Способ диагностики риккетсиозов группы клещевой пятнистой лихорадки, иммуноферментная диагностическая тест-система для его осуществления Российский патент 2020 года по МПК G01N33/543 G01N33/531 

Область техники

Изобретение относится к области клинической лабораторной диагностики, биотехнологии и медицины, и касается способа диагностики риккетсиозов группы клещевой пятнистой лихорадки и иммуноферментной диагностической тест-системы для его осуществления.

Уровень техники

Для серологической лабораторной диагностики риккетсиозов группы клещевой пятнистой лихорадки (КПЛ) используют общеизвестные методы: реакцию связывания комплемента (РСК), реакцию непрямой иммунофлуоресценции (РНИФ), реакцию иммунофлуоресценции (РИФ), реакцию агглютинации, реакцию непрямой гемагглютинации, иммуноферментный анализ (ИФА), иммунный блоттинг и другие на основе, как правило, нативных риккетсиальных антигенов. Исходным материалом для приготовления таких антигенов служат зараженные первичными культурами патогенных риккетсий, например, хорошо охарактеризованными штаммами, овокультуры (накопление проводят в желточном мешке развивающихся куриных эмбрионов), адаптированные клеточные культуры, риккетсиозно-тканевый материал, полученный из органов зараженных восприимчивых животных. В зависимости от метода очистки получают корпускулярные, растворимые или цельнорастворимые антигены риккетсий. Корпускулярный антиген риккетсий представляет собой очищенные риккетсии (корпускулы), полученные, как правило, методом сочетанной эфирной обработки и дифференциального центрифугирования. Растворимый антиген риккетсий, чаще всего, выделяют водно-фенольной экстракцией риккетсиальных суспензий с последующим центрифугированием. Цельнорастворимый антиген наряду с растворимой антигенной фракцией содержит очищенные корпускулы [Здродовский П.Ф., Голиневич Е.М. Учение о риккетсиях и риккетсиозах. Москва, «Медицина», 1972, 495 с].

Известно, что ИФА обладает высокими показателями чувствительности, специфичности, метод легко воспроизводим, доступен. Известен способ лабораторной диагностики клещевого риккетсиоза с использованием иммуноферментного анализа для определения антител к антигену Rickettsia sibirica по патенту RU 2477860 (прототип) (Рудаков Н.В., Абрамова Н.В., Пеньевская Н.А., Самойленко И.Е., Шпынов С.Н., Решетникова Т.А. Способ лабораторной диагностики клещевого риккетсиоза с использованием иммуноферментного анализа для определения антител к антигену Rickettsia sibirica. Патент RU 2477860, приоритет от 13.08.2010 г.), по которому для его осуществления в качестве антигена для приготовления иммуносорбента используют «Диагностикум риккетсиозный Сибирика сухой для РСК» производства НПО «Микроген», Россия. В соответствии с описанием патента, основу этого диагностикума составляет цельнорастворимый антиген Rickettsia sibirica. Согласно Инструкции по применению производителя НПО «Микроген» «Диагностикум риккетсиозный Сибирика сухой для РСК» представляет собой лиофилизированные антигенные комплексы, выделенные методом эфирной обработки из риккетсий Сибирика, выращенных (накопленных) в желточных мешках куриных эмбрионов и инактивированных фенолом. Иммуноферментная тест-система на его основе позволяет выявлять в сыворотке крови человека антитела классов М и G к Rickettsia sibirica и осуществлять серологическую диагностику клещевого риккетсиоза с чувствительностью, превосходящей РСК. Недостатком антигена, используемого авторами патента для приготовления иммуносорбента иммуноферментной тест-системы, является то, что он, несмотря на проводимую в производственных условиях очистку, содержит примеси тканей оболочек желточных мешков куриных развивающихся эмбрионов (овокультур), что может привести к ложноположительным результатам. Антитела к антигенным структурам тканей овокультур могут встречаться у лиц, страдающих непереносимостью компонентов куриного яйца (аллергические реакции, развивающиеся, как правило, на основные аллергены - овальбумин, овамукоид, лизоцим, кональбумин), или по другим причинам (например, антитела к лизоциму повышаются у больных язвенным колитом и при ревматоидных васкулитах). Доказательством специфической иммунореактивности антител в исследуемом образце исключительно на риккетсиальный антиген является отсутствие реактивности образца с контрольным антигеном. В случае накопления риккетсий (получения антигенов) в овокультурах в качестве такого контрольного антигена может служить гомогенизат незараженных риккетсиями тканей оболочек желточного мешка развивающегося куриного эмбриона. Использование панели сывороток крови людей, страдающих аллергическими реакциями на компоненты куриного яйца, показало, что в ИФА, где для приготовления иммуносорбента использован «Диагностикум риккетсиозный Сибирика сухой для РСК», были выявлены ложноположительные значения, подтвержденные перекрестной иммунореактивностью с контрольным антигеном. Подробное доказательство этому приведено в примере 3. Таким образом, для повышения специфичности способа диагностики риккетсиозов необходима высокая степень очистки используемых риккетсиальных антигенов от примесей среды культивирования (накопления).

Известно, что для серологической диагностики риккетсиозов возможно использование не цельного нативного антигена, а выделенного из него липополисахарида (ЛПС) или белков. Так, компания «Fuller Laboratories», США (http://www.fullerlabs.com) для производства иммуноферментных тест-систем с целью определения IgG к антигенам группы КПЛ использует ЛПС, а для выявления антител класса М - поверхностные антигены OmpA и/или OmpB. Компания «Vircell», Испания для обнаружения антител классов M и G к антигенам риккетсий группы КПЛ (в частности, Rickettsia conorii) использует единый инактивированный нативный антиген Rickettsia conorii, однако детальной информации производитель об этом антигене не раскрывает.

Известные коммерческие иммуноферментные тест-системы для диагностики риккетсиозов группы КПЛ предназначены для выявления в сыворотке или плазме крови человека специфических антител двух классов - М (IgM) и G (IgG).

Раскрытие изобретения

Техническая задача изобретения состоит в повышении чувствительности, информативности и специфичности способа диагностики риккетсиозов группы КПЛ, проводимого методом непрямого твердофазного иммуноферментного анализа.

Техническая задача решается за счет того, что авторами разработан способ диагностики риккетсиозов группы клещевой пятнистой лихорадки методом твердофазного иммуноферментного анализа, заключающийся в том, что в сыворотке или плазме крови человека проводят раздельное дифференциальное выявление антител классов М, G и А, а иммуносорбент получают на основе инактивированной растворимой очищенной белково-липополисахаридной антигенной субстанции, выделенной из суспензии антигенов Rickettsia sibirica.

Разработан также способ получения инактивированной растворимой очищенной белково-липополисахаридной антигенной субстанции, заключающийся в ультразвуковой обработке риккетсиальных антигенов, предварительно ресуспендированных в буфере 10mM трис-HCl и 0,5 M хлорида натрия, рН-7,4-7,6, содержащем 10% изопропанол или 8 М мочевину, последующеем центрифугировании и гель-фильтрации супернатанта на колонке с хроматографическим сорбентом, дальнейшем объединении фракции первого пика и соседних с ним, демонстрирующих при проверке в ИФА наилучшее соотношение сигнала оптической плотности положительных образцов сывороток или плазмы крови человека, содержащих антитела к антигенам риккетсий группы клещевой пятнистой лихорадки, к оптической плотности отрицательных контрольных образцов сывороток или плазмы крови человека, не содержащих антитела к антигенам риккетсий группы клещевой пятнистой лихорадки. При этом ультразвуковую обработку предварительно ресуспендированных риккетсиальных антигенов проводят в диапазоне частот 15-23 кГц в течение 15-30 минут, а центрифугирование проводят при 10000 -12000g.

