Способ лечения нейродегенеративного процесса в глазу в эксперименте Российский патент 2023 года по МПК A61K31/381 A61K31/405 A61P27/02 

Изобретение относится к офтальмологии и предназначено для лечения нейродегенеративного процесса в глазу в эксперименте, как этап и обоснование для дальнейшего клинического использования.

Распространенность нейродегенеративных заболеваний как центральной нервной системы, так и глаза во всем мире возрастает, что связано как с увеличением продолжительности жизни, так и с увеличением загрязненности внешней среды. По данным, представленным ВОЗ, в 2019 году 55 миллионов человек во всем мире страдали деменцией, и к 2050 году эта цифра увеличится до 139 миллионов человек (Глобальный отчет о состоянии реагирования общественного здравоохранения на деменцию. Женева: Всемирная организация здравоохранения. 2021). Многие широко распространенные глазные болезни, такие, например, как возрастная макулярная дегенерация, глаукома, ретинопатия недоношенных, диабетическая ретинопатия и др. сопровождаются гибелью нервных клеток сетчатки. Нейродегенеративные заболевания ЦНС, такие как болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, рассеянный склероз и др., сопровождаются патологическими изменениями в глазных структурах, в том числе нейродегенеративными. Ключевыми патогенетическими механизмами, лежащими в основе гибели нервных клеток при нейродегенеративном процессе, по современным представлениям, являются образование неправильно свернутых белков и их аггрегатов (α-синуклеина, β-амилоида, тау-белков и др.), митохондриальная дисфункция, и эти взаимосвязанные процессы приводят к окислительному стрессу и так называемому нейровоспалению, которое в свою очередь, усиливает образование свободных радикалов. Поэтому для лечения НДЗ показано применение противовоспалительных и антиоксидантных препаратов.

Известно противовоспалительное действие индометацина, которое связано с ингибированием фермента циклооксигеназы, что приводит к угнетению синтеза простагландинов. На животных моделях токсического и ишемического повреждения гиппокампа было показано уменьшение воспаления при лечении индометацином, что приводит к защите от потери нервных клеток (Hain EG, Sparenberg М, Rasinska J, Klein С, Akyiiz L, Steiner B. Indomethacin promotes survival of new neurons in the adult murine hippocampus accompanied by anti-inflammatory effects following MPTP-induced dopamine depletion. J Neuroinflammation. 2018 May 26;15(1):162. doi: 10.1186/s 12974-018-1179-4. PMID: 29803225; PMCID: PMC5970532). Механизмом нейропротекторного действия индометацина также является его способность увеличивать экспрессию α2-макроглобулина (α2-МГ), который являясь внеклеточным шапероном снижает образование и агрегацию β-амилоидного белка, а также индуцирует его отток из мозга (Indomethacin Disrupts the Formation of β-Amyloid Plaques via an α2-Macroglobulin-Activating lrpl-Dependent Mechanism. Int J Mol Sci. 2021 Jul 30;22(15):8185. doi: 10.3390/ijms22158185. PMID: 34360951; PMCID: PMC8348656). Индометацин используется в таблетированной форме (https://www.vidal.ru/drugs/indometacin_40741), а также в виде глазных капель, препарат хорошо проникает в переднюю камеру глаза и определяется в ней в течение нескольких часов после закапывания. Показаниями к применению глазных капель индометацина являются ингибирование миоза во время операции по поводу катаракты, воспалительный процесс, вызванный хирургическим вмешательством, профилактика и лечение кистоидного отека желтого пятна сетчатки после хирургического удаления катаракты, лечение и профилактика воспалительных процессов глазного яблока, неинфекционный конъюнктивит.Противопоказание эпителиальный герпетический кератит (Регистр лекарственных средств России). В показаниях к применению глазных капель индометацина отсутствует нейровоспалительные и нейродегенеративные процессы в глазу (https://www.rlsnet.ru/drugs/indokollir-24916).

