кодирующего полипептид, или последовательности оснований, кодирующей 5'-UTR область, может быть, например, замена последовательностью оснований, кодирующей другой инициирующий кодон, имеющий меньшую скорость экспрессии полипептида по сравнению с эндогенным инициирующим кодоном, но не ограничивается ей.
4) и 5) Модификацией аминокислотной последовательности или последовательности полинуклеотида может быть делеция, вставка или неконсервативная, или консервативная замена аминокислотной последовательности полипептида или последовательности полинуклеотида, кодирующей данный полипептид, или появление изменения в последовательности из-за их комбинации, или замена аминокислотной последовательностью или последовательностью полинуклеотида, модифицированной так, чтобы демонстрировать более слабую активность, или аминокислотной последовательностью, или последовательностью полинуклеотида, модифицированной так, чтобы быть неактивной, таким образом, что активность данного полипептида ослабевает, но не ограничивается ими. Например, экспрессию гена можно ингибировать или ослаблять посредством введения изменения в последовательность полинуклеотида и образования терминирующего кодона, но модификация не ограничивается ей.
6) Для введения антисмыслового олигонуклеотида (например, антисмысловой РНК), который комплементарно связывается с транскриптом гена, кодирующего полипептид, можно сделать ссылку на документы, например, Weintraub, Н. et al., Antisense-RNA as a molecular tool for genetic analysis, Reviews-Trends in Genetics, Vol.1(1) 1986.
7) Добавление последовательности, комплементарной последовательности Шайна-Дальгарно, перед последовательностью Шайна-Дальгарно, гена, кодирующего полипептид, для того, чтобы образовать вторичную структуру, к которой не может присоединиться рибосома, для того, чтобы сделать невозможной трансляцию мРНК или для замедления скорости трансляции мРНК.
8) Добавление промотора, подлежащего транскрипции в противоположном направлении относительно 3'-конца открытой рамки считывания (ORF) последовательности гена, кодирующего полипептид (инженерия обратной транскрипции, RTE), может служить для ослабления активности посредством получения антисмыслового нуклеотида, комплементарного транскрипту гена, кодирующего полипептид.
В настоящем раскрытии термин «усиление» активности полипептида означает то, что активность полипептида увеличивается по сравнению с эндогенной активностью. Термин «усиление» можно использовать взаимозаменяемо с такими терминами, как активация, повышающая регуляция, сверхэкспрессия и увеличение. Здесь активация, усиление, повышающая регуляция, сверхэкспрессия и увеличение могут включать как демонстрирование активности, которой исходно не обладали, так и демонстрирование улучшенной активности по сравнению с эндогенной активностью или активностью перед модификацией. Термин «эндогенная активность» означает активность конкретного полипептида, которой исходно обладал родительский штамм перед изменением признака или немодифицированный микроорганизм при изменении признака посредством генетической вариации из-за природных или искусственных факторов. Это можно использовать взаимозаменяемо с «активностью перед модификацией». Тот факт, что активность полипептида «усиливается», «подвергается повышающей регуляции», «сверхэкспрессируется» или «увеличивается» по сравнению с эндогенной активностью означает то, что активность полипептида улучшается по сравнению с активностью и/или концентрацией (уровнем экспрессии) конкретного полипептида, которой исходно обладает родительский штамм перед изменением признака или немодифицированный микроорганизм.
Данное усиление может быть достигнуто посредством введения чужеродного полипептида или увеличения эндогенной активности и/или концентрации (уровня экспрессии) данного полипептида. Усиление активности полипептида может быть подтверждено увеличением степени активности и уровня экспрессии полипептида или количества продукта, продуцируемого из данного полипептида.
Для усиления активности полипептида можно применять разные способы, хорошо известные в данной области, и данный способ не ограничивается, при условии, что активность интересующего полипептида может быть усилена по сравнению с активностью микроорганизма до модификации. В частности, можно использовать генную инженерию и/или белковую инженерию, хорошо известные специалистам в данной области, которые представляют собой традиционные способы молекулярной биологии, но данный способ не ограничивается ими (например, Sitnicka et al., Functional Analysis of Genes. Advances in Cell Biology. 2010, Vol.2. 1-16; Sambrook et at, Molecular Cloning 2012; и тому подобные).
В частности, усиление активности полипептида по настоящему раскрытию может представлять собой:
1) увеличение числа внутриклеточных копий полинуклеотида, кодирующего полипептид;
2) замену регуляторной области экспрессии гена на хромосоме, кодирующей полипептид, последовательностью, демонстрирующей сильную активность;
3) модификацию инициирующего кодона транскрипта гена, кодирующего полипептид, или последовательности оснований, кодирующей 5'-UTR область;
4) модификацию аминокислотной последовательности полипептида для увеличения активности данного полипептида;
5) модификацию последовательности полинуклеотида, кодирующей полипептид, для усиления активности данного полипептида (например, модификацию последовательности полинуклеотида гена полипептида для кодирования полипептида, который был модифицирован для усиления активности данного полипептида);
6) введение чужеродного полипептида, демонстрирующего активность данного полипептида, или чужеродного полинуклеотида, кодирующего данный полипептид;
7) оптимизацию кодонов полинуклеотида, кодирующего полипептид;
8) анализ третичной структуры полипептида для отбора и модификации или химической модификации экспонированного сайта; или
9) комбинацию двух или более чем двух, выбранных из (1) - (8), но конкретно не ограничиваясь ими.
Более конкретно:
1) Увеличение числа внутриклеточных копий полинуклеотида, кодирующего полипептид, может быть достигнуто посредством введения в клетку-хозяина вектора, который может реплицироваться и функционировать независимо от хозяина, и с которым полинуклеотид, кодирующий данный полипептид, связан функциональным образом. В качестве альтернативы, увеличение может быть достигнуто введением одной копии или двух или более чем двух копий полинуклеотида, кодирующего данный полипептид, в хромосому клетки-хозяина. Введение в хромосому можно осуществлять введением вектора, способного вставлять полинуклеотид в хромосому клетки-хозяина, в клетку-хозяина, но не ограничивается им. Данный вектор является таким, как описано выше.
2) Замена регуляторной области экспрессии гена (или регуляторной последовательности экспрессии) на хромосоме, кодирующей полипептид, последовательностью, демонстрирующей сильную активность, может представлять собой, например, делецию, вставку, неконсервативную или консервативную замену, или появление изменения в последовательности из-за их комбинации, или замену последовательностью, демонстрирующей более сильную активность, таким образом, что активность регуляторной области экспрессии дополнительно усиливается. Регуляторная область экспрессии конкретно не ограничивается ими, но может содержать промотор, последовательность оператора, последовательность, кодирующую сайт связывания рибосомы, последовательность, регулирующую терминацию транскрипции и трансляции и тому подобные. Например, замена может представлять собой замену исходного промотора сильным промотором, но не ограничивается ей.
