Композиция для определения содержания иммуноглобулинов IgA в лекарственных препаратах Российский патент 2023 года по МПК A61K39/395 A61K35/16 

Настоящее техническое решение относится к фармацевтической композиции для определения содержания иммуноглобулинов класса A (IgA) в лекарственных препаратах иммуноглобулинов человека.

Заявленное техническое решение может быть использовано в фармацевтической и (или) биотехнологической промышленности, здравоохранении и иммунологии, а также, в научно-исследовательской деятельности.

Уровень техники

Препараты иммуноглобулинов человека - группа иммунобиологических лекарственных средств, действующим веществом которых являются иммуноглобулины G (IgG) человека, выделенные промышленным способом из пула плазмы крови более чем 1000 здоровых доноров. Объединение такого значительного объема субстанции биологического происхождения обеспечивает присутствие в готовых лекарственных формах широкого спектра антител иммуноглобулинов G донорской популяции, обладающих заместительным эффектом при лечении первичных и вторичных иммунодефицитов. Вероятность выделения в ходе технологического процесса производства препаратов иммуноглобулинов помимо действующего вещества других, физиологических белковых составляющих плазмы крови человека, например, фракции иммуноглобулина A (IgA) велика.

Присутствие примеси иммуноглобулинов класса IgA в парентеральных лекарственных препаратах иммуноглобулинов человека для внутримышечного, внутривенного и подкожного введения препаратов может стать причиной развития таких нежелательных реакций со стороны иммунной системы как, головная боль, миалгия, артралгия, озноб, общее недомогание, повышение температуры, сыпь, покраснение, зуд, крапивница, анафилактические/анафилактоидные реакции [1].

Для предупреждения развития перечисленных нежелательных реакций в препаратах иммуноглобулинов человека контролируют содержание примеси IgA.

В 2009 году в странах Европейского Союза впервые введены фармакопейные требования по оценке содержания примеси IgA в препаратах иммуноглобулинов человека для внутривенного и подкожного введения любым пригодным иммунохимическим методом [2, 3]. Европейские производители препаратов иммуноглобулинов человека для оценки содержания примеси IgA в лекарственных препаратах иммуноглобулина человека, используют методы радиальной иммунодиффузии, кинетической нефелометрии и иммуноферментного анализа.

В 2018 году и в Российской Федерации показатель «Иммуноглобулин А» включен в перечень обязательных для оценки качества препаратов иммуноглобулинов человека для внутривенного введения с обязательным использованием стандартного образца количественного содержания IgA фармакопейными методами: кинетической нефелометрии, радиальной иммунодиффузии и иммуноферментным анализом[4].

В 1970 году в реестр стандартных образцов Всемирной организации здравоохранения включен Международный стандартный образец содержания иммуноглобулинов G, А, М (WHO International Standard Immunoglobulins G, A, M, Human Serum, NIBSC code 67/086). Международный стандартный образец представляет собой лиофилизированную сыворотку крови человека, разлитую в ампулы по 1 мл, аттестованную весовым и методом радиальной иммунодиффузии. Установлено, что 1 единица активности IgA в Международном стандартном образце соответствует 14,2 мкг IgA (12,1-16,6 мкг) при доверительной вероятности 95%, 1 ампула Международного стандартного образце (1 мл) содержит 100 единиц активности IgA [5].

Международный стандартный образец рекомендовано использовать при определении содержания примеси IgA в лекарственных препаратах иммуноглобулинов человека методом радиальной иммунодиффузии, а также для аттестации вторичных стандартных образцов.

Международный стандартный образец не аттестован такими современными иммунохимическими методами, как кинетическая нефелометрия и иммуноферментный анализ, широко используемыми отечественными и зарубежными производителями препаратов иммуноглобулинов человека для количественного определения содержания примеси IgA.

Отечественные и зарубежные производители препаратов иммуноглобулинов человека при использовании методов кинетической нефелометрии и иммуноферментного для оценки содержания примеси IgA в лекарственных препаратах иммуноглобулинов человека используют стандартные образцы предприятий, аттестованные по отношению к Международному стандартному образцу, или контрольные/калибровочные образцы, входящие в состав иммунохимических наборов реактивов/реагентов для определения концентрации IgA в сыворотке/плазме крови и цереброспинальной жидкости человека.

В настоящее время национальный стандартный образец содержания IgA в препаратах иммуноглобулинов человека, аттестованный тремя фармакопейными методами (радиальной иммунодиффузии, кинетической нефелометрии и иммуноферментного анализа), отсутствует.

Отсутствие единого эталонного препарата не только не позволяет сопоставить результаты, полученными разными методами, но и может стать причиной неадекватной оценки содержания нежелательной биологической примеси в препаратах иммуноглобулинов человека.

Аналогов заявленной фармацевтической композиции для количественного определения содержания примеси иммуноглобулинов класса A (IgA) в лекарственных препаратах иммуноглобулинов человека не выявлено. Кроме того, оценка валидационных характеристик таких как, специфичность, правильность, повторяемость (сходимость), внутрилабораторная (промежуточная) прецизионность методами кинетической нефелометрии, радиальной иммунодиффузии и иммуноферментного при подтверждении их пригодности для оценки содержания примеси IgA в препаратах иммуноглобулинов человека из уровня техники не выявлено.

Технической задачей изобретения является создание композиции для определения содержания примеси иммуноглобулинов класса A (IgA) в лекарственных препаратах иммуноглобулинов человека, аттестованной по отношению к Международному стандартному образцу методами радиальной иммунодиффузии, кинетической нефелометрии и иммуноферментным, применимого для количественного определения содержания примеси IgA тремя указанными методами и для проведения валидационных исследований этих методов, что позволяет получать достоверные и адекватные результаты оценки содержания нежелательной биологической примеси IgA в лекарственных препаратах иммуноглобулинов человека.