Создана также иммуноферментная диагностическая тест-система для осуществления способа диагностики риккетсиозов группы клещевой пятнистой лихорадки, которая включает:

иммуносорбент, полученный на основе инактивированной растворимой очищенной белково-липополисахаридной антигенной субстанции, выделенной из суспензии риккетсиальных антигенов группы клещевой пятнистой лихорадки,

три конъюгата: анти-IgA человека, анти-IgM человека и анти-IgG человека, меченых пероксидазой хрена,

вспомогательные растворы для проведения ИФА,

положительный и отрицательный контрольные образцы:

K+ и K.

Причем в иммуноферментной диагностической тест-системе в качестве вспомогательных растворов используют раствор для разведения образцов, раствор для разведения конъюгатов, хромоген 3',5' - тетраметилбензидин, стоп-реагент, концентрат фосфатно-солевового раствора с твином 20 - ФСР-Т. А в качестве положительного и отрицательного контрольных образцов - K+ и K - соответственно - используют сыворотку или плазму крови человека или пул сывороток или плазм крови человека, содержащих и соответственно не содержащих специфические антитела классов А, М, G к антигенам риккетсий группы КПЛ, инактивированные прогреванием. Создан также способ диагностики риккетсиозов группы клещевой пятнистой лихорадки с использованием иммуноферментной диагностической тест-системы, заключающийся в том, что в лунки параллельных рядов иммуносорбента вносят по 100 мкл в лунку разведения исследуемых образцов сыворотки или плазмы крови человека и контрольных образцов K+ и K-, приготовленных с применением раствора для разведения образцов в начальных разведениях 1: 10 для выявления специфических антител класса А; 1: 20 для выявления антител класса M; 1: 40 для выявления специфических антител класса G, затем проводят инкубирование разведенных исследуемых и контрольных образцов при 37-38°C в течение 45-60 мин, иммуносорбент промывают рабочим раствором ФСР-Т 5-6 раз, вносят в соответствующие ряды иммуносорбента по 100 мкл в лунку рабочие разведения конъюгатов анти-IgA человека, анти-IgM человека и анти-IgG человека, меченых пероксидазой хрена, проводят инкубирование при 37-38°C в течение 30 - 60 мин, иммуносорбент промывают ФСР-Т 5-6 раз, в каждую лунку иммуносорбента вносят по 100 мкл хромогена ТМБ и выдерживают 10-30 мин при комнатной температуре, защищая планшет от прямого света, далее ферментативную реакцию останавливают добавлением 50-100 мкл стоп-реагента и проводят спектрометрическое измерение оптической плотности ОП при длине волны 450 нм с возможным применением референс-волны 620-680 нм, раздельно вычисляют пороговое значение ОПкрит для каждого класса антител по формуле:

ОПкрит = среднее значение ОП K- +0,2,

где ОП K- - среднее значение оптической плотности в лунках соответствующих рядов с внесенным отрицательным контрольным образцом K-.

Описание фигур

На Фиг. 1

представлена типичная хроматограмма, полученная на заключительной стадии обработки и очистки суспензии первичных антигенов Rickettsia sibirica. Продемонстирован профиль элюции супернатанта после ультразвуковой обработки суспензии цельнорастворимого антигена Rickettsia sibirica. Инактивированная растворимая очищенная белково-липополисахаридная антигенная субстанция получается в результате объединения фракций первого пика и некоторых соседних с ним, которые продемонстрировали в ИФА наилучшее соотношение средних значений оптической плотности (ОП) положительных контрольных образцов, содержащих антитела к антигенам риккетсий группы КПЛ, к средним значениям ОП отрицательных контрольных образцов, не содержащих антитела к антигенам риккетсий группы КПЛ.

На оси Х отмечены фракции 1-30 (объем каждой фракции - 1,5 мл), общий объем фазы, прошедшей через колонку - 45 мл; ось Y - оптическая плотность (детекция при двух длинах волн 260 нм и 280 нм).

На Фиг. 2

приведен электрофорез инактивированной растворимой очищенной белково-липополисахаридной антигенной субстанции в полиакриламидном геле, окраска EZBlue^tmGelStainingReagent (Sigma-Aldrich, США). Для характеристики полученной инактивированной растворимой очищенной белково-липополисахаридной оценивается содержание белка и бактериальных липополисахаридов.

1 - маркер, 2 - инактивированная растворимая очищенная белково-липополисахаридная субстанция.

РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Технический результат изобретения достигается дополнительной обработкой и очисткой первичных суспензий цельнорастворимых или корпускулярных или растворимых антигенов Rickettsia sibirica. Для этого инактивированные риккетсиальные антигены ресуспендируют в буфере, например, состава 10mM трис-HCl и 0,5 M хлорида натрия, рН-7,4-7,6, содержащем 10% изопропанол или 8 М мочевину, подвергают ультразвуковой обработке в диапазоне частот 15-23 кГц, в течение 15-30 минут с периодическим охлаждением с применением подходящей модели ультразвукового дезинтегратора. Полученную суспензию центрифугируют при 10000 - 12000 g, отбирают супернатант и проводят гель-фильтрацию супернатанта (растворимого антигена) на колонке, заполненной хроматографическим сорбентом, например, сорбентом Superdex-200. Фракции оценивают на специфическую антигенную активность в ИФА с применением контрольных сывороток крови человека, содержащих и не содержащих специфические антитела к антигенам риккетсий группы КПЛ. Фракции первого пика и некоторые соседние с ним, демонстрирующие при проверке в ИФА наилучшее соотношение сигнала ОП положительных контрольных образцов (содержащих антитела к антигенам риккетсий группы КПЛ) к ОП отрицательных контрольных образцов (не содержащих антитела к антигенам риккетсий группы КПЛ), объединяют и используют в дальнейшем для получения иммуносорбента иммуноферментной тест-системы. Количественное определение белка оценивают спектрофотометрически по одной из известных методик (ОФС.1.2.3.0012.15. Определение белка), количественное определение бактериальных липополисахаридов оценивают в ЛАЛ-тесте по одной из регламентированных методик (ОФС.1.2.4.0006.15. Бактериальные эндотоксины).

Для приготовления иммуносорбента проводят сорбцию рабочего разведения инактивированной растворимой очищенной белково-липополисахаридной субстанции на твердую фазу (подходящая модель полистиролового 96-луночного планшета для целей ИФА). Подбор оптимальных разведений хорошо понятен специалисту и не требует дополнительных разъяснений.

Технический результат достигается также подбором условий проведения ИФА и тем, что для повышения информативности и чувствительности способа диагностики риккетсиозов группы КПЛ исследуемый образец (сыворотку или плазму крови человека) параллельно и дифференциально исследуют не только на наличие специфических антител классов G и M, но и на наличие антител класса A с раздельным использованием трех конъюгатов антител (анти-IgA, анти-IgM, анти-IgG человека, меченых пероксидазой).