Примеры известных сильных промоторов включают промоторы CJ1-CJ7 (US 7662943 В2), промотор lac, промотор trp, промотор trc, промотор tac, промотор PR фага лямбда, промотор PL, промотор tet, промотор gapA, промотор SPL7, промотор SPL13 (sm3) (US 10584338 В2), промотор 02 (US 10273491 В2), промотор tkt и промотор уссА, но не ограничиваются ими.
3) Модификация инициирующего кодона транскрипта гена, кодирующуего полипептид, или последовательности оснований, кодирующей 5'-UTR область, может представлять собой, например, замену последовательностью оснований, кодирующей другой инициирующий кодон, имеющий более высокую скорость экспрессии полипептида по сравнению с эндогенным инициирующим кодоном, но не ограничивается ей.
4) и 5) Модификация аминокислотной последовательности или последовательности полинуклеотида может представлять собой делецию, вставку, неконсервативную или консервативную замену аминокислотной последовательности полипептида или последовательности полинуклеотида, кодирующей данный полипептид, или появление изменения в данной последовательности из-за их комбинации или замены аминокислотной последовательностью или последовательностью полинуклеотида, модифицированной для демонстрации более сильной активности, или аминокислотной последовательностью или последовательностью полинуклеотида, модифицированной для того, чтобы быть более активной, таким образом, что активность данного полипептида усиливается, но не ограничивается ими. Данную замену можно конкретно осуществлять посредством вставки полинуклеотида в хромосому гомологичной рекомбинацией, но не ограничиваясь ей. Используемый здесь вектор может дополнительно содержать селективный маркер для подтверждения вставки в хромосому. Селективный маркер является таким, как описано выше.
6) Введение чужеродного полипептида, демонстрирующего активность полипептида, может представлять собой введение в клетку-хозяина чужеродного полинуклеотида, кодирующего полипептид, демонстрирующий такую же или аналогичную данному полипептиду активность. Данный чужеродный полинуклеотид не ограничивается по его происхождению или последовательности при условии, что он демонстрирует такую же или аналогичную данному полипептиду активность. Введение можно осуществлять посредством подходящего выбора способа трансформации, известного специалистам в данной области. Поскольку введенный полинуклеотид экспрессируется в клетке-хозяине, может продуцироваться полипептид и может увеличиваться его активность.
7) Оптимизация кодонов полинуклеотида, кодирующего полипептид, может представлять собой оптимизацию кодонов эндогенного полинуклеотида таким образом, чтобы увеличивать транскрипцию или трансляцию в клетке-хозяине, или оптимизацию кодонов чужеродного полинуклеотида таким образом, чтобы осуществлять оптимизированную транскрипцию и трансляцию в клетке-хозяине.
8) Анализ третичной структуры полипептида для выбора и модификации или химическая модификация экспонированного сайта можно осуществлять, например, для определения шаблонного белка-кандидата согласно степени сходства последовательности посредством сравнения информации по последовательности полипептида, подлежащего анализу, с хранилищем информации по последовательностям известных белков базы данных для подтверждения структуры на основе этого и для выбора и модификации или химической модификации экспонированной части, подлежащей модификации или химической модификации.
Такое усиление активности полипептида может представлять собой увеличение активности или концентрации, или уровня экспрессии соответствующего полипептида на основе активности или концентрации полипептида, экспрессируемого в микробном штамме дикого типа или в микробном штамме перед модификацией, или увеличение количества продукта, продуцируемого от полипептида, но не ограничивается ими.
В микроорганизме по настоящему раскрытию частичную или полную модификацию (например, модификация для кодирования варианта белка, как описано выше) полинуклеотида можно индуцировать (а) гомологичной рекомбинацией с использованием вектора для вставки в хромосому в микроорганизме или редактированием генома с использованием генетически модифицированной нуклеазы (например, CRISPR-Cas9), и/или (б) обработкой светом, таким как ультрафиолетовые лучи и излучение, и/или химическими агентами, но не ограничиваясь ими. Способ осуществления модификации части или всего гена может включать способ с использованием технологии рекомбинантной ДНК. Например, посредством введения в микроорганизм нуклеотидной последовательности или вектора, содержащего нуклеотидную последовательность, гомологичную интересующему гену, для вызова гомологичной рекомбинации можно удалить часть гена или весь данный ген. Введенная нуклеотидная последовательность или вектор может содержать доминантный селективный маркер, но не ограничиваясь им.
В микроорганизме по настоящему раскрытию вариант, полинуклеотид, L-валин и тому подобные являются такими, как описано в других аспектах.
Согласно еще одному другому аспекту настоящего раскрытия предложен способ продуцирования L-аминокислоты, который включает культивирование в среде штамма Corynebacterium glutamicum, содержащего вариант по настоящему раскрытию или полинуклеотид по настоящему раскрытию.
Способ продуцирования L-аминокислоты по настоящему раскрытию может включать культивирование в среде штамма Corynebacterium glutamicum, содержащего вариант по настоящему раскрытию или полинуклеотид по настоящему раскрытию, или вектор по настоящему раскрытию.
Кроме того, L-аминокислота по настоящему раскрытию может представлять собой L-валин.
В настоящем раскрытии термин «культивирование» означает выращивание штамма Corynebacterium glutamicum по настоящему раскрытию при условиях среды, контролируемых подходящим образом. Способ культивирования по настоящему раскрытию можно осуществлять в соответствии с подходящей средой и условиями культивирования, известными в данной области. Такой способ культивирования можно легко корректировать и использовать специалистами в данной области согласно выбранному штамму. В частности, культивирование может быть периодического типа, непрерывного типа и/или типа с подпиткой, но не ограничивается ими.
В настоящем раскрытии термин «среда» означает смешанное вещество, содержащее питательные вещества, требующиеся для культивирования штамма Corynebacterium glutamicum по настоящему раскрытию в качестве главного компонента, и данная среда поставляет питательные вещества, факторы роста и тому подобное, включая воду, которые являются незаменимыми для выживания и развития. В частности, в качестве среды и других условий культивирования, используемых для культивирования штамма Corynebacterium glutamicum по настоящему раскрытию, можно использовать любые без конкретного ограничения, при условии, что она представляет собой среду, используемую для обычного культивирования микроорганизмов. Штамм Corynebacterium glutamicum по настоящему раскрытию можно культивировать в обычной среде, содержащей правильные источники углерода, источники азота, источники фосфора, неорганические соединения, аминокислоты и/или витамины, и тому подобное, при одновременном осуществлении контроля температуры, рН и тому подобного при аэробных условиях.
В частности, культуральную среду для штамма рода Corynebacterium можно найти в документе "Manual of Methods for General Bacteriology" by the American Society for Bacteriology (Washington, D.C., USA, 1981).
