Способ получения антирезусной плазмы крови человека Российский патент 2024 года по МПК A61K35/16 A61K39/395 A61P7/00 

Изобретение относится к области производственной трансфузиологии, фармацевтической биотехнологии и может быть использовано для получения антирезусной плазмы для производства лекарственных препаратов антирезусного иммуноглобулина человека.

Иммунопрофилактика антирезусным иммуноглобулином осуществляется в целях уменьшения риска резус-иммунизации беременных женщин, заболеваемости новорожденных гемолитической болезнью и перинатальной смертности, а также при лечении первичной иммунной тромбоцитопении у пациентов с положительным резус-фактором [Оловникова Н.И., Николаева Т.Л., Эршлер М.А. Иммунопрофилактика резус-иммунизации: перспектива создания моноклонального иммуноглобулина для предупреждения гемолитической болезни новорожденных. Иммунология. 2018; 1 (39): 74-80; El-Habil M.K. Anti-D immunoglobulin versus immunoglobulin G for the treatment of acute immune thrombocytopenia in children: a 10-year retrospective study. Lancet. 2021; S25 (398): 25]. Для производства этого препарата используют плазму крови доноров, которая содержит антитела к D-антигену эритроцитов в титре 1:64 и выше [Приказ Минздрава России от 21.11.2022 N 750н "Об утверждении порядка иммунизации доноров для заготовки иммуноспецифической плазмы" (Зарегистрировано в Минюсте России 30.11.2022 N 71216]. Для получения такой плазмы из уровня техники известен способ иммунизации доноров D-положительными эритроцитами. Для достаточной продукции анти-D антител может быть проведено до 4 курсов иммунизации. Каждый курс включает в себя 3-4 внутривенных или внутримышечных инъекции эритроцитов подходящего фенотипа в объеме по 5-10 мл. При использовании такого способа получения антирезусной плазмы целевой показатель уровня антител оценивается в титрах [Приказ Минздрава России от 21.11.2022 N 750н «Об утверждении порядка иммунизации доноров для заготовки иммуноспецифической плазмы» (Зарегистрировано в Минюсте России 30.11.2022 N 71216].

Известно, что дозу препарата, необходимую для предотвращения резус-иммунизации, назначают, исходя из следующего соотношения: для нейтрализации 0,5 мл резус-положительных эритроцитов плода, попавших в кровоток матери, необходимо 50 международных единиц анти-D антител [Guideline on the clinical investigation of human anti-D Immunoglobulin for intravenous and/or intramuscular use: EMA CPMP/BPWG/575/99 Rev. 1]. То есть более информативным является выражение количества антител в препарате в международных единицах, что позволяет рассчитать эффективную дозу препарата. Соответственно и активность донорской плазмы, которая служит сырьем для производства антирезусного иммуноглобулина человека, целесообразно определять в указанных единицах.

Кроме того, нтирезусная плазма может быть получена от естественно иммунизированных лиц, например, резус-отрицательных женщин, аллоиммунизированных к D-антигену в результате беременности. Получение сырья без дополнительной антигенной стимуляции безопасно для донора и позволяет значительно снизить затраты, связанные с проведением иммунизации.

Описание сущности изобретения

В связи с тем, что существует потребность в решении вышеизложенной проблемы поставлена техническая задача разработать способ получения антирезусной плазмы от естественно иммунизированных лиц, который может быть использован для заготовки иммунного сырья для производства антирезусного иммуноглобулина человека и позволяет стандартизовать плазму по содержанию анти-D антител в международных единицах.

Техническим результатом заявленного изобретения является повышение эффективности иммунопрофилактики резус-иммунизации, более полное использование донорского ресурса и упрощение процедуры получения иммунного сырья за счет применения плазмы от естественно иммунизированных лиц.