Тиоктовая (альфа-липоевая) кислота (ТК) - природное серосодержащее органическое соединение, синтезируется в митохондриях. Липоевая кислота функционирует как кофактор митохондриальных мультиферментных комплексов, оказывает прямое антиоксидантное действие за счет обезвреживания активных форм кислорода, усиливает поглощение глюкозы клетками и модулирует активность различных сигнальных молекул и факторов транскрипции (Тутельян В.А., Махова А.А., Погожева А.В., Ших Е.В., Елизарова Е.В., Хотимченко С.А. Липоевая кислота: физиологическая роль и перспективы клинического применения // Вопр. питания. 2019. Т. 88, №4. С.6-11. doi: 10.24411/0042-8833-2019-10035). Целесообразность применения липоевой кислоты при нейродегенеративных процессах была доказана в экспериментальных и клинических исследованиях (Molz Р., Schroder N. Potential therapeutic effects of lipoic acid on memory defi cits related to aging and neurodegeneration. Front Pharmacol. 2017; 8: 849; Hager K., Kenklies M., McAfoose J., Engel J., Munch G. Alphalipoic acid as a new treatment option for Alzheimer's disease -a 48 months follow-up analysis. J Neural Transm Suppl. 2007; 72: 189-93). Липоевая кислота в виде глазных капель не выпускается. Однако известен способ, в котором предлагается использование липоевой кислоты в концентрации 0,1-1% в виде глазных капель для лечения глаукомы на основании того, что было показано повышение антиокислительной активности во внутриглазной жидкости интактных кроликов после их закапывания (патент RU 2223099, 31.07.2002). Ряд работ посвящен применению липоевой кислоты в виде глазных капель, но при патологии поверхностных структур глаза (Roszkowska AM, Spinella R, Oliverio GW, Postorino EI, Signorino GA, Rusciano D, Aragona P. Effects of the Topical Use of the Natural Antioxidant Alpha-Lipoic Acid on the Ocular Surface of Diabetic Patients with Dry Eye Symptoms. Front Biosci (Landmark Ed). 2022 Jun 27;27(7):202. doi: 10.31083/j.fbl2707202. PMID: 35866400). Показано, что при инсталляциях липоевая кислота хорошо проникает в переднюю камеру глаза и пребывает в ней более 1,5 часов (Cagini С, Leontiadis A, Ricci MA, Bartolini A, Dragoni A, Pellegrino RM. Study of alpha-lipoic acid penetration in the human aqueous after topical administration. Clin Exp Ophthalmol. 2010 Aug;38(6):572-6. doi: 10.1111/j.1442-9071.2010.02319.x- Epub 2010 Apr 29. PMID: 20456443).

В экспериментальных и клинических исследованиях показана перспективность системного применения липоевой кислоты для лечения дегенеративных процессов в сетчатке (Liu R, Wang Y, Pu M, Gao J. Effect of alpha lipoic acid on retinal ganglion cell survival in an optic nerve crush model. Mol Vis. 2016 Sep 23;22:1122-1136. PMID: 27703307; PMCID: PMC5040455). Данный способ принят за ближайший аналог.

Задача предлагаемого способа состояла в обосновании возможности лечения нейродегенеративного процесса в глазу путем местного применения одновременно противовоспалительного и антиоксидантного препаратов -индометацина и тиоктовой кислоты.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является усиление эффекта нормализации физиологических и биохимических показателей в глазу кролика на модели начальных стадий нейродегенерации при последовательных инсталляциях глазных капель, содержащих индометацин и раствор липоевой кислоты.

Технический результат достигается за счет инсталляций в конъюнктивальную полость кролику с воспроизведенной моделью локальной симпатэктомии поочередно с интервалом 15 минут по 1 капле индометацина 0,1% и тиоктовой кислоты 1-2% при рН 6.8-7.8 4 раза в день в течение 7 дней.