В настоящем раскрытии источники углерода включают углеводы, такие как глюкоза, сахароза, лактоза, фруктоза, сахароза и мальтоза; сахароспирты, такие как маннит и сорбит; органические кислоты, такие как пировиноградная кислота, молочная кислота и лимонная кислота; аминокислоты, такие как глутаминовая кислота, метионин и лизин; и тому подобное. Можно использовать природные органические питательные вещества, такие как гидролизат крахмала, мелассу, сырую мелассу, рисовые отруби, маниок, остаток сахарного тростника и жидкий кукурузный экстракт. В частности, можно использовать углеводы, такие как глюкоза и стерилизованные пред обработанные мелассы (а именно: мелассы, превращенные в восстанавливающий сахар), и можно использовать подходящие количества других источников углерода разными способами без ограничения. Данные источники углерода можно использовать одиночно или в комбинации с двумя или более чем двумя, но не ограничиваясь ими.
В качестве источников азота можно использовать неорганические источники азота, такие как аммиак, сульфат аммония, хлорид аммония, ацетат аммония, фосфат аммония, карбонат аммония и нитрат аммония; и органические источники азота, такие как аминокислоты, такие как глутаминовая кислота, метионин и глутамин, пептон, NZ-амин, мясной экстракт, дрожжевой экстракт, солодовый экстракт, жидкий кукурузный экстракт, гидролизат казеина, рыба или продукты ее разложения и обезжиренный соевый жмых или продукты его разложения. Данные источники азота можно использовать одиночно или в комбинации двух или более чем двух, но не ограничиваясь ими.
Источники фосфора могут включать монокалия фосфат, дикалия фосфат или соответствующие им натрийсодержащие соли. В качестве неорганических соединений можно использовать хлорид натрия, хлорид кальция, хлорид железа, сульфат магния, сульфат железа, сульфат марганца, карбонат кальция и тому подобное. Помимо них могут содержаться аминокислоты, витамины и/или подходящие предшественники, и тому подобное. Данные компоненты или предшественники можно добавлять в среду порционно или непрерывно, но способ добавления не ограничивается ими.
Во время культивирования штамма Corynebacterium glutamicum по настоящему раскрытию рН среды можно корректировать добавлением в данную среду правильным способом таких соединений, как гидроксид аммония, гидроксид калия, аммиак, фосфорная кислота и серная кислота. Во время культивирования пенообразование можно подавлять посредством применения пеногасителя, такого как сложный полигликолевый эфир жирной кислоты. В среду можно инъецировать кислород или кислородсодержащий газ для поддержания аэробного состояния данной среды, или газ можно не инъецировать, или можно инъецировать газообразный азот, водород или диоксид углерода для того, чтобы поддерживать анаэробное и микроаэробное состояния, но способ поддержания данного состояния не ограничивается ими.
При культивировании по настоящему раскрытию можно поддерживать температуру культивирования от 20°С до 45°С, в частности, от 25°С до 40°С, и данный штамм можно культивировать в течение примерно от 10 до 160 часов, но условия культивирования не ограничиваются ими.
L-аминокислота, продуцируемая посредством культивирования по настоящему раскрытию, может секретироваться в среду или может оставаться в клетках.
Способ продуцирования L-аминокислоты по настоящему раскрытию может дополнительно включать стадию получения штамма Corynebacterium glutamicum по настоящему раскрытию, стадию приготовления среды для культивирования данного штамма или их комбинацию (в любом порядке), например, перед стадией культивирования.
Способ продуцирования L-аминокислоты по настоящему раскрытию может дополнительно включать стадию выделения L-аминокислоты из среды в соответствии с культивированием (среда, подвергнувшаяся воздействию культуры) или из штамма Corynebacterium glutamicum. После стадии культивирования может быть дополнительно включена стадия выделения.
Выделение может служить для сбора интересующей L-аминокислоты посредством подходящего способа, известного в данной области, согласно способу культивирования микроорганизма по настоящему раскрытию, например, способу периодического, непрерывного культивирования или культивирования с подпиткой. Например, можно использовать центрифугирование, фильтрование, обработку осадителем кристаллизованного белка (высаливание), экстракцию, ультразвуковое разрушение, ультрафильтрацию, диализ, разные виды хроматографии, такие как хроматография на молекулярных ситах (гель-фильтрация), адсорбционная хроматография, ионообменная хроматография и аффинная хроматография, ВЭЖХ (высокоэффективная жидкостная хроматография), или их комбинацию. Интересующую L-аминокислоту можно выделять из среды или микроорганизма посредством подходящего способа, известного в данной области.
Способ продуцирования L-аминокислоты по настоящему раскрытию может дополнительно включать стадию очистки. Очистку можно осуществлять посредством подходящего способа, известного в данной области. В одном примере, когда способ продуцирования L-аминокислоты по настоящему раскрытию включает и стадию выделения, и стадию очистки, данные стадии выделения и очистки можно осуществлять непрерывно или прерывисто, независимо от порядка, или можно осуществлять одновременно, или посредством объединения в одну стадию, но способ осуществления данных стадий не ограничивается ими.
В способе по настоящему раскрытию вариант, полинуклеотид, вектор, штамм и тому подобное являются такими, как описано в других аспектах.
Еще одним другим аспектом настоящего раскрытия является предложение композиции для продуцирования L-аминокислоты, которая содержит штамм Corynebacterium glutamicum, содержащий вариант по настоящему раскрытию, полинуклеотид, кодирующий данный вариант, вектор, содержащий данный полинуклеотид, или полинуклеотид по настоящему раскрытию; среду, в которой культивировали данный штамм Corynebacterium glutamicum; или комбинацию двух или более чем двух из них.
Композиция по настоящему раскрытию может дополнительно содержать произвольные подходящие эксципиенты, которые обычно применяют в композициях для продуцирования аминокислот. Такие эксципиенты могут представлять собой, например, консервант, увлажнитель, диспергирующий агент, суспендирующий агент, буферизующий агент, стабилизатор или изотоничный агент, но не ограничиваются ими.
В композиции по настоящему раскрытию вариант, полинуклеотид, вектор, штамм, среда, L-аминокислота и тому подобные являются такими, как описано в других аспектах.
Полезные эффекты
В случае культивирования штамма Corynebacterium glutamicum, содержащего новый вариант белка по настоящему раскрытию, возможна продукция L-валина с более высоким выходом по сравнению со случаем существующих микроорганизмов, имеющих немодифицированные полипептиды.
ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
ФИГ. 1 представляет собой схематическую диаграмму плазмиды pDCM2.
Способ осуществления изобретения
Ниже настоящее раскрытие будет более подробно описано посредством Примеров. Однако следующие Примеры являются лишь предпочтительными воплощениями для иллюстрации настоящего раскрытия и, таким образом, не предназначены для ограничения ими объема настоящего раскрытия. Тем не менее, технические вопросы, не описанные в настоящем описании изобретения, могут быть в достаточной степени поняты и легко воплощены специалистами в технической области настоящего раскрытия или в аналогичных технических областях.
