МОДЕЛЬ ПРОГРЕССИРУЮЩЕЙ ОССИФИЦИРУЮЩЕЙ ФИБРОДИСПЛАЗИИ НА ГРЫЗУНАХ Российский патент 2023 года по МПК A01K67/27 C12N15/85 

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

[0001] Настоящая заявка испрашивает приоритет на основании предварительной заявки на патент США №62/684582, поданной 13 июня 2018 года, и предварительной заявки на патент США №62/828532, поданной 3 апреля 2019 года, полное содержание которых включено в данный документ посредством ссылки.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0002] Настоящее изобретение относится к генетически модифицированным животным из отряда грызунов и моделям заболеваний человека на грызунах. Более конкретно, настоящее изобретение относится к генетически модифицированным грызунам, геном которых содержит модифицированный ген Acvr1 грызуна; грызунам, проявляющим такой фенотипический признак прогрессирующей оссифицирующей фибродисплазии (FOP), как образование эктопической костной ткани; выделенным тканям и клеткам грызунов, геном которых содержит модифицированный ген Acvr1 грызуна; выделенным нуклеиновым кислотам, содержащим модифицированный ген Acvr1 грызуна; композициям и способам получения генетически модифицированных грызунов; способам скрещивания и способам применения генетически модифицированных грызунов.

ВКЛЮЧЕНИЕ ПЕРЕЧНЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ ПОСРЕДСТВОМ ССЫЛКИ

[0003] Перечень последовательностей в виде текстового файла ASCII под названием 36190_10461US01_ _SequenceListing.txt, размером 4 КБ, созданный 6 июня 2019 года и поданный в Ведомство по патентам и товарным знакам США через EFS-Web, включен в данный документ посредством ссылки.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[0004] В тексте описания упоминаются различные публикации, включающие патенты, патентные заявки, опубликованные патентные заявки, номера доступа, технические статьи и научные статьи. Каждая из упоминаемых публикаций включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте и для всех целей.

[0005] Acrv1 представляет собой рецептор костных морфогенетических белков (BMP) типа I. Определенные мутации в гене ACVR1 человека, включающие мутации, приводящие к аминокислотной модификации R206H или R258G, тесно связаны с прогрессирующей оссифицирующей фибродисплазией (FOP) (см., например, публикацию заявки на патент США №2009/0253132; Pignolo, R. J. (2011) Orphanet Journal of Rare Diseases, 6:80,1-6; и Kaplan et al., Am J Med Genet A. 2015; 167(10): 2265-2271). У химерных мышей, несущих мутацию R206H в Acvr1, развивается FOP-подобный фенотип (см., например, Chakkalakal et al. (2012) J. Bone and Mineral Res. 27:1746-1756). Определенные мутации в гене Acvr1, например, результатом которых является вариант белка Acvr1 c R206H, являются перинатальными летальными у мышей и создают проблему при передаче нокин-гена, содержащего мутацию, через зародышевую линию грызуна.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0006] Настоящее изобретение направлено на генетически модифицированных животных из отряда грызунов, зародышевая линия которых содержит последовательность нуклеиновой кислоты, содержащей модифицированный ген Acvr1 грызуна.

[0007] Предусмотрены генетически модифицированные животные из отряда грызунов, зародышевая линия которых содержит последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую модифицированный ген Acvr1 грызуна, где модифицированный ген Acvr1 грызуна содержит условное изменение гена Acvr1 грызуна, где упомянутое изменение делает животное из отряда грызунов предрасположенным к образованию эктопической костной ткани.

[0008] Предусмотрены генетически модифицированные животные из отряда грызунов, содержащие в своей зародышевой линии последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую модифицированный ген Acvr1 грызуна, содержащий условный измененный экзон Acvr1, где индукция экспрессии условного измененного экзона Acvr1 придает животному из отряда грызунов предрасположенность к образованию эктопической костной ткани. В одном варианте осуществления измененный экзон Acvr1 является экзоном 7. В конкретном варианте осуществления измененный экзон 7 Acvr1 содержит изменение, результатом которого является аминокислотная вариация R258G в белке Acvr1.

[0009] Предусмотрены животные из отряда грызунов, которые при определенных условиях экспрессируют измененный аллель Acvr1. В различных аспектах измененный аллель Acvr1 представляет собой аллель, который придает патологический фенотип животному из отряда грызунов, экспрессирующему данный аллель. В различных аспектах животные из отряда грызунов содержат измененный экзон аллеля Acvr1, фланкированный выше и ниже сайтами распознавания сайт-специфической рекомбиназы (SRRS), и животное из отряда грызунов содержит рекомбиназу, распознающую SRRS, где при этом активность рекомбиназы является индуцируемой.

[001] Предусмотрены животные из отряда грызунов, которые содержат модификацию гена Acvr1 грызуна, которая обуславливает (в одном варианте осуществления у гетерозиготного животного; в одном варианте осуществления у гомозиготного животного) то, что животное из отряда грызунов становится предрасположенным к образованию эктопической костной ткани, способствует этому или обеспечивает это.

[0011] Предусмотрены животные из отряда грызунов, которые содержат условное изменение гена Acvr1 грызуна, где измененный аллель Acvr1 не экспрессируется in utero и не экспрессируется в перинатальном периоде, и где механизм экспрессии измененного аллеля Acvr1 у животных из отряда грызунов имеет обусловленный характер, где обусловленная экспрессия индуцируется посредством введения животному из отряда грызунов соединения, представляющего интерес.

[0012] В одном аспекте предусмотрено животное из отряда грызунов, геном которого содержит модифицированный локус Acvr1 грызуна, содержащий измененный экзон Acvr1 в антисмысловой ориентации, где измененный экзон Acvr1 фланкирован выше и ниже с помощью SRRS, ориентированных таким образом, чтобы направлять инверсию при воздействии рекомбиназы, распознающей SRRS.

[0013] В некоторых вариантах осуществления предусмотрено животное из отряда грызунов, геном которого содержит модифицированный ген Acvr1 грызуна в пределах эндогенного локуса Acvr1 грызуна, модифицированный ген Acvr1 грызуна, содержащий функционирующий экзон 7 Acvr1 в смысловой ориентации и фланкированный выше и ниже первой парой SRRS, и измененный экзон 7 Acvr1 в антисмысловой ориентации и фланкированный выше и ниже второй парой SRRS, где первая и вторая пары SRRS ориентированы так, чтобы рекомбиназа могла осуществить инверсию измененного экзона 7 Acvr1 с обеспечением его расположения в смысловой ориентации и осуществить делецию функционирующего экзона 7 Acvr1 с получением в результате измененного аллеля Acvr1 (т. е. аллеля Acvr1, содержащего изменение). В различных вариантах осуществления остальные экзоны модифицированного гена Acvr1 грызуна, за исключением экзона 7, представляют собой функционирующие экзоны эндогенного гена Acvr1 грызуна, например экзоны грызуна дикого типа, присутствующие в эндогенном локусе Acvr1 грызуна. В различных вариантах осуществления измененный аллель Acvr1 является аллелем, который придает патологический фенотип животному из отряда грызунов, экспрессирующему данный аллель.

[0014] В некоторых вариантах осуществления в данном документе предусмотрен генетически модифицированный грызун, геном которого содержит модифицированный ген Acvr1 грызуна в пределах эндогенного локуса Acvr1 грызуна, где модифицированный ген Acvr1 грызуна содержит (a) функционирующий экзон 7 Acvr1, кодирующий R258 в смысловой ориентации, фланкированный выше и ниже первой парой SRRS; и (b) измененный экзон 7 Acvr1 грызуна, кодирующий вариацию R258G в антисмысловой ориентации, фланкированный второй парой SRRS, которые отличаются от первой пары SRRS; где первая и вторая пары SRRS ориентированы таким образом, чтобы рекомбиназа могла осуществить инверсию измененного экзона 7 Acvr1 грызуна с обеспечением его расположения в смысловой ориентации, осуществить делецию функционирующего экзона 7 Acvr1 и обеспечить экспрессию измененного аллеля Acvr1, содержащего измененный экзон 7 Acvr1 грызуна. В некоторых вариантах осуществления экспрессия измененного аллеля Acvr1, содержащего измененный экзон 7 Acvr1 грызуна, приводит в результате к образованию эктопической костной ткани. В различных вариантах осуществления остальные экзоны модифицированного гена Acvr1 грызуна, за исключением экзона 7, представляют собой функционирующие экзоны эндогенного гена Acvr1 грызуна, например, экзоны грызуна дикого типа, присутствующие в эндогенном локусе Acvr1 грызуна.

[0015] В некоторых вариантах осуществления функционирующий экзон 7 Acvr1, кодирующий R258, представляет собой встречающийся в природе функционирующий экзон 7 Acvr1 грызуна, т. е. экзон 7 Acvr1 грызуна дикого типа. В некоторых вариантах осуществления функционирующий экзон 7 Acvr1, кодирующий R258, представляет собой по сути человеческий экзон 7 ACVR1. В некоторых вариантах осуществления по сути человеческий экзон 7 ACVR1 представляет собой встречающийся в природе функционирующий экзон 7 ACVR1 человека, т. е. экзон 7 ACVR1 человека дикого типа. В других вариантах осуществления по сути человеческий экзон 7 ACVR1 отличается от экзона 7 ACVR1 человека дикого типа по меньшей мере одним нуклеотидом (т. е. один или более нуклеотидов) и характеризуется сниженной степенью идентичности последовательности с измененным экзоном 7 Acvr1 грызуна по сравнению со степенью идентичности последовательности между экзоном 7 ACVR1 человека дикого типа и измененным экзоном 7 Acvr1 грызуна. В некоторых вариантах осуществления по сути человеческий экзон 7 ACVR1 кодирует те же аминокислоты, что и экзон 7 ACVR1 человека дикого типа.

[0016] В некоторых вариантах осуществления первая пара SRRS включает первый SRRS и второй SRRS, где первый и второй SRRS совместимы друг с другом и ориентированы таким образом, чтобы направлять инверсию. В некоторых вариантах осуществления вторая пара SRRS включает третий SRRS и четвертый SRRS, где третий и четвертый SRRS совместимы друг с другом и ориентированы таким образом, чтобы направлять инверсию, но не совместимы с первым или вторым SRRS.

[0017] В некоторых вариантах осуществления предусмотрен генетически модифицированный грызун, который содержит модифицированный ген Acvr1 грызуна в локусе Acvr1 в зародышевой линии грызуна, где модифицированный ген Acvr1 грызуна Acvr1 содержит, в соответствии с направлением транскрипции гена Acvr1, (i) функционирующий экзон 7 (например, по сути человеческий экзон 7) в смысловой ориентации и (ii) измененный экзон 7 в антисмысловой ориентации и содержит первую пару SRRS, состоящую из первого SRRS (SRRS1) и второго SRRS (SRRS2), а также вторую пару SRRS, состоящую из третьего SRRS (SRRS3) и четвертого SRRS (SRRS4); где SRRS1 совместим с SRRS2, SRRS3 совместим с SRRS4, однако ни SRRS1, ни SRRS2 не совместимы с SRRS3 или SRRS4, где SRRS1 расположен выше функционирующего экзона 7, SRRS2 расположен непосредственно ниже (в соответствии с направлением транскрипции гена Acvr1) антисмыслового измененного экзона 7, где SRRS1 и SRRS2 ориентированы таким образом, чтобы направлять инверсию; где SRRS3 размещен между функционирующим экзоном 7 и измененным антисмысловым экзоном 7, и SRRS4 расположен ниже (в соответствии с направлением ориентации гена Acvr1) SRRS2, где SRRS3 и SRRS4 ориентированы таким образом, чтобы направлять инверсию. В некоторых вариантах осуществления каждый из SRRS 1-4 распознается одной и той же рекомбиназой, такой как Cre.

[0018] В некоторых вариантах осуществления первая пара SRRS представляет собой пару сайтов Lox2372, и вторая пара SRRS представляет собой пару сайтов LoxP. В других вариантах осуществления первая пара SRRS представляет собой пару сайтов LoxP, и вторая пара SRRS представляет собой пару сайтов Lox2372.

[0019] В некоторых вариантах осуществления генетически модифицированное животное из отряда грызунов дополнительно содержит индуцируемую рекомбиназу, которая распознает SRRS и способна осуществить инверсию антисмыслового измененного экзона Acvr1 с обеспечением его расположения в смысловой ориентации. В одном варианте осуществления ген, кодирующий индуцируемую рекомбиназу, находится в зародышевой линии грызуна, например интегрирован в эндогенный локус ROSA26 грызуна.

[0020] Индуцируемость рекомбиназы может быть достигнута на уровне транскрипции (экспрессии гена) или на уровне активности белка. В некоторых вариантах осуществления экспрессия гена рекомбиназы является индуцируемой и/или регулируемой в процессе развития и/или специфичной по отношению к определенным типам тканей или клеток. В других вариантах осуществления экспрессия гена рекомбиназы является конститутивной, и активность рекомбиназы является индуцируемой.

[0021] В некоторых вариантах осуществления рекомбиназа представляет собой Cre. В некоторых вариантах осуществления SRRS представляют собой сайты lox или их варианты, распознаваемые Cre. В некоторых вариантах осуществления рекомбиназа (например, Cre) слита с лигандсвязывающим доменом, восприимчивым к связыванию лигандом. В некоторых вариантах осуществления рекомбиназа (например, Cre) слита с лигандсвязывающим доменом, который является лигандсвязывающим доменом рецептора, такого как стероидный рецептор, глюкокортикоидный рецептор, ретиноидный рецептор, тиреоидный рецептор или эстрогеновый рецептор (ER), или который получен из лигандсвязывающего домена рецептора. В некоторых вариантах осуществления Cre является слитой с лигандсвязывающим доменом ER, содержащим мутации T2 (в данном документе она называется Cre-ER^T2). Слитый белок Cre-ER^T2 является восприимчивым к (т. е. активируется посредством) связыванию лигандом, например тамоксифеном или его функциональными аналогами/производными. В одном варианте осуществления ген, кодирующий Cre-ER^T2, присутствует в локусе ROSA26 генетически модифицированного грызуна.