Описание сущности изобретения

Технической задачей является создание фармацевтической композиции для определения содержания примеси иммуноглобулинов класса A (IgA) в лекарственных препаратах иммуноглобулинов человека, аттестованной по отношению к Международному стандартному образцу методами радиальной иммунодиффузии, кинетической нефелометрии и иммуноферментным, применимого для количественного определения содержания примеси IgA тремя указанными методами и для проведения валидационных исследований этих методов.

Техническим результатом заявленного технического решения, является то, что создана фармацевтическая композиция для определения содержания иммуноглобулинов IgA в лекарственных препаратах иммуноглобулина человека в качестве стандартного образца, состоящая из стерильной сыворотки крови человека, полученной из плазмы человека для фракционирования, содержащая аттестованное количество IgA, без содержания стабилизаторов и без консервантов.

Используемые термины и определения

Плазма человека для фракционирования - жидкая часть крови здоровых доноров, отделенная от клеточных элементов крови, методами центрифугирования, афереза и др. Плазма человека для фракционирования используется в качестве субстанции для производства лекарственных препаратов крови человека, в том числе препаратов иммуноглобулинов человека [6].

Сыворотка крови человека - плазма крови человека, лишенная фибриногена [7].

Индивидуальная единица субстанции «Плазма человека для фракционирования» - индивидуальная донация плазмы крови здорового донора, протестированная на содержание маркеров гемотрансмиссивных инфекций [6].

Специфичность метода оценки количественного содержания примеси IgA в препаратах иммуноглобулинов человека - это способность аналитического метода однозначно оценивать определяемое вещество в присутствии сопутствующих компонентов [8].

Правильность метода характеризуется отклонением среднего результата определений, выполненных с ее использованием, от значения, принимаемого за истинное. Валидируемый метод признается правильным, если значения, принимаемые за истинные, лежат внутри доверительных интервалов соответствующих средних результатов анализов, полученных экспериментально по данному методу [8].

Фармакопейные методы определения содержания примеси IgA в лекарственных препаратах иммуноглобулинов человека - это известные специалисту из области техники методы: кинетическая нефелометрия, радиальная иммунодиффузия и иммуноферментный анализ.

Метод кинетической нефелометрии основан на измерении скорости увеличения светорассеяния реакционного раствора, содержащего латексные частицы с комплексами антиген-антитело, где для определения содержания иммуноглобулинов классов А используют наборы реагентов, содержащие латексные частицы с иммобилизованными антителами к иммуноглобулинам класса А [4].

Метод радиальной иммунодиффузии основан на специфическом взаимодействии антисыворотки (антитело) с иммуноглобулинами класса А в испытуемом образце (антиген), внесенном в лунки, с образованием кольца преципитации, площадь которого прямо пропорциональна концентрации иммуноглобулинов IgA, где для определения содержания иммуноглобулинов классов А используют коммерческие наборы реагентов для радиальной иммунодиффузии [4].

Иммуноферментный метод определения содержания иммуноглобулинов класса А основан на специфическом взаимодействии антигена с антителом с образованием иммунного комплекса и последующей детекцией полученного комплекса с помощью метода спектрофотометрии. Оценку количественного содержания иммуноглобулинов IgA проводят по измерению интенсивности окраски реакционной смеси, зависящей от количества выделившегося хромофора, которая прямо пропорциональна содержанию иммуноглобулинов класса А в испытуемом образце. Для определения содержания иммуноглобулинов классов А используют наборы реагентов иммуноферментного метода [4].

В соответствии с требованиями ФС.3.3.2.0001.19 «Плазма человека для фракционирования» ГФ РФ в заявленной композиции используют стерильную сыворотку крови человека, полученную из стерильной плазмы крови здоровых доноров с содержанием стабильных белков, в виде иммуноглобулинов, в том числе иммуноглобулинов класса IgA не менее 50 г/л, рН от 6,5 до 7,5, оптической плотностью не более 0,25 (гемпигменты).

Плазма крови здоровых доноров отобрана по результатам медицинского обследования, изучения медицинского анамнеза и лабораторных исследований крови доноров. Плазму каждого донора обязательно тестируют на отсутствие поверхностного антигена вируса гепатита В, антитела к вирусу гепатита С, антигена р24 ВИЧ-1, антитела к ВИЧ-1, ВИЧ-2 и к возбудителю сифилиса.

Подлинность (видоспецифичность) плазмы крови человека подтверждают наличием прослеживаемости доноров, гарантирующих человеческую природу плазмы крови человека для фракционирования.

Плазма крови человека для выделения стабильных белков (иммуноглобулинов) замораживают до температуры минус 20°С и ниже не позднее 24 ч после донации. Плазму крови человека, полученную иными способами, замораживают до температуры минус 20°С и ниже не позднее 72 ч после донации. Оттаивание индивидуальной единицы плазмы крови плазмы крови проводят при температуре от 35°С до 37°С в течение 15 минут.

Способ изготовления сыворотки крови человека осуществляют путем объединения индивидуальных единиц плазмы крови человека в одной емкости, после этого добавляют к полученному объему плазмы крови человека 1% раствора кальция хлористого, центрифугируют полученный объема плазмы до получения сыворотки крови человека с ее последующей стерилизацией фильтрованием.

Центрифугирование объединенных индивидуальных единиц субстанции проводят до получения сыворотки крови, лишенной фибриногена, при условиях известных специалисту из области техники (1500-2000 g, 10 мин) [9].