Пример 1: конструирование плазмиды
Плазмида (pDCM2, ФИГ. 1, SEQ ID NO: 11) для вставки и замены генов в хромосоме Corynebacterium была сконструирована и синтезирована с использованием службы Gene-synthesis от BIONICS Co., Ltd. Данная плазмида была сконструирована так, чтобы она содержала сайт рестрикционного фермента для легкого применения для клонирования со ссылкой на общеизвестную статью по системе sacB (Gene, 145 (1994) 69-73). Плазмида pDCM2, синтезированная таким образом, имеет следующие свойства:
1) Плазмида pDCM2 имеет репликатор, который работает только в Е. coli, и автономная репликация, таким образом, возможна в Е. coli, но не в Corynebacterium.
2) Плазмида pDCM2 имеет ген устойчивости к канамицину в качестве селективного маркера.
3) Плазмида pDCM2 имеет ген левансахаразы (sacB) в качестве вторичного маркера положительного отбора.
4) В конечном сконструированном штамме не остается информации о гене, происходящем из плазмиды pDCM2.
Пример 2. Конструирование вектора для экспрессии в микроорганизме варианта белка
Для того, чтобы подтвердить влияние варианта (Е253К; SEQ ID NO: 1), у которого глутаминовая кислота (Glu, Е) в положении 253 белка, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3 была заменена лизином (Lys, К), на продукцию L-валина, конструировали вектор для конструирования штамма, экспрессирующего данный вариант, следующим образом.
ПЦР (полимеразная цепная реакция) проводили с использованием гДНК (геномная ДНК) Corynebacterium glutamicum дикого типа АТСС14067 в качестве матрицы, пары праймеров, имеющих последовательности SEQ ID NO: 5 и 6, и пары праймеров, имеющих последовательности SEQ ID NO: 7 и 8. Вновь проводили ПЦР с перекрывающимися праймерами с использованием смеси двух фрагментов, полученных выше, в качестве матрицы и пары праймеров, имеющих последовательности SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 8, с получением фрагмента. ПЦР проводили следующим образом: денатурация при 94°С в течение 5 минут; 30 циклов при 94°С в течение 30 секунд, 55°С в течение 30 секунд, 72°С в течение 1 минуты 30 секунд; и 72°С в течение 5 минут. Вектор pDCM2 обрабатывали smal, и ПЦР-продукт, полученный выше, клонировали в него посредством слияния. Клонирование посредством слияния проводили с использованием набора для клонирования hi-Fusion® HD (Clontech). Полученную плазмиду называли pDCM2-NCgl2805(E253K).
Последовательности праймеров, используемых в данном примере, описаны в следующей Таблице 1:
Пример 3. Оценка способности к продуцированию L-валина микроорганизма, экспрессирующего вариант белка
3-1. Конструирование штамма, экспрессирующего вариант белка
Вектор, сконструированный в Примере 2, трансформировали в Corynebacterium glutamicum СА08-0072 (KССМ11201Р).
Штамм, в который был введен данный вариант, был выбран из штаммов, в которых происходила гомологичная рекомбинация с использованием SEQ ID NO: 9 и 10. Выбранный штамм называли СА08-0072 NCgl2805 Е253К. Последовательности праймеров, использованных в данном примере, описываются в следующей Таблице 2:
3-2. Сравнение способности к продуцированию L-валина штаммов, экспрессирующих вариант белка
Способность к продуцированию L-валина анализировали посредством оценки титра ферментации в колбе каждого штамма, сконструированного в Примере 3-1, и контрольного родительского штамма.
Сначала каждую колонию субкультивировали в питательной среде, и затем каждый штамм инокулировали в 250 мл колбу с угловыми перегородками, содержащей 25 мл продукционной среды, и подвергали культивированию со встряхиванием при 200 об/мин при 30°С в течение 72 часов. Затем концентрацию L-валина анализировали посредством ВЭЖХ, и проанализированная концентрация L-валина показана в Таблице 3 ниже.
Питательная среда (рН 7,2)
10 г глюкозы, 5 г экстракта говядины, 10 г полипептона, 2,5 г хлорида натрия, 5 г дрожжевого экстракта, 20 г агара, 2 г мочевины (на основе 1 литра дистиллированной воды).
Продукционная среда (рН 7,0)
100 г глюкозы, 40 г сульфата аммония, 2,5 г соевого белка, 5 г твердых веществ кукурузного экстракта, 3 г мочевины, 1 г дикалия фосфата, 0,5 г сульфата магния гептагидрата, 100 мкг биотина, 1 мг тиамина-НСl, 2 мг пантотената кальция, 3 мг никотинамида, 30 г карбоната кальция (на основе 1 литра дистиллированной воды).
Данный эксперимент повторяли 3 раза, и средние значения результатов его анализа представлены в Таблице 3 ниже.
Как представлено в Таблице 3, штамм CA08-0072_NCgl2805_E253K демонстрировал повышенную способность к продуцированию L-валина по сравнению со способностью к продуцированию L-валина контрольной группы.
Данный модифицированный штамм СА08-0072_NCgl2805_Е253K был назван Corynebacterium glutamicum СА08-1745, депонирован в Корейский центр культуры микроорганизмов учреждение депонирования, работающее согласно Будапештскому соглашению, 22 декабря 2020 г., и ему был присвоен номер доступа KССМ12909Р.
Из приведенного выше описания специалистам в технической области, к которой принадлежит настоящее раскрытие, будет понятно то, что настоящее раскрытие можно осуществлять в других конкретных формах без изменения его технической сущности и важных характеристик. В данном отношении следует понимать то, что воплощения, описанные выше, являются во всех отношениях иллюстративными и не ограничивающими. Объем настоящего раскрытия следует истолковывать как включающий все изменения или модифицированные формы, происходящие из значения и объема формулы изобретения, подлежащей описанию ниже, а не из приведенного выше подробного описания и эквивалентных ему идей.
Учреждение депонирования: Корейский центр культуры микроорганизмов
Номер доступа: KССМ12909Р
Дата доступа: 22.12.2020 г.