[0022] В некоторых вариантах осуществления предусмотрен мутантный грызун, полученный от генетически модифицированного грызуна, описанного выше (т. е. полученный от генетически модифицированного грызуна, содержащего модифицированный ген Acvr1 грызуна, который содержит условное изменение Acvr1 в антисмысловой ориентации), где мутантный грызун обладает геномом, содержащим изменение в Acvr1 в смысловой ориентации, и где ген Acvr1, содержащий изменение, экспрессируется у мутантного грызуна, что в некоторых вариантах осуществления приводит в результате к образованию эктопической костной ткани.

[0023] В одном варианте осуществления генетически модифицированный грызун представляет собой мышь, обладающую генотипом Acvr1^{[R258G]FlEx/+}; Gt(ROSA26)Sor^CreERt2/+.

[0024] В некоторых вариантах осуществления предусмотрен генетически модифицированный грызун, который экспрессирует аллель Acvr1, содержащий функционирующий экзон 7 Acvr1 (например, in utero и в перинатальный период), где при воздействии рекомбиназы на генетически модифицированного грызуна грызун экспрессирует вариант белка Acvr1, содержащий аминокислотную вариацию R258G.

[0025] В некоторых вариантах осуществления предусмотрена взрослая особь грызуна, которая экспрессирует продукт гена Acvr1, характеризующийся наличием вариации R258G, где по меньшей мере 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% или 99% клеток грызуна содержат измененный ген Acvr1, кодирующий вариацию R258G. В других вариантах осуществления предусмотрена взрослая особь грызуна, в которой экспрессируется продукт гена Acvr1, характеризующийся наличием вариации R258G в определенных типах тканей или клеток.

[0026] В некоторых вариантах осуществления предусмотрен генетически модифицированный грызун, где данный грызун содержит модифицированный локус Acvr1 грызуна в его зародышевой линии, с которого под воздействием рекомбиназы экспрессируется белок Acvr1, содержащий вариацию R258G.

[0027] В некоторых вариантах осуществления предусмотрен грызун, в котором экспрессируется вариант белка, содержащий вариацию R258G, где данный грызун является нехимерным (т. е. все клетки грызуна экспрессируют данный вариантный белок). В некоторых вариантах осуществления предусмотрена взрослая особь грызуна, в которой экспрессируется вариант белка, содержащий вариацию R258G, где по меньшей мере 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% или 99% клеток грызуна экспрессируют данный вариант белка.

[0028] В некоторых вариантах осуществления предусмотрен грызун, в котором экспрессируется вариант белка из модифицированного локуса Acvr1 грызуна в зародышевой линии грызуна, где все Acvr1-экспрессирующие клетки грызуна содержат модифицированный ген Acvr1 грызуна, который кодирует белок Acvr1, содержащий вариацию R258G. В одном варианте осуществления все зародышевые клетки грызуна содержат модифицированный локус Acrv1 грызуна, содержащий условную генетическую модификацию, кодирующую белок Acvr1 с вариацией R258G.

[0029] В некоторых вариантах осуществления генетически модифицированный грызун является гетерозиготным по генетический модификации, т. е. по модифицированному гену Acvr1 грызуна, содержащему условное изменение. В некоторых вариантах осуществления грызун является гомозиготным по генетический модификации.

[0030] В различных вариантах осуществления генетически модифицированный грызун выбран из группы, состоящей из мыши, крысы и хомяка. В некоторых конкретных вариантах осуществления грызун представляет собой мышь. В некоторых конкретных вариантах осуществления грызун представляет собой крысу.

[0031] В другом аспекте в данном документе раскрыта нуклеиновая кислота, содержащая модифицированный ген Acvr1 грызуна, описанный в данном документе.

[0032] В некоторых вариантах осуществления модифицированный ген Acvr1 грызуна в нуклеиновой кислоте содержит функционирующий экзон 7 Acvr1 в смысловой ориентации, фланкированный выше и ниже первой парой SRRS, и измененный экзон 7 Acvr1 в антисмысловой ориентации, фланкированный выше и ниже второй парой SRRS, где первая и вторая пары SRRS ориентированы таким образом, чтобы рекомбиназа могла осуществить инверсию измененного экзона 7 Acvr1 с обеспечением его расположения в смысловой ориентации и осуществить делецию функционирующего экзона 7 Acvr1. В различных вариантах осуществления остальные экзоны модифицированного гена Acvr1 грызуна, за исключением экзона 7, представляют собой функционирующие экзоны гена Acvr1 грызуна, например, экзоны дикого типа эндогенного гена Acvr1 грызуна.

[0033] В некоторых вариантах осуществления модифицированный ген Acvr1 грызуна в нуклеиновой кислоте содержит (a) функционирующий экзон 7 Acvr1, кодирующий R258 в смысловой ориентации, фланкированный выше и ниже первой парой SRRS, и (b) измененный экзон 7 Acvr1 грызуна, кодирующий вариацию R258G в антисмысловой ориентации, фланкированный второй парой SRRS, которые отличаются от первой пары SRRS; где первая и вторая пары SRRS ориентированы таким образом, чтобы рекомбиназа могла осуществить инверсию измененного экзона 7 Acvr1 грызуна с обеспечением его расположения в смысловой ориентации, осуществить делецию функционирующего экзона 7 Acvr1 и обеспечить экспрессию измененного аллеля Acvr1, содержащего измененный экзон 7 Acvr1 грызуна. В некоторых вариантах осуществления экспрессия измененного аллеля Acvr1, содержащего измененный экзон 7 Acvr1 грызуна, приводит в результате к образованию эктопической костной ткани. В различных вариантах осуществления остальные экзоны модифицированного гена Acvr1 грызуна, за исключением экзона 7, представляют собой функционирующие экзоны гена Acvr1 грызуна, например экзоны дикого типа гена Acvr1 грызуна.

[0034] В некоторых вариантах осуществления функционирующий экзон 7 Acvr1, кодирующий R258, представляет собой экзон 7 Acvr1 грызуна дикого типа. В некоторых вариантах осуществления функционирующий экзон 7 Acvr1, кодирующий R258, представляет собой по сути человеческий экзон 7 ACVR1. В некоторых вариантах осуществления по сути человеческий экзон 7 ACVR1 представляет собой экзон 7 ACVR1 человека дикого типа. В других вариантах осуществления по сути человеческий экзон 7 ACVR1 отличается от экзона 7 ACVR1 человека дикого типа по меньшей мере одним нуклеотидом и характеризуется сниженной степенью идентичности последовательности с измененным экзоном 7 Acvr1 грызуна по сравнению со степенью идентичности последовательности между экзоном 7 ACVR1 человека дикого типа и измененным экзоном 7 Acvr1 грызуна. В некоторых вариантах осуществления по сути человеческий экзон 7 ACVR1 кодирует те же аминокислоты, что и экзон 7 ACVR1 человека дикого типа.

[0035] В некоторых вариантах осуществления первая пара SRRS включает первый SRRS и второй SRRS, где первый и второй SRRS совместимы друг с другом и ориентированы таким образом, чтобы направлять инверсию. В некоторых вариантах осуществления вторая пара SRRS включает третий SRRS и четвертый SRRS, где третий и четвертый SRRS совместимы друг с другом и ориентированы таким образом, чтобы направлять инверсию, но не совместимы с первым или вторым SRRS.

[0036] В некоторых вариантах осуществления модифицированный ген Acvr1 грызуна в нуклеиновой кислоте содержит, в соответствии с направлением транскрипции гена Acvr1, (i) функционирующий экзон 7 (например, по сути человеческий экзон 7) в смысловой ориентации и (ii) измененный экзон 7 в антисмысловой ориентации; и содержит первую пару SRRS, состоящую из первого SRRS (SRRS1) и второго SRRS (SRRS2), а также вторую пару SRRS, состоящую из третьего SRRS (SRRS3) и четвертого SRRS (SRRS4); где SRRS1 совместим с SRRS2, SRRS3 совместим с SRRS4, однако ни SRRS1, ни SRRS2 не совместимы с SRRS3 или SRRS4, где SRRS1 расположен выше функционирующего экзона 7, SRRS2 расположен непосредственно ниже (в соответствии с направлением транскрипции гена Acvr1) антисмыслового измененного экзона 7, где SRRS1 и SRRS2 ориентированы таким образом, чтобы направлять инверсию; где SRRS3 размещен между функционирующим экзоном 7 и измененным антисмысловым экзоном 7 и SRRS4 расположен ниже (в соответствии с направлением ориентации гена Acvr1) SRRS2, где SRRS3 и SRRS4 ориентированы таким образом, чтобы направлять инверсию. В некоторых вариантах осуществления каждый из SRRS 1-4 распознается одной и той же рекомбиназой, такой как Cre.

[0037] В другом аспекте в данном документе раскрыт геном грызуна, содержащий нуклеиновую кислоту, которая содержит модифицированный ген Acvr1 грызуна, описанный выше.

[0038] В некоторых вариантах осуществления геном грызуна дополнительно содержит ген, кодирующий индуцируемую рекомбиназу, которая распознает SRRS и способна осуществить инверсию измененного экзона 7 и осуществлять делецию функционирующего экзона 7.

[0039] В некоторых вариантах осуществления рекомбиназа представляет собой Cre. В некоторых вариантах осуществления SRRS представляют собой сайты lox или их варианты, распознаваемые Cre. В некоторых вариантах осуществления рекомбиназа (например, Cre) слита с лигандсвязывающим доменом, восприимчивым к связыванию лигандом, например Cre-ER^T2, который является восприимчивым к (т. е. активируется посредством) связыванию тамоксифеном или его функциональными аналогами/производными. В одном варианте осуществления ген, кодирующий Cre-ER^T2, интегрирован в локус ROSA26 генома грызуна.

[0040] В дополнительном аспекте в данном документе раскрыта выделенная ткань или клетка грызуна, геном которой содержит нуклеиновую кислоту, описанную выше, т. е. геном из ткани или клетки содержит модифицированный ген Acvr1 грызуна. В некоторых вариантах осуществления выделенные ткань или клетка грызуна содержат модифицированный ген Acvr1 в пределах эндогенного локуса Acvr1 грызуна. В некоторых вариантах осуществления выделенная клетка грызуна представляет собой эмбриональную стволовую клетку (ES). В некоторых вариантах осуществления выделенная ткань или клетка грызуна представляет собой яйцеклетку грызуна или эмбрион грызуна. Выделенные ткань или клетка грызуна включают, например, ткань или клетку мыши или крысы.

[0041] В некоторых вариантах осуществления выделенные ткань или клетка грызуна содержат в своем геноме модифицированный ген Acvr1 грызуна, содержащий функционирующий экзон 7 Acvr1 в смысловой ориентации и фланкированный выше и ниже первой парой SRRS, и измененный экзон 7 Acvr1 в антисмысловой ориентации и фланкированный выше и ниже второй парой SRRS, где первая и вторая пары SRRS ориентированы таким образом, чтобы рекомбиназа могла осуществить инверсию измененного экзона 7 Acvr1 с обеспечением его расположения в смысловой ориентации и осуществить делецию функционирующего экзона 7 Acvr1. В различных вариантах осуществления остальные экзоны модифицированного гена Acvr1 грызуна, за исключением экзона 7, представляют собой функционирующие экзоны эндогенного гена Acvr1 грызуна, например экзоны дикого типа, присутствующие в эндогенном локусе Acvr1 грызуна.

[0042] В некоторых вариантах осуществления выделенные ткань или клетка грызуна содержат в своем геноме модифицированный ген Acvr1 грызуна, содержащий (a) функционирующий экзон 7 Acvr1, кодирующий R258 в смысловой ориентации, фланкированный выше и ниже первой парой SRRS, и (b) измененный экзон 7 Acvr1 грызуна, кодирующий вариацию R258G в антисмысловой ориентации, фланкированный второй парой SRRS, которые отличаются от первой пары SRRS; где первая и вторая пары SRRS ориентированы таким образом, чтобы рекомбиназа могла осуществить инверсию измененного экзона 7 Acvr1 грызуна с обеспечением его расположения в смысловой ориентации, осуществить делецию функционирующего экзона 7 Acvr1 и обеспечить экспрессию измененного аллеля Acvr1, содержащего измененный экзон 7 Acvr1 грызуна. В некоторых вариантах осуществления экспрессия измененного аллеля Acvr1, содержащего измененный экзон 7 Acvr1 грызуна, приводит в результате к образованию эктопической костной ткани. В различных вариантах осуществления остальные экзоны модифицированного гена Acvr1 грызуна, за исключением экзона 7, представляют собой функционирующие экзоны эндогенного гена Acvr1 грызуна, например экзоны дикого типа, присутствующие в эндогенном локусе Acvr1 грызуна.

[0043] В некоторых вариантах осуществления функционирующий экзон 7 Acvr1, кодирующий R258, представляет собой экзон 7 Acvr1 грызуна дикого типа. В некоторых вариантах осуществления функционирующий экзон 7 Acvr1, кодирующий R258, представляет собой по сути человеческий экзон 7 ACVR1. В некоторых вариантах осуществления по сути человеческий экзон 7 ACVR1 представляет собой экзон 7 ACVR1 человека дикого типа. В других вариантах осуществления по сути человеческий экзон 7 ACVR1 отличается от экзона 7 ACVR1 человека дикого типа по меньшей мере одним нуклеотидом и характеризуется сниженной степенью идентичности последовательности с измененным экзоном 7 Acvr1 грызуна по сравнению со степенью идентичности последовательности между экзоном 7 ACVR1 человека дикого типа и измененным экзоном 7 Acvr1 грызуна. В некоторых вариантах осуществления по сути человеческий экзон 7 ACVR1 кодирует те же аминокислоты, что и экзон 7 ACVR1 человека дикого типа.

[0044] В некоторых вариантах осуществления первая пара SRRS включает первый SRRS и второй SRRS, где первый и второй SRRS совместимы друг с другом и ориентированы таким образом, чтобы направлять инверсию. В некоторых вариантах осуществления вторая пара SRRS включает третий SRRS и четвертый SRRS, где третий и четвертый SRRS совместимы друг с другом и ориентированы таким образом, чтобы направлять инверсию, но не совместимы с первым или вторым SRRS.