Способ диагностики риккетсиозов группы КПЛ заключается в том, что сыворотку/плазму крови пациента с подозрением на риккетсиоз, вызываемый возбудителем группы КПЛ, исследуют на наличие специфических антител методом непрямого ИФА. Для упрощения способа диагностики риккетсиозов группы КПЛ разработана иммуноферментная диагностическая тест-система, которая представляет собой многокомпонентный набор реагентов и включает иммуносорбент на основе инактивированной растворимой очищенной белково-липополисахаридной антигенной субстанции, три конъюгата (анти-IgA человека, анти-IgM человека и анти-IgG человека, меченых пероксидазой хрена), вспомогательные растворы для проведения ИФА, положительный и отрицательный контрольные образцы (K+ и K). Вспомогательными растворами являются раствор для разведения образцов (РРО), раствор для разведения конъюгатов (РРК), хромоген (3',5' - тетраметилбензидин, далее - ТМБ), стоп-реагент, концентрат фосфатно-солевового раствора с твином 20 (ФСР-Т). В лунки трех параллельных рядов иммуносорбента вносят разведения исследуемых и контрольных образцов (K+ и K-), приготовленные с применением РРО (например, ряд 1 выделяют для выявления специфических антител класса А, ряд 2 - для выявления специфических антител класса M, лунки ряд 3 - для выявления специфических антител класса G). Начальные разведения образцов с целью выявления специфических антител класса А к антигенам риккетсий группы КПЛ (инактивированной растворимой очищенной белково-липополисахаридной антигенной субстанции) - 1: 10, для выявления специфических антител класса M - 1: 20, для выявления специфических антител класса G - 1: 40. Далее проводят инкубирование разведений исследуемых и контрольных образцов, для чего защищенный крышкой иммуносорбент выдерживают при температуре 37-38°C, желательно, во влажной камере, в течение 45-60 мин. Лунки иммуносорбента промывают рабочим раствором ФСР-Т 5-6 раз, внося не менее 200 мкл раствора в лунку. Готовят рабочие разведения трех конъюгатов (анти-IgA человека, анти-IgM человека и анти-IgG человека, меченых пероксидазой хрена) с применением РРК. Раздельно в лунки рядов иммуносорбента вносят по 100 мкл соответствующих конъюгатов, проводят инкубирование при температуре 37-38°C в течение 30-60 мин. Далее планшет (иммуносорбент) промывают ФСР-Т 5-6 раз и вносят по 100 мкл в каждую лунку хромогена ТМБ и выдерживают 10-30 мин при комнатной температуре, защищая планшет от прямого света. Для остановки реакции в лунки иммуносорбента добавляют по 50-100 мкл стоп-реагента и проводят измерение оптической плотности (ОП) с помощью подходящей модели спектрофотометра при длине волны 450 нм с возможным применением референс-волны 620-680 нм. Для оценки результатов ИФА раздельно вычисляют пороговое значение ОП - ОПкрит - для каждого класса антител по формуле: ОПкрит=среднее значение ОП (K-) + 0,2, где ОП (K-) - среднее значение оптической плотности в лунках соответствующих рядов с внесенным отрицательным контрольным образцом (K-). Исследуемый образец содержит специфические антитела класса А и/или М и/или G, если его значение ОП превышает или равно ОПкрит.

На основании результатов ИФА с применением созданной иммуноферментной диагностической тест-системы делают вывод о наличии специфических антител классов классов А, М, G к антигенам риккетсий группы КПЛ в сыворотке/плазме крови человека.

Изобретение поясняется следующими примерами.

Пример 1.

Получение инактивированной растворимой очищенной белково-липополисахаридной антигенной субстанции, выделенной из цельнорастворимого антигена Rickettsia sibirica.

Для получения инактивированной растворимой очищенной белково-липополисахаридной антигенной субстанции использовали инактивированный лиофилизированный цельнорастворимый препарат антигена Rickettsia sibirica (штамм «Нецветаев»), произведенный в ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России (накопление риккетсий проводилось в желточных мешках куриных развивающихся эмбрионов).

Инактивированный лиофилизированный цельнорастворимый антиген Rickettsia sibirica ресуспендировали в буфере состава 10mM трис-HCl и 0,5 M натрия хлорида, рН-7,4-7,6, содержащем 10% изопропанол. Далее суспензию антигена подвергали ультразвуковой обработке при частоте 23 кГц с использованием ультразвукового дезинтегратора SoniPrep 150 Plus (MSE, Великобритания), для чего шток погружали в стакан с водой, пробирка с суспензией антигена помещалась в этот же стакан. Ультразвуковую обработку проводили в режиме 5 мин озвучивания с последующим охлаждением пробирки и сменой воды в стакане. Время обработки ультразвуком составило 30 мин. Полученную суспензию центрифугировали при 10000 g и отбирали супернатант. Проводили эксклюзионную хроматографию (гель-фильтрацию) супернатанта с использованием хроматографа AktaExplorer 10 (GE, Швеция) при постоянной температуре +4°С. Отобранный супернатант наносили на колонку с размерами 10×300 мм, заполненную сорбентом Superdex 200 (GE, Швеция). Использовали подвижную фазу следующего состава: ЮтМ трис- HCl и 0,5 М хлорида натрия, рН-7,5, содержащую 10% изопропанола. Полученная хроматограмма приведена на Фиг. 1. Как видно из Фиг. 1, на хроматограмме отчетливо выделяются три основных пика. Фракции оценивали на специфическую антигенную активность в ИФА с применением сывороток/плазмы крови человека, содержащих и не содержащих специфические антитела к антигенам риккетсий группы КПП (Таблица 1).

Таблица 1. Результаты проверки фракций, полученных в результате проведенной гель-фильтрации, на специфическую антигенную активность.

Примечание: * ОП(+)/ОП(-) - соотношение средних значений оптической плотности положительных образцов сыворотки/плазмы крови человека, содержащих антитела к риккетсиям группы КПП, к средним значениям оптической плотности отрицательных контрольных образцов сыворотки/плазмы крови человека, не содержащих антитела к риккетсиям группы КПП.

Фракции первого пика (№№6-8), демонстрирующие при проверке в ИФА наилучшее соотношение среднего значения сигналов оптической плотности пяти положительных образцов сывороток крови человека, содержащих антитела к антигенам риккетсий группы КПП (ОП+), к среднему значению оптической плотности пяти отрицательных образцов сывороток крови человека, не содержащих антитела к антигенам риккетсий группы КПЛ (ОП-), объединяли. Полученная таким объединением фракций 6,7,8 целевая фракция представляла собой инактивированную растворимую очищенную белково-липополисахаридную антигенную субстанцию. Остальные фракции, демонстрирующие в ИФА снижение ОП(+)/ОП(-) на 30% и более по сравнению со средним значением ОП(+)/ОП(-), вычисленному для фракций первого пика (в данном примере среднее значение - 8,1), исключались.

Для качественной оценки полученной антигенной субстанции проводили электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия по известной методике (ОФС 1.2.1.0023.15. Электрофорез в полиакриламидном геле). Гель окрашивали с использованием реагента EZ Blue Gel Staining Reagent (Sigma-Aldrich, США). Электрофорез представлен на Фиг. 2.

Количественное определение белка в полученном антигенном препарате оценивали спектрофотометрически по методу Брэдфорд (ОФС.1.2.3.0012.15. Определение белка). Количественное определение бактериальных липополисахаридов оценивали с использованием турбидиметрического кинетического ЛАЛ-теста (ОФС.1.2.4.0006.15. Бактериальные эндотоксины). Содержание белка в полученной антигенной субстанции, определенное по методу Брэдфорд, составило 0,292 мг/мл; содержание бактериальных липополисахаридов, определенное с использованием метода кинетического турбидиметрического ЛАЛ-теста, составило 6654 EU/мл.

Таким образом, полученные результаты подтвердили присутствие в инактивированной растворимой очищенной белково-липополисахаридной субстанции как белков, так и бактериальных липополисахаридов.

По аналогичной методике можно получить инактивированную растворимую очищенную белково-липополисахаридную антигенную субстанцию, используя при этом корпускулярные или цельнорастворимые или растворимые антигены других патогенных видов риккетсий, включенных в группу КПЛ.

Пример 2.

Получение иммуноферментной диагностической тест-системы для осуществления способа диагностики риккетсиозов группы клещевой пятнистой лихорадки.

Иммуноферментная диагностическая тест-система для осуществления способа диагностики риккетсиозов группы клещевой пятнистой лихорадки представляет собой набор реагентов (компонентов), предназначенный для выявления в сыворотке/плазме крови человека специфических антител классов А, М, G к антигенам риккетсий группы КПЛ.

Для приготовления основного компонента тест-системы - иммуносорбента - использована инактивированная растворимая очищенная белково-липополисахаридная антигенная субстанция, выделенная из суспензии цельнорастворимого Rickettsia sibirica (штамм Нецветаев). Подробное описание получения инактивированной растворимой очищенной белково-липополисахаридной приведено в примере 1. Инактивированную растворимую очищенную белково-липополисахаридную антигенную субстанцию, разведенную в 0,05 М карбонат-бикарбонатной буфере, рН-9,6, до рабочей концентрации (по белку 10 мкг/мл, содержание бактериальных эндотоксинов - 225 EU/мл), сорбировали в течение 18 ч при комнатной температуре (22°C) в лунках планшета Maxi Sorp Costar в объеме 100 мкл в лунке. Далее содержимое иммуносорбента сбрасывали и вносили на 1 ч при комнатной температуре по 150 мкл в каждую лунку раствор для блокировки неспецифических связываний (0,05М карбонат-бикарбонатный буфер рН-9,6, содержащий 0,5% раствор казеината натрия и консерванты), после раствор удаляли, планшет высушивали, помещали в фольгированный пакет с вложенным силикагелем и запаивали под вакуумом.