Технический результат достигается за счет того, что способ получения антирезусной плазмы крови человека включает в себя

проведение поиска в доступной информационной системе трансфузиологии потенциальных доноров антирезусной плазмы с отрицательной резус-принадлежностью и отводенных от донаций по причине выявления в крови антиэритроцитарных антител;

формирование пула доноров с титром анти-D антител 1:64 и выше;

заготовку плазмы и определение в ней содержания анти-D антител в сравнении с эталоном с известным содержанием анти-D антител, выраженным в международных единицах, причем для определения содержания анти-D антител готовят последовательные 1,5-кратные разведения образцов плазмы, начиная с разведения в два раза ниже, чем титр антител, выявленный в крови доноров, и 1,5-кратные разведения эталона в диапазоне содержания анти-D антител от 0,002 до 0,020 МЕ/мл, а содержание анти-D антител в исследуемом образце определяют путем умножения количества анти-D антител в максимальном разведении эталона, при котором наблюдается агглютинация эритроцитов, на максимальное разведение исследуемого образца с наличием гемагглютинации.

При этом индивидуальные единицы плазмы крови доноров заготавливают методом автоматического плазмафереза в объеме в среднем 600 мл, или из дозы крови методом центрифугирования в объеме в среднем 250 мл.

Заявляемое изобретение разработано в ФГБУН КНИИГиПК ФМБА России в соответствии с планом научно-исследовательской работы на тему: «Разработка стандартного образца содержания антирезус Rh₀(D) антител для определения специфической (антирезусной) активности препаратов иммуноглобулина человека антирезус Rh_o(D)» (шифр: «Стандартные образцы-20», № гос. регистрации АААА-А20-120022090028-2 от 20.02.2020).

Способ осуществляется следующим образом:

Поиск потенциальных доноров проводят с помощью доступной информационной системы трансфузиологии. К параметрам поиска относятся: отрицательная резус-принадлежность и отвод от донаций по причине выявления антиэритроцитарных антител. Потенциальных доноров антирезусной плазмы направляют на иммуногематологическое обследование для определения титра анти-D антител. Плазму заготавливают методом автоматического афереза или из дозы крови от доноров с титром анти-D антител 1:64 и выше. В заготовленной плазме определяют содержание анти- D антител методом непрямой гемагглютинации с использованием эталона, аттестованного в международных единицах. При этом не требуется проведения предварительной иммунизации доноров резус-положительными эритроцитами человека. Полученная таким образом антирезусная плазма стандартизована по количеству анти-D антител в международных единицах, что способствует повышению качества выпускаемых отечественных препаратов антирезусного иммуноглобулина человека и повышению эффективности анти-D иммунопрофилактики.

Возможность осуществления заявленного способа раскрыта в следующих примерах.

Пример 1. Поиск потенциальных доноров антирезусной плазмы

Поиск потенциальных доноров может быть осуществлен с использованием автоматизированной информационной системы трансфузиологии (АИСТ) по заданным параметрам (отрицательная резус-принадлежность и отвод от донаций по причине выявления антиэритроцитарных антител). В плазме крови лиц, соответствующих заданным параметрам, определяют содержание анти-D антител в реакции непрямой гемагглютинации, например, с использованием гелевых карт ID Кумбс Анти-IgG и оборудования производства BioRad DiaMed GmbH, Швейцария.

За период январь 2015 г. - декабрь 2022 г. критериям поиска соответствовали 510 доноров. По результатам иммуногематологического исследования у 28 доноров в крови выявлены анти-D антитела в количестве 1:64 и выше. Таким образом, среди лиц, которые отведены от донорства по причине наличия в крови антиэритроцитарных антител, каждый 18-ый потенциально может стать донором антирезусной плазмы.

Пример демонстрирует возможность получения антирезусной плазмы от естественно иммунизированных к D-антигену лиц и повышение эффективности использования донорского ресурса за счет увеличения числа доноров, допущенных к донации, на 5,5%.