[0045] В некоторых вариантах осуществления выделенные ткань или клетка грызуна содержат в своем геноме модифицированный ген Acvr1 грызуна, содержащий, в соответствии с направлением транскрипции гена Acvr1, (i) функционирующий экзон 7 (например, по сути человеческий экзон 7) в смысловой ориентации и (ii) измененный экзон 7 в антисмысловой ориентации, и содержит первую пару SRRS, состоящую из первого SRRS (SRRS1) и второго SRRS (SRRS2), а также вторую пару SRRS, состоящую из третьего SRRS (SRRS3) и четвертого SRRS (SRRS4); где SRRS1 совместим с SRRS2, SRRS3 совместим с SRRS4, однако ни SRRS1, ни SRRS2 не совместимы с SRRS3 или SRRS4, где SRRS1 расположен выше функционирующего экзона 7, SRRS2 расположен непосредственно ниже (в соответствии с направлением транскрипции гена Acvr1) антисмыслового измененного экзона 7, где SRRS1 и SRRS2 ориентированы таким образом, чтобы направлять инверсию; где SRRS3 размещен между функционирующим экзоном 7 и измененным антисмысловым экзоном 7, и SRRS4 расположен ниже (в соответствии с направлением ориентации гена Acvr1) SRRS2, где SRRS3 и SRRS4 ориентированы таким образом, чтобы направлять инверсию. В некоторых вариантах осуществления каждый из SRRS 1-4 распознается одной и той же рекомбиназой, такой как Cre.

[0046] В дополнительном аспекте в данном документе раскрыта конструкция нуклеиновой кислоты для целенаправленной модификации гена Acvr1 в геноме грызуна, также называемая "нацеливающей нуклеиновой кислотой".

[0047] В некоторых вариантах осуществления нацеливающая нуклеиновая кислота содержит (a) функционирующий экзон 7 Acvr1, кодирующий R258 в смысловой ориентации, фланкированный выше и ниже первой парой SRRS; и (b) измененный экзон 7 Acvr1 грызуна, кодирующий вариацию R258G в антисмысловой ориентации, фланкированный второй парой SRRS, которые отличаются от первой пары SRRS; где первая и вторая пары SRRS ориентированы таким образом, чтобы рекомбиназа могла осуществить инверсию измененного экзона 7 Acvr1 грызуна с обеспечением его расположения в смысловой ориентации и осуществить делецию функционирующего экзона 7 Acvr1. В некоторых вариантах осуществления каждый из функционирующего экзона 7 и измененного экзона 7 фланкированы интронными последовательностями. Как правило, нацеливающая конструкция нуклеиновой кислоты содержит 5'- и 3'-плечи гомологии (нуклеотидные последовательности, гомологичные нуклеотидным последовательностям в локусе нацеливания), которые опосредуют гомологичную рекомбинацию и интеграцию последовательности нуклеиновой кислоты между плечами гомологии. В некоторых вариантах осуществления нацеливающая конструкция нуклеиновой кислоты также содержит селектируемый маркерный ген для облегчения идентификации и отбора клонов, в которых происходит правильное нацеливание.

[0048] В некоторых вариантах осуществления функционирующий экзон 7 Acvr1, кодирующий R258, представляет собой экзон 7 Acvr1 грызуна дикого типа. В некоторых вариантах осуществления функционирующий экзон 7 Acvr1, кодирующий R258, представляет собой по сути человеческий экзон 7 ACVR1. В некоторых вариантах осуществления по сути человеческий экзон 7 ACVR1 представляет собой экзон 7 ACVR1 человека дикого типа. В других вариантах осуществления по сути человеческий экзон 7 ACVR1 отличается от экзона 7 ACVR1 человека дикого типа по меньшей мере одним нуклеотидом и характеризуется сниженной степенью идентичности последовательности с измененным экзоном 7 Acvr1 грызуна по сравнению со степенью идентичности последовательности между экзоном 7 ACVR1 человека дикого типа и измененным экзоном 7 Acvr1 грызуна. В некоторых вариантах осуществления по сути человеческий экзон 7 ACVR1 кодирует те же аминокислоты, что и экзон 7 ACVR1 человека дикого типа.

[0049] В некоторых вариантах осуществления первая пара SRRS включает первый SRRS и второй SRRS, где первый и второй SRRS совместимы друг с другом и ориентированы таким образом, чтобы направлять инверсию. В некоторых вариантах осуществления вторая пара SRRS включает третий SRRS и четвертый SRRS, где третий и четвертый SRRS совместимы друг с другом и ориентированы таким образом, чтобы направлять инверсию, но не совместимы с первым или вторым SRRS.

[0050] В некоторых вариантах осуществления нацеливающая нуклеиновая кислота содержит, в соответствии с направлением транскрипции гена Acvr1, (i) функционирующий экзон 7 (например, по сути человеческий экзон 7) в смысловой ориентации и (ii) измененный экзон 7 в антисмысловой ориентации и содержит первую пару SRRS, состоящую из первого SRRS (SRRS1) и второго SRRS (SRRS2), а также вторую пару SRRS, состоящую из третьего SRRS (SRRS3) и четвертого SRRS (SRRS4); где SRRS1 совместим с SRRS2, SRRS3 совместим с SRRS4, однако ни SRRS1, ни SRRS2 не совместимы с SRRS3 или SRRS4, где SRRS1 расположен выше функционирующего экзона 7, SRRS2 расположен непосредственно ниже (в соответствии с направлением транскрипции гена Acvr1) антисмыслового измененного экзона 7, где SRRS1 и SRRS2 ориентированы таким образом, чтобы направлять инверсию; где SRRS3 размещен между функционирующим экзоном 7 и измененным антисмысловым экзоном 7 и SRRS4 расположен ниже (в соответствии с направлением ориентации гена Acvr1) SRRS2, где SRRS3 и SRRS4 ориентированы таким образом, чтобы направлять инверсию. В некоторых вариантах осуществления каждый из SRRS 1-4 распознается одной и той же рекомбиназой, такой как Cre.

[0051] В другом аспекте в данном документе раскрыт способ получения генетически модифицированного грызуна, включающий модифицирование генома грызуна таким образом, чтобы он содержал модифицированный ген Acvr1 грызуна в пределах эндогенного локуса Acvr1 грызуна, как описано в данном документе.

[0052] В некоторых вариантах осуществления геном грызуна модифицируют способом, включающим введение в эмбриональную стволовую (ES) клетку грызуна нацеливающей конструкции нуклеиновой кислоты, описанной в данном документе; получение ES-клетки грызуна, геном которой содержит модифицированный ген Acvr1 грызуна; и получение генетически модифицированного грызуна с применением ES-клетки грызуна, содержащей модифицированный геном. Например, нацеливающую нуклеиновую кислоту вводят в ES-клетку грызуна, где нацеливающая нуклеиновая кислота содержит (a) функционирующий экзон 7 Acvr1, кодирующий R258 в смысловой ориентации, фланкированный выше и ниже первой парой SRRS; и (b) измененный экзон 7 Acvr1 грызуна, кодирующий вариацию R258G в антисмысловой ориентации, фланкированный второй парой SRRS, которые отличаются от первой пары SRRS; где первая и вторая пары SRRS ориентированы таким образом, чтобы рекомбиназа могла осуществить инверсию измененного экзона 7 Acvr1 грызуна с обеспечением его расположения в смысловой ориентации и осуществить делецию функционирующего экзона 7 Acvr1. Может быть выбрана ES-клетка грызуна, геном которой был модифицирован и содержит функционирующий экзон 7 Acvr1, кодирующий R258 в смысловой ориентации, фланкированный выше и ниже первой парой SRRS; и измененный экзон 7 Acvr1 грызуна, кодирующий вариацию R258G в антисмысловой ориентации, фланкированный второй парой SRRS, которые отличаются от первой пары SRRS. Такую ES-клетку грызуна можно применять для получения грызуна.

[0053] В некоторых вариантах осуществления генетически модифицированный грызун, полученный с помощью настоящего способа и содержащий модифицированный ген Acvr1 грызуна, дополнительно содержит индуцируемую рекомбиназу (например, Cre). В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота, кодирующая индуцируемую рекомбиназу, присутствует в геноме ES-клетки грызуна, в которую вводят нацеливающую конструкцию нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах осуществления грызуна, содержащего в своем геноме модифицированный ген Acvr1 грызуна, получают первым и затем скрещивают с другим грызуном, содержащим в своем геноме нуклеиновую кислоту, кодирующую индуцируемую рекомбиназу.

[0054] В некоторых вариантах осуществления индуцируемая рекомбиназа активируется в грызуне и действует таким образом, что осуществляет инверсию измененного экзона 7 и делецию функционирующего экзона с обеспечением экспрессии белка Acvr1, содержащего изменение (например, R258G).

[0055] В дополнительном аспекте в данном документе раскрыт способ скрещивания полученных грызунов и потомства грызунов.

[0056] В некоторых вариантах осуществления в данном документе раскрыт способ, включающий скрещивание первого грызуна, геном которого содержит модифицированный ген Acvr1 грызуна, со вторым грызуном с получением в результате грызуна-потомка, геном которого содержит модифицированный ген Acvr1 грызуна. В данном документе описан модифицированный ген Acvr1 грызуна; например, модифицированный ген Acvr1 грызуна может содержать функционирующий экзон 7 Acvr1 в смысловой ориентации и фланкированный выше и ниже первой парой SRRS, а также измененный экзон 7 Acvr1 грызуна в антисмысловой ориентации и фланкированный выше и ниже второй парой SRRS, где первая и вторая пары SRRS ориентированы таким образом, чтобы рекомбиназа могла осуществить инверсию измененного экзона 7 Acvr1 с обеспечением его расположения в смысловой ориентации и осуществить делецию функционирующего экзона 7 Acvr1. В некоторых вариантах осуществления измененный экзон 7 Acvr1 грызуна кодирует вариацию R258G, и функционирующий экзон 7Acvr1 представляет собой по сути человеческий экзон 7 ACVR1, кодирующий R258.

[0057] В некоторых вариантах осуществления второй грызун содержит индуцируемую рекомбиназу. В некоторых вариантах осуществления индуцируемая рекомбиназа представляет собой индуцируемую рекомбиназу Cre. В некоторых вариантах осуществления индуцируемая рекомбиназа Cre представляет собой рекомбиназу Cre-ER^T2, индуцируемую посредством связывания лиганда, такого как тамоксифен или его функциональное производное или аналог.

[0058] В некоторых вариантах осуществления грызун-потомок содержит индуцируемую рекомбиназу. В некоторых вариантах осуществления индуцируемая рекомбиназа представляет собой индуцируемую рекомбиназу Cre. В некоторых вариантах осуществления индуцируемая рекомбиназа Cre представляет собой рекомбиназу Cre-ER^T2.

[0059] В некоторых вариантах осуществления индуцируемая рекомбиназа экспрессируется в клетке или ткани, например в выбранных клетках или тканях грызуна-потомка. В некоторых вариантах осуществления экспрессируемая рекомбиназа действует в клетке или ткани таким образом, что осуществляет инверсию измененного экзона 7 Acvr1 с обеспечением его расположения в смысловой ориентации и осуществляет делецию функционирующего экзона 7 Acvr1, вследствие чего обеспечивается экспрессия измененного аллеля Acvr1, содержащего измененный экзон 7.

[0060] Также в данном документе предусмотрены грызуны-потомки, получаемые в результате скрещивания согласно способу, раскрытому в данном документе.

[0061] В еще одном аспекте генетически модифицированное животное из отряда грызунов, которое экспрессирует измененный аллель Acvr1, применяют в качестве модели нарушения, характеризующегося эктопической оссификацией. В одном варианте осуществления нарушение, характеризующееся эктопической оссификацией, представляет собой прогрессирующую оссифицирующую фибродисплазию (FOP). В некоторых вариантах осуществления генетически модифицированное животное из отряда грызунов, в котором экспрессируется измененный аллель Acvr1, применяют для оценки кандидатного терапевтического соединения для определения того, может ли кандидатное соединение ингибировать развитие образования эктопической костной ткани у грызуна.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

[0062] На фиг. 1 проиллюстрирована схема превращения Acvr1 дикого типа в R258G FlEx. На верхней схеме изображена геномная область Acvr1 после нокина и делеции Neo. На нижней схеме показана геномная область после Cre-опосредованной инверсии и делеции, которые обеспечивают помещение мутантного экзона в его обычное место в обычной ориентации. Экзон (незакрашенный прямоугольник) и фланкирующие интронные (незакрашенная полоса) последовательности человека применяли для уменьшения уровня образования шпилек с инвертированными экзонными/интронными (заштрихованный прямоугольник/заштрихованная полоса) последовательностями мыши во время транскрипции. В экзон человека вводили дополнительные нуклеотидные изменения для дополнительного снижения степени идентичности последовательности с экзоном мыши.

[0063] На фиг. 2 показано, что у мышей с Acvr1^{[R258G]FlEx/+}; Gt(ROSA26)Sor^CreERt2/+ развилась гетеротопическая оссификация (HO) после обработки тамоксифеном. Четыре мыши с Acvr1^{[R258G]FlEx/+}; Gt(ROSA26)Sor^CreERt2/+ получили по 5 инъекций тамоксифена раз в день в дозе 40 мг/кг. Через 2 недели у всех мышей наблюдали образование HO.

[0064] На фиг. 3 показано, что блокирующее антитело к активину A ингибирует образование HO у мыши с активным условным нокином Acvr1^R258G.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

[0065] Прогрессирующая оссифицирующая фибродисплазия (FOP) представляет собой аутосомно-доминантное нарушение, характеризующееся образованием эктопической костной ткани. Примерно 95% случаев FOP обусловлены мутацией R206H в рецепторе активина A типа I (Acvr1). Однако были описаны несколько других мутаций либо в домене GS, либо в домене киназы, включая R258G, которые обуславливают развитие атипичной формы FOP с более тяжелым фенотипом. У двух пациентов с мутацией R258G наблюдались значительные отклонения в развитии в дополнение к развитию гетеротопической оссификации после рождения (Kaplan et al., Am J Med Genet A. 2015; 167(10): 2265-2271).