<110> CJ CheilJedang Corporation
<120> Новый вариант белка и способ продуцирования L-валина с его
применением
<130> OPP20211112KR
<150> KR 10-2021-0012615
<151> 2021-01-28
<160> 11
<170> koPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 422
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223>Вариантбелка
<400> 1
Met Arg Leu Asn Lys Arg Leu Pro Ala Ala Leu Ser Gly Leu Leu Leu
1 5 10 15
Ser Ala Ala Leu Leu Ala Gly Cys Ser Thr Ser Gly Thr Ala Glu Thr
20 25 30
Thr Thr Thr Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala Ser Thr Thr Thr Ser Thr
35 40 45
Ser Ser Asp Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Asp Ser Ser Thr Thr Ala
50 55 60
Glu Thr Ile Ser Asn Thr Ala Glu Ala Ala Gln Ala Phe Leu Ser Thr
65 70 75 80
Leu Ser Thr Glu Glu Gln Asp Ala Val Leu Tyr Asp Tyr Asp Ala Glu
85 90 95
Glu Lys Ser Thr Gly Trp Ser Asn Phe Pro Val Thr Phe Val Gln Arg
100 105 110
Ser Gly Val Asn Leu Thr Asp Leu Thr Glu Glu Gln Gln Ala Ala Ala
115 120 125
Leu Asn Val Leu Lys Asn Leu Leu Asn Asp Asp Ala Tyr Gln Met Ile
130 135 140
Glu Asp Ile Met Ala Ser Asp Gln Tyr Leu Asn Asp Glu Ser Asn Thr
145 150 155 160
Thr Glu Asp Ser Leu Gly Gln Tyr Tyr Ile Ala Phe Phe Gly Asp Pro
165 170 175
Ser Ser Asp Ser Asp Trp Ser Ile Gln Phe Gly Gly His His Ile Gly
180 185 190
Ile Asn Ala Thr Phe Ser Asp Gly Ala Ile Thr Phe Ala Pro Thr His
195 200 205
Leu Gly Thr Gln Pro Ser Glu Trp Thr Asn Gln Asp Gly Glu Thr Val
210 215 220
Ala Ala Leu Ser Asn Met Tyr Glu Thr Ala Phe Ala Phe Tyr Asp Ser
225 230 235 240
Leu Thr Glu Glu Gln Gln Ala Gln Leu Tyr Gln Gly Lys Glu Leu Asp
245 250 255
Ser Met Val Cys Ala Pro Gly Ser Thr Cys Asp Tyr Pro Thr Gly Thr
260 265 270
Gly Leu Lys Gly Ser Asp Leu Thr Asp Glu Gln Lys Glu Leu Leu Leu
275 280 285
Asp Val Ile Ala Asn Trp Val Gly Leu Ala Asp Glu Glu Thr Thr Glu
290 295 300
Thr Glu Leu Asp Ala Ile Arg Glu Thr Leu Asp Asp Thr Tyr Ile Asn
305 310 315 320
Trp Ser Gly Ala Thr Glu Tyr Asp Thr Ser Thr Gly Asp Gly Ile Tyr
325 330 335
Phe Gln Ile Ser Gly Pro Lys Val Tyr Ile Glu Phe Ala Asn Gln Gln
340 345 350
Gly Ser Ala Gly Ala Asp Ile Asp Gly Val Ile Thr Ala Gly Trp Gly
355 360 365
His Ile His Thr Ile Tyr Arg Asp Pro Thr Asn Asp Tyr Ala Asn Ser
370 375 380
Val Thr Gln Glu Ala Ala Ser Gly Met Met Gly Gly Gly Pro Gly Gly
385 390 395 400
Asn Gly Gly Glu Met Pro Ser Gly Asp Met Pro Thr Gly Glu Met Pro
405 410 415
Ser Gly Ala Pro Ser Asn
420
<210> 2
<211> 1269
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223>Ген, кодирующийвариантбелка
<400> 2
atgcgcctca acaaacgact cccagcggca ctctccggac tgctgctctc tgctgccctt 60
cttgccggat gctccacttc tggaaccgcc gagaccacga caacaaccgt ttcatctgct 120
gcggcatcaa caaccacttc cacctcctcc gattcctctt cctcctcttc ctccgactca 180
agcaccaccg ccgaaaccat ctccaacacc gcggaagctg cccaagcttt cttgtccacc 240
ctgtccaccg aagaacaaga cgccgtactc tacgactacg acgctgaaga aaagtccacc 300
ggctggtcta acttcccagt caccttcgtg cagcgttccg gcgtgaacct caccgacctc 360
actgaggaac agcaagcagc tgccctcaac gtgctgaaga acctgctcaa cgacgacgcc 420
taccaaatga tcgaagacat catggctagc gatcagtacc tcaacgacga aagcaacacc 480
accgaggatt ccctcggcca gtactacatc gcattcttcg gcgatccaag cagcgactcc 540
gactggtcca tccaattcgg cggacaccac atcggcatca acgccacctt ctccgacggt 600
gccatcacct tcgccccaac ccaccttggc acccagcctt ccgagtggac caaccaggac 660
ggcgaaaccg ttgcagcact aagcaacatg tacgaaaccg ccttcgcctt ctacgacagc 720
ctcaccgaag agcagcaagc acagctctac cagggtaaag agttggattc catggtctgc 780
gcaccgggca gcacctgcga ctacccaacc ggcaccggct tgaaaggctc cgacctcacc 840
gacgagcaaa aggaattgct tctcgacgtg atcgccaact gggttggtct agccgatgag 900
gaaaccaccg aaactgaact cgatgccatc cgcgaaaccc tggatgacac ctacatcaac 960
tggtccggag ccaccgagta cgacacctcc accggcgacg gcatctactt ccagatcagt 1020
ggcccaaagg tctacattga gttcgctaac cagcaaggtt ctgcaggtgc cgacatcgac 1080
ggtgtcatca ccgctggatg gggccacatt cacaccatct accgcgaccc aaccaatgat 1140
tacgctaact ccgtaactca ggaagcagcc agcggaatga tgggcggcgg ccctggtggt 1200
aatggtggcg agatgcctag cggtgacatg cctactggtg aaatgccttc tggcgctcca 1260
tcaaactaa 1269
<210> 3
<211> 422
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223>Белокдикоготипа
<400> 3
Met Arg Leu Asn Lys Arg Leu Pro Ala Ala Leu Ser Gly Leu Leu Leu
1 5 10 15
Ser Ala Ala Leu Leu Ala Gly Cys Ser Thr Ser Gly Thr Ala Glu Thr
20 25 30
Thr Thr Thr Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala Ser Thr Thr Thr Ser Thr
35 40 45
Ser Ser Asp Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Asp Ser Ser Thr Thr Ala
50 55 60
Glu Thr Ile Ser Asn Thr Ala Glu Ala Ala Gln Ala Phe Leu Ser Thr
65 70 75 80
Leu Ser Thr Glu Glu Gln Asp Ala Val Leu Tyr Asp Tyr Asp Ala Glu
85 90 95
Glu Lys Ser Thr Gly Trp Ser Asn Phe Pro Val Thr Phe Val Gln Arg
100 105 110
Ser Gly Val Asn Leu Thr Asp Leu Thr Glu Glu Gln Gln Ala Ala Ala