Пример 2. Заготовка антирезусной плазмы крови человека

После допуска донора к донации заготавливают плазму методом автоматического плазмафереза, при этом объем заготовленного таким образом компонента составляет в среднем 600 мл, или из дозы крови методом центрифугирования, объем компонента - в среднем 250 мл. Заготовленную плазму замораживают в быстрозамораживателе при температуре минус 80°С в течение не менее 30 минут и хранят при температуре не ниже минус 25°С для сохранения функциональной активности и биологической полноценности белков плазмы крови.

Пример демонстрирует возможность получения индивидуальных единиц антирезусной плазмы от естественно иммунизированных лиц в объеме в среднем 600 мл или 250 мл.

Пример 3. Определение диапазона разведения образцов донорской плазмы

Исследуемые образцы:

А - образец донорской плазмы с титром анти-D антител 1:64;

Б - образец донорской плазмы с титром анти-D антител 1:512;

B - образец донорской плазмы с титром анти-D антител 1:2560.

Образцы предварительно разводят фосфатным буферным раствором 0,01 М, рН 7,4, содержащим 2 г/л бычьего сывороточного альбумина. Предварительное разведение выбирают в два раза ниже, чем титр анти-D антител, выявленный в крови донора: образец А - 1:32, образец Б - 1:256, образец В -1:1280. Последующие 1,5-кратные разведения готовят в лунках U- или V-образного 96-луночного планшета. В первый ряд лунок переносят по 225 мкл приготовленных разведений, в четыре следующих ряда - по 150 мкл фосфатного буферного раствора. Содержимое лунок тщательно перемешивают и последовательно переносят по 75 мкл смеси. Из лунок крайнего (пятого) ряда 75 мкл смеси удаляют в емкость с дезинфицирующим раствором.

Проводят реакцию гемагглютинации в геле, например, с использованием гелевых карт ID Кумбс Анти-IgG и оборудования производства BioRad DiaMed GmbH, Швейцария. В промаркированные микропробирки гелевой карты вносят по 25 мкл приготовленных разведений исследуемых образцов и по 50 мкл 0,8% суспензии папаинизированных эритроцитов человека предпочтительно с фенотипом 0R₂R₂ (например, входящих в набор готовых эритроцитарных реагентов ID-DiaCell IP-IIP-IIIP производства BioRad DiaMed GmbH, Швейцария). Для контроля специфичности используют эритроциты с фенотипом 0rr (например, входящие в набор готовых эритроцитарных реагентов ID-DiaCell IP-IIP-IIIP производства BioRad DiaMed GmbH, Швейцария) и исследуемый образец в наименьшем разведении. Карты термостатируют в инкубаторе в течение 15 минут при (37 ± 1)°С, по окончании инкубации помещают в центрифугу для гелевых карт и проводят центрифугирование в течение 10 минут при скорости 1175 об/мин.

Учитывают результат реакции. Результат реакции учитывают, если в микропробирках с эритроцитами с фенотипом 0rr гемагглютинация отсутствует (контроль специфичности). Регистрируют степень агглютинации в микропробирках и максимальное разведение образца, при котором заметна гемагглютинация любой интенсивности. Результаты представлены в таблице 1. Согласно представленным данным максимальное разведение образцов, при котором наблюдается гемагглютинация, соответствует 2 и 3 микропробиркам гелевой карты. Специфичность подтверждена отсутствием гемагглютинации в пробах с эритроцитами с фенотипом 0rr (микропробирка № 6).

Пример демонстрирует возможность регистрации результата реакции при использовании 1,5-кратных разведений образцов плазмы, начиная с разведения в два раза ниже, чем титр анти-D антител, выявленный в крови доноров.

Пример 4. Определение диапазона разведения эталона

В качестве эталона, аттестованного в международных единицах, используют, например, 3-ий международный стандартный образец (МСО) анти-D иммуноглобулина c активностью 297 МЕ/мл (3nd WHO International Standard for anti-D Immunoglobulin, code: 16/332, производства NIBSC, Великобритания).