[0066] Предусмотрены генетически модифицированные грызуны, которые способны к экспрессии белка Acvr1, содержащего изменение, которое приводит в результате к нарушению, характеризующемуся образованием эктопической костной ткани, например FOP. В некоторых вариантах осуществления грызуны, у которых экспрессируется измененный белок Acvr1, включают грызунов, которые не являются химерными, например грызунов, геномы которых несут модифицированный ген Acvr1, содержащий условное изменение, которое при его экспрессии приводит в результате к образованию эктопической костной ткани у грызуна.

[0067] Предусмотрены генетически модифицированные грызуны, которые содержат конструкцию FlEx, которая обеспечивает условную делецию функционирующего экзона и замену функционирующего экзона измененным экзоном. Функционирующий экзон кодирует аминокислоты белка, который является функциональным, т. е. выполняет свою ожидаемую биологическую функцию. В некоторых вариантах осуществления функционирующий экзон представляет собой встречающийся в природе экзон дикого типа. В некоторых вариантах осуществления функционирующий экзон кодирует те же аминокислоты, что и экзон дикого типа. FlEx обеспечивает образование условного аллеля посредством помещения последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей измененный экзон, в антисмысловую цепь (далее называемой “инвертированный измененный экзон”) рядом с функционирующим экзоном, который позже подвергается делеции. C применением выбранных сайтов распознавания сайт-специфической рекомбиназы (SRRS) в присутствии их когнатной рекомбиназы инвертированный измененный экзон переносится в смысловую цепь и, следовательно, также в одну рамку считывания с остальной частью гена, при этом функционирующий экзон подвергается делеции. Данный FlEx-подход основываться на помещении несовместимых SRRS (например, lox2372 и loxP) в положениях, примыкающих к функционирующему и измененному экзонам. Таким образом, одним преимуществом FlEx-подхода является то, что (перинатальная/эмбриональная) летальный мутация не экспрессируется, пока на FlEx-аллель не воздействует(-ют) выбранная(-ые) рекомбиназа(-ы). Другим преимуществом данного FlEx-подхода является необратимое удаление функционирующего экзона при воздействии выбранной рекомбиназы, и таким образом после осуществления инверсии в геноме не остается инвертированного повтора, что исключает возможность восстановления аллеля дикого типа. Еще одним преимуществом FlEx-подхода является необратимое закрепление измененного экзона в смысловой цепи, что является результатом удаления по одному из каждых двух разных типов SRRS (например, одного из двух сайтов lox2372 и одного из сайтов loxP). Функционирующий экзон, получаемый посредством гуманизации экзона грызуна дикого типа, также минимизирует последовательность инвертированного повтора, таким образом облегчая стадии клонирования и уменьшая объем проблем, связанных с перегруппировками, во время и после нацеливания, а также количество артефактов сплайсинга РНК во время созревания соответствующей мРНК. В некоторых вариантах осуществления в конструкции FlEx применяют по сути человеческий экзон дикого типа. Выражение "экзон человека дикого типа" или "экзон человека" относится к встречающемуся в природе функционирующему экзону человека. Термин "по сути человеческий экзон дикого типа" или "по сути человеческий экзон" включает как встречающийся в природе функционирующий экзон человека, так и его модифицированные формы, где один или более (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 или более) нуклеотидов встречающегося в природе экзона человека были изменены. В конкретных вариантах осуществления один или более (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 или более) нуклеотидов были изменены без изменения кодируемых аминокислот (существенного изменяло выбор кодонов) для снижения степени идентичности последовательности с экзоном грызуна, что дополнительно минимизирует последовательность инвертированного повтора и снижает возможность перегруппировок.

[0068] Если грызуна, несущего FlEx-аллель, скрестить с содержащим рекомбиназу грызуном, измененный аллель будет экспрессироваться у потомства in utero; и если изменение представляет собой перинатальное/эмбриональное летальное изменение, цель, состоящая в получении животного для исследований, экспрессирующего аллель, может оказаться под угрозой. Следовательно, грызуна, несущего FlEx-аллель, не скрещивают с грызуном с нерегулируемым содержанием рекомбиназы. Вместо этого грызуна, несущего FlEx-аллель, скрещивают с грызуном, который экспрессирует рекомбиназу, активность которой является индуцируемой (например, восприимчивой к индуктору) (т. е. индуцируемую рекомбиназу). Индуцируемая рекомбиназа может быть получена посредством слияния рекомбиназы с лигандсвязывающим доменом белка, который при связывании со своим когнатным лигандом или функциональными производными когнатного лиганда делает белок функциональным (например, путем стабилизации белка). Функциональные производные когнатного лиганда относятся к соединениям, которые являются аналогичными по структуре и выполняют по сути такую же функцию (т. е. связывают тот же рецептор), что и когнатный лиганд. Примеры таких лигандсвязывающих доменов включают без ограничения лигандсвязывающие домены стероидных рецепторов, глюкокортикоидных рецепторов, ретиноидных рецепторов и тиреоидных рецепторов (Eilers et al. (1989) Nature 340:66-68; Picard et al. (1988) Cell 54:1073-1080). В некоторых вариантах осуществления индуцируемая рекомбиназа представляет собой слитый белок, образованный Cre и эстрогеновым рецептором (ER), модифицированным посредством T2-мутаций (кодируемым аллелем Cre-ER^T2). В случае данного слитого белка рекомбиназа Cre является неактивной в отсутствие лиганда для ER (см. Indra, A. et al. (1999), Nucleic Acids Res. 27(22):4324-4327; Feil, R. et al. (1997) Biochem. Biophys. Res. Commun. 237:752-757; патент США №7112715), и рекомбиназа Cre становится активной при предоставлении лиганда для ER, например тамоксифена или функционального производного тамоксифена. Грызун, содержащий условный аллель, сконструированный с помощью Cre-восприимчивых SRRS, описанных в данном документе, и содержащий Cre-ER^T2, будет, следовательно, экспрессировать аллель, содержащий функционирующий экзон, до тех пор, пока грызуна не подвергнут воздействию лиганда для ER с целью индуцирования активности Cre. Таким образом, получают грызунов, содержащих модифицированный ген Acvr1 в их зародышевой линии, но не экспрессирующих соответствующий вариант белка Acvr1 до тех пор, пока грызунов не подвергнут воздействию лиганда ER (например, тамоксифена). После воздействия лиганда слитый белок Cre-ER^T2 активируется и условный аллель превращается в соответствующий измененный аллель.

[0069] Для индуцирования активности рекомбиназы лиганд можно вводить грызуну различными путями, включая парентеральные и непарентеральные пути введения. Парентеральные пути включают, например, внутривенный, внутриартериальный, интрапортальный, внутримышечный, подкожный, внутрибрюшинный, интраспинальный, интратекальный, интрацеребровентрикулярный, внутричерепной, интраплевральный или другие пути инъекции. Непарентеральные пути включают, например, пероральный, интраназальный, трансдермальный, внутрилегочный, ректальный, трансбуккальный, вагинальный, внутриглазной. В конкретных вариантах осуществления лиганд вводят грызуну путем внутрибрюшинной инъекции.

[0070] В различных вариантах осуществления переход к измененному аллелю является необратимым и сопровождается делецией функционирующего экзона. Таким образом линию грызунов, содержащую летальную в обычных условиях мутацию Acvr1, можно поддерживать практически бесконечно, получая требуемое генетическое нарушение и сопутствующий ему фенотип когда потребуется.

[0071] Грызуны, предусмотренные в данном документе, включают, например, мышей, крыс и хомяков. В некоторых вариантах осуществления грызун представляет собой мышь или крысу. В конкретных вариантах осуществления грызун представляет собой мышь. Acvr1 является высококонсервативным у различных видов, при этом R258 является консервативным и занимает одинаковое положение у мышей и крыс.

[0072] В некоторых вариантах осуществления грызун представляет собой мышь линии C57BL, например линии C57BL, выбранной из C57BL/A, C57BL/An, C57BL/GrFa, C57BL/KaLwN, C57BL/6, C57BL/6J, C57BL/6ByJ, C57BL/6NJ, C57BL/10, C57BL/10ScSn, C57BL/10Cr и C57BL/Ola. В других вариантах осуществления грызун представляет собой мышь линии 129, например линии 129, выбранной из группы, состоящей из 129P1, 129P2, 129P3, 129X1, 129S1 (например, 129S1/SV, 129S1/SvIm), 129S2, 129S4, 129S5, 129S9/SvEvH, 129/SvJae, 129S6 (129/SvEvTac), 129S7, 129S8, 129T1, 129T2 (см., например, Festing et al. (1999), Mammalian Genome 10:836; Auerbach et al. (2000), Biotechniques 29(5):1024-1028, 1030, 1032). В некоторых вариантах осуществления грызун представляет собой мышь, которая представляет собой результат скрещивания вышеуказанной линии 129 и вышеуказанной линии C57BL/6. В некоторых вариантах осуществления мышь представляет собой результат скрещивания (т. е. гибрид) вышеуказанных линий 129, или результат скрещивания вышеуказанных линий C57BL, или результат скрещивания линии C57BL и линии 129. В некоторых вариантах осуществления мышь представляет собой результат скрещивания линии C57BL/6 и линии 129. В конкретных вариантах осуществления мышь относится к линии VGF1, также известной как F1H4, которая представляет собой гибрид C57BL/6 и 129. В других вариантах осуществления мышь относится к линии BALB, например линии BALB/c. В некоторых вариантах осуществления мышь представляет собой результат скрещивания линии BALB и другой вышеуказанной линии.

[0073] В некоторых вариантах осуществления грызун представляет собой крысу. В определенных вариантах осуществления крыса выбрана из крыс линии Wistar, лини LEA, линии Sprague Dawley, линии Fischer, F344, F6 и Dark Agouti. В других вариантах осуществления крыса представляет собой результат скрещивания двух или более линий, выбранных из группы, состоящей из линий Wistar, LEA, Sprague Dawley, Fischer, F344, F6 и Dark Agouti.

[0074] Условный аллель Acvr1, содержащий вариацию R258G, может быть сконструирован с применением способа на основе FlEx. См., например, Schnutgen, F. et al. (2003) Nat. Biotech. 21:562-565; и патент США №7205148. Для FlEx используют пару мутантных сайтов Lox, называемых FlEx-матрицей, которые распознаются одной и той же рекомбиназой (Cre), но которые не вступают в реакцию друг с другом, и располагают их в виде конфигурации A-B/[A-B], где "[A-B]" находится в противоположной цепи по отношению к "A-B", для обеспечения инверсии последовательности ДНК, фланкированной этими матрицами. В некоторых вариантах осуществления пару LoxP-Lox2372 применяют в качестве комбинации мутантных сайтов Lox для условного аллеля, описанного в данном документе. Эти два мутантных сайта Lox не проявляют перекрестной реактивности. Последовательность, содержащаяся в пределах каждой матрицы, т. е. между сайтами LoxP и Lox2372 каждой матрицы, будет подвергаться делеции под воздействием Cre. Один вариант осуществления условного аллеля проиллюстрирован на фиг. 1.

[0075] Для Acvr1 мыши продемонстрировано большое количество сплайс-вариантов (например, Acvr1-201, 202, 203, 204). Экзоны, которые мутируют при FOP, являются общими для всех сплайс-вариантов Acvr1, кодирующих белок. В одном варианте осуществления в данном документе раскрыт условный аллель Acvr1, содержащий модификацию экзона 7 (ENSMUSE00001232449) изоформы Acvr1-201.

[0076] Аллель Acvr1^[R258G]FlEx может быть сконструирован путем помещения экзона Acvr1 грызуна, кодирующего измененную версию аминокислоты 258 (например, ENSMUSE00001232449), в антисмысловую цепь таким образом, чтобы измененный экзон не являлся включенным в транскрипт Acvr1. Так как последовательность, кодируемая экзоном 7, требуется для функционирования Acvr1, было необходимо, чтобы функционирующий экзон 7 был также включен в конструкцию (экзон 7 является общим для всех сплайс-вариантов Acvr1, кодирующих белок). Кроме того, так как экзоны не распознаются как таковые без вспомогательных интронных последовательностей, последовательности, располагающиеся как выше, так и ниже данного экзона, были также включены как в измененный, так и в функционирующий экзоны, кодирующие аминокислоту 258. Однако, подобные действия привели бы к возникновению длинного инвертированного повтора, и такие ДНК-структуры по своей природе имеют тенденцию к рекомбинации как во время стадий, требуемых для построения нацеливающего вектора с помощью генной инженерии, так и в период после нацеливания in vivo (Holkers, M. et al. (2012) Nucleic Acids Res. 40:1984-1999). Кроме того, если последовательность экзона, кодирующего аминокислоту 258, грызуна дикого типа и выше- и нижележащие интронные последовательности, связанные с экзоном, оставались интактными и были расположены перед измененным экзоном грызуна, то данная область дикого типа могла выступать в качестве плеча гомологии и использоваться во время нацеливания в ES-клетках грызуна, тем самым приводя в результате к исключению измененного экзона из аллеля нацеливания.

[0077] Следовательно, аллель Acvr1^[R258G]FlEx может быть сконструирован таким образом, что будет обеспечиваться следующее.

a) Предотвращение возникновения длинного инвертированного повтора. Для этого экзон, кодирующий R258 (например, ENSMUSE00001232449), а также связанные с ним выше- и нижележащие интронные последовательности могут быть заменены на соответствующие области из ACVR1 человека.

b) Последовательность экзона, кодирующего R258, грызуна дикого типа (например, ENSMUSE00001232449) сохраняется на белковом уровне. Последовательности белка мыши и человека, кодируемые экзонами ENSMUSE00001232449 и ENSE00001009617 соответственно, являются идентичными. Однако по мере возможности кодоны в пределах последовательности экзона человека (например, ENSE00001009617) могут быть изменены с целью дополнительного снижения степени идентичности нуклеотидной последовательности экзонов грызуна и человека без изменения аминокислот, кодируемых экзоном.

c) Введенная последовательность человека удаляется полностью под воздействием Cre. Следовательно, в случае «активированного условного» состояния, когда транскрибируется мутантный ген Acvr1^[R258G], последовательностей человека не остается и, следовательно, любой полученный фенотип не может являться следствием присутствия инородной последовательности.