Для приготовления конъюгата №1 (11-кратного концентрата конъюгата анти-IgA человека с пероксидазой) использовали препарат аффиноочищенных антител козы против иммуноглобулинов А человека, меченых пероксидазой хрена (ООО «Имтек», Россия), разведенных до концентрации 7 мкг/мл на смеси из глицерина 30% и сыворотки крупного рогатого скота 70%. Для приготовления конъюгата №2 (11-кратного концентрата конъюгата анти-IgM человека, меченых пероксидазой) использовали препарат аффиноочищенных антител козы против иммуноглобулинов М человека, меченых пероксидазой хрена (ООО «Имтек», Россия), разведенных до концентрации 2 мкг/мл на смеси из глицерина 30% и сыворотки крупного рогатого скота 70%. Для приготовления конъюгата №3 (11-кратного концентрата конъюгата анти-lgG человека, меченых пероксидазой) использовали препарат аффиноочищенных антител козы против иммуноглобулинов G человека, меченых пероксидазой хрена (ООО «Имтек», Россия), разведенных до концентрации 8 мкг/мл на смеси из глицерина 30% и сыворотки крупного рогатого скота 70%.

Готовили вспомогательные растворы для проведения ИФА:

- раствор для разведения образцов (РРО) состава: 0,1 М фосфатно-солевой буфер, рН 7,3-7,5, содержащий 1% раствор казеината натрия, 0,25 М мочевину, 0,5 М хлорида натрия, 0,01% твин-20, 0,01% мертиолята натрия;

- раствор для разведения конъюгатов (РРК) состава: 0,1 М фосфатно-солевой буфер, рН 7,3-7,4, содержащий 10% сыворотки крупного рогатого скота, 0,05% твин-20;

- хромоген (однокомпонентный водный раствор 3',5'-тетраметилбензидина, далее - ТМБ) производства ЗАО «НЕЮ ИММУНОТЕХ», Россия;

- стоп-реагент (0,75 нормальная серная кислота);

- концентрат фосфатно-солевового раствора с твином 20 (ФСР-Т) для промывания планшетов (состав рабочего раствора ФСР-Т после разведения концентрата дистиллированной водой: 0,1 М фосфатно-солевой буфер, рН 7,3-7,4, содержащий 0,15 М хлорида натрия, 0,05% твин-20).

Готовили положительный и отрицательный контрольные образцы (K+ и K). Положительный контрольный образец (К+) представлен сывороткой/плазмой крови человека или пулом сывороток/плазмы крови человека, содержащих антитела классов А, М, G к антигенам риккетсий группы КПЛ, инактивированный прогреванием на водяной бане в течение 30 мин при 56°C. Отрицательный контрольный образец (K-) представлен сывороткой/плазмой крови человека или пулом сывороток/плазмы крови человека, не содержащих антитела классов А, М, G к антигенам риккетсий группы КПЛ, также инактивированный прогреванием на водяной бане в течение 30 мин при 56°C.

Все компоненты соответствующим образом упаковываются, маркируются. Тест-система (набор реагентов) упакована в картонную коробку, снабжена инструкцией по применению с описанием предназначения, состава, детальной последовательности проведения анализа с ее помощью, указанием производителя, сроков производства и годности, прочей дополнительной необходимой информации.

Указанные выше прописи реагентов (компонентов) в составе диагностической иммуноферментной тест-системы приведены для конкретного примера. Корректировка составов находится в компетенции специалиста.

Таким образом, иммуноферментная диагностическая тест-система представляет собой многокомпонентный набор реагентов, предназначенный для дифференциального выявления специфических антител классов А, М, G к антигенам группы КПЛ в сыворотке/плазме крови человека.

Пример 3.

Изучение параметров чувствительности и специфичности иммуноферментного анализа в сравнительном анализе иммуносорбентов, полученных на основе цельнорастворимых антигенов Rickettsia sibirica и инактивированной растворимой очищенной белково-липополисахаридной антигенной субстанции, выделенной из суспензии цельнорастворимого антигена Rickettsia sibirica.

Для сравнительной оценки параметров чувствительности и специфичности иммуноферментного анализа раздельно готовили иммуносорбенты на основе лиофилизированного инактивированного цельнорастворимого антигена Rickettsia sibirica, штамм «Нецветаев» (ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» МЗ РФ), «Диагностикума риккетсиозного Сибирика сухого для РСК» (НПО «Микроген», Россия) и инактивированной растворимой очищенной белково-липополисахаридной антигенной субстанции, полученной по оригинальной методике (см. пример 1). Для этого проводили сорбцию в лунках полистироловых планшетов Maxi Sorp Corning, США в объеме 100 мкл в каждой лунке рабочих разведений вышеуказанных антигенов и инактивированной растворимой очищенной белково-липополисахаридной антигенной субстанции, приготовленных с применением 0,05 М карбонат-бикарбонатного буфера, рН-9,6. Закрытые крышками планшеты выдерживали в течение 20 ч при температуре 18°C, после содержимое лунок удаляли без промывания планшета и вносили раствор для блокировки неспецифических связываний на 1 час состава, приведенного в примере 2, при температуре 18°C. Содержимое лунок удаляли, планшеты высушивали и использовали для проведения ИФА. Таким образом, иммуносорбент 1 был получен в результате сорбции «Диагностикума риккетсиозного Сибирика сухого для РСК» в концентрации 200 мкг/мл. Иммуносорбент 2 получен в результате сорбции инактивированного цельнорастворимого антигена Rickettsia sibirica, штамм «Нецветаев» (ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» МЗ РФ), разведенного до концентрации 200 мкг/мл. Для получения иммуносорбента 3 использовали инактивированную растворимую очищенную белково-липополисахаридную субстанцию, выделенную из инактивированного цельнорастворимого антигена Rickettsia sibirica, штамм «Нецветаев», сорбированную в концентрации 10 мкг/мл по белку и содержанием бактериальных эндотоксинов - 225 EU/мл.

Дополнительно для оценки специфичности иммуноферментного анализа с использованием иммуносорбентов 1, 2, 3 и выявления возможных перекрестных (ложноположительных реакций) готовили аналогичным образом иммуносорбент 5 на основе контрольного антигена, представляющим собой гомогенизат незараженных риккетсиями тканей оболочек желточного мешка развивающихся куриных эмбрионов (ФГБУ «НИЦЭМ им.Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России), который сорбировали в подобранной концентрации 10 мкг/мл. Также готовили иммуносорбент 4 на основе яичного лизоцима (Amresco, США) в концентрации 5 мкг/мл.

РРО, РРК, ФСР-Т, ТМБ, стоп-реагент, контрольные образцы (K+ и K-) для проведения ИФА использовали состава, приведенного в примере 2.

Для сравнительной оценки чувствительности ИФА использовали:

- 18 сывороток/плазмы крови пациентов с диагнозом «астраханская пятнистая лихорадка», установленным по совокупности клинико-эпидемиологических данных и подтвержденным серологически с применением коммерческой иммуноферментной тест-системы «Rickettsia conorii ELISA IgG/IgM» производства Vircell, Испания;

- 2 сыворотки крови человека с предварительным диагнозом «африканская пятнистая лихорадка», установленным по совокупности клинико-эпидемиологических данных и подтвержденным методом ПЦР и серологически (РНИФ);

- 6 сывороток/плазмы крови пациентов с установленным клиническим диагнозом «клещевой сыпной тиф Северной Азии» (клещевой риккетсиоз, в тексте - КР) из коллекции лаборатории экологии риккетсий ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» МЗ РФ и подтвержденным серологически в РСК/РНИФ.