Для решения поставленной задачи было необходимо выявить влияние местного применения в виде глазных капель липоевой кислоты и индометацина по отдельности и совместно на физиологические и биохимические процессы в глазу кроликов на разработанной нами ранее модели нейродегенеративного процесса в глазу, на основе локальной симпатэктомии, вызванной интравитреальным введением нейротоксина 6-OHDA (патент RU 2787515, 09.01.2023).

В работе задействовано 20 кроликов породы шиншилла, самцы, весом 2,0-2,5 кг. Работу с животными проводили в соответствии с «Правилами надлежащей лабораторной практики в Российской Федерации» от 2016 г.

Готовили раствор 6-OHDA (Sigma-Aldrich, USA) в NaCl 0,9%, содержащий аскорбиновую кислоту в концентрации 0,5%. Опытным группам животных в оба глаза интравитреально (и/в) вводили по 100 мкл раствора, содержащего 500 мкг 6-OHDA (Sigma-Aldrich, USA) в NaCl 0,9% с аскорбиновой кислотой в концентрации 0,5%. Контрольные группы (4 и 5 группа, 8 кроликов, 16 глаз) получали и/в инъекции в оба глаза по 100 мкл NaCl 0,9%, содержащего аскорбиновую кислоту в концентрации 0,5%. Аскорбиновая кислота необходима для поддержания стабильности 6-OHDA.

В качестве препарата, содержащего индометацин в концентрации 0,1% использован Индоколлир, растворы ТК (липоевой кислоты) приготовлены из концентрата ТК для приготовления инфузионного раствора (30 мг/кг) ООО ОЗОН (Россия).

Офтальмоскопию проводили с помощью цифровой портативной фундус-камеры (Aurora Optomed, Финляндия). Оценивали площадь поражения сетчатки в условных единицах, где общая площадь сетчатки была принята за 4 единицы.

Для выявления нарушения зрачкового рефлекса проводили измерение прямой реакции зрачка в ответ на направленный в течение 3 секунд световой источник непосредственно на исследуемый глаз в темноте. Оценивали реакцию (амплитуду и скорость сужения освещенного зрачка) в условных единицах (у,е.). Зрачковый дефект ранжировали по шкале от 1 до 4 у.е.

Сетчатку, полученную после эфтаназии животных и последующей энуклеации глаза, гомогенизировали в NaCl 0,9% с помощью ультразвукового ручного гомогенизатора (UP50H, Hielscher, Germany), гомогенат центрифугировали 10 мин при 5000 об/мин для отделения нерастворимых компонентов и в надосадочной жидкости проводили измерения. Определяли концентрацию дофамина для оценки его локального синтеза методом ИФА (Cloud-Clone Corp., США). Для оценки реакции на нейровоспаление измеряли активность α2-МГ ферментативным методом с помощью субстрата N-бензоил-DL-аргинин-п-нитроанилиду (БАПНА) (Веремеенко К.Н., Васильева Т.Г., Доброгорская Л.Н., Краева Л.Н., Гончарова В.П. α2-Макроглобулин в спинномозговой жидкости при нейрохирургических заболеваниях. Вопросы медицинской химии. 1989; 6:48-51) в расчете на содержание общего белка в пробе, определяемого по методу Lowry О.Н. Измерения проводили на фотометре «Synergy МХ» («BioTek», США).

На 7 сутки после введения 6-OHDA по данным офтальмоскопии повреждение сетчатки составляло около ¼ ее поверхности. При инсталляциях ТК площадь повреждения достоверно снижается почти вдвое, при инсталляциях индометацина площадь повреждения снижается в меньшей степени, и наибольшее снижение отмечено при совместном применении этих препаратов (Фиг. 1 - Площадь повреждения сетчатки на 7 сутки после введения 6-OHDA (в у.е.) * - здесь и далее значения, статистически достоверно отличающиеся от уровня нормы).