[0078] Более конкретно, в качестве примера, область, ограниченную нуклеотидами 58468399-58468770 в mmuAcvr1 (т. е. нуклеотиды 58468399-58468770 хромосомы 2 мыши, GRCm38/mm10), заменяли нуклеиновой кислотой, состоящей из нуклеотидов 157770252-157770625 из hsaACVR1 (т. е. нуклеотиды 157770252-157770625 из хромосомы 2 человека, GRCh38/hg38), таким образом, чтобы введенная последовательность, которая содержит экзон ENSE00001009617 hsaACVR1, транскрибировался как часть полученного модифицированного локуса Acvr1^[R258G]FlEx. Кроме того, изменяя выбор кодонов, изменяли нуклеотидную последовательность экзона ENSE00001009617 человека с целью снижения степени идентичности последовательности экзона мыши и человека без изменения кодирования белка. Данная введенная последовательность человека далее упоминается в данном документе как hsa_e7+. Следовательно, до момента инверсии FlEx-элемента (измененный экзон ENSMUSE00001232449 и связанные с ним выше- и нижележащие интронные последовательности - см. ниже) полученный локус Acvr1^[R258G]FlEx должен функционировать как локус дикого типа.

[0079] Вариацию R258G моделировали с помощью изменения экзона ENSMUSE00001232449 в соответствующем положении посредством изменения кодона, определенного нуклеотидами 58468530-58468532, с AGG (кодирующего аргинин) на GGG (кодирующий глицин). Полученный мутантный экзон вместе с фланкирующими интронными последовательностями помещали 3'-концом к hsa_e7+ и в антисмысловую цепь mmuAcvr1. Кроме того, осуществляли делецию нуклеотидов 58468771-58468815 mmuAcvr1 с целью создания небольшой делеции для размещения LOA-зондов (Gomez-Rodriguez, J. et al. (2008) Nucleic Acids Res. 36:e117; Valenzuela, D. et al. (2003) High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis, Nat. Biotech. 21:652-659). Данная введенная подвергнутая мутации последовательность мыши далее упоминается в данном документе как mmu_e7R258G+.

[0080] Иллюстративные последовательности экзона 7 человека, измененного экзона 7, кодирующего R258G, мыши и измененного экзона 7 человека вместе с выше- и нижележащими интронными последовательностями приведены ниже и представлены в перечне последовательностей.

SEQ ID NO Описание

1 Экзон 7 человека

2 Экзон 7 человека с изменениями кодонов

3 Последовательность человека, содержащая экзон 7 с измененными кодонами и примыкающие интроны

4 Измененный экзон 7 мыши, кодирующий R258G

5 Измененный экзон 7 мыши (в обратном порядке, как в конструкции)

6 Последовательность мыши, содержащая измененный экзон 7 и примыкающие интроны

7 Последовательность мыши, содержащая измененный экзон 7 и примыкающие интроны (в обратном порядке, как в конструкции)

8 Экзон 7 крысы

[0081] С целью обеспечения Cre-зависимой инверсии mmu_e7R258G+ и одновременной делеции hsa_e7+ комбинацию FlEx-подобных Lox-матриц применяли таким образом, чтобы

a) сайт LoxP предшествовал hsa_e7+, а сайт Lox2372 следовал за ней; для этого hsa_e7+ заключали в FlEx-подобную матрицу 5'-LoxP-Lox2372;

b) за mmu_e7R258G+ следовала FlEx-подобная матрица 3'-LoxP-Lox2372, однако данная матрица была сконструирована таким образом, чтобы ее конфигурация являлась зеркальным отображением FlEx-подобной матрицы 5' LoxP-Lox2372; это обеспечивает необратимую инверсию mmu_e7R258G+ с помещением в смысловую цепь с помощью Cre.

[0082] Когда полученный аллель Acvr1^[R258G]FlEx подвергнется действию Cre, hsa_e7+ будет подвергнута делеции и mmu_e7R258G+ будет подвергнута инверсии с помещением в смысловую цепь. В результате этого Acvr1^[R258G] будет экспрессироваться вместо Acvr1.

[0083] Для введения FlEx-аллеля Acvr1 в геном грызуна можно получить конструкцию нацеливающей нуклеиновой кислоты, содержащую FlEx-аллель Acvr1, описанный выше. В дополнение к последовательности FlEx Acvr1 (по сути человеческий экзон 7 в смысловой ориентации и примыкающие интронные последовательности, измененный экзон 7 грызуна, кодирующий R258G, в антисмысловой ориентации и примыкающие интронные последовательности, а также сайты распознавания рекомбиназы), конструкция нуклеиновой кислоты может содержать фланкирующие последовательности, которые имеют подходящую длину и являются гомологичными последовательностям гена Acvr1 грызуна в эндогенном локусе Acvr1 грызуна, для обеспечения ее способности опосредовать гомологичную рекомбинацию и интеграцию последовательности FlEx Acvr1 в эндогенный локус Acvr1 грызуна.

[0084] В некоторых вариантах осуществления конструкцию нацеливающей нуклеиновой кислоты, содержащую FlEx-аллель Acvr1, вводят в эмбриональную стволовую (ES) клетку грызуна, чтобы модифицировать геном ES-клетки. Как ES-клетки мыши, так и ES-клетки крысы описаны в уровне техники. См., например, патенты США №№7576259, 7659442 и 7294754 и публикацию заявки на патент США №2008/0078000 A1 (все из которых включены в данный документ посредством ссылки), в которых описаны ES-клетки мыши и способ получения генетически модифицированной мыши VELOCIMOUSE®; и публикацию заявки на патент США №2014/0235933 A1 и публикацию заявки на патент США №2014/0310828 A1 (все из которых включены в данный документ посредством ссылки), в которых описаны ES-клетки крысы и способы получения генетически модифицированной крысы.

[0085] Можно осуществить отбор ES-клеток, содержащих FlEx-аллель Acvr1, интегрированный в эндогенный локус Acvr1 грызуна. Затем ES-клетки, содержащие с FlEx-аллель Acvr1, интегрированный в геном, применяют в качестве донорных ES-клеток для инъекции в эмбрион на стадии, предшествующей стадии морулы (например, эмбрион на стадии 8 клеток), с применением способа VELOCIMOUSE® (см., например, патенты США №№7576259, 7659442 и 7294754 и публикацию заявки на патент США №2008/0078000 A1) или способов, описанных в публикациях заявок на патент США №№2014/0235933 A1 и 2014/0310828 A1. Эмбрион, содержащий донорные ES-клетки, инкубируют до стадии бластоцисты и затем имплантируют суррогатной матери с получением грызуна F0, полностью полученного из донорных ES-клеток. Детенышей грызуна, несущих FlEx-аллель, можно идентифицировать посредством генотипирования ДНК, выделенной из отрезанных фрагментов хвостов, с помощью, например, анализа потери аллеля (Valenzuela et al., выше).

[0086] В различных вариантах осуществления генетически модифицированного грызуна, содержащего FlEx-аллель Acvr1, получают с помощью модифицирования ES-клетки грызуна таким образом, чтобы она содержала FlEx-аллель, и модифицирования той же ES-клетки таким образом, чтобы она содержала ген, кодирующий индуцируемую рекомбиназу (например, Cre-ER^T2), и применения этой ES-клетки в качестве донорной клетки для получения грызуна, содержащего FlEx-аллель и ген, кодирующий индуцируемую рекомбиназу. В некоторых вариантах осуществления генетически модифицированного грызуна, содержащего FlEx-аллель Acvr1, получают с применением ES-клетки грызуна, которая уже содержит ген, кодирующий индуцируемую рекомбиназу (например, Cre-ER^T2), и модифицирования такой ES-клетки грызуна таким образом, чтобы она содержала FlEx-аллель. В других вариантах осуществления получают генетически модифицированного грызуна, содержащего FlEx-аллель Acvr1, и скрещивают с грызуном, содержащим ген, кодирующий индуцируемую рекомбиназу (например, Cre-ER^T2), с получением потомка, содержащего FlEx-аллель и ген, кодирующий индуцируемую рекомбиназу.

[0087] Взрослые особи мышейAcvr1^R258GFlEx/+; Gt(ROSA26)Sor^CreERt2/+ были фенотипически нормальными; однако общеорганизменная активация аллеля Acvr1, кодирующего R258G, привела к развитию прогрессирующей оссификации, видимой при рентгенографическом исследовании уже через 2 недели после введения доз тамоксифена, аналогично тому, как это наблюдали у мыши Acvr1 R206H Flex, описанной в патенте США №9510569. См. также фиг. 2.

[0088] Применение грызунов, предусмотренных в данном документе, позволяет лучше понять молекулярные механизмы, лежащие в основе развития нарушений, характеризующихся образованием эктопической костной ткани, таких как FOP. Кроме того, такие грызуны могут применяться для скрининга и разработки терапевтических соединений для ингибирования, предупреждения и/или лечения нарушений, характеризующихся образованием эктопической костной ткани, включая FOP.

[0089] В некоторых вариантах осуществления кандидатное терапевтическое соединение испытывают in vivo посредством введения соединения грызуну, раскрытому в данном документе, т. е. грызуну, несущему FlEx-аллель Acvr1.

[0090] Кандидатные терапевтические соединения могут представлять собой без ограничения низкомолекулярные химические соединения, антитела, ингибиторные нуклеиновые кислоты или любую их комбинацию. В конкретном варианте осуществления соединение представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, например антитело к Acvr1 или его антигенсвязывающий фрагмент. В некоторых вариантах осуществления соединение содержит антагонист одного или более из рецептора активина 1, рецептора активина типа 2A и рецептора активина типа 2B. Любой такой антагонист может содержать антитело. В некоторых вариантах осуществления соединение содержит антитело к активину A. Антагонист или антитело к рецептору активина 1, к рецептору активина типа 2A, к рецептору активина типа 2B или к активину A могут представлять собой любой антагонист или антитело, описанные или проиллюстрированные в публикации заявки на патент США №2018/0111983, которая включена в данный документ посредством ссылки.

[0091] Введение соединения можно осуществлять до, во время или после индукции активности рекомбиназы у грызуна, обеспечивающей экспрессию мутантного аллеля Acvr1. Дозы кандидатных терапевтических соединений можно вводить любым необходимым путем введения, включая парентеральные и непарентеральные пути введения. Парентеральные пути включают, например, внутривенный, внутриартериальный, интрапортальный, внутримышечный, подкожный, внутрибрюшинный, интраспинальный, интратекальный, интрацеребровентрикулярный, внутричерепной, интраплевральный или другие пути инъекции. Непарентеральные пути включают, например, пероральный, интраназальный, трансдермальный, внутрилегочный, ректальный, трансбуккальный, вагинальный, внутриглазной. Введение также можно осуществлять путем непрерывной инфузии, местного применения, замедленного высвобождения из имплантатов (гелей, мембран и т. п.) и/или внутривенной инъекции.

[0092] Можно проводить различные анализы для определения фармакокинетических свойств вводимых соединений с применением образцов, полученных от описанных животных из отряда грызунов. Фармакокинетические свойства включают без ограничения характер переработки животным, отличным от человека, соединения в различные метаболиты (или выявление наличия или отсутствия одного или более метаболитов, в том числе без ограничения токсических метаболитов), период полувыведения, уровни циркулирующего в крови соединения (например, концентрация в сыворотке крови), ответ на введение соединения (например, выработка антител), всасывание и распределение, пути выведения и/или клиренс соединения.

[0093] В некоторых вариантах осуществления проведение анализа включает определение отличий между мутантным животным из отряда грызунов, которому вводилось соединение, и мутантным животным из отряда грызунов, которому не вводилось соединение, и определение способности соединения ингибировать развитие и/или прогрессирование образования эктопической костной ткани у грызунов.

[0094] Настоящее описание дополнительно проиллюстрировано следующими примерами, которые не следует понимать как ограничивающие каким-либо образом. Содержание всех приведенных ссылок (включая ссылки на литературу, выданные патенты и опубликованные заявки на патенты, приводимые в настоящей заявке) явным образом включено в данный документ посредством ссылки.

Пример 1

[0095] Область, ограниченную нуклеотидами 58468399-58468770 в mmuAcvr1 (т. е. нуклеотиды 58468399-58468770 хромосомы 2 мыши, GRCm38/mm10), заменяли нуклеиновой кислотой, состоящей из нуклеотидов 157770252-157770625 из hsaACVR1 (т. е. нуклеотидов 157770252-157770625 из хромосомы 2 человека, GRCh38/hg38), таким образом, чтобы введенная последовательность, которая содержит экзон ENSE00001009617 hsaACVR1, транскрибировалась как часть полученного модифицированного локуса Acvr1^[R258G]FlEx. Кроме того, изменяя выбор кодонов, изменяли нуклеотидную последовательность экзона ENSE00001009617 человека с целью снижения степени идентичности последовательности экзона мыши и человека без изменения кодирования белка. Данная введенная последовательность человека далее упоминается в данном документе как hsa_e7+. Следовательно, до момента инверсии FlEx-элемента (измененный экзон ENSMUSE00001232449 и связанные с ним выше- и нижележащие интронные последовательности - см. ниже) полученный локус Acvr1^[R258G]FlEx должен функционировать как локус дикого типа.

[0096] Вариацию R258G моделировали с помощью изменения экзона ENSMUSE00001232449 в соответствующем положении посредством изменения кодона, определенного нуклеотидами 58468530-58468532, с AGG (кодирующего аргинин) на GGG (кодирующий глицин). Полученный измененный экзон вместе с фланкирующей интронной последовательностью помещали 3'-концом к hsa_e7+ и в антисмысловую цепь mmuAcvr1. Кроме того, осуществляли делецию нуклеотидов 58468771-58468815 mmuAcvr1 с целью создания небольшой делеции для размещения LOA-зондов (Gomez-Rodriguez, J. et al. (2008) Nucleic Acids Res. 36:e117; Valenzuela, D. et al. (2003) High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis, Nat. Biotech. 21:652-659). Данная введенная подвергнутая мутации последовательность мыши далее упоминается в данном документе как mmu_e7R258G+.