МСО предварительно разводят фосфатным буферным раствором 0,01 М, рН 7,4, содержащим 2 г/л бычьего сывороточного альбумина, до содержания анти-D антител 0,200 МЕ/мл (1), 0,020 МЕ/мл (2), 0,015 МЕ/мл (3), 0,010 МЕ/мл (4), 0,005 МЕ/мл (5). Последующие 1,5-кратные разведения готовят в лунках U- или V-образного 96-луночного планшета. В первый ряд лунок переносят по 225 мкл приготовленных разведений МСО (1) - (5), в четыре следующих ряда - по 150 мкл фосфатного буферного раствора. Содержимое лунок тщательно перемешивают и последовательно переносят по 75 мкл смеси. Из лунок крайнего (пятого) ряда 75 мкл смеси удаляют в емкость с дезинфицирующим раствором.

Проводят реакцию гемагглютинации в геле, например, с использованием гелевых карт ID Кумбс Анти-IgG и оборудования производства BioRad DiaMed GmbH, Швейцария. В промаркированные микропробирки гелевой карты вносят в дублях по 25 мкл приготовленных разведений МСО и по 50 мкл 0,8% суспензии папаинизированных эритроцитов человека предпочтительно с фенотипом 0R₂R₂ (например, входящих в набор готовых эритроцитарных реагентов ID-DiaCell IP-IIP-IIIP производства BioRad DiaMed GmbH, Швейцария). Для контроля специфичности используют эритроциты с фенотипом 0rr (например, входящие в набор готовых эритроцитарных реагентов ID-DiaCell IP-IIP-IIIP производства BioRad DiaMed GmbH, Швейцария) и МСО в наименьшем разведении. Карты термостатируют в инкубаторе в течение 15 минут при температуре от (37 ± 1)°С, по окончании инкубации помещают в центрифугу для гелевых карт и проводят центрифугирование в течение 10 минут при скорости 1175 об/мин.

Учитывают результат реакции. Результат реакции учитывают, если в микропробирках с эритроцитами с фенотипом 0rr агглютинация отсутствует (контроль специфичности). Регистрируют степень агглютинации в микропробирках и максимальное разведение МСО, при котором наблюдается гемагглютинация. Результаты представлены в таблице 2. Согласно представленным данным в первом ряду разведений (от 0,200 до 0,040 МЕ/мл) во всех микропропробирках отмечено наличие гемагглютинация. В этом случае для определения максимального разведения необходимо тестировать МСО в больших разбавлениях. В пятом ряду разведений (от 0,0050 до 0,0010 МЕ/мл), напротив, отмечено отсутствие агглютинации эритроцитов. Для определения максимального разведения, дающего гемагглютинацию, необходимо тестировать МСО в меньших разведениях.

Диапазон разведений МСО, при котором может быть определено максимальное разведение, соответствует рядам:

от 0,020 до 0,004 МЕ/мл (2);

от 0,015 до 0,003 МЕ/мл (3);

от 0,010 до 0,002 МЕ/мл (4),

Значения максимального разведения составляют 0,006, 0,007 и 0,007 МЕ/мл. Специфичность подтверждена отсутствием гемагглютинации во всех пробах с эритроцитами с фенотипом 0rr (микропробирка № 6).

Пример демонстрирует возможность регистрации результата реакции при использовании 1,5-кратных разведений эталона в диапазоне содержания анти-D антител от 0,002 до 0,020 МЕ/мл.