Разливают полученную сыворотку крови человека по 2 мл или по 1 мл во флаконы, с дальнейшим укупориванием резиновыми пробками и завальцовыванием алюминиевыми колпачками.

Розлив и укупорку полученной сыворотки крови человека проводят в асептических условиях.

Полученную сыворотку крови человека, при необходимости, можно разливать в ампулы с дальнейшим их запаиванием.

Заявленную композицию, содержащую аттестованное количество IgA выраженное в мг/мл, применяют в качестве стандартного образца для определения содержания примеси IgA в лекарственных препаратах иммуноглобулина человека. Аттестованное содержание IgA в мг/мл указывают в инструкции по применению заявленной композиции либо на этикетке зафиксированной на упаковке и/или флаконе или ампуле или непосредственно на флаконе или ампуле.

Разлитую и укупоренную во флаконах или ампулах в асептических условиях стерильную сыворотку крови человека упаковывают в наборы, в которые вкладывают инструкцию по применению заявленной композиции.

Заявленную композицию применяют для количественного определения содержания примеси иммуноглобулинов класса A (IgA) в парентеральных лекарственных препаратах иммуноглобулинов человека.

Заявленную композицию аттестуют в качестве стандартного образца методами радиальной иммунодиффузии, кинетической нефелометрии и иммуноферментным.

Заявленную композицию, применяют для количественного определения содержания примеси иммуноглобулинов класса A (IgA) в парентеральных лекарственных препаратах иммуноглобулинов человека методами радиальной иммунодиффузии и иммуноферментным, а также для оценки валидационных характеристик (специфичности, правильности, повторяемости (сходимости), внутрилабораторной (промежуточной) прецизионности методов кинетической нефелометрии, радиальной иммунодиффузии и иммуноферментного при подтверждении их пригодности для оценки содержания примеси IgA в препаратах иммуноглобулинов человека.

Аттестацию заявленной композиции в качестве стандартного образца проводят фармакопейными методами: кинетической нефелометрии, радиальной иммунодиффузии и методом иммуноферментного анализа. Установление значения аттестуемой характеристики (содержание иммуноглобулинов класса A (IgA), выраженное в мг/мл) проводят с использованием известных специалисту из данной области техники трех фармакопейных методов испытаний и Международного стандартного образца.

В заявленной композиции значение аттестованное содержание IgA, соответствует от 1,736 мг/мл до 2,224 мг/мл (1,98 мг/мл±0,244).

Заявленную композицию применяют в качестве стандартного образца для определения примеси IgA в парентеральных лекарственных препаратах иммуноглобулина человека.

Заявленную композицию разливают по 1 мл или 2 мл во флаконы или ампулы в асептических условия и упаковывают в наборы, в которые вкладывают инструкцию по применению.

Возможность осуществления заявленного изобретения раскрыта в следующих примерах.

Пример 1. Приготовление заявленной композиции для определения содержания иммуноглобулинов IgA в лекарственных препаратах.

Для приготовления заявленной композиции для определения содержания иммуноглобулинов IgA в лекарственных препаратах берут индивидуальные единицы субстанции (плазму крови здоровых доноров), отобранные по результатам медицинского обследования, изучения медицинского анамнеза и лабораторных исследований крови доноров. Плазму каждого донора обязательно тестируют на отсутствие поверхностного антигена вируса гепатита В, антитела к вирусу гепатита С, антигена р24 ВИЧ-1, антитела к ВИЧ-1, ВИЧ-2 и к возбудителю сифилиса.

Подлинность (видоспецифичность) плазмы крови человека подтверждают наличием прослеживаемости доноров, гарантирующих человеческую природу плазмы крови человека для фракционирования.

Объединяют отобранные индивидуальные единицы субстанции в одной емкости, добавляют к полученному объему плазмы крови человека 1% раствор кальция хлористого, центрифугируют полученный объем плазмы до получения сыворотки крови человека и подвергают стерилизующей фильтрации.

Центрифугирование объединенных индивидуальных единиц субстанции проводят до получения сыворотки крови человека, лишенной фибриногена, при условиях: 1800 g, 10 мин.

Разливают полученную сыворотку крови человека во флаконы, укупоривают резиновыми пробками и завальцовывают алюминиевыми колпачками.

Розлив и укупорку полученной сыворотки крови человека проводят в асептических условиях.

Полученную сыворотку крови человека, при необходимости, можно разливать в ампулы с дальнейшим их запаиванием.

Таким образом, полученная стерильная сыворотка крови человека содержит 58 г/л стабильного белка, в виде иммуноглобулинов, в том числе иммуноглобулины класса IgA, значение рН 7,0, оптическая плотность - не более 0,200 (гемпигменты).

Пример 2. Проведение аттестации заявленной композиции методом кинетической нефелометрии

В день проведения аттестации:

- извлекают из холодильника набор диагностических иммунохимических реагентов для определения IgA методом кинетической нефелометрии и выдерживают при комнатной температуре не менее 30 минут;

- извлекают из холодильника необходимое количество флаконов стандартного образца и ампул Международного стандартного образца и выдерживают при комнатной температуре не менее 30 минут;

- готовят два независимых разведения стандартного образца и Международного стандартного образца в соотношении 1/10 соответственно, путем добавления к 1 мл стандартного образца/Международного стандартного образца 9,0 мл растворителя 1, входящего в состав диагностического набора реагентов для кинетической нефелометрии.

Температура хранения в холодильнике должна быть не более 8°С, не допуская образования кристаллов льда и/или замерзания.