115 120 125
Leu Asn Val Leu Lys Asn Leu Leu Asn Asp Asp Ala Tyr Gln Met Ile
130 135 140
Glu Asp Ile Met Ala Ser Asp Gln Tyr Leu Asn Asp Glu Ser Asn Thr
145 150 155 160
Thr Glu Asp Ser Leu Gly Gln Tyr Tyr Ile Ala Phe Phe Gly Asp Pro
165 170 175
Ser Ser Asp Ser Asp Trp Ser Ile Gln Phe Gly Gly His His Ile Gly
180 185 190
Ile Asn Ala Thr Phe Ser Asp Gly Ala Ile Thr Phe Ala Pro Thr His
195 200 205
Leu Gly Thr Gln Pro Ser Glu Trp Thr Asn Gln Asp Gly Glu Thr Val
210 215 220
Ala Ala Leu Ser Asn Met Tyr Glu Thr Ala Phe Ala Phe Tyr Asp Ser
225 230 235 240
Leu Thr Glu Glu Gln Gln Ala Gln Leu Tyr Gln Gly Glu Glu Leu Asp
245 250 255
Ser Met Val Cys Ala Pro Gly Ser Thr Cys Asp Tyr Pro Thr Gly Thr
260 265 270
Gly Leu Lys Gly Ser Asp Leu Thr Asp Glu Gln Lys Glu Leu Leu Leu
275 280 285
Asp Val Ile Ala Asn Trp Val Gly Leu Ala Asp Glu Glu Thr Thr Glu
290 295 300
Thr Glu Leu Asp Ala Ile Arg Glu Thr Leu Asp Asp Thr Tyr Ile Asn
305 310 315 320
Trp Ser Gly Ala Thr Glu Tyr Asp Thr Ser Thr Gly Asp Gly Ile Tyr
325 330 335
Phe Gln Ile Ser Gly Pro Lys Val Tyr Ile Glu Phe Ala Asn Gln Gln
340 345 350
Gly Ser Ala Gly Ala Asp Ile Asp Gly Val Ile Thr Ala Gly Trp Gly
355 360 365
His Ile His Thr Ile Tyr Arg Asp Pro Thr Asn Asp Tyr Ala Asn Ser
370 375 380
Val Thr Gln Glu Ala Ala Ser Gly Met Met Gly Gly Gly Pro Gly Gly
385 390 395 400
Asn Gly Gly Glu Met Pro Ser Gly Asp Met Pro Thr Gly Glu Met Pro
405 410 415
Ser Gly Ala Pro Ser Asn
420
<210> 4
<211> 1269
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223>Ген, кодирующийбелокдикоготипа
<400> 4
atgcgcctca acaaacgact cccagcggca ctctccggac tgctgctctc tgctgccctt 60
cttgccggat gctccacttc tggaaccgcc gagaccacga caacaaccgt ttcatctgct 120
gcggcatcaa caaccacttc cacctcctcc gattcctctt cctcctcttc ctccgactca 180
agcaccaccg ccgaaaccat ctccaacacc gcggaagctg cccaagcttt cttgtccacc 240
ctgtccaccg aagaacaaga cgccgtactc tacgactacg acgctgaaga aaagtccacc 300
ggctggtcta acttcccagt caccttcgtg cagcgttccg gcgtgaacct caccgacctc 360
actgaggaac agcaagcagc tgccctcaac gtgctgaaga acctgctcaa cgacgacgcc 420
taccaaatga tcgaagacat catggctagc gatcagtacc tcaacgacga aagcaacacc 480
accgaggatt ccctcggcca gtactacatc gcattcttcg gcgatccaag cagcgactcc 540
gactggtcca tccaattcgg cggacaccac atcggcatca acgccacctt ctccgacggt 600
gccatcacct tcgccccaac ccaccttggc acccagcctt ccgagtggac caaccaggac 660
ggcgaaaccg ttgcagcact aagcaacatg tacgaaaccg ccttcgcctt ctacgacagc 720
ctcaccgaag agcagcaagc acagctctac cagggtgaag agttggattc catggtctgc 780
gcaccgggca gcacctgcga ctacccaacc ggcaccggct tgaaaggctc cgacctcacc 840
gacgagcaaa aggaattgct tctcgacgtg atcgccaact gggttggtct agccgatgag 900
gaaaccaccg aaactgaact cgatgccatc cgcgaaaccc tggatgacac ctacatcaac 960
tggtccggag ccaccgagta cgacacctcc accggcgacg gcatctactt ccagatcagt 1020
ggcccaaagg tctacattga gttcgctaac cagcaaggtt ctgcaggtgc cgacatcgac 1080
ggtgtcatca ccgctggatg gggccacatt cacaccatct accgcgaccc aaccaatgat 1140
tacgctaact ccgtaactca ggaagcagcc agcggaatga tgggcggcgg ccctggtggt 1200
aatggtggcg agatgcctag cggtgacatg cctactggtg aaatgccttc tggcgctcca 1260
tcaaactaa 1269
<210> 5
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NCgl2805_1F
<400> 5
tcgagctcgg tacccaagac gccgtactct acgac 35
<210> 6
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NCgl2805_2R
<400> 6
accatggaat ccaactcttt accctggtag agctgtgctt g 41
<210> 7
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NCgl2805_3F
<400> 7
caagcacagc tctaccaggg taaagagttg gattccatgg t 41
<210> 8
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NCgl2805_4R
<400> 8
ctctagagga tccccagcgc cagaaggcat ttcac 35
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NCgl2805_5F
<400> 9
aagacgccgt actctacgac 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NCgl2805_6R
<400> 10
agcgccagaa ggcatttcac 20
<210> 11
<211> 5803
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pDCM2
<400> 11
gttcgcttgc tgtccataaa accgcccagt ctagctatcg ccatgtaagc ccactgcaag 60
ctacctgctt tctctttgcg cttgcgtttt cccttgtcca gatagcccag tagctgacat 120
tcatccgggg tcagcaccgt ttctgcggac tggctttcta cgtgttccgc ttcctttagc 180
agcccttgcg ccctgagtgc ttgcggcagc gtgaagctag cttttatcgc cattcgccat 240
tcaggctgcg caactgttgg gaagggcgat cggtgcgggc ctcttcgcta ttacgccagc 300
tggcgaaagg gggatgtgct gcaaggcgat taagttgggt aacgccaggg ttttcccagt 360
cacgacgttg taaaacgacg gccagtgaat tcgagctcgg tacccgggga tcctctagag 420
tcgacctgca ggcatgcaag cttggcgtaa tcatggtcat agctgtttcc tgtgtgaaat 480
tgttatccgc tcacaattcc acacaacata cgagccggaa gcataaagtg taaagcctgg 540
ggtgcctaat gagtgagcta actcacatta attgcgttgc gctcactgcc cgctttccag 600
tcgggaaacc tgtcgtgcca gctgcattaa tgaatcggcc aacgcgcggg gagaggcggt 660
ttgcgtattg ggcgctcttc cgcttcctcg ctcactgact cgctgcgctc ggtcgttcgg 720
ctgcggcgag cggtatcagc tcactcaaag gcggtaatac ggttatccac agaatcaggg 780