[0097] С целью обеспечения Cre-зависимой инверсии mmu_e7R258G+ и одновременной делеции hsa_e7+ комбинацию FlEx-подобных Lox-матриц применяли таким образом, чтобы

a) сайт LoxP предшествовал hsa_e7+, а сайт Lox2372 следовал за ней; для этого hsa_e7+ заключали в 5' LoxP-Lox2372 FlEx-подобную матрицу;

b) за mmu_e7R258G+ следовала FlEx-подобная матрица 3'-LoxP-Lox2372, однако данная матрица была сконструирована таким образом, чтобы ее конфигурация являлась зеркальным отображением FlEx-подобной матрицы 5'-LoxP-Lox2372. Это обеспечивало необратимую инверсию mmu_e7R258G+ с помещением в смысловую цепь с помощью Cre.

[0098] Когда полученный аллель Acvr1^[R258G]FlEx подвергался действию Cre, hsa_e7+ подвергалась делеции и mmu_e7R258G+ подвергалась инверсии с помещением в смысловую цепь. В результате этого Acvr1^[R258G] экспрессировался вместо Acvr1.

[0099] Гомозиготные мыши Acvr1^{[R258G]FlEx/ R258G]FlEx]} рождались в ожидаемом менделевском соотношении, что позволяло предположить, что у данной мыши сплайсинг прошел нормально и экспрессировался Acvr1 дикого типа.

Пример 2

Индуцирование FOP у мышей Acvr1^[R258G]FlEx

[0100] Для обеспечения управляемой по времени и при этом общеорганизменной инверсии ^[R258G]FlEx-аллеля Acvr1, мышей Acvr1^[R258G]FlEx спаривали с мышами Gt(ROSA26)Sor^CreERT2/+ для получения Acvr1^[R258G]FlEx; Gt(ROSA26)Sor^CreERT2/+. У них поддерживали гетерозиготность при смешанном C57BL/6NTac-129S6/SvEvTac генетическом фоне. Все эксперименты проводили в соответствии с протоколами Комитета по содержанию и использованию лабораторных животных компании Regeneron. Использовали как самцов, так и самок мышей в возрасте 8-11 недель, однако мышей распределяли между группами по возрастному и половому признаку. Фенотипов, связанных с полом или возрастом, не отмечено. Модель инициировали посредством инверсии экзона, кодирующего R258G, с помещением его в смысловую цепь, достижение чего обеспечивали путем обработки мышей Acvr1^[R258G]FlEx; Gt(ROSA26)Sor^CreERT2/+ раствором тамоксифена (Sigma) в масле в дозе 40 мг/кг внутрибрюшинно (i. p.) ежедневно в течение 5 дней (для активации CreER^T2). Для оценки гетеротопической оссификации мышей анестезировали изофлураном и подвергали сканированию всего тела с полем зрения 60 мм х 120 мм с применением микрокомпьютерной томографии in vivo (Quantum FX, PerkinElmer, Хопкинтон, Массачусетс, США). В источнике рентгеновского излучения устанавливали значение тока 160 мкА, значение пикового напряжения - 90 кВп, при этом размер вокселя составлял 120 мкм или 240 мкм.

[0101] Взрослые особи мышей Acvr1^R258GFlEx/+; Gt(ROSA26)Sor^CreERt2/+ были фенотипически нормальными; однако общеорганизменная активация мутантного аллеля Acvr1 с R258G привела к развитию прогрессирующей оссификации, видимой при рентгенографическом исследовании уже через 2 недели после введения доз тамоксифена, аналогично тому, как это наблюдали у мышей Acvr1R206HFlex, описанных в патенте США №9510569. См. также фиг. 2.

Введение доз антител мышам

[0102] Для исследований с обработкой мышей Acvr1^{[R258G]FlEx/+}; Rosa^CreERT2 разделяли на соответствующие группы по возрастному и половому признаку, обработки начинали в тот же день, в который начинали введение тамоксифена. Мышам вводили подкожные инъекции (s. c.) 25 мг/кг либо нейтрализующего антитела к активину A человека (заявка на патент США №2015/0037339), либо антитела изотипического контроля еженедельно в течение 6 недель. Мониторинг гетеротопической оссификации проводили еженедельно с помощью системы визуализации на основе μCT in vivo.

[0103] Как показано на фиг. 3, у мышей, получавших антитело изотипического контроля, HO развивалась на неделе 4, а у мышей, получавших блокирующее антитело к активину A, через 4 недели не наблюдали поддающегося обнаружению уровня образования HO, превышающего фоновые значения μCT.

[0104] Таким образом, аллели ACVR1^R206H или ACVR1^R258G с активированным условным нокином обеспечивают точное моделирование прогрессирующей оссифицирующей фибродисплазии (FOP) у грызунов, таких как мыши; и нейтрализующее антитело к активину A блокирует развитие гетеротопической оссификации в такой модели на грызунах.

Дополнительные варианты осуществления

1. Генетически модифицированный грызун, геном которого содержит модифицированный ген Acvr1 грызуна в пределах эндогенного локуса Acvr1 грызуна, где модифицированный ген Acvr1 грызуна содержит:

a) по сути человеческий экзон 7 ACVR1 в смысловой ориентации, фланкированный первой парой сайтов распознавания сайт-специфической рекомбиназы (SRRS), где по сути человеческий экзон 7 ACVR1 кодирует те же аминокислоты, что и экзон 7 ACVR1 человека; и

b) измененный экзон 7 Acvr1 грызуна, кодирующий R258G, в антисмысловой ориентации, фланкированный второй парой SRRS, которые отличаются от первой пары SRRS;

где первые и вторые SRRS ориентированы таким образом, чтобы рекомбиназа могла осуществить инверсию мутантного экзона 7 Acvr1 грызуна с обеспечением его расположения в смысловой ориентации, осуществить делецию по сути человеческого экзона 7 ACVR1 и обеспечить экспрессию измененного аллеля Acvr1, содержащего измененный экзон 7 Acvr1 грызуна.

2. Генетически модифицированный грызун по пункту 1, где по сути человеческий экзон 7 ACVR1 отличается от экзона 7 ACVR1 человека по меньшей мере одним нуклеотидом и характеризуется сниженной степенью идентичности последовательности с измененным экзоном 7 Acvr1 грызуна по сравнению со степенью идентичности последовательности между экзоном 7 ACVR1 человека и измененным экзоном 7 Acvr1 грызуна.

3. Генетически модифицированный грызун по пункту 1, где ген, кодирующий рекомбиназу, содержится в геноме генетически модифицированного грызуна и активность рекомбиназы является индуцируемой.

4. Генетически модифицированный грызун в соответствии с любым из пунктов 1-3, где рекомбиназа представляет собой Cre.

5. Генетически модифицированный грызун по пункту 4, где Cre является слитой с лигандсвязывающим доменом эстрогенового рецептора (ER) таким образом, что активность Cre индуцируется при связывании лиганда с ER.

6. Генетически модифицированный грызун по пункту 5, где лигандсвязывающий домен ER содержит T2-мутации.

7. Генетически модифицированный грызун по пункту 5 или пункту 6, где лиганд представляет собой тамоксифен.

8. Генетически модифицированный грызун по любому из пунктов 1-7, где генетически модифицированный грызун является гомозиготным по модифицированному гену Acvr1.

9. Мутантный грызун, полученный от генетически модифицированного грызуна по любому из пунктов 1-8, где мутантный грызун имеет геном, содержащий измененный аллель Acvr1, который содержит измененный экзон 7 в смысловой ориентации, и где измененный аллель Acvr1 экспрессируется у мутантного грызуна, результатом чего является образование эктопической костной ткани.

10. Грызун в соответствии с любым из предыдущих пунктов, выбранный из мыши или крысы.

11. Нуклеиновая кислота, содержащая модифицированный ген Acvr1 грызуна, где модифицированный ген Acvr1 грызуна содержит:

a) по сути человеческий экзон 7 ACVR1 в смысловой ориентации, фланкированный первой парой сайтов распознавания сайт-специфической рекомбиназы (SRRS), где по сути человеческий экзон 7 ACVR1 кодирует те же аминокислоты, что и экзон 7 ACVR1 человека; и

b) измененный экзон 7 Acvr1 грызуна, кодирующий R258G, в антисмысловой ориентации, фланкированный второй парой SRRS, которые отличаются от первой пары SRRS;

где первые и вторые SRRS ориентированы таким образом, чтобы рекомбиназа могла осуществить инверсию мутантного экзона 7 Acvr1 грызуна с обеспечением его расположения в смысловой ориентации, осуществить делецию по сути человеческого экзона 7 ACVR1.

12. Нуклеиновая кислота по пункту 11, где по сути человеческий экзон 7 ACVR1 отличается от экзона 7 ACVR1 человека по меньшей мере одним нуклеотидом и характеризуется сниженной степенью идентичности последовательности с измененным экзоном 7 Acvr1 грызуна по сравнению со степенью идентичности последовательности между экзоном 7ACVR1 человека и измененным экзоном 7 Acvr1 грызуна.

13. Нуклеиновая кислота по пункту 11, где активность рекомбиназы является индуцируемой.

14. Нуклеиновая кислота по любому из пунктов 11-13, где рекомбиназа представляет собой Cre.

15. Нуклеиновая кислота по пункту 14, где Cre является слитой с лигандсвязывающим доменом эстрогенового рецептора (ER) таким образом, что активность Cre индуцируется при связывании лиганда с ER.

16. Нуклеиновая кислота по пункту 15, где лигандсвязывающий домен ER содержит T2-мутации.

17. Нуклеиновая кислота по пункту 15 или пункту 16, где лиганд представляет собой тамоксифен.

18. Нуклеиновая кислота по любому из пунктов 11-17, где грызун представляет собой мышь или крысу.

19. Геном грызуна, содержащий нуклеиновую кислоту по пункту 11 или пункту 12.

20. Геном грызуна по пункту 19, дополнительно содержащий ген, кодирующий рекомбиназу, которая распознает SRRS и осуществляет инверсию измененного экзона.

21. Геном грызуна по пункту 20, где активность рекомбиназы является индуцируемой.

22. Геном грызуна по пункту 21, где рекомбиназа представляет собой Cre.

23. Геном грызуна по пункту 22, где Cre является слитой с лигандсвязывающим доменом эстрогенового рецептора (ER) таким образом, что активность Cre индуцируется при связывании лиганда с ER.

24. Геном грызуна по пункту 23, где лигандсвязывающий домен ER содержит T2-мутации.

25. Геном грызуна по пункту 23 или пункту 24, где лиганд представляет собой тамоксифен.

26. Геном грызуна по любому из пунктов 19-25, где геном грызуна является гомозиготным по модифицированному гену Acvr1.

27. Геном грызуна по любому из пунктов 19-26, где грызун представляет собой мышь или крысу.

28. Выделенная ткань или клетка грызуна, содержащая геном грызуна по любому из пунктов 19-27.

29. Выделенная ткань или клетка грызуна по пункту 28, где грызун представляет собой мышь или крысу.

30. Выделенная ткань или клетка грызуна по пункту 28 или пункту 29, где клетка грызуна представляет собой эмбриональную стволовую клетку.

31. Конструкция нуклеиновой кислоты для целенаправленной модификации гена Acvr1 в геноме грызуна, которая содержит:

a) по сути человеческий экзон 7 ACVR1 в смысловой ориентации, фланкированный первой парой сайтов распознавания сайт-специфической рекомбиназы (SRRS), где по сути человеческий экзон 7 ACVR1 кодирует те же аминокислоты, что и экзон 7 ACVR1 человека; и

b) измененный экзон 7 Acvr1 грызуна, кодирующий R258G, в антисмысловой ориентации, фланкированный второй парой SRRS, которые отличаются от первой пары SRRS;

где первые и вторые SRRS ориентированы таким образом, чтобы рекомбиназа могла осуществить инверсию мутантного экзона 7 Acvr1 грызуна с обеспечением его расположения в смысловой ориентации, осуществить делецию по сути человеческого экзона 7 ACVR1 и обеспечить экспрессию измененного аллеля Acvr1, содержащего измененный экзон 7 Acvr1 грызуна.

32. Конструкция нуклеиновой кислоты по пункту 31, где по сути человеческий экзон 7 ACVR1 отличается от экзона 7 ACVR1 человека по меньшей мере одним нуклеотидом и характеризуется сниженной степенью идентичности последовательности с измененным экзоном 7 Acvr1 грызуна по сравнению со степенью идентичности последовательности между экзоном 7 ACVR1 человека и измененным экзоном 7 Acvr1 грызуна.

33. Конструкция нуклеиновой кислоты по пункту 31, где первая и вторая пары SRRS представляют собой Lox2372 и LoxP или наоборот.

34. Конструкция нуклеиновой кислоты по пункту 31, где рекомбиназа представляет собой Cre.

35. Конструкция нуклеиновой кислоты по пункту 34, где Cre является слитой с эстрогеновым рецептором (ER) таким образом, что активность Cre индуцируется при связывании лиганда с ER.

36. Конструкция нуклеиновой кислоты по пункту 35, где ER содержит T2-мутации.

37. Конструкция нуклеиновой кислоты по пункту 35, где лиганд представляет собой тамоксифен.

38. Конструкция нуклеиновой кислоты в соответствии с любым из пунктов 31-37, где грызун выбран из мыши или крысы.