Количественное определение содержания IgA (мг/мл) проводят с использованием автоматического иммунохимического анализатора путем внесения по 1 мкл в лунки прибора приготовленных проб стандартного и Международного стандартного образца. Результат (содержание IgA (мг/мл)) автоматического анализа прибора получают на бумажном носителе (см. табл. 1)

Пример 3. Проведение аттестации заявленной композиции методом радиальной иммунодиффузии

В день проведения аттестации:

- извлекают из холодильника набор диагностических реагентов для определения IgA методом радиальной иммунодиффузии и выдерживают при комнатной температуре не менее 30 минут;

- извлекают из холодильника необходимое количество флаконов СО стандартного образца и ампул Международного стандартного образца и выдерживают при комнатной температуре не менее 30 минут;

- готовят 2% агаровый гель, путем добавления навески (2 г) агара в колбу со 100 мл 0,9% раствора натрия хлорида, перемешивают и оставляют для набухания при комнатной температуре на 30 минут, затем помещают колбу на водяную баню и нагревают до полного расплавления агара и получения прозрачного, однородного раствора, не содержащего видимых включений;

- ампулу с сывороткой против IgA(H) из набора диагностических реагентов для радиальной иммунодиффузии восстанавливают в 1,0 мл воды и добавляют раствор 0,9% натрия хлорида до концентрации в 2 раза превышающей титр, указанный на ампуле (титр 1:28-1 мл антисыворотки и 13 мл раствора 0,9% натрия хлорида). Пробирку с разведенной сывороткой против IgA прогревают на водяной бане при температуре (53+3)°С в течение 30 мин. Пробирку с расплавленным агаровым гелем охлаждают (агар не должен застыть) и агаровый гель смешивают в равных количествах с прогретой антисывороткой до получения слоя агара высотой 1 мм (7,5 мл антисыворотки + 7,5 мл агара).

- содержимое ампулы с Международным стандартным образцом растворяют в 1 мл воды, далее готовят 2 независимые повторности следующих разведений Международного стандартного образца/стандартного образца (1:2, 1:4, 1:8) с помощью 0,9% раствора натрия хлорида (например, к 0,5 мл Международного стандартного образца/стандартного образца добавляют 0,5 мл 0,9% раствора натрия хлорида, получая разведение 1:2, затем из полученного разведения отбирают 0,5 мл и добавляют 0,5 мл 0,9% раствора натрия хлорида, остальные разведения готовят таким же способом).

Температура хранения в холодильнике должна быть не более 8°С, не допуская образования кристаллов льда и/или замерзания.

В лунки агара вносят по 2 мкл разведений стандартного и Международного стандартного образца, пластины помещают во влажную камеру и инкубируют в холодильнике в течение 24 часов. После инкубации в агаровом геле образуются кольца преципитации, диаметр которых измеряют с помощью специальной линейки с точностью до 0,1 мм. По результатам измерения диаметров колец преципитации проводят вычисления концентраций IgA в образцах в исследуемых образцах в мг/мл (см. табл. 1).

Пример 4. Проведение аттестации заявленной композиции методом иммуноферментного анализа

В день проведения аттестации:

- извлекают из холодильника набор реагентов для иммуноферментного определения концентрации IgA и выдерживают при комнатной температуре не менее 30 минут;

- необходимое количество флаконов стандартного образца и ампул Международного стандартного образца извлекают из холодильника и выдерживают при комнатной температуре не менее 30 минут;

- температура хранения в холодильнике должна быть не более 8°С, не допуская образования кристаллов льда и/или замерзания;

- готовят рабочий раствор для разведения сывороток и промывочный раствор в соответствии с инструкцией по применению коммерческого набора реагентов для иммуноферментного определения концентрации IgA;

- готовят по две повторности последовательных разведений стандартного образца/Международного стандартного образца: 1/1000, 1/2000, 1/4000, 1:8000. В качестве раствора для разведения используют раствор для разведения сывороток, входящий в состав диагностического набора реагентов для иммуноферментного определения концентрации IgA.

Для аттестации в лунки основного планшета из коммерческого диагностического набора реагентов для иммуноферментного определения концентрации IgA вносят по 100 мкл раствора для разведения сывороток. Затем в 2-х повторностях вносят по 20 мкл предварительно разведенных стандартного /Международного стандартного образца. Последующие этапы иммуноферментного метода проводят в соответствии с инструкцией по применению диагностического набора реагентов:

- планшет заклеивают пленкой и инкубируют в течение 20 мин при встряхивании на термостатируемом шейкере при температуре 37±1°С и 700 об/мин;

- по окончании инкубации планшет промывают 4 раза, удаляют остатки жидкости из лунок;

- вносят во все лунка планшета по 100 мкл конъюгата, инкубируют в течение 20 мин при встряхивании на термостатируемом шейкере при температуре 37±1°С и 700 об/мин;

- по окончании инкубации планшет промывают 4 раза, удаляют остатки жидкости из лунок;

- вносят во все лунка планшета по 100 мкл раствора тетраметилбензидина плюс (готовый для использования), инкубируют в защищенном от света месте в течение 15 мин при температуре от 18 до 25°С, далее вносят во все лунки по 100 мкл стоп-реагента, при этом содержимое лунок окрашивается в желтый цвет;

- измеряют величину оптической плотности растворов в лунках планшета на спектрофотометре вертикального сканирования в двухволновом режиме: 450 нм и 450 нм;

- вычисляют средние арифметические значения оптической плотности для каждой пары лунок, содержащих исследуемые образцы;

- строят в линейных координатах калибровочный график среднего арифметического значения оптической плотности от концентрации IgA в стандартном/Международном стандартном образце (мг/мл).

- содержание IgA в мг/мл определяют по калибровочному графику (линейная зависимость) (см. табл.1).