Пример 5. Определение содержания анти-D антител в антирезусной плазме в международных единицах

Исследуемые образцы

А - образец донорской плазмы с титром анти-D антител 1:64;

Б - образец донорской плазмы с титром анти-D антител 1:128;

B - образец донорской плазмы с титром анти-D антител 1:256;

Г - образец донорской плазмы с титром анти-D антител 1:512;

Д - образец донорской плазмы с титром анти-D антител 1:640;

Е - образец донорской плазмы с титром анти-D антител 1:2560;

Содержание анти-D антител в образцах донорской плазмы определяют в реакции непрямой гемагглютинации в сравнении с эталоном, аттестованным в международных единицах, например, с 3-им международным стандартным образцом (МСО) анти-D иммуноглобулина c активностью 297 МЕ/мл (3nd WHO International Standard for anti-D Immunoglobulin, code: 16/332 производства NIBSC, Великобритания).

Для приготовления разведений используют фосфатный буферный раствора 0,01 М, рН 7,4, содержащий 2 г/л бычьего сывороточного альбумина.

В микроцентрифужных пробирках предварительно разводят исследуемые образцы плазмы и МСО. При приготовлении предварительного разведения образцов плазмы ориентируются на титр анти-D антител, выявленный в крови донора: готовят разведение в два раза ниже, чем титр анти-D антител по примеру 3. МСО разводят до содержания анти-D антител в диапазоне от 0,002 до 0,020 МЕ/мл по примеру 4. Готовят предварительное разведение МСО, например, в 20000 раз до ожидаемого содержания анти-D антител 0,015 МЕ/мл.

Последующие разведения готовят в лунках U- или V-образного 96-луночного планшета. В первый ряд лунок переносят по 225 мкл приготовленных разведений, в четыре следующих ряда - по 150 мкл фосфатного буферного раствора 0,01 М, рН 7,4, содержащего 2 г/л бычьего сывороточного альбумина. Содержимое лунок тщательно перемешивают и последовательно переносят по 75 мкл смеси. Из лунок крайнего (пятого) ряда 75 мкл смеси удаляют в емкость с дезинфицирующим раствором.

В промаркированные микропробирки гелевой карты вносят в дублях по 25 мкл приготовленных разведений исследуемых образцов и МСО и по 50 мкл 0,8 % суспензии папаинизированных эритроцитов человека предпочтительно с фенотипом 0R₂R₂ (например, входящих в набор готовых эритроцитарных реагентов ID-DiaCell IP-IIP-IIIP производства BioRad DiaMed GmbH, Швейцария). Для контроля специфичности исследуемый образец и МСО в наименьших разведениях инкубируют с эритроцитами с фенотипом 0rr (например, входящих в набор готовых эритроцитарных реагентов ID-DiaCell IP-IIP-IIIP производства BioRad DiaMed GmbH, Швейцария) в течение 15 минут при температуре от (37 ± 1)°С, по окончании термостатирования помещают в центрифугу для гелевых карт и проводят центрифугирование в течение 10 минут при скорости 1175 об/мин.

Учитывают результат реакции. Результат реакции учитывают, если в микропробирках с эритроцитами с фенотипом 0rr гемагглютинация отсутствует (контроль специфичности). Определяют максимальное разведение образца, при котором заметна гемагглютинация любой интенсивности.

Содержание анти-D антител рассчитывают по отношению к МСО с использованием формулы:

- содержание анти-D антител в испытуемом образце, МЕ/мл;

- содержание анти-D антител в максимальном разведение МСО, при котором наблюдается гемагглютинация любой интенсивности, МЕ/мл;

- величина, обратная максимальному разведению исследуемого образца, при котором наблюдается гемагглютинация любой интенсивности.

Результаты определения анти-D антител согласно вышеизложенному примеру приведены в таблице 3. Рассчитанное по формуле (1) содержание анти-D антител в образцах донорской плазмы составляет от 0,504 до 13,44 МЕ/мл.

Пример демонстрирует возможность стандартизации антирезусной плазмы по содержанию анти-D антител в международных единицах.

Представленные примеры не ограничивают объем притязаний настоящего изобретения и служат только для цели иллюстрации и раскрытия заявленного способа.