39. Способ получения генетически модифицированного грызуна, включающий модифицирование генома грызуна таким образом, чтобы он содержал модифицированный ген Acvr1 грызуна в пределах эндогенного локуса Acvr1 грызуна, где модифицированный ген Acvr1 грызуна содержит:

a) по сути человеческий экзон 7 ACVR1 в смысловой ориентации, фланкированный первой парой сайтов распознавания сайт-специфической рекомбиназы (SRRS), где по сути человеческий экзон 7 ACVR1 кодирует те же аминокислоты, что и экзон 7 ACVR1 человека; и

b) измененный экзон 7 Acvr1 грызуна, кодирующий R258G, в антисмысловой ориентации, фланкированный второй парой SRRS, которые отличаются от первой пары SRRS;

где первые и вторые SRRS ориентированы таким образом, чтобы рекомбиназа могла осуществить инверсию измененного экзона 7 Acvr1 грызуна с обеспечением его расположения в смысловой ориентации, осуществить делецию по сути человеческого экзона 7 ACVR1 и обеспечить экспрессию измененного аллеля Acvr1, содержащего измененный экзон 7 Acvr1 грызуна.

40. Способ по пункту 39, где геном грызуна модифицируют посредством способа, включающего:

a) введение конструкции нуклеиновой кислоты в эмбриональную стволовую (ES) клетку грызуна, где конструкция нуклеиновой кислоты содержит:

по сути человеческий экзон 7 ACVR1 в смысловой ориентации, фланкированный первой парой SRRS; и

измененный экзон 7 Acvr1 грызуна, кодирующий R258G, в антисмысловой ориентации, фланкированный второй парой SRRS;

где конструкция нуклеиновой кислоты целенаправленно воздействует на эндогенный локус Acvr1 грызуна с получением в результате модифицированного гена Acvr1 грызуна в пределах эндогенного локуса Acvr1 грызуна;

b) получение генетически модифицированной ES-клетки грызуна, геном которой содержит модифицированный ген Acvr1 грызуна; и

c) получение генетически модифицированного грызуна с применением генетически модифицированной ES-клетки грызуна из b).

41. Способ по пункту 39 или пункту 40, где генетически модифицированный грызун является гомозиготным по модифицированному гену Acvr1.

42. Способ по пункту 40 или пункту 41, где ES-клетка грызуна дополнительно содержит ген, кодирующий рекомбиназу.

43. Способ по любому из пунктов 39-42, где активность рекомбиназы является индуцируемой.

44. Способ в соответствии с любым из пунктов 39-43, где рекомбиназа представляет собой Cre.

45. Способ по пункту 44, где Cre является слитой с лигандсвязывающим доменом эстрогенового рецептора (ER) таким образом, что активность Cre индуцируется при связывании лиганда с ER.

46. Способ по пункту 45, где лигандсвязывающий домен ER содержит T2-мутации.

47. Способ по пункту 45 или пункту 46, где лиганд представляет собой тамоксифен.

48. Способ по любому из пунктов 43-47, дополнительно включающий индуцирование активности рекомбиназы в клетке или ткани грызуна, где рекомбиназа осуществляет инверсию измененного экзона 7, осуществляя делецию по сути человеческого экзона 7, вследствие чего обеспечивается экспрессия измененного аллеля Acvr1, содержащего измененный экзон 7, в клетке или ткани.

49. Способ в соответствии с любым из пунктов 40-48, где грызун выбран из мыши или крысы.

50. Способ скрещивания, включающий скрещивание первого грызуна, геном которого содержит модифицированный ген Acvr1 грызуна, со второй мышью с получением в результате грызуна-потомка, геном которого содержит модифицированный ген Acvr1 грызуна, где модифицированный ген Acvr1 грызуна содержит:

a) по сути человеческий экзон 7 ACVR1 в смысловой ориентации, фланкированный первой парой сайтов распознавания сайт-специфической рекомбиназы (SRRS), где по сути человеческий экзон 7 ACVR1 кодирует те же аминокислоты, что и экзон 7 ACVR1 человека; и

b) измененный экзон 7 Acvr1 грызуна, кодирующий R258G, в антисмысловой ориентации, фланкированный второй парой SRRS, которые отличаются от первой пары SRRS;

где первые и вторые SRRS ориентированы таким образом, чтобы рекомбиназа могла осуществить инверсию измененного экзона 7 Acvr1 грызуна с обеспечением его расположения в смысловой ориентации, осуществить делецию по сути человеческого экзона 7 ACVR1 и обеспечить экспрессию измененного аллеля Acvr1, содержащего измененный экзон 7 Acvr1 грызуна.

51. Способ по пункту 50, где первый грызун является гомозиготным по модифицированному гену Acvr1 грызуна.

52. Способ по пункту 50 или пункту 51, где второй грызун содержит индуцируемую рекомбиназу.

53. Способ по пункту 52, где индуцируемая рекомбиназа представляет собой индуцируемую рекомбиназу Cre.

54. Способ по пункту 53, где индуцируемая рекомбиназа Cre включает индуцируемую тамоксифеном рекомбиназу Cre-ER^T2.

55. Способ по любому из пунктов 52-54, дополнительно включающий индуцирование индуцируемой рекомбиназы в клетке или ткани у грызуна-потомка таким образом, чтобы индуцированная рекомбиназа осуществила инверсию измененного экзона 7 Acvr1 грызуна с обеспечением его расположения в смысловой ориентации и осуществила делецию по сути человеческого экзона 7 ACVR1 в клетке или ткани с получением в результате измененного аллеля Acvr1, содержащего измененный экзон 7 Acvr1 грызуна.

56. Способ по любому из пунктов 50-55, где грызун представляет собой мышь или крысу.

57. Грызун-потомок, полученный согласно способу по любому из пунктов 50-56.

58. Способ испытания кандидатного терапевтического соединения для лечения, направленного против образования эктопической костной ткани, включающий:

получение генетически модифицированного грызуна в соответствии с любым из пунктов 1-8 и 10;

индуцирование активности рекомбиназы у грызуна для обеспечения экспрессии измененного аллеля Acvr1, содержащего измененный экзон 7 Acvr1 грызуна;

введение кандидатного соединения грызуну; и

определение того, ингибирует ли кандидатное соединение развитие образования эктопической костной ткани у грызуна.

59. Способ по пункту 58, где кандидатное соединение вводят грызуну до индукции активности рекомбиназы, во время этого или после этого.

60. Способ по пункту 58, где кандидатное соединение представляет собой низкомолекулярное химическое соединение.

61. Способ по пункту 58, где кандидатное соединение представляет собой нуклеиновую кислоту.

62. Способ по пункту 58, где кандидатное соединение представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент.

63. Способ по пункту 62, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент представляют собой антитело к рецептору активина 1 или его антигенсвязывающий фрагмент.

64. Способ по пункту 62, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент представляют собой антитело к рецептору активина типа 2A или его антигенсвязывающий фрагмент.

65. Способ по пункту 62, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент представляют собой антитело к рецептору активина типа 2B или его антигенсвязывающий фрагмент.

66. Способ по пункту 62, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент представляют собой антитело к активину типа A или его антигенсвязывающий фрагмент.

67. Способ в соответствии с любым из пунктов 58-66, где грызун представляет собой мышь или крысу.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Регенерон Фармасьютикалс, Инк.

<120> Модель прогрессирующей оссифицирующей фибродисплазии на грызунах

<130> 36190PCT (10461WO01)

<160> 8

<170> PatentIn версия 3.5

<210> 1

<211> 147

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 1

ggaaaggcag gtatggtgag gtgtggaggg gcagctggca aggggagaat gttgccgtga 60

agatcttctc ctcccgtgat gagaagtcat ggttcaggga aacggaattg tacaacactg 120

tgatgctgag gcatgaaaat atcttag 147

<210> 2

<211> 147

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический полинуклеотид

<400> 2

ggaaagggag atacggtgag gtgtggcgcg gatcttggca gggagagaac gttgccgtca 60

aaatttttag cagccgtgat gaaaaaagct ggtttagaga aacagagctc tataatacag 120

tcatgctgag gcacgagaac attctgg 147

<210> 3

<211> 374

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический полинуклеотид

<400> 3

agcaatggag ggattaagag ttgcatgcac taaattaatt attcttaatg atgggctggc 60

tgcctccaaa atgactactg ttctgtgtca cctatgtttt gcttttcata gggaaaggga 120

gatacggtga ggtgtggcgc ggatcttggc agggagagaa cgttgccgtc aaaattttta 180

gcagccgtga tgaaaaaagc tggtttagag aaacagagct ctataataca gtcatgctga 240

ggcacgagaa cattctgggt aagtacaagg ataaccccct cattaattgt atctagggag 300

aaacaattgt ctgcctttgc tctctccgtt ttggtgaatg tgaattcgag agtgtctcct 360

aaaaagcaat atag 374

<210> 4

<211> 147

<212> ДНК

<213> Mus musculus

<400> 4

ggaagggccg gtatggagaa gtatggaggg gcagctggca aggcgaaaat gtcgctgtga 60

agatcttctc ctcccgagac gagaagtcat ggttcaggga gacggaattg tacaacactg 120

tgatgttggg gcatgaaaat atcttag 147

<210> 5

<211> 147

<212> ДНК

<213> Mus musculus

<400> 5

ctaagatatt ttcatgcccc aacatcacag tgttgtacaa ttccgtctcc ctgaaccatg 60

acttctcgtc tcgggaggag aagatcttca cagcgacatt ttcgccttgc cagctgcccc 120

tccatacttc tccataccgg cccttcc 147

<210> 6

<211> 372

<212> ДНК

<213> Mus musculus

<400> 6

gagaagagca ggaggttcaa atataaggac actgtcgggt tcactgtgtt tgagaggaaa 60

aggaaagcca acccatttct tacatatatc atctgttttg ctgtccacag ggaagggccg 120

gtatggagaa gtatggaggg gcagctggca aggcgaaaat gtcgctgtga agatcttctc 180

ctcccgagac gagaagtcat ggttcaggga gacggaattg tacaacactg tgatgttggg 240

gcatgaaaat atcttaggtg agtaccaggt gagctttcac cagctggtct ccatagagat 300

aagggccggc cctttctctc tcccatttgc caaatctgag gtgtgtggag tctcttctgg 360

aaaacaacat ag 372

<210> 7

<211> 372

<212> ДНК

<213> Mus musculus

<400> 7

ctatgttgtt ttccagaaga gactccacac acctcagatt tggcaaatgg gagagagaaa 60

gggccggccc ttatctctat ggagaccagc tggtgaaagc tcacctggta ctcacctaag 120

atattttcat gccccaacat cacagtgttg tacaattccg tctccctgaa ccatgacttc 180

tcgtctcggg aggagaagat cttcacagcg acattttcgc cttgccagct gcccctccat 240

acttctccat accggccctt ccctgtggac agcaaaacag atgatatatg taagaaatgg 300

gttggctttc cttttcctct caaacacagt gaacccgaca gtgtccttat atttgaacct 360

cctgctcttc tc 372

<210> 8

<211> 147

<212> ДНК

<213> Rattus norvegicus

<400> 8

ggaagggccg gtatggagaa gtgtggaggg gcagctggca aggcgaaaat gttgctgtga 60

agatcttctc ctcccgtgat gagaagtcgt ggttcaggga gacagaattg tacaacacgg 120

tgatgctgag gcatgagaat atcttag 147

<---

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к генетически модифицированному грызуну для экспрессии измененного белка Acvr1 грызуна, содержащему R258G, где геном грызуна содержит модифицированный ген Acvr1 грызуна в пределах эндогенного локуса Acvr1 грызуна, к его клетке, ткани и геному, а также к способу получения указанного грызуна. Также раскрыта нуклеиновая кислота для экспрессии измененного белка Acvr1 грызуна, содержащего R258G, где нуклеиновая кислота содержит модифицированный ген Acvr1 грызуна, а также конструкция нуклеиновой кислоты для целенаправленной модификации гена Acvr1 в геноме грызуна. Изобретение также относится к способу получения антитела против Абета или его антигенсвязывающего фрагмента. Изобретение эффективно для испытания кандидатного терапевтического соединения для лечения, направленного против образования эктопической костной ткани. 10 н. и 54 з.п. ф-лы, 3 ил., 2 пр.

1. Генетически модифицированный грызун для экспрессии измененного белка Acvr1 грызуна, содержащего R258G, где геном грызуна содержит модифицированный ген Acvr1 грызуна в пределах эндогенного локуса Acvr1 грызуна, где модифицированный ген Acvr1 грызуна содержит:

a) по сути человеческий экзон 7 ACVR1 в смысловой ориентации, фланкированный первой парой сайтов распознавания сайт-специфической рекомбиназы (SRRS); и

b) измененный экзон 7 Acvr1 грызуна, кодирующий R258G, в антисмысловой ориентации, фланкированный второй парой SRRS, которая отличается от первой пары SRRS;

где по сути человеческий экзон 7 ACVR1 (i) кодирует те же аминокислоты, что и человеческий экзон 7 ACVR1, но отличается от экзона 7 ACVR1 человека по меньшей мере одним нуклеотидом; и (ii) характеризуется сниженной степенью идентичности последовательности с измененным экзоном 7 Acvr1 грызуна по сравнению с экзоном 7 ACVR1 человека;

где первая и вторая пары SRRS ориентированы таким образом, чтобы рекомбиназа могла осуществить инверсию измененного экзона 7 Acvr1 грызуна с обеспечением его расположения в смысловой ориентации, осуществить делецию по сути человеческого экзона 7 ACVR1 и обеспечить экспрессию измененного аллеля Acvr1, содержащего измененный экзон 7 Acvr1 грызуна, таким образом экспрессируя измененный белок Acvr1 грызуна, содержащий R258G; и

где грызун представляет собой мышь или крысу.

2. Генетически модифицированный грызун по п. 1, где ген, кодирующий рекомбиназу, содержится в геноме генетически модифицированного грызуна и активность рекомбиназы является индуцируемой.

3. Генетически модифицированный грызун по п. 1 или 2, где рекомбиназа представляет собой Cre.

4. Генетически модифицированный грызун по п. 3, где Cre является слитой с лигандсвязывающим доменом эстрогенового рецептора (ER), благодаря чему активность Cre индуцируется при связывании лиганда с ER.

5. Генетически модифицированный грызун по п. 4, где лигандсвязывающий домен ER содержит Т2-мутации.

6. Генетически модифицированный грызун по п. 4 или 5, где лиганд представляет собой тамоксифен.