gataacgcag gaaagaacat gtgagcaaaa ggccagcaaa aggccaggaa ccgtaaaaag 840
gccgcgttgc tggcgttttt ccataggctc cgcccccctg acgagcatca caaaaatcga 900
cgctcaagtc agaggtggcg aaacccgaca ggactataaa gataccaggc gtttccccct 960
ggaagctccc tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc ttaccggata cctgtccgcc 1020
tttctccctt cgggaagcgt ggcgctttct caatgctcac gctgtaggta tctcagttcg 1080
gtgtaggtcg ttcgctccaa gctgggctgt gtgcacgaac cccccgttca gcccgaccgc 1140
tgcgccttat ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg taagacacga cttatcgcca 1200
ctggcagcag ccactggtaa caggattagc agagcgaggt atgtaggcgg tgctacagag 1260
ttcttgaagt ggtggcctaa ctacggctac actagaagga cagtatttgg tatctgcgct 1320
ctgctgaagc cagttacctt cggaaaaaga gttggtagct cttgatccgg caaacaaacc 1380
accgctggta gcggtggttt ttttgtttgc aagcagcaga ttacgcgcag aaaaaaagga 1440
tctcaagaag atcctttgat cttttctacg gggtctgacg ctcagtggaa cgaaaactca 1500
cgttaaggga ttttggtcat gagattatca aaaaggatct tcacctagat ccttttgggg 1560
tgggcgaaga actccagcat gagatccccg cgctggagga tcatccagcc ctgatagaaa 1620
cagaagccac tggagcacct caaaaacacc atcatacact aaatcagtaa gttggcagca 1680
tcacccgacg cactttgcgc cgaataaata cctgtgacgg aagatcactt cgcagaataa 1740
ataaatcctg gtgtccctgt tgataccggg aagccctggg ccaacttttg gcgaaaatga 1800
gacgttgatc ggcacgtaag aggttccaac tttcaccata atgaaataag atcactaccg 1860
ggcgtatttt ttgagttatc gagattttca ggagctgata gaaacagaag ccactggagc 1920
acctcaaaaa caccatcata cactaaatca gtaagttggc agcatcaccc gacgcacttt 1980
gcgccgaata aatacctgtg acggaagatc acttcgcaga ataaataaat cctggtgtcc 2040
ctgttgatac cgggaagccc tgggccaact tttggcgaaa atgagacgtt gatcggcacg 2100
taagaggttc caactttcac cataatgaaa taagatcact accgggcgta ttttttgagt 2160
tatcgagatt ttcaggagct ctttggcatc gtctctcgcc tgtcccctca gttcagtaat 2220
ttcctgcatt tgcctgtttc cagtcggtag atattccaca aaacagcagg gaagcagcgc 2280
ttttccgctg cataaccctg cttcggggtc attatagcga ttttttcggt atatccatcc 2340
tttttcgcac gatatacagg attttgccaa agggttcgtg tagactttcc ttggtgtatc 2400
caacggcgtc agccgggcag gataggtgaa gtaggcccac ccgcgagcgg gtgttccttc 2460
ttcactgtcc cttattcgca cctggcggtg ctcaacggga atcctgctct gcgaggctgg 2520
ccggctaccg ccggcgtaac agatgagggc aagcggatgg ctgatgaaac caagccaacc 2580
aggaagggca gcccacctat caaggtgtac tgccttccag acgaacgaag agcgattgag 2640
gaaaaggcgg cggcggccgg catgagcctg tcggcctacc tgctggccgt cggccagggc 2700
tacaaaatca cgggcgtcgt ggactatgag cacgtccgcg agggcgtccc ggaaaacgat 2760
tccgaagccc aacctttcat agaaggcggc ggtggaatcg aaatctcgtg atggcaggtt 2820
gggcgtcgct tggtcggtca tttcgaaaaa ggttaggaat acggttagcc atttgcctgc 2880
ttttatatag ttcantatgg gattcacctt tatgttgata agaaataaaa gaaaatgcca 2940
ataggatatc ggcattttct tttgcgtttt tatttgttaa ctgttaattg tccttgttca 3000
aggatgctgt ctttgacaac agatgttttc ttgcctttga tgttcagcag gaagctcggc 3060
gcaaacgttg attgtttgtc tgcgtagaat cctctgtttg tcatatagct tgtaatcacg 3120
acattgtttc ctttcgcttg aggtacagcg aagtgtgagt aagtaaaggt tacatcgtta 3180
ggcggatcaa gatccatttt taacacaagg ccagttttgt tcagcggctt gtatgggcca 3240
gttaaagaat tagaaacata accaagcatg taaatatcgt tagacgtaat gccgtcaatc 3300
gtcatttttg atccgcggga gtcagtgaac aggtaccatt tgccgttcat tttaaagacg 3360
ttcgcgcgtt caatttcatc tgttactgtg ttagatgcaa tcagcggttt catcactttt 3420
ttcagtgtgt aatcatcgtt tagctcaatc ataccgagag cgccgtttgc taactcagcc 3480
gtgcgttttt tatcgctttg cagaagtttt tgactttctt gacggaagaa tgatgtgctt 3540
ttgccatagt atgctttgtt aaataaagat tcttcgcctt ggtagccatc ttcagttcca 3600
gtgtttgctt caaatactaa gtatttgtgg cctttatctt ctacgtagtg aggatctctc 3660
agcgtatggt tgtcgcctga gctgtagttg ccttcatcga tgaactgctg tacattttga 3720
tacgtttttc cgtcaccgtc aaagattgat ttataatcct ctacaccgtt gatgttcaaa 3780
gagctgtctg atgctgatac gttaacttgt gcagttgtca gtgtttgttt gccgtaatgt 3840
ttaccggaga aatcagtgta gaataaacgg atttttccgt cagatgtaaa tgtggctgaa 3900
cctgaccatt cttgtgtttg gtcttttagg atagaatcat ttgcatcgaa tttgtcgctg 3960
tctttaaaga cgcggccagc gtttttccag ctgtcaatag aagtttcgcc gactttttga 4020
tagaacatgt aaatcgatgt gtcatccgca tttttaggat ctccggctaa tgcaaagacg 4080
atgtggtagc cgtgatagtt tgcgacagtg ccgtcagcgt tttgtaatgg ccagctgtcc 4140
caaacgtcca ggccttttgc agaagagata tttttaattg tggacgaatc aaattcagaa 4200
acttgatatt tttcattttt ttgctgttca gggatttgca gcatatcatg gcgtgtaata 4260
tgggaaatgc cgtatgtttc cttatatggc ttttggttcg tttctttcgc aaacgcttga 4320
gttgcgcctc ctgccagcag tgcggtagta aaggttaata ctgttgcttg ttttgcaaac 4380
tttttgatgt tcatcgttca tgtctccttt tttatgtact gtgttagcgg tctgcttctt 4440
ccagccctcc tgtttgaaga tggcaagtta gttacgcaca ataaaaaaag acctaaaata 4500
tgtaaggggt gacgccaaag tatacacttt gccctttaca cattttaggt cttgcctgct 4560
ttatcagtaa caaacccgcg cgatttactt ttcgacctca ttctattaga ctctcgtttg 4620
gattgcaact ggtctatttt cctcttttgt ttgatagaaa atcataaaag gatttgcaga 4680
ctacgggcct aaagaactaa aaaatctatc tgtttctttt cattctctgt attttttata 4740