После и/в введения 6-OHDA на 2 сутки отмечено снижение реакции зрачка на свет и это нарушение прогрессировало вплоть до 9 суток наблюдения (Фиг. 2 - Изменение зрачкового рефлекса у кроликов после введения 6-OHDA без лечения и на фоне лечения (в у.е.)). При инсталляциях индометацина и ТК, по отдельности и в комбинации, изменения реакции зрачка на свет не происходит. Поскольку снижение реакции зрачка на свет связано с вызванной 6-OHDA снижением дофаминергической и симпатической иннервации, то можно полагать, что с помощью индометацина и липоевой кислоты можно нивелировать недостаточность этих систем, и подобное действие этих препаратов нами было выявлено впервые.

Введение дофаминэргического нейротоксина 6-OHDA вызывает достоверное снижение концентрации дофамина в сетчатке (Фиг. 3 - Изменение концентрации дофамина в сетчатке кроликов на 9-е сутки после введения 6-OHDA без лечения и на фоне лечения (пг/мг)). Поскольку дофамин является предшественником адреналина и норадреналина, то снижение его содержания приводит к снижению активности не только дофаминергической, но и симпатической нервной системы. Поэтому эта модель рассматривается как модель симпатэктомии, приводящей к нейровоспалению, ведущему к апопоптозу ганглиозных клеток сетчатки, т.е. к нейродегенерации. При инсталляциях ТК обнаруживается тенденция к увеличению содержания дофамина в сетчатке, а после введения индометацина среднее по группе содержание дофамина возрастает, но это увеличение наблюдается не у всех животных, что объясняет разброс данных и отсутствие статистической достоверности различия по отношению к нелеченым животным. Совместное применение индометацина и ТК приводит к значительному повышению содержания дофамина в сетчатке даже выше контрольного уровня, что свидетельствует о стимулировании компенсаторного ответа на повреждение со стороны синтезирующих дофамин клеток. Нами впервые показано влияние индометацина и липоевой кислоты и их совместного действия на уровень дофамина в сетчатке.

Снижение активности α2-МГ в сетчатке после введения 6-OHDA указывает на потребление этого белка на связывание и удаление активированных при воспалении протеолитических ферментов и образовавшихся провоспалительных цитокинов (Фиг. 4 - Изменение активности α2-макроглобулина в сетчатке кроликов на 9-е сутки после введения 6-OHDA без лечения и на фоне лечения (нмоль/мин*мг)). В то же время снижение уровня α2-МГ, обладающего шаперонной активностью, способствует образованию неправильно свернутых белков и их агломератов, что характерного для нейродегенеративного процесса. Индометацин значительно повышает активность α2-МГ в сетчатке даже выше уровня контроля благодаря его способности увеличивать экспрессию α2-макроглобулина (α2-МГ). Липоевая кислота также, но в меньшей степени увеличивает активность этого многофункционального белка, но, по-видимому, за счет других механизмов, а именно за счет своего антиоксидантного действия, предохраняющего этот белок от разрушения, вызванного окислительным стрессом (Siddiqui Т, Zia МК, АН SS, Rehman АА, Ahsan Н, Khan FH. Reactive oxygen species and anti-proteinases. Arch Physiol Biochem. 2016;122(1):1-7. doi: 10.3109/13813455.2015.1115525. Epub 2015 Dec 23. PMID: 26699123). Совместное применение индометацина и ТК увеличивает активность α2-МГ в сетчатке в такой же степени как один индометацин. Тем не менее совместное их применение оправдано различием в механизме действия: индометацин увеличивает синтез этого белка, а ТК предохраняет его от разрушения.

Таким образом нами показано, что лечение нейровоспалительного процесса в глазу кроликов путем инсталляций индометацина в сочетании с инсталляциями липоевой кислоты (ТК) обеспечивает новый неожиданный результат. Интравитреальное введение 6-OHDA имитирует т.н. симпатэктомию и приводит к снижению образования дофамина в глазу, что приводит к развитию нейровоспаления с последующим апоптозом нервных клеток сетчатки, и эти механизмы лежат в основе развития нейродегенеративных процессов в сетчатке. Сочетанное применение индометацина и липоевой кислоты (ТК) может быть рекомендовано для дальнейших исследований с целью внедрения этого метода в клиническую практику.

