Способ количественного определения анти-D-антител IgG в препаратах иммуноглобулина человека антирезус Rh0(D) Российский патент 2022 года по МПК G01N33/15 G01N33/48 A61B10/00 

Изобретение относится к области здравоохранения, фармации, биотехнологии и иммунологии и может быть использовано для количественного определения анти-D-антител IgG (анти-D-Ат IgG) в лекарственных препаратах иммуноглобулина человека антирезус Rh₀(D) для контроля их качества.

Уровень техники

Препараты иммуноглобулина человека антирезус Rh₀(D) - иммунобиологические лекарственные средства, применяемые для специфической перинатальной профилактики резус-иммунизации женщин с резус-отрицательной принадлежностью крови.

Препараты иммуноглобулина человека антирезус Rh₀(D) представляют собой концентраты анти-D-Ат IgG, полученные из плазмы крови здоровых доноров, иммунизированных резус-положительными (Rh(+)) эритроцитами человека 1(0) группы крови любого фенотипа, содержащего D-антиген (D-Ar) [1].

Анти-D-At IgG - это анти-D-AT IgG, нейтрализующие резус-положительные эритроциты плода, попавшие в кровоток матери. Фармакологическое действие препаратов иммуноглобулина человека антирезус Rh₀(D) реализуется посредством нейтрализации анти-D-Ат IgG резус-положительных эритроцитов плода, попавших в кровоток матери. Содержание анти-D-Ат IgG в препаратах, способных нейтрализовать резус-положительные эритроциты плода, попавших в кровоток матери, выражают количественно в Международных единицах (ME) или в микрограммах по отношению к Международному стандартному образцу (МСО) (1 мкг=5 ME).

Известно, что 10 мкг (50 ME) специфических анти-D-Ат IgG в препарате иммуноглобулина человека антирезус Rh₀(D) нейтрализует 0,5 мл резус-положительных эритроцитов плода (или 1 мл цельной крови) [2].

Таким образом, способ определения анти-D-Ат IgG в препаратах иммуноглобулина человека антирезус Rh₀(D) должен позволять оценить количество анти-D-Ат IgG, способных нейтрализовать резус-положительные эритроциты плода, попавшие в кровоток матери, выраженное количественно (в МЕ/мл или мкг) по отношению к МСО.

Известны разные способы определения содержания анти-D-Ат IgG в препаратах иммуноглобулина человека антирезус Rh₀(D) [3].

Из уровня техники известен один способ, характеризующийся тем, что анти-D-Ат IgG в препарате иммуноглобулина человека антирезус Rh₀(D) вызывают визуально выявляемую агглютинацию резус-положительных эритроцитов человека, обработанных протеолитическим ферментом, при взаимодействии с антиглобулиновой сывороткой (реакция непрямой гемагглютинации). Существенным недостатком данного способа определения содержания анти-D-Ат IgG в препаратах иммуноглобулина человека антирезус Rh₀(D) является визуальная субъективная полуколичественная оценка результатов в титрах, что затрудняет адекватно рассчитать дозу введения препарата.

Из уровня техники известен другой способ, характеризующийся тем, что измеряют интенсивность флуоресценции комплекса, образованного последовательным связыванием D-Аг эритроцитов фенотипа R1R1 с анти-D-Ат IgG в препаратах иммуноглобулина человека антирезус Rh₀(D) и вторичными флуоресцентно-меченными Ат. Недостатками способа являются: необходимость использования дорогостоящих оборудования (проточного цитофлуориметра), расходных материалов и реагентов.

В качестве прототипа выбран способ определения анти-D-AT IgG методом прямого конкурентного иммуноферментного анализа (ИФА), основанного на конкуренции биотинилированных моноклональных анти-D-AT IgG с анти-D-AT IgG в препарате иммуноглобулина человека антирезус Rh₀(D) за связывание со специфическим D-эпитопом D-Аг эритроцитов, иммобилизованными на твердой фазе.

В прототипе при приготовлении иммуносорбента иммобилизируют на твердой фазе D-положительные эритроциты 1(0) группы крови человека фенотипа R2R2, полученные не менее чем от 3 доноров [4].

К недостаткам прототипа следует отнести:

- ограниченная доступность способа, связанная с использованием эритроцитов фенотипа R2R2 для приготовления иммуносорбента, который менее распространен в популяции (14,11%) в сравнении с фенотипом R1R1 (40,76%) [5];

- на этапе приготовления иммуносорбента отсутствует визуальная и инструментальная оценка распределения эритроцитов фенотипа R2R2 на твердой фазе, что может привести к получению недостоверных результатов анализа.

- высокая трудоемкость способа, связанная с увеличением времени постановки ИФА и расхода реагентов для проведения второго этапа способа, связанная с отсутствием визуальной и количественной инструментальной оценки распределения эритроцитов в приготовленном иммуносорбенте.

Известно, что некоторые зарубежные исследователи в связи с затруднениями в получении эритроцитов фенотипа R2R2, связанными с их меньшей распространенностью в популяции предпринимали попытки использования и эритроцитов фенотипа R1R1 для определения содержания анти-D-AT IgG в препаратах иммуноглобулина человека антирезус Rh₀(D) методом ИФА. На основе проведенных исследований было установлено, что возможно использование эритроцитов фенотипа R1R1 как альтернативного фенотипу R2R2 при условии соблюдения критериев валидации способа [6, 7, 8].

В связи с тем, что существует потребность в решении вышеизложенной проблемы, была поставлена техническая задача разработать способ количественного определения анти-D-AT IgG в препаратах иммуноглобулина человека антирезус Rh₀(D), который возможно использовать для контроля качества, и где для приготовления иммуносорбента, в случае отсутствия эритроцитов фенотипа R2R2, могут быть использованы иммобилизованные эритроциты фенотипа R1R1.

Описание сущности изобретения

Технической задачей является разработка способа количественного определения анти-D-Ат IgG в препаратах иммуноглобулина человека антирезус Rho(D), который возможно использовать для контроля качества, и где для приготовления иммуносорбента, в случае отсутствия эритроцитов фенотипа R2R2, могут быть использованы иммобилизованные эритроциты фенотипа R1R1. Разрабатываемый способ должен обладать специфичностью, чувствительностью, линейностью аналитического диапазона, прецизионностью, правильностью.