gtttctgttg catgggcata aagttgcctt tttaatcaca attcagaaaa tatcataata 4800
tctcatttca ctaaataata gtgaacggca ggtatatgtg atgggttaaa aaggatcacc 4860
ccagagtccc gctcagaaga actcgtcaag aaggcgatag aaggcgatgc gctgcgaatc 4920
gggagcggcg ataccgtaaa gcacgaggaa gcggtcagcc cattcgccgc caagctcttc 4980
agcaatatca cgggtagcca acgctatgtc ctgatagcgg tccgccacac ccagccggcc 5040
acagtcgatg aatccagaaa agcggccatt ttccaccatg atattcggca agcaggcatc 5100
gccatgggtc acgacgagat cctcgccgtc gggcatccgc gccttgagcc tggcgaacag 5160
ttcggctggc gcgagcccct gatgctcttc gtccagatca tcctgatcga caagaccggc 5220
ttccatccga gtacgtgctc gctcgatgcg atgtttcgct tggtggtcga atgggcaggt 5280
agccggatca agcgtatgca gccgccgcat tgcatcagcc atgatggata ctttctcggc 5340
aggagcaagg tgagatgaca ggagatcctg ccccggcact tcgcccaata gcagccagtc 5400
ccttcccgct tcagtgacaa cgtcgagaca gctgcgcaag gaacgcccgt cgtggccagc 5460
cacgatagcc gcgctgcctc gtcttggagt tcattcaggg caccggacag gtcggtcttg 5520
acaaaaagaa ccgggcgccc ctgcgctgac agccggaaca cggcggcatc agagcagccg 5580
attgtctgtt gtgcccagtc atagccgaat agcctctcca cccaagcggc cggagaacct 5640
gcgtgcaatc catcttgttc aatcatgcga aacgatcctc atcctgtctc ttgatcagat 5700
cttgatcccc tgcgccatca gatccttggc ggcaagaaag ccatccagtt tactttgcag 5760
ggcttcccaa ccttaccaga gggcgcccca gctggcaatt ccg 5803
| название | год | авторы | номер документа |
|---|---|---|---|
| Новый вариант пролиндегидрогеназы и способ получения L-валина с его применением | 2021 |
|
RU2795067C1 |
| Новый вариант аспарагинсинтазы и способ получения L-валина с его применением | 2021 |
|
RU2793442C1 |
| Новый вариант 2-изопропилмалатсинтазы и способ получения L-валина с его применением | 2021 |
|
RU2794279C1 |
| НОВЫЙ ВАРИАНТ ТЕТРАГИДРОДИПИКОЛИНАТ-N-СУКЦИНИЛТРАНСФЕРАЗЫ И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-ВАЛИНА С ЕГО ПРИМЕНЕНИЕМ | 2021 |
|
RU2793468C1 |
| Новый вариант цистеинсульфинат-десульфиназы и способ получения L-валина с его применением | 2021 |
|
RU2792650C1 |
| Новый вариант белка и способ получения L-лизина с его применением | 2021 |
|
RU2793405C1 |
| НОВЫЙ ВАРИАНТ ЦИТРАТСИНТАЗЫ II ТИПА И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-ЛИЗИНА С ЕГО ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ | 2021 |
|
RU2793434C1 |
| НОВЫЙ ВАРИАНТ ТРАНСПОРТЕРА ИЗ СЕМЕЙСТВА MFS САХАРНЫХ ПОРТЕРОВ И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-ВАЛИНА С ЕГО ПРИМЕНЕНИЕМ | 2021 |
|
RU2796590C1 |
| Новый вариант 5,10-метилентетрагидрофолатредуктазы и способ получения L-валина с его применением | 2021 |
|
RU2793443C1 |
| НОВЫЙ ВАРИАНТ ПЕРМЕАЗЫ АМИНОКИСЛОТ С РАЗВЕТВЛЕННОЙ ЦЕПЬЮ И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-ВАЛИНА С ЕГО ПРИМЕНЕНИЕМ | 2021 |
|
RU2792638C1 |
Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой полипептид, участвующий в продуцировании L-валина, микроорганизм Corynebacterium glutamicum для продуцирования L-валина, содержащий такой полипептид или полинуклеотид, кодирующий данный полипептид. Изобретение касается также способа продуцирования L-валина с использованием полученного микроорганизма. Изобретение позволяет получать L-валин с высокой степенью эффективности. 4 н. и 1 з.п. ф-лы, 1 ил., 3 табл., 3 пр.
1. Полипептид, участвующий в продуцировании L-валина, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 1, в которой глутаминовая кислота, которая представляет собой аминокислоту, соответствующую положению 253 в SEQ ID NO: 3, заменена лизином.
2. Полинуклеотид, кодирующий полипептид по п. 1.
3. Микроорганизм Corynebacterium glutamicum для продуцирования L-валина, содержащий полипептид по п. 1 или полинуклеотид, кодирующий данный полипептид.
4. Микроорганизм по п. 3, который имеет повышенную способность к продуцированию L-валина по сравнению с Corynebacterium glutamicum, содержащей полипептид SEQ ID NO: 3 или полинуклеотид, кодирующий данный полипептид.
5. Способ продуцирования L-валина, включающий культивирование в среде микроорганизма Corynebacterium glutamicum, содержащего полипептид по п. 1 или полинуклеотид, кодирующий данный полипептид.
| СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-ЛЕЙЦИНА, L-ВАЛИНА, L-ИЗОЛЕЙЦИНА, АЛЬФА-КЕТОИЗОВАЛЕРАТА, АЛЬФА-КЕТО-БЕТА-МЕТИЛВАЛЕРАТА ИЛИ АЛЬФА-КЕТОИЗОКАПРОАТА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ РЕКОМБИНАНТНЫХ КОРИНЕБАКТЕРИЙ, СОДЕРЖАЩИХ ОПЕРОН ILVBN, КОТОРЫЙ МОЖНО ИНДУЦИРОВАТЬ ПРОПИОНАТОМ | 2014 |
|
RU2675506C2 |
| СПОСОБ ФЕРМЕНТАТИВНОГО ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТЫ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ КОРИНЕФОРМНЫХ БАКТЕРИЙ | 2000 |
|
RU2247778C2 |
| KR 1020060039992 A, 10.05.2006 | |||
| US 8158390 B2, 17.04.2012 | |||
| CN 106520655 A, 22.03.2017 | |||
| Шайба-указатель | 1991 |
|
SU1812553A1 |
| EP 3567110 A1, 18.09.2007. | |||