Способ осуществляют следующим образом.

Кролику на фоне нейродегенеративного процесса проводят инсталляции в конъюнктивальную полость поочередно с интервалом 15 минут по 1 капле индометацина 0,1% и тиоктовой кислоты 1-2% при рН 6.5-7.8 4 раза в день в течение 7 дней.

Примеры

Пример 1.

Кролик №1. Контрольный. После и/в инъекции 6-OHDA 4 раза в день дважды инсталлировали в нижний конъюнктивальный мешок по 1 капле буфера рН 7,4 с интервалом 15 мин в течение 7 дней.

На 7 сутки после инъекции:

площадь повреждения сетчатки - 3 у.е.

реакция зрачка на свет - 2 у.е.

концентрация дофамина в сетчатке - 0,05 пг/мг

активность α2-макроглобулина в сетчатке - 3,0 нмоль/мин*мг.

Пример 2.

Кролик №7. После и/в инъекции 6-OHDA получал ежедневные инсталляции

1% тиоктовой кислоты рН 6,8 4 раза в день в течение 7 дней.

На 7 сутки после инъекции:

площадь повреждения сетчатки - 1 у.е

реакция зрачка на свет -1 у.е

концентрация дофамина в сетчатке - 0,07 пг/мл

активность α2-макроглобулина в сетчатке - 4,1 нмоль/мин*мг

Ежедневные инсталляции 1% тиоктовой кислоты 4 раза в день снизили площадь повреждения сетчатки, улучшили реакцию зрачка на свет, немного увеличили содержание дофамина и активность α2-макроглобулина в сетчатке по сравнению с нелечеными животными.

Пример 3.

Кролик №11. После и/в инъекции 6-OHDA получал ежедневные инсталляции 2% тиоктовой кислоты рН 7,4 4 раза в день в течение 7 дней.

На 7 сутки после инъекции:

площадь повреждения сетчатки - 1 у.е

реакция зрачка на свет - 1 у.е

концентрация дофамина в сетчатке - 0,08 пг/мг

активность α2-макроглобулина в сетчатке - 4,3 нмоль/мин*мг

Ежедневные инсталляции 2% тиоктовой кислоты 4 раза в день снизили площадь повреждения сетчатки, улучшили реакцию зрачка на свет, немного увеличили содержание дофамина и активность α2-макроглобулина в сетчатке по сравнению с нелечеными животными.

Пример 4.

Кролик №14. После и/в инъекции 6-OHDA получал ежедневные инсталляции 0,5% тиоктовой кислоты рН 6,5 4 раза в день в течение 7 дней.

На 7 сутки после инъекции:

площадь повреждения сетчатки - 2 у.е

реакция зрачка на свет - 2 у.е

концентрация дофамина в сетчатке - 0,07 пг/мг

активность α2-макроглобулина в сетчатке - 3,8 нмоль/мин*мг

Ежедневные инсталляции 0,5% тиоктовой кислоты 4 раза в день не вызвали значимых изменений исследованных параметров по сравнению с нелечеными кроликами.

Пример 5.

Кролик №9. После и/в инъекции 6-OHDA получал ежедневные инсталляции 3% тиоктовой кислоты рН 7,8 4 раза в день в течение 7 дней.

В связи с выраженным местно-раздражающим действием тиоктовой кислоты в концентрации 3% эксперимент был прерван на 4 сутки.

Пример 6.

Кролик №11. После и/в инъекции 6-OHDA получал ежедневные инсталляции Индоколлира 4 раза в день в течение 7 дней.

На 7 сутки после инъекции:

площадь повреждения сетчатки - 2 у.е

реакция зрачка на свет - 1 у.е

концентрация дофамина в сетчатке - 0,09 пг/мг

активность α2-макроглобулина в сетчатке- 7,1 нмоль/мин*мг

Ежедневные инсталляции Индоколлира (0,1% индометацин) 4 раза в день снизили площадь повреждения сетчатки, но в меньшей степени, чем при применении тиоктовой кислоты, улучшили реакцию зрачка на свет, увеличили содержание дофамина и активность α2-макроглобулина в сетчатке по сравнению с нелечеными животными.