7. Генетически модифицированный грызун по любому из пп. 1-6, где генетически модифицированный грызун является гомозиготным по модифицированному гену Acvr1.

8. Мутантный грызун, который экспрессирует измененный белок Acvr1, содержащий R258G, где мутантный грызун получен от генетически модифицированного грызуна по любому из пп. 1-7 и имеет геном, содержащий измененный аллель Acvr1, который содержит измененный экзон 7 в смысловой ориентации, и где измененный аллель Acvr1 экспрессируется у мутантного грызуна, результатом чего является образование эктопической костной ткани.

9. Грызун по любому из предыдущих пунктов, где грызун представляет собой мышь.

10. Нуклеиновая кислота для экспрессии измененного белка Acvr1 грызуна, содержащего R258G, где нуклеиновая кислота содержит модифицированный ген Acvr1 грызуна и где модифицированный ген Acvr1 грызуна содержит:

а) по сути человеческий экзон 7 ACVR1 в смысловой ориентации, фланкированный первой парой сайтов распознавания сайт-специфической рекомбиназы (SRRS); и

b) измененный экзон 7 Acvr1 грызуна, кодирующий R258G, в антисмысловой ориентации, фланкированный второй парой SRRS, которая отличается от первой пары SRRS;

где по сути человеческий экзон 7 ACVR1 (i) кодирует те же аминокислоты, что и человеческий экзон 7 ACVR1, но отличается от экзона 7 ACVR1 человека по меньшей мере одним нуклеотидом; и (ii) характеризуется сниженной степенью идентичности последовательности с измененным экзоном 7 Acvr1 грызуна по сравнению с экзоном 7 ACVR1 человека;

где первая и вторая пары SRRS ориентированы таким образом, чтобы рекомбиназа могла осуществить инверсию измененного экзона 7 Acvr1 грызуна с обеспечением его расположения в смысловой ориентации, осуществить делецию по сути человеческого экзона 7 ACVR1; и

где грызун представляет собой мышь или крысу.

11. Нуклеиновая кислота по п. 10, где активность рекомбиназы является индуцируемой.

12. Нуклеиновая кислота по п. 10 или 11, где рекомбиназа представляет собой Cre.

13. Нуклеиновая кислота по п. 12, где Cre является слитой с лигандсвязывающим доменом эстрогенового рецептора (ER), благодаря чему активность Cre индуцируется при связывании лиганда с ER.

14. Нуклеиновая кислота по п. 13, где лигандсвязывающий домен ER содержит Т2-мутации.

15. Нуклеиновая кислота по п. 13 или 14, где лиганд представляет собой тамоксифен.

16. Нуклеиновая кислота по любому из пп. 10-15, где грызун представляет собой мышь.

17. Геном грызуна для экспрессии измененного белка Acvr1 грызуна, содержащего R258G, где геном грызуна содержит нуклеиновую кислоту по п. 10 и где грызун представляет собой мышь или крысу.

18. Геном грызуна по п. 17, дополнительно содержащий ген, кодирующий рекомбиназу, которая распознает SRRS и осуществляет инверсию измененного экзона.

19. Геном грызуна по п. 18, где активность рекомбиназы является индуцируемой.

20. Геном грызуна по п. 19, где рекомбиназа представляет собой Cre.

21. Геном грызуна по п. 20, где Cre является слитой с лигандсвязывающим доменом эстрогенового рецептора (ER), благодаря чему активность Cre индуцируется при связывании лиганда с ER.

22. Геном грызуна по п. 21, где лигандсвязывающий домен ER содержит Т2-мутации.

23. Геном грызуна по п. 21 или 22, где лиганд представляет собой тамоксифен.

24. Геном грызуна по любому из пп. 17-23, где геном грызуна является гомозиготным по модифицированному гену Acvr1.

25. Геном грызуна по любому из пп. 17-24, где грызун представляет собой мышь.

26. Выделенная ткань для экспрессии измененного белка Acvr1 грызуна, содержащего R258G, где выделенная ткань грызуна содержит геном грызуна по любому из пп. 17-25, где грызун представляет собой мышь или крысу.

27. Выделенная ткань грызуна по п. 26, где грызун представляет собой мышь.

28. Выделенная клетка грызуна для экспрессии измененного белка Acvr1 грызуна, содержащего R258G, где выделенная клетка грызуна содержит геном грызуна по любому из пп. 17-25, где грызун представляет собой мышь или крысу.

29. Выделенная клетка грызуна по п. 28, где грызун представляет собой мышь.

30. Выделенная клетка грызуна по п. 28 или 29, где клетка грызуна представляет собой эмбриональную стволовую клетку.

31. Конструкция нуклеиновой кислоты для целенаправленной модификации гена Acvr1 в геноме грызуна, которая содержит:

a) по сути человеческий экзон 7 ACVR1 в смысловой ориентации, фланкированный первой парой сайтов распознавания сайт-специфической рекомбиназы (SRRS); и

b) измененный экзон 7 Acvr1 грызуна, кодирующий R258G, в антисмысловой ориентации, фланкированный второй парой SRRS, которая отличается от первой пары SRRS;

где по сути человеческий экзон 7 ACVR1 (i) кодирует те же аминокислоты, что и человеческий экзон 7 ACVR1, но отличается от экзона 7 ACVR1 человека по меньшей мере одним нуклеотидом; и (ii) характеризуется сниженной степенью идентичности последовательности с измененным экзоном 7 Acvr1 грызуна по сравнению с экзоном 7 ACVR1 человека;

где первая и вторая пары SRRS ориентированы таким образом, чтобы рекомбиназа могла осуществить инверсию измененного экзона 7 Acvr1 грызуна с обеспечением его расположения в смысловой ориентации, осуществить делецию по сути человеческого экзона 7 ACVR1 и обеспечить экспрессию измененного аллеля Acvr1, содержащего измененный экзон 7 Acvr1 грызуна; и где грызун представляет собой мышь или крысу.

32. Конструкция нуклеиновой кислоты по п. 31, где первая и вторая пары SRRS представляют собой Lox2372 и LoxP или наоборот.

33. Конструкция нуклеиновой кислоты по п. 31, где рекомбиназа представляет собой Cre.

34. Конструкция нуклеиновой кислоты по п. 33, где Cre является слитой с эстрогеновым рецептором (ER), благодаря чему активность Cre индуцируется при связывании лиганда с ER.

35. Конструкция нуклеиновой кислоты по п. 34, где ER содержит Т2-мутации.

36. Конструкция нуклеиновой кислоты по п. 34, где лиганд представляет собой тамоксифен.

37. Конструкция нуклеиновой кислоты по любому из пп. 31-36, где грызун представляет собой мышь.

38. Способ получения генетически модифицированного грызуна, включающий модифицирование генома грызуна для содержания модифицированного гена Acvr1 грызуна в пределах эндогенного локуса Acvr1 грызуна, где модифицированный ген Acvr1 грызуна содержит:

a) по сути человеческий экзон 7 ACVR1 в смысловой ориентации, фланкированный первой парой сайтов распознавания сайт-специфической рекомбиназы (SRRS); и

b) измененный экзон 7 Acvr1 грызуна, кодирующий R258G, в антисмысловой ориентации, фланкированный второй парой SRRS, которая отличается от первой пары SRRS;

где по сути человеческий экзон 7 ACVR1 (i) кодирует те же аминокислоты, что и человеческий экзон 7 ACVR1, но отличается от экзона 7 ACVR1 человека по меньшей мере одним нуклеотидом; и (ii) характеризуется сниженной степенью идентичности последовательности с измененным экзоном 7 Acvr1 грызуна по сравнению с экзоном 7 ACVR1 человека;

где первая и вторая пары SRRS ориентированы таким образом, чтобы рекомбиназа могла осуществить инверсию измененного экзона 7 Acvr1 грызуна с обеспечением его расположения в смысловой ориентации, осуществить делецию по сути человеческого экзона 7 ACVR1 и обеспечить экспрессию измененного аллеля Acvr1, содержащего измененный экзон 7 Acvr1 грызуна; где грызун представляет собой мышь или крысу, где геном грызуна модифицируют посредством способа, включающего:

i) введение конструкции нуклеиновой кислоты в эмбриональную стволовую (ES) клетку грызуна, где конструкция нуклеиновой кислоты содержит:

по сути человеческий экзон 7 ACVR1 в смысловой ориентации, фланкированный первой парой SRRS; и

измененный экзон 7 Acvr1 грызуна, кодирующий R258G, в антисмысловой ориентации, фланкированный второй парой SRRS;

где конструкция нуклеиновой кислоты целенаправленно воздействует на эндогенный локус Acvr1 грызуна с образованием в результате модифицированного гена Acvr1 грызуна в пределах эндогенного локуса Acvr1 грызуна;

ii) получение генетически модифицированной ES-клетки грызуна, геном которой содержит модифицированный ген Acvr1 грызуна; и

iii) получение генетически модифицированного грызуна с применением генетически модифицированной ES-клетки грызуна из ii).

39. Способ по п. 38, где генетически модифицированный грызун является гомозиготным по модифицированному гену Acvr1.

40. Способ по п. 38 или 39, где ES-клетка грызуна дополнительно содержит ген, кодирующий рекомбиназу.

41. Способ по любому из пп. 38-40, где активность рекомбиназы является индуцируемой.

42. Способ по любому из пп. 38-41, где рекомбиназа представляет собой Cre.

43. Способ по п. 42, где Cre является слитой с лигандсвязывающим доменом эстрогенового рецептора (ER), благодаря чему активность Cre индуцируется при связывании лиганда с ER.

44. Способ по п. 43, где лигандсвязывающий домен ER содержит Т2-мутации.

45. Способ по п. 43 или 44, где лиганд представляет собой тамоксифен.

46. Способ по любому из пп. 41-45, дополнительно включающий индуцирование активности рекомбиназы в клетке или ткани грызуна, где рекомбиназа осуществляет инверсию измененного экзона 7 Acvr1 грызуна, осуществляя делецию по сути человеческого экзона 7, вследствие чего обеспечивается экспрессия измененного аллеля Acvr1, содержащего измененный экзон 7 Acvr1 грызуна, в клетке или ткани.

47. Способ по любому из пп. 38-46, где грызун представляет собой мышь.

48. Способ скрещивания, включающий скрещивание первого грызуна, геном которого содержит модифицированный ген Acvr1 грызуна, со вторым грызуном с получением в результате грызуна-потомка, геном которого содержит модифицированный ген Acvr1 грызуна, где модифицированный ген Acvr1 грызуна содержит:

a) по сути человеческий экзон 7 ACVR1 в смысловой ориентации, фланкированный первой парой сайтов распознавания сайт-специфической рекомбиназы (SRRS); и

b) измененный экзон 7 Acvr1 грызуна, кодирующий R258G, в антисмысловой ориентации, фланкированный второй парой SRRS, которая отличается от первой пары SRRS;

где по сути человеческий экзон 7 ACVR1 (i) кодирует те же аминокислоты, что и человеческий экзон 7 ACVR1, но отличается от экзона 7 ACVR1 человека по меньшей мере одним нуклеотидом; и (ii) характеризуется сниженной степенью идентичности последовательности с измененным экзоном 7 Acvr1 грызуна по сравнению с экзоном 7 ACVR1 человека;

где первая и вторая пары SRRS ориентированы таким образом, чтобы рекомбиназа могла осуществить инверсию измененного экзона 7 Acvr1 грызуна с обеспечением его расположения в смысловой ориентации, осуществить делецию по сути человеческого экзона 7 ACVR1 и обеспечить экспрессию измененного аллеля Acvr1, содержащего измененный экзон 7 Acvr1 грызуна; и где грызун представляет собой мышь или крысу.

49. Способ по п. 48, где первый грызун является гомозиготным по модифицированному гену Acvr1 грызуна.

50. Способ по п. 48 или 49, где второй грызун содержит индуцируемую рекомбиназу.

51. Способ по п. 50, где индуцируемая рекомбиназа представляет собой индуцируемую рекомбиназу Cre.

52. Способ по п. 51, где индуцируемая рекомбиназа Cre включает индуцируемую тамоксифеном рекомбиназу Cre-ER^T2.

53. Способ по любому из пп. 50-52, дополнительно включающий индуцирование индуцируемой рекомбиназы в клетке или ткани у грызуна-потомка таким образом, чтобы индуцированная рекомбиназа осуществила инверсию измененного экзона 7 Acvr1 грызуна с обеспечением его расположения в смысловой ориентации и осуществила делецию по сути человеческого экзона 7 ACVR1 в клетке или ткани с получением в результате измененного аллеля Acvr1, содержащего измененный экзон 7 Acvr1 грызуна.

54. Способ по любому из пп. 48-53, где грызун представляет собой мышь.

55. Способ испытания кандидатного терапевтического соединения для лечения, направленного против образования эктопической костной ткани, включающий:

получение генетически модифицированного грызуна по любому из пп. 1-7 и 9;

индуцирование активности рекомбиназы у грызуна для обеспечения экспрессии измененного аллеля Acvr1, содержащего измененный экзон 7 Acvr1 грызуна;

введение кандидатного соединения грызуну; и

определение того, ингибирует ли кандидатное соединение развитие образования эктопической костной ткани у грызуна.

56. Способ по п. 55, где кандидатное соединение вводят грызуну до индукции активности рекомбиназы, во время этого или после этого.

57. Способ по п. 55, где кандидатное соединение представляет собой низкомолекулярное химическое соединение.

58. Способ по п. 55, где кандидатное соединение представляет собой нуклеиновую кислоту.

59. Способ по п. 55, где кандидатное соединение представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент.

60. Способ по п. 59, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент представляет собой антитело к рецептору активина 1 или его антигенсвязывающий фрагмент.

61. Способ по п. 59, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент представляет собой антитело к рецептору активина типа 2А или его антигенсвязывающий фрагмент.

62. Способ по п. 59, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент представляет собой антитело к рецептору активина типа 2 В или его антигенсвязывающий фрагмент.

63. Способ по п. 59, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент представляет собой антитело к активину А или его антигенсвязывающий фрагмент.

64. Способ по любому из пп. 55-63, где грызун представляет собой мышь.