Для сравнительной оценки специфичности ИФА использованы:

- 6 контрольных сывороток крови человека, не содержащих антитела по данным РНИФ, ИФА, дот-блоттинга, РСК к антигенам риккетсий группы КПЛ;

- 30 сывороток условно здоровых крови людей, неинфицированных на момент получения сывороток крови и не переносивших ранее заболевания риккетсиальной этиологии.

ИФА проводили с использованием приготовленных иммуносорбентов в одинаковых условиях. В конкретном примере все образцы сыворотки/плазмы крови человека исследовали в отношении только специфических антител классов М и G. Антитела класса А в данном примере не оценивали, т.к. целью исследования была сравнительная оценка не только специфичности, но и чувствительности анализа (способа диагностики) по одному варьируемому параметру - составу иммуносорбента.

В параллельные лунки каждого иммуносорбента вносили исследуемые образцы в объеме 100 мкл в разведениях 1: 20 с целью выявления специфических антител класса М и 1:40 с целью выявления антител класса G, приготовленных на РРО, иммуносорбенты инкубировали 45 мин при температуре 37°C. Далее содержимое лунок удаляли в емкость для сбора инфицированного материала, лунки иммуносорбентов промывали 6 раз рабочим раствором ФСР-Т. В лунки одного ряда вносили по 100 мкл аффиноочищенных антител козы против иммуноглобулинов М человека, меченых пероксидазой хрена (ООО «Имтек», Россия) в конечной концентрации 0,2 мкг/мл, а в лунки параллельного ряда вносили конъюгат аффиноочищенных антител козы против иммуноглобулинов G человека, меченых пероксидазой хрена (ООО «Имтек», Россия) в конечной концентрации 0,7 мкг/мл. Разведения конъюгатов проводили с использованием РРК. Планшеты (иммуносорбенты) инкубировали в течение 30 мин при 37°C, после чего содержимое лунок удаляли в емкость для сбора инфицированного материала, лунки промывали 6 раз рабочим раствором ФСР-Т, вносили по 100 мкл раствора ТМБ и выдерживали 15 мин в защищенном от света месте при температуре 18°C. Реакцию останавливали добавлением во все лунки планшета по 50 мкл стоп-реагента. Учет результатов проводили спектрофотометрически при длине волны 450 нм. Интерпретацию результатов ИФА с иммуносорбентами 1, 2, 3 проводили следующим образом. Раздельно рассчитывали ОПкрит для определения пороговых значений уровня антител классов М и G по формуле: ОПкрит = среднее значение ОП (K-) + 0,2, где ОП (K-) - среднее значение оптической плотности в лунках с внесенным K- в рядах, маркированных для выявления антител класса М, и в лунках с внесенным K- в рядах для выявления антител класса G. Пробу считали положительной на наличие антител определенного класса (М или G) к антигенам риккетсий группы КПЛ, если оптическая плотность анализируемого образца была выше и равна соответствующему значению ОПкрит.

Для интерпретации результатов ИФА с иммуносорбентами 4 и 5 рассчитывали среднее значение ОП по всем сывороткам, включенным в исследование, исключая в дальнейшем такие, ОП которых отклонялась от среднего значения ОП более чем на 3 стандартных отклонения, вычисляемого с применением методов математической статистики. Вычисляли ОПкрит = среднее значение ОП + 0,2. Пробу считали положительной на наличие антител определенного класса к лизоциму или контрольному антигену, если оптическая плотность анализируемого образца была выше и равна значению ОПкрит. Полученные результаты приведены в таблице 2.

Таблица 2. Сравнительная оценка показателей чувствительности и специфичности ИФА при использовании цельнорастворимых антигенов Rickettsia sibirica и инактивированной растворимой очищенной белково-липополисахаридной субстранции.

ложноположительных образцов при изучении отрицательных контрольных сывороток крови (n=6) Количество ложноположительных образцов при изучении сывороток крови условно здоровых людей (n=30) 3/30 3/30 0/30 1/30 4/30 Чувствительность, % 88,5 88,5 100 - - Специфичность, % 88,9 88,9 100 - -

Примечание:

1 - «Диагностикум риккетсиозный Сибирика сухой для РСК»,

2 - цельнорастворимый антиген Rickettsia sibirica (штамм «Нецветаев»),

3 - инактивированная растворимая очищенная белково-липополисахаридная субстанция, выделенная из цельнорастворимого Rickettsia sibirica,

4 - лизоцим из яичного желтка,

5 - контрольный антиген.

Представленные данные убедительно демонстрируют, что ложноположительные реакции при использовании иммуносорбентов 1 и 2 были вызваны наличием в них примесей тканей овокультур, что было доказано при анализе с контрольным антигеном (иммуносорбент 5), имеющий сложный состав и включающий также детерминанты, общие с лизоцимом (иммуносорбент 4). Специфичность ИФА с использованием иммуносорбента 3 составила 100% и превосходила специфичность, достигаемой использованием недостаточно очищенных антигена Rickettsia sibirica и «Диагностикума риккетсиозного Сибирика для РСК» (иммуносорбенты 1 и 2).

Чувствительность ИФА с использованием иммуносорбента 3 также превосходила параметры чувствительности анализа с применением иммуносорбентов 1 и 2. Это объясняется тем, что для приготовления инактивированной растворимой очищенной белково-липополисахаридной субстанции первичная суспензия антигенов подвергается ультразвуковой обработкой, что дополнительно способствует полному переводу антигена в растворимую форму, при этом достигается наибольшая доступность основных антигенных детерминант для эффективного связывания специфическими антителами.

Из представленных данных также следует, что диагностика риккетсиозов группы КПЛ носит группоспецифический характер, т.к. антиген Rickettsia sibirica и полученные на его основе антигенные субстанции позволили успешно серологически детектировать не только клещевой сыпной тиф Северной Азии (клещевой риккетсиоз), но также АПЛ и африканскую пятнистую лихорадку.

Пример 4.

Способ диагностики риккетсиозов группы КПЛ с применением разработанной иммуноферментной тест-системы на примере исследования образцов сывороток или плазмы крови пациентов Ш., С., К., В. с подозрениями на заболевания риккетсиальной этиологии, вызываемыми возбудителями риккетсиозов группы КПЛ.

Использовали разработанную иммуноферментную тест-систему, позволяющую определять в сыворотке или плазме крови человека антитела классов A, M, G к антигенам риккетсий группы КПЛ (описание тест-системы и состав основных компонентов представлены в примере 2).

В лунки 1 ряда иммуносорбента, маркированного для выявления специфических IgA (антител класса А) к антигенам риккетсий группы КПЛ, вносили 180 мкл РРО и 20 мкл сывороток крови исследуемых пациентов Ш., С., К., В. и контрольных образцов K+ и K - (конечное разведение образцов - 1:10). В лунки 2 ряда иммуносорбента, маркированного нами для выявления специфических IgM (антител класса М) к антигенам риккетсий группы КПЛ, вносили по 100 мкл РРО и по 100 мкл сывороток исследуемых пациентов Ш., С., К., В. и контрольных образцов K+ и K-, разведенных предварительно 1:10 в лунках ряда 1. В параллельные лунки 3 ряда иммуносорбента, маркированного для выявления специфических IgG (антител класса G) к антигенам риккетсий группы КПЛ, вносили по 100 мкл РРО и по 100 мкл сывороток/плазмы исследуемых пациентов Ш., С., К., В. и контрольных образцов K+ и K-, разведенных предварительно 1:20 в лунках ряда 2 (конечное разведение образцов составило 1: 40), далее из каждой лунки удаляли по 100 мкл разведенных образцов так, чтобы остаточный объем составил 100 мкл. Иммуносорбент инкубировали, защищая крышкой, при температуре 37°C во влажной камере 45 мин. Далее иммуносорбент промывали 6 раз рабочим раствором ФСР-Т. В лунки ряда 1 иммуносорбента вносили по 100 мкл рабочего разведения конъюгата 1, разведенного с помощью РРК. В лунки ряда 2 иммуносорбента вносили по 100 мкл рабочего разведения конъюгата 2, разведенного РРК. В лунки ряда 3 иммуносорбента вносили по 100 мкл рабочего разведения конъюгата 3, разведенного РРК. Планшет инкубировали при температуре 37°C в течение 30 мин. После планшет (иммуносорбент) промывали ФСР-Т 6 раз и вносили по 100 мкл водного однокомпонентного хромогена ТМБ, выдерживали 15 мин при комнатной температуре, защищая планшет от прямого света. Для остановки реакции в лунки иммуносорбента добавляли по 50 мкл стоп-реагента. Проводили измерение ОП на спектрофотометре при длине волны 450 нм. Рассчитывали ОПкрит для каждого класса антител по формуле: ОПкрит = среднее значение ОП (K-) + 0,2, где ОП (K-) - среднее значение оптической плотности в лунках с внесенным K-.