Выводы в отношении примеров 2-4

Аттестацию заявленной композиции в качестве стандартного образца проводили фармакопейными методами кинетической нефелометрии, радиальной иммунодиффузии и методом иммуноферментного анализа. Установление значения аттестуемой характеристики (содержание иммуноглобулинов класса A (IgA), выраженное в мг/мл) провели с использованием известных специалисту из данной области техники трех фармакопейных методов испытаний и Международного стандартного образца.

Результаты аттестации стандартного образца методами кинетической нефелометрии, радиальной иммунодиффузии и иммуноферментным представлены в Таблице 1.

Таким образом, в заявленной композиции значение содержание IgA, аттестуемой в качестве стандартного образца, соответствует от 1,736 мг/мл до 2,224 мг/мл (1,98 мг/мл±0,244).

Возможность использования стандартного образца для оценки валидационных характеристик (специфичности, правильности, повторяемости (внутрилабораторной прецизионности), промежуточной (внутрилабораторной прецизионности) методов кинетической нефелометрии, радиальной иммунодиффузии и иммуноферментного при подтверждении их пригодности для оценки содержания примеси IgA в парентеральных препаратах иммуноглобулинов человека раскрыта в следующих примерах.

Пример 5. Оценка специфичности метода кинетической нефелометрии, радиальной иммунодиффузии и иммуноферментного с использованием стандартного образца

В день проведения испытания:

- извлекают из холодильника наборы диагностических реагентов для определения IgA методами кинетической нефелометрии, радиальной иммунодиффузии и иммуноферментным, выдерживают при комнатной температуре не менее 30 минут;

- извлекают из холодильника в необходимое количество флаконов стандартного образца и выдерживают при комнатной температуре не менее 30 минут;

- температура хранения в холодильнике должна быть не более 8°С, не допуская образования кристаллов льда и/или замерзания;

- в качестве образца плацебо используют 0,9% раствор натрия хлорида. Вывод.

Проведена оценка специфичности метода кинетической нефелометрии, радиальной иммунодиффузии и иммуноферментного с использованием стандартного образца.

Результаты оценки специфичности методов кинетической нефелометрии, радиальной иммунодиффузии и иммуноферментного представлены в Таблицах 2-4.

Вывод: в соответствии с данными, представленными в Таблице 2, в образцах плацебо IgA не выявлены, в стандартном образце содержание IgA -2,134 мг/мл - метод кинетической нефелометрии является специфичным.

Вывод: в соответствии с данными, представленными в Таблице 3, в образцах плацебо IgA не выявлены, в стандартном образце содержание IgA -1,963 мг/мл и 1,978 мг/мл - метод радиальной иммунодиффузии является специфичным.

Вывод: в соответствии с данными, представленными в Таблице 4, в образцах плацебо IgA не выявлены, в стандартном образце содержание IgA - 1,802 мг/мл и 1,845 мг/мл - иммуноферментный метод является специфичным.

Пример 6. Оценка правильности методов кинетической нефелометрии, радиальной иммунодиффузии и иммуноферментного с использованием стандартного образца

- в день проведения испытания извлекают из холодильника наборы диагностических реагентов для определения IgA методами кинетической нефелометрии, радиальной иммунодиффузии и иммуноферментным, выдерживают при комнатной температуре не менее 30 минут;

- в день проведения испытания необходимое количество флаконов стандартного образца извлекают из холодильника и выдерживают при комнатной температуре не менее 30 минут;

- температура хранения в холодильнике должна быть не более 8°С, не допуская образования кристаллов льда и/или замерзания;

- для метода кинетической нефелометрии готовят два независимых разведения стандартного образца (1/10) путем добавления к 1 мл стандартного образца 9,0 мл растворителя 1, входящего в состав коммерческого диагностического набора реагентов для кинетической нефелометрии;

- для метода радиальной иммунодиффузии готовят две независимые повторности следующих разведений стандартного образца (1:2, 1:4, 1:8) с помощью 0,9% раствора натрия хлорида (например, к 0,5 мл стандартного образца добавляют 0,5 мл 0,9% раствора натрия хлорида, получая разведение 1:2, затем из полученного разведения отбирают 0,5 мл и добавляют 0,5 мл 0,9% раствора натрия хлорида, остальные разведения готовят таким же способом);

- для иммуноферментного метода готовят две повторности последовательных разведений стандартного образца: 1/1000, 1/2000, 1/4000, 1:8000. В качестве раствора для разведения используют раствор для разведения сывороток, входящий в состав диагностического набора реагентов для иммуноферментного определения концентрации IgA.

Вывод.

Проведена оценка правильности методов кинетической нефелометрии, радиальной иммунодиффузии и иммуноферментного с использованием стандартного образца.

Результаты оценки правильности методов кинетической нефелометрии, радиальной иммунодиффузии и иммуноферментного представлены в Таблицах 5-7.

Вывод: метод кинетической нефелометрии является правильным, так как в соответствии с данными, представленными в Таблице 5, доверительные интервалы среднего значения в стандартном образце составили от 2,037 до 2,231 мг/мл (I день испытаний), от 2,027 до 2,241 мг/мл (II день испытаний) находились в пределах неопределенности аттестованного значения стандартного образца (от 1,532 до 2,420 мг/мл). Смещение среднего относительно аттестованного значения стандартного образца составило 8,0%.

Вывод: метод радиальной иммунодиффузии является правильным, так как в соответствии с данными, представленными в Таблице 6, доверительные интервалы среднего значения в стандартном образце составили от 1,856 до 2,070 мг/мл (I день испытаний), от 1,817 до 2,139 мг/мл (II день испытаний) находились в пределах неопределенности аттестованного значения стандартного образца (от 1,532 до 2,420 мг/мл). Смещение среднего относительно аттестованного значения в стандартном образце составило 0,7% (I день испытаний), 0,1% (II день испытаний).