Техническим результатом изобретения является: разработка способа количественного определения анти-D-AT IgG в препаратах иммуноглобулина человека антирезус Rh₀(D), с использованием иммуносорбента, содержащего эритроциты фенотипа R1R1, при проведении конкурентного иммуноферментного анализа, где заявленный способ обладает эффективностью, специфичностью, чувствительностью, линейностью аналитического диапазона (доза-ответ), прецизионностью, правильностью.

Технический результат предлагаемого технического решения достигается за счет использования иммуносорбента содержащего эритроциты фенотипа R1R1 и их эффективным распределением агрегированного слоя иммобилизованных папаинизированных эритроцитов фенотипа R1R1.

Используемые в описании термины:

- эритроциты человека фенотипа R1R1 - это фенотип резус-положительных эритроцитов (Rh(+))I(0) группы крови человека, полученных не менее чем от трех доноров и содержащие в своей мембране значимые резус-Аг - полипептиды CDe (далее - эритроциты фенотипа R1R1);

- эритроциты человека фенотипа R2R2 - это фенотип резус-положительных эритроцитов (Rh(+))I(0) группы крови человека, полученных не менее чем от трех доноров и содержащие в своей мембране значимые резус-Аг - полипептиды cDE (далее - эритроциты фенотипа R2R2);

- эритроциты человека фенотипа rr_ - это фенотип резус-отрицательных эритроцитов (Rh(-))I(0) группы крови человека, полученные не менее чем от трех доноров и не содержащие в своей мембране резус-Аг - полипептиды CDE (далее - эритроциты фенотипа гг);

- анти-D-Ат IgG - это анти-D-AT IgG, нейтрализующие резус-положительные эритроциты плода, попавшие в кровоток матери. Фармакологическое действие препаратов иммуноглобулина человека антирезус Rh₀(D) реализуется посредством нейтрализации анти-D-Ат IgG резус-положительных эритроцитов плода, попавших в кровоток матери;

- иммуносорбент - это иммунологический сорбент, представляющий собой отмытые D - положительные эритроциты I(0) фенотипа R1R1 или любого другого фенотипа, обработанные папаином и иммобилизованные на твердую фазу в условиях испытательных лабораторий без использования автоматизированных систем;

- резус Rh₀(D) - D-антиген системы крови резус-фактор;

- IgG - иммуноглобулины класса G;

-твердая фаза - полистироловый планшет для иммунологических реакций;

- критерии иммобилизации эритроцитов - это числовые значения, используемые для оценки корректности приготовления иммуносорбента;

- относительная площадь покрытия эритроцитами (S_отн.) - это числовая характеристика, позволяющая количественно оценить распределение эритроцитов на поверхности твердой фазы готового иммуносорбента, выраженная в процентах по отношению к общей аналитической площади твердой фазы;

- коэффициент распределения эритроцитов (К_расп.) - это числовой показатель, позволяющий количественно оценить плотность слоя, образованного агрегированными эритроцитами на поверхности твердой фазы готового иммуносорбента, выраженный как отношение количества агрегированных эритроцитов к количеству не агрегированных эритроцитов на поверхности твердой фазы;

- МСО - это третий международный стандартный образец содержания анти-D-AT IgG (3^rd WHO International standard for anti-D Immunoglobulin, NIBSC code: 16/332) с аттестованной характеристикой содержания анти-D-Ат IgG 297 МЕ/мл;

На основе экспериментальных данных были разработаны критерии иммобилизации с использованием микроскопии и компьютерной морфометрии при определении относительной площади (S_отн.) покрытия твердой фазы эритроцитами в приготовленном иммуносорбенте и коэффициента их распределения (К_расп.) на твердой фазе, характеризующего плотность слоя агрегированных эритроцитов в приготовленном иммуносорбенте, а также данных, полученных конкурентным иммуноферментным анализом (ИФА) при количественном определении анти-D-Ат IgG в испытуемых образцах с известным содержанием анти-D-Ат IgG в сравнении с МСО.

Осуществление способа

В заявляемом способе количественного определения анти-D-Ат IgG в препаратах иммуноглобулина человека антирезус Rh₀(D) предусматривается использование эритроцитов фенотипа R1R1 для приготовления иммуносорбента.

Заявляемый способ состоит из трех основных этапов: 1) приготовление иммуносорбента путем иммобилизации отмытых и папаинизированных эритроцитов фенотипа R1R1 на твердой фазе; 2) проведение оценки распределения эритроцитов фенотипа R1R1 в приготовленном иммуносорбенте с определением относительной площади (S_отн., %) покрытия эритроцитами фенотипа R1R1 и коэффициента их распределения (К_расп.), характеризующего плотность слоя агрегированных эритроцитов; 3) проведение иммуноферментного анализа (далее - ИФА), включающего блокирование неспецифического связывания свободных от покрытия эритроцитами зон твердой фазы, приготовление разведений растворов испытуемого и стандартного образцов, внесение их в лунки приготовленного иммуносорбента, последующую инкубацию с конъюгатом и субстратом, внесение стоп-реагента, учет результатов с использованием спектрофотометра и оценку полученных результатов на соответствие критериям приемлемости.

Для приготовления иммуносорбента используют:

- фосфатно-солевой буферный раствор с рН 7,4, состоящий из 8,0 г/л натрия хлорида, 0,76 г/л безводного натрия гидрофосфата, 0,2 г/л калия хлорида, 0,2 г/л калия дигидрофосфата;

- 10% раствор папаина, состоящий из 1 г папаина, растворенного в фосфатно-солевом буферном растворе с рН 5,4, затем проинкубированного в термостате при 37°С в течение 30 минут и выдержанного после инкубации 15 минут при комнатной температуре, к которому далее добавляют 1 мл раствора L-цистеина с концентрацией 48,5 мг/мл и 1 мл натрия ЭДТА с концентрацией 3,7 мг/мл и доводят общий объем до 10 мл фосфатно-солевым буферным раствором с рН 5,4;

- фосфатно-солевой буферный раствор для иммобилизации эритроцитов с рН 7,0, состоящий из фосфатно-солевого буферного раствора с рН 7,4, в котором растворяют 18 г/л глюкозы, 10 г/л натрия цитрата, 0,7 г/л натрия ЭДТА;

- раствор глютеральдегида, состоящий из 0,5 г/л глютеральдегида, растворенного в фосфатно-солевом буферном растворе с рН 7,4.