В конкретном примере значения ОПкрит следующие:

ОПкрит (IgA) = 0,2+0,074 = 0,274, где 0,074 - среднее значение по двум лункам ОП (K-) в ряду 1,

ОПкрит (IgM) = 0,2+0,061 = 0,261, где 0,061 - среднее значение по двум лункам ОП (K-) в ряду 2,

ОПкрит (IgG) = 0,2 + 0,068=0,268, где 0,068 - среднее значение по двум лункам ОП (K-) в ряду 3.

ОП (K+) в лунках рядов 1, 2, 3 соответственно были равны значениям 0,564; 0,671; 0,988. Тест-система считается валидной, т.к. получены положительные значения ОП в лунках с внесенным положительным контролем (K+).

На основании результатов ИФА делали вывод о наличии антител A, M, G в сыворотках крови пациентов Ш., С., К., В. к антигенам риккетсий группы КПЛ.

Выдержки из истории болезни пациентов Ш., С., К., В. и результаты проводимых специфических лабораторных исследований приводим ниже.

Пациент Ш., 6 лет поступил в областную инфекционную больницу г. Астрахани с подозрением по клинико-эпидемиологическим данным на заболевание АПЛ в острой форме (характерная макулопапулезная сыпь, лихорадка). Первичный аффект отсутствовал.

Проводимые специфические лабораторные исследования:

ПЦР на наличие Rickettsia conorii в лейкоцитарном осадке крови с помощью набора реагентов «АмплиСенс® Rickettsia conorii-FL» с гибридизационно-флуоресцентной детекцией результатов (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора) - получен отрицательный результат,

результаты ИФА, полученного с применением коммерческой иммуноферментной диагностической тест-системы «Rickettsia conorii ELISA IgG/IgM» (Vircell, Испания) - в сыворотке крови не выявлены специфические антитела классов G и M,

- результаты ИФА с применением разработанной тест-системы на основе инактивированной растворимой очищенной белково-липополисахаридной субстанции, выделенной из Rickettsia sibirica - в сыворотке крови не были обнаружены антитела классов M и G, т.к. ОП сыворотки крови пациента в рядах 2 и 3 соответствовали значениям 0,078 и 0,095 и не превысили значения ОПкрит, рассчитанные для специфических IgM и IgG. Однако выявлены антитела класса А, т.к. ОП сыворотки в ряду 1 составила 1,1204 и превысила ОПкрит (IgA) = 0,274.

Таким образом, у больного Ш. с подозрением по клинико-эпидемиологическим данным на АПЛ, диагноз был подтвержден выявлением в сыворотке крови специфических антител класса А к антигенам риккетсий группы КПЛ.

Пациентка С., 75 лет госпитализирована в областную инфекционную больницу г. Астрахани с подозрением по клинико-эпидемиологическим данным на заболевание АПЛ в острой форме.

Проводимые специфические лабораторные исследования:

- ПЦР на наличие Rickettsia conorii в лейкоцитарном осадке крови с помощью коммерческого набора реагентов «АмплиСенс® Rickettsia conorii-FL» - положительный результат,

- ИФА с применением разработанной тест-системы на основе инактивированной растворимой очищенной белково-липополисахаридной субстанции, выделенной из Rickettsia sibirica - были выявлены в сыворотке крови пациента антитела классов А (ОП сыворотки = 1,141) и G (ОП = 0,603) и не обнаружены антитела класса М (ОП = 0,09).

Таким образом, серологическая картина, полученная с применением разработанной тест-системы, дополнительно подтвердила картину острого риккетсиоза, в частности, АПЛ.

Пациент К., поступил в клиническую инфекционную больницу №1 г. Москвы с подозрением по клинико-эпидемиологическим данным на риккетсиоз группы КПЛ (африканская пятнистая лихорадка?). Инфицирование, по-видимому, произошло в результате присасывания клеща (отмечен первичный аффект) во время туристической поездки на сафари в Танзании.

Проводимые специфические лабораторные исследования:

- при использовании тест-системы в формате ПЦР «РеалБест ДНК Rickettsia species» (ЗАО «Вектор-Бест», Россия) и использовании в качестве биоматериала смыва с биоптата первичного аффекта был получен положительный результат,

- ИФА с применением тест-системы на основе инактивированной растворимой очищенной белково-липополисахаридной субстанции, выделенной из Rickettsia sibirica - в плазме крови пациента К. выявлены специфические антитела всех трех классов: А (ОП = 1,077), класса М (ОП = 0,456), класса G (ОП = 0,507), что наряду с результатами ПЦР дополнительно подтверждало первичный диагноз острого риккетсиоза группы КПЛ (африканская пятнистая лихорадка).

Пациентка В., 45 лет поступила в областную инфекционную больницу г. Астрахани с подозрением на аденовирусную инфекцию на 14 день заболевания с момента регистрации первых симптомов инфекции (отмечалась высокая температура, конъюнктивит, катаральные явления, на момент госпитализации - отсутствие характерной для АПЛ сыпи). Во время госпитализации пациентки В. не проводилось лабораторных исследований, направленных на верификацию диагноза АПЛ. Ретроспективно в плазме крови пациентки В. с помощью разработанной ИФА-тест-системы были выявлены только антитела класса А (ОП = 1,198). Из образца плазмы крови также ретроспективно выделена ДНК Rickettsia conorii с применением набора реагентов «АмплиСенс® Rickettsia conorii-FL». Следовательно, ретроспективно была доказана риккетсиальная природа инфекционного заболевания (АПЛ), в том числе серологически с применением разработанной иммуноферментной тест-системы.

Таким образом, способ диагностики риккетсиозов группы КПЛ, предусматривающий раздельное выявление в сыворотке или плазме крови человека специфических антител не только классов М и G, но и класса А, является наиболее информативным и чувствительным, что особенно важно в ранний период инфицирования.

Пример 5.

Возможность применения иммуноферментной тест-системы не только для диагностики риккетсиоза, вызываемым Rickettsia sibirica. Поскольку серологическая диагностика риккетсиозов КПЛ носит группоспецифический характер, представлял интерес изучение сывороток или плазмы крови больных клещевыми риккетсиозами, вызываемыми возбудителями (риккетсиями) группы КПЛ в отношении эффективности выявления в них специфических антител с применением предлагаемой иммуноферментной тест-системы. Для приготовления иммуносорбентов использована инактивированная растворимая очищенная белково-липополисахаридная антигенная субстанция, выделенная из суспензии цельнорастоворимого антигена R.sibirica subsp. sibirica (штамм Нецветаев). Субстанция получена по оригинальной методике, изложенной ранее (пример 1). В работе использовали тест-систему, описание которой изложено в примере 2. Постановку ИФА проводили по схеме, приведенной в примере 4.