Вывод: иммуноферментный метод является правильным, так как в соответствии с данными, представленными в Таблице 6, доверительные интервалы среднего значения в стандартном образце составили от 1,575 до 2,028 мг/мл (I день испытаний), от 1,651 до 2,040 мг/мл (II день испытаний) и находились в пределах неопределенности аттестованного значения стандартного образца от 1,532 до 2,420 мг/мл. Смещение среднего относительно аттестованного значения стандартного значения составило минус 8,8% (I день испытаний) и 6,6% (II день испытаний).

Повторяемость метода характеризуется рассеянием результатов, получаемых с ее использованием, относительно величины среднего результата. Мерой такого рассеяния является величина стандартного отклонения результата отдельного определения, полученная для выборки достаточно большого объема.

Пример 7. Оценка повторяемости методов кинетической нефелометрии, радиальной иммунодиффузии и иммуноферментного с использованием стандартного образца

- в день проведения испытания извлекают из холодильника наборы диагностических реагентов для определения IgA методами кинетической нефелометрии, радиальной иммунодиффузии и иммуноферментным, выдерживают при комнатной температуре не менее 30 минут;

- в день проведения испытания необходимое количество флаконов стандартного образца извлекают из холодильника и выдерживают при комнатной температуре не менее 30 минут;

- температура хранения в холодильнике должна быть не более 8°С, не допуская образования кристаллов льда и/или замерзания;

- для метода кинетической нефелометрии готовят 2 независимых разведения стандартного образца (1/10) путем добавления к 1 мл стандартного образца 9,0 мл растворителя 1, входящего в состав диагностического набора реагентов для кинетической нефелометрии;

- для метода кинетической нефелометрии образцы препарата иммуноглобулина человека для внутримышечного введения (образец 1), препарата иммуноглобулина для внутривенного введения (образец 2), препарата для подкожного применения (образец 3) используют без предварительного разведения, вносят по три пробы каждого образца;

- для метода радиальной иммунодиффузии готовят 2 независимые повторности следующих разведений стандартного образца (1:2, 1:4, 1:8) с помощью 0,9% раствора натрия хлорида (например, к 0,5 мл стандартного образца добавляют 0,5 мл 0,9% раствора натрия хлорида, получая разведение 1:2, затем из полученного разведения отбирают 0,5 мл и добавляют 0,5 мл 0,9% раствора натрия хлорида, остальные разведения готовят таким же способом);

- для метода радиальной иммунодиффузии готовят предварительное разведение образцов препарата иммуноглобулина человека для внутримышечного (образец 1) и подкожного применения (образец 3) - 1/10 с использованием 0,9% раствором натрия хлорида. Все образцы вносят в трех повторностях;

- для метода радиальной иммунодиффузии образцы препарата иммуноглобулина для внутривенного применения (образец 2) используют без разведения, вносят в трех повторностях;

- для иммуноферментного метода готовят две повторности последовательных разведений стандартного образца: 1/1000, 1/2000, 1/4000, 1:8000. В качестве раствора для разведения используют раствор для разведения сывороток, входящий в состав диагностического набора реагентов для иммуноферментного определения концентрации IgA.

- для иммуноферментного метода готовят по 2 независимые повторности следующих последовательных разведений образцов 1,2,3 лекарственных препаратов иммуноглобулинов человека для внутримышечного, внутривенного и подкожного применения - 1:1000, 1:2000, 1:4000, 1:8000. В качестве раствора для разведения используют раствор для разведения сывороток, входящий в состав коммерческого диагностического набора реагентов для иммуноферментного анализа.

Вывод: результаты оценки повторяемости методов кинетической нефелометрии, радиальной иммунодиффузии и иммуноферментного представлены в Таблицах 8-10.

В результаты оценки повторяемости метода кинетической нефелометрии установлено, что CV варьировал от 4,2% до 8,4%.

=

В результаты оценки повторяемости метода радиальной иммунодиффузии установлено, что CV варьировал от 6,5% до 12,6%.

В результаты оценки повторяемости иммуноферментного метода установлено, что CV рьировал от 11,5% до 18,7%.

В результаты оценки внутрилабораторной (промежуточной) прецизионности метода кинетической нефелометрии установлено, что различия дисперсий не значимы р>0,05 (Levene test), различия средних не значимы р>0,05 (ANOVA), СVобщ ≤ варьировал от 5,4 до 7,3%.

В результаты оценки внутрилабораторной (промежуточной) прецизионности метода установлено, что различия дисперсий не значимы р>0,05 (Levene test), различия средних не значимы р>0,05 (ANOVA), СУобщ<варьировал от 9,6 до 10,5%.

В результаты оценки внутрилабораторной (промежуточной) прецизионности метода иммуноферментного метода установлено, что различия дисперсий не значимы р>0,05 (Levene test), различия средних не значимы р>0,05 (ANOVA), СVо6щ ≤ варьировал от 12,4 до 17,9%.

Результаты валидационных исследований методов кинетической нефелометрии, радиальной иммунодиффузии и иммуноферментного позволили установить критерии приемлемости оценки результатов содержания IgA в препаратах иммуноглобулинов человека.

Критерии приемлемости оценки результатов содержания IgA в препаратах иммуноглобулинов человека методом кинетической нефелометрии представлены в Таблице 14.

Установленные критерии приемлемости предназначены для использования при проведении валидационных исследований методов радиальной иммунодиффузии, кинетической нефелометрии и иммуноферментного в контрольно-аналитических лабораториях Испытательных центров и лабораторий контроля качества медицинских иммунобиологических лекарственных средств и предприятий-изготовителей препаратов иммуноглобулинов человека.