Пример 7.

Кролик №19. После и/в инъекции 6-OHDA получал ежедневные инсталляции 4 раза в день Индоколлира с последующими через 15 мин инсталляциями 1% тиоктовой кислоты рН 7,8 в течение 7 дней.

На 7 сулаг после инъекции:

площадь повреждения сетчатки - 1 у.е

реакция зрачка на свет - 1 у.е

концентрация дофамина в сетчатке - 0,13 пг/мг

активность α2-макроглобулина в сетчатке - 6,5 нмоль/мин*мг

Ежедневные инсталляции 4 раза в день в течение 10 дней Индоколлира с последующими через 15 мин инсталляциями 1% тиоктовой кислоты существенно снизили площадь повреждения сетчатки, улучшили реакцию зрачка на свет, значительно повысили содержание дофамина и активность α2-макроглобулина в сетчатке по сравнению с нелечеными животными.

Пример 8.

Кролик №15. После и/в инъекции 6-OHDA получал ежедневные инсталляции 4 раза в день Индоколлира с последующими через 15 мин инсталляциями 2% тиоктовой кислоты рН 6,8 в течение 7 дней.

На 7 сутки после инъекции:

площадь повреждения сетчатки - 1 у.е

реакция зрачка на свет - 1 у.е

концентрация дофамина в сетчатке -0,10 пг/мг

активность α2-макроглобулина в сетчатке - 8,2 нмоль/мин*мг

Ежедневные инсталляции 4 раза в день в течение 7 дней Индоколлира с последующими через 15 мин инсталляциями 2% тиоктовой кислоты существенно снизили площадь повреждения сетчатки, улучшили реакцию зрачка на свет, значительно повысили содержание дофамина и активность α2-макроглобулина в сетчатке по сравнению с нелечеными животными.

Пример 9.

Кролик №16. После и/в инъекции 6-OHDA получал ежедневные инсталляции 4 раза в день Индоколлира с последующими через 15 мин инсталляциями 0,5% тиоктовой кислоты рН 7,4 в течение 7 дней.

На 7 сутки после инъекции:

площадь повреждения сетчатки - 2 у.е

реакция зрачка на свет - 1 у.е

концентрация дофамина в сетчатке - 0,08 пг/мг

активность α2-макроглобулина в сетчатке - 6,2 нмоль/мин*мг

Ежедневные инсталляции 4 раза в день Индоколлира с последующими через 15 мин инсталляциями 0,5% тиоктовой кислоты вызвали изменения исследуемых параметров такие же как при применении одного Индоколлира.

Таким образом, на модели симпатэктомии, приводящей к нейровоспалению и нейродегенерации и воспроизводящей процессы в глазу, связанные со снижением продукции дофамина, показано, что совместное применение 1% индометацина с тиоктовой кислотой в концентрации 1-2% наиболее эффективно снижает площадь повреждения сетчатки и восстанавливает уровень дофамина.

Изобретение относится к офтальмологии и предназначено для лечения нейродегенеративного процесса в глазу в эксперименте. Кролику на фоне нейродегенеративного процесса проводят инсталляции в конъюнктивальную полость поочередно с интервалом 15 минут по 1 капле индометацина 0,1% и тиоктовой кислоты 1-2% при рН 6.5-7.8 4 раза в день в течение 7 дней. Изобретение обеспечивает усиление эффекта нормализации физиологических и биохимических показателей в глазу кролика на модели начальных стадий нейродегенерации. 4 ил., 9 пр.

Способ лечения нейродегенеративного процесса в глазу в эксперименте, включающий применение тиоктовой кислоты, отличающийся тем, что кролику проводят инсталляции в конъюнктивальную полость поочередно с интервалом 15 минут по 1 капле индометацина 0,1% и тиоктовой кислоты 1-2% при рН 6.5-7.8 4 раза в день в течение 10 дней.