В данное исследование были включены сыворотки или плазмы крови пациентов (всего - 86 образцов), полученные на 7-14 дни со дня регистрации клинических симптомов острой инфекции риккетсиальной этиологии, которая подтверждалась положительными результатами ПЦР-тестирования лейкоцитарных фракций крови и/или смывов с первичных аффектов уданных пациентов с применением коммерческого набора реагентов «РеалБест ДНК Rickettsia species» (ЗАО «Вектор-Бест», Россия). Набор реагентов «РеалБест ДНК Rickettsia species» предназначен для обнаружения генетического материала, содержащего консервативный участок гена gltA (цитратсинтазы), который имеется у всех видов риккетсий группы КПЛ (Е.И. Бондаренко, Л.Д. Щучинова, Д.И. Тимофеев и др. Выявление генетических маркеров возбудителей клещевых риккетсиозов в ПЦР с помощью наборов реагентов «РеалБест ДНК Rickettsia species» и «РеалБест ДНК Rickettsia sibirica/ Rickettsia heilongjiangensis». НОВОСТИ «Вектор-Бест», 2018, №1 (87)). В таблице 3 представлены данные тестирования сывороток или плазмы крови пациентов в ИФА.

Таблица 3. Выявление специфических антител к антигенам риккетсий группы КПЛ в ИФА с применением тест-системы на основе инактивированной растворимой очищенной белково-липополисахаридной антигенной субстанции, выделенной из суспензий цельнорастворимых антигенов Rickettsia sibirica.

Спектры выявляемых антител в исследуемых образцах Количество образцов с соответствующим спектром антител к антигенам риккетсий группы КПЛ IgG 19 IgA 21 IgM 10 IgG + IgM 15 IgM + IgA 17 IgG + IgM + IgA 4 Всего 86

У пациентов, инфицирование которых было вызвано патогенными для человека видами риккетсий группы КПЛ, в ИФА на основе инактивированной растворимой очищенной белково-липополисахаридной антигенной субстанции, выделенной из Rickettsia sibirica, в образцах (сыворотках или плазме крови) выявлялись специфические антитела.

Таким образом, иммуноферментная тест-система может быть использована не только для диагностики клещевого риккетсиоза (клещевого сыпного тифа Северной Азии), вызываемого Rickettsia sibirica, но также и для диагностики других риккетсиозов группы КПЛ, возбудителями которых могут быть другие патогенные виды риккетсий, объединенных в группу КПЛ (Rickettsia conorii с выделенными подвидами и вызываемыми ими отдельными нозологическими формами риккетсиозов, среди которых наибольшую актуальность для РФ имеют Rickettsia conorii subsp.conorii - возбудитель марсельской лихорадки, Rickettsia conorii subsp.caspensis - возбудитель астраханской пятнистой лихорадки; Rickettsia heilongjiangensis - возбудитель дальневосточной пятнистой лихорадки; Rickettsia africae - возбудитель африканской клещевой лихорадки и другие патогенные виды).

Следует также особо отметить, что одиночные специфические антитела класса А к антигенам группы КПЛ были обнаружены в сыворотках крови 21 пациента (24,4%) с клиническими признаками острой инфекции риккетсиальной этиологии. Следовательно, дополнительное выявление антител класса А повышает чувствительность и информативность способа диагностики риккетсиозов группы КПЛ.

Показано, что дополнительное выявление специфических антител класса А существенно сокращает количество серонегативных результатов в ранний период инфицирования. Подробное подтверждение этому приведено в примерах.

Все приведенные примеры доказывают, что задача, поставленная в изобретении, решена.

ПРОМЫШЛЕННАЯ ПРИМЕНИМОСТЬ

Способ диагностики риккетсиозов группы клещевой пятнистой лихорадки, основанный на раздельном дифференциальном выявлении методом непрямого твердофазного иммуноферментного анализа в сыворотке или плазме крови человека специфических антител классов M, G и A к антигенам риккетсий группы КПЛ, с применением иммуносорбента, полученного на основе инактивированной растворимой очищенной белково-липополисахаридной антигенной субстанции, выделенной из суспензии антигенов Rickettsia sibirica, является чувствительным, специфичным и информативным.

Из-за наличия в составе риккетсий группы КПЛ растворимого (группоспецифического антигена), который неоднороден и включает липополисахарид с высокой гомологией антигенных структур у риккетсий внутри группы и другие антигены белковой природы, серологическая диагностика риккетсиозов группы клещевой пятнистой лихорадки с использованием таких антигенов является группоспецифической, что делает возможным выявление специфических антител к большинству видов патогенных для человека риккетсий в составе группы КПЛ, хотя титр специфических антител к гомологичному антигену (возбудителю), как правило, выше (K. Amano, M. Fujita, T. Suto. Chemical properties of lipopolysaccharides from spotted fever group rickettsiae and their common antigenicity with lipopolysaccharides from Proteus species. Infection of Immunology,1993, v. 61, №10, р. 4350-4355;

Здродовский П.Ф., Голиневич Е.М. Учение о риккетсиях и риккетсиозах. Москва, «Медицина», 1972, 495 с;

D. Jones, B. Anderson, J. Olson, C. Greene. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay for Detection of Human Immunoglobulin G to Lipopolysaccharide of Spotted Fever Group Rickettsiae. Journal of Clinical Microbiology, 1993, v. 31, №1, p. 138-141).

Оригинальная методика получения инактивированной растворимой очищенной белково-липополисахаридной антигенной субстанции из суспензии первичных антигенов Rickettsia sibirica, позволяет выделить антигенную субстанцию с аналогичными свойствами и характеристиками из суспензии корпускулярных/цельнорастворимых/растворимых антигенов других патогенных видов риккетсий, включенных в группу КПЛ.

Разработанная иммуноферментная диагностическая система может быть использована для диагностики риккетсиозов группы КПЛ и верификации диагнозов инфекционных заболеваний риккетсиальной этиологии от других инфекций со схожими клиническими проявлениями. Тест-система, помимо выявления специфических антител классов М и G к антигенам риккетсий группы КПЛ, представляет дополнительную информацию о наличии/отсутствии в сыворотке или плазме крови человека специфических антител класса А, что повышает надежность, информативность и чувствительность иммуноферментного анализа и способа диагностики риккетсиозов группы КПЛ с ее помощью.

Список литературы

1. Здродовский П.Ф., Голиневич Е.М. Учение о риккетсиях и риккетсиозах. Москва, «Медицина», 1972, 495 с.

2. ОФС.1.2.4.0006.15. Бактериальные эндотоксины.

3. ОФС.1.2.1.0023.15. Электрофорез в полиакриламидном геле.

4. Рудаков Н.В., Абрамова Н.В., Пеньевская Н.А., Самойленко И.Е., Шпынов С.Н., Решетникова Т.А. Способ лабораторной диагностики клещевого риккетсиоза с использованием иммуноферментного анализа для определения антител к антигену Rickettsia sibirica. Патент RU 2477860, приоритет от 13.08.2010 г.

5. K. Amano, M. Fujita, T. Suto. Chemical properties of lipopolysaccharides from spotted fever group rickettsiae and their common antigenicity with lipopolysaccharides from Proteus species. Infection of Immunology,1993, v. 61, №10, р. 4350-4355.

6. http://www.fullerlabs.com.

7. D. Jones, B. Anderson, J. Olson, C. Greene. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay for Detection of Human Immunoglobulin G to Lipopolysaccharide of Spotted Fever Group Rickettsiae. Journal of clinical microbiology, 1993, v. 31, №1, p. 138-141.

8. Teysseire N, Raoult D. Comparison of western immunoblotting and microimmunofluorescence for diagnosis of Mediterranean spotted fever. Journal of Clinical Microbiology, 1992, v. 30, №2, р. 455-460.

9. Е.И. Бондаренко, Л.Д. Щучинова, Д.И. Тимофеев и др. Выявление генетических маркеров возбудителей клещевых риккетсиозов в ПЦР с помощью наборов реагентов «РеалБест ДНК Rickettsia species» и «РеалБест ДНК Rickettsia sibirica/ Rickettsia heilongjiangensis». НОВОСТИ «Вектор-Бест», 2018, №1 (87).