Процедура отмывания эритроцитов фенотипа R1R1 от консервантов и остатков компонентов крови проводится путем добавления 10 мл фосфатно-солевого буферного раствора с рН 7,4 в пробирку или флакон, затем полученную суспензию эритроцитов центрифугируют при 1200 g в течение 3 мин, супернатант удаляют. Процедуру отмывания повторяют 4 раза. Получают осадок отмытых эритроцитов.

Осадок отмытых эритроцитов папаинизируют путем добавления к 1 объему эритроцитов 1 объема 10% раствора папаина и последующего инкубирования суспензии при температуре 37°С в течение 15 минут.

Далее проводят отмывание папаинизированных эритроцитов фенотипа R1R1 от продуктов гидролиза путем добавления к суспензии 10 мл фосфатно-солевого буферного раствора с рН 7,4, центрифугированием при 1200 g в течение 3 мин и с последующим удалением супернатанта. Процедуру отмывания повторяют 3 раза. Получают осадок отмытых папаинизированных эритроцитов.

Суспензию папаинизированных отмытых эритроцитов с концентрацией 0,2% готовят путем добавления к осадку фосфатно-солевого буферного раствора с рН 7,0.

Проводят иммобилизацию эритроцитов на поверхности твердой фазы путем внесения в лунки любого доступного полистиролового планшета с максимальной сорбционной емкостью 650 нг белка/см по 50 мкл 0,2% суспензии отмытых папаинизированных эритроцитов. Для фиксации эритроцитов на твердой фазе планшет с внесенной суспензией эритроцитов центрифугируют при 120 g в течение 3 минут при температуре не более 8°C, не допуская замораживания и образования кристаллов; затем, не удаляя суспензию эритроцитов, вносят в каждую лунку 100 мкл раствора глютеральдегида и выдерживают 10 мин, после чего жидкость из лунок планшета удаляют. Затем каждую лунку планшета промывают путем добавления 300 мкл фосфатно-солевого буферного раствора с рН 7,4, процедуру отмывания повторяют 3 раза.

Полученный иммуносорбент представляет собой иммобилизованные эритроциты фенотипа R1R1 в лунках полистиролового планшета.

Проведение оценки распределения эритроцитов в иммуносорбенте

Приготовление иммуносорбента представляет собой иммобилизацию на твердой фазе эритроцитов в форме агрегатов разной величины и плотности, с последующим проведением оценки распределения эритроцитов в приготовленном иммуносорбенте на соответствие критериям иммобилизации.

Для оценки иммобилизации эритроцитов с помощью микроскопии и компьютерной морфометрии проводят определение относительной площади покрытия эритроцитами (S_отн.) и коэффициента их распределения (К_расп.), который характеризует плотность слоя агрегированных эритроцитов по формулам (1, 2):

где S1 - площадь пика S1 (пикс), S _общ. - аналитическая область.

где S2 - площадь пика S2 (пикс), S3 - площадь пика S3 (пикс), ΣS - суммарное значение площадей всех пиков (пикс).

С использованием микроскопии получают цифровые снимки лунок планшета при увеличении в 10² раз с использованием любого пригодного микроскопа, имеющего цифровую фотокамеру и прикладное компьютерное обеспечение (фиг. 1).

При помощи компьютерной морфометрии получают количественные морфометрические измерения в результате обработки цифровых фотоснимков лунок планшета с использованием любой известной лицензионной аналитической программы, предназначенной для морфометрического количественного анализа изображений (фиг. 2). Путем автоматической оценки абсолютной и относительной площади соответствующего цветового спектра по отношению к заданной при настройках пространственной калибровки общей площади получают данные для построения гистограмм интенсивности распределения эритроцитов фенотипа R1R1 (фиг. 3, табл. 1, 2).

Были проведены исследования иммуносорбента содержащего эритроциты фенотипа R1R1:

В результате исследований было установлено, что наилучший результат продемонстрировали иммуносорбенты с распределением эритроцитов фенотипа R1R1 если S_отн. была в диапазоне от 76,1% до 100% при К_расп. в диапазоне 0,217 до 0,22, то есть иммуносорбент с эритроцитами фенотипа R1R1 будет наиболее подходящим для определения анти-D-AT IgG в иммунологических лекарственных препаратах человека при распределении эритроцитов фенотипа R1R1 не менее 88% и К_расп. не более 0,22.

На основе экспериментальных данных были разработаны критерии иммобилизации с использованием микроскопии и компьютерной морфометрии при определении относительной площади (S_отн.) покрытия твердой фазы эритроцитами в приготовленном иммуносорбенте и коэффициента их распределения (К_расп.) на твердой фазе, характеризующего плотность слоя агрегированных эритроцитов в приготовленном иммуносорбенте, а также данных, полученных методом конкурентного ИФА при количественном определении анти-D-AT IgG в испытуемых образцах с известным содержанием анти-D-AT IgG в диапазоне от 30 до 1,88 МЕ/мл (30, 15, 7,5 3,75, 1,88 МЕ/мл) в сравнении с МСО. Результаты оценки сопоставимости данных представлены в таблице 3.

Установлено, что значения содержания анти-D-AT IgG, определенное ИФА с использованием эритроцитов фенотипа R1R1 для приготовления иммуносорбента, находятся в диапазоне от 96,92 до 99,48%, что соответствует установленным требованиям, предъявляемым к биоаналитическим методам испытаний (содержание анти-D-Ат IgG должно быть от 80 до 120% (±20%) от номинального значения), при относительной площади (S_отн.) покрытия эритроцитами не менее 88%, при коэффициенте распределения (К_расп.), характеризующим плотность слоя эритроцитов, не более 0,22 [7,8].

Проведение конкурентного иммуноферментного анализа

Проводят блокирование неспецифических центров связывания иммуносорбента - свободных от покрытия эритроцитами зон твердой фазы. Для этого вносят в лунки иммуносорбента 250 мкл раствора 20 г/л бычьего сывороточного альбумина в фосфатно-солевом буферном растворе с рН 7,4 и инкубируют в течение 30 мин при комнатной температуре, по истечении времени раствор удаляют.