Возможность использования стандартного образца для количественного определения содержания примеси иммуноглобулинов класса A (IgA) в парентеральных лекарственных препаратах иммуноглобулинов человека методами радиальной иммунодиффузии и иммуноферментным раскрыта в следующих примерах.

Пример 8. Определения содержания в лекарственных препаратах иммуноглобулина человека примеси IgA методом радиальной иммунодиффузии и методом иммуноферментного анализа

В день проведения испытания:

- извлекают из холодильника набор диагностических реагентов для определения IgA методом радиальной иммунодиффузии и иммуноферментным, выдерживают при комнатной температуре не менее 30 минут;

- извлекают необходимое количество флаконов, содержащих заявленную композицию, используемую в качестве стандартного образца из холодильника и выдерживают при комнатной температуре не менее 30 минут;

- температура хранения в холодильнике должна быть не более 8°С, не допуская образования кристаллов льда и/или замерзания;

- для метода радиальной иммунодиффузии готовят 2 независимые повторности 3-х последовательных двукратных разведений стандартного образца (1:2, 1:4, 1:8) с помощью 0,9% раствора натрия хлорида (например, к 0,5 мл стандартного образца добавляют 0,5 мл 0,9% раствора натрия хлорида, получая разведение 1:2, затем из полученного разведения отбирают 0,5 мл и добавляют 0,5 мл 0,9% раствора натрия хлорида, остальные разведения готовят таким же способом);

- для метода радиальной иммунодиффузии для образцов 2 серий препаратов иммуноглобулина человека для внутримышечного (образцы №1, №2) готовят предварительное разведение 1/10 с использованием 0,9% раствора натрия хлорида, все образцы вносят в трех повторностях;

- для метода радиальной иммунодиффузии образцы 3 серий препаратов иммуноглобулинов человека для внутривенного введения (образцы №3-№5), образцы 2 серий препарата иммуноглобулина человека для подкожного введения (образец №6-№7) используют без разведения, все образцы вносят в трех повторностях.

- для иммуноферментного метода готовят рабочий раствор для разведения сывороток и промывочный раствор в соответствии с инструкцией по применению набора реагентов для иммуноферментного определения концентрации IgA;

- для иммуноферментного метода готовят две повторности последовательных разведений стандартного образца: 1/1000, 1/2000, 1/4000, 1:8000. В качестве раствора для разведения используют раствор для разведения сывороток, входящий в состав диагностического набора реагентов для иммуноферментного определения концентрации IgA.

- для иммуноферментного метода готовят по 2 независимые повторности следующих последовательных разведений образцов №1-№7 лекарственных препаратов иммуноглобулинов человека для внутримышечного, внутривенного и подкожного применения - 1:1000, 1:2000, 1:4000, 1:8000. В качестве раствора для разведения используют раствор для разведения сывороток, входящий в состав диагностического набора реагентов для иммуноферментного анализа.

Результаты оценки содержания примеси IgA в лекарственных препаратах иммуноглобулинов человека методами радиальной иммунодиффузии (I) и иммуноферментным (II) и с использованием заявленной композиции представлены в Таблице 17.

Вывод: данный пример подтверждает, что с использованием стандартного образца возможно определить для количественное содержания примеси иммуноглобулинов класса A (IgA) в парентеральных лекарственных препаратах иммуноглобулинов человека методами радиальной иммунодиффузии и иммуноферментным.

Все приведенные примеры подтверждают реализацию заявленного способа, позволяющего определить количественное определения содержание примеси иммуноглобулинов класса IgA в парентеральных лекарственных препаратах иммуноглобулинов человека методами радиальной иммунодиффузии и иммуноферментным, а также оценить валидационные характеристики (специфичность, правильность, повторяемость, внутрилабораторную (промежуточную) прецизионность методов кинетической нефелометрии, радиальной иммунодиффузии и иммуноферментного при подтверждении их пригодности для оценки содержания примеси IgA в препаратах иммуноглобулинов человека.

Представленные примеры не ограничивают объем притязаний настоящего изобретения и служат только для цели иллюстрации и раскрытия заявленного способа.

Промышленная применимость

Поставленная техническая задача, а именно, создание композиции, используемую в качестве стандартного образца для определения содержания примеси IgA в лекарственных препаратах иммуноглобулинов человека, аттестованного по отношению к Международному стандартному образцу методами радиальной иммунодиффузии, кинетической нефелометрии и иммуноферментным, применимого для количественного определения содержания примеси IgA тремя указанными методами и для проведения валидационных исследований этих методов, достигнута, что подтверждается приведенными примерами.

Практическое применение заявленной композиции позволяет получать достоверные и адекватные результаты оценки содержания нежелательной биологической примеси IgA в лекарственных препаратах иммуноглобулинов человека, а также использовать полученные критерии приемлемости оценки результатов при проведении валидационных исследований методов радиальной иммунодиффузии, кинетической нефелометрии и иммуноферментного в контрольно-аналитических лабораториях Испытательных центров и лабораторий контроля качества медицинских иммунобиологических лекарственных средств и предприятий-изготовителей препаратов иммуноглобулинов человека.

Применение заявленного технического решения в области здравоохранения, фармации, биотехнологии и иммунологии, является эффективным и позволит получать достоверные и адекватные результаты оценки содержания нежелательной биологической примеси IgA в лекарственных препаратах иммуноглобулинов человека и проводить валидационные исследования методов кинетической нефелометрии, радиальной иммунодиффузии и иммуноферментного в контрольно-аналитических лабораториях Испытательных центров и лабораторий контроля качества медицинских иммунобиологических лекарственных средств и предприятий-изготовителей препаратов иммуноглобулинов человека.