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АВИ - аденовирусная инфекция

АПЛ - астраханская пятнистая лихорадка

ИФА - иммуноферментный анализ

K+ - положительный контрольный образец в составе тест-системы

K - - отрицательный контрольный образец в составе тест-системы

КПП - клещевая пятнистая лихорадка

КР - клещевой риккетсиоз

ЛАЛ (англ. LAL - сокр. Лизат амебоцитов Limulus) - тест на содержание бактериальных эндотоксинов

ЛПС - липополисахарид

ОП - оптическая плотность

ОПкрит - критическое (пороговое) значение оптической плотности

ПЦР - полимеразно-цепная реакция

РИФ - реакция иммунофлуоресценции

РНИФ - реакция непрямой иммунофлуоресценции

РРК - раствор для разведения конъюгатов

РРО - раствор для разведения образцов

РСК - реакция связывания комплемента

ТМБ - 3',5'-тетраметилбензидин (хромоген)

ФСР-Т - фосфатно-солевой раствор с твином 20.

Группа изобретений относится к области клинической лабораторной диагностики, биотехнологии и медицины. Раскрыт способ получения инактивированной растворимой очищенной белково-липополисахаридной антигенной субстанции Rickettsia sibirica для приготовления основного компонента тест-системы – иммуносорбента, заключающийся в том, что инактивированный лиофилизированный цельнорастворимый антиген Rickettsia sibirica ресуспендируют, далее суспензию антигена подвергают ультразвуковой обработке с последующим центрифугированием и отбирают супернатант, затем проводят эксклюзионную хроматографию супернатанта на колонке с хроматографическим сорбентом, после чего фракции оценивают на специфическую антигенную активность в ИФА и проводят дальнейшее объединение фракций первого пика и соседних с ним, которые продемонстрировали в ИФА наилучшее соотношение средних значений оптической плотности ОП положительных контрольных образцов к средним значениям оптической плотности ОП отрицательных контрольных образцов. Также раскрыты тест-система, включающая указанную выше инактивированную растворимую очищенную белково-липополисахаридную антигенную субстанцию Rickettsia sibirica, и способ диагностики риккетсиозов с использованием данной тест-системы. Группа изобретений обеспечивает повышение чувствительности, информативности и специфичности способа диагностики риккетсиозов, проводимого методом непрямого твердофазного ИФА. 3 н. и 1 з.п. ф-лы, 2 ил., 3 табл., 5 пр.

1. Способ получения инактивированной растворимой очищенной белково-липополисахаридной антигенной субстанции Rickettsia sibirica для приготовления основного компонента тест-системы – иммуносорбента, заключающийся в том, что инактивированный лиофилизированный цельнорастворимый антиген Rickettsia sibirica ресуспендируют в буфере состава 10mM трис-HCl и 0,5 M хлорида натрия, рН-7,4-7,6, содержащем 8 М мочевину, далее суспензию антигена подвергают ультразвуковой обработке при частоте 15-23 кГц в течение 15-30 минут с последующим центрифугированием при 10000 -12000g и отбирают супернатант, затем проводят эксклюзионную хроматографию супернатанта на колонке с хроматографическим сорбентом, после чего фракции оценивают на специфическую антигенную активность в ИФА с применением сыворотки или плазмы крови человека, содержащих и не содержащих специфические антитела к антигенам риккетсий группы клещевой пятнистой лихорадки КПЛ, и проводят дальнейшее объединение фракций первого пика и соседних с ним, которые продемонстрировали в ИФА наилучшее соотношение средних значений оптической плотности ОП положительных контрольных образцов сывороток или плазмы крови человека, содержащих антитела к антигенам риккетсий клещевой пятнистой лихорадки КПЛ, к средним значениям оптической плотности ОП отрицательных контрольных образцов, не содержащих антитела к антигенам риккетсий клещевой пятнистой лихорадки КПЛ, при этом остальные фракции, демонстрирующие в ИФА снижение оптической плотности ОП(+) по отношению к оптической плотности ОП(-) на 30% и более по сравнению со средним значением ОП(+) к ОП(-), вычисленным для фракций первого пика, исключают.

2. Иммуноферментная диагностическая тест-система для анализа сыворотки или плазмы крови человека и осуществления диагностики риккетсиозов группы клещевой пятнистой лихорадки, включающая: планшет для иммуноферментного анализа с адсорбированным в лунках иммуносорбентом, полученным на основе инактивированной растворимой очищенной белково-липополисахаридной антигенной субстанции, клещевой пятнистой лихорадки Rickettsia sibirica по п.1, с маркированными параллельными рядами лунок: для выявления специфических IgA - первый ряд, для выявления специфических IgМ – второй ряд, для выявления специфических IgG- третий ряд, три конъюгата: анти-IgA человека, анти-IgМ человека и анти-IgG человека, меченных пероксидазой хрена, кроме того, вспомогательные растворы: раствор для разведения образцов, раствор для разведения конъюгатов, хромоген 3′,5′–тетраметилбензидин ТМБ, стоп-реагент, концентрат фосфатно-солевового раствора с твином 20 - ФСР-Т, положительный и отрицательный контрольные образцы: К+ и К, где в качестве положительного и отрицательного контрольных образцов К+ и К используют сыворотку или плазму крови человека или пул сывороток или плазм крови человека, содержащих и соответственно не содержащих специфические антитела классов А, М, G к антигенам риккетсий группы клещевой пятнистой лихорадки КПЛ.

3. Иммуноферментная диагностическая тест-система по п. 2, в которой антигены риккетсий группы клещевой пятнистой лихорадки КПЛ – это, как минимум, Rickettsia conorii, Rickettsia sibirica, Rickettsia heilongjangensis.

4. Способ диагностики риккетсиозов группы клещевой пятнистой лихорадки КПЛ, в котором сыворотку или плазму крови пациента с подозрением на риккетсиоз, вызываемый возбудителем группы КПЛ исследуют на наличие специфических антител методом твердофазного иммуноферментного анализа ИФА, отличающийся тем, что проводят раздельное дифференциальное выявление антител классов М, G и А в сыворотке или плазме крови человека с использованием иммуноферментной диагностической тест-системы по п.2, в которой использован иммуносорбент, полученный на основе инактивированной растворимой очищенной белково-липополисахаридной антигенной субстанции Rickettsia sibirica по п.1, при этом в лунки параллельных рядов с адсорбированным иммуносорбентом вносят по 100 мкл в лунку разведения исследуемых образцов сыворотки или плазмы крови человека и контрольных образцов К+ и К-, приготовленных с применением раствора для разведения образцов: в начальных разведениях 1:10 для выявления специфических антител класса А - первый ряд лунок; 1:20 для выявления специфических антител класса M - второй ряд лунок; 1:40 для выявления специфических антител класса G - третий ряд лунок, затем проводят инкубирование разведенных исследуемых и контрольных образцов при 37 – 38 °C в течение 45 - 60 мин, иммуносорбент промывают рабочим раствором ФСР-Т 5-6 раз, вносят в соответствующие ряды лунок с иммуносорбентом и образцами по 100 мкл в лунку рабочие разведения конъюгатов анти-IgA человека, анти-IgМ человека и анти-IgG человека, меченных пероксидазой хрена, проводят инкубирование при 37 – 38 °C в течение 30 - 60 мин, иммуносорбент промывают ФСР-Т 5-6 раз, в каждую лунку иммуносорбента вносят по 100 мкл хромогена 3′,5′–тетраметилбензидин ТМБ и выдерживают 10 – 30 мин при комнатной температуре, защищая планшет от прямого света, далее ферментативную реакцию останавливают добавлением 50-100 мкл стоп-реагента и проводят спектрометрическое измерение оптической плотности ОП при длине волны 450 нм, раздельно вычисляют пороговое значение оптической плотности ОПкрит для каждого класса антител М, G и А по формуле:

ОПкрит = среднее значение ОП К- + 0,2,

где ОП К- – среднее значение оптической плотности в лунках соответствующих рядов с внесенным отрицательным контрольным образцом К-, при этом исследуемый образец содержит специфические антитела М, или G, или А, если его значение оптической плотности ОП превышает или равно ОП крит.