Предварительно готовят растворы стандартного и испытуемого образцов. МСО (NIBSC, code: 16/332 с активностью 297 МЕ/мл) готовят согласно инструкции. Получают раствор с содержанием анти-D-Ат IgG 297 МЕ/мл. Предварительно готовят 10% трис-буферный раствор бычьего сывороточного альбумина, содержащий 8,0 г натрия хлорида, 0,6 г трис(гидроксиметил) аминометана, 1 г бычьего сывороточного альбумина. Далее готовят растворы стандартного образца с использованием МСО в виде 5 последовательных двух кратных разведений, начиная с 30 МЕ/мл до 1,8 МЕ/мл (30, 15, 7,5, 3,75, 1,8 МЕ/мл). Для этого в микроцентрифужную пробирку вместимостью 1,5 мл отбирают 0,1 мл раствора МСО с содержанием анти-D-Ат IgG 297 МЕ/мл, добавляют 0,89 мл 10% трис-буферного раствора бычьего сывороточного альбумина и перемешивают, получая таким образом раствор стандартного образца с содержанием анти-D-Ат IgG 30 МЕ/мл. Далее путем двукратного разведения в диапазоне от 15 МЕ/мл до 1,8 МЕ/мл, начиная с 15 МЕ/мл полученного раствора, готовят растворы стандартного образца с концентрациями 15 МЕ/мл, 7,5 МЕ/мл, 3,75 МЕ/мл, 1,8 МЕ/мл. Аналогичным образом готовят разведения испытуемого образца.

Вносят по 25 мкл разведений растворов стандартных образцов, приготовленных из МСО, и разведения испытуемого образца в лунки иммуносорбента, приготовленного с использованием эритроцитов фенотипа R1R1. К каждому разведению добавляют 25 мкл меченых стандартных анти-D-Ат (Bio-BRAD-5, NIBSC 02/230). Все образцы вносят в трех повторностях. После инкубации в течение 1 часа при температуре 37°С образованные иммунные комплексы «Аг-Ат» трехкратно отмывают от не связавшихся Ат фосфатно-солевым буферным раствором с рН 7,4. Затем для выявления образованных иммунных комплексов «Аг-Ат» в каждую лунку иммуносорбента вносят 50 мкл любого доступного авидин-стрептавидина, конъюгированного с щелочной фосфатазой и проводят инкубацию в течение 30 минут при комнатной температуре. После инкубации раствор из лунок иммуносорбента удаляют. Лунки иммуносорбента трехкратно промывают фосфатно-солевым буферным раствором с рН 7,4. Затем в лунки вносят 100 мкл субстрата паранитрофенил фосфата (любого доступного) и проводят инкубацию в течение 10 минут в темном месте. Реакцию останавливают внесением в лунки иммуносорбента 50 мкл 3М раствора натрия гидроксида.

Проводят учет результатов с использованием спектрофотометра при длине волны 405 нм. Расчеты проводят при построении логарифмического калибровочного графика зависимости оптической плотности, относительные единицы (ОЕ) от концентрации растворов стандартного образца. Содержание анти-D-Ат IgG (МЕ/мл) в испытуемых образцах определяют по формулам (3, 4, 5):

где: Q - содержание анти-D-Ат IgG, измеренное в 1 пробе, МЕ/мл; А, В -коэффициенты уравнения линейной регрессии калибровочного графика; Сст - содержание специфических анти-D-Ат IgG в стандартном образце, МЕ/мл; ОПи - оптическая плотность испытуемого образца, ОЕ; К - коэффициент разведения; С_изм - среднее значение содержания анти-D-Ат IgG, рассчитанное для 3 повторностей, МЕ/мл, n - количество повторностей.

Для расчета содержания анти-D-Ат IgG в препарате иммуноглобулина человека антирезус Rh₀(D) используют любую известную специалисту из области техники лицензионную программу для статистической обработки результатов ИФА.

Определяют соответствие полученных значений критериям приемлемости результатов, установленных в соответствии с требованиями, предъявляемыми к количественным биоаналитическим методам испытаний лекарственных препаратов и подтвержденных в процессе валидации заявляемого способа: 1) относительное стандартное отклонение (RSD, %) трех значений оптической плотности, относительные единицы (ОЕ) для каждой концентрации растворов стандартного и испытуемого образцов не должен превышать 15%; 2) коэффициент детерминации линейного диапазона (R²) - не менее 0,9; 3) относительные значения содержания анти-D-AT IgG в испытуемом образце должны быть в интервале от 80 до 120% (±20%) [7, 8].

Статистическую обработку массива данных проводят с использованием любой известной специалисту из области техники программы. Определение соответствия значений выборки нормальному распределению проводят с применением критерия Шапиро-Уилка и коэффициента аппроксимации линейной зависимости при сортировке значений выборки. Значимость различий данных оценивают с помощью t-критерия Стьюдента и U-критерия Манна-Уитни для независимых выборок.

Краткое описание чертежей и иных материалов (приложение 1-7)

Фиг. 1 Микроскопический снимок эритроцитов фенотипа R1R1, х 10².

Фиг. 2 Пространственный морфометрический снимок эритроцитов фенотипа R1R1, х 10².

Фиг. 3 Гистограмма интенсивности распределения эритроцитов фенотипа R1R1 на твердой фазе. Ось ординат - интенсивность распределения эритроцитов (пике), ось абсцисс - аналитическая площадь (пике). 1, 2, 3 - пики интенсивности распределения эритроцитов.

Фиг. 4 Результаты оценки линейности аналитического диапазона способа количественного определения анти-D-Ат IgG в растворах стандартного образца.

Фиг. 5 График регрессионной зависимости содержания анти-D-Ат IgG в растворах стандартного образца от оптической плотности (ОП), определенной методом ИФА с использованием эритроцитов фенотипа R1R1.

Фиг. 6 График регрессионной зависимости содержания анти-D-Ат IgG в растворах стандартного образца от оптической плотности (ОП), определенной методом ИФА с использованием эритроцитов фенотипа R1R1.

Фиг. 7 Результаты оценки количественного определения анти-D-Ат IgG в препаратах иммуноглобулина человека Rh₀(D) заявляемым способом с применением эритроцитов фенотипа R1R1 и способом прототипа с применением эритроцитов R2R2.

Возможность осуществления заявляемого способа раскрыта в следующих примерах.

Пример 1. Описание приготовления иммуносорбента с использованием эритроцитов фенотипа R1R1

Для приготовления иммуносорбента используют заранее приготовленные растворы:

- фосфатно-солевой буферный раствор с рН 7,4;

- фосфатно-солевой буферный раствор для иммобилизации эритроцитов с рН 7,0;

- 10% раствор папаина проинкубированного в термостате при 37°С в течение 30 минут и выдержанного после инкубации 15 минут при комнатной температуре;

- 0,05% раствор глютеральдегида, растворенного в фосфатно-солевом буферном растворе с рН 7,4.

Проводят процедуру отмывания эритроцитов от консервантов и остатков компонентов крови путем добавления 10 мл фосфатно-солевого буферного раствора с рН 7,4 в пробирку или флакон, затем суспензию эритроцитов центрифугируют при 1200 g в течение 3 мин, супернатант удаляют. Процедуру отмывания повторяют 4 раза. Получают осадок отмытых эритроцитов.

Затем осадок отмытых эритроцитов папаинизируют путем добавления к 1 объему эритроцитов заранее приготовленного 1 объема 10% раствора папаина с последующим инкубированием суспензии при температуре 37°С в течение 15 минут.

Проводят отмывание папаинизированных эритроцитов от продуктов гидролиза путем добавления к суспензии 10 мл фосфатно-солевого буферного раствора с рН 7,4, центрифугированием при 1200 g в течение 3 мин и удалением супернатанта. Процедуру отмывания повторяют 3 раза. Получают осадок отмытых папаинизированных эритроцитов.

Готовят 0,2% суспензию папаинизированных отмытых эритроцитов путем добавления к осадку фосфатно-солевого буферного раствора с рН 7,0.

Проводят иммобилизацию эритроцитов на поверхности твердой фазы путем внесения в лунки полистиролового планшета с максимальной сорбционной емкостью 650 нг белка/см² (MaxiSorp, Nunc, кат.№44-2404-21 или аналогичные) по 50 мкл 0,2% суспензии отмытых папаинизированных эритроцитов. Для фиксации эритроцитов на твердой фазе планшет с внесенной суспензией эритроцитов центрифугируют при 120 g в течение 3 минут при температуре не более 8°С, не допуская замораживания и образования кристаллов, затем, не удаляя суспензию эритроцитов, вносят в каждую лунку 100 мкл раствора глютеральдегида и выдерживают 10 мин, после чего жидкость из лунок планшета удаляют. Затем каждую лунку планшета промывают добавлением 300 мкл фосфатно-солевого буферного раствора с рН 7,4, процедуру отмывания повторяют 3 раза.

Затем проводят количественную оценку распределения эритроцитов в приготовленном иммуносорбенте на соответствие критериям иммобилизации в соответствии с описанием изобретения.

Результаты оценки распределения эритроцитов фенотипа R1R1 на поверхности полистиролового планшета путем микроскопии представлены на фиг. 1. Результаты оценки распределения эритроцитов фенотипа R1R1 на поверхности полистиролового планшета путем компьютерной морфометрии представлены на фиг. 2, 3 и в таблицах 4, 5.

Пример демонстрирует возможность приготовления иммуносорбента с использованием эритроцитов фенотипа R1R1 заявляемым способом, где распределение эритроцитов фенотипа R1R1 на твердой фазе в приготовленном иммуносорбенте: S_отн.=90,75%, К_расп.=0,218, что соответствует установленным критериям иммобилизации.

Пример 2. Оценка линейности аналитического диапазона (доза-ответ) способа количественного определения анти-D-Ат IgG в препаратах иммуноглобулина человека антирезус Rh₀(D) с применением иммуносорбента, приготовленного с использованием эритроцитов фенотипа R1R1

Приготовление иммуносорбента, количественную оценку распределения эритроцитов на твердой фазе на соответствие критериям иммобилизации (согласно примеру 1).

Проводят 10 испытаний способом количественного определения анти-D-антител IgG в препаратах иммуноглобулина человека антирезус Rh₀(D) с использованием фенотипа R1R1. Результаты оценки линейности заявляемого способа представлены в таблице 6.

Графики зависимости значений оптической плотности от содержания анти-D-Ат IgG в растворах стандартного образца характеризуются линейностью, коэффициенты детерминации линейной регрессии (R²) не менее 0,9 (фиг. 4), величина относительного стандартного отклонения (RSD, %) значений оптической плотности не превышает 15% и соответствует установленным критериям приемлемости результатов, что подтверждает наличие линейной зависимости в аналитическом диапазоне от 1,88 до 30 МЕ/мл содержания анти-D-Ат IgG.

Пример демонстрирует возможность получения достоверных результатов в диапазоне содержания анти-D-Ат IgG от 1,88 до 30 МЕ/мл в сравнении с МСО заявляемым способом с применением иммуносорбента, приготовленного с использованием фенотипа эритроцитов R1R1.

Пример 3. Оценка правильности способа количественного определения анти-D-Ат IgG в препаратах иммуноглобулина человека антирезус Rh₀(D) с применением иммуносорбента, приготовленного с использованием эритроцитов фенотипа R1R1

Правильность метода ИФА для количественного определения анти-D-Ат IgG в препаратах иммуноглобулина человека антирезус Rh₀(D) характеризуется отклонением среднего результата определений, выполненных с его использованием, от значения, принимаемого за истинное. Валидируемый метод признается правильным, если значения, принимаемые за истинные, лежат внутри доверительных интервалов соответствующих средних результатов анализов, полученных экспериментально по данной методике.

Оценку правильности проводили с использованием стандартных образцов с известным содержанием (концентрацией) определяемого вещества;

Предварительно готовят раствор стандартного образца МСО (NIBSC, code: 16/332 с активностью 297 МЕ/мл) согласно инструкции. Предварительно готовят раствор стандартного образца иммуноглобулина человека нормального, не содержащего специфических анти-D-AT IgG (BRP Standard anti-D antibodies test negative control, NIBSC code: Y0000540) согласно инструкции. Затем к полученному раствору стандартного образца иммуноглобулина человека нормального, не содержащего анти-D-Ат IgG (BRP Standard anti-D antibodies test negative control, NIBSC code: Y0000540) в отношении 1:1 добавляют раствор стандартного образца МСО (NIBSC, code: 16/332) с активностью 297 МЕ/мл, получая раствор стандартного образца с содержанием анти-D-Ат IgG 148,5 МЕ/мл. Далее готовят испытуемые растворы в пяти концентрациях от 30 МЕ/мл до 1,88 МЕ/мл, где каждое последующее разведение в два раза: 30, 15, 7,5, 3,75, 1,88 МЕ/мл в соответствии с описанием изобретения. Всего готовят методом добавок 25 испытуемых образцов, по 5 образцов для каждой концентрации (30, 15, 7,5, 3,75, 1,88 МЕ/мл).

Вычисляют процент выявления анти-D-Ат IgG - степень извлечения (R, %) в испытуемом образце по формуле (6):

где: С_изм. - среднее значение содержания анти-D-Ат IgG в испытуемом образце, рассчитанное по 3 пробам, МЕ/мл; С_теор - за теоретическое значение принимают количество анти-D-Ат IgG в стандартном образце, добавленных в раствор стандартного образца иммуноглобулина человека нормального, не содержащего анти-D-Ат IgG (BRP Standard anti-D antibodies test negative control, NIBSC code: Y0000540).

Рассчитывают средние значения степени извлечения (R, %) для каждого испытуемого раствора в диапазоне от 30 МЕ/мл до 1,88 МЕ/мл с последующим двукратным разведением (30, 15, 7,5, 3,75, 1,88 МЕ/мл), а затем среднее значение для пяти испытуемых растворов. Результаты оценки правильности представлены в таблице 7.

Правильность заявляемого способа подтверждается оценкой степени извлечения (R, %) анти-D-Ат IgG в испытуемых образцах. Диапазон средних значений степени извлечения (R, %) при использовании эритроцитов фенотипа R1R1 для приготовления иммуносорбента - (100,5±5,37)%, что соответствует установленному критерию - относительные значения содержания специфических анти-D-Ат IgG в испытуемом образце должны быть в интервале от 80 до 120% (±20%).

Данный пример демонстрирует, что заявляемый способ с применением иммуносорбента, приготовленного с использованием эритроцитов фенотипа R1R1, обладает правильностью.

В настоящее время в Российской Федерации зарегистрированы две лекарственные формы препарата иммуноглобулина человека антирезус Rh₀(D): раствор для внутримышечного введения (далее препарат №1) и раствор для внутривенного введения (далее препарат №2) [9].

Пример 4. Количественное определение анти-D-Ат IgG в препарате иммуноглобулина человека антирезус Rh₀(D) для внутримышечного введения (препарат №1) с применением иммуносорбента, приготовленного с использованием эритроцитов фенотипа R1R1

Восстанавливают лиофилизат препарата иммуноглобулина человека антирезус Rho(D) для внутримышечного применения (препарат №1) с содержанием анти-D-Ат IgG 750 МЕ/мл (150 мкг), иммуноглобулинов G не менее 90%, глицина 22,5 мг, натрия хлорида 9,0 мг в 1 мл растворителя (вода для инъекций), затем к полученному раствору прибавляют 24 мл воды очищенной и перемешивают, получая таким образом испытуемый образец с содержанием анти-D-Ат IgG 30 МЕ/мл.

Получение иммуносорбента с использованием эритроцитов фенотипа R1R1 проводят по примеру 1, количественное определение анти-D-Ат IgG в испытуемом образце проводят в соответствии с описанием изобретения.

Подтверждение критериев пригодности результатов, полученных методом ИФА:

- относительное стандартное отклонение (RSD, %) трех значений оптической плотности для каждой концентрации растворов стандартного и испытуемого образцов не превышает 15%. Результаты представлены в таблицах 8, 9;

- коэффициент детерминации линейного диапазона (R2) при использовании эритроцитов фенотипа R1R1 - 0,9946 (фиг. 5);

- относительные значения содержания анти-D-Ат IgG в испытуемом образце при использовании эритроцитов фенотипа R1R1 - 100,53%.

Результат: содержание анти-D-Ат IgG в препарате №1 при использовании эритроцитов фенотипа R1R1 - 754 МЕ/мл (150,8 мкг).

Пример демонстрирует возможность использования заявляемого способа для количественного определения анти-D-Ат IgG в препарате иммуноглобулина человека антирезус Rh₀(D) для внутримышечного введения с применением иммуносорбента, приготовленного с использованием эритроцитов фенотипа R1R1.

Пример 5. Количественное определение анти-D-Ат IgG в препарате иммуноглобулина человека антирезус Rh₀(D) для внутривенного введения (препарат №2) с применением иммуносорбента, приготовленного с использованием эритроцитов фенотипа R1R1.

Восстанавливают лиофилизат препарата иммуноглобулина человека антирезус Rh₀(D) для внутривенного применения (препарат №2) с содержанием анти-D-Ат IgG 750 МЕ/мл (150 мкг), иммуноглобулинов G не менее 95%, глицина 20,6 мг, натрия хлорида не более 0,250 ммоль и альбумина человека 10 мг в 1 мл растворителя (вода для инъекций), затем к полученному раствору прибавляют 24 мл воды очищенной и перемешивают, получая таким образом испытуемый образец с содержанием специфических анти-D-Ат IgG 30 МЕ/мл.

Приготовление иммуносорбента с использованием эритроцитов фенотипа R1R1 проводят по примеру 1, количественное определение анти-D-Ат IgG в испытуемом образце проводят в соответствии с описанием изобретения.

Подтверждение критериев пригодности результатов, полученных методом ИФА:

- относительное стандартное отклонение (RSD, %) трех значений оптической плотности для каждой концентрации растворов стандартного и испытуемого образцов не превышает 15%. Результаты представлены в таблицах 10, 11;

- коэффициент детерминации линейного диапазона (R²) при использовании эритроцитов фенотипа R1R1 - 0,9841 (фиг. 6);

- относительные значения содержания анти-D-Ат IgG в испытуемом образце при использовании эритроцитов фенотипа R1R1 - 100,5%.

Результат: содержание анти-D-Ат IgG в препарате №2 при использовании эритроцитов фенотипа R1R1 - 753,5 МЕ/мл (150,7 мкг).

Данный пример демонстрирует возможность использования заявляемого способа для количественного определения анти-D-Ат IgG в препарате иммуноглобулина человека антирезус Rh₀(D) для внутривенного введения с применением иммуносорбента, приготовленного с использованием эритроцитов фенотипа R1R1.

Пример 6. Оценка специфичности способа количественного определения анти-D-Ат IgG в препаратах иммуноглобулина человека антирезус Rh₀(D) с применением иммуносорбента, приготовленного с использованием эритроцитов фенотипа R1R1.

Специфичность заявляемого способа - способность метода ИФА однозначно оценивать содержание анти-D-Ат IgG в препаратах иммуноглобулина человека антирезус Rh₀(D) в присутствии сопутствующих компонентов.

Для оценки специфичности для приготовления иммуносорбента используют эритроциты человека фенотипа гг.Количественную оценку распределения эритроцитов на твердой фазе на соответствие критериям иммобилизации, приготовление растворов стандартных и испытуемых образцов, определение анти-D-Ат IgG ИФА в препарате иммуноглобулина человека антирезус Rh₀(D), учет полученных результатов проводят по формулам 3,4,5.

Специфичность подтверждается:

1. Отсутствием образования комплекса «Аг-Ат» при внесении растворов стандартного и испытуемого образцов в лунки иммуносорбента, приготовленного с использованием эритроцитов человека фенотипа rr, что выражается отсутствием окрашивания реакционной смеси после внесения субстрата при визуальной оценке.

2. Отсутствием конкуренции между раствором иммуноглобулина человека нормального, не содержащего анти-D-Ат IgG (BRP Standard anti-D antibodies test negative control, EDQM code: Y0000540) и моноклональными анти-D-Ат IgG (BioBRAD-5, NIBSC code: 02/230) при внесении в лунки иммуносорбента, приготовленного с использованием эритроцитов фенотипа R1R1, что характеризуется развитием яркого окрашивания реакционной смеси после внесения субстрата и стоп-реагента.

3. Соответствием критериям пригодности результатов, подтверждающих, что входящие в состав препаратов дополнительные вещества (стабилизаторы - глицин, натрия хлорид, альбумин человека) не влияют на определение анти-D-Ат IgG в препаратах иммуноглобулина человека антирезус Rh₀(D) (Примеры 4, 5).

Данный пример демонстрирует, что заявляемый способ с использованием эритроцитов фенотипа R1R1 для приготовления иммуносорбента специфичен для определения содержания анти-D-Ат IgG в препаратах иммуноглобулина человека антирезус Rh₀(D).

Пример 7. Оценка прецизионности способа количественного определения анти-D-Ат IgG в препаратах иммуноглобулина человека антирезус Rh₀(D) с применением иммуносорбента, приготовленного с использованием эритроцитов фенотипа R1R1

Для подтверждения прецизионности заявляемого способа в разные дни аналитик проводит по 6 испытаний способом количественного определения анти-D-Ат IgG в препаратах иммуноглобулина человека антирезус Rh₀(D) с использованием фенотипа R1R1 на разных препаратах иммуноглобулина человека антирезус Rh₀(D): для внутримышечного введения (препарат №1) и для внутривенного введения (препарат №2) с одинаковым содержанием анти-D-Ат IgG -750 МЕ/мл. Общее количество испытаний - 12. Результаты оценки прецизионности заявляемого способа представлены в таблице 12.

Прецизионность подтверждается соответствием полученных результатов, установленным критериям приемлемости:

- величина относительного стандартного отклонения (RSD, %) значений содержания анти-D-Ат IgG в препаратах иммуноглобулина человека антирезус Rh₀(D) менее 15% (3,54% и 8,89%);

- величина относительного стандартного отклонения (RSD, %) значений содержания анти-D-Ат IgG в препаратах иммуноглобулина человека антирезус Rh₀(D) менее 15% (6,48%).

- содержание анти-D-Ат IgG в препаратах иммуноглобулина человека антирезус Rh₀(D), определенное аналитиком в диапазоне от 80 до 120% (±20%) или от 600 до 900 МЕ/мл от номинального значения (750 МЕ/мл), что соответствует установленным критериям приемлемости результатов.

Данный пример демонстрирует, что заявляемый способ с применением иммуносорбента, приготовленного с использованием эритроцитов фенотипа R1R1, обладает достаточной прецизионностью.

Пример 8. Пример сравнения

Для количественного определения анти-D-Ат IgG в препаратах иммуноглобулина человека антирезус Rh₀(D).

Для подтверждения возможности применения заявляемого способа как альтернативного способу прототипа оценивают сопоставимость результатов количественной оценки содержания анти-D-Ат IgG в препаратах иммуноглобулина человека антирезус Rh₀(D), полученных двумя способами - заявляемым способом и способом прототипа. Для оценки сопоставимости результатов используют статистические методы в соответствии с описанием изобретения.

Образцы препаратов №№1,2 готовят по примерам 4,5, каждый образец готовят в 18 повторностях. Приготовление иммуносорбента с использованием эритроцитов фенотипа R1R1 проводят по примеру 1, количественное определение анти-D-Ат IgG в испытуемых образцах проводят в соответствии с описанием изобретения. Количественное определение анти-D-Ат IgG в испытуемых образцах с использованием эритроцитов фенотипа R2R2 проводят в соответствии со способом прототипа.

Результаты оценки количественного определения анти-D-Ат IgG в препарате иммуноглобулина человека антирезус Rh₀(D) (Препараты №№1, 2) представлены в таблицах 13, 14 и фиг. 7.

Возможность реализации заявляемого способа для количественного определения анти-D-Ат IgG в препаратах иммуноглобулина человека антирезус Rh₀(D) подтверждается отсутствием статистической значимости различий данных при оценке независимых выборок (результаты количественного определения анти-D-Ат IgG в препаратах №№1, 2) с помощью t-критерия Стьюдента: для препарата №1 t-критерий фактический (1,24) меньше t-критерия теоретического (табличного -2,30 при Р=95%), для препарата №2: t-критерий фактический (0,79) меньше t-критерия теоретического (табличного - 2,30 при Р=95%) и затем с помощью U-критерия Манна-Уитни: U крит.(18) меньше U факт.(21).

Данный пример демонстрирует, что полученные результаты с использованием заявленного способа сопоставимы с результатами прототипа, а также демонстрируют то, что заявленный способ является специфичным, чувствительным, линейным, прецизионным, правильным и может быть использован для количественного определения содержания анти-D-Ат IgG в препаратах иммуноглобулина человека антирезус Rh₀(D) в случае отсутствия используемых в прототипе эритроцитов фенотипа R2R2, могут быть использованы иммобилизованные эритроциты фенотипа R1R1.

Представленные примеры не ограничивают объем притязаний настоящего изобретения и служат только для цели иллюстрации и раскрытия заявленного способа.

Промышленная применимость

Все приведенные примеры, подтверждают реализацию заявленного способа, обладающего специфичностью, чувствительностью, линейностью аналитического диапазона, прецизионностью, правильностью.

Поставленная техническая задача, а именно, разработка способа количественного определения анти-D-антител IgG (анти-D-Ат IgG) в лекарственных препаратах иммуноглобулина человека антирезус Rh₀(D) достигнута, что подтверждается приведенными примерами.

Применение заявленного технического решения в области здравоохранения, фармации, биотехнологии и иммунологии, является эффективным и может быть использовано для количественного определения анти-D-антител IgG (анти-D-Ат IgG) в лекарственных препаратах иммуноглобулина человека антирезус Rh₀D) для контроля их качества.

Источники информации

1. Requirements for the collection, processing and quality control of blood, blood components and plasma derivatives, WHO Technical Report Series, №840.

2. Guideline on the clinical investigation of human anti-D immunoglobulin for intravenous and/or intramuscular use: EMA/CPMP/BPWG/575/99, rev.

3. Шведова E.B., Кудашева Э.Ю., Климов В.И. Методы оценки специфической активности препаратов иммуноглобулина человека антирезус Rh₀(D): современное состояние проблемы. Иммунология. 2020; 41 (3): 256-1.

4. 2.7.13 Assay of Human Anti-D Immunoglobulin: European Pharmacopoeia, ed.10. Strasboung, Directorate for the Quality of Medicines of the Council of Europe.

5. Донсков С.И. Группы крови системы Rhesus. Теория и практика. М.: ВИНИТ и РАН, 2005. 392 с.

6. Susan J.Thorpe, Christina Е. Turner, Amanda С. Heath, Dawn Sands. A competitive enzyme-linked immunoassay using erythrocytes fixed to microtitre plates for anti-D quantitation in immunoglobulin products. Vox Sang. 2000; 79: 100-7.

7. Bioanalytical method validation guidance for industry. U.S. Biopharmaceutics, may 2018.

8. Руководства ICH для фармацевтической отрасли. Качество. Ред. Береговых В.В. СПб.: ЦОП «Профессия», 2017, 768 с.

9. Государственный реестр лекарственных средств.

Настоящее изобретение относится к области здравоохранения, фармации, биотехнологии и иммунологии и может быть использовано для количественного определения анти-D-антител IgG в лекарственных препаратах иммуноглобулина человека антирезус Rh₀(D) для контроля их качества. Способ включает подготовку иммуносорбента путем иммобилизации отмытых папаинизированных эритроцитов фенотипа резус-положительных эритроцитов (Rh(+))I(0) группы крови человека (далее - эритроциты фенотипа R1R1) на твердой фазе. Затем распределяют иммобилизованные папаинизированные эритроциты в иммуносорбенте и оценивают их распределение. После чего проводят конкурентный иммуноферментный анализ (ИФА). При этом распределение агрегированного слоя иммобилизованных папаинизированных эритроцитов фенотипа R1R1 в иммуносорбенте не менее 88% при коэффициенте распределения эритроцитов фенотипа R1R1 не более 0,22; где линейный диапазон анти-D-антител IgG от 1,88 МЕ/мл до 30 МЕ/мл. Способ обладает эффективностью, специфичностью, чувствительностью, линейностью аналитического диапазона (доза-ответ), прецизионностью, правильностью результатов. 8 з.п. ф-лы, 7 ил., 14 табл., 8 пр.

1. Способ количественного определения анти-D-антител IgG в препаратах иммуноглобулина человека антирезус Rh₀(D), характеризующийся тем, что готовят иммуносорбент путем иммобилизации отмытых папаинизированных эритроцитов фенотипа резус-положительных эритроцитов (Rh(+))I(0) группы крови человека (далее - эритроциты фенотипа R1R1) на твердой фазе; затем распределяют иммобилизованные папаинизированные эритроциты в иммуносорбенте и оценивают; после чего проводят конкурентный иммуноферментный анализ (ИФА); отличающийся тем, что распределение агрегированного слоя иммобилизованных папаинизированных эритроцитов фенотипа R1R1 в иммуносорбенте не менее 88% при коэффициенте распределения эритроцитов фенотипа R1R1 не более 0,22; где линейный диапазон анти-D-антител IgG от 1,88 МЕ/мл до 30 МЕ/мл.

2. Способ по п. 1 дополнительно характеризуется тем, что эритроциты фенотипа R1R1 отмывают в эффективном количестве фосфатно-солевого буферного раствора с рН 7,4, с последующим центрифугированием при 1200 g в течение трех минут, повторяя отмывание эритроцитов фенотипа R1R1 с последующим центрифугированием четыре раза.

3. Способ по п. 1 дополнительно характеризуется тем, что эритроциты фенотипа R1R1 папаинизируют 10% раствором папаина в соотношении 1:1, с последующим инкубированием при температуре 37°С в течение 15 минут.

4. Способ по п. 3 дополнительно характеризуется тем, что папаинизированные эритроциты фенотипа R1R1 отмывают от продуктов гидролиза в эффективном количестве фосфатно-солевого буферного раствора с рН 7,4 и последующим центрифугированием при 1200 g в течение трех минут, повторяя отмывание эритроцитов фенотипа R1R1 с последующим центрифугированием три раза.

5. Способ по п. 4 дополнительно характеризуется тем, что отмытые папаинизированные эритроциты фенотипа R1R1 представляют собой осадок.

6. Способ по п. 5 дополнительно характеризуется тем, что к осадку эритроцитов фенотипа R1R1 добавляют фосфатно-солевой буферный раствор с рН 7,0 до образования суспензии с концентрацией 0,2%.

7. Способ по п. 1 дополнительно характеризуется тем, что при иммобилизации эритроцитов фенотипа R1R1 проводят центрифугирование при 120 g в течение трех минут при температуре не более 8°С без замораживания и образования кристаллов.

8. Способ по п. 1 дополнительно характеризуется тем, что твердая фаза представляет собой полистироловый планшет с лунками.

9. Способ по п. 1 дополнительно характеризуется тем, что иммуносорбент представляет собой иммобилизованные эритроциты фенотипа R1R1 в лунках полистиролового планшета.