Источники информации

1. Кудашева Э.Ю., Лешина С.А., Арефьева И.Л., Нечаев А.В., Борисевич И.В., Лебединская Е.В., Кормщикова Е.С.Иммунологическая безопасность препаратов иммуноглобулинов человека нормальных для внутривенного введения // Иммунология. - 2017. - Т. 38, №6. - С. 307-313.

2. 07/2022:0918 Human normal immunoglobulin for intravenous administration: European Pharmacopoeia ed.10.8, Strasburg, Directorate for the quality of Medicines of the Council of Europe.

3. 07/2022:2788 Human normal immunoglobulin for subcutaneous administration: European Pharmacopoeia ed.10.8, Strasburg, Directorate for the quality of Medicines of the Council of Europe.

4. ОФС.1.8.2.0012.18 Количественное определение содержания иммуноглобулинов классов А, М и G в препаратах иммуноглобулинов человека: Государственная фармакопея Российской Федерации. - XIV издание. - Том II.

5. Международный стандартный образец содержания иммуноглобулинов G, А, М (WHO International Standard Immunoglobulins G, A, M, Human Serum, NIBSC code 67/086).

6. ФС.3.3.2.0001.19 Плазма человека для фракционирования: Государственная фармакопея Российской Федерации. XIV издание. Том IV.

7. Хаитов P.M., Игнатьева Г.А., Сидорович И.Г.. Иммунология. М.: Медицина, 2002. - 536 с.

8. ОФС.1.1.0012.15 Валидация аналитических методик Государственная фармакопея Российской Федерации. XIV издание. Том I.

9. ГОСТ Р 59778-2021 Национальный стандарт Российской Федерации. Процедуры взятия проб венозной и капиллярной крови для лабораторных исследований. Приложение В.

Группа изобретений относится к фармацевтической промышленности, а именно к композиции для определения содержания примеси иммуноглобулинов IgA в лекарственных препаратах иммуноглобулинов человека, способу её получения и применяя, а также набору для определения содержания примеси иммуноглобулинов IgA в лекарственных препаратах иммуноглобулинов человека. Композиция для определения содержания примеси иммуноглобулинов IgA в лекарственных препаратах иммуноглобулинов человека включает сыворотку крови человека с оптической плотностью 0,200, содержащую 58 г/мл стабильного белка, который включает аттестованное количество иммуноглобулинов IgA от 1,736 до 2, 224 мг/мл. Способ приготовления композиции включает получение объединенной отобранной плазмы крови человека, содержащей раствор кальция хлористого, с последующим центрифугированием до получения сыворотки крови человека при определенных условиях. Также заявлен набор для определения содержания примеси иммуноглобулинов IgA в лекарственных препаратах иммуноглобулинов человека, имеющий определенный состав. Применяют заявленную композицию для определения содержания примеси иммуноглобулинов IgA в лекарственных препаратах иммуноглобулинов человека в качестве стандартного образца. Вышеописанная композиция позволяет получить фармацевтическую композицию для определения содержания примеси иммуноглобулинов класса A (IgA) в лекарственных препаратах иммуноглобулинов человека, аттестованной по отношению к Международному стандартному образцу, методами радиальной иммунодиффузии, кинетической нефелометрии и иммуноферментного анализа, применимого для количественного определения содержания примеси IgA тремя указанными методами и для проведения валидационных исследований этих методов. 4 н. и 10 з.п. ф-лы, 17 табл., 8 пр.

1. Композиция для определения содержания примеси иммуноглобулинов IgA в лекарственных препаратах иммуноглобулинов человека, включающая сыворотку крови человека с оптической плотностью 0,200, содержащую 58 г/мл стабильного белка, который включает аттестованное количество иммуноглобулинов IgA от 1,736 мг/мл до 2, 224 мг/мл.

2. Композиция по п.1, дополнительно характеризующаяся тем, что сыворотка крови человека получена из объединённой плазмы крови человека.

3. Композиция по п.1 или 2, где сыворотка крови человека с рН 7,0.

4. Композиция по п. 1 или 2 без содержания консервантов и стабилизаторов.

5. Композиция по п. 1 или 2, где количество иммуноглобулинов IgA аттестовано радиальной иммунодиффузией.

6. Композиция по п. 1 или 2, где количество иммуноглобулинов IgA аттестовано кинетической нефелометрией.

7. Композиция по п. 1 или 2, где количество иммуноглобулинов IgA аттестовано иммуноферментным анализом.

8. Способ приготовления композиции по пп. 1-7, отличающийся тем, что объединенную отобранную плазму крови человека, содержащую 1% раствор кальция хлористого, центрифугируют при 1800g до получения сыворотки крови человека.

9. Способ по п. 8, дополнительно характеризующийся тем, что центрифугируют в течение 10 минут.

10. Набор для определения содержания примеси иммуноглобулинов IgA в лекарственных препаратах иммуноглобулинов человека, включающий композицию по пп. 1-7, приготовленную способом по пп. 8, 9, этикетку с указанием на количество аттестованных иммуноглобулинов класса IgA, растворитель и инструкцию по применению.

11. Набор по п. 10, дополнительно характеризующийся тем, композиция по пп. 1-7, приготовленная способом по п.п. 8, 9, стерильная.

12. Набор по п. 10 или 11, дополнительно характеризующийся тем, композиция по пп.1-7, приготовленная способом по пп. 8, 9, расфасована во флаконы или ампулы.

13. Набор по п. 12, дополнительно характеризующийся тем, что флаконы или ампулы укупорены.

14. Применение композиции по пп. 1-7 или набора по пп. 10-13 для определения содержания примеси иммуноглобулинов IgA в лекарственных препаратах иммуноглобулинов человека в качестве стандартного образца.