Промышленная применимость

Все приведенные примеры подтверждают возможность осуществления заявленного способа с целью получения антирезусной плазмы от естественно иммунизированных лиц и ее стандартизации по содержанию анти-D антител в международных единицах.

Поставленная техническая задача, а именно разработка способа получения антирезусной плазмы, который может быть использован в производстве антирезусного иммуноглобулина человека и который позволяет получать сырье от естественно иммунизированных лиц, стандартизованное по содержанию анти-D антител в международных единицах, достигнута, что подтверждается приведенными примерами.

Применение поставленного технического решения в области производственной трансфузиологии, фармацевтической биотехнологии является эффективным и может быть применено для получения антирезусной плазмы для производства лекарственных препаратов антирезусного иммуноглобулина человека.

Изобретение относится к области производственной трансфузиологии, фармацевтической биотехнологии и может быть использовано для получения антирезусной плазмы для производства лекарственных препаратов антирезусного иммуноглобулина человека. Способ включает в себя поиск потенциальных доноров антирезусной плазмы с помощью доступной информационной системы трансфузиологии по заданным параметрам (отрицательная резус-принадлежность и отвод от донаций по причине выявления в крови антиэритроцитарных антител); формирование пула доноров с титром анти-D антител 1:64 и выше; заготовку плазмы методом автоматического плазмафереза объемом в среднем 600 мл или из дозы крови методом центрифугирования объемом в среднем 250 мл; определение содержания анти-D антител методом непрямой гемагглютинации в сравнении с эталоном с известным содержанием анти-D антител. Для этого готовят последовательные 1,5-кратные разведения образцов плазмы, начиная с разведения в два раза ниже, чем титр антител, выявленный в крови донора, и 1,5-кратные разведения эталона в диапазоне содержания анти-D антител от 0,002 до 0,020 МЕ/мл. Содержание анти-D антител в исследуемом образце определяют путем умножения количества анти-D антител в максимальном разведении эталона, при котором наблюдается агглютинация эритроцитов, на максимальное разведение исследуемого образца с наличием гемагглютинации. Использование изобретения позволяет повысить эффективность использования донорской плазмы, снизить трудозатраты, связанные с проведением технологически сложной процедуры иммунизации доноров эритроцитами человека, за счет использования плазмы крови доноров естественно иммунизированных к D-антигену, и стандартизовать донорскую плазму по содержанию анти-D антител в международных единицах. 1 з.п. ф-лы, 3 табл., 5 пр.

1. Способ получения антирезусной плазмы крови человека, заключающийся в том, что

проводят поиск потенциальных доноров антирезусной плазмы в доступной информационной системе трансфузиологии по отрицательной резус-принадлежности и отводу от донаций по причине выявления антиэритроцитарных антител,

формируют пул доноров с титром анти-D антител 1:64 и выше,

заготавливают плазму и определяют в ней содержание анти-D антител в сравнении с эталоном с известным содержанием анти-D антител, выраженным в международных единицах,

отличающийся использованием плазмы крови лиц, естественно иммунизированных к D-антигену, и стандартизацией антирезусной плазмы по содержанию анти-D антител в международных единицах, причем для определения содержания анти-D антител готовят последовательные 1,5-кратные разведения образцов плазмы, начиная с разведения в два раза ниже, чем титр антител, выявленный в крови доноров, и 1,5-кратные разведения эталона в диапазоне содержания анти-D антител от 0,002 до 0,020 МЕ/мл, а содержание анти-D антител в исследуемом образце определяют путем умножения количества анти-D антител в максимальном разведении эталона, при котором наблюдается агглютинация эритроцитов, на максимальное разведение исследуемого образца с наличием гемагглютинации.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что индивидуальные единицы плазмы крови доноров заготавливают методом автоматического плазмафереза в объеме в среднем 600 мл или из дозы крови методом центрифугирования в объеме в среднем 